JULIANA SEMENSATO Derivados de Poli(L-Lisina) com Fosforilcolina para Transferência Gênica Não-Viral São José do Rio Preto 2014 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Campus de São José do Rio Preto JULIANA SEMENSATO Derivados de Poli(L-Lisina) com Fosforilcolina para Transferência Gênica Não-Viral Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química, junto ao Programa de Pós-Graduação em Química, Área de Concentração – Química Ambiental, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Orientador: Prof. Dr. Marcio José Tiera São José do Rio Preto 2014 JULIANA SEMENSATO Derivados de Poli(L-Lisina) com Fosforilcolina para Transferência Gênica Não -Viral Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química, junto ao Programa de Pós-Graduação em Química, Área de Concentração – Química Ambiental, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Comissão Examinadora Prof. Dr. Marcio José Tiera UNESP – São José do Rio Preto Prof. Dr. Miguel Jafelicci Junior UNESP – Araraquara Prof. Dr. Julio C. Fernandes UNIVERSITÉ DE MONTRÉAL – Montréal São José do Rio Preto 2014 Dedico este trabalho aos meus pais, Marcos e Célia, por todo amor e apoio constante, ao meu irmão Marcelo, por me incentivar sempre, e ao meu amor Elder, que esteve comigo nos melhores momentos e nos mais difíceis, sempre disposto a me ajudar. Vocês foram minhas inspirações e fortalezas. Eu amo vocês! Agradecimentos Primeiramente agradeço a Deus, que me guia e dá força e entusiasmo para sempre seguir em frente. Sem Ele em minha vida eu não conseguiria superar dificuldades, vencer obstáculos e acreditar que posso sempre aprender e evoluir como pessoa e profissional. Aos meus pais, Marcos e Célia e ao meu irmão Marcelo, que são o meu alicerce, minha fonte de inspiração, por me incentivar a buscar meus sonhos e me tornar uma pessoa melhor, por todo amor, dedicação, paciência e por sempre acreditarem em mim. Ao meu namorado Elder, por todo amor, companheirismo e paciência, que tornaram as dificuldades mais fáceis de serem superadas, fazendo do meu dia-a-dia mais feliz. Eu te amo! Ao Prof. Dr Marcio José Tiera, pela orientação, oportunidade, paciência, confiança, ensinamentos e por acreditar em mim e neste projeto. Sua contribuição foi imprescindível para a minha formação e realização deste trabalho. Ao Prof. Dr Julio C. Fernandes pela orientação, oportunidade, amizade, incentivo, confiança e todo o ensinamento transmitido. A oportunidade de estagiar em seu laboratório foi muito importante para mim, como pessoa e profissional. A Dra Qin Shi, ao Dr. Mohamed Bendehour e a querida Patrícia pela ajuda, excelente receptividade e por tornarem meus dias em Montréal muito agradáveis. A Prof. Vera pela amizade e energia contagiante e a Jô que me recebeu em sua casa com muito carinho. Aos amigos do Laboratório de Biomateriais e Nanotecnologia, vocês me acolheram de braços abertos, sempre dispostos a me ajudar e sou muito feliz em fazer parte desta equipe. Gostaria de agradecer em especial a M.ª Hellen e a Dr. Isadora, pela amizade, ajuda, atenção, disponibilidade, paciência e discussões. Aos inúmeros amigos que Rio Preto e Montréal me trouxeram, e aos meus “velhos” amigos de Novo Horizonte e Maringá que sempre me motivaram e apoiaram. A CAPES pela bolsa de mestrado e ao governo canadense pela bolsa ELAP (Programa Futuros Líderes nas Américas). É Proibido “É proibido chorar sem aprender, Levantar-se um dia sem saber o que fazer Ter medo de suas lembranças. É proibido não rir dos problemas Não lutar pelo que se quer, Abandonar tudo por medo, Não transformar sonhos em realidade. É proibido não demonstrar amor (...) (...) É proibido não tentar compreender as pessoas, Pensar que as vidas deles valem mais que a sua, Não saber que cada um tem seu caminho e sua sorte. É proibido não criar sua história, Deixar de dar graças a Deus por sua vida, Não ter um momento para quem necessita de você, Não compreender que o que a vida te dá, também te tira. É proibido não buscar a felicidade, Não viver sua vida com uma atitude positiva, Não pensar que podemos ser melhores, Não sentir que sem você este mundo não seria igual.” Pablo Neruda http://pensador.uol.com.br/autor/pablo_neruda/ RESUMO A terapia gênica baseada em vetores não virais, tais como aqueles que se utiliza de sistemas poliméricos, é uma proposta promissora para o tratamento de doenças que se manifestam devido alguma disfunção gênica. Entretanto, o maior desafio desta técnica é a transferência do material genético, e a maioria dos esforços focaliza o desenvolvimento de vetores eficientes que possam transportar e transferir o DNA de modo seguro e eficaz. Neste trabalho, buscou- se sintetizar derivados de Poli(L-Lisina) (PLL) introduzindo o grupo fosforilcolina (PC) nos grupos amino da PLL, procurando-se variar os graus de substituição, com o objetivo de melhorar as propriedades deste vetor. A caracterização dos derivados foi realizada por RMN de hidrogênio, FTIR-ATR e GPC. O grau de substituição foi determinado com as técnicas de RMN de hidrogênio e potenciometria. A modificação da PLL com PC aumentou a capacidade de tamponamento dos derivados substituídos, o que pode melhorar a eficiência de transfecção. Estudos de interação entre PLL e PLL-PC com o DNA plasmidial VR1412 foram realizados em dois pHs (pH 5,0 e 7,4) por meio das técnicas de espectroscopia de fluorescência, eletroforese em gel de agarose, espalhamento de luz dinâmico e potencial zeta. Os resultados mostraram que os derivados são capazes de formar poliplexos e que a interação depende do grau de substituição, do pH, e da razão de cargas (razão N/P: razão de mol de grupos amino (polímero) por mol de grupos fosfato (pDNA)). Os estudos de espalhamento de luz dinâmico mostraram a formação de nanopartículas com diâmetros de 150 a 300 nm em pH 5,0 e de 350 a 700 nm em pH 7,4. As partículas exibiram carga superficial positiva (~ +25 mV em pH 5,0 e ~ +10 mV em pH 7,4), propriedade importante no processo de internalização dos poliplexos por endocitose. A viabilidade celular utilizando o ensaio colorimétrico com o MTS mostrou que proporções crescentes de PC podem diminuir a citotoxicidade das nanopartículas, e a CI50 dos polímeros sintetizados mostraram que a citoxicidade de PLL diminui favorecendo o processo de transfecção. A eficiência do processo de transfecção “in vitro” mostrou-se dependente do grau de substituição, e foi fortemente influenciada pela razão N/P, sendo que todos os derivados apresentaram eficiência de transfecção comparável ao vetor comercial LipofetaminaTM2000. Portanto, verificou-se que a substituição por PC permitiu preparar nanopartículas carregadas positivamente em pH 7,4 com elevada estabilidade coloidal e baixa citotoxicidade “in vitro” e ainda pôde-se estabelecer as condições ideais para o uso das mesmas como possíveis vetores não-virais aplicáveis à transferência gênica. Palavras chaves: Poli(L-Lisina). Fosforilcolina. Nanopartículas. Transfecção Gênica. pDNA. β-gal. ABSTRACT Gene therapy based on non-viral vectors, such as those that utilize polymerics systems, is a promising treatment for diseases that arise due some genetic disorder. However the challenge of using this technique is the transfer of the genetic material and most of the efforts have focused on the development of effective vectors to efficiently deliver the DNA into the cells. In this work, the main purpose was to synthesize PLL derivatives containing increasing proportions of the group phosphorylcholine (PC), aiming to improve the PLL properties as a non viral vector. The derivatives were characterized by ¹H NMR, FTIR-ATR and GPC techniques. The degree of substitution was determined by ¹H NMR and potentiometry. The buffering capacity was evaluated and showed the grafting with PC groups increased the buffering capacity, which may improve the transfection efficiency. The interaction between PLL and PLL-PC derivatives and the plasmid VR 1412, was studied at two pH values (pH 5.0 and 7.4) by fluorescence, agarose gel electrophoresis, dynamic light scattering and zeta potential techniques. The results showed that all derivatives were able to form polyplexes depending on the degree of substitution, pH and the charge ratio (N/P, the ratio of amino groups to phosphate groups from the pDNA). Nanoparticles prepared using the coacervation process showed sizes varying from 150 to 300 nm at pH 5.0 and from 350 to 700 nm at pH 7.4. The particles exhibited positives surface charges (~ +25 mV at pH 5.0 and ~ +10 mV at pH 7.4) an important property for promoting the internalization process by endocytosis. Cell viability using the MTS colorimetric assay showed that increasing proportions of PC groups can reduce the cytotoxicity of nanoparticles, and IC50 values for the sinthesized polymers were graphically determined. The in vitro transfection efficiencies were shown to depend on the degree of substitution and N/P ratio and all the derivatives showed efficiency comparable to commercial vector LipofetamineTM2000. Therefore, it was found that the substitution of phosphorylcholine allowed prepare positively charged nanoparticles at pH 7.4 with high colloidal stability and low cytotoxicity in vitro and can still establish ideal conditions for the use of the same as possible non-viral vectors applicable to gene transfer. Keywords: Poly(L-Lysine). Phosphorylcholine. Nanoparticles. Genic Transfection. pDNA. β-gal. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Indicações clínicas referentes aos ensaios na área de terapia gênica até junho de 2013. Figura adaptada de “The Journal of Gene Medicine”, 2013. (http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical).........................................................................17 Figura 2. Construção de um vetor viral para a Terapia Gênica. (Retirada de LINDEN, 2010).........................................................................................................................................18 Figura 3. Vetores utilizados em ensaios clínicos. Figura adaptada de “ The Journal of Gene Medicine”, junho de 2013 http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical)................................19 Figura 4. Representação esquemática do processo de endocitose, formação do endossomo e mecanismo de liberação intracelular de pDNA pelo mecanismo “esponja de prótons.......................................................................................................................................26 Figura 5. Estrutura química do policátion PLL.......................................................................27 Figura 6. Estrutura química do grupo substituinte fosforilcolina gliceraldeído (PC)..............29 Figura 7. Representação esquemática do mecanismo de não-trombogenicidade observado para o polímero MPC. (Adaptado de IWASAKI e ISHIHARA, 2005)....................................30 Figura 8. Mecanismo da síntese de modificação da PLL com PC via aminação- redutiva......................................................................................................................................34 Figura 9. (A) Estrutura dos derivados de PLL-PC: hidrogênios utilizados na determinação do grau de substituição em vermelho. (B) Espectro de RMN de ¹H representativo dos derivados de PLL-PC (PLL-PC7,5%).......................................................................................................37 Figura 10. Representação esquemática do ensaio com EtBr em meio aquoso para estudo da interação de PLL e seus derivados com pDNA.......................................................................40 Figura 11. (A) Estrutura química da Fosforilcolina Gliceraldeído contendo as atribuições dos sinais dos hidrogênios. (B) Espectro de RMN de ¹H do PC com as respectivas atribuições, obtido em D2O/DCl (1:100) a 25 °C com frequência de 500 MHz..........................................45 Figura 12. Espectro de FTIR-ATR para o composto Fosforilcolina Gliceraldeido (PC)...........................................................................................................................................46 Figura 13. Representação da síntese dos derivados zwiteriônicos de PLL substituídos pelo grupo PC...................................................................................................................................47 Figura 14. (A) Estrutura genérica dos derivados PLL-PC com identificação dos prótons utilizados na determinação do grau de substituição. (B) Espectros de RMN de ¹H do grupo http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical) substituinte PC, da Poli(L-Lisina) e seus derivados modificados, PLL-PC7,5% e PLL-PC20% e PLL-PC40% obtidos em D2O/DCl (1:100) a 25 °C com frequência de 500 MHz................48 Figura 15. Espetros de FTIR-ATR para a PLL e seus derivados modificados com PC com diferentes graus de substituição................................................................................................49 Figura 16. Titulação potenciométrica de PLL-PC7,5% para determinação do grau de substituição................................................................................................................................50 Figura 17. Titulação potenciométrica de PLL-PC20% para determinação do grau de substituição................................................................................................................................51 Figura 18. Titulação potenciométrica de PLL-PC40% para determinação do grau de substituição................................................................................................................................51 Figura 19. Curva de calibração utilizando padrões de massa molar monodisperso no intervalo de 6200 a 805000 Da................................................................................................................53 Figura 20. Curva de distribuição de massa molar da PLL e seus derivados modificados com o grupo zwiteriônico PC..............................................................................................................54 Figura 21. Capacidade de tamponamento da PLL e seus derivados em solução de NaCl 150 mmol.L-1 titulado com HCl.......................................................................................................55 Figura 22. Titulação do complexo pDNA-EtBr por PLL e PLL substituídas com grupos PC em tampão acetato, pH 5,0 e força iônica de 150 mmol.L-1 a 25 °C........................................56 Figura 23. Titulação do complexo pDNA-EtBr por PLL e PLL substituídas com grupos PC em tampão fosfato, pH 7,4 e força iônica de 150 mmol.L-1 a 25°C.........................................57 Figura 24. Eletroforeses em gel de agarose dos poliplexos PLL/pDNA e PLL-PC/pDNA em tampão acetato, pH 5,0 e força iônica de 150 mmol.L-1 (A) PLL; (B) PLL-PC7,5%; (C) PLL- PC20%; (D) PLL-PC40%.........................................................................................................59 Figura 25. Eletroforeses em gel de agarose dos poliplexos PLL/pDNA e PLL-PC/pDNA em tampão fosfato pH 7,4 e força iônica de 150 mmol.L-1. (A) PLL; (B) PLL-PC7,5%; (C) PLL- PC20%; (D) PLL-PC40%.........................................................................................................60 Figura 26. Diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas de PLL/pDNA e PLL-PC/pDNA em função da razão N/P em tampão acetato, pH 5,0 e força iônica 150 mmol.L-1.........................61 Figura 27. Potencial zeta das nanopartículas formadas em função da razão N/P em tampão acetato, pH 5,0 e força iônica 150 mmol.L-1.............................................................................63 Figura 28. Diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas de PLL/pDNA e PLL-PC/pDNA em função da razão N/P em tampão fosfato, pH 7,4 e força iônica de 150 mmol.L-1...........................64 Figura 29. Potencial zeta das nanopartículas formadas em função da razão N/P em tampão fosfato, pH 7,4 e força iônica de 150 mmol.L-1.........................................................................64 Figura 30. Diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas de PLL/pDNA e PLL-PC/pDNA na razão N/P 3,0, tampão fosfato, pH 7,4 e força iônica de 150 mmol.L-1 em função do tempo (minutos)...................................................................................................................................65 Figura 31. Estrutura do sal de tetrazólio MTS e seu produto formazana................................66 Figura 32. Viabilidade celular relativa de células HeLa em função da concentração de PLL e PLL substituídas com grupos PC..............................................................................................67 Figura 33. Viabilidade celular relativa de células HeLa em função de diferentes razões N/P para as nanopartículas de PLL/pDNA e PLL-PC/pDNA, preparadas em pH 5,0 e força iônica de 150 mmol.L-1.........................................................................................................................69 Figura 34. Viabilidade celular relativa de células HeLa em função de diferentes razões N/P para as nanopartículas de PLL/pDNA e PLL-PC/pDNA, preparadas em pH 5,0 e força iônica de 150 mmol.L-1.........................................................................................................................70 Figura 35. Eficiência de transfecção “in vitro” em células HeLa para as nanopartículas formadas pela PLL e seus derivados com o DNA plasmidial VR1412, avaliada em pH 7,4 e força iônica de 150 mmol.L-1. Valores de expressão da β-gal (pg)/ proteínas totais (mg) em função da razão N/P, (n=3; *** p < 0,0001).............................................................................71 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Vantagens e desvantagens dos principais vetores virais utilizados na terapia gênica anti-câncer (Adaptada de Ortiz et al., 2012).............................................................................20 Tabela 2. Polímeros sintéticos e naturais utilizados como vetores não virais em transfecção gênica (Adaptada de Hosseinkhani et al., 2013).......................................................................24 Tabela 3. Grau de substituição dos derivados substituídos com PC por meio das técnicas de RMN de ¹H e potenciometria....................................................................................................51 Tabela 4. Valores de massa molar ponderal média (Mw), massa molar numérica média (Mn) e índice de polidispersividade (Mw/Mn) para PLL e seus derivados, obtidos por cromatografia de permeação em gel (GPC).....................................................................................................53 Tabela 5. Valores de CI50 (μg.mL-1) para PLL, derivados substituídos com fosforilcolina e o lipídeo catiônico comercial LipofectaminaTM2000...................................................................67 LISTA DE ABREVIATURAS BCA Ácido Bicinconínico CI50 Concentração na qual ocorre 50% de inibição da viabilidade celular CMV Citomegalovírus ctDNA DNA de Timo de Bezerro DLS Espalhamento de Luz Dinâmico DMEM Meio de cultura celular Dulbecco Mem DEAE-dextrana Dietilaminoetil dextrana EtBr Brometo de Etídeo FBS Soro Fetal Bovino FTIR-ATR Espectroscopia de Infravermelho por Reflectância Total Atenuada GPC Cromatografia de Permeação em Gel GS Grau de Substituição Mn Massa Molar Numérica média Mw Massa Molar Ponderal média Mw/Mn Índice de Polidispersividade MPC Metacriloiloxietil fosforilcolina MTS 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4- sulfofenil)-2H-tetrazólio nm Nanômetros N/P Razão de grupos amino do polímero (N) por grupos fosfato de DNA (P) PAMAM Poliamidoamina PBS Tampão Fosfato Salino PC Fosforilcolina gliceraldeído pDNA DNA plasmidial PDMAEMA Poli[2-(dimetilamino)etil metacrilato] PTMAEMA Poli(trimetilamino)etil metacrilato PEG Poli(etileno)glicol PEI Polietilenoimina PLL Poli(L-Lisina) PLL-PC7,5% Poli(L-Lisina) modificada com fosforilcolina na proporção 7,5% PLL-PC20% Poli(L-Lisina) modificada com fosforilcolina na proporção 20% PLL-PC40% Poli(L-Lisina) modificada com fosforilcolina na proporção 40% PMS Metasulfato de Fenazina PS Penicilina- estreptomicina RMN de ¹H Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio β-gal β-galactosidase SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO...........................................................................................................16 1.1 Terapia gênica.............................................................................................................16 1.2 Terapia gênica viral....................................................................................................17 1.3 Terapia gênica não-viral.............................................................................................21 1.4 Vetores poliméricos utilizados em terapia gênica não viral....................................22 1.5 Poli(L-Lisina)...............................................................................................................27 1.6 Fosforilcolina gliceraldeído........................................................................................28 2 OBJETIVOS................................................................................................................31 2.1 Objetivos gerais...........................................................................................................31 2.2 Objetivos específicos...................................................................................................31 3 METODOLOGIA.......................................................................................................32 3.1 Materiais......................................................................................................................32 3.2 Síntese de fosforilcolina gliceraldeído.......................................................................32 3.3 Síntese dos derivados..................................................................................................33 3.4 Caracterização dos derivados de PLL modificados com fosforilcolina (PLL- PC)............................................................................................................................................36 3.4.1 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de ¹H) e espectroscopia de infravermelho por reflectância total atenuada (FTIR-ATR)........................36 3.5 Determinação do grau de substituição por RNM de ¹H..........................................37 3.6 Determinação do grau de substituição por potenciometria....................................38 3.7 Determinação da massa molar e polidispersividade dos polímeros por cromatografia de permeação em gel (GPC).........................................................................38 3.8 Determinação da capacidade de tamponamento......................................................39 3.9 Amplificação e purificação do plasmídeo (pDNA)...................................................39 3.10 Preparação de nanopartículas poliméricas com pDNA por coacervação..............39 3.11 Avaliação da estabilidade e tamanho das nanopartículas em função de diferentes condições experimentais.........................................................................................................40 3.11.1 Estudo da interação pDNA-Poli(L-Lisina) e seus derivados utilizando-se o ensaio com brometo de etídio...................................................................................................40 3.11.2 Eletroforese em gel de agarose......................................................................................41 3.11.3 Espalhamento de luz dinâmico (DLS) e medidas de potencial zeta.............................42 3.12 Estudos de citotoxicidade e transfecção “in vitro”...................................................42 3.12.1 Estudo da citotoxicidade dos polímeros........................................................................42 3.12.2 Estudo da citotoxicidade das nanopartículas.................................................................43 3.12.3 Estudos de eficiência de transfecção “in vitro” utilizando o plasmídeo VR1412.....................................................................................................................................44 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................45 4.1 Síntese e caracterização de fosforilcolina gliceraldeído (PC)..................................45 4.2 Síntese e caracterização dos derivados PLL-PC por RMN de ¹H e FTIR- ATR..........................................................................................................................................47 4.3 Determinação do grau de substituição por potenciometria....................................50 4.4 Determinação da massa molar e polidispersividade por cromatografia de permeação em gel (GPC)........................................................................................................52 4.5 Determinação da capacidade de tamponamento......................................................54 4.6 Avaliação da estabilidade e tamanho das nanopartículas em função de diferentes condições experimentais.........................................................................................................55 4.6.1 Estudo da interação pDNA-Poli(L-Lisina) e seus derivados utilizando-se o ensaio com brometo de etídio......................................................................................................................55 4.6.2 Estudo da interação pDNA-Poli(L-Lisina) e seus derivados por meio de eletroforese em gel de agarose......................................................................................................................58 4.6.3 Espalhamento de luz dinâmico (DLS) e medidas de potencial zeta das nanopartículas preparadas com o pDNA...........................................................................................................61 4.7 Estudos de citotoxicidade e transfecção “in vitro”...................................................65 4.7.1 Estudos de citotoxicidade dos polímeros......................................................................65 4.7.2 Estudos de citoxicidade das nanopartículas..................................................................68 4.7.3 Estudos de transfecção “in vitro” utilizando o plasmídeo VR1412..............................70 5 CONCLUSÕES...........................................................................................................73 REFERÊNCIAS..........................................................................................................75 16 1 INTRODUÇÃO 1.1 Terapia gênica A terapia gênica pode ser definida como o tratamento de doenças hereditárias ou adquiridas que se manifestam devido alguma desordem genética, por meio da transferência de material genético para dentro de células específicas de um paciente, com o objetivo de substituir, corrigir ou suplementar genes ausentes ou defeituosos, responsáveis pelo desenvolvimento destas doenças. Assim, esta técnica baseia-se essencialmente no transporte, transferência e expressão de material genético na célula alvo (CRYSTAL, 1995). Portanto, trata-se de uma intervenção terapêutica em nível molecular (ORTIZ et al., 2012). Este tipo de tratamento pode ser dividido em três categorias, de acordo com a finalidade da ação do material genético transferido: correção, quando o material genético funcional transferido tem a finalidade de corrigir genes não funcionais ou deletérios; complementação, quando o gene funcional transferido apenas complementa genes celulares sem modificações danosas; ou adição, quando há o acréscimo de gene funcional transferido, devido à ausência do gene original no genoma (MATTE e GIUGLIANI, 2004). A terapia gênica inicialmente foi direcionada para o tratamento de doenças hereditárias monogênicas, como fibrose cística, hemoglobinopatias e distrofia muscular. No entanto, frente à atual e elevada ocorrência de doenças adquiridas, tais como o câncer e doenças cardiovasculares, os esforços foram redirecionados e estão concentrados para o tratamento destes tipos de enfermidades, cuja incidência na população mundial é superior quando comparada com a frequência de doenças monogênicas (NARDI et al., 2002). Neste aspecto, um levantamento entre os protocolos clínicos referentes aos ensaios na área de terapia gênica até marçoo de 2014, demonstra que 63,8% das indicações clínicas são para o tratamento de câncer, seguido de doenças monogênicas (8,9%) e doenças cardiovasculares (8,4%) (Figura 1). 17 Figura 1. Indicações clínicas referentes aos ensaios na área de terapia gênica até março de 2014. Figura adaptada de “The Journal of Gene Medicine”, 2013. (http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical). O maior desafio relacionado à terapia gênica é a transferência do material genético para o interior da célula alvo e a maioria dos esforços se concentra na busca de vetores eficientes que possam transportar e transferir o DNA de modo seguro e eficaz (SOMIA et al., 2000). Os agentes terapêuticos responsáveis pelo transporte e liberação intracelular de genes são denominados vetores e podem ser subdivididos em duas categorias: vetores virais e vetores não virais. 1.2 Terapia gênica viral A terapia gênica viral utiliza vetores de natureza viral como veículos transportadores do material genético terapêutico. Basicamente, vírus são organismos especializados em invadir células hospedeiras carregando seu material genético e nelas iniciar o processo de expressão gênica. A produção de vetores virais para a terapia gênica se baseia na remoção dos genes responsáveis pelo mecanismo de multiplicação/replicação viral e dos que conferem o caráter patogênico, mantendo somente os genes necessários para a invasão das células alvo, regiões http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical 18 do DNA definidas como Repetições Terminais Invertidas (ITR) que são suficientes para o ciclo de vida do vírus, com consequente inserção do gene terapêutico. Este processo ocorre graças às novas tecnologias baseadas em DNA recombinante e está representado na figura abaixo (Figura 2) (LINDEN, 2010). Figura 2. Construção de um vetor viral para a Terapia Gênica. Na figura, o vírus adenoassociado é utilizado como exemplo (Retirada de LINDEN, 2010). Por possuirem esta alta capacidade de transportar e expressar o material genético exógeno em células hospedeiras (células alvo), os vetores virais são selecionados para a maioria dos testes clínicos. Entre os vetores virais mais amplamente estudados estão os vetores adenovirais, vetores retrovirais e os vetores adenovirais. Dados compilados na base de dados da revista “The Journal of Gene Medicine” (www.wiley.co.uk/genmed/clinica/) mostram que aproximadamente 1370 ensaios clínicos realizados até março de 2014 utilizaram vetores virais, como veículos carreadores de material genético (Figura 3). http://www.wiley.co.uk/genmed/clinica/ 19 Figura 3. Vetores utilizados em ensaios clínicos. Figura adaptada de “The Journal of Gene Medicine”, março de 2014 (http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical). Ortiz e colaboradores (2012) realizaram um levantamento a respeito de patentes recentes registradas para o tratamento de câncer utilizando terapia gênica e observaram uma alta ocorrência de vetores virais como carreadores gênicos. Baseado em seu levantamento, foi possível listar (Tabela 1) as vantagens e desvantagens dos principais vetores virais utilizados na terapia gênica anti-câncer. http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical 20 Tabela 1. Vantagens e desvantagens dos principais vetores virais utilizados na terapia gênica anti-câncer. Fonte: Adaptada de Ortiz et al., 2012. Desta forma, diante dos resultados promissores envolvendo vetores virais, testes em humanos foram realizados. Em 1999, a Universidade da Pensilvânia (Filadélfia), realizou o tratamento de Jesse Gesinger, paciente que sofria de deficiência de Ornitina Transcarbamoilase (OTC), distúrbio mais comum do ciclo da uréia. Para o tratamento desta enfermidade, foi utilizado um tipo de adenovírus com deleções E1 e E4. Após quatro dias do tratamento, Gessinger morreu de falência múltipla dos orgãos. O laudo da autópsia mostrou que apesar da administração do vetor ter sido direcionada ao fígado, o principal orgão que realiza o ciclo da uréia, o vetor também foi encontrado na corrente sanguínea, e uma alta acumulação do mesmo foi encontrado no baço, linfonodos e na medula óssea, causando uma reação inflamatória grave, que levou à coagulação intravascular disseminada, dificuldade respiratória aguda e falência múltipla dos orgãos (THOMAS et al., 2003). 21 Em 2000 um grupo de pesquisa do “Hospital Necker” de Doenças Infantis em Paris, liderado por Alain Fisher publicou o primeiro artigo referente ao sucesso no tratamento de uma doença genética, a Síndrome da Imunodeficiência Combinada Grave ligada ao cromossomo X (SCID-IX) que afeta exclusivamente homens, utilizando vetor retroviral. No entanto, um dos pacientes de Fisher não resistiu ao tratamento e o acompanhamento do quadro clínico das crianças tratadas, atualmente (2014) com idade entre 10 e 13 anos, mostrou o desenvolvimento de células T decorrente do surgimento de leucemia, resultado direto de recombinação do vetor retroviral (THOMAS et al., 2003; GINN et al., 2013). Diante destes acontecimentos, apesar de os vetores virais possuirem a vantagem de serem mais eficientes como agentes de transfecção gênica, são considerados pouco seguros devido à possibilidade de mutações e recombinação, possibilidade de resposta imunitária e inflamatória, além de apresentarem limitação no tamanho do DNA plasmidial a ser incorporado e dificuldade na sua produção em grande escala (KIKUSHI et al., 1999). Desta forma, por estas questões de segurança, limitações no uso de alguns vetores virais e na tentativa de se melhorar a viabilidade da terapia gênica, novas estratégias foram desenvolvidas como alternativa aos vetores virais, dando origem a uma nova classe de vetores, os vetores não virais. 1.3 Terapia gênica não viral As terapias viral e não viral compartilham da mesma premissa, em que graças ao sequenciamento do genoma humano e aos avanços na identificação de numerosos genes que estão envolvidos em processos celulares e doenças genéticas, foi possível a manipulação de genes com o objetivo de corrigí-los, substituí-los ou suplementá-los buscando em níveis moleculares a intervenção terapêutica. (GASCÓN et al., 2013). A introdução de material genético exógeno dentro de células alvo, para expressar o gene terapêutico, pode ser realizado utilizando vetores não virais. Os vetores não virais apesar de serem menos eficientes do que os vetores virais quanto a capacidade de transfecção gênica, exibem algumas vantagens como fácil produção e manipulação, baixo custo e maior segurança ao paciente (MOHAN et al., 2012). Neste tipo de sistema carreador, destacam-se os polímeros, lipídeos, lipossomas, proteínas e peptídeos que possuem carga líquida positiva. O caráter catiônico do sistema 22 carreador propicia a interação eletrostática com as cargas negativas do DNA (grupo fosfato) formando um complexo vetor-DNA, que promove a proteção do mesmo contra a degradação, a estabilização e o mascaramento das cargas negativas do DNA incorporado (ELOUAHABI e RUYSSCHAERT, 2005). Segundo Nardi et al. (2002) e Pack et al. (2005) o vetor ideal deve possuir algumas características altamente desejáveis para que consiga vencer as barreiras extracelulares e intracelulares e liberar eficientemente o gene de interesse no núcleo. Entre as características desejadas estão, garantir que a técnica não comprometa a saúde do paciente; ser não patogênico; possuir toxicidade desprezível e baixa imunogenicidade; proteger o DNA; expressar o material genético de forma estável; direcionar para tipos específicos de células; possibilitar o regulamento da expressão do gene exógeno no tempo e/ou na quantidade adequada; apresentar baixo custo e ser de fácil produção e manipulação. Portanto, há mais de 20 anos, uma nova área de pesquisa foi iniciada buscando-se novos vetores não virais baseados em lipídeos e polímeros, com o objetivo de se obter as características citadas acima. Para isto, várias pesquisas focalizam a síntese de novos polímeros sintéticos, bem como a modificação de polímeros naturais visando sobrepor as barreiras inerentes a uma via específica de administração, o reconhecimento de superfícies celulares, a captação celular, a sensibilidade para responder ao pH do ambiente intracelular, o escape endossomal e portanto, desempenhar eficientemente o papel funcional do vetor (PACK et al., 2005). 1.4 Vetores poliméricos utilizados em terapia gênica não viral Inúmeros polímeros sintéticos e naturais estão sendo estudados como vetores não virais. A natureza catiônica destes carreadores possibilitam a interação eletrostática com os grupos fosfato presentes na cadeia de DNA para formar complexos polímero-DNA, os denominados poliplexos. Estes poliplexos em geral se apresentam em formas compactas e na maioria das vezes em escala nanométrica (1-1000 nm). Entre eles, destacam-se a polietilenoimina (PEI) (CHEN et al., 2013), polimetacrilatos (SUN et al., 2013) poliamidoamina (PAMAM) (CHEN et al., 2012), quitosana (PICOLA, 2009) e Poli(L-Lisina) (BENNS et al., 2000). O PEI é um dos polímeros mais estudados em terapia gênica. PEI é produzido pela polimerização de aziridina e possui uma elevada densidade de cargas positivas devido aos 23 seus grupos amino protonáveis, o que lhe confere alta capacidade de tamponamento e alto escape endossomal, tornando-o um vetor promissor (GASCÓN et al., 2013). Em estudos “in vitro” com células epiteliais da córnea humana e córnea de coelho, o PEI mostrou uma excelente liberação do transgene da β-galactosidade quando revestido por ácido hiálurônico de massa molecular inferior a 10 kDa (HORNOF et al., 2008; MOHAN et al., 2012). Poliplexos contendo PEI tem sido direcionados à células específicas pela conjugação de alguns ligantes, como galactose, manose, anticorpos e transferrina (PACK et al., 2005). Além disso, autores reportaram melhores características do PEI por meio da inserção de poli(etileno)glicol (PEG), sendo que esta modificação aumentou a eficiência de transfecção e reduziu sua citotoxicidade. (GASCÓN et al., 2013). Polimetacrilatos são polímeros catiônicos baseados em unidades vinílicas, capazes de condensar o DNA em partículas nanométricas (GASCÓN et al., 2013). Poli[2-(dimetilamino) etil metacrilato] (PDMAEMA) foi investigado quanto à influência do comprimento da cadeia polimérica na citotoxicidade, e utilizando concentrações variadas (10-110 μg.mL-1) observou- se que PDMAEMA linear é citotóxico frente às células HepG2, e esta citotoxicidade aumenta à medida que a concentração do polímero e o comprimento da cadeia aumenta (CAI et al., 2011; YUE e WU, 2013). Qi e colaboradores (2009) demonstraram que dendrímeros de poli(amidoamina) (PAMAM) de geração 5 e 6 (G5 e G6) conjugados com PEG podem melhorar a eficiência de transfecção “in vitro” e “in vivo”. Recentemente, Yue Chen e colaboradores (2012) relataram a utilização do sistema de gene suicida mediado por dendrímeros de poli(amidoamina) de geração 5, G5-PAMAM-D, o qual foi eficaz na diminuição da proliferação das células PC-3, inibiu o crescimento do tumor “in vivo” e induziu a apoptose das células (CHEN et al., 2012). A quitosana é um polissacarídeo biodegradável, obtido por meio da desacetilação alcalina da quitina. Este biopolímero vem sendo estudado como vetor em terapia gênica e modificações em sua estrutura permitem melhorar suas propriedades físico-químicas. Quitosanas modificadas com grupos imidazol apresentaram maior capacidade de tamponamento e a solicitação de patentes referentes a este derivado modificado vem sendo requeridas (KIM et al., 2008; ROY et al., 2009). Wang e colaboradores (2008) mostraram que a conjugação de ácido urocânico com quitosana permite a obtenção de um derivado com uma alta taxa de transfecção comparável ao vetor comercial LipofectaminaTM 2000 (WANG et al., 2008). A LipofectaminaTM 2000 é um vetor não viral comercial baseado em lipídeo catiônico mais comumente utilizado em ensaios de transfecção gênica (CLEMENTS et al., 2007). 24 Contendo subunidades de lipídeos catiônicos, pode formar lipossomos quando em meio aquoso, e por meio de interações eletrostáticas é capaz de interagir e complexar cadeias aniônicas de DNA, formando os denominados lipoplexos (DODDS et al., 1998). Apresenta alta eficiência de transfecção e altos níveis de expressão de transgene em inúmeros tipos de células mamárias, tais como células musculares de ratos (C2C12) (DODDS et al., 1998), neurônios pós-mitóticos, hepatócitos primários de ratos e células embrionárias de rim humano (H-293) (DALBY et al., 2004) e células do estroma da medula óssea (BMSC) (CLEMENTS et al., 2007). Hosseinkhani e colaboradores (2013) fizeram um levantamento acerca dos polímeros sintéticos e naturais que vem sendo utilizados em estudos visando à aplicação em terapia gênica, e permitiu sumarizá-los na Tabela 2. Tabela 2. Polímeros sintéticos e naturais utilizados como vetores não virais em transfecção gênica. 25 Adaptada de Fonte: Adaptada de Hosseinkhani et al., 2013 Uma das principais características de todos os vetores baseados em polímeros catiônicos é a alta densidade de carga positiva, que torna possível condensar cadeias de DNA (carregadas negativamente) devido a atrações eletrostáticas, formando os chamados poliplexos. Estudos tem demonstrado que poliplexos são captados pela membrana celular via endocitose, como detalhado na Figura 4. 26 Figura 4. Representação esquemática do processo de endocitose, formação do endossomo e mecanismo de liberação intracelular de pDNA pelo mecanismo “esponja de prótons”. A Figura 4 ilustra as etapas envolvidas na captação celular e a consequente transfecção do DNA mediada por policátions. Entretanto o rompimento do endossomo e o escape do DNA ainda é um mecanismo não esclarecido. Entre as propostas de como ocorre o escape endossomal, o mecanismo mais aceito é o denominado “esponja de prótons”. Este mecanismo foi proposto inicialmente por Boussif e colaboradores (1995) para explicar a alta taxa de transfecção do PEI. Esta alta taxa de transfecção é atribuída a sua elevada capacidade de tamponamento em uma ampla faixa de pH, resultado da presença de grupos amino protonáveis. Sendo assim, poliplexos presentes no endossomo podem absorver os prótons que são bombeados para dentro desta organela, e devido à protonação e consequentemente a repulsão dos grupos amino protonados, ocorre o intumescimento do polímero. Além disso, para evitar um aumento da densidade de cargas dentro do endossomo ocasionado pelo fluxo de prótons, ocorre também um fluxo equivalente de íons cloreto (Cl-). A entrada de ambos, prótons e íons cloreto, aumenta a osmolaridade do endossomo e causa uma maior absorção de água. A combinação do intumescimento do 27 polímero e do inchamento osmótico do endossomo leva a desestabilização do mesmo e resulta no seu rompimento, com consequente liberação do seu conteúdo no citoplasma (BOUSSIF et al., 1995; FUNHOFF et al., 2004). 1.5 Poli(L-Lisina) A Poli(L-Lisina) (PLL) (Figura 5) foi um dos primeiros policátions estudados para a liberação de genes (ELIYAHU et al., 2005). Possui unidades repetitivas do aminoácido lisina, unidos por ligações peptídicas, portanto é biodegradável, propriedade que a torna especialmente adequada para uso “in vivo”. Entretanto o polímero exibe uma toxicidade considerada de modesta a alta (LUTEN et al., 2008). Nos últimos cinco anos, novas estratégias tem sido adotadas a fim de se melhorar as propriedades da PLL, entre elas modificações em sua estrutura (MIYATA et al., 2008) e a utilização de ligantes para receptores celulares (BARATI et al., 2006; NIE et al., 2009). Outras alternativas que vem sendo utilizadas são a ligação de grupos endossomolíticos à PLL para aumentar a liberação intracelular (SHIM e KWON, 2010). Figura 5. Estrutura química do policátion PLL. Neste tema, Zhang e colaboradores (2010) relataram que nanopartículas baseadas em PLL (PLLRP), utilizando o vetor plasmidial SPT7pTL que expressa o fator de transcrição nuclear humano SPT7 e o hormônio estimulante de alfa-melanócitos (α-MSH), são eficientes N H H N (CH2)4 NH2 O (CH2)4 NH2 N H O (CH2)4 NH2 O n 28 na transfecção gênica em células B16-F1, concomitantemente a estimulação da síntese da melanina. Nanoparículas de PLL conjugada com ácido palmítico (PA) foram eficazes na transfecção de DNA plasmidial em células estromáticas da medula óssea, e apresentaram melhor performance quanto à proteção do DNA por nucleases do que a formulação comercial LipofectaminaTM2000. Além disso, em alguns casos a eficiência de transfecção de PLL-PA foi da ordem de 2 a 5 vezes maior que a eficácia da LipofectaminaTM2000 (CLEMENTS et al., 2007). A conjugação de PLL com PEG proporciona a estabilização estérica da nanopartícula e previne a agregação e interação da mesma com proteínas do soro fisiológico. Nanopartículas compostas por copolímeros tri-bloco: poli(ácido lático) (PLA), poli(etileno glicol) e Poli(L- Lisina) (PLA-PEG-PLL) foram capazes de proteger o DNA da degradação por nucleases, mostraram-se praticamente atóxicas e apresentaram eficiências de transfecção superiores aquela exibida por PEI (FU et al., 2011). Já a combinação de asialoorosomucoide (AsOR) com PLL tem sido utilizada para tornar a nanopartícula sítio-dirigida à hepatócitos via receptores asialoglicoproteína (ASGPr) (KWOH et al., 1999). Desta forma, a modificação da superfície da PLL é um fator determinante para a eficiência da terapia gênica, a fim de proporcionar menor citotoxicidade e prolongar o tempo de permanência do nanocarreador na corrente sanguínea até atravessar a membrana da célula alvo, e possuir compatibilidade tal que, não seja removido por macrófagos do sistema retículo endotelial do fígado, baço e outros órgãos (PEPPAS et al., 2004). A obtenção de novos polímeros com camadas protetoras na superfície das nanopartículas pode evitar interações com proteínas plasmáticas e fagócitos, prolongando o tempo de circulação na corrente sanguínea (LEONG et al., 1998; SATO et al., 2001). 1.6 Fosforilcolina gliceraldeído Moléculas de fosfolipídeos são típicos componentes da membrana celular. Particularmente, o grupo zwiteriônico fosforilcolina (PC) (Figura 6) é encontrado naturalmente na camada externa de biomembranas. A inserção do grupo PC promove uma configuração biomimética ao vetor, através da formação de uma barreria de hidratação termodinâmica sobre a superfície do nanocarreador devido a grande natureza hidrofílica do 29 PC. Como consequência, a adsorção por proteínas plasmáticas e fagócitos é diminuída e a compatibilidade das nanopartículas com o sangue é melhorada. Adicionalmente, a inserção de PC na cadeia polimérica, evita respostas inflamatórias e propicia a estabilidade estérica dos complexos formados com o DNA (LAM et al., 2004; IWASAKI e ISHIHARA, 2005; PICOLA, 2009; AHMED et al., 2012). Assim, vetores contendo PC podem ter suas citotoxicidadse diminídas e suas hemocompatibilidades aumentadas. Figura 6. Estrutura química do grupo substituinte fosforilcolina gliceraldeído (PC). Estudos anteriores do nosso grupo mostraram que a introdução de grupos fosforilcolina em quitosana, além de resultar na formação de um grupo amino secundário, aumenta a solubilidade e estabilidade das nanopartículas formadas com os derivados. Os grupos PC permitem aumentar a estabilidade coloidal das nanopartículas em pH fisiológico, bem como o escape endossomal do DNA plasmidial com um aumento na eficiência de transfecção (PICOLA, 2009). Estudos envolvendo o polímero metacriloiloxietil-fosforilcolina (MPC) demonstraram que a presença de fosforilcolina impede a adsorção de proteínas e adesão de plaquetas e células, desta forma, evita a trombogenicidade tornando-o mais hemocompatível, segundo o mecanismo proposto a seguir (Figura 7) (IWASAKI e ISHIHARA, 2005). Lam e colaboradores (2004) propuseram um novo modelo de carreador gênico baseado em copolímeros em bloco, o [2-(dimetilamino)etil metacrilato-2-(metacriloiloxietil fosforilcolina)] (DMAEMA-MPC) e obtiveram um novo sistema carreador que foi capaz de condensar o DNA eficientemente, formando complexos compactos com estabilidade estérica e com baixo nível de interação celular não-específica. O H O P O O O N CH3 CH3 CH3 30 Figura 7. Representação esquemática do mecanismo de não-trombogenicidade observado para o polímero MPC. (Adaptado de IWASAKI e ISHIHARA, 2005). 31 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivos gerais O presente trabalho teve como objetivo a síntese de derivados de Poli(L-Lisina) contendo proporções crescentes do grupo fosforilcolina, visando sua aplicação como sistemas para a transferência gênica. A execução da proposta inclui avaliar o efeito do grau de substituição nas propriedades das nanopartículas formadas por meio da interação com o DNA plasmidial, tais como tamanho, estabilidade coloidal, biocompatibilidade e eficiência de transfecção “in vitro”. 2.2 Objetivos específicos i) Síntese e caracterização de derivados de Poli(L-Lisina) contendo proporções crescentes do grupo fosforilcolina. ii) Estudo da formação, estabilidade e propriedades das nanopartículas, utilizando-se o plasmídeo VR 1412 que contém o gene da beta-galactosidase, variando-se os parâmetros: pH e razão de cargas (N/P) (grupos amino (PLL) por grupos fosfato do pDNA). iii) Estudos de citoxicidade e transfecção “in vitro” utilizando-se os derivados obtidos. 32 3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 3.1 Materiais Os reagentes utilizados para a elaboração deste trabalho foram os seguintes: Ácido acético glacial (Synth), Ácido clorídrico (Chemco), Agarose (Aldrich Chemical Co), Borocianohidreto de sódio (Fluka), Cloreto de deutério (Aldrich Chemical Co), Hidróxido de sódio (Synth), Periodato de sódio (Synth), Poli(L-Lisina) (Alamanda Polymers – Mw 41000 Da), S,n glicero-3-fosfocolina (Bachem).As membranas de diálise utilizadas para a purificação do polímero modificado possuem tamanho de exclusão de 12000 Da (Spectra Pore®/Dyalysis). O DNA plasmidial VR1412 que codifica o gene da β-galactosidase (β-gal) com o promotor Citomegalovírus (CMV) e tamanho de 8,100 kb foi fornecido pela Vical Inc (San Diego, CA, EUA). Para amplificação e purificação do plasmídeo o Kit QIAGEN® foi utilizado. Para os testes de viabilidade celular utilizou-se o kit CellTiter96® (Promega Corporation). Os testes de eficiência de transfecção foram realizados utilizando o kit ELISA para β-gal (ROCHE) e a para a quantificação das proteínas totais o kit baseado no ácido bicinconínico (BCA) foi utilizado (Thermo Scientific). 3.2 Síntese de fosforilcolina gliceraldeído Para a preparação de fosforilcolina gliceraldeído (PC), seguiu-se o procedimento descrito em Picola (2009). Inicialmente, solubilizou-se 7 gramas de s,n glicero-3-fosfocolina (MM 257,22 g/mol) em 100 mL de água (H2O), obtendo-se uma solução 0,07 g.mL-1 que foi resfriada em banho de gelo. Sob agitação gotejou-se 50 mL de uma solução 0,956 mol.L-1 de periodato de sódio (NaIO4, MM 213,89 g/mol). A mistura reacional foi deixada sob agitação por 5 horas. Em seguida, a solução resultante foi congelada, para posteriormente ser liofilizada. O sólido obtido após a liofilização foi solubilizado em 100 mL de metanol (MeOH) gelado e colocado em banho de gelo, a fim de se precipitar o NaIO4 excedente e garantir maior remoção deste sólido insolúvel por filtração. O MeOH foi removido da solução 33 por destilação a pressão reduzida em rotaevaporador por aproximadamente 90 minutos à temperatura de 30 °C, até obter-se um líquido viscoso. A massa de PC obtida foi de 5,306 g e foi solubilizada em 16 mL de MeOH e 7,8 mL de H2O, obtendo-se uma solução estoque de PC equivalente a 0,989 mol.L-1. O grupo substituinte, fosforilcolina gliceraldeído, foi posteriormente caracterizado por ressonância magnética nuclear de prótons (RMN de ¹H) e espectroscopia de infravermelho por reflectância total atenuada (FTIR-ATR). 3.3 Síntese dos derivados A proposta de modificação no polímero, Poli(L-Lisina) (PLL) com o grupo PC, tem como objetivo introduzir grupos amino secundários em sua estrutura, para proporcionar maior capacidade de tamponamento e diminuir a citotoxicidade das nanopartículas, que provavelmente poderá aumentar a eficiência de transfecção. Os derivados foram preparados segundo o procedimento descrito em Tiera et al. (2006), pesando-se 0,5 g de PLL, e solubilizando-a em 20 mL de solução aquosa de ácido acético (H3CCOOH) 2% em massa. A solução foi colocada em banho de gelo, para que a temperatura da reação fosse mantida a 0 °C. O grau de substituição foi controlado, variando-se o volume da solução estoque de PC. Uma alíquota da solução estoque de PC foi diluída em 10 mL de MeOH e gotejada lentamente sobre a solução de PLL a 0 °C sob agitação vigorosa, permanecendo com agitação e nesta temperatura por 30 minutos. Em seguida o pH da mistura reacional foi ajustado para 6,5 com solução diluída de hidróxido de sódio (NaOH) e deixado reagir por 1 hora em temperatura ambiente e sob agitação. Após uma hora, a solução foi resfriada a 0 °C e adicionou-se 10 mL de uma solução de borocianoidreto de sódio (0,8 mol.L-1). A solução resultante foi mantida sob agitação em temperatura ambiente por 20 horas. O polímero foi purificado por diálise, utilizando-se membranas de 12000 Da, inicialmente contra água por dois dias, contra NaOH (0,05 mol.L-1) por um dia, contra HCl (0,01 mol.L-1) por 2 dias, e novamente contra H2O por dois dias. O polímero foi congelado e liofilizado, para posterior caracterização. 34 A reação de PLL com PC envolve uma reação de adição nucleofílica à carbonila do grupo substituinte fosforilcolina gliceraldeído, seguido da formação de imina (ou também denominada Base de Schiff) e de um rápido equilíbrio que leva a redução da dupla ligação da base de Schiff e a formação da ligação covalente simples, obtendo-se o derivado PLL-PC, conforme o mecanismo a seguir (Figura 8). N H H N (CH2)4 NH2 O (CH2)4 NH2 N H O (CH2)4 NH2 O O H O P OO O N CH3 CH3 CH3 + n OP O O ON CH3 H3C H3C H N H H N (CH2)4 NH2 O (CH2)4 NH2 N H O (CH2)4 NH2 O O n OP O O ON CH3 H3C H3C H N H H N (CH2)4 NH O (CH2)4 NH2 N H O (CH2)4 NH2 O OH n 35 OP O O ON CH3 H3C H3C H N H H N (CH2)4 NH O (CH2)4 NH2 N H O (CH2)4 NH2 O OH2 n OP O O ON CH3 H3C H3C H N H H N (CH2)4 NH O (CH2)4 NH2 N H O (CH2)4 NH2 O n OP O O ON CH3 H3C H3C H N H H N (CH2)4 N O (CH2)4 NH2 N H O (CH2)4 NH2 O n OH2 H OP O O ON CH3 H3C H3C H N H H N (CH2)4 N O (CH2)4 NH2 N H O (CH2)4 NH2 O n NaCNBH3 36 Figura 8. Mecanismo da síntese de modificação da PLL com PC via aminação-redutiva. 3.4 Caracterização dos derivados de PLL modificados com fosforilcolina (PLL-PC) 3.4.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN de ¹H) e Espectroscopia Infravermelho por reflectância total atenuada (FTIR-ATR) Os derivados foram caracterizados utilizando-se a técnica de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de ¹H) a 25 °C, solubilizando-se aproximadamente 10 mg de amostra em 1 mL de D2O/DCl (100:1). As medidas foram realizadas em um equipamento de Ressonância Magnética Nuclear da Bruker de 500 MHz no Laboratório Multi Usuário da Faculdade de Filosofia, Ciência e Letras - USP de Ribeirão Preto-SP. Os espectros na região do infravermelho por reflectância total atenuada (FTIR-ATR) foram realizados em um espectrofotômetro modelo Spectrum UATR Two – Perkin Elmer®, sem preparo prévio da amostra. Este equipamento mede as variações que ocorrem quando um feixe de radiação infravermelha é totalmente refletido em uma amostra, alocada sobre a superfície de um cristal opticamente denso com um elevado índice de refração, que neste caso foi o diamante. As medidas foram realizadas no Laboratório de Sucroquímica, Química Analítica e Bio- inorgânica – (Ibilce/UNESP) do Prof. Dr. Maurício Boscolo. OP O O ON CH3 H3C H3C H N H H N (CH2)4 NH O (CH2)4 NH2 N H O (CH2)4 NH2 O n H 37 3.5 Determinação do grau de substituição por RMN de ¹H Os graus de substituição (% GS) foram determinados por ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de ¹H) a partir da identificação dos prótons correspondentes a PLL e ao grupo PC. As porcentagens de substituição foram determinadas utilizando-se a equação 1 (abaixo), sendo que, H2 corresponde à área do sinal dos hidrogênios dos grupos metilas do trimetilamônio do grupo PC, e H1 corresponde à área do sinal dos dois hidrogênios ligados ao carbono γ da cadeia lateral da PLL (Figura 9). Figura 9. (A) Estrutura dos derivados de PLL-PC: hidrogênios utilizados na determinação do grau de substituição em vermelho. (B) Espectro de RMN de ¹H do derivado PLL-PC7,5%. Portanto, utilizando a equação abaixo, determinou-se o % GS: Equação 1 B A 6 5 4 3 2 1 0 ppm PLL-PC H2 H1 1 N H 2 H N N H ( C H 2 ) 4 N H 2 O O N H O P O - O O ( C H 2 ) 4 O N H 2 N + C H 3 H 3 C H 3 C n H H 2 H H 38 3.6 Determinação do grau de substituição por potenciometria Os graus de substituição também foram determinados por potenciometria, tendo como base o método de Muzzareli (MUZZARELI, 1977). Neste método, aproximadamente 40 mg de polímero foi previamente solubilizado em solução aquosa de HCl 0,1 mol.L-1, seguida da titulação com NaOH 0,0955 mol.L-1 padronizado. A cada adição de base o pH foi registrado em pHmetro digital (Digimed). A primeira derivada da curva de pH em função do volume de NaOH foi utilizada para determinação do volume de NaOH necessário para total desprotonação dos grupos amino. Assim, o cálculo para a determinação do grau de substituição foi feito por meio da equação 2: 3.7 Determinação da massa molar e polidispersividade dos polímeros por cromatografia de permeação em gel (GPC) A massa molar das amostras de PLL e seus derivados sintetizados foi determinada por cromatografia de permeação em gel (GPC), que se baseia na separação do polímero por tamanho molecular. As medidas foram realizadas em um cromatógrafo líquido HPLC Shimadzu LC-20 equipado com detector de índice de refração Shimadzu RID-10A. Duas colunas em série (SB-803 HQ e SB-805- SHODEX) foram utilizadas na separação e análise das amostras. O conjunto de padrões monodispersos possui massa molar no intervalo de 6200 a 805000 Da. As corridas foram realizadas a 35 ºC tendo como eluente a solução tampão ácido acético/acetato de sódio (0,3 mol.L-1/0,2 mol.L-1) pH 4,5 com fluxo de 0,8 mL por minuto, e concentração do polímero de 5 mg.mL-1. As análises foram realizadas no Lab. de Fotoquímica do Instituto de Química de São Carlos (IQSC/USP) em colaboração com a Profª. Drª. Carla Cristina Schmitt Cavaleiro. 39 3.8 Determinação da capacidade de tamponamento A capacidade tamponante da PLL e seus derivados foi determinada por titulação ácido base, utilizando o procedimento descrito por LU et al. (2008). Os polímeros previamente solubilizados em solução aquosa de cloreto de sódio 150 mmol.L-1 foram titulados com solução de NaOH 0,1 mol.L-1 até atingir o pH 12. Em seguida titulou-se novamente com uma solução de HCl 0,1 mol.L-1 até pH 2. 3.9 Amplificação e purificação do plasmídeo (pDNA) O plasmídeo VR1412, contendo o gene da β-galactosidase (β-gal) e o promotor Citomegalovírus (CMV) com tamanho de 8,100 kb, foi obtido da VICAL Inc. (San Diego, CA, USA) e amplificado com a bactéria Escherichia coli (DH5α) e purificado utilizando-se o Mega kit QIAGEN de acordo com a instrução do fabricante. O plasmídeo purificado foi avaliado via eletroforese em gel de agarose (1%) e sua concentração determinada utilizando- se o aparelho NanoDrop® 3300 (Thermo Science) em 260 nm como previamente descrito (CASÉ et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2011). 3.10 Preparação de nanopartículas poliméricas com pDNA por coacervação O procedimento mais utilizado para a preparação de nanopartículas envolvendo polímeros catiônicos e pDNA é a coacervação do complexo. Neste procedimento as soluções do policátion e pDNA são preparadas separadamente, pela dissolução na solução tampão apropriada a temperatura ambiente. Soluções dos polímeros são injetadas na solução contendo pDNA sob agitação intensa e a quantidade do policátion pode ser variada para obtenção de diferentes razões N/P (razão de mol de grupos amino (polímero) por mol de grupos fosfato (pDNA)). 40 3.11 Avaliação da estabilidade e tamanho das nanopartículas em função de diferentes condições experimentais 3.11.1 Estudo da interação pDNA-Poli(L-Lisina) e seus derivados utilizando-se o ensaio com Brometo de Etídio A interação entre o pDNA (DNA plasmidial: VR1412) e os polímeros, foi avaliada utilizando-se o ensaio de decaimento de fluorescência da sonda catiônica Brometo de Etídio (EtBr). O ensaio baseia-se no monitoramento da fluorescência de EtBr intercalado entre as bases da cadeia de pDNA. A adição de PLL e seus derivados à solução contendo pDNA e EtBr desloca as moléculas de EtBr para o meio aquoso, o que causa um decréscimo na intensidade de fluorescência. O ensaio é representado na figura abaixo (Figura 10). Figura 10. Representação esquemática do ensaio com EtBr em meio aquoso para estudo da interação de PLL e seus derivados com pDNA. Neste estudo, preparou-se uma solução estoque de aproximadamente 7,0 mmol.L-1 do polímero em solução tampão de pH desejado, sendo que as soluções tampão utilizadas neste ensaio consistiam de tampão acetato (50 mmol.L-1, força iônica 150 mmol.L-1 e pH 5,0) e tampão fosfato (50 mmol.L-1, força iônica 150 mmol.L-1 e pH 7,4). A solução de pDNA foi 41 preparada na concentração de 16 µmol.L-1 de grupos fosfato e a de EtBr em 4 µmol.L-1 em solução tampão de pH desejado. As medidas de fluorescência foram realizadas em fluorímetro Hitashi F4500, com comprimento de onda de excitação de 560 nm e a emissão de fluorescência foi monitorada em 605 nm. A temperatura foi mantida constante a 25 ºC, por meio de banho termostatizado durante todo o experimento. A solução contendo pDNA-EtBr foi titulada com a solução do polímero, e registrou-se o decaimento da intensidade de fluorescência. Os ensaios para todos os polímero em cada pH investigado foram feitos em duplicata. Posteriormente, construiu-se um gráfico de % de fluorescência relativa em função da razão de grupos amino do polímero (N) por grupos fosfato de DNA (P) (Razão N/P). 3.11.2 Eletroforese em gel de agarose A técnica de eletroforese em gel de agarose permite avaliar a estabilidade dos complexos formados em função do grau de substituição, razão N/P e pH, a partir da análise da mobilidade do pDNA na matriz de gel, quando esta é submetida a um campo elétrico. A molécula de pDNA possui carga negativa então tende a migrar para o pólo positivo, enquanto que à medida que os poliplexos vão sendo formados, a interação eletrostática entre o pDNA e os polímeros catiônicos começa a ser tão significativa que todo o pDNA fica complexado e não se visualiza a migração do mesmo em direção ao pólo positivo. A cuba de eletroforese horizontal foi cedida gentilmente pelo Prof. Dr. Carlos Roberto Ceron. Os complexos foram formados a diferentes razões N/P (0,25; 0,5; 1; 3 e 6), para uma concentração fixa de pDNA (70 μmol.L-1) e foram incubados nos tampões apropriados (dependendo do pH avaliado) na força iônica de 150 mmol.L-1 por 30 minutos. As amostras foram adicionadas nos poços do gel de agarose 1% e a corrida foi realizada em tampão TAE 1x por 70 minutos a 75 V. Após a corrida da eletroforese o pDNA foi revelado incubando-se os géis em água destilada contendo brometo de etídio (1µg/mL) por 2 minutos e revelado no Lab. de Evolução Molecular de Insetos da Prof. Drª. Claudia Carareto (Ibilce-UNESP) no aparelho UVtransiluminator com máquina fotográfica conectada ao computador e interligada ao programa Alpha Digital. 42 3.11.3 Espalhamento de luz dinâmico e medidas de potencial zeta Os tamanhos das partículas foram determinados por espalhamento de luz dinâmico com o aparelho Zetasizer nano-ZS90 (Malvern Instrument Worcstershire, UK), equipado com laser de 633 nm e ângulo de 90º do Laboratório de Polímeros (Ibilce-UNESP) em colaboração com o Prof. Dr. João Ruggiero Neto. As nanopartículas de PLL/pDNA e PLL-PC/pDNA foram preparadas em diferentes razões N/P (0,25; 0,5; 1; 3 e 6) em tampão apropriado (dependendo do pH avaliado) e força iônica 150 mmol.L-1 por meio da titulação da solução de pDNA (60 μmol.L-1) com as soluções dos diferentes polímeros. As medidas foram feitas em duplicata com três acumulações. As mesmas soluções foram utilizadas nas medidas de potencial zeta. 3.12 Estudos de citotoxicidade e transfecção “in vitro” 3.12.1 Estudo da citotoxicidade dos polímeros Os estudos de citotoxicidade e transfecção “in vitro” foram realizados utilizando-se células de carcinoma cervical HeLa (FR-positivo) (America Type Culture cell Collection/Rockville, MD, USA). As células foram cultivadas em frasco de cultura contendo o meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina- estreptomicina (PS) em atmosfera de 5-95% de CO2-O2 a 37 °C. Inicialmente as células HeLa em meio DMEM suplementado foram transferidas para placa de 96 poços a uma densidade de 10.000 células/poço e incubadas por 24 horas em atmosfera de 5-95% de CO2-O2 a 37 °C. Após 24 horas, trocou-se o meio por novo meio DMEM suplementado e posteriormente adicionou-se alíquotas da solução dos polímeros avaliados (cuja concentração das soluções estoques dos polímeros são equivalentes a 1,0 mg.mL-1, preparadas em tampão fosfato pH 6,3 e força iônica 150 mmol.L-1) e LipofectaminaTM2000 (LP), de forma que as concentrações finais em cada poço foram 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; 25,0; 50,0 e 100,0 μg.mL-1, sendo cada concentração repetida em três poços e incubando-se novamente a placa por 24 horas. No último dia as células expostas a diferentes 43 concentrações de polímeros foram analisadas por meio da determinação da viabilidade celular utilizando o ensaio de CellTiter96® aquoso não adioativo de proliferação celular (Promega Corporation), que consiste na combinação dos compostos 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3- carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio (MTS) e fenazina metasulfato (PMS). Assim, o meio de cultura da placa foi removido e trocado por meio DMEM suplementado contendo MTS e PMS, na proporção de 20 μL de meio : 100 μL de MTS/PMS (por poço), e incubou-se a placa por 30 minutos a 37 ºC em atmosfera de 5-95% de CO2-O2. O composto MTS pode ser biorreduzido pela enzima desidrogenase mitocondrial, encontrada em células metabolicamente ativas, em sais de formazan que são solúveis em meio de cultura, e consequentemente provocam o aparecimento de cor púrpura à solução. Desta maneira, a viabilidade celular pode ser determinada pela intensidade da coloração púrpura que é proporcional à quantidade de cristais de formazan formados, e quantificado pela leitura da densidade ótica em 490 nm com um leitor de microplaca EL800 universal (Molecular Devices Corporation, Menlo Park, CA, EUA), e a porcentagem de viabilidade celular foi calculada ajustando as células sem exposição ao polímero (controle celular) como 100%. 3.12.2 Estudo da citotoxicidade das nanopartículas Os estudos de citotoxicidade das nanopartículas foram executados da mesma forma como descrito pelo item 3.12.1, de forma que as células são inicialmente cultivadas em placa de 96 poços a uma densidade de 10.000 células/poço e incubadas por 24 horas em atmosfera de 5-95% de CO2-O2 a 37 °C. Em seguida, o meio de cultura é removido e 50 μL de nanopartículas a diferentes razões N/P (0,5; 1; 2; 3 e 6) são adicionados em cada poço (repetindo a mesma razão N/P em três poços), sendo a concentração de pDNA equivalente a 3,775.10-5 mol.L-1 (2,5 μg/poço). Após a aplicação das nanopartículas, 100 μL de meio DMEM suplementado são adicionados às células e incuba-se a placa por 24 horas, para posterior determinação da viabilidade celular com o teste colorimétrico utilizando-se o corante MTS, como previamente descrito, e a porcentagem de viabilidade celular foi calculada ajustando as células sem exposição às nanopartículas (controle celular) como 100%. 44 3.12.3 Estudos de eficiência de transfecção “in vitro” utilizando o plasmídeo VR1412 Os estudos de transfecção “in vitro” utilizando o plasmídeo VR1412 (que contém o gene da β-galactosidase (β-gal) e o promotor CMV com tamanho de 8,100 kb) foi utilizado para o preparo das nanopartículas, como os demais experimentos. Inicialmente as células HeLa em meio DMEM suplementado foram transferidas para placas de 24 poços a uma densidade de 50.000 células/poço e incubadas por 24 horas em atmosfera de 5-95% de CO2- O2 a 37 °C. Após 24 horas, o meio de cultura é removido e as células são lavadas três vezes com meio de cultura (DMEM) sem FBS e PS. Em seguida, 200 μL de nanopartículas preparadas em tampão fosfato (pH 7,4) a diferentes razões N/P (0,5; 1; 2; 3 e 6) são adicionados em cada poço (repetindo a mesma razão N/P em três poços), sendo a concentração de pDNA equivalente a 2,265.10-5 mol.L-1 (1,5 μg/poço), e após a aplicação das nanopartículas, adicionou-se 200 μL de meio DMEM sem FBS e PS e incubou-se a placa em atmosfera de 5-95% de CO2-O2 a 37 °C por 2 horas. Após 2 horas as nanopartículas foram removidas dos seus respectivos poços e adiciona-se 1,0 mL de meio DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de PS e a placa é novamente incubada por 24 horas. No terceiro dia, o meio é removido e adiciona-se 1,0 mL de novo meio DMEM suplementado. Após 72 horas, o meio foi removido e as células foram lavadas com 1,0 mL de tampão fosfato salino (PBS) gelado. A determinação quantitativa da concentração da proteína β-gal transfectada nas células utilizou o método colorimétrico a partir do kit ELISA para β-gal (ROCHE), segundo instruções do fabricante. A determinação da concentração de proteínas totais utilizou o método do ácido bicinconínico (BCA: 4,4'-dicarboxi-2,2'-biquinolina) empregando o kit comercial: BCA – Thermo Scientific, e a albumina do soro bovino foi utilizada como padrão para a construção da curva analítica. Assim, pôde-se estimar a eficiência de transfecção por meio da razão entre a quantidade em pg de β-gal e a quantidade em mg de proteínas totais. A análise estatística foi realizada utilizando o teste t-Student. 45 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Síntese e caracterização de fosforilcolina gliceraldeído (PC) A obtenção dos derivados de PLL com grupos fosforilcolina depende da presença do grupo aldeído da fosforilcolina para a formação de imina (base de Schiff) com os grupos amina de PLL, seguido da redução com borocianohidreto de sódio. Deste modo, para obter estes derivados, inicialmente foi necessário preparar a fosforilcolina gliceraldeído, por meio da oxidação do s,n glicero-3-fosfocolina utilizando periodato de sódio (PICOLA, 2009). A Figura 11 mostra o espectro de RMN de ¹H da fosforilcolina gliceraldeído com a atribuição dos hidrogênios presentes na molécula. Figura 11. (A) Estrutura química da Fosforilcolina Gliceraldeído contendo as atribuições dos sinais dos hidrogênios. (B) Espectro de RMN de ¹H do PC com as respectivas atribuições, obtido em D2O/DCl (1:100) a 25 °C com frequência de 500 MHz. Este resultado está de acordo com o proposto por Miyazawa e Winnik (Miyazawa e Winnik, 2002). A Figura 11B confirma o equilíbrio químico proposto por Miyazawa e Winnik (2002), no qual o aldeído existe majoritariamente na forma hidratada, isto é, existe um equilíbrio ressonante, que desfavorece a formação do aldeído na presença de água, A B 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 ppm a bc d H2O e O P OO O N H3C CH3 CH3 a b c d H O P OO O N H3C CH3 CH3 a b c d OH OH H O e H2O 46 consequentemente observa-se um sinal em aproximadamente δ 5,0 ppm. Entretanto o equilíbrio entre o aldeído e sua forma hidratada não impede a reação de substituição. O sinal em δ 3,3 ppm é atribuído aos hidrogênios das metilas do grupo trimetilamônio e foi utilizado para determinar o grau de substituição de PC nos derivados PLL-PC. A espectroscopia na região do infravermelho (FTIR-ATR) também foi utilizada para confirmar o sucesso da síntese. A técnica não requer preparo prévio da amostra e foi possível registrar o espectro na região do infravermelho de PC em solução, isto é, em metanol e água (2:1), na concentração de 1,0 mol.L-1 (Figura 12). Figura 12. Espectro FTIR-ATR do composto Fosforilcolina Gliceraldeido (PC). O espectro FTIR-ATR para o PC exibiu bandas proeminentes que comprovam o sucesso da síntese. A banda em 3325 cm-1 (a) corresponde à vibração da ligação O-H do solvente metanol/H2O, uma vez que análise foi realizada em solução; a banda na região de 1650 cm-1 é atribuída à ligação C=O da função aldeído (banda b); a vibração da ligação N+(CH3)3 provoca o aparecimento de banda em 1433 cm-1 (banda c); a vibração devido ao estiramento assimétrico da ligação PO2 - provoca o surgimento de banda em 1220 cm-1 (banda d) e por fim a banda na frequência de 1015 cm-1 surge devido ao estiramento da ligação P-O-C (banda e) (TIERA et al, 2006; SILVERSTEIN, 1981). 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 e db c cm-1  a 47 Após a confirmação da síntese do grupo PC, partiu-se para a etapa de modificação da Poli(L-Lisina) com diferentes graus de substituição. 4.2 Síntese e caracterização dos derivados PLL-PC por RMN de ¹H e FTIR-ATR Um esquema simples da síntese dos derivados zwiteriônicos de PLL-PC é mostrado na Figura 13. Figura 13. Representação da síntese dos derivados zwiteriônicos de PLL substituídos pelo grupo PC. Os graus de substituição por PC foram determinados comparando-se a área do sinal referente aos hidrogênios das metilas presentes no grupo trimetilamônio de PC, com a área do sinal referente aos dois hidrogênios mais desblindados do grupo metileno, presente na cadeia lateral polimérica da PLL. Deste modo, o grau de substituição dos derivados foi determinado pela Equação 1, previamente exposta. Na Figura 14 é apresentada a estrutura genérica dos derivados obtidos e os espectros de PC, PLL e PLL-PC, com as respectivas atribuições dos sinais dos hidrogênios utilizados na determinação dos graus de substituição. A análise dos RMNs de ¹H dos derivados comprovou a substituição pelo grupo PC, por meio do aparecimento do sinal em 3,3 ppm que caracteriza a presença de metilas do grupo trimetilamônio (pertencente ao grupo PC), sendo que o grau 48 de substituição foram respectivamente 7,5%, 20% e 40% de substituição para o último derivado da série. Figura 14. (A) Estrutura genérica dos derivados PLL-PC com identificação dos prótons utilizados na determinação dos graus de substituição. (B) Espectros de RMN de ¹H do grupo substituinte PC, da PLL e seus derivados modificados, PLL-PC7,5% e PLL-PC20% e PLL- PC40% obtidos em D2O/DCl (1:100) a 25 °C com frequência de 500 MHz. A OP O O ON H3C H3C H3C H N H H N (CH2)4 NH O N H O (CH2)4 NH2 O H H2N H H n B 49 Os espectros FTIR-ATR são mostrados na Figura 15, os quais também confirmam a inserção do grupo PC na cadeia polimérica da PLL, devido ao aparecimento de bandas características apenas nos espectros dos derivados. Estas bandas específicas na região de 1220 a 950 cm-1 são atribuídas ao grupo fosforilcolina, sendo que a banda em 1220 cm-1 aparece devido ao estiramento assimétrico do PO2 -, a banda referente ao estiramento da ligação P=O possui frequência equivalente a 1065 cm-1, e a banda cuja frequência de estiramento é 950 cm-1 é devida à ligação P-O-C (SILVERSTEIN, 1981; TIERA et al., 2006; REISCH et al., 2007). Figura 15. Espetros FTIR-ATR para a PLL e seus derivados modificados com PC com diferentes graus de substituição. Além destas bandas que são atribuídas à presença do grupo PC nos derivados sintetizados, outras bandas se destacam. A banda na frequência de 3250 cm-1 é decorrente à vibração do estiramento de ligação N-H de aminas primárias alifáticas, desta forma, ressalta- 50 se que à medida que o grau de substituição aumentou (PLL-PC40%) esta banda tornou-se menos intensa quando comparada com o polímero sem nenhuma substituição (PLL). Isto acontece, uma vez que o ataque nucleofílico e consequentemente a substituição pelo PC, ocorre neste sítio de ligação. Outras duas bandas na região de 1650 cm-1 e 1520 cm-1 são bastante intensas e surgem nos três espectros de FTIR-ATR apresentados, devido ao estiramento da ligação O=C-N de amidas secundárias, que estão presentes na cadeia polimérica de PLL. 4.3 Determinação do grau de substituição por potenciometria Os graus de substituição dos derivados foram também determinados por potenciometria (Figuras 16 a 18), utilizando-se a Equação 2 que relaciona o número de mols de NaOH necessários para a total desprotonação dos grupos amina não substituídos da PLL e o número de mols de PLL que foram substituídos, desta forma permite determinar indiretamente a massa de PC e o número de mols desta unidade. Figura 16. Titulação potenciométrica de PLL-PC7,5% para determinação do grau de substituição. 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 0 5 10 15 20 25 30 35 40 pH pH  pH / V Vol. NaOH 0,0955 mol/L adicionado(mL) Derivada:pH/V PLL-PC 7,5% V = 1,85 mL GS = 12,0% 51 Figura 17. Titulação potenciométrica de PLL-PC20% para determinação do grau de substituição. Figura 18. Titulação potenciométrica de PLL-PC40% para determinação do grau de substituição. A Tabela 3 compara o grau de substituição obtido pelas técnicas de RMN de 1H e potenciometria. Tabela 3. Grau se substituição dos derivados substituídos com PC por meio das técnicas de RMN de 1H e potenciometria. Polímeros Grau de Substituição (% GS) RMN de ¹H Potenciometria PLL-PC7,5% 7,5 12 PLL-PC20% 18,3 18 PLL-PC40% 38,7 29,3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 2 4 6 8 10 12 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Vol. NaOH 0,0955 mol/L adicionado(mL) pH  pH / V pH Derivada:pH/V PLL-PC 40% V = 1,54 mL GS = 29,3% 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 2 4 6 8 10 12 14 16 pH Vol. NaOH 0,0955 mol/L adicionado(mL) Derivada:pH/V PLL-PC 20% V = 1,51 mL GS = 18,3%  pH / V pH 52 Observa-se que o grau de substituição para o derivado PLL-PC7,5% pela técnica de potenciometria foi de 12%, isto é, houve uma diferença significativa do resultado obtido por meio da técnica de RMN de ¹H. O mesmo ocorreu com o derivado PLL-PC40% sendo esta diferença ainda mais acentuada. Isto pode ter ocorrido devido à característica da PLL e seus derivados modificados serem altamente higroscópicos, acarretando em valores discrepantes. Além disso, o segundo pico no gráfico da segunda derivada não está bem definido, o que pode contribuir para aumentar o erro nos cálculos. Portanto, para todos os demais cálculos foram utilizados os valores de GS obtidos das medidas de RMN de ¹H. 4.4 Determinação da massa molar e polidispersividade por cromatografia de permeação em gel A Poli(L-Lisina) e seus derivados foram caracterizados para determinação da massa molar, utilizando cromatografia de permeação em gel. Este método exige a utilização de padrões de massa molar monodispersos para construção de uma curva de calibração, e fornece resultados em termos de massa molar ponderal média (Mw), massa molar numérica média (Mn) e curva de distribuição de massa molar. A razão Mw/Mn é denominada índice de polidispersividade e indica o quão larga ou estreita está a curva de distribuição de massa molar do polímero. O valor de Mw é mais afetado por cadeias de alta massa molar, enquanto Mn é mais afetado pela presença de cadeias de menor massa molar. A Mw geralmente é maior que Mn, exceto para polímeros monodispersos, os quais possuem esta relação equivalente a 1,0, isto é, Mw=Mn. Se a diferença entre Mw e Mn for alta, a distribuição é considerada larga, ao contrário, quando a diferença entre Mw e Mn for mínima a distribuição é considerada estreita (BRETAS e D’ÁVILA, 2005). A Figura 19 apresenta a curva de calibração utilizada para determinar a massa molar dos polímeros modificados com PC, que foi obtida por meio da injeção de padrões monodispersos Pullulan, massa molar no intervalo de 6200 à 805000 Da. O Pulluan é um polissacarídeo e pode ser definido como um glucano essencialmente linear, consistindo principalmente de unidade repetitivas de maltotrioses com algumas unidades de maltotetraoses intercaladas. 53 Figura 19. Curva de calibração utilizando padrões de massa molar monodispersos no intervalo de 6200 a 805000 Da. A Tabela abaixo (Tabela 4) apresenta os valores de Mw e Mn, assim como o índice de polidispersividade obtido para a PLL e seus derivados. Tabela 4. Valores de massa molar ponderal média (Mw), massa molar numérica média (Mn) e índice de polidispersividade (Mw/Mn) para PLL e seus derivados, obtidos por cromatografia de permeação em gel (GPC). Polímeros Mw (kDa) Mn (kDa) Mw/Mn A B MÉDIA A B MÉDIA A B PLL 71966 71593 71779 57597 54194 55895 1,2 1,3 PLL-PC7,5% 98835 99175 99005 68317 69112 68714 1,4 1,4 PLL-PC20% 155093 143728 149410 78409 78793 78601 1,9 1,8 PLL-PC40% 115222 116034 115628 81684 80841 81262 1,4 1,4 Nota-se que com o aumento do grau de substituição há um aumento nos valores de Mw e Mn. O derivado PLL-PC20% apresentou um valor de Mw superior ao derivado com um grau de substituição maior (PLL-PC40%), o que pode estar relacionado ao preparo da amostra. O procedimento de secagem destes polímeros exige certo cuidado, uma vez que são compostos por grupamentos zwiteriônicos (PC) e estão sujeitos a ligações intercruzadas, isto é, ligações inter-cadeias devido a efeitos eletrostáticos. Verifica-se que apesar dos polímeros 17 18 19 20 21 22 23 24 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 Padrões Pullulan Mw 805.000 à 6200 Fluxo: 0,8 mL/min Lo g M w Tempo de retenção (min) LogMw LogMw 54 não serem classificados como monodispersos (Mw=Mn), os índices de polidispersividade não se afastaram muito da unidade, o que também é visualizado pela a estreita curva de distribuição de massa molar dos mesmos (Figura 20). Figura 20. Curva de distribuição de massa molar da PLL e seus derivados modificados com o grupo zwiteriônico PC, obtida pela cromatografia de permeação em gel. 4.5 Determinação da capacidade de tamponamento Uma das características que torna o vetor não viral mais eficiente para a transfecção do pDNA dentro da célula alvo é sua capacidade de tamponar o meio em que se encontra. Assim realizaram-se testes para avaliar a capacidade de tamponamento do polímero antes e após sua modificação com o grupo PC, utilizando o método de Lu et al. (2008). A Figura 21 apresenta o comportamento tamponante dos polímeros em solução salina 150 mmol.L-1. 0 5 10 15 20 25 30 35 0 2000 4000 6000 8000 10000 In te ns id ad e de T ra ns m itâ nc ia Tempo de retenção (min) PLL PLL-PC7,5% PLL-PC20% PLL-PC40% 55 Figura 21. Capacidade de tamponamento da PLL e seus derivados em solução de NaCl 150 mmol.L-1 titulado com HCl. A análise da Figura 21 mostra que após a modificação da PLL com o grupo PC, a capacidade de tamponamento aumentou, sendo necessário maior volume de ácido para alterar o pH da solução com o aumento do grau de substituição. O resultado obtido está de acordo com estudos anteriores realizados por Oliveira et al. (2011) e pode melhorar a liberação do plasmídeo dentro da célula (BENNS et al., 2000). 4.6 Avaliação da estabilidade e tamanho das nanopartículas em função de diferentes condições experimentais 4.6.1 Estudo da interação pDNA-Poli(L-Lisina) e seus derivados utilizando-se o ensaio com brometo de etídio A capacidade da PLL e PLL-PC interagir com o DNA plasmidial foi avaliada qualitativamente por meio do ensaio com a sonda fluorescente brometo de etídio (EtBr). Neste sentido, os resultados obtidos com a PLL e seus derivados sintetizados em solução tampão de pH 5,0 e 7,4 de maneira geral foram similares, uma vez que houve a 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 2 4 6 8 10 12 pH PLL PLL-PC7,5% PLL-PC20% PLL-PC40% HCl 0,094 mol.L-1 56 diminuição da intensidade de fluorescência do EtBr com a adição contínua do polímero na solução inicial. A Figura 22 apresenta o decaimento da intensidade de fluorescência da sonda EtBr em pH 5,0. A análise desta figura mostra que o decaimento da fluorescência aumenta com a razão N/P e depende da composição dos polímeros. Isto pode ser correlacionado com a força de interação, portanto quanto maior o decaimento da fluorescência, maior forte é a interação entre o polímero e o pDNA. Em pH 5,0 a intensidade de fluorescência do complexo pDNA-EtBr decai continuamente com a razão N/P atingindo um mínimo em aproximadamente 30% na razão N/P 2,0, para a PLL. Para os derivados PLL-PC7,5% e PLL- PC20% maiores razões N/P são necessárias para atingir o mínimo de fluorescência de aproximadamente 35%. Para o derivado mais substituído, PLL-PC40% este mesmo mínimo de fluorescência relativa (~35%) só é atingido quando a razão N/P é 8. Estes resultados mostram que o aumento no grau de substituição diminui a força de interação com o pDNA, uma vez que são necessárias maiores razões N/P para produzirem o mesmo decréscimo na fluorescência. Além da proteção contra a degradação por nucleases, a liberação gênica envolve a superação de interações eletrostáticas, portanto interações mais fracas podem favorecer a liberação do pDNA. Figura 22. Titulação do complexo pDNA-EtBr por PLL e PLL substituídas com grupos PC em tampão acetato, pH 5,0 e força iônica de 150 mmol.L-1 a 25 °C. O mesmo experimento foi realizado em pH 7,4 (Figura 23) e um comportamento similar foi observado. Para os polímeros PLL, PLL-PC7,5% e PLL-PC20% a força de interação com pDNA é ligeiramente enfraquecida, uma vez que a intensidade de fluorescência atinge seu 0 5 10 15 20 25 0 20 40 60 80 100 % F lu o re s c ê n c ia R e la ti v a Razão N/P Tampão Acetato - pH5,0 PLL PLL-PC7,5% PLL-PC20% PLL-PC40% 57 mínimo (~25%) em razões N/P superiores (N/P > 3,5) comparado ao ensaio em pH 5,0. O derivado mais substituído PLL-PC40% provocou um mínimo de fluorescência de 50% na razão N/P 5, o que indica uma interação mais fraca com o plasmídeo. Em estudos anteriores com derivados quitosana-PC verificou-se um comportamento similar, e o derivado de mesma composição proporcionou um decréscimo para 40% do valor inicial. Este efeito é resultado do decréscimo no grau de ionização em pH fisiológico, (PICOLA, 2009). Para PLL e PLL-PC o aumento do pH de 5,0 para 7,4, não afetou drasticamente a interação, o que se deve provavelmente aos maiores graus de ionização para PLL-PC no pH neutro. Figura 23. Titulação do complexo pDNA-EtBr por PLL e PLL substituídas com grupos PC em tampão fosfato, pH 7,4 e força iônica de 150 mmol.L-1 a 25 °C. Portanto, a partir do ensaio de fluorescência verificou-se que a interação leva a formação de poliplexos PLL/pDNA e PLL-PC/pDNA em pH 5,0 e pH 7,4. Logo pode-se inferir que a formação de nanopartículas carreadoras de pDNA ocorre devido a atrações eletrostáticas entre as cargas positivas dos polímeros estudados e as cargas negativas do pDNA, e se mostra dependente tanto do grau de substituição do polímero, quanto do pH do meio, por influenciar na densidade de cargas positivas (KWOH et al., 1999; PICOLA, 2009). 0 5 10 15 20 0 30 60 90 % F lu o re s c ê n c ia R e la ti v a Razão N/P Tampão Fosfato - pH 7,4 PLL PLL-PC7,5% PLL-PC20% PLL-PC40% 58 4.6.2 Estudo da interação pDNA-Poli(L-Lisina) e seus derivados por meio de eletroforese em gel de agarose A capacidade de complexação do pDNA pelos derivados foi também verificada por meio de eletroforese em gel de agarose. A estabilidade dos complexos desempenha um papel importante na proteção do pDNA contra a degradação por nucleases no meio intracelular. Neste sentido verifica-se na literatura que a eletroforese configura-se como uma ferramenta importante na avaliação da estabilidade da nanopartícula, e pode ser usada como um guia para estabelecer as condições de preparação e os estudos de transfecção. A Figura 24 traz as imagens dos géis corados com EtBr para os complexos formados a diferentes razões N/P em força iônica de 150 mmol.L-1 e pH5,0. As razões N/P estão indicadas acima de cada fotografia de eletroforese. O primeiro poço à esquerda da Figura 25A corresponde ao marcador de massa molecular - Ladder 1 kb plus. Analisando a Figura 24A-D, observa-se que ocorre migração do pDNA apenas até a razão N/P 0,5, isto é, acima da razão 1 toda a carga negativa do pDNA é neutralizada e a intensidade de complexação é tão forte que nenhum deslocamento é verificado. Portanto, o grau de substituição por grupos PC não afetou significativamente a força de interação entre os policátions e pDNA, uma vez que todos os polímeros interagiram semelhantemente com o pDNA, liberando-o na mesma razão N/P. O mesmo estudo foi realizado com a PLL e seus derivados em pH 7,4 (Figura 25A-D). O aumento do pH não influenciou na força de interação dos polímeros, pois a habilidade em interagir com o pDNA foi similar ao encontrado em pH 5,0. Para todas as nanopartículas investigadas, a razão N/P 1 foi suficiente para impedir a liberação do pDNA, com exceção da PLL-PC40% (Figura 25D) na qual observa-se uma leve liberação de pDNA na razão N/P 1. Ambas as constatações são coerentes com os dados de decaimento de fluorescência, uma vez que foi demonstrado que para esta série de derivados de PLL (PLL-PC7,5% e PLL-PC20%), o grau de ionização não interfere significativamente na força de interação, resultando em comportamento similar em ambos os pHs, isto é, nos dois pHs avaliados os polímeros: PLL, PLLL-PC7,5% e PLL-PC20% provocaram o decaimento da fluorescência de 80%, enquanto que o derivado mais substituído com PC (PLL-PC40%) apresentou diminuição na afinidade de ligação com pDNA, decorrente da menor capacidade em deslocar a sonda EtBr para o meio aquoso, e produziu um mínimo de fluorescência de 50%. 59 A) PLL B) PLL-PC7,5% C) PLL-PC20% D) PLL-PC40% Figura 24(A-D). Eletroforese em gel de agarose dos poliplexos PLL/pDNA e PLL- PC/pDNA em pH 5,0 e força iônica de 150 mmol.L-1. (A) PLL; (B) PLL-PC7,5%; (C) PLL- PC20%; (D) PLL-PC40%. 60 A) PLL B) PLL-PC7,5% C) PLL-PC20% D) PLL-PC40% Figura 25(A-D). Eletroforese em gel de agarose dos poliplexos PLL/pDNA e PLL- PC/pDNA em pH 7,4 e força iônica de 150 mmol.L-1. (A) PLL; (B) PLL-PC7,5%; (C) PLL- PC20%; (D) PLL-PC40%. Os resultados aqui obtidos são semelhantes àqueles reportados na literatura e confirmam que para a PLL, a razão N/P 1 é suficiente para total complexação do pDNA (CHOI et al., 61 1998; TONCHEVA et al., 1998; LEE e AHN, 2006; SUN et al., 2013). Para PLL enxertada com poli(etileno)glicol os poliplexos obtidos exibem alta estabilidade, sendo o DNA plasmidial liberado somente até a razão N/P 1 (TONCHEVA et al., 1998). Esta forte interação não impediu a liberação do pDNA em células Hep G2 e ainda observou-se expressão gênica após 96 horas da transfecção (CHOI et al., 1998). Sun e colaboradores (2013) verificaram que a força de interação PLL-pDNA também depende da composição de forma similar. Os autores avaliaram a força de interação de PLL e carreadores tendo como base poli(metacrilatos) substituídos com L-Lisina (PHML). Os resultados mostraram que PHML de 6kDa liberou o pDNA até a razão N/P 2, já PHML de maior massa molecular (30kDa) impediu a migração do pDNA na razão N/P 1 o que denota a dependência da força de interação com a massa molecular. Resultados similares foram obtidos por Toncheva e colaboradores (1998), os quais relataram que PLL interage fortemente com o DNA de timo de bezerro (ctDNA), e que para razões N/P superiores a 1 o ctDNA não é liberado. Adicionalmente PLL enxertada com poli[N-2-(hidroxipropil)metacrilamida] retardou completamente a migração do ctDNA na razão N/P 1. 4.6.3 Espalhamento de luz dinâmico (DLS) e medidas de potencial zeta das nanopartículas preparadas com pDNA O tamanho, potencial zeta e a morfologia das nanopartículas são parâmetros que influenciam na citotoxicidade, captação celular, liberação dos genes e transfecção em células (SUN et al., 2013). As medidas dos diâmetros hidrodinâmicos das nanopartículas foram obtidas por meio de espalhamento de luz dinâmico (DLS). Os ensaios de fluorescência com EtBr e os experimentos de eletroforese mostraram que os derivados de PLL são capazes de formar poliplexos em baixas razões N/P. Entretanto como a força de interação é dependente desta razão, a análise por DLS teve como objetivo verificar o efeito da razão N/P e do pH sobre o tamanho das nanopartículas hidratadas bem como sua carga superficial e estabilidade. Em geral, em pH 5,0 os poliplexos diminuem de tamanho com o aumento da razão N/P, uma vez que a densidade de carga positiva no complexo é aumentada. Uma variação brusca no diâmetro hidrodinâmico das partículas pode ser notado na razão N/P 1 (Figura 26). Este 62 comportamento pode ser atribuído à neutralização das cargas negativas do pDNA com as cargas positivas do policátion resultando na minimização da repulsão eletrostática e consequ