RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta Dissertação será disponibilizado somente a partir de 14/11/2025. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia VALIDAÇÃO DO TRANSPORTE DE EMBRIÕES BOVINOS EM CAIXA ISOTÉRMICA LUIZ GUSTAVO FERREIRA DE LIMA Botucatu, SP Maio – 2025 Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia VALIDAÇÃO DO TRANSPORTE DE EMBRIÕES BOVINOS EM CAIXA ISOTÉRMICA Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Animal para obtenção do título de MESTRE. Aluno: Luiz Gustavo Ferreira de Lima Orientador: Prof. Dr. João Carlos Pinheiro Ferreira. Botucatu, SP Maio – 2025 Autor: Luiz Gustavo Ferreira de Lima Título: Validação do transporte de embriões bovinos em caixa isotérmica BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. João Carlos Pinheiro Ferreira. Presidente e Orientador Departamento de Cirurgia Veterinária e Reprodução Animal, FMVZ - UNESP - Botucatu/SP Profa. Dra. Gisele Zoccal Mingoti Membro PPG Ciência animal, FCAV – UNESP, Jaboticabal/SP Profa. Dra. Maricy Apparício Ferreira Membro Departamento de Cirurgia Veterinária e Reprodução Animal, FMVZ - UNESP - Botucatu/SP Data da defesa: 14 de maio de 2025. AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar agradeço a Deus por me conceder o dom da vida, saúde, sabedoria, e me conceder todos os dias a sua proteção. A toda a minha família, fonte inesgotável de força. Em especial a minha mãe Vanessa Aparecida Ferreira, pela base ética e por todo o apoio, sacrifício realizado que me permitiu chegar até aqui. Obrigado por ser meu alicerce em todos os momentos, por me incentivar mesmo quando os caminhos pareciam difíceis, por me apoiar silenciosamente e acreditar em mim quando nem eu mesmo tinha certeza. Este trabalho é, acima de tudo, um reflexo do seu esforço, do seu sacrifício e da sua fé. Se hoje chego até aqui, é porque você nunca me deixou desistir. Essa conquista é tão sua quanto minha. Ao meu orientador, Prof. Dr. João Carlos Pinheiro Ferreira, pela confiança, orientação técnica, e pela liberdade intelectual concedida para explorar este tema. Suas críticas construtivas e expertise na área de reprodução animal foram fundamentais para o aprimoramento desta pesquisa. A prof. Dra. Eunice Oba dedico igual reconhecimento pelo apoio e parceria firmada durante o mestrado. Aos demais professores que pacientemente compartilharam de seus conhecimentos e experiencias ao longo dessa jornada. A universidade estadual paulista “Júlio de Mesquita Filho “, em especial ao programa de Pós-Graduação em Biotécnologia Animal, direciono meus agradecimentos pela infraestrutura e recursos técnicos oferecidos.Agradeço ao apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Não poderia deixar de mencionar os colegas que dedicaram seus dias a auxiliar na produção deste trabalho Thainá Sallum Bacco, Thaisy Tino Dellaqua, Rogério Araújo de Almeida Filho os quais foram essenciais para o desenvolvimento deste trabalho, cujo companheirismo e cumplicidade tornou essa trajetória mais leve e agradável. Em especial a Thainá que além da parceria do trabalho se tornou minha parceira de vida. Agradeço as empresas BotuPharma e CEOgenétics, meu reconhecimento pela colaboração e apoio quanto aos materiais utilizados para o desenvolvimento do trabalho. Aos amigos que me acompanharam durante a trajetória e aqueles que adquiri durante ela, meu carinho em especial. Vocês foram meu porto seguro nos dias de incerteza e minha celebração nas pequenas conquistas. Por fim, dedico este trabalho a comunidade cientifica e aos profissionais da pecuária, na esperança de que os resultados aqui apresentados possam de alguma forma contribuir para avanços na pecuária. RESUMO LIMA, L. G. F. Validação do transporte de embriões bovinos em caixa isotérmica. Botucatu, 2025, 89p. Dissertação de mestrado – Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, FMVZ – Campos Botucatu. A produção in vitro de embriões (PIVE) e a transferência de embriões são biotecnologias amplamente empregadas na reprodução de bovinos, desempenhando papel estratégico no melhoramento genética dos rebanhos e no aumento da eficiência produtiva dos sistemas de cria. Apesar dos avanços significativos nas técnicas de produção in vitro e sincronização hormonal, a etapa de transporte dos embriões ainda representa um ponto crítico e pouco explorado na literatura científica, sendo determinante para o sucesso final do procedimento. Este trabalho teve como objetivo reunir, analisar e discutir os principais fatores que afetam a viabilidade embrionária durante o transporte, buscando compreender os desafios logísticos e técnicos que podem comprometer a taxa de sucesso obtida com a técnica. Foram abordados aspectos relacionados aos diferentes métodos de transporte, como o uso de incubadoras portáteis, criopreservação, vitrificação e resfriamento, bem como suas respectivas vantagens e limitações. A temperatura durante o transporte foi destacada como um dos fatores mais críticos, sendo demonstrado que tanto temperaturas excedendo o nível fisiológico quanto temperaturas abaixo do mesmo podem comprometer a integridade celular, influenciar negativamente a eclosão embrionária e consequentemente reduzir as taxas de prenhez. Além da temperatura, o meio utilizado para transporte também exerce papel fundamental na manutenção da viabilidade embrionária, uma vez que fornece substratos essenciais ao metabolismo e pode atuar como barreira contra o estresse oxidativo. O uso de soluções tamponadas, suplementadas com antioxidantes e proteínas séricas, tem se mostrado eficaz para o transporte de curta e média duração. No entanto, para trajetos mais longos, estratégias como o cultivo sequencial ou sistemas microfluídicos são alternativas promissoras, embora ainda pouco aplicadas em escala comercial. Complementarmente, a tese aborda a importância da seleção criteriosa e da sincronização hormonal das receptoras, fatores decisivos para o sucesso da técnica. A preparação adequada da receptora, incluindo avaliação clínica e ginecológica, bem como a escolha do protocolo hormonal mais adequado à categoria animal e à realidade da propriedade, são fundamentais para otimizar os resultados da TE. Conclui-se que o transporte de embriões, frequentemente negligenciado em muitos programas de PIVE, deve ser tratado como uma etapa estratégica, cuja padronização e aprimoramento técnico podem resultar em ganhos significativos nas taxas de prenhez e na eficiência geral dos programas comerciais de transferência de embriões. A escassez de estudos específicos sobre o tema reforça a necessidade de mais pesquisas aplicadas, com foco na validação de protocolos logísticos e no desenvolvimento de soluções que garantam a estabilidade térmica e metabólica dos embriões durante o deslocamento entre laboratórios e propriedades rurais. Palavras-chave: in vitro; transporte embrionário; transferência de embriões; biotecnologia da reprodução. ABSTRACT LIMA, L. G. F. Validation of bovine embryo transport in an isothermal box. Botucatu, 2025, 89p. Master’s thesis – São Paulo State University Júlio de Mesquita Filho (UNESP), FMVZ – Botucatu Campus. In vitro embryo production and embryo transfer are biotechnologies widely used in bovine reproduction, playing a strategic role in the genetic improvement of herds and in increasing the productive efficiency of cow-calf systems. Despite significant advances in in vitro production techniques and hormonal synchronization, the embryo transport stage still represents a critical point that is little explored in the scientific literature, being decisive for the final success of the procedure. This study aimed to compile, analyze, and discuss the main factors that affect embryonic viability during transport, seeking to understand the logistical and technical challenges that may compromise the success rate achieved with the technique. Aspects related to different transport methods were addressed, such as the use of portable incubators, cryopreservation, vitrification, and cooling, as well as their respective advantages and limitations. Temperature during transport was highlighted as one of the most critical factors, with evidence showing that both temperatures exceeding the physiological level and those below it can compromise cellular integrity, negatively influence embryonic hatching, and consequently reduce pregnancy rates. In addition to temperature, the medium used for transport also plays a fundamental role in maintaining embryonic viability, as it provides essential substrates for metabolism and can act as a barrier against oxidative stress. The use of buffered solutions, supplemented with antioxidants and serum proteins, has proven effective for short and medium-duration transport. However, for longer journeys, strategies such as sequential culture or microfluidic systems are promising alternatives, although still rarely applied on a commercial scale. Additionally, the thesis addresses the importance of careful selection and hormonal synchronization of recipients, which are decisive factors for the success of the technique. The proper preparation of the recipient, including clinical and gynecological evaluation, as well as the selection of the most appropriate hormonal protocol for the animal category and the reality of the farm, are fundamental to optimize the results of embryo transfer. It is concluded that embryo transport, often neglected in many IVP programs, should be treated as a strategic stage, whose standardization and technical improvement can result in significant gains in pregnancy rates and in the overall efficiency of commercial embryo transfer programs. The scarcity of specific studies on the subject reinforces the need for more applied research, focusing on the validation of logistical protocols and the development of solutions that ensure thermal and metabolic stability of embryos during transportation between laboratories and rural properties. Keywords: in vitro; embryo transport; embryo transfer; reproductive biotechnology. LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS SIGLAS CCOs: Complexos cúmulos-oócito CFA: Contagem de folículos antrais CIV: Cultivo in vitro CL: Corpo lúteo ECC: Escore de condição corporal eCG: Gonadotrofina coriônica equina FD: Folículo dominante FIV: Fecundação in vitro FSH: Hormônio folículo estimulante IA: Inseminação artificial IATF: Inseminação artificial em tempo fixo LH: Hormônio luteinizante MIV: Maturação in vitro OPU: Ovum pick-up pH: Potencial de hidrogênio PIVE: Produção in vitro de embriões TE: Transferência de embrião TETF: Transferência de embrião em tempo fixo SÍMBOLOS °C: Graus Celsius. %: Porcentagem. SUMÁRIO CAPÍTULO 1 ...............................................................................................................13 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA .........................................................................32 2. REVISÃO DE LITERATURA...................................................................................34 2.1. Fisiologia reprodutiva da fêmea Bovina ................................................ 34 2.1.1. Controle hormonal do ciclo estral ....................................................... 35 2.1.2. Dinâmica folicular e seleção do folículo dominante ........................... 36 2.1.3. Reserva ovariana e implicações na fertilidade ................................... 38 2.2. Reprodução assistida em bovinos ........................................................ 39 2.2.1 Importância da reprodução assistida para o melhoramento genético e produtividade pecuária ..................................................................................... 39 2.2.2 Papel da transferência de embriões e produção in vitro de embriões na eficiência reprodutiva e produtiva ..................................................................... 40 2.3 Aspiração Folicular ................................................................................ 41 2.3.1. Fatores que influenciam na qualidade oocitária ................................. 43 2.3.2. Critérios de seleção dos complexos cúmulos-oócitos para a PIVE ... 44 2.4. Produção in vitro de embriões .............................................................. 47 2.4.1. Maturação In Vitro .............................................................................. 49 2.4.2. Fertilização In Vitro ............................................................................ 51 2.4.3 Cultivo in vitro ..................................................................................... 51 2.5. Transporte de embriões bovinos e fatores críticos ............................... 52 2.5.1. Tipos de transporte de embriões bovinos .......................................... 53 2.5.2. Temperatura para transporte de embriões bovinos ........................... 55 2.5.3. Meio de transporte ............................................................................. 56 2.5.4. Tempo de duração do transporte ....................................................... 56 2.6. Transferência de embriões ................................................................... 57 2.6.1. Seleção e preparação de receptoras ................................................. 58 2.6.2. Inovulação .......................................................................................... 60 3. CONSIDERAÇÕES FINAIS ....................................................................................60 4. HIPÓTESE E OBJETIVOS .....................................................................................62 4.1. Hipótese(s) ............................................................................................ 62 4.2. Objetivo(s) geral(s) ............................................................................... 62 4.3. Objetivo(s) específico(s) ....................................................................... 63 5. REFERÊNCIAS.......................................................................................................63 CAPÍTULO 2 ...............................................................................................................77 ARTIGO CIENTÍFICO .................................................................................................. 1 2.1. Ethical aspects ........................................................................................... 4 2.2. Experimental design ................................................................................... 4 2.3. Experiment 1: Validation of the isothermal box ............................................. 6 2.4.1. Animals .................................................................................................. 8 2.4.2. Follicular aspiration ................................................................................. 8 2.4.3. Recovery and selection of cumulus-oocyte complexes ................................. 9 2.4.4. In vitro maturation ................................................................................... 9 2.4.5. In vitro fertilization ................................................................................ 10 2.4.6. In vitro culture ...................................................................................... 10 2.4.7. Packaging and transport of embryos ........................................................ 11 2.4.8. In vitro assessment of embryos after simulated transport ............................ 11 2.5. Experiment 3: In vivo viability of bovine embryos following 6-hour simulated transport in the Botuflex® isothermal box. ............................................................ 12 2.5.1. Animals ................................................................................................ 12 2.5.2. Embryo production ................................................................................ 12 2.5.3. Packaging and transport of embryos ........................................................ 12 2.5.4. Embryo Transfer ................................................................................... 13 2.6. Statistical analysis .................................................................................... 14 3. Results ....................................................................................................... 15 CAPÍTULO 1 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA A pecuária bovina desempenha um papel estratégico na segurança alimentar global, fornecendo carne e leite para uma população em constante crescimento (DAVIS; WHITE, 2020). No entanto, o setor enfrenta desafios como a demanda por maior eficiência produtiva, sustentabilidade ambiental e otimização do melhoramento genético (IDAMOKORO, 2023). Tecnologias reprodutivas avançadas têm sido fundamentais para atender a essas exigências, permitindo maior controle sobre a reprodução e a disseminação de material genético superior. Nesse contexto, a produção in vitro de embriões (PIVE) destaca-se como uma ferramenta essencial para acelerar o ganho genético, aumentar a produtividade e viabilizar a reprodução de animais de alto valor zootécnico. No entanto, para se obter bons resultados utilizando a PIVE, se faz necessário o controle minucioso de todas as etapas da técnica. Todos os fatores envolvidos no processo, desde a aspiração folicular até a transferência embrionária, desempenham um papel determinante na viabilidade e no potencial gestacional dos embriões (CHEBEL; DEMÉTRIO; METZGER, 2008; FERRAZ et al., 2016). Entre esses fatores, as condições de transporte dos embriões até os locais de transferência representam um aspecto crítico, ainda pouco explorado na literatura científica. A distância percorrida, o tempo utilizado no transporte de embriões e a temperatura utilizada para o transporte desses são pontos potencialmente limitantes à técnica, uma vez que podem impactam diretamente na taxa de sucesso (LOIOLA et al., 2014). O transporte de oócitos é embriões predominantemente realizado com o auxílio de incubadoras portáteis elétricas automáticas que permitem a manutenção de ovócitos e embriões em ambiente e temperatura ideais desde a maturação inicial até a inovulação nas receptoras (MAX et al., 2012). Apesar de eficazes, essas incubadoras apresentam desafios operacionais significativos, como alto custo de aquisição, necessidade contínua de energia elétrica, fragilidade em ambientes de campo e consequentemente, dificuldades logísticas para uso em larga escala. Em regiões remotas ou em países com infraestrutura limitada, essas restrições assumem um caráter ainda mais limitante, dificultam a disseminação da PIVE. Esse cenário evidencia a necessidade de alternativas de transporte mais acessíveis (CURRIN et al., 2021; SOUZA et al., 2021). Uma solução promissora para o transporte de embriões é o uso de caixas isotérmicas. Essas caixas, que estão validada e são empregadas para o transporte de uma variedade gametas e materiais biológicos (MALMGREN, 1998; FILHO et al., 2012; CUNHA et al., 2014; CAMARGO et al., 2024; LOPES, 2024), já vêm sendo adotadas empiricamente no transporte de embriões bovinos. Esses sistemas passivos utilizam materiais isolantes térmicos para manter uma temperatura estável ao longo do transporte, dispensando a necessidade de eletricidade e controle eletrônico. Essa modalidade de transporte tem o potencial de simplificar a logística, reduzir custos operacionais e ampliar o acesso à tecnologia PIVE. No entanto, a substituição das incubadoras portáteis por sistemas isotérmicos requer rigorosa validação científica, uma vez que os embriões produzidos por PIVE são particularmente sensíveis a oscilações térmicas, e tempos prolongados de transporte (PUELKER et al., 2010). Acknowledgements 457 The authors thank São Paulo State University (Júlio de Mesquita Filho), FMVZ-458 UNESP Botucatu-SP, for the technical support and infrastructure provided for this study. 459 We also thank the laboratory team for their assistance during the experiments. 460 We are grateful to BotuPharma (Botucatu, SP, Brazil) for their support and for 461 providing the production media, which were essential for conducting this study. 462 Finally, we express our gratitude to the collaborators and reviewers whose 463 suggestions contributed to the improvement of this manuscript. 464 465 466 467 468 469 470 471 6. References472 [1] Ferré LB, Kjelland ME, Strøbech LB, Hyttel P, Mermillod P, Ross PJ. Review: Recent473 advances in bovine in vitro embryo production: reproductive biotechnology history474 and methods. Animal 2020;14:991–1004.475 https://doi.org/10.1017/S1751731119002775.476 [2] Marques De Lima W, Mazzarollo Frata M, Rovani MT, Mondadori RG, Vieira AD,477 Ferreira R, et al. Current challenges and perspectives of in vivo and in vitro commercial478 embryo production of taurine and synthetic breeds 2023.479 https://doi.org/10.21451/1809-3000.RBRA2023.036.480 [3] Leite RF, Annes K, Ispada J, De Lima CB, Dos Santos ÉC, Fontes PK, et al. Oxidative481 Stress Alters the Profile of Transcription Factors Related to Early Development on in482 Vitro Produced Embryos. Oxid Med Cell Longev 2017;2017. 483 https://doi.org/10.1155/2017/1502489. 484 [4] Motta JCL, Hayden CB, Sala R V., Ross PJ, García-Guerra A. Advances in synchronization 485 and superstimulation for OPU/IVEP: optimizing oocyte quantity and quality. Reprod 486 Fertil Dev 2024;37. https://doi.org/10.1071/RD24143. 487 [5] Wiltbank M, Garcia-Guerra A, Sala R V, Fosada M, Carrenho-Sala L, Moreno JF. 200 488 Improving efficiency of embryo transfer (ET) programs by optimizing fertility and 489 management of recipients. J Anim Sci 2019;97:116–7. 490 https://doi.org/10.1093/JAS/SKZ122.206. 491 [6] Santos JEP, Cerri RLA, Sartori R. Nutritional management of the donor cow. 492 Theriogenology 2008;69:88–97. 493 https://doi.org/10.1016/J.THERIOGENOLOGY.2007.09.010. 494 [7] Heyman Y. Factors affecting the survival of whole and half-embryos transferred in 495 cattle. Theriogenology 1985;23:63–75. https://doi.org/10.1016/0093-691X(85)90073-496 1. 497 [8] Max MC, Santos GMG, Melo-Sterza FA, Silva-Santos KC, Morotti F, Basso AC, et al. In 498 vitro embryo production in sheep: Pregnancy after long periods of oocyte and embryo 499 transport. Small Ruminant Research 2012;105:286–9. 500 https://doi.org/10.1016/j.smallrumres.2012.03.004. 501 [9] Aparicio-Ruiz B, Gámiz P, Galán A, Remohí J. Embryo culture conditions under high 502 humidity significantly enhances blastocysts formation and quality according to an 503 automatic time-lapse algorithm 2019. 504 [10] Naranjo-Gómez JS, Uribe-García HF, Herrera-Sánchez MP, Lozano-Villegas KJ, 505 Rodríguez-Hernández R, Rondón-Barragán IS. Heat stress on cattle embryo: gene 506 regulation and adaptation. Heliyon 2021;7. 507 https://doi.org/10.1016/J.HELIYON.2021.E06570/ASSET/A6343D3B-51CF-4066-B029-508 4B685884200B/MAIN.ASSETS/GR1.JPG. 509 [11] Rivera RM, Hansen PJ. Development of cultured bovine embryos after exposure to 510 high temperatures in the physiological range. Reproduction 2001;121:107–15. 511 https://doi.org/10.1530/REP.0.1210107. 512 [12] Loiola MVG, Chalhoub M, Rodrigues AS, Ferraz PA, Bittencourt RF, Filho A de LR. 513 Validação de um programa de produção in vitro de embriões bovinos com transporte 514 de oócitos e de embriões por longas distâncias. Ciencia Animal Brasileira 2014;15:93–515 101. https://doi.org/10.5216/cab.v15i1.23327. 516 [13] Cavalieri FLB, Adreazzi MA, Colombo AHB, Emanuelli IP, Moreski DAB, Silva WM. 517 Estudo sobre o cultivo in vitro de embriões bovinos durante o trasnporte. Ars 518 Veterinaria 2015;31:07–11. https://doi.org/10.15361/2175-0106.2015V31N1P07-11. 519 [14] Marinho LSR, Untura RM, Morotti F, Moino LL, Rigo AG, Sanches B V, et al. Large-scale 520 programs for recipients of in vitro-produced embryos. 2012. 521 [15] Bilton RJ, Moore NW. Successful transport of frozen cattle embryos from New Zealand 522 to Australia. Reproduction 1977;50:363–4. https://doi.org/10.1530/JRF.0.0500363. 523 [16] Cavichioli Sebastião TR, de Souza Francisquini CD, Mungai Chacur MG. Efeito de meios 524 diluentes e sistemas de transporte no semen congelado analisado pelo método 525 computacional casa em touros nelore. Colloquium Agrariae 2018;14:145–50. 526 https://doi.org/10.5747/CA.2018.V14.N4.A257. 527 [17] D. Missio . Conservacao-de-foliculos-pre-antrais-de-felinos-domesticos-Felis-catus-528 refrigerados-por-24-horas-em-TCM-199-e-PBS 2014. 529 [18] Houghton PL, Lemenager RP, Horstman LA, Hendrix KS, Moss GE. Effects of body 530 composition, pre- and postpartum energy level and early weaning on reproductive 531 performance of beef cows and preweaning calf gain. J Anim Sci 1990;68:1438–46. 532 https://doi.org/10.2527/1990.6851438X. 533 [19] Ferrazza R de A, Garcia HDM, Schmidt EM dos S, Carmichael MM, Souza FF de, 534 Burchmore R, et al. Quantitative proteomic profiling of bovine follicular fluid during 535 follicle development. Biol Reprod 2017;97:835–49. 536 https://doi.org/10.1093/BIOLRE/IOX148. 537 [20] Oliveira CS, Varella R, Carolina S, Romano C, Biotécnicas Q, Reprodução D, et al. 538 Documentos 175 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Gado de Leite 539 Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento 2014. 540 [21] Baruselli PS, Ferreira RM, Filho MFS, Nasser LFT, Rodrigues CA, Bó GA. Bovine embryo 541 transfer recipient synchronisation and management in tropical environments. Reprod 542 Fertil Dev 2009;22:67–74. https://doi.org/10.1071/RD09214. 543 [22] Silva LKX, Reis AN, Silva AOA, Sousa JS, Souza AJO, Vale WG. Transporte de oócitos 544 bovinos em meio de maturação por diferentes períodos de tempo sem controle da 545 atmosfera gasosa. Arq Bras Med Vet Zootec 2011;63:74–80. 546 https://doi.org/10.1590/S0102-09352011000100012. 547 [23] Hasler JF. The current status and future of commercial embryo transfer in cattle. Anim 548 Reprod Sci 2003;79:245–64. https://doi.org/10.1016/S0378-4320(03)00167-2. 549 [24] Leese HJ. Quiet please, do not disturb: A hypothesis of embryo metabolism and 550 viability. BioEssays 2002;24:845–9. 551 https://doi.org/10.1002/BIES.10137;SUBPAGE:STRING:ACCESS. 552 [25] Baumann CG, Morris DG, Sreenan JM, Leese HJ. The quiet embryo hypothesis: 553 Molecular characteristics favoring viability. Mol Reprod Dev 2007;74:1345–53. 554 https://doi.org/10.1002/MRD.20604. 555 [26] Camargo GS, de Barros LD, Oliveira-Filho JP, Bromberger CR, Dias-Melicio LA, Alves dos 556 Santos L, et al. Evaluation of blastocyst re-expansion, quality in relation to storage 557 temperature, and sexing using blastocoel fluid after manual perforation with a hand-558 held needle involving in vivo produced equine embryos. Theriogenology 2024;219:39–559 48. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2024.02.012. 560 [27] Ramos ADA, Polisseni J, De Sá WF, Ferreira ADM, Camargo LSDA, Folhadella DDS, et al. 561 Effect of transportation on development of fresh or vitrified-warmed bovine embryos. 562 Revista Brasileira de Zootecnia 2006;35:2285–9. https://doi.org/10.1590/S1516-563 35982006000800012. 564 [28] Swain JE. Optimal human embryo culture. Semin Reprod Med 2015;33:103–17. 565 https://doi.org/10.1055/S-0035-1546423/ID/JR00931-22/BIB. 566 [29] Seidel GE., Seidel SM. Training manual for embryo transfer in cattle 1991:164. 567 [30] Madan ML, Das SK, Palta P. Application of reproductive technology to buffaloes. Anim 568 Reprod Sci 1996;42:299–306. https://doi.org/10.1016/0378-4320(96)01534-5. 569 [31] Mapletoft RJ, Hasler JF, Mapletoft RJ, Hasler JF. Assisted reproductive technologies in 570 cattle: A review Article in Revue Scientifique et Technique de l OIE · May 2005 Assisted 571 reproductive technologies in cattle: a review. vol. 24. 2005. 572 [32] Baruselli PS, Ferreira RM, Vieira LM, Souza AH, Bó GA, Rodrigues CA. Use of embryo 573 transfer to alleviate infertility caused by heat stress. Theriogenology 2020;155:1–11. 574 https://doi.org/10.1016/J.THERIOGENOLOGY.2020.04.028. 575 [33] Mukunoki A, Takeo T, Nakao S, Tamura K, Horikoshi Y, Nakagata N. Simple transport 576 and cryopreservation of cold-stored mouse embryos. Exp Anim 2020;69:423–9. 577 https://doi.org/10.1538/EXPANIM.20-0042. 578 579 580 CAPÍTULO 1 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Fisiologia reprodutiva da fêmea Bovina 2.1.1. Controle hormonal do ciclo estral 2.1.2. Dinâmica folicular e seleção do folículo dominante 2.1.3. Reserva ovariana e implicações na fertilidade 2.2. Reprodução assistida em bovinos 2.2.1 Importância da reprodução assistida para o melhoramento genético e produtividade pecuária 2.2.2 Papel da transferência de embriões e produção in vitro de embriões na eficiência reprodutiva e produtiva 2.3 Aspiração Folicular 2.3.1. Fatores que influenciam na qualidade oocitária 2.3.2. Critérios de seleção dos complexos cúmulos-oócitos para a PIVE 2.4. Produção in vitro de embriões 2.4.1. Maturação In Vitro 2.4.2. Fertilização In Vitro 2.4.3 Cultivo in vitro 2.5. Transporte de embriões bovinos e fatores críticos 2.5.1. Tipos de transporte de embriões bovinos 2.5.2. Temperatura para transporte de embriões bovinos 2.5.3. Meio de transporte 2.5.4. Tempo de duração do transporte 2.6. Transferência de embriões 2.6.1. Seleção e preparação de receptoras 2.6.2. Inovulação 3. CONSIDERAÇÕES FINAIS 4. HIPÓTESE E OBJETIVOS 4.1. Hipótese(s) 4.2. Objetivo(s) geral(s) 4.3. Objetivo(s) específico(s) 5. REFERÊNCIAS CAPÍTULO 2. ARTIGO CIENTÍFICO 2.1. Ethical aspects 2.2. Experimental design 2.3. Experiment 1: Validation of the isothermal box 2.4.1. Animals 2.4.2. Follicular aspiration 2.4.3. Recovery and selection of cumulus-oocyte complexes 2.4.4. In vitro maturation 2.4.5. In vitro fertilization 2.4.6. In vitro culture 2.4.7. Packaging and transport of embryos 2.4.8. In vitro assessment of embryos after simulated transport 2.5. Experiment 3: In vivo viability of bovine embryos following 6-hour simulated transport in the Botuflex® isothermal box. 2.5.1. Animals 2.5.2. Embryo production The procedures for follicular aspiration, selection of COCs, in vitro maturation of COCs, in vitro fertilization, and embryo in vitro culture followed the same protocols outlined in Exp. 2. On the 7th day of culture, the blastocyst rate, embryo stage,... 2.5.3. Packaging and transport of embryos 2.5.4. Embryo Transfer 2.6. Statistical analysis 3. Results