UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista AVALIAÇÃO DE MOLÉCULAS BIOATIVAS COMO INIBIDORES DO SISTEMA ANTIOXIDANTE DE PEROXIRREDOXINAS 2-CYS TÍPICAS (AhpC) EM BACTÉRIAS MELINA CARDOSO DOS SANTOS SÃO VICENTE – SP 2021 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS CÂMPUS DO LITORAL PAULISTA AVALIAÇÃO DE MOLÉCULAS BIOATIVAS COMO INIBIDORES DO SISTEMA ANTIOXIDANTE DE PEROXIRREDOXINAS 2-CYS TÍPICAS (AhpC) EM BACTÉRIAS MELINA CARDOSO DOS SANTOS PROF. DR. MARCOS ANTONIO DE OLIVEIRA Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus do Litoral Paulista, UNESP, para obtenção do título de Doutora no Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade de Ambientes Costeiros. SÃO VICENTE - SP 2021 S237a Santos, Melina Cardoso dos Avaliação de moléculas bioativas como inibidores do sistema antioxidante de peroxirredoxinas 2-Cys típicas (AhpC) em bactérias / Melina Cardoso dos Santos. -- São Vicente, 2021 317 p. : il., tabs. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências, São Vicente Orientador: Marcos Antonio de Oliveira 1. Biologia molecular. 2. Antibióticos. 3. Peroxirredoxinas. 4. Inibição enzimática. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências, São Vicente. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista Dedico este trabalho aos meus pais, Neuza e Adilson. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista AGRADECIMENTOS Aos membros da banca examinadora, por participarem da avaliação do meu trabalho, contribuindo para a qualidade da análise dos meus resultados. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (Processos n° 2017/06263-4 e 2017/19942-7) e ao Centro de Pesquisa, Inovação e Difusão (CEPID) Redoxoma (Processo n° 2013/07937-8), pelo suporte financeiro para a execução deste trabalho. Ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade de Ambientes Costeiros do Instituto de Biociências do Campus do Litoral Paulista (São Vicente), pela formação e pela oportunidade de cursar a pós-graduação. À Universidade Estadual Paulista – Campus do Litoral Paulista, por ceder a estrutura para a execução deste trabalho, e a todos os funcionários e professores. Ao Prof. Dr. Marcos Toyama, por permitir utilizar as facilidades do Laboratório de Biologia Molecular de Proteínas e Peptídeos, e às doutorandas Mariana e Carol, pelo imenso auxílio nos experimentos de análises estruturais, e também pela amizade e parceria. Ao Prof. Dr. Denis Abessa e a toda a sua equipe por me permitir utilizar a estrutura do Laboratório do Núcleo de Estudos em Poluição e Ecotoxicologia Aquática, em especial à doutoranda Guacira pela amizade de longa data. Ao Prof. Dr. João Lago e à doutoranda Deborah Sessa pelo fornecimento dos compostos naturais utilizados neste trabalho. Agradeço ainda ao Prof. Dr. João pelas muitas discussões e sugestões sempre pertinentes. Ao Prof. Dr. Marcelo Brocchi e à Dra. Ana Cauz, por me acompanharem durante os experimentos com bactérias e por todas as discussões e sugestões muito proveitosas. Ao Prof. Dr. Luís Netto, pelas inúmeras discussões, sugestões e contribuições para este trabalho, bem como por ter disponibilizado a estrutura de seu laboratório. Agradeço também a toda equipe do Laboratório de Genética e Biologia Molecular de Oxidantes e Radicais Livres. Em especial, agradeço à Dra. Renata pela amizade e apoio toda vez que eu ficava perdida no laboratório. Ao Me. Alegria pela ajuda em diversos experimentos e ao Dr. Fernando pelo auxílio com os experimentos de western blotting. Ao Dr. Carlos Tairum, por todos os ensinamentos desde a minha iniciação científica, UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista pelas incontáveis ajudas durante esses nove anos de parceria e por ser um grande profissional e amigo. A todo o pessoal do Laboratório de Biologia Molecular Estrutural, aos que ainda permanecem e aos que já seguiram outros caminhos. Agradeço pela ajuda com os experimentos, pela constante troca de ideias e pelo companheirismo. Em especial, agradeço às mestrandas Ana, Vitória e Gabriella, pela amizade, conversas, conselhos e tardes com bolo. Ao Dr. Leonardo e Dr. Breyer por toda colaboração, ajuda e paciência de sempre. À Luciana, pela competência e organização. Às minhas co-orientadas Beatriz, Heloisa e Camila, agradeço por me auxiliarem nos experimentos, me permitirem participar do trabalho de vocês, passando um pouco do que aprendi, e por terem me ensinado tantas outras coisas. À Prof a Dr a Gisele Monteiro, por ser um exemplo de profissional e uma pessoa admirável. Ao Prof. Dr. Marcos Antonio de Oliveira, por me orientar desde o meu primeiro ano de graduação, sendo um grande exemplo de profissionalismo, competência e amor pela ciência. Você é uma grande inspiração para mim, Marcão, e tem toda a minha admiração e respeito. Muito obrigada por todo o apoio! Aos meus pais, Neuza e Adilson, pelo apoio incondicional, por serem a minha base e o meu porto seguro, ao meu irmão Felipe e minha cunhada Cláudia, pelo companheirismo e por aturar minhas muitas visitas, e também à Penélope, Laila e Tina, por conseguirem me alegrar até nos dias mais difíceis. Ao Daniel, por ter compartilhado grande parte dessa jornada comigo e ter estado ao meu lado nos momentos bons e ruins. Por fim, agradeço a todos que dedicam sua vida à ciência e enfrentam tantas adversidades na busca e difusão do conhecimento. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista RESUMO O aumento da resistência aos antibióticos por microrganismos tem crescido vertiginosamente e especialistas têm alertado quanto à rápida ineficácia dos medicamentos frente a linhagens de bactérias super-resistentes. A resistência de bactérias aos antibióticos pode estar diretamente relacionada ao estresse oxidativo, pois antibióticos distintos possuem a capacidade convergente de produzir espécies reativas de oxigênio, que causam danos às macromoléculas, em especial ao DNA, acentuando as taxas de mutação o que pode contribuir para o aparecimento de linhagens super-resistentes. Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio também são produzidas pelo sistema imunológico de hospedeiros para combater patógenos e estudos indicam que a inibição da expressão de enzimas antioxidantes de patógenos é capaz de gerar um aumento intracelular significativo dessas espécies, o que interfere de forma substancial na sua sobrevivência. Recentemente foi demonstrado que um composto natural denominado adenantina (Adn) é capaz de inibir a atividade peroxidásica de peroxirredoxinas (Prx) 2-Cys típicas de humanos (PrxI e PrxII), resultando na mortalidade de células tumorais, mas apresentando baixa toxicidade para células normais. As Prx 2-Cys são capazes de decompor hidroperóxidos utilizando um resíduo de cisteína (CysP) e sua a alta reatividade sobre diferentes tipos de hidroperóxido é alcançada por interações com os resíduos de Thr/Ser e Arg, absolutamente conservados entre as Prx 2-Cys. Em conjunto, CysP, Thr/Ser e Arg, recebem o nome de tríade catalítica (TC). As Prx 2-Cys típicas também estão presentes em bactérias e são denominadas de AhpCs, sendo consideradas como uma das frentes de defesa oxidativas fundamentais para o patógeno. Em projeto anterior, avaliamos os efeitos da presença do resíduo de Thr ou Ser na TC de duas Prx-2 Cys típicas de levedura sobre a atividade inibitória de Adn. Demonstramos então que Adn possui maior afinidade por enzimas contendo Ser na TC e que a presença da Ser nesta posição existe essencialmente em procariotos, sobretudo em bactérias. No presente estudo, dando continuidade a este trabalho, verificamos que AhpCs contendo uma Ser na TC são mais resistentes à superoxidação e apresentariam ainda uma atividade de holdase em situações de estresse térmico mais acentuada do que AhpCs contendo uma Thr nessa posição. Uma vez que o estresse oxidativo e térmico são barreiras impostas à infecção por bactérias pelo organismo hospedeiro, a inibição desse sistema de defesa poderia constituir uma estratégia de importância no combate a esses patógenos. Nesse sentido, avaliamos a capacidade inibitória de Adn sobre AhpCs e verificamos que Adn apresenta maior afinidade por AhpC de Escherichia coli (EcAhpC), independente da presença de Thr ou Ser na TC (EcAhpCWT e EcAhpCT44S) do que para as isoformas de humanos, apresentando um valor de IC50 ≈ 5 e 50 vezes inferior do que para PrxI e PrxII, respectivamente. Adicionalmente, observamos que Adn também inibiu a atividade de Trx de E. coli (EcTrx1) com maior eficiência que a Trx de humanos. Verificamos ainda que Adn mostrou-se tóxica para bactérias Gram-positivas, apresentando valores de IC50 na faixa de 110-140µM, e para Gram-negativa (E. coli) quando tratadas com polimixina B nonapeptídeo (PMBN). Uma vez que PMBN também apresenta atividade antibiótica, sua utilização em associação com Adn pode representar uma potencial nova terapia antimicrobiana. Adicionalmente, realizamos uma triagem de compostos naturais oriundos da biota florística do Estado de São Paulo e identificamos uma molécula capaz de inibir a atividade peroxidásica de EcAhpC com eficiência semelhante à Adn, além de inibir também EcTrx1 com menor eficiência. Este composto representa o primeiro inibidor de Prx da classe das lactonas sesquiterpênicas, além de ser também o primeiro inibidor proveniente da biodiversidade brasileira. Por fim caracterizamos uma nova tiól proteína de X. fastidiosa e demonstramos que ela é capaz de proteger as células bacterianas contra o cianeto e o estresse oxidativo gerado por H2O2. Coletivamente os resultados obtidos neste trabalho contribuem para a descoberta de novas abordagens de combate a bactérias patogênicas. PALAVRAS CHAVE: Peroxirredoxinas, antibióticos, inibidores, adenantina. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista ABSTRACT The increase in resistance to antibiotics by microorganisms has grown dramatically and experts have warned of the rapid ineffectiveness of drugs against super-resistant bactéria strains. The bacterial resistance to antibiotics can be directly related to oxidative stress, since different antibiotics have the convergent capacity to produce reactive oxygen species, which cause damage to macromolecules, especially to DNA, increasing mutation rates, which can contribute to appearance of super-resistant strains. Reactive oxygen and nitrogen species are also produced by the host immune system to combat pathogens and studies indicate that inhibition of the expression of pathogen antioxidant enzymes is able to generate a significant intracellular increase in these species, which significantly interferes in their survival. It has recently been demonstrated that a natural compound named adenantin (Adn) is able to inhibit the peroxidase activity of typical 2-Cys peroxyredoxins (Prx) from humans (PrxI and PrxII), resulting in the mortality of tumor cells, but presenting low toxicity to normal cells . 2-Cys Prx are capable of decomposing hydroperoxides using a cysteine residue (CysP) and their high reactivity over different types of hydroperoxide is achieved by interactions with Thr/Ser and Arg residues, absolutely conserved between 2- Cys Prx. Together, CysP, Thr / Ser and Arg, are called catalytic triad (CT). Typical 2-Cys Prx are also present in bacteria and are named AhpC, being considered one of the fundamental oxidative defense fronts for the pathogen. In a previous project, we have evaluated the effects of the presence of the Thr or Ser residue on the TC of two yeast typical 2-Cys Prx on the inhibitory activity of Adn. We then demonstrated that Adn has higher affinity for enzymes containing Ser on TC and that the presence of Ser in this position exists essentially in prokaryotes, especially in bacteria. In the present study, continuing this work, we have found that AhpCs containing a Ser on TC are more resistant to overoxidation and would have higher holdase activity during thermal stress than AhpCs containing a Thr in that position. Since oxidative and thermal stress are barriers imposed to bacteria infection by the host organism, the inhibition of this defense system could be an important strategy in the fight against these pathogens. So, we have evaluated the inhibitory capacity of Adn over AhpCs and found that Adn has a higher affinity for AhpC of Escherichia coli (EcAhpC), regardless of the presence of Thr or Ser on TC (EcAhpCWT and EcAhpCT44S), than for human isoforms, presenting an IC50 value ≈ 5 and 50 times lower than for PrxI and PrxII, respectively. Additionally, we observed that Adn also inhibited E. coli Trx activity (EcTrx1) with higher efficiency than human Trx. We also found that Adn was toxic to Gram-positive bacteria, with IC50 values in the range of 110-140µM, and to Gram-negative (E. coli) when treated with polymyxin B nonapeptide (PMBN). Since PMBN also has antibiotic activity, its use in association with Adn may represent a potential new antimicrobial therapy. Additionally, we carry out a screening of natural compounds from the floristic biota of the State of São Paulo and identified a molecule capable of inhibiting the peroxidase activity of EcAhpC with similar efficiency to Adn, besides inhibiting EcTrx1 with less efficiency. This compound represents the first Prx inhibitor in the sesquiterpene lactone class, in addition to being the first inhibitor derived from Brazilian biodiversity. Finally, we have characterized a new thiol protein from Xylella fastidiosa and demonstrated that it is able to protect bacterial cells against cyanide and oxidative stress generated by H2O2. Collectively, the results obtained in this work contribute to the discovery of new approaches to combat pathogenic bacteria KEYWORDS: Peroxiredoxins, antibiotics, inhibitors, adenanthin. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista LISTA DE FIGURAS Figura 1: Representação das reações de Fenton e de Harber-Weiss. ............................. 16 Figura 2: Substituição de Thr (presente em eucariotos) por Ser (presente em procariotos) na TC das Prx. ................................................................................................................ 23 Figura 3: Ciclos de oxirredução envolvidos na redução de hidroperóxidos por Prx 2-Cys típicas de eucariotos e bactérias...................................................................................... 25 Figura 4: Comparação entre estruturas de Trx e TrxR de bactéria e de humanos e AhpF de bactérias. .................................................................................................................... 26 Figura 5: Resultados das purificações das AhpCs contendo Thr ou Ser como parte da TC. .................................................................................................................................. 37 Figura 6: Avaliação da inibição da atividade de AhpC contendo Thr na TC e mutantes Thr→Ser através do ensaio de oxidação de DTT. .......................................................... 38 Figura 7: Avaliação da inibição da atividade de AhpC contendo Ser na TC e mutantes Ser→Thr através do ensaio de oxidação de DTT. .......................................................... 39 Figura 8: Ensaio acoplado de oxidação de NADPH e resultado de expressão e purificação de EcTrx1 e EcTrxR. ................................................................................... 42 Figura 9: Inibição da formação de dissulfeto intermolecular e atividade peroxidásica de EcAhpC WT e EcAhpC T44S por Adn. ................................................................................ 44 Figura 10: Ensaio de inibição do sistema redutor de Tsa1 por Adn. .............................. 46 Figura 11: Avaliação de inibição de sistemas redutores de AhpC por Adn. .................. 47 Figura 12: Ensaio de oxidação de NADPH com o sistema Trx de S. cerevisiae pré- tratado com Adn. ............................................................................................................ 48 Figura 13: Superfícies moleculares de AhpC e de enzimas de sistemas redutores e quantificação de cisteínas livres em EcTrxR e ScTrxR. ................................................ 50 Figura 14: Viabilidade celular de B. subtilis, S. aureus, S. epidermidis, E. coli, P. aeruginosa e S. typhimurium após tratamento com Adn. ............................................... 52 Figura 15: Avaliação da toxicidade de EDTA combinado a ampicilina e Adn sobre E. coli: ................................................................................................................................. 54 Figura 16: Avaliação da toxicidade de Adn associada a PMBN sobre E. coli. .............. 56 Figura 17: Estruturas químicas de inibidores de Prx2 2-Cys típicas. ............................. 57 Figura 18: Estrutura dos compostos naturais, isolados da biota florística de São Paulo, selecionados para o desenvolvimento do estudo. ........................................................... 58 Figura 19: Avaliação de inibição da atividade peroxidásica de EcAhpC WT . ................. 59 Figura 20: Avaliação de inibição da atividade peroxidásica de EcAhpC T44S . ................ 59 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista Figura 21: Avaliação da inibição da formação de dissulfeto intermolecular em EcAhpC. ........................................................................................................................................ 60 Figura 22: Inibição da formação de dissulfeto intermolecular e atividade peroxidásica de EcAhpC WT e EcAhpC T44S por C-3. ................................................................................. 62 Figura 23: Avaliação de inibição da atividade de EcTrx1.............................................. 63 Figura 24: Avaliação de inibição da atividade peroxidásica de EcTrxR. ....................... 64 Figura 25: Avaliação de inibição da atividade oxidoredutase de EcAhpF. .................... 64 Figura 26: Viabilidade celular de E. coli, P. aeruginosa, B. subtilis e S. epidermidis após tratamento com C-3. ............................................................................................... 66 Figura 27: Ensaio de oxidação NADPH para avaliação da superoxidação AhpC de P. aeruginosa e S. epidermidis utilizando o sistema Trx heterólogo E. coli. ..................... 67 Figura 28: Estruturas químicas de inibidores de identificados para AhpC e de hidroperóxidos orgânicos. .............................................................................................. 68 Figura 29: Desenovelamento térmico de PaAhpC, SeAhpC e mutantes monitorado por fluorimetria de varredura diferencial. ............................................................................. 69 Figura 30: Proteção comparativa de PaAhpC e SeAhpC contra a agregação da citrato sintase (CS) induzida por estresse térmico. .................................................................... 70 Figura 31: Envolvimento de resíduos de cisteína na atividade de sulfutransferase de GLP. ................................................................................................................................ 72 Figura 32: A expressão heteróloga de GLP confere alta resistência ao cianeto em E. coli. ........................................................................................................................................ 72 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista LISTA DE TABELAS Tabela 1: Oligonucleotídeos utilizados para a clonagem dos genes .............................. 30 Tabela 2: Oligonucleotídeos utilizados para as mutações Thr/Ser nos genes ahpC. ..... 31 Tabela 3: Velocidade inicial (v0) de enzimas AhpCs contendo Thr ou Ser como parte da TC de diferentes espécies de bactérias tratadas (Adn+) ou não (Adn-) com o inibidor Adn ................................................................................................................................. 41 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista LISTA DE ABREVIATURAS Adn Adenantina AhpC Alquil hidroperóxido redutase subunidade C AhpF Alquil hidroperóxido redutase subunidade F C-3 Composto 3 Cat Catalase CHP Hidroperóxido de cumeno CysP Cisteína peroxidásica CysR Cisteína de resolução DTNB Ácido 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzóico) EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético ERNs Espécies reativas de nitrogênio EROs Espécies reativas de oxigênio FF Fully folded (totalmente enovelado) IAA 2-iodoacetamida IPTG Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósideo LU Locally unfolded (parcialmente desenovelado) MDR Resistente a múltiplas drogas ME Membrana externa MIC Concentração inibitória mínima MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina NADH β-nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido NADPH β-nicotinamida adenina dinucleotídeo 2-fosfato reduzido NTD Domínio N-terminal PMBN Polimixina B nonapeptídeo Prx Peroxirredoxina SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil- sulfato de sódio Sod Superóxido dismutase TC Tríade catalítica TCA Ciclo dos ácidos tricarboxílicos Trx Tiorredoxina TrxR Tiorredoxina redutase Tsa 1/2 Thiol-specific antioxidante 1/2 UFC Unidades formadoras de colônia UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 14 1.1 Bactérias resistentes a múltiplos antibióticos ....................................................... 14 1.2 A letalidade de antibióticos é acompanhada pela geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) ......................................................................................................... 16 1.3 Defesas oxidativas do organismo hospedeiro na infecção por patógenos ............ 17 1.4 Peroxirredoxinas e sua importância em bactérias patogênicas ............................. 18 1.5 Inibição de Prx2-Cys típicas por Adenantina (Adn) ............................................. 22 1.6 Diferenças entre Prx 2-Cys de eucariotos e procariotos ....................................... 23 1.7 Presença de Ser na TC é mais comum em Prx 2-Cys típicas bacterianas ............ 24 1.8 Efeitos da Adn sobre o sistema redutor das Prx 2-Cys típicas ............................. 25 2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 28 3. JUSTIFICATIVA ....................................................................................................... 28 4. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 29 4.1 Reagentes .............................................................................................................. 29 4.2 Meios de cultura para bactérias............................................................................. 29 4.3 Linhagens de E. coli para expressão de proteínas recombinantes ........................ 29 4.4 Plasmídeos de expressão e genes de proteínas alvo.............................................. 29 4.5 Mutações sítio dirigidas ........................................................................................ 31 4.6 Expressão e purificação em bactérias de proteínas selvagens e mutantes ............ 31 4.7 Quantificação de proteínas .................................................................................... 32 4.8 Tratamento das proteínas com os compostos ....................................................... 32 4.9 Verificação da ligação dos compostos ao sítio ativo das AhpC por SDS-PAGE . 33 4.10 Ensaio de oxidação de DTT ................................................................................ 33 4.11 Análise da inibição dos compostos sobre a atividade de AhpC e sistema Trx ... 33 4.12 Análise da inibição dos compostos sobre a atividade de AhpF .......................... 34 4.13 Quantificação das Cys livres de EcTrxR e ScTrxR ............................................ 34 4.14 Avaliação do meio de cultura ............................................................................. 34 4.15 Determinação da concentração inibitória mínima (MIC) ................................... 35 4.16 Permeabilização da membrana externa (ME) de E. coli ..................................... 35 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 36 5.1 Inibição de AhpC contendo Thr ou Ser na TC por Adn ....................................... 36 5.1.1 Obtenção de AhpC selvagens e contendo a mutação Thr ⇄ Ser ................... 36 5.1.2 Avaliação da inibição de AhpC por Adn através de ensaio de oxidação de DTT ......................................................................................................................... 38 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 5.1.3 Avaliação de inibição de AhpC por Adn pelo ensaio acoplado de oxidação de NADPH ................................................................................................................... 41 5.1.4 Determinação do IC50 aparente pelo ensaio acoplado de oxidação de NADPH ................................................................................................................................. 43 5.1.5 Avaliação de inibição de Adn sobre proteínas do sistema redutor de EcAhpC (EcTrx1, EcTrxR e EcAhpF) .................................................................................. 46 5.1.6 Avaliação da toxicidade de Adn sobre células bacterianas ............................ 51 5.1.7 A influência da membrana externa de bactérias Gram-negativas sobre a toxicidade de Adn.................................................................................................... 52 5.2 Avaliação de compostos naturais oriundos da biota florística de São Paulo sobre AhpC e seu sistema redutor ........................................................................................ 56 5.2.1 Avaliação da atividade inibitória dos compostos naturais sobre AhpC de E. coli por meio do ensaio de oxidação de NADPH.................................................... 56 5.2.2 Determinação do IC50 aparente de C-3 para EcAhpC WT e EcAhpC T44S ........ 61 5.2.3 Avaliação da atividade inibitória dos compostos naturais sobre sistemas redutores de AhpC ................................................................................................... 63 5.2.4 Avaliação da toxicidade de C-3 sobre células bacterianas ............................. 65 5.3 A importância da presença de Thr ou Ser na TC das AhpC na suscetibilidade à superoxidação ............................................................................................................. 66 5.4 Caracterização de uma nova enzima antioxidante presente somente em bactérias envolvidas na resistência ao estresse por cianeto e oxidativo .................................... 71 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................................... 73 7. PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 75 REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 78 APÊNDICES .................................................................................................................. 88 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 14 1. INTRODUÇÃO 1.1 Bactérias resistentes a múltiplos antibióticos Os antibióticos revolucionaram a medicina humana e veterinária e são considerados um dos maiores avanço da medicina do século XX. O período que compreende os anos 1950 e 1970 foi o auge das descobertas de novas classes de antibióticos (Aminov, 2010; Strebhardt e Ullrich, 2008). Entretanto, após este período, o número de novos antibióticos se tornou muito escasso e a principal abordagem para o desenvolvimento de novos medicamentos para combater a resistência emergente e re- emergente de patógenos a antibióticos tem sido, em sua grande maioria, baseada na modificação dos antibióticos existentes, inclusive por razões econômicas (Chopra et al., 2002; Docquier & Mangani, 2018; Fernandes et al., 2017; Mendes, et al. 2014). Este decréscimo no desenvolvimento de novos fármacos ocorre devido a obstáculos econômicos e regulatórios bem como fusões empresariais que reduziram substancialmente o número de pesquisas. Das 18 maiores empresas farmacêuticas, 15 abandonaram a produção de antibióticos (Bartlett et al., 2013; Piddock, 2012). Por outro lado, as taxas de mortalidade relacionadas às infecções bacterianas resistentes a múltiplas drogas (Multi Drug Resistance - MDR) têm se tornado cada vez mais elevadas, o que constitui um grave problema de saúde em todo o mundo e a Organização Mundial da Saúde (OMS) alerta para os impactos desastrosos do aumento da resistência a antimicrobianos em um futuro próximo. A resistência de microorganismos a antibióticos de segunda e terceira geração, os quais constituem as últimas linhas de defesa contra infecções comuns, deve dobrar entre os anos de 2005 e 2030 e as mortes provocadas anualmente em todo o mundo por essas doenças passariam das centenas de milhares para dezenas de milhões até 2050 (WHO/IACG, 2019). Na União Europeia (UE), mais de 33 mil pacientes morrem por ano em decorrência de infecções ocasionadas por 16 bactérias MDR (Cassini et al., 2019). Nos Estados Unidos da América (EUA), cerca de 63.000 pacientes morrem anualmente como consequência de infeções hospitalares ocasionadas por bactérias MDR (Ventola et al., 2015). Os custos econômicos estimados na UE revelam que os gastos para o sistema de saúde em conjunto com a perda de produtividade dos pacientes geraram um prejuízo aproximado de 1.5 bilhão de euros por ano (ECDC / EMEA Joint Working Group, 2009; Dadgostar et al., 2019). Em período similar, o custo anual do tratamento de infecções hospitalares nos EUA de apenas seis espécies de bactérias MDR foi estimado em aproximadamente UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 15 1.9 bilhão de dólares (Ventola et al., 2015). Em 2013, o CDC (Centers for Disease Control and Prevention - CDC) dos EUA declarou que estamos na "era pós-antibiótica" e esta declaração está alinhada com a OMS que, em 2014, alertou que a crise de resistência aos antibióticos está se tornando alarmante uma vez que o percentual de bactérias MDR aumenta ano a ano (Michael et al., 2014; Reardon, 2015). No Brasil, infelizmente, esses dados não são claros, mas a preocupação com os danos provocados pela crescente resistência de organismos a antimicrobianos levou à elaboração do ―Plano de Ação Nacional de Prevenção e Controle da Resistência aos Antimicrobianos no Âmbito da Saúde Única‖, com vigência de 2018 a 2022 (PAN-BR) (Ministério da Saúde, 2018). Nesse sentido, novas abordagens voltadas para o tratamento dessas das infecciosas causadas por esses agentes seriam de grande importância tanto clínica quanto financeira. Entre os patógenos Gram-positivos, a maior ameaça para uma pandemia global é representada por bactérias como Staphylococcus aureus e o gênero Enterococcus (CDC, 2013; Rossolini, 2014). De fato, ainda na década de 1960 já foram descritos isolados de Staphylococcus resistentes à meticilina, denominados de MRSA (para Methicillin- resistant Staphylococcus aureus). Nessa época, para o tratamento das infecções causadas por este agente etiológico, foi utilizada a vancomicina. Entretanto, duas décadas mais tarde, foram identificadas linhagens resistentes à vancomicina e atualmente as MRSA representam uma grande ameaça à saúde pública mundial (Ventola et al., 2015). De fato, somente nos EUA, a MRSA é responsável por mais mortes todos os anos do que AIDS, doença de Parkinson, enfisema e homicídio juntos (CDC, 2013). Apesar da resistência aos antibióticos anti-MRSA geralmente ocorrer através de mutações, existem estudos que demonstram a transferência de genes de resistência aos antibióticos linezolida (oxazolidinonas) e glicopeptídeos, aspecto de grande gravidade (Chen et al., 2020; Rossolini et al., 2014). Bactérias Gram-negativas também trazem preocupação porque estão se tornando resistentes a quase todos os antibióticos disponíveis (Eichenberger e Thaden, 2019; Golkar et al., 2014; Rossolini et al., 2014). O surgimento de bacilos Gram-negativos MDR tem tido grande impacto na medicina, e as infecções mais graves ocorrem em ambientes hospitalares sendo as mais comuns causadas por Enterobacteriaceae (principalmente Klebsiella pneumoniae), Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter (CDC, 2013; Feretzakis et al., 2019; Rossolini et al., 2014). Bactérias patogênicas Gram-negativas MDR como Escherichia UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 16 coli e Neisseria gonorrhoeae também estão se tornando cada vez mais prevalentes em ambientes hospitalares, e já foi demonstrado que diversas linhagens produzem β- lactamases capazes de inibir a ação de antibióticos β-lactâmicos (Dryden, 2018; Ventola, 2015). 1.2 A letalidade de antibióticos é acompanhada pela geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) Diversos estudos indicam que diferentes classes de antibióticos, independentemente das suas interações fármaco-alvo, geram níveis variáveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) que contribuem significativamente para a morte celular dos patógenos (Bizzini et al., 2009; Breidenstein et al., 2008; Brynildsen et al., 2013; Calhoun et al., 2011; Davies et al., 2009; Dryden, 2018; Foti et al., 2012; Girgis et al., 2009; Grant et al., 2012; Gusarov et al., 2009; Jee et al., 2016; Kang et al., 2012; Kohanski et al., 2008; Ling et al., 2012; Nguyen et al., 2011; Shatalin et al., 2011; Wang et al., 2010; Yeom et al., 2010). Apesar de existir ainda grande debate sobre a relação de antibióticos, geração de EROs e letalidade em patógenos, trabalhos recentes utilizando as mais distintas abordagens reforçam as conclusões obtidas pelos diferentes grupos de pesquisa (van Acker et al., 2016; Dwyer et al., 2014; Ibacache-Quiroga et al., 2018; Jiang et al., 2020). Neste contexto, foi demonstrado que as três principais classes de drogas bactericidas utilizam um mecanismo comum que estimula a produção de radicais hidroxila (HO • ) por meio de reações químicas de Fenton (Figura 1A). De fato, a administração de quelantes de ferro (Fe) atenua a morte por fármacos bactericidas, sugerindo que os radicais hidroxila contribuem para a morte das bactérias tratadas com antibióticos. Neste contexto é importante salientar que a produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) por meio da dismutação efetuada pela enzima superóxido dismutase (Sod) também pode favorecer a formação de HO • . Além disso, o H2O2 juntamente com o radical ânion superóxido (O2 • ) também é capaz de produzir HO • por meio da reação de Harber-Weiss (Figura 1) (Halliwell & Gutteridge, 2010). A) Reações de Fenton: Fe 3+ O2 ●-  Fe 2+ + O2 (Reação 1) Fe 2+ + H2O2  Fe 3+ + OH - + HO ● (Reação 2) B) Reação de Haber-Weiss: H2O2 + O2 ●-  O2 + HO ● + OH - Figura 1: Representação das reações de Fenton e de Harber-Weiss. (A) A Reações de Fenton ocorre entre uma molécula de Fe 3+ e molécula de radical ânion superóxido e resulta na formação de Fe 2+ que, ao UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 17 reagir com peróxido de hidrogênio, produz o radical hidroxila. (B) Representação da reação de Haber Weiss, originando radical hidroxila a partir da reação entre o peróxido de hidrogênio o e ânion superóxido. Ponto de importância reside no fato que, apesar dos diferentes fármacos bactericidas (β-lactâmicos, aminoglicosídeos e fluoroquinolonas) terem diferentes alvos biológicos (proteínas de ligação à penicilina, ribossomo e topoisomerase, respectivamente), todos eles convergem em uma via comum. Essa via é baseada na produção de oxidantes através de resposta metabólica envolvendo o ciclo dos ácidos tricarboxílicos (tricarboxylic acid cycle – TCA) que induz a rápida depleção de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH), resultando em uma hiperativação da cadeia de transporte de elétrons, o que aumenta a produção de produtos secundários como o radical ânion superóxido (O2 •- ) e o peróxido de hidrogênio (H2O2) (Kohanski et al., 2010). O O2 •- pode atacar grupamentos ferro-enxofre (Fe-S) presentes em diversas proteínas podendo levar à disponibilização de Fe ferroso (Fe 2+ ) que participa da reação de Fenton, resultando em formação de HO • , o que auxilia na morte celular (Kohanski et al., 2010). Cabe ressaltar que o H2O2 também é capaz de danificar grupos Fe-S levando à disponibilização de Fe 2+ (Imlay, 2008; Jang et al., 2010), o que deve maximizar este processo e levar a mais danos celulares. É importante salientar que, apesar de baixas doses de antibióticos estarem associadas ao aparecimento de bactérias resistentes em função das mutações provocadas no DNA, altas concentrações ou concentrações apropriadas de antibióticos levam a sérios danos em biomoléculas, o que impossibilita ou decresce fortemente as taxas de sobrevivência do patógeno (Dryden, 2018; Giguère et al., 2007). 1.3 Defesas oxidativas do organismo hospedeiro na infecção por patógenos Quando um patógeno invade um hospedeiro, um dos mecanismos de defesa mais estudados é denominado de explosão respiratória (respiratory burst), o qual se caracteriza pela geração de grandes quantidades de espécies reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio (ERNs). A geração de EROs é devida à ativação de uma multicomponente oxidase (NADPH oxidase, também denominado de fagócito oxidase), que oxida o NADPH e, no processo, reduz o oxigênio a O2 •- (Halliwell & Gutteridge, 2015). Em neutrófilos, essa reação oxidativa é disparada pelos sinais de ativação e acompanha a fagocitose (Babior, 2004). Quando o radical O2 •- sofre dismutação, produz UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 18 H2O2, o qual é altamente difusível no organismo e capaz de desencadear mecanismos potencialmente tóxicos para as células (Gordon, 2016; Halliwell e Gutteridge, 2015; Underhill e Ozinsky, 2002). O H2O2, por si só, não é capaz de destruir eficientemente o patógeno, entretanto, ao ser convertido em HO • , pode atingir e destruir membranas celulares, proteínas e causar mutações em ácidos nucleicos (Halliwell e Gutteridge, 2015). Outra forma de eliminar os organismos invasores é através da produção do radical óxido nítrico (NO • ). O NO • é gerado quando ocorre a oxidação da arginina na presença da molécula de oxigênio, sendo esta reação catalisada pela enzima óxido nítrico sintetase (NOS) (Fritzsche et al., 2010; Prolo et al., 2013). O NO • , por sua vez, pode levar à formação de peroxinitrito (ONOO - ), um potente agente oxidante cujos derivados são capazes de causar danos ao DNA e oxidação lipídica (Calcerrada et al., 2011; Niles et al., 2006; Radi, 2018). Se por um lado os organismos hospedeiros produzem EROs e ERNs como defesa oxidativa, os organismos patogênicos dispõem de enzimas antioxidantes capazes defendê-los dos efeitos tóxicos dessas espécies reativas e ajudá-los a superar a barreira oxidante imposta pelo hospedeiro, possibilitando assim a infecção, manutenção e crescimento. As enzimas antioxidantes utilizadas pelos patógenos para metabolizar as EROs e ERNs em produtos menos tóxicos ou atóxicos são representadas principalmente por enzimas como as superóxido dismutases (Sod), as catalases (Cat) e as peroxirredoxinas (Prx). Portanto, uma alternativa lógica seria a utilização de inibidores de enzimas antioxidantes em terapias antimicrobianas (Birben et al., 2012). No entanto, os hospedeiros, incluindo os humanos, possuem enzimas extremamente semelhantes às dos patógenos, principalmente quando se trata da Sod e Cat e os inibidores acabam por ser tóxicos também para as células dos hospedeiros (Benov e Fridovich, 1994; Brennan et al., 2015; Discola et al., 2005; Heikkila et al., 1977; Lu et al., 1998; Mishra e Imlay 2012; Roberts e Hirst, 1996; Sugadev et al., 2011). Neste contexto, um importante alvo seria a família das Prx, em razão de sua diversidade. 1.4 Peroxirredoxinas e sua importância em bactérias patogênicas As Prx constituem a última grande família de peroxidases a ser descoberta. Diferentemente da Sod e Cat, estas enzimas não possuem grupos prostéticos e utilizam um resíduo de cisteína (cisteína peroxidásica - CysP) altamente reativa para decompor hidroperóxidos (Jacobson et al., 1989; Kim et al., 1988; Netto et al., 1996). Quando se UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 19 analisa as estruturas quaternárias destas enzimas, observa-se que a CysP se encontra em grande proximidade com uma Thr (ou Ser, em alguns casos) e com uma arginina (Arg), a qual é totalmente conservada em todas as Prx já descritas até o momento. Estes três resíduos de aminoácidos (CysP, Thr/Ser e Arg) formam a tríade catalítica (TC) e todos apresentam importância na catálise, visto que a desprotonação e a manutenção de CysP na forma de tiolato (S - ) é dependente da integridade da TC (Tairum et al., 2016). Apesar de todas as Prx possuírem CysP, elas constituem uma família de enzimas bastante heterogênea e diversas classificações já foram propostas, sendo que a mais utilizada subdivide essas proteínas em três grandes grupos (Prx 1-Cys, Prx 2-Cys típicas e Prx 2-Cys atípicas) de acordo com a quantidade de resíduos de cisteína envolvidos no processo de redução do hidroperóxido (Wood et al., 2003). As Prx 1-Cys são proteínas homodiméricas que apresentam apenas um resíduo de cisteína (CysP) envolvido no ciclo catalítico localizado na região N-terminal. Já as Prx 2-Cys utilizam dois resíduos de cisteína, um na região N-terminal (CysP) e outro na C-terminal, denominado de cisteína de resolução (CysR), que durante o ciclo catalítico formam um dissulfeto CysP - CysR. As Prx 2-Cys típicas apresentam-se em homodímeros e a formação do dissulfeto CysP - CysR é intermolecular, ao passo que as Prx 2-Cys atípicas apresentam-se como monômeros ou homodímeros e formam um dissulfeto CysP - CysR intramolecular (Wood et al., 2003). Após sua oxidação, as Prx são geralmente reduzidas pelo sistema Trx, composto pelas enzimas tiorredoxina (Trx) e tiorredoxina redutase (TrxR), que utiliza elétrons provenientes do NADPH via uma molécula de FAD (flavina adenina dinucleotídeo). A redução pelo sistema Trx restaura a atividade peroxidásica das Prx, tornando-as aptas à decomposição de uma nova molécula de hidroperóxido. Entretanto, apesar das Prx 2-Cys de eucariotos serem reduzidas principalmente pelo sistema Trx, as Prx 2-Cys típicas de procariotos, denominadas AhpC (para alquil hidroperóxido redutase C), também possuem um sistema redutor adicional composto por enzimas denominadas AhpF (alquil hidroperóxido redutase F) que utilizam NADH como redutor (Jaeger et al., 2006; Jönsson et al., 2007). Outra característica apresentada pelas Prx 2-Cys típicas é o processo de superoxidação de CysP que, após atacar a molécula e hidroperóxido e assumir sua forma de ácido sulfênico (CysP-SOH), pode reagir com mais uma ou duas moléculas de hidroperóxido, gerando como intermediários a cisteína ácido sulfínico (CysP-SO2H) ou sulfônico (CysP-SO3H) (Poole et al., 2011). Nessas condições, CysP é incapaz de formar UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 20 o dissulfeto com CysR e, consequentemente, de ser reduzida por seus redutores endógenos e, portanto, a proteína perde sua atividade peroxidásica. A forma CysP-SO2H pode ser reduzida eficientemente pela sulfirredoxina (Srx), uma proteína de baixo peso molecular dependente de ATP, Mg2+ e um Cys tiól que é capaz de restaurar a capacidade peroxidásica das Prx. Já para a forma CysP-SO3H, até o momento, não foram encontrados redutores (Biteau et al., 2003). Existe um consenso de que a superoxidação das Prx 2-Cys típica é facilitada pelo atraso na formação do dissulfeto entre CysP e CysR, o que deixaria CysP-SOH disponível por mais tempo para interagir com outras moléculas de hidroperóxido (Poole et al., 2011; Wood et al., 2003). Esse atraso tem sido atribuído à presença do motivo Gly-Gly-Leu-Gly e de um prolongamento na região C-terminal (contendo o motivo Tyr-Phe) o qual está localizado próximo ao sítio ativo em Prx 2-Cys típicas eucarióticas. Em seu estado reduzido, CysP encontra-se na extremidade do chamado CysP-loop a uma distância de aproximadamente 14Å de CysR, na conformação denominada FF (fully folded - totalmente enovelada). Para que ocorra a formação do dissulfeto com CysR, é necessário haver um desenovelamento parcial dessa região que culmina com a aproximação das duas cisteínas e, consequentemente, com a formação do dissulfeto, em uma conformação denominada LU (locally unfolded – parcialmente desenovelada). Entretanto, durante a transição FF-LU, a cauda C-terminal precisa sofrer um deslocamento e esse processo pode atrasar a formação do dissulfeto e favorecer a superoxidação. Tanto o motivo Gly-Gly-Leu-Gly quanto o prolongamento C-terminal não existem nas AhpC, o que as torna mais resistentes ao processo de superoxidação, sendo denominadas de proteínas ―robustas‖, enquanto as proteínas eucarióticas são chamadas de ―sensíveis‖ (Poole et al., 2011; Wood et al., 2003). Recentemente, foi proposto que aminoácidos presentes no CysP-loop também teriam participação no desencadeamento de eventos de superoxidação através de interações com a cauda C- terminal (Kamariah et al., 2018), mas estudos mais aprofundados são necessários para se compreender como de fato essas interações acontecem. No que concerne à atividade das peroxidases, enquanto a Cat é capaz de decompor somente H2O2, embora com alta eficiência, as Prx 2-Cys típicas são capazes de decompor uma grande variedade de hidroperóxidos, dentre eles hidroperóxidos de lipídeos (Lp-OOH) e peroxinitrito (NOO-), com constantes de segunda ordem de 10 7-8 M -1 s -1 (Condeles et al., 2020, Ogusucu et al., 2007; Parsonage et al., 2005; Tairum et UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 21 al., 2016). Também foi demonstrado que as Prx 2-Cys típicas são capazes de decompor até mesmo peróxidos de proteínas e aminoácidos com eficiência moderada (10 4 M -1 s -1 ), o que revela sua grande versatilidade na decomposição de hidroperóxidos (Carvalho et al., 2017; Peskin et al., 2010). Adicionalmente, estas proteínas estão entre as mais abundantes em bactérias. Como exemplo, em E. coli as Prx estão entre as dez proteínas mais expressas (Link et al., 1997). Em bactérias patogênicas, a importância das Prx foi demonstrada em linhagens de Helicobacter pylori e Helicobacter hepaticus, agentes causadores de úlceras/gastrites estomacais e de hepatite crônica em mamíferos, respectivamente, os quais apresentam níveis elevados de hidroperóxidos de lipídeos quando o gene ahpC é deletado (Mehta et al., 2007). Resultados similares foram descritos para Campylobacter jejuni, o agente etiológico de gastroenterites (Oh e Jeon, 2014). Em Salmonella typhimurium, patógeno responsável por moléstias gastrointestinais, febre tifóide e septicemia, foi demonstrado que linhagens deficientes de Prx apresentam alteração da morfologia celular e proliferação reduzida. O estudo também revelou que quando uma AhpC é superexpressa em células de S. typhimurium nocauteadas para genes envolvidos na decomposição de peróxidos (ΔkatE, ΔkatG, ΔkatN, ΔahpC e ΔtsaA), o patógeno recupera as características da linhagem selvagem (Hébrard et al., 2009). Esses dados indicam que as Prx de S. typhimurium contribuem para a virulência do patógeno ao capacitá-lo a sobreviver às defesas do hospedeiro. Em Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose, a expressão de AhpC em isolados clínicos com a deleção de uma das isoformas de Cat (ΔkatG) é aumentada tanto no meio intracelular quanto no extracelular o que aparentemente é de importância para a manutenção da virulência de M. tuberculosis (Nieto et al., 2016). No caso de S. aureus, o agente etiológico de diversas infecções hospitalares, AhpC juntamente com Cat possuem papéis compensatórios e são fundamentais na sobrevivência e colonização do trato respiratório (Cosgrove et al., 2007). Estudos envolvendo metatranscriptoma de S. aureus e Staphylococcus epidermidis revelaram que ahpC é altamente expresso no trato respiratório, sendo que sua expressão é ao menos três vezes maior nesse ambiente quando comparado com os microrganismos crescidos em meio de cultura (~1320 reads per million × ~540 rpm) (Chaves-moreno et al., 2016). Com base nesses dados, podemos inferir que a inibição da atividade peroxidásica das Prx de patógenos consiste em uma abordagem promissora para o tratamento das doenças causadas por eles, pois UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 22 levaria a um aumento nos níveis intracelulares de hidroperóxidos nesses organismos o que pode contribuir com a diminuição das suas taxas de sobrevivência. 1.5 Inibição de Prx2-Cys típicas por Adenantina (Adn) Os compostos extraídos de plantas despertam um interesse especial da indústria farmacêutica em função de seu potencial para o desenvolvimento de novas drogas. Entre esses compostos naturais encontram-se os diterpenóides, uma ampla classe de metabólitos secundários com significativa atividade biológica que vem sendo investigada quanto à sua eficácia no tratamento de diversas doenças como câncer, doenças cardiovasculares e inflamatórias (Tirapelli et al., 2008). Foi demonstrado que a adenantina (Adn), um diterpenóide extraído das folhas de Isodon adenantha, possui propriedades antitumorais. Liu e colaboradores (2012) observaram que a Adn possui a capacidade de induzir a diferenciação de células de leucemia mieloide aguda (LMA) (Liu et al., 2012) através da inibição da atividade peroxidásica das isoformas citosólicas Prx1 e Prx2, as quais são evolutivamente relacionadas e compartilham homologia na sequência de aminoácidos (78% de identidade e 91% de similaridade) (Lee, et al., 2007). Também foi proposto um modelo de ligação em que a Adn interagiria com outros aminoácidos na região do sítio ativo, incluindo os resíduos da TC por meio de uma interação hidrofóbica com a Thr 49 e uma interação polar com a Arg 128 , sendo também estabilizada também por interações de caráter hidrofóbico com outros aminoácidos próximos ao sítio ativo da enzima (Leu 46 , Phe 50 , Val 51 , Ile 125 , Pro 148 e CysP). Consequentemente, a inibição da atividade peroxidásica dessas proteínas permitiria um acúmulo de H2O2 intracelular em níveis suficientes para a ativação das quinases reguladoras de sinal extracelular ERK1 e ERK2, levando ao aumento da expressão de proteínas β estimuladoras de ligação CCAAT (C/EBPβ), as quais conduziriam a diferenciação celular e consequente repressão do tumor (Liu et al., 2012; Liu et al., 2013). Adicionalmente, Hou e colaboradores observaram que a inibição de Prx1 e Prx2 por Adn foi capaz de induzir a morte de células de hepatocarcinoma (CHC) com mais eficiência do que a de células normais imortalizadas, além de inibir significantemente o crescimento de tumores xenográficos sem efeitos tóxicos significativos (Hou et al., 2014). Mais recentemente, também foi demonstrado que Adn é capaz de atuar sobre células tumorais pulmonares, causando apoptose e/ou promovendo a diferenciação de células leucêmicas (Mo et al., 2019), além de promover UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 23 efetivamente a morte de linhagens celulares de leucemia linfoblástica aguda precursora de células B (Fidyt et al., 2019). Entretanto, apesar da Adn possuir importância por inibir as Prx humanas, pouco se sabe a respeito de sua atividade sobre enzimas de outros organismos. 1.6 Diferenças entre Prx 2-Cys de eucariotos e procariotos Conforme mencionado anteriormente, uma diferença marcante entre as Prx 2- Cys típicas de procariotos e eucariotos reside na existência de um prolongamento C- terminal que insere uma α hélice nas enzimas de eucariotos e está relacionada com sua sensibilidade a superoxidação (Wood et al., 2003). Outra diferença existente entre as 2- Cys típicas de eucariotos e procariotos reside na ocorrência de Thr ou Ser na TC (Figura 2A e 2B). De fato, nas Prx 2-Cys típicas identificadas em mamíferos e, de forma geral, nos eucariotos (com exceção poucos organismos, o que será abordado posteriormente) possuem uma Thr como parte da TC ao passo que algumas bactérias possuem uma Ser. Figura 2: Substituição de Thr (presente em eucariotos) por Ser (presente em procariotos) na TC das Prx. (A) Estrutura cristalográfica de Tsa1 (1SBC) e (B) modelo teórico de Tsa1 T44S mostrando a rede de interações polares entre aminoácidos da TC (CysP, Thr/Ser e Arg). As estruturas estão representadas em sticks e coloridas em CPK (N=azul, O= vermelho e S=laranja claro). Os carbonos em Tsa1 estão representados em bege e cinza claro e de Tsa1 T44S em rosa e cinza claro. Nosso grupo de pesquisa explorou estas diferenças em um trabalho anterior utilizando a Prx Tsa1 de S. cerevisiae como modelo biológico para a compreensão da interação de Adn com as Prx 2-Cys típicas. Com o objetivo de mimetizar as Prx 2-Cys típicas de procariotos, realizamos o truncamento do prolongamento C-terminal (do aminoácido 176 ao 196) e geramos o mutante Tsa1 175ΔCT . Entretanto, essa proteína mutante não apresentou diferenças na interação com Adn em relação à proteína selvagem. Adicionalmente, assim como as proteínas encontradas em mamíferos, Tsa1 possui uma Thr como parte da TC. Para avaliar os efeitos da substituição de Thr por Ser, utilizamos a proteína mutante Tsa1 T44S . Nossos resultados revelaram que o resíduo de Thr/Ser está relacionado à manutenção da estrutura decamérica de Tsa1, uma vez que UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 24 a Tsa1 selvagem transita entre decâmeros (pentâmeros de dímeros do tipo [α2]5) quando reduzida, e dímeros, oligômeros de massa molecular intermediária e decâmeros quando oxidada, enquanto que o mutante Tsa1 T44S se apresenta como um decâmero constitutivo independente do estado redox (Tairum et al., 2016). S. cerevisiae também possui uma segunda Prx 2-Cys típica denominada de Tsa2, a qual guarda grande similaridade em relação à estrutura primária com Tsa1 (86% de identidade e 96% de similaridade). No entanto, curiosamente, esta enzima difere de Tsa1, e também das enzimas de mamíferos, por possuir naturalmente uma Ser como parte da TC. Ensaios de espectroscopia de dicroísmo circular (CD), cromatografia de exclusão molecular (SEC) e oxidação de NADPH, realizados por nosso grupo de pesquisa, revelaram que Adn é capaz de ligar-se ao sítio ativo de Tsa1 e Tsa2, provocando alterações nas estruturas secundária e quaternária, além de inibir parcialmente a atividade peroxidásica dessas proteínas. Entretanto, as análises revelaram que Adn promoveu maiores alterações na estrutura e atividade peroxidásica da mutante Tsa1 T44S e de Tsa2 WT do que de Tsa1 WT , indicando que a presença da Ser na TC poderia promover uma maior afinidade de Adn ao sítio ativo dessas proteínas (Apêndice B). 1.7 Presença de Ser na TC é mais comum em Prx 2-Cys típicas bacterianas Segundo dados da base GenBank do NCBI, quase a totalidade dos organismos eucariotos sequenciados até o momento possuem Prx 2-Cys com uma Thr na TC. Por outro lado, a TC contendo uma Ser é um evento mais comum em Prx de procariotos, especialmente em bactérias (dados apresentados no Apêndice E). Dentre os organismos que possuem Ser na TC das Prx, existe uma série de bactérias Gram-positivas do gênero Staphylococcus como Staphylococcus agalactiae, Staphylococcus castoreus, S. epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus gallolyticus, Staphylococcus equi e Staphylococcus pyogenes que são agentes etiológicos de várias doenças humanas como endocardite, septicemia, periodontite, infecções agudas do trato urinário, infecções de pele, dentre outros. Também foi identificada esta mutação nos patógenos Bacillus subtilis e Enterococcus faecalis. Algumas das doenças causadas por estes agentes constituem um sério problema de saúde pública uma vez ocorrem geralmente em ambiente hospitalar, podendo acometer pacientes imunocomprometidos e, em alguns casos, diversos UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 25 antibióticos não são capazes de eliminar estas bactérias pois são MDR (Egan et al., 2109; Oteo et al., 2015; Purrello et al., 2016). Neste contexto, a presença da Ser na TC das Prx 2-Cys de determinadas espécies de bactérias colocam a Adn como uma representante promissora de um novo fármaco antimicrobiano. Adicionalmente elaboramos uma revisão sobre peroxirredoxinas de microroganismos patogênicos que foi submetido ao periódico Applied Microbiology and Biotechnology (Apêndice D). 1.8 Efeitos da Adn sobre o sistema redutor das Prx 2-Cys típicas Soethoudt e colaboradores (2014) relataram que a Adn é capaz de se ligar em ambas as cisteínas das Prx de humanos (CysP e CysR) além de inibir também as enzimas do sistema Trx (hTrx e hTrxR). De fato, os autores demonstraram que, entre as enzimas analisadas, a hTrxR é a que sofre maior inibição pela Adn. Neste contexto, como mencionado anteriormente, o sistema redutor de 2-Cys eucarióticas difere significativamente do encontrado para a redução de AhpC. Enquanto em eucariotos o sistema e composto pela enzima Trx e pela flavoenzima TrxR e os equivalentes redutores são oriundos do NADPH (Figura 3A), em procariotos o sistema redutor é composto apenas pela flavoenzima AhpF que utiliza hidretos do NADH no processo de redução (Figura 3B). Figura 3: Ciclos de oxirredução envolvidos na redução de hidroperóxidos por Prx 2-Cys típicas de eucariotos e bactérias. A) As Prx 2-Cys típicas de células eucarióticas são reduzidas pelo sistema Trx que compreende as enzimas tiorredoxina, tiorredoxina redutase, uma flavoenzima, e NADPH. B) Em células procarióticas, as Prx 2-Cys típicas (AhpC) são reduzidas pela flavoenzima AhpF, que utiliza elétrons oriundos do NADH. De fato, em eucariotos inferiores também existe o sistema redutor Trx-TrxR. No entanto, estas enzimas normalmente estão associadas a diversos processos de NADP+ NADPH+H+ R-OH R-OOH CYS-S CYS-S CYS-SH CYS -S- CR-S CP-S CR-SH CP -S- TrxR Prx CYS-SH CYS -S- CYS-S CYS-S Trx FADOxi FADRed NADH R-OH R-OOH CYS-SH CYS -S- CR-S CP-S CR-SH CP -S- AhpC CYS-SH CYS -S- CYS-S CYS-S AhpF CYS-SH CYS -S- CYS-S CYS-S CYS-S CYS-S NADH+H+ NTD A) B) UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 26 oxirredução centrais como síntese de desoxirribonucleotídeos, reparação de proteínas danificadas oxidativamente, enovelamento de proteínas, metabolismo do enxofre, ativação de fatores de transcrição, entre outros (Lu e Holmgren, 2014; Vignols et al., 2005). Neste contexto, quando se analisa as estruturas de TrxR de procariotos e eucariotos, é possível perceber que as enzimas possuem estruturas muito distintas (Figura 4A e 4B, respectivamente). Apesar de ambas serem homodímeros, a enzima de bactérias é menor (~70kDa) quando comparada com a de eucariotos multicelulares (~100kDa). Adicionalmente, os motivos que contém as cisteínas catalíticas diferem de forma significativa tanto em sua composição quanto na localização. Nas TrxR de eucariotos inferiores o motivo (Cys-X-X-Cys) está inserido no domínio de ligação ao NADPH ao passo que nas enzimas de eucariotos multicelulares o motivo (Cys-Val-Asn- Val-Gly-Cys) está inserido no domínio de ligação ao FAD e podem possuir um terceiro resíduo de Cys ou de selenocisteina (Sec) na porção C-terminal (Oliveira et al., 2004; Oliveira et al., 2010). Por outro lado, a enzima Trx é bastante conservada estruturalmente entre procariotos e eucariotos (Collet et al., 2010) (Figura 4C e 4D). Figura 4: Comparação entre estruturas de Trx e TrxR de bactéria e de humanos e AhpF de bactérias. Todas as estruturas estão apresentadas em cartoon de acordo com a unidade biológica (representada por monômeros para Trx e dímeros para TrxR e AhpF). A) TrxR de E. coli (pdb: 3ITJ). B) TrxR1 de H. sapiens (pdb: 2J3N). C) e D) Trx de E. coli e de humanos, respectivamente. E) AhpF de S. typhimurium (pdb: 1HYU). As representações gráficas foram geradas com auxílio do software Pymol. A AhpF também é uma proteína homodimérica com massa molecular aproximada de 220kDa e que possui, além de dos domínios de ligação para FAD e NADH (o que contrasta com as TrxR), um terceiro domínio denominado de NTD (para E) A) C) B) Dimerization Domain (Mammlian TrxR) NAD(P)H Domain FAD Domain Trx NTD Domain (AhpF) D) UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 27 N-terminal domain) formado por duas moléculas contíguas de Trx (Figura 4E). Essas moléculas de Trx contém duas cisteínas envolvidas na reação inicial de redução de AhpC. Dessa forma, uma vez que AhpF representa um sistema acoplado Trx-TrxR a ligação de um inibidor em um dos centros redox impossibilitaria a redução de AhpC. Adicionalmente, trabalhos indicam que os efeitos dos antibióticos de induzir depleção do NADH, promovendo uma maior abundância de NAD + na célula, resultam em uma hiperativação de TCA e da cadeia de transporte de elétrons, o que aumenta a produção de produtos secundários como O2 •- e H2O2 (van Acker et al., 2016; Dwyer et al., 2014; Kohanski et al., 2010). Nesse sentido, outros estudos demonstraram que, em condições aeróbicas, a limitação na concentração de AhpC induz AhpF a produzir H2O2 a partir do oxigênio molecular (O2). Nesse processo, AhpF consome NADH e produz NAD + , contribuindo para a hiperativação da cadeia transportadora de elétrons e, consequentemente, para a produção de mais espécies reativas de oxigênio (Poole & Ellis, 1996; Niimura et al., 1995). Nesse sentido, a inibição de AhpC contribuiria para morte de patógenos ao acentuar os efeitos oxidativos observados na administração de antibióticos. Com base nos dados apresentados acima, as investigações envolvendo a atividade inibitória de Adn sobre as Prx é de grande importância e apresenta grande potencial para a caracterização de um novo fármaco antimicrobiano. Vale salientar que, até o presente momento, nenhum trabalho havia atentado para avaliar a inibição de Adn sobre as Prx 2-Cys de bactérias ou mesmo sobre os sistemas redutores bacterianos. Neste contexto, a análise dos efeitos de Adn sobre bactérias patogênicas pode ampliar o campo de utilização dessa molécula, podendo resultar em novas formas de terapias para as doenças causadas por elas. Adicionalmente, além do diterpenóide Adn, o qual pertence a família dos ent-cauranos, existem compostos similares que podem ser obtidos de plantas da biota brasileira (Dutra et al., 2014; Nogueira et al., 2016; Vandresen et al. 2010) o que representa uma forma bastante importante de prospecção direcionada a nossa biodiversidade, mas novamente nenhum trabalho ate o presente momento atentou para esta investigação. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 28 2. OBJETIVOS i) Investigar a suscetibilidade à superoxidação de AhpCs contendo Thr ou Ser na TC; ii) Analisar a eficiência de Adn como um inibidor tanto das Prx 2-Cys bacterianas (AhpC), contendo Thr ou Ser como parte da TC, quanto de seu sistema redutor (sistema Trx e AhpF); iii) Avaliar a ação inibitória sobre AhpC e seu sistema redutor (sistema Trx e AhpF) de compostos naturais oriundos da biota florística de São Paulo. 3. JUSTIFICATIVA A crise no desenvolvimento de novas drogas para o combate de bactérias multirresistentes tem se tornado um grave problema de saúde pública em todo o mundo. A descoberta de novos fármacos para combater infecções causadas por microrganismos tem sofrido uma queda nas últimas décadas em decorrência tanto do desinteresse da indústria farmacêutica, que considera esse investimento economicamente desvantajoso, quanto da redução do financiamento destinado às pesquisas conduzidas por instituições acadêmicas. Uma abordagem relevante para combater organismos patogênicos consiste na potencialização do estresse oxidativo, tanto o promovido pelo hospedeiro como forma de defesa à invasão quanto àquele promovido pela ação de antibióticos, através da inibição do sistema antioxidante do patógeno. Nesse caso, as Prx 2-Cys podem ser alvos de grande importância para a inibição em função de sua alta reatividade e abundância, além de possuírem características estruturais distintas entre eucariotos e procariotos. Nesse sentido, o diterpenóide Adn, descrito na literatura como um inibidor de Prx humana, possui grande potencial para ser utilizado como um fármaco antimicrobiano. Adicionalmente, a biodiversidade brasileira é capaz de oferecer uma grande quantidade de moléculas semelhantes à Adn e que podem apresentar ação inibitória sobre Prx 2-Cys bacterianas. Cabe ressaltar que, apesar de existirem estudos acerca ação de inibidores sobre proteínas Prx 2-Cys de humanos e tripanossomatídeos, não existem pesquisas dirigidas à inibição de AhpC ou de seu sistema redutor, o que torna este trabalho original e inédito dentro de um campo de pesquisa de grande importância. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 29 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Reagentes Os reagentes utilizados nesse trabalho foram adquiridos junto a Merck Millipore, Sigma Aldrich, Thermo Scientific e GE Healthcare. Adn foi adquirida junto à ChemFaces. Os compostos oriundos da biota brasileira foram isolados e fornecidos pelo Prof. Dr. João Henrique Ghilardi Lago da Universidade Federal do ABC (UFABC). 4.2 Meios de cultura para bactérias Meio de cultura Luria-Bertani (LB): (1% triptona; 0,5% extrato de levedura (YE); 0,5% NaCl); meio de cultura Super Optimal Broth (SOC): (2% triptona; 0,5% YE; 0,058% NaCl; 0,018% KCl; [glicose] final de 20mM; pH=7.0); meio de cultura Mueller Hinton (Kasvi K25-610034); meio de cultura M9 (Alegria et al., 2016); meio de cultura M9 suplementado com glicose (Dwyer et al., 2014); meio de cultura M9 suplementado com aminoácidos e vitaminas (Washburn et al., 2001); meio de cultura mínimo sintérico (AAM) (Rudin et al., 1957); ampicilina 100 μg/ml para seleção das bactérias de interesse. 4.3 Linhagens de E. coli para expressão de proteínas recombinantes DH5αF’ - F’ (Z80dlacZ_(lacZ)Adn5)_(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk - ,mk + ); DH10B – F - mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) f80dlacZΔAdn5 ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araΔ139 D (ara, leu) 7697 galK1 - rpsLnupG; XL1-Blue - recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIq Z∆M15 Tn10 (Tet r )]; BL21(DE3) - [F - , amp T, hsdSb (rB - mb - ), gal, dcm (DE3) (Novagen); B84 DE3 [F - , metamp T - , hsdSb (rB - mb - ), gal, dcm (DE3)]. 4.4 Plasmídeos de expressão e genes de proteínas alvo Os genes ahpC de B. subtilis (F41923/PY79), P. aeruginosa (ATCC29853), S. typhimurium LT2 (ATCC 19585) e E. coli (ATCC25922), além dos genes trxA, trxB e ahpF da mesma linhagem de E. coli, foram amplificados a partir do DNA genômico extraído dessas bactérias utilizando protocolo de Chen & Kuo (1993). A amplificação dos genes foi realizada por reação de PCR utilizando oligonucleotídeos contendo sítios de ligação para as enzimas de restrição Bam HI e Nde I (Tabela 1). As reações de PCR foram realizadas em termociclador ProFlex PCR System 32 × 3 (Thermo Fisher UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 30 Scientific) utilizando a enzima Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Thermo Fisher Scientific) e os produtos da PCR foram submetidos a eletroforese em gel de agarose para extração e purificação dos fragmentos contendo apenas os genes ahpC (utilizando o kit GFX TM PCR and Gel Band Purification - GE Healthcare), sendo estes posteriormente digeridos com Bam HI e Nde I. A seguir, utilizando a enzima T4 DNA ligase, foi realizada a ligação dos genes em plasmídeo pET15b, também previamente digerido com Bam HI e Nde I. Após a inativação da T4 DNA ligase a 65°C por 10 minutos e diálise em membrana com poros de 0.025µm (Merck-Millipore), o produto da reação foi transformado na linhagem de E. coli DH5α. A confirmação da integridade dos genes foi efetuada por sequenciamento utilizando o sequenciador automático ABI 3730 DNA Analyser, utilizando o kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Thermo Scientific). Tabela 1: Oligonucleotídeos utilizados para a clonagem dos genes. As bases em sublinhado foram adicionadas aos genes, sendo que em preto estão destacados os sítios de ligação para Bam HI e Nde I e em vermelho a região de ancoragem dessas enzimas. Oligonucleotídeos AhpC – B. subtilis F-5´CGCGATCCATATGATGTCTTTAATCGGTAAAGAAGTACTT3’ R-5´CGCAAGCTTGGATCCTTAGATTTTACCTACTAGATCAAGGCT3’ AhpC – P. aeruginosa F-5´CGCGATCCATATGATGTCCCTGATCAACACTCAAGTCCAA3’ R-5´CGCAAGCTTGGATCCTTAGATCTTGCCGACCAGGTCCAGG3’ AhpC – S. typhimurium F-5´CGCGATCCATATGATGTCCTTAATTAACACCAAAATCAAACC3’ R-5´CGCAAGCTTGGATCCTTAGATTTTACCGACCAGGTCTAAGG3’ AhpC - E. coli F-5´CGCGATCCATATGATGTCCTTGATTAACACCAAAATTAAA3´ R-5´CGCAAGCTTGGATCCTTAGATTTTACCAACCAGGTCCAG3´ Trx1 - E. coli F-5´CGCGATCCATATGATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACT3´ R-5´CGCAAGCTTGGATCCTTACGCCAGGTTAGCGTCGAGGAA3´ TrxR - E. coli F-5´CGCGATCCATATGATGGGCACGACCAAACACAGTAAACTG3´ R-5´CGCAAGCTTGGATCCTTATTTTGCGTCAGCTAAACCATC3´ AhpF – E. coli F-5'CGCGATCCATATGATGCTCGACACAAATATGAAAACTCAA3’ R-5’CGCAAGCTTGGATCCTTATGCAGTTTTGGTGCGAATCAG3’ Os genes ahpC das bactérias S. aureus e S. epidermidis com códons otimizados para a expressão em E. coli e inseridos no vetor pUC57 foram adquiridos junto a empresa GenScript. Os plasmídeos foram digeridos com as enzimas de restrição Bam HI e Nde I (Thermo Fisher Scientific), sendo os produtos da digestão submetidos a eletroforese em gel de agarose para extração e purificação dos fragmentos contendo apenas os genes ahpC utilizando o kit GFX TM PCR and Gel Band Purification (GE Healthcare). Uma vez purificados, os genes foram ligados ao plasmídeo pET15b previamente digerido com as mesmas enzimas de restrição. A reação de ligação ocorreu UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 31 overnight a 4°C utilizando a enzima T4 DNA ligase (Thermo Fisher Scientific) e, após a inativação da enzima e diálise em membrana com poros de 0.025µm (Merck-Millipore), o produto da reação foi utilizado para transformar células da linhagem de E. coli DH5α. 4.5 Mutações sítio dirigidas As mutações para obter as proteínas carreando a substituição pontual da Thr da TC por Ser (EcAhpC T44S , StAhpC T44S e PaAhpC T44S ) e de Ser por Thr (SaAhpC S46T , SeAhpC S46T e BsAhpC S44T ) foram efetuadas utilizando o kit Quick Change II (Stratagene), seguindo as orientações do fabricante. Os oligonucleotídeos utilizados estão representados na tabela 2. Uma vez que os genes ahpC de S. aureus e S. epidermidis tiveram os códons otimizados em sua síntese, os oligonucleotídeos para a mutação Ser/Thr foram idênticos para ambos os genes. O produto da reação de mutação foi utilizado na transformacao da linhagem de E. coli XL1-Blue e para a confirmação das mutações foi efetuado o sequenciamento dos genes utilizando o sequenciador automático ABI 3730 DNA Analyser, utilizando o kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Thermo Scientific). Tabela 2: Oligonucleotídeos utilizados para as mutações Thr/Ser nos genes ahpC. Em vermelho estão destacados os nucleotídeos alterados em relação ao gene selvagem Oligonucleotídeos EcAhpC T44S F – 5´GCTGACTTTTCTTTCGTATGC3´ R –5´GCATACGAAAGAAAAGTCAGC 3 PaAhpC T44S F – 5´GCTGCCTTCTCCTTCAACTGC3´ R – 5´GCAGTTGAAGGAGAAGGCAGC3 StAhpC T44S F – 5’ GCCGATTTTAGTTTGTTTGCC3’ R – 5’ GGCAAACAAACTAAAATCGGC3’ Sa/SeAhpC S46T F – 5´GCGGACTTCACCTTTGTTTGC3´ R – 5´GCAAACAAAGGTGAAGTCCGC3´ BsAhpC S44T F – 5’ GGCCAATGGACCGTATTCTGC3’ R – 5’ GCAGAATACGGTCCATTGGCC3’ 4.6 Expressão e purificação em bactérias de proteínas selvagens e mutantes Linhagens de E. coli BL21 (DE3) transformadas com plasmídeos contendo os genes para a expressão de AhpC de B. subtilis (BsAhpC WT ou BsAhpC S44T ), E. coli (EcAhpC WT ou EcAhpC T44S ), P. aeruginosa (PaAhpC WT ou PaAhpC T44S ), S. typhimurium (StAhpC WT ou StAhpC T44S ), S. aureus (SaAhpC WT ou SaAhpC S46T ) e S. epidermidis (SeAhpC WT ou SeAhpC S46T ) ou Trx1, TrxR e AhpF de E. coli foram inoculadas em 30 ml de meio LB contendo 100 μg/ml de ampicilina e cultivadas por 16 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 32 h/37°C/250 RPM em agitador orbital. Após este período, a cultura foi transferida para 1 litro de meio LB/Ampicilina, cultivada até OD600 ~ 0,6 e, neste momento, foi adicionado IPTG na concentração final de 0,3 mM para a indução da expressão por 3h a 37°C/250 RPM. A seguir, as células foram decantadas por meio de centrifugação por 30 min/4°C/4000 RPM e ressuspendidas em tampão Tris 50 mM pH = 7.4/ NaCl 500mM. O rompimento das células foi realizado por sonicação (30% amplitude) e os ácidos nucleicos foram removidos por meio de tratamento com sulfato de estreptomicina ([ ] final = 1%) por 20 minutos. Após este período, o extrato foi centrifugado por 45 min/4°C/12000 RPM, o precipitado descartado e os extratos proteicos livres de ácidos nucleicos coletados. Uma vez que as proteínas foram expressas em vetores que adicionam cauda de histidina (pET15b) a purificação foi feita por cromatografia de afinidade por metais (IMAC) em colunas HisTrap (GE Healthcare) em gradiente de imidazol (5mM e 300mM). A qualidade da purificação das proteínas foi constatada por SDS-PAGE em condições redutoras (loading buffer: 62.5 mM Tris-HCl pH = 6.8, 2.5% SDS, 0.002 % azul de bromofenol, 200mM β-mercaptoetanol, 10% glicerol). Após estes procedimentos, as proteínas foram dessalinizadas através de cromatografia de filtração em gel utilizando a coluna PD10 (GE Healthcare) e concentradas por centrifugação (4000 RPM/4°C) utilizando concentradores Ultracel YM-30 (Millipore). 4.7 Quantificação de proteínas As proteínas purificadas foram quantificadas espectrofotometricamente, a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar específico de cada uma obtido através da ferramenta ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/). 4.8 Tratamento das proteínas com os compostos BsAhpC, EcAhpC, PaAhpC, StAhpC, SaAhpC, e SeAhpC, selvagens e mutantes, além das proteínas EcTrx1, EcTrxR e EcAhpF, na concentração de 100µM, foram reduzidas com 5mM de ditiotreitol (DTT) por 30 minutos em temperatura ambiente. A seguir, as proteínas foram dessalinizadas em coluna PD10 (GE Healthcare), quantificadas e tratadas com 20 equivalentes molares dos compostos (iodoacetamida, Adn ou compostos 1-6) por uma hora, a temperatura ambiente. Finalmente, as proteínas tratadas foram novamente dessalinizadas para a retirada do excesso de ligante e quantificadas para a utilização nos ensaios posteriores. http://web.expasy.org/protparam/ UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 33 4.9 Verificação da ligação dos compostos ao sítio ativo das AhpC por SDS-PAGE Para a verificação da efetividade dos passos de redução com DTT e dessalinização durante o tratamento das AhpC com os compostos, alíquotas de 10µM das proteínas após essas etapas foram coletadas e alquiladas pela adição de stop buffer (Tris-HCl 50mM pH = 6.8, SDS 2%, azul de bromofenol 0.4%, glicerol 10%, NEM 50mM). A seguir, a ligação dos compostos as cisteínas das AhpC foi avaliado coletando-se alíquotas na concentração de 10µM de AhpC tratada com cada composto e oxidando-as com 50µM de H2O2 por 30 minutos em temperatura ambiente, sendo posteriormente alquiladas pela adição de stop buffer. As amostras foram submetidas à análise em SDS-PAGE não redutor corado por comassie blue. 4.10 Ensaio de oxidação de DTT 25 µM de EcAhpC, PaAhpC, StAhpC, SaAhpC, SeAhpC e BsAhpC, selvagens e mutantes, tratadas ou não tratadas com Adn foram adicionadas a reações contendo DTT 10mM, Hepes 50mM, Azida sódica 1mM e DTPA 0.1 mM. As reações foram iniciadas pela adição de 2mM de hidroperóxido de cumeno (CHP) e monitoradas a 310 nm em espectrofotômetro Cary 60 UV-Vis (Agilent), a 30°C, por 10 minutos (Tairum Jr. et al., 2012). As velocidades de reação foram calculadas através do valor do coeficiente angular das retas com o auxílio do programa GraphPad Prism 4. 4.11 Análise da inibição dos compostos sobre a atividade de AhpC e sistema Trx EcAhpC WT ou EcAhpC T44S tratadas com iodoacetamida (IAM), Adn ou com os compostos 1-6, em concentração final de 3μM, foram adicionadas a mixes contendo 6 μM de EcTrx1, 0,9 μM de EcTrxR, 150 μM de NADPH, em tampão 50 mM HEPES pH = 7.0, 1mM DTPA e 100 μM azida sódica, sendo então incubadas por 5 minutos a 37°C. As reações foram então iniciadas pela adição de 500 μM de H2O2 e monitoradas a 340nm em espectrofotômetro Cary 60 UV-Vis (Agilent), a 37°C, por 5 minutos. Para a análise da inibição dos compostos sobre a atividade de EcTrx1 e EcTrxR, essas proteínas tratadas com iodoacetamida (IAM), Adn ou com os compostos 1-6, foram adicionadas separadamente a reações utilizando as mesmas concentrações citadas anteriormente, sendo que a AhpC, nestes casos, não foi tratada com nenhum composto. Como controle negativo, foram utilizadas reações sem a adição da proteína analisada e, UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 34 como controle positivo, foram utilizadas reações em que nenhuma proteína recebeu tratamento com os compostos. As velocidades de reação foram calculadas através do valor do coeficiente angular das retas com o auxílio do programa GraphPad Prism 4. 4.12 Análise da inibição dos compostos sobre a atividade de AhpF O efeito inibitório de IAM, Adn e compostos 1-6 sobre a atividade dissulfeto redutase de EcAhpF foi avaliada através de ensaio de redução de DTNB adaptado de Poole & Ellis, 1996. Para isso, EcAhpF na concentração final de 0.5μM e tratada com os compostos foi adicionada a reações contendo DTNB 500μM, DTPA 500μM, fosfato de sódio 100mM pH = 7.0. As reações foram iniciadas pela adição de NADH 300μM e a formação de TNB foi monitorada a 412nm em espectrofotômetro Cary 60 UV-Vis (Agilent) a 37°C por 5 minutos. Como controle positivo foram utilizadas reações em que EcAhpF não recebeu tratamento com nenhum composto e, como controle negativo, foram utilizadas reações sem a adição de EcAhpF. 4.13 Quantificação das Cys livres de EcTrxR e ScTrxR EcTrxR e ScTrxR foram reduzidas e dessalinizadas, conforme descrito anteriormente, e adicionadas em uma concentração final de 20 µM a reações contendo 200 µM de DTNB e tampão denaturante (Tris 30mM pH = 7.0, guanidina 6M) ou não denaturante (Tris 30mM pH=7.0). As reações foram incubadas por 15 minutos em temperatura ambiente e ao abrigo de luz, sendo posteriormente analisadas espectrofotometricamente a 412 nm. A quantificação do TNB formado nas reações foi realizada utilizando seu coeficiente de extinção molar (ε412= 13600 M -1 cm -1 ). 4.14 Avaliação do meio de cultura Para avaliar qual seria o meio de cultura mais adequado para a determinação da concentração inibitória mínima de Adn, as bactérias B. subtilis (F41923/PY79), E. coli (ATCC25922), P. aeruginosa (ATCC29853), S. typhimurium LT2 (ATCC 19585), S. aureus (ATCC29213), S. epidermidis (ATCC12228) foram cultivadas em meio LB-ágar por 24 horas a 37°C. A seguir, uma colônia de cada bactéria foi inoculada nos meios de cultura Mueller Hinton, M9 (Alegria et al., 2016), M9 suplementado com glicose (Dwyer et al., 2014); M9 suplementado com aminoácidos e vitaminas (Washburn et al., 2001) ou meio de cultura mínimo sintérico (AAM) (Rudin et al., 1957) e as culturas UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 35 foram incubadas a 37°C e 250RPM por 16 horas. Ao final do crescimento, as células foram quantificadas por espectrometria a 600nm. 4.15 Determinação da concentração inibitória mínima (MIC) B. subtilis (F41923/PY79), E. coli (ATCC25922), P. aeruginosa (ATCC29853), S. typhimurium LT2 (ATCC 19585), S. aureus (ATCC29213), S. epidermidis (ATCC12228) foram cultivadas em meio LB-ágar por 24 horas a 37°C. A seguir, colônias uniformes de cada uma das bactérias foram coletadas e diluídas em solução salina 0.9%. A concentração celular foi estimada através de espectrofotometria (λ=600nm) e ajustada para ~10 6 unidades formadora de colônia (UFC). Posteriormente, as células foram adicionadas ao meio de cultura Mueller Hinton contendo concentrações variáveis de Adn (500 µM, 250 µM, 125 µM, 62.5 µM, 31.2 µM e 15.6 µM) passando então a apresentar uma densidade celular de ~10 5 UFC, e as culturas foram incubadas por 24 horas a 37°C. Como controle positivo foram utilizadas culturas sem a adição de nenhum composto e, como controle negativo, sem a adição de células. A concentração celular foi então estimada através de espectrofotometria (λ=600nm) (CLSI, 2015). 4.16 Permeabilização da membrana externa (ME) de E. coli E. coli ATCC25922 foi cultivada em meio LB-ágar por 24 horas a 37°C. A seguir, colônias uniformes de cada uma das bactérias foram coletadas e diluídas em solução salina 0.9%. A concentração celular foi estimada através de espectrofotometria (λ=600nm) e ajustada para ~10 6 UFC. Posteriormente, as células foram adicionadas ao meio de cultura Mueller Hinton contendo concentrações crescentes de EDTA (0, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, .09 e 1 mM ) ou PMBN (0, 0.15, 0.3, 0.6 ou 1.2 μg/ml) na presença ou ausência de Adn (0, 16.6, 31.2, 62.5, 125, 250 e 500 μM para EDTA e 200 μM para PMBN). Nesse estágio, as culturas passaram a apresentar uma concentração de células de 10 5 UFC, as quais foram incubadas por 24 horas, a 37°C, sendo então quantificadas espectrofotometricamente a 600nm. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 36 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO A seção de Resultados e Discussão será apresentada em quatro subseções com o objetivo de facilitar sua compreensão. A primeira subseção (5.1) discorrerá sobre os efeitos inibitórios de Adn sobre AhpC contendo Thr ou Ser na TC, bem como sobre seus sistemas redutores (Trx/TrxR e AhpF), a qual deu origem a uma solicitação de propriedade intelectual (Apêndice A) e a um manuscrito que investiga as interações moleculares entre enzimas contendo Thr ou Ser na TC (Apêndice B). A segunda subseção (5.3) aborda a triagem de compostos naturais oriundos da biota florística do estado de São Paulo na busca de novos inibidores de AhpC e de seus sistemas redutores, cujos resultados foram compilados em uma solicitação de patente (Apêndice C) e também serviu de base para a elaboração de uma revisão de peroxirredoxinas de microorganismos patogênicos (Apêndice D). A terceira subseção (5.3) reside em observações fundamentadas nas nossas descobertas e compõem um manuscrito abordando os aspectos relacionados a eventos de superoxidação em Prx 2-Cys típicas contendo Thr ou Ser na TC, assim como a diferença dessas proteínas na interação com ligantes (Apêndice E). Finalmente, a quarta e última subseção (5.4) se refere à caracterização de uma tiol proteína única de patógenos cujos resultados foram publicados em periódico de circulação internacional (Apêndice F). 5.1 Inibição de AhpC contendo Thr ou Ser na TC por Adn 5.1.1 Obtenção de AhpC selvagens e contendo a mutação Thr ⇄ Ser Uma vez que temos como ponto de partida que as Prx 2-Cys típicas de levedura que contém Thr (Tsa1) ou Ser (Tsa2) apresentaram diferenças na inibição por Adn e a substituição da Thr por Ser é rara em eucariotos mas mais frequente em bactérias, iniciamos este trabalho efetuando as clonagens gênicas de AhpCs (Prx 2-Cys típicas) de espécies bacterianas contendo Thr (E. coli, P. aeruginosa e S. typhimurium) ou Ser (B. subtilis, S. aureus e S. epidermidis) como parte da TC. Em seguida foram padronizadas as condições de expressão e purificação destas enzimas e, após padronização, foi possível obter todas as peroxidases com alto grau de pureza (>95%) e alto rendimento na expressão (14 - 25mg por litro de cultura de células) (Figura 5). Em seguida foram efetuadas as mutações sítio dirigidas para a obtenção de proteínas mutantes contendo substituições pontuais da Thr→Ser da TC de E. coli (EcAhpC T44S ), P. aeruginosa (PaAhpC T44S ) e S. typhimurium (StAhpC T44S ) e Ser→ Thr de B. subtilis (BsAhpC S44T ), UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 37 S. aureus (SaAhpC S44T ) e S. epidermidis (SeAhpC S44T ). Após padronizadas as condições de expressão/purificação para cada proteína também foi possível obter as enzimas mutantes com alto grau de pureza (>95%) e rendimento satisfatório (10-18 mg/L de cultura) (Figura 5). Figura 5: Resultados das purificações das AhpCs contendo Thr ou Ser como parte da TC. Em todas as figuras são apresentadas as purificações de AhpCs selvagens e mutantes por IMAC utilizando gradiente de imidazol. Em todas as figuras na lane 1 foi aplicado o marcador de massa molecular, nas lanes 2 e 6 as frações insolúveis, nas lanes 3 e 7 as frações solúveis, nas lanes 4 e 8 a frações eluídas com 5mM de imidazol, nas lanes 5 e 9 as frações eluídas com 300 mM de imidazol. A) AhpC selvagem de E. coli (EcAhpC WT ) (lanes 2-5) e mutante (EcAhpC T44S ) (lanes 6-9). B) AhpC selvagem de P. aeruginosa (PaAhpC WT ) (lanes 2-5) e mutante (PaAhpC T44S ) (lanes 6-9). C) AhpC selvagem de S. typhimurium (SaAhpC WT ) (lanes 2-5) e mutante (StAhpC T44S ) (lanes 6-9). D) AhpC de B. subtilis (BsAhpC WT ) (lanes 2-5) e mutante (BsAhpC S44T ), E) AhpC de S. aureus (SaAhpC WT ) (lanes 2-5) e mutante (SaAhpC S46T ) (lanes 6-9) e F) AhpC de S. epidermidis (SeAhpC WT ) (lanes 2-5) e mutante (SeAhpC S46T ) (lanes 6-9). Os asteriscos (*) denotam bandas referentes a dímeros das enzimas. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 38 5.1.2 Avaliação da inibição de AhpC por Adn através de ensaio de oxidação de DTT A metodologia para avaliação da atividade peroxidásica de AhpC testada que se mostrou inicialmente mais adequada foi a de oxidação do DTT (Tairum et al., 2012). Nesse ensaio, após a redução do hidroperóxido, o dissulfeto formado entre as cisteínas de AhpC é reduzido pelo DTT que, por sua vez, assume a sua forma oxidada cíclica que pode ser monitorada espectrofotometricamente a 310 nm. Para este ensaio, foi utilizado o hidroperóxido de cumeno (CHP) em razão de sua menor redução pelo DTT e, consequentemente, menor formação de artefatos metodológicos. Dessa forma, avaliamos a atividade inibitória de Adn sobre enzimas AhpC selvagens de E. coli, P. aeruginosa e S. typhimurium, as quais contém uma Thr como parte da TC e também mutantes carreando a substituição de Thr→Ser (Figura 6). Os resultados revelaram que Adn é capaz de inibir tanto as proteínas selvagens quanto as proteínas mutantes, no entanto a inibição de proteínas contendo a substituição Thr → Ser (Figura 6) foi sutilmente maior. Curiosamente para EcAhpC e PaAhpC as mutações levaram, aparentemente, a uma maior velocidade da reação (Figuras 6A e 6D; Figuras 6B e 6E). Figura 6: Avaliação da inibição da atividade de AhpC contendo Thr na TC e mutantes Thr→Ser através do ensaio de oxidação de DTT. Para os ensaios foi utilizado 25 µM de EcAhpC WT (A), PaAhpC WT (B), StAhpC WT (C), EcAhpC T44S (D), PaAhpC T44S (E) e StAhpC T44S (F), tratadas () e não tratadas () com Adn. As proteínas foram incubadas com DTT (10 mM) em tampão (HEPES 50 mM, pH=7.0), azida sódica (1 mM) e DTPA (0.1 mM) e as reações foram iniciadas pela adição de CHP (2 mM) e monitoradas espectrofotometricamente a 310 nm a 30°C por 10 minutos. Como controle negativo, foram utilizadas reações sem a adição das proteínas (). UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 39 Também avaliamos a inibição por Adn sobre AhpCs contendo naturalmente Ser na TC bem como os mutantes contendo a substituição Ser→Thr das bactérias B. subtilis, S. aureus e S. epidermidis. De forma geral tanto as proteínas selvagens quanto as contendo a substituição Ser→Thr apresentaram decréscimo na atividade peroxidásica em razão do tratamento com Adn (Figura 7). Entretanto, para as AhpCs de B. subtilis e S. epidermidis selvagens, que possuem Ser na TC, foi possível detectar uma diminuição da velocidade de reação mais acentuada do que para os mutantes contendo a substituição Ser→Thr (Figuras 7A e 7D; Figuras 7B e 7E). Figura 7: Avaliação da inibição da atividade de AhpC contendo Ser na TC e mutantes Ser→Thr através do ensaio de oxidação de DTT. Para os ensaios 25 µM de BsAhpC WT (A), SaAhpC WT (B), SeAhpC WT (C), BsAhpC S46T (D), SaAhpC S46T (E) e SeAhpC S44T (F), tratadas () e não tratadas () com Adn (20 eq.), foram incubadas com DTT (10mM) em tampão HEPES (50mM, pH=7.0), azida 1mM e DTPA (0.1) mM. As reações foram iniciadas pela adição de CHP (2mM) e monitoradas espectrofotometricamente em 310 nm/30°C/10 minutos. Como controle negativo, foram utilizadas reações sem a adição das proteínas (). Para se averiguar possíveis diferenças na inibição de enzimas contendo Thr ou Ser na TC foram determinadas as velocidades iniciais (v0) das reações com AhpC tratadas ou não com Adn (Tabela 3). As enzimas selvagens de E. coli, P. aeruginosa e S. typhimurium, as quais contém naturalmente Thr como parte de TC, tiveram os menores decréscimos de v0 (16 -37%) em razão do tratamento com Adn, enquanto que as AhpCs WT de B. subtilis, S. aureus e S. epidermidis, que possuem Ser, tiveram decréscimos de v0 substancialmente maiores (61-84%) indicando que Adn é capaz de inibir mais eficientemente enzimas que contem Ser como parte da TC. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 40 Em acordo com os dados obtidos para as proteínas selvagens, a substituição de Thr por Ser resultou em um decréscimo mais acentuado de v0 das enzimas de E. coli, P. aeruginosa e S. typhimurium (47 -58%) e de maneira inversa aumentou a refratividade à inibição por Adn quando enzimas de B. subtilis, S. aureus e S. epidermidis que possuíam naturalmente Ser tiveram o resíduo mutado por Thr (24 -74%). De forma geral, estes resultados revelam que Adn é capaz de inibir AhpCs, o que torna Adn o primeiro inibidor descrito para Prx 2-Cys bacterianas. Os resultados também sugerem que as substituições naturais Thr ⇄ Ser podem estar envolvidas em uma menor (Thr) ou maior (Ser) suscetibilidade da inibição por Adn. Também foi possível constatar que as substituições de Thr por Ser nas enzimas EcAhpC e PaAhpC, elevou significativamente a v0 das reações (v0EcAhpCWT=10.53 ± 0.75 µMs -1 / v0EcAhpCT44S=16.29 ± 0.23 µMs -1 e v0PaAhpCWT=9.36 ± 0.13 µMs -1 / v0PaAhpCT43S=18.08 ± 0.11 µMs -1 ), enquanto para a enzima StAhpC o aumento foi bastante discreto e dentro da margem de erro (v0StAhpCWT=8.03 ± 0.83 µMs - 1 /v0StAhpCT44S= 8.63 ± 1.23 µMs -1 ). De maneira inversa para as enzimas SeAhpC e BsAhpC, que contêm naturalmente a Ser como parte de TC, foi observado um decréscimo da velocidade inicial quando este resíduo foi substituído por uma Thr (v0SeAhpCWT=15.88 ± 0.78 µMs -1 / v0SeAhpCS46T=11.05 ± 1.37 µMs -1 e v0BsAhpCWT=19.49 ± 1.40 µMs -1 / v0BsAhpCT44S=15.80 ± 0.06 µMs -1 ), enquanto que para a enzima SaAhpC não houve alteração significativa (v0SaAhpCWT=12.04 ± 0.73 µMs -1 /v0StAhpCT46S= 12.86 ± 1.52 µMs -1 ). Em conjunto, os resultados indicam que fatores adicionais às substituições da Thr/Ser da TC estão envolvidos em uma maior ou menor atividade de decomposição de hidroperóxidos, o que pode estar relacionado com diferenças na suscetibilidade a superoxidação, levando a implicações funcionais como atividade de chaperona ou eventos de transdução de sinal, ou mesmo maior afinidade por diferentes substratos (Lee et al., 2016; Rhee, 2016). De fato, estes resultados, nos motivaram a investigações que serão apresentadas na seção 5.3, que avaliaram a suscetibilidade a superoxidação de Prx 2-Cys típicas contendo Thr ou Ser na TC. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 41 Tabela 3: Velocidade inicial (v0) de enzimas AhpCs contendo Thr ou Ser como parte da TC de diferentes espécies de bactérias tratadas (Adn+) ou não (Adn-) com o inibidor Adn. As enzimas selvagens analisadas são de E. coli, P. aeruginosa, S. typhimurium, B. subtilis, S. aureus e S. epidermidis e as enzimas mutantes contém substituições recíprocas Thr⇄Ser. As fontes em preto denotam enzimas com Thr como parte da TC e as em vermelho aquelas que possuem Ser. 5.1.3 Avaliação de inibição de AhpC por Adn pelo ensaio acoplado de oxidação de NADPH Embora o ensaio de oxidação do DTT apresentado no tópico anterior seja bastante informativo, pois se baseia na redução das AhpCs por um agente químico (DTT) e consiste em um método de análise relativamente rápido para avaliação de inibidores, um artefato intrínseco da metodologia reside no fato que o DTT é capaz de reduzir não só as Prx, mas também o próprio hidroperóxido. Apesar deste artefato ser bastante minimizado com a utilização de um hidroperóxido orgânico (CHP) (Tairum et al., 2012) ainda representa uma barreira para obtenção de dados com parâmetros cinéticos mais confiáveis pois as variações de absorbância são bastante sutis (Figuras 6 e 7). Visando averiguar a inibição por Adn por um método com menor artefato metodológico, utilizamos também o ensaio acoplado de oxidação do NADPH. Apesar deste ensaio ser mais trabalhoso, pois envolve a expressão de três enzimas distintas (AhpC, Trx e TrxR), ele é mais confiável pois a variação de absorbância é significativamente maior que a do ensaio de oxidação do DTT e não ocorre consumo de reagentes do sistema (NADPH ou hidroperóxido) por enzimas do sistema redutor ou componentes do ensaio (e.g. DTT). Para efetuarmos este ensaio clonamos e UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista 42 padronizamos a expressão e purificação de Trx e TrxR de E. coli (Figura 8C) e, em seguida, reconstituímos o sistema redutor in vitro e avaliamos a atividade peroxidásica de EcAhpC WT e EcAhpC T44S previamente tratadas com Adn (20 equivalentes molares) (Figuras 8A e 8B). Figura 8: Ensaio acoplado de oxidação de NADPH e