RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 25/01/2025. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA CÂMPUS DE ARAÇATUBA AVALIAÇÃO DE PROCESSOS DE LIMPEZA DE TANQUES DE ARMAZENAMENTO DE LEITE EM UNIDADE DE ORDENHA MECANIZADA João Alexandre Sanchez Palencia Rovedilho Engenheiro Químico ARAÇATUBA - SP 2023 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA CÂMPUS DE ARAÇATUBA AVALIAÇÃO DE PROCESSOS DE LIMPEZA DE TANQUES DE ARMAZENAMENTO DE LEITE EM UNIDADE DE ORDENHA MECANIZADA João Alexandre Sanchez Palencia Rovedilho Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária – Unesp, Câmpus de Araçatuba, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal (Medicina Veterinária Preventiva e Produção Animal). Orientadora: Profa. Dra. Elisa Helena Giglio Ponsano ARAÇATUBA – SP 2023 R873a Rovedilho, João Alexandre Sanchez Palencia Avaliação de processos de limpeza de tanques de armazenamento de leite em unidade de ordenha mecanizada / João Alexandre Sanchez Palencia Rovedilho. -- Araçatuba, 2023 49 f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Medicina Veterinária, Araçatuba Orientadora: Elisa Helena Giglio Ponsano 1. Leite. 2. Limpeza. 3. Microbiologia. 4. Sanitização. 5. Segurança de Alimentos. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Medicina Veterinária, Araçatuba. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. DADOS CURRICULARES DO AUTOR JOÃO ALEXANDRE SANCHEZ PALENCIA ROVEDILHO – Nascido em 29 de setembro de 1991, na cidade de Birigui/SP. Em 2014, concluiu o curso de Graduação em Engenharia Química na Universidade Federal de São Carlos (UFSCar). Em 2018, concluiu o curso de Especialização em Engenharia de Segurança do Trabalho pela Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais (PUC- MG). Trabalhou em áreas industriais de alimentos com a produção de lácteos, lácteos pulverizados, atomatados, derivados de milho, maltodextrina e chocolates. Atualmente é fiscal sanitário na vigilância sanitária da Prefeitura Municipal de Araçatuba (SP). AGRADECIMENTOS Agradeço aos meus familiares e envolvidos diretamente nesse processo. À Profa. Elisa Helena, por todo o companheirismo e paciência, me apoiando em cada desenvolvimento. À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Faculdade de Medicina Veterinária e ao Curso de Pós-graduação em Ciência Animal pela oportunidade de realização do curso de Mestrado. A todos os professores e colaboradores da UNESP que, de alguma forma, fizeram parte desta conquista direta ou indiretamente. ROVEDILHO, J. A. S. P. Avaliação de processos de limpeza de tanques de armazenamento de leite em unidade de ordenha mecanizada. 48 f. Dissertação de Mestrado – Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba (SP), Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Araçatuba, 2023. RESUMO O alto valor nutricional do leite o torna, um meio suscetível ao desenvolvimento bacteriano, que é influenciado pelas contaminações que ocorrem durante e após a ordenha. Com o intuito de eliminar contaminações provenientes de equipamentos, as propriedades leiteiras e as indústrias de laticínios adotam a metodologia clean in place (CIP) cuja eficiência pode ser avaliada por meio de indicadores microbiológicos. O objetivo deste trabalho de pesquisa foi avaliar a eficiência de higienização em superfícies internas de equipamentos de uma unidade de ordenha mecanizada. Para isso, utilizaram-se três metodologias de limpeza em circuito fechado, alterando-se o binômio tempo de contato e temperatura da solução de detergente (20 min/70 °C, 20 min/75 °C e 25 min/70 °C). Para as análises microbiológicas foi utilizado o método do swab de superfície seguido das determinações dos grupos microbianos enterobactérias, mesófilos aeróbios e bolores e leveduras, seguindo-se os métodos oficiais tradicionais, antes e após a aplicação dos processos de higienização. Os resultados foram convertidos para escala logarítmica e avaliados estatisticamente por análise de variância e teste de Tukey, adotando-se 5% como nível de significância. Concluiu-se que todos os procedimentos CIP propostos foram efetivos na redução da carga microbiana das superfícies dos equipamentos de ordenha que fazem contato com o leite, e que os procedimentos a 20 min/75 °C e 25 min/70 °C foram os mais efetivos para o processo de higienização. Palavras-chave: Leite. Limpeza. Microbiologia. Sanitização. Segurança de Alimentos. ROVEDILHO, J. A. S. P. Evaluation of cleaning procedures of milk tanks in a mechanized milking unit. 48 f. Dissertação de Mestrado – Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba (SP), Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Araçatuba, 2023. ABSTRACT The high nutritional value of milk makes it susceptible to bacteriological development, which is influenced by the contaminations that occur during and after the milking process. In order to eliminate the contamination coming from equipment, the dairy farms and industries adopt the clean in place (CIP) methodology, whose efficiency can be evaluated by microbiological indicators. The objective of this research was to evaluate the efficiency of cleaning on internal surfaces of the equipment of a mechanized milking unit. For that, three closed-circuit cleaning methodologies were used, changing the contact time and the temperature of the detergent solution (20 min/70 °C, 20 min/75 °C and 25 min/70 °C). The surface swab method was used for the microbiological analysis, followed by the determination of the microbial groups enterobacteria, aerobic mesophylls and molds and yeast, which were performed by analytical official traditional methods, before and after the application of the cleaning processes. The results were converted to logarithmic scale and statistically evaluated by analysis of variance and Tukey’s test, adopting 5% as the significance level. It was concluded that all the proposed CIP procedures were effective in reducing the microbial load on the surfaces of milking equipment that contact milk, and that the procedures at 20 min/75 °C and 25 min/70 °C were the most effective for the cleaning operation. Keywords: Cleaning. Food Safety. Microbiology. Milk. Sanitization. LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Contagens de enterobactérias, bactérias mesófilas aeróbias e anaeróbias facultativas viáveis e bolores e leveduras (médias ± desvios padrões) após a aplicação dos procedimentos de higienização e o respectivo percentual de redução no comparativo antes e após o CIP. .................................................................................. 43 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Layout simplificado da linha de ordenha mecanizada (números) e pontos de coleta do teste de esfregaço (letras) ....................................... 40 Figura 2 - Médias obtidas antes e depois do procedimento de limpeza CIP para contagens de enterobactérias, bactérias mesófilas aeróbias e anaeróbias facultativas viáveis e bolores e leveduras (escala logarítmica). .............................................................................................. 41 Figura 3 - Boxplot para cada metodologia e cada grupo microbiano dos resultados obtidos após o processo de higienização (escala logarítmica). .............................................................................................. 42 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................. 11 1.1 Revisão da literatura .............................................................................................. 12 1.1.1 Produção de leite no Brasil ................................................................................. 12 1.1.2 Legislação brasileira referente à produção e à qualidade do leite .................... 12 1.1.3 Higienização de equipamentos de contato com o leite...................................... 14 1.1.4 Biofilmes e limpeza clean in place (CIP) ............................................................ 15 1.1.5 Contaminantes dos produtos lácteos ................................................................. 17 1.1.6 Indicadores microbianos ..................................................................................... 18 1.2 Objetivo ................................................................................................................... 19 2 CAPÍTULO 1 - VARIAÇÕES DE TEMPO E TEMPERATURA NA HIGIENIZAÇÃO CIP DE EQUIPAMENTOS DE ORDENHA MECANIZADA AFETAM OS INDICADORES MICROBIANOS ........................................................... 21 2.1 Abstract ................................................................................................................... 21 2.2 Resumo .................................................................................................................. 22 2.3 Introdução ............................................................................................................... 23 2.4 Materiais e métodos ............................................................................................... 24 2.4.1 Descrição da unidade de ordenha mecanizada ................................................. 24 2.4.2 Procedimento de higienização ............................................................................ 25 2.4.3 Pontos amostrais ................................................................................................. 26 2.4.4 Metodologia de coleta de amostras .................................................................... 26 2.4.5 Análises microbiológicas ..................................................................................... 26 2.4.6 Análises estatísticas ............................................................................................ 26 2.5 Resultados e discussão ......................................................................................... 27 2.6 Conclusão ............................................................................................................... 28 2.7 Declaração de conflito de interesse....................................................................... 28 2.8 Contribuição dos autores ....................................................................................... 29 2.9Referências.............................................................................................................. 29 APÊNDICE A – REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO GERAL .................................... 33 APÊNDICE B – INFORMAÇÕES SUPLEMENTARES ............................................... 40 ANEXO A – NORMAS DE PUBLICAÇÃO DA REVISTA CIÊNCIA RURAL .............. 44 11 1 INTRODUÇÃO GERAL Independente da origem, os alimentos podem conter agentes causadores de danos ao consumidor de forma física, química ou biológica, e a quantidade desses agentes está diretamente relacionada às práticas utilizadas desde o cultivo ou criação, passando pelos métodos de processamento e industrialização, até as condições de armazenamento e transporte (FRANCO; LANDGRAF, 2008). O leite é um alimento de alto valor nutricional e, devido a suas características de pH próximo à neutralidade e alta atividade de água, é suscetível à contaminação durante as etapas de obtenção, estocagem, transporte e processamento, o que o torna um veículo potencial de agentes causadores de doenças de origem alimentar (DESMARCHELIER, 2001). Dentre as possíveis contaminações, o leite pode conter substâncias estranhas de ordem física (pedaços de insetos, de plástico, pregos e agulhas), química (herbicidas, resíduos de antibióticos e sanitizantes) ou microbiológica (bactérias, fungos e vírus), provenientes de efeitos externos como cuidados inadequados no processo de ordenha e na refrigeração pós-ordenha (CNI; SENAI; SEBRAE; EMBRAPA, 2005). Quando em contato com utensílios de ordenha, superfícies de equipamento ou tanques de refrigeração com deficiência de higienização, o leite pode se contaminar, levando a um aumento significativo na contagem bacteriana (GUERREIRO et al., 2005). Este trabalho de pesquisa se justifica pela necessidade de se investigar a eficiência da realização de operações de limpeza em uma linha de ordenha mecanizada com o intuito de evitar contaminações do leite cru fornecido a laticínios e atender aos requisitos legais de condições higiênico-sanitárias de produção e fabricação. 12 1.1 Revisão da literatura 1.1.1 Produção de leite no Brasil A produção leiteira tem aumentado nos últimos 50 anos no Brasil. De 1961 a 2015, houve um crescimento linear na produção leiteira brasileira, com acréscimo de 30 milhões de toneladas e ganho médio anual de 555 mil toneladas (VILELA et al., 2017). Em 2019 foram produzidos 34,84 bilhões de litros de leite no Brasil e, sendo responsável por 27,11% do total da produção nacional, o estado de Minas Gerias figurava na primeira posição entres os estados brasileiros, seguido por Paraná (12,45%), Rio Grande do Sul (12,26%), Goiás (9,13%), Santa Catarina (8,71%) e São Paulo (4,74%) (HOTT; ANDRADE; MAGALHÃES, 2021). No terceiro trimestre de 2021, foram produzidos no Brasil 6.157.114 mil litros de leite cru (resfriado ou não), passando para 6.404.735 mil litros no quarto trimestre daquele ano. Em contrapartida, no primeiro trimestre de 2022, foi observada uma redução na produção, alcançando um patamar de 5.875.533 mil litros de leite cru (IBGE, 2022). Baseando-se em um modelo matemático, se prevê uma produção de 44,2 bilhões de litros de leite no Brasil no ano de 2025 (MELO, 2021). A produção de leite no Brasil possui diversos níveis tecnológicos ou organizacionais, ou seja, é realizada por pequenos produtores de origem familiar, evoluindo em pequenas cooperativas e consagrando-se em propriedades de grande porte e patamar tecnológico elevado (FARINA et al., 2005). No levantamento realizado pelo site Milkpoint (2022), os cem maiores produtores brasileiros de leite foram responsáveis pela produção diária de 25.508 litros de leite em 2021 e, devido a eles, a região sudeste se destacou como a maior produtora, produzindo 488 milhões de litros de leite naquele ano. Contribuem para os avanços tecnológicos na produção (área rural) e na industrialização, os sensores para monitoramento de parâmetros, físicos, químicos e biológicos, além do conhecimento de especialistas para uma produção pecuária mais técnica e de melhor qualidade de produtos e processos (VILELA et al., 2017). 1.1.2 Legislação brasileira referente à produção e à qualidade do leite Com a implementação da Instrução Normativa Nº 51 de 18 de setembro de 2002 (IN 51/2002) do Ministério Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), 13 definiram-se os regulamentos técnicos de produção, identidade e qualidade do leite cru e dos diferentes tipos de leites pasteurizados que, àquela época eram A, B e C (BRASIL, 2002). A partir da publicação da Instrução Normativa Nº 62 de 29 de dezembro de 2011, os leites pasteurizados tipo B e C foram substituídos pelo leite pasteurizado e novos padrões de produção, identidade e qualidade foram definidos para esse tipo de leite, bem como para o leite cru refrigerado que lhe daria origem (BRASIL, 2011). No ano de 2018, a Instrução Normativa Nº 62 foi substituída pela Instrução Normativa N° 76 de 26 de novembro de 2018 (IN 76/2018), a qual definiu novas características de identidade e qualidade que devem apresentar o leite cru refrigerado, o leite pasteurizado e o leite pasteurizado tipo A. A IN 76/2018 define que o leite cru proveniente de tanque individual ou de uso comunitário deve apresentar médias geométricas trimestrais de Contagem Padrão em Placas de, no máximo, 300.000 UFC/mL (BRASIL, 2018a). Também define que o leite cru deve apresentar a seguinte composição centesimal: 3 g/100 g (três gramas por cem gramas de produto) de gordura, 2,9 g/100 g de proteína total, 4,3 g/100 g de lactose anidra, 8,4 g/100 g de sólidos não gordurosos e 11,4 g/100 g de sólidos totais (BRASIL, 2018a). A Instrução Normativa N° 77 de 26 de novembro de 2018 (IN 77/2018), lançada simultaneamente à IN 76/2018, estabelece critérios e procedimentos para produção, acondicionamento, conservação, transporte, seleção e recepção do leite cru em estabelecimentos registrados no serviço de inspeção oficial (BRASIL, 2018b). Dentre as boas práticas agropecuárias que visam à obtenção de matéria- prima em condições higiênico-sanitárias adequadas, a IN 77/2018 prevê a higienização de superfícies, equipamentos e instalações, incluindo os tanques de refrigeração e armazenamento do leite, de uso individual ou comunitário, e os equipamentos de ordenha, que devem ser higienizados de acordo com as recomendações do fabricante (BRASIL, 2018b). Ainda, de acordo com a IN 77/2018, os procedimentos de higienização adotados nas propriedades rurais devem estar descritos no programa de autocontrole da matéria-prima, que deve ser elaborado pela indústria, como parte de seu plano de qualificação de fornecedores de leite. 14 1.1.3 Higienização de equipamentos de contato com o leite Para a adoção de medidas suficientemente adequadas para a higienização de equipamentos e superfícies industriais, deve-se levar em consideração a composição dos alimentos e as características dos processos. No caso do leite, os resíduos do processo produtivo são as proteínas, os carboidratos, os sais minerais e a gordura. As proteínas e os sais minerais são de difícil limpeza, estes devido à insolubilização e, aquelas, devido à desnaturação e consequente formação de incrustações. Já os carboidratos são solúveis em água e de fácil remoção (SANTOS, 2010). Quando os maquinários de ordenha mecanizada estão parados em intervalos de produção, pode haver a deposição de sujidades, com formação de incrustações e biofilmes nos equipamentos (HAYES; BOOR, 2001). Após aderirem à superfície dos equipamentos, os microrganismos podem resistir ao processo de limpeza, impactando a qualidade do leite (SANTOS; FONSECA, 2001), daí a necessidade de realização de higienização adequada para garantir que não haja a contaminação do leite por bactérias presentes nas superfícies de contato dos equipamentos (HAYES; BOOR, 2001). Guerreiro et al. (2005) avaliaram a qualidade do leite de diferentes propriedades e verificaram que o leite que apresentava melhor qualidade, definida pela contagem inicial de bactérias, era proveniente da propriedade que possuía maior rigor e critério no atendimento às práticas preventivas de higiene. Essas atividades incluíam a higienização de utensílios e equipamentos com água quente ou morna e a utilização de solução clorada. Cavalcanti et al. (2010) encontraram redução de mais de um ciclo logarítmico no número de microrganismos mesófilos e psicrotróficos ao realizar a limpeza da superfície de contato dos equipamentos com o leite, demonstrando a efetividade da realização da higienização antes do início do processo produtivo para garantir a diminuição da carga microbiológica no meio de contato com o produto. Em um estudo realizado para avaliar os efeitos do leite residual nas superfícies de contato não higienizadas do interior de caminhões de transporte, Kuhn, Meunier-Goddik e Waite-Cusic (2018) encontraram que as contagens de bactérias mesófilas, bactérias láticas e coliformes totais, entre outros, se intensificavam com o tempo. 15 Com o intuito de garantir a limpeza dos equipamentos de contato com alimentos com a maior remoção possível dos resíduos, deve-se utilizar uma metodologia que contemple as etapas de pré-limpeza, limpeza, enxágue, desinfecção e novo enxágue (ANDRADE, 2008). Ainda segundo o autor, um exemplo comum de limpeza em áreas industriais inclui pré-limpeza com água potável em temperatura ambiente, limpeza com detergente alcalino a 80 °C por 20 minutos de circulação, enxágue com água e desinfecção com solução ácida a 45 °C e, caso necessário, novo enxágue das tubulações e equipamentos. 1.1.4 Biofilmes e limpeza clean in place (CIP) Os biofilmes bacterianos se constituem em uma matriz formada por polissacarídeos, proteínas, ácidos nucléicos e lipídios, que se desenvolvem como uma camada protetora sobre as superfícies internas de equipamentos de contato com alimentos, sendo um problema recorrente na indústria de alimentos (FLEMMING; WINGENDER, 2010). Essas estruturas são formadas por um conjunto de células bacterianas, com ligações entre si e com adesão ao substrato ou superfície de contato (DONLAN; COSTERTON, 2002), com a finalidade de se defender das intempéries do ambiente externo, tais como alterações de pH e temperatura e ação de agentes químicos e físicos) (CLUTTERBUCK et al., 2007). As etapas de formação de biofilmes bacterianos consistem em adesão das bactérias na superfície de contato; consolidação das bactérias nas superfícies, formando polímeros; colonização e reprodução das bactérias (NORTERMANS; DORMANS; MEAD, 1991). Os biofilmes são encontrados na indústria de laticínios, principalmente em equipamentos para estocagem de leite (TEH et al., 2015). O mecanismo de formação dos biofilmes torna os microrganismos mais resistentes ao processo de limpeza e desinfecção (GAN et al., 2021), motivo de preocupação do ponto de vista de segurança do alimento, devido às bactérias patogênicas que podem estar ali aderidas, representando um perigo em potencial para os consumidores (SIQUEIRA et al., 2021). Por esse motivo, a limpeza clean in place (CIP) é recomendada para a higienização de equipamentos em linhas de produção de leite (LIU et al., 2020; OSTROV et al., 2016). A limpeza CIP baseia-se em métodos físicos de higienização, aliados à utilização de agentes químicos como detergentes e agentes biológicos como 16 enzimas, com o intuito de obtenção de um ambiente livre de biofilmes. Trata-se de um procedimento automatizado onde a limpeza regular das tubulações e equipamentos é realizada com o auxílio de soluções ácidas e alcalinas aplicadas sob altas temperaturas (SILVA et al., 2020). Na limpeza CIP são levados em consideração a temperatura das soluções, o tempo de circulação das soluções nos equipamentos, a concentração dos produtos químicos e a turbulência do fluido (LELIEVELD; MOSTERT; HOLAH, 2005). Temperaturas mais elevadas favorecem o processo de limpeza devido à redução da tensão superficial e da viscosidade do fluido (TAMIME, 2008). Além disso, permitem a solubilização das sujidades de forma mais eficiente com ação mais efetiva dos detergentes (JACQUES; LYONS; KELSALL, 2003). O fator tempo no CIP se relaciona à duração das etapas de limpeza e à frequência de realização. Por isso, o tempo utilizado em uma operação CIP deve ser suficiente para provocar a dissolução e a remoção das sujidades presentes nos equipamentos, considerando-se todas as etapas necessárias para o procedimento (LELIEVELD; MOSTERT; HOLAH, 2005). A concentração dos produtos químicos utilizados no CIP deve ser suficiente para realizar a decomposição das sujidades em frações inferiores, solubilizar os depósitos presentes nas superfícies dos equipamentos e tubulações e garantir a movimentação das sujidades removidas em suspensão na solução (TAMIME, 2008). Por fim, para a eficiente higienização de tubulações, o procedimento CIP exige que haja energia cinética nas soluções de limpeza, ou seja, o fluxo das soluções deve ocorrer em estágio turbulento para favorecer a remoção dos depósitos das sujidades. No caso de tanques de estocagem, são utilizados spray balls ou outros dispositivos para garantir que haja ação mecânica no interior das superfícies (TAMIME, 2008). O uso destas soluções de detergentes garante a obtenção de superfícies limpas e a eliminação de resíduos orgânicos nos pontos de difícil higienização. No entanto, mesmo com a utilização do tratamento CIP, podem restar microrganismos nas superfícies internas dos equipamentos higienizados (SHI; ZHU, 2009). 17 1.1.5 Contaminantes dos produtos lácteos O Decreto Nº 9.013, de 29 de março de 2017 (BRASIL, 2017) define o leite como o produto oriundo da ordenha completa, ininterrupta, em condições de higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas. O leite obtido nestas condições deve atender aos padrões pré-definidos no referido decreto para evitar prejuízos aos consumidores. Os microrganismos presentes em alimentos, por si só, não são indicadores de baixa qualidade do produto ou de riscos para o consumidor. Verifica-se que, usualmente, os alimentos se tornam perigosos somente quando ocorrem desvios relacionados à sanitização e à higiene dos processos e na cadeia de suprimentos e armazenamento (ICMSF, 2015). O leite pode ser considerado um meio de cultura ideal para o desenvolvimento de bactérias e outros microrganismos, que podem acarretar danos à saúde pública, se forem patogênicos, defeitos na qualidade industrial e redução na vida de prateleira, se forem deteriorantes. Dentre as alterações que podem ocorrer na qualidade do produto, podem ser citadas a acidificação, a coagulação, a produção de gases, alterações de características sensoriais e organolépticas, acarretando redução na vida de prateleira dos produtos (CASSOLI, 2005). Durante o armazenamento e o transporte, o leite é suscetível ao desenvolvimento de bactérias do grupo Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Salmonella, Yersinia enterocolitica, entre outras) causadores de gastrenterites, bactérias mesófilas aeróbias, e de fungos (bolores e leveduras) desenvolvedores de micotoxinas. Em uma pesquisa realizada por Ryu et al. (2021) foram verificados ambientes e equipamentos de fazendas produtoras de leite, tendo sido detectada a presença de bolores e leveduras em pontos internos dos equipamentos de ordenha e dos filtros de leite, além de outros pontos externos das propriedades (HAYES; BOOR, 2001). A principal causa do aumento nos níveis de Enterobacteriaceae em laticínios é a contaminação proveniente de áreas produtivas (ICMSF, 2015). Por isso, a testagem ambiental se torna peça-chave na avaliação de medidas preventivas, já que esse grupo microbiano é indicador de boas práticas de higiene (ICMSF, 2015). Apesar da suscetibilidade do leite ao desenvolvimento microbiano, em um estudo foi detectado a presença de Campylobacter apenas em duas amostras de 18 leite cru (de um total de 15 amostras analisadas) em um estabelecimento que aplica ações de boas práticas de fabricação (BPF) e boas práticas agropecuárias (BPA), na região de Curitiba (Paraná), demonstrando que essas ações são capazes de assegurar a qualidade do leite (NARCISO; MONTANHINI, 2014). O leite se deteriora de forma rápida, mesmo sob refrigeração, com a proliferação de grande número de bactérias. Em alguns casos, verifica-se o dobro da população de microrganismos a cada 20 a 30 minutos. Por isso, é recomendável que o leite seja manuseado corretamente desde o momento da ordenha até chegar à indústria de laticínios (GUERREIRO et al., 2005). 1.1.6 Indicadores microbianos A IN 77/2018 define que compete às indústrias, como parte do programa de autocontrole, a implementação de um plano de qualificação de fornecedores de leite, no qual se apresentem, no mínimo, objetivos, metas, indicadores e cronograma para implementação e/ou execução de BPA (BRASIL, 2018b). Para a estruturação de um programa de gestão de segurança e qualidade de alimentos, podem-se utilizar análises microbiológicas como indicadoras de performance de boas práticas de higienização. Essas análises servem como ferramenta de apoio para a avaliação de processos de desinfecção ou falhas na fabricação (ICMSF, 2015). Para a verificação de eventuais contaminações no processo produtivo, usualmente são pesquisados os microrganismos indicadores, que são espécies fornecedoras de indicativos de ocorrência de contaminação ou de condições sanitárias inadequadas durante o processamento, a produção ou o armazenamento (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Os indicadores microbianos são utilizados para avaliar a eficácia e os benefícios da implementação de um programa de boas práticas de fabricação (BPF) relacionado à segurança dos alimentos e à qualidade do leite, uma vez que esses dados podem ser utilizados para avaliar a eficiência dos processos de desinfecção e limpeza de estruturas (DIAS et al., 2012). A utilização do grupo coliformes como indicador de qualidade higiênico- sanitária é prática consolidada na produção e na industrialização do leite pois permite a verificação das condições empegadas durante a ordenha, bem como eventuais falhas na pasteurização (OLIVEIRA, 2016). Além disso, o grupo coliforme permite avaliar a condição higiênico-sanitária dos produtos lácteos e do ambiente de 19 processamento e armazenamento (OLIVEIRA, 2016). A identificação de grupos bacterianos, incluindo os coliformes e as enterobactérias, representam indícios de deficiência de sanitização ou contaminação após a pasteurização em produtos lácteos (HEBERT et al., 2016). Para Barbosa et al. (2011), condições aceitáveis de higienização de superfícies são atestadas com contagem de coliformes totais de, no máximo, 50 UFC/cm². De acordo com os autores, esse limite segue o estabelecido pela Organización Panamericana de la Salud (OPAS) e pela Organização Mundial da Saúde (OMS). Contudo, não há limite legal na legislação brasileira para o grau de contaminação das superfícies de contato com o leite (RODRIGUES; FERREIRA, 2016). Além do grupo coliformes, o número elevado na contagem de bactérias mesófilas aeróbias pode indicar contaminação no leite cru, relacionada a falhas na higienização dos tetos antes da ordenha ou no sistema de sanitização dos equipamentos que entram em contato com o leite (BRITO; ARCURI; BRITO, 2000). Após a efetivação da limpeza de superfícies de contato direto com alimentos, consideram-se efetivamente higienizadas aquelas que obtêm resultados limitados a 2 UFC/cm² (APHA, 2001). A presença de microrganismos como coliformes totais e bolores e leveduras pode indicar falhas higiênico-sanitárias no processamento do leite, levando a alterações que acarretam impacto na qualidade do leite, quanto aos aspectos físico- químicos, organolépticos e de durabilidade do produto (MACHADO et al., 2012). Considerando a necessidade de garantir condições produtivas satisfatórias das propriedades leiteiras, faz-se necessária a realização de procedimentos de limpeza específicos e eficazes nos equipamentos da linha de produção, principalmente em superfícies de contato direto com leite, para alcançar os requisitos microbiológicos mínimos e a segurança microbiológica do produto, o que justifica a realização deste trabalho de pesquisa. 1.2 Objetivo O objetivo neste trabalho de pesquisa foi investigar a eficiência de distintos procedimentos de limpeza CIP em uma propriedade leiteira de ordenha mecanizada 20 utilizando indicadores microbianos (bactérias mesófilas aeróbias, enterobactérias e bolores e leveduras). 33 APÊNDICE A – REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO GERAL ANDRADE, N. J. Higiene na indústria de alimentos: avaliação e controle da adesão e formação de biofilmes bacterianos. São Paulo: Varela, 2008. 412 p. APHA - AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard methods for examination of water and wastewater. 20. ed. Washington, DC: APHA, 2001. BARBOSA, L. G.; RUY, M. J.; OLIVEIRA, A. D.; MARTINS, E. M. F.; MARTINS, C. T. Determinação de coliformes e aplicação de checklist em uma unidade de alimentação pública do Estado de Minas Gerais. Higiene Alimentar, São Paulo, v. 25, n. 196-197, p. 38-41, mai-jun, 2011. RODRIGUES, D. S.; FERREIRA, F. C. Avaliação microbiológica de leite pasteurizado produzido em laticínio do município de Januária-MG. Higiene Alimentar, São Paulo, v. 30, n. 252-253, p. 122-125. Disponível em: https://higienealimentar.com.br/252253janfev/. Acesso em: 5 set. 2022. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Decreto n° 9.013, de 29 de março de 2017. Regulamenta a Lei nº 1.283, de 18 de dezembro de 1950, e a Lei nº 7.889, de 23 de novembro de 1989, que dispõem sobre a inspeção industrial e sanitária de produtos de origem animal. Diário Oficial da União, Brasília, DF, Seção 1, p. 3, 30 mar. 2017. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa n° 51, de 20 de setembro de 2002. Aprova os regulamentos técnicos de produção, identidade e qualidade do leite. Diário Oficial da União, Brasília, DF, Seção 1, p. 13-21, 20 set. 2002. 34 BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa n° 62, de 29 de dezembro de 2011. Aprova os regulamentos técnicos de produção, identidade e qualidade do leite cru refrigerado, o regulamento técnico de identidade e qualidade de leite pasteurizado e o regulamento técnico da coleta de leite cru refrigerado e seu transporte a granel, em conformidade com os anexos desta Instrução Normativa. Diário Oficial da União, Brasília, DF, Seção 1, p. 6, 29 dez. 2011. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa n° 76, de 26 de novembro de 2018. Aprova os Regulamentos Técnicos que fixam a identidade e as características de qualidade que devem apresentar o leite cru refrigerado, o leite pasteurizado e o leite pasteurizado tipo A. Diário Oficial da União, Brasília, DF, Seção 1, p. 230-231, 26 nov. 2018a. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa n° 77, de 26 de novembro de 2018. Estabelece os critérios e procedimentos para a produção, acondicionamento, conservação, transporte, seleção e recepção do leite cru em estabelecimentos registrados no serviço de inspeção oficial. Diário Oficial da União, Brasília, DF, Seção 1, p. 10, 26 nov. 2018b. BRITO, M. A. V. P.; ARCURI, E. F.; BRITO, J. R. F. Avanços tecnológicos para o aumento da produtividade leiteira. In: DURAES, M. C.; MARTINS, C. E.; DERESZ, F.; BRITO, J. R. F.; FREITAS, A. F.; PORTUGAL, J. A. B.; COSTA, C. N. Anais Minas Leite. Juiz de Fora: Embrapa Gado de Leite, 2000. p. 83-94. CASSOLI, L. D. Validação da metodologia de citometria de fluxo para avaliação da contagem bacteriana do leite cru. 2005. 57 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz “, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2005. CAVALVANTI, E. R. C. C.; CAVALCANTI, M. A. R.; SOUZA, W. J.; ARAÚJO, D. G. Avaliação microbiológica em ordenhadeira mecânica antes e após adoção de procedimento orientado de higienização. Revista Brasileira de Ciência Veterinária, Niterói, v. 17, n. 1, p. 3-6, 2010. 35 CLUTTERBUCK, A. L.; WOODS, E. J.; KNOTTENBELT, D. C.; CLEGG, P. D.; COCHRANE, C. A.; PERCIVAL, S. L. Biofilms and their relevance to veterinary medicine. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v. 121, n. 1-2, p. 1-17, mar. 2007. CNI; SENAI; SEBRAE; EMBRAPA. Boas práticas agropecuárias para produção de alimentos seguros no campo: perigos na produção leiteira. 2. ed. rev. atual. Brasília, DF: Embrapa Transferência de Tecnologia, 2005. 30 p. DESMARCHELIER, P. M. Pathogenic microbiological contaminants of milk. The Australian Journal of Dairy Technology, North Melbourne, v. 56, n. 2, p. 123-125, 2001. DIAS, A. M.; SANT'ANA, A. S.; CRUZ, A. G.; FARIA, J. A. F.; FERNANDES, C. A. On the implementation of good manufacturing practices in a small processing unity of mozzarella cheese in Brazil. Food Control, Oxford, v. 24, n. 1-2, p. 199-205, 2012. DONLAN, R. M.; COSTERTON, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews, Washington, v. 15, n. 2, p. 167-193, abr. 2002. FARINA, E. M. M. Q.; HUTMAN, G. E.; LAVARELLO, P. J.; NUNES, R.; REARDON, T. Private and public milk standards in Argentina and Brazil. Food Policy, Oxford, v. 30, n. 3, p. 302-315, 2005. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia de alimentos. São Paulo: Atheneu, 2008. 192 p. FLEMMING, H. C.; WINGENDER, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology, Londres, v. 8, n.1, p. 623-633, 2010. GAN, X.; YANG, B.; WANG, X.; DONG, Y.; HU, Y.; XU, J.; FENGQIN, L. Contamination, persistence and dissemination of Cronobacter during the production of powdered infant formula in China in 2016. Quality Assurance and Safety of Crops & Foods, Brisbane, v. 13, n.1, p. 105-114, 2021. 36 GUERREIRO, P. K.; MACHADO, M. R.; BRAGA, G. C.; GASPARINO, E.; FRANZENER, A. S. M. Qualidade microbiológica de leite em função de técnicas profiláticas no manejo de produção. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 29, n. 1, p. 216-222, 2005. HAYES, M. C.; BOOR, K. Raw milk and fluid milk products. In: MARTH, E. H.; STEELE, J. L. Applied Dairy Microbiology. 2. ed. Nova Iorque: Marcel Dekker, 2001. p. 59-76. HEBERT, C. J.; ALLES; A. S.; MARTIN; N. H.; BOOR; K. J. WHEDMANN; M. Evaluation of different methods to detect microbial hygiene indicators relevant in the dairy industry. Journal of Dairy Science, Nova Iorque, v. 99, n. 9, p. 7033-7042, 2016. HOTT, M. C.; ANDRADE, R. G.; MAGALHÃES, W. C. P. Distribuição da produção de leite por estados e mesorregiões. In: EMBRAPA GADO DE LEITE. Anuário Leite 2021. São Paulo: Texto Comunicação Corporativa, 2021. p. 10-13. IBGE – INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA. Pesquisa trimestral do leite. [Brasília, DF], 2022. Disponível em: https://www.ibge.gov.br/estatisticas/economicas/agricultura-e-pecuaria/21121- primeiros-resultadios-2leite.html?=&t=resultados. Acesso em: 5 set. 2022. ICMSF - INTERNATIONAL COMMISSION ON MICROBIOLOGICAL SPECIFICATIONS FOR FOODS. Microrganismos em alimentos 8: utilização de dados para avaliação do controle de processo e aceitação de produto. São Paulo: Blucher, 2015. 522 p. IRIE, Y.; ONO, M.; ARITSUNE, M.; IMAMURA, Y.; NISHIOKA, S.; AKIYAMA, K.; ENOKIDANI, M.; HORIKITA, T. Cleaning procedures and cleanliness assessments of bucket milkers and suckling buckets on Japanese dairy farms. The Journal of Veterinary Medical Science, Tóquio, v. 83, n. 5, p. 863-868, 2021. 37 JACQUES, K.; LYONS, T.; KELSALL, D. The alcohol textbook. 4 ed. Nottingham: Nottingham University Press, 2003. 445 p. KUHN, E.; MEUNIER-GODDIK, L.; WAITE-CUSIC, J. G. Effect of leaving milk trucks empty and the idle for 6 h between raw milk loads. Journal of Dairy Science, Nova Iorque, v. 101, n. 2, p. 1767-1776, 2018. LELIEVELD, H.; MOSTERT, T.; HOLAH, J. Handbook of hygiene control in the food industry. Cambridge: CRC, 2005. 744 p. LIU, Y.; WANG, C.; SHI, Z.; LI, B. Optimization and modeling of slightly acid electrolyzed water for the clean-in-place process in milking systems. Foods, Basel, v. 9, n. 11, p. 1685, nov. 2020. Disponível em: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7698708. Acesso em: 5 set. 2022. MACHADO, N. J. B.; LAUREANO, M. M. M.; MOTA, D. A.; MATOS, I. T. S. R.; BRASIL, R. J. M.; HOSHIDA, M. A. Caracterização da qualidade microbiológica do leite cru de propriedades do município de Parintins-AM. Revista de Ciências Agrárias, Belém, v. 55, n. 4, p. 327-331, 2012. MELO, L. Modelagem matemática da produção de leite no Brasil: uma aplicação de conhecimentos adquiridos durante o curso de graduação. Pensar Acadêmico, Manhuaçu, v. 19, n. 1, p. 87-98, 2021. MILKPOINT. Levantamento Top 100 produtores de leite no Brasil. São Paulo, 2022 Disponível em: https://www.milkpoint.com.br/top100/2022/. Acesso em: 5 set. 2022. NARCIZO, D. K.; MONTANHINI, M. T. M. Ocorrência de Campylobacter jejuni em leite cru e pasteurizado comercializado em Curitiba, estado do Paraná, Brasil. Revista Instituto Laticínios Cândido Tostes, Juiz de Fora, v. 69, n. 5, p. 341-347, 2014. 38 NORTERMANS, S.; DORMANS, J. A. M. A.; MEAD, G. C. Contribution of surface attachment to the establishment of microorganism in food processing plants: a review. Biofouling, Abingdon, v. 5, n. 1-2, p. 21-36, 1991. OLIVEIRA, J. Uso de critérios para avaliação da qualidade microbiológica de um laticínio. 2016. 53 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Bacharel em Engenharia de Alimentos) – Universidade Federal de Laranjeiras do Sul, Laranjeiras do Sul, 2016. OSTROV, I.; HAREL, A.; BERNSTEIN, S.; STEINBERG, D. SHEMESH, M. Development of a method to determine the effectiviness of cleaning agents in removal of biofilm derived spores in milking system. Frontiers in Microbiology, Lausanne, v. 7, article 1498, 9 p., 2016. Disponível em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2016.01498/full. Acesso em: 13 set. 2022. RODRIGUES, D. S.; FERREIRA, F. C. Avaliação microbiológica de leite pasteurizado produzido em laticínio do município de Januária-MG. Higiene Alimentar, São Paulo, v. 30, n. 252-253, p. 122-125, 2016. Disponível em: https://higienealimentar.com.br/252253janfev/. Acesso em: 5 set. 2022. RYU, S.; SHIN, M.; YUN, B.; LEE. W.; CHOI, H.; KANG, M.; OH, S.; KIM, Y. Bacterial quality, prevalence of pathogens, and molecular characterization of biofilm- producing Staphylococcus aureus from Korean dairy farm environments. Animals, Basel, v 11, n. 5, p. 1306, abr. 2021. Disponível em: https://www.mdpi.com/2076- 2615/11/5/1306. Acesso em: 5 set. 2022. SANTOS, A. L. Implantação de um procedimento de higienização em uma unidade produtora de queijo minas artesanal na região da Canastra e avaliação pelo método de ATP-bioluminescência. 2010. 87 f. Dissertação (Mestrado Profissional em Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados) - Universidade Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora, 2010. https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2016.01498/full 39 SANTOS, M. V.; FONSECA, L. F. L. Importância e efeito das bactérias psicotrópicas sobre a qualidade do leite. Higiene Alimentar, São Paulo, v. 15, n. 82, p.13-19, mar. 2001. Disponível em: https://higienealimentar.com.br/82-2/. Acesso em: 5 set. 2022. SHI, X.; ZHU, X.; Biofilm formation and food safety in food industries. Trends in Food Science & Technology, Oxford, v. 20, n. 9, p. 407-413, 2009. SILVA, L. D.; MOREIRA, M. G.; GUERRA, N. T.; NAVES, E. A. A.; VIANNA, P. C. B.; FILHO, U. C. Limpeza clean in place (CIP) de diferentes geometrias de aço inoxidável contaminadas com Pseudomonas fluorescens. Research, Society and Development, [S.l.], v. 9, n. 12, p. e23491210866, 2020. Disponível em: https://rsdjournal.org/index.php/rsd/article/view/10866. Acesso em: 03 dez. 2022. SIQUEIRA, I. N.; LIMEIRA, C. H.; CAVALCANTI, A. A. C.; SOUZA, J. G.; AZEVEDO, S. S.; MELO, M. A.; FREIRE, D. H. F. Bactérias formadoras de biofilmes na indústria de laticínios: uma breve revisão. Ensaios e Ciência C Biológicas, Agrárias e da Saúde, [S.l.], v. 25, n. 4, p. 491-500, 2021. Disponível em: https://ensaioseciencia.pgsskroton.com.br/article/view/8580. Acesso em: 13 set. 2022. TAMIME, A. Cleaning-in-place: Dairy, Food and Beverage Operations. 3 ed. Oxford: Blackell Publishing, 2008. 272 p. TEH, K. H.; FLINT, S.; BROOKS, J.; KNIGHT, G. Biofilms in the dairy industry. Oxford: Wiley, 2015. 288 p. VILELA, D.; RESENDE, J. C.; LEITE, J. B.; ALVES, E. A evolução do leite no Brasil em cinco décadas. Revista de Política Agrícola, Brasília, DF, v. 26, n. 1, p. 5-24, jan. 2017. https://ensaioseciencia.pgsskroton.com.br/article/view/8580 1 INTRODUÇÃO GERAL 1.1 Revisão da literatura 1.1.1 Produção de leite no Brasil 1.1.2 Legislação brasileira referente à produção e à qualidade do leite 1.1.3 Higienização de equipamentos de contato com o leite 1.1.4 Biofilmes e limpeza clean in place (CIP) 1.1.5 Contaminantes dos produtos lácteos 1.1.6 Indicadores microbianos 1.2 Objetivo 2 CAPÍTULO 1 - VARIAÇÕES DE TEMPO E TEMPERATURA NA HIGIENIZAÇÃO CIP DE EQUIPAMENTOS DE ORDENHA MECANIZADA AFETAM OS INDICADORES MICROBIANOS 2.1 Abstract 2.2 Resumo 2.3 Introdução 2.4 Materiais e métodos 2.4.1 Descrição da unidade de ordenha mecanizada 2.4.2 Procedimento de higienização 2.4.3 Pontos amostrais 2.4.4 Metodologia de coleta de amostras 2.4.5 Análises microbiológicas 2.4.6 Análises estatísticas 2.5 Resultados e discussão 2.6 Conclusão 2.7 Declaração de conflito de interesse 2.8 Contribuição dos autores 2.9 Referências APÊNDICE A – REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO GERAL APÊNDICE B – INFORMAÇÕES SUPLEMENTARES ANEXO A – NORMAS DE PUBLICAÇÃO DA REVISTA CIÊNCIA RURAL