Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Programa de Pós Graduação em Alimentos e Nutrição Ciências Nutricionais Gisele Massafera Efeito protetor do suco de laranja vermelha e dieta hiperlipídica nos parâmetros fisiológicos e marcadores bioquímicos em ratos submetidos à dieta hiperlipídica Orientador: Profª. Drª. Thais Borges César Coorientadora: Prof.ª. Drª. Telma Maria Braga Costa Araraquara - SP 2014 Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Programa de Pós Graduação em Alimentos e Nutrição Ciências Nutricionais Gisele Massafera Efeito protetor do suco de laranja vermelha e dieta hiperlipídica nos parâmetros fisiológicos e marcadores bioquímicos em ratos submetidos à dieta hiperlipídica Orientador: Profª. Dr a. Thais Borges César Co-orientadora: Profª. Drª. Telma Maria Braga Costa Araraquara - SP 2014 Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Alimentos e Nutrição da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Alimentos e Nutrição. Ficha Catalográfica Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara Massafera, Gisele M414e Efeito protetor do suco de laranja vermelha e dieta hiperlipídica nos parâmetros fisiológicos e marcadores bioquímicos em ratos submetidos à dieta hiperlipídica / Gisele Massafera. – Araraquara, 2014 68 f. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Alimentos e Nutrição Orientador: Thaís Borges César Coorientador: Telma Maria Braga Costa 1. Suco de laranja vermelha. 2. Dieta hiperlipídica. 3. Glicemia. 4. Gordura hepática. 5. Rato. I. Thaís Borges César, orient. II. Costa, Telma Maria Braga, coorient. III. Título. CAPES: 50700006 Folha de Aprovação Prof. Dra. Thais Borges César Prof. Dra. Vivian Marques Miguel Suen Prof. Dr. Anderson Marliere Navarro Prof. Dr. Luis Vitor Sacramento Prof. Dr. Caio Tales Álvares da Costa Dedico este trabalho: Ao meu marido Júlio, que sempre esteve ao meu lado, compartilhando todos os momentos comigo, sendo sempre meu maior incentivador; você é o amor da minha vida. Às minhas filhas, Ana Laura e Isabela, vocês preencheram uma lacuna que havia em meu coração fazendo com que eu me tornasse um ser humano melhor, e que a minha vida passasse a ter outro sentido. Sempre estarei ao lado de vocês, amando-as incondicionalmente. Agradecimentos À minha orientadora Prof.ª Dr.ª Thais Borges César expresso o meu profundo agradecimento pela orientação e apoio incondicionais que muito elevaram os meus conhecimentos científicos e, sem dúvida, muito estimularam o meu desejo de querer, sempre, saber mais e a vontade constante de querer fazer melhor. Agradeço também a confiança que em mim depositou, desde o início, e também o sentido de responsabilidade que me incutiu em todas as fases do projeto. À minha Coorientadora Prof.ª Dr.ª Telma Maria Braga Costa, por todas as oportunidades para que este trabalho fosse finalizado, acreditando na minha competência. Às alunas do curso de nutrição da UNAERP que me auxiliaram na coleta de dados à Maria Fernanda, Ana Paula, Josiani e Taciane, sem vocês isto não seria possível. À querida amiga Carla Antonietto, que não mediu esforços para me ajudar no biotério. Aos meus amigos da UNAERP e de fora dela, que fizeram que os meus dias fossem mais fáceis de serem vividos, por todas as risadas, incentivos, parcerias, enfim, por tudo de bom que os amigos proporcionam na nossa vida. À Universidade de Ribeirão Preto pela oportunidade e apoio financeiro deste trabalho. A Empresa Citrosuco S.A., pela doação do suco de laranja vermelha para a realização deste trabalho. A todos que direta ou indiretamente contribuíram com a execução deste trabalho. “Não devemos ter medo dos confrontos... “Até os planetas se chocam e do caos nascem as estrelas.” (Charles Chaplin) Resumo MASSAFERA, G. Interação entre o suco de laranja vermelha e dieta hiperlipídica nos parâmetros fisiológicos e marcadores bioquímicos em ratos. 2014. 70f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, UNESP, Araraquara, 2014. Tem sido evidenciado que o consumo regular do suco de laranja melhora o perfil lipídico, a pressão arterial, a sensibilidade insulínica, o estresse oxidativo e, reduz o estado inflamatório sistêmico no homem e em animais experimentais. Por sua vez, pouco se conhece sobre os efeitos do suco de laranja de polpa vermelha (SLV), que apresenta teores diferentes dos componentes bioativos encontrados nas laranjas de polpa clara, por exemplo, menor teor de vitamina C, maior concentração de carotenoides. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o efeito do SLV no perfil lipídico, composição corporal e proteção hepática, em ratos tratados com dieta hiperlipídica, que simula importantes efeitos deletérios associados ao desenvolvimento das doenças crônicas. Foram utilizados 60 ratos adultos, divididos em seis grupos que foram tratados com dieta padrão ou hiperlipídica associado a três tipos de ingesta hídrica: água, SLV ou bebida teste (solução aquosa com açúcar). O tratamento durou 30 dias e foram coletadas medidas da massa corporal e ingesta alimentar. Ao final do período os animais foram eutanasiados e o sangue utilizado para determinação dos parâmetros bioquímicos. Os órgãos (rins, baço e fígado) e a gordura abdominal foram coletados para analises posteriores. Os resultados mostraram que os grupos tratados com dieta hiperlipídica ganharam maior massa corporal ao final do período. Todos os grupos que receberam dieta padrão, independente da ingesta hídrica (água, SLV, ou bebida teste), apresentaram maior consumo de dieta. Os animais tratados com SLV apresentaram menor consumo de ração e maior consumo hídrico em comparação aos seus controles. Tanto a glicemia como triglicérides do soro sanguíneo foram reduzidos nos grupos tratados com a dieta hiperlipídica. O colesterol sérico foi aumentado pela dieta hiperlipídica, e foi levemente reduzido pela ingesta do SLV. As enzimas hepáticas, AST e ALT não mostraram efeitos da dieta ou da ingesta hídrica, mas a ALP foi reduzida nos animais que receberam SLV, independente do tipo de dieta. Houve acúmulo de gordura abdominal e de gordura hepática nos grupos tratados com dieta hiperlipídica, mostrando o efeito deletério da dieta hiperlipídica. Em conclusão, o SLV mostrou efeito hipoglicêmico e protegeu parcialmente o tecido hepático na vigência de dieta hiperlipídica. Palavras-Chaves: Suco de laranja vermelha, dieta hiperlipídica, glicemia, gordura hepática, rato. Abstract It has been shown that regular consumption of yellow pulp orange juice improves the lipid profile, blood pressure, insulin sensitivity, and oxidative stress and, reduces the systemic inflammatory state in man and experimental animals. On the other hand, little is known about the effects of the red pulp orange juice (RPOJ), which have different contents of bioactive components, for example, less amount of vitamin C, but higher amounts of carotenoids. The objective of this study was to investigate the effect of RPOJ on the lipid profile, body composition and hepatic protection in rats treated with high-fat diet, which simulates important deleterious effects associated with the development of chronic diseases. Adult rats (n=60) were divided into 6 groups that were treated with standard or high-fat diet associated with three types of drink intake: water, RPOJ or test drink (solution of water plus sugar), the treatment lasted 30 days and measurements of body weight and food intake were made. At the end of the period the animals were euthanized and biochemical parameters were determinated in the blood serum. Organs (kidney, spleen and liver) and abdominal fat were collected for further analysis. The results showed that the groups treated with high-fat diet gained more body mass at the end of the period. All groups that received standard diet, regardless of fluid intake (water, SLV, or drink test), showed higher feed intake. Animals treated with SLV showed lower feed intake and increased water consumption compared to their controls. Both glucose and triglycerides in blood serum was decreased in the groups treated with the fat diet. Serum cholesterol was increased by high-fat diet but was reduced by the intake of RPOJ. Liver enzymes, AST and ALT showed no effects of diet or water intake, but the ALP was reduced in animals receiving RPOJ, regardless of the type of diet. There was accumulation of abdominal fat and liver fat in groups treated with high fat diet, showing deleterious effect of high fat diet. In conclusion, the RPOJ have shown hypoglycemic effect and partial protector to the liver tissue in the presence of high-fat diet. Key Words: Red pulp orange juice, hyperlipidic diet, glycemia, fat liver, rat model LISTA DE FIGURAS Figura 1. Fruto de laranja da variedade Valência, do grupo das variedades claras........................................................................................................................ 21 Figura 2. Fruto de laranja da variedade Moro, do grupo das variedades sanguíneas............................................................................................................... 22 Figura 3. Fruto de laranja vermelha de Mombuca, do grupo das variedades falsas sanguíneas..................................................................................................... 23 Figura 4: Massa corporal inicial (g) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha.......................................................................................... 58 Figura 5: Massa corporal final (g) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha.................................................................................................. 58 Figura 6: Ganho de peso corpóreo (g) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha....................................................................................... 59 Figura 7: Consumo diário de dieta (g) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha.......................................................................................... 59 Figura 8: Eficiência da dieta em ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha....................................................................................................... 60 Figura 9: Ingesta hídrica diária (mL) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha.......................................................................................... 60 Figura 10 Glicemia (mg/dL) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha....................................................................................................... 61 Figura 11: Triglicérides (mg/dL) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha.................................................................................................. 61 Figura 12 Colesterol (mg/dL) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha....................................................................................................... 62 Figura 13: HDL (mg/dL) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha....................................................................................................... 62 Figura 14: Atividade antioxidante (mM) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha....................................................................................... 63 Figura 15: Atividade da enzima fosfatase alcalina (ALP) (U/L) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha.................................................. 63 Figura 16: Massa relativa dos rins (massa órgão/peso corpóreo) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha.................................... 64 Figura 17: Massa relativa do baço (massa órgão/peso corpóreo) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha.................................... 64 Figura 18: Massa relativa do fígado (massa órgão/peso corpóreo) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha.................................... 65 Figura 19: Teor de gordura no fígado (g/100g) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha................................................................... 65 Figura 20: Massa relativa da gordura abdominal (massa órgão/peso corpóreo) de ratos tratados com dieta hiperlipídica e suco de laranja vermelha...................... 66 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Composição centesimal em macronutrientes das dietas (comercial e hiperlipídica) oferecidas aos ratos tratados com suco de laranja vermelha............. 54 Tabela 2: Parâmetros fisiológicos (Peso corpóreo inicial e final, ganho de peso corpóreo), consumo dietético e sua eficiência, consumo hídrico em ratos tratados com dieta comercial e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos...................................................................................................................... 55 Tabela 3: Parâmetros bioquímicos plasmáticos (Glicemia, perfil lipídico), capacidade antioxidante (CAT) e enzimas hepáticas em ratos tratados com dieta comercial e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos...................................................................................................................... 56 Tabela 4: Avaliação dos órgãos em ratos tratados com dieta comercial e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos...................................................................................................................... 57 LISTA DE QUADROS Quadro 1: Informação nutricional do suco de laranja clara integral e pasteurizado 24 Quadro 2: Composição de carotenoides do suco de laranja vermelha e clara, integral e pasteurizado........................................................................................... 25 LISTA DE ABREVIATURAS LDL-C Colesterol de LDL (Lipoproteína de baixa densidade) HDL-C Colesterol de HDL (lipoproteína de alta densidade) ABTS 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid UV Ultra violeta DNA Ácido desoxirribonucleico USDA United States os Agriculture VLDL Lipoproteínas de muito baixa densidade ACAT Acil colesterol-acil transferase AST Aspartato aminotransferase ALT Alanina aminotransferase ALP Fosfatase alcalina CAET Atividade antioxidante em equivalente Trolox EROS Espécies Reativas de Oxigênio HMG-CoA 3-metilglutaril coenzima A SUMÁRIO Capítulo 1: 1. Introdução........................................................................................................... 16 2. Objetivo Geral..................................................................................................... 19 2.1. Objetivos específicos................................................................................... 19 3. Revisão da literatura........................................................................................... 21 Referências............................................................................................................ 29 Capítulo 2 4. Artigo.................................................................................................................. 35 Resumo.............................................................................................................. 36 Abstract.............................................................................................................. 37 Introdução........................................................................................................... 38 Material e Métodos............................................................................................. 40 Desenho experimental........................................................................................ 41 Análise estatística............................................................................................... 41 Resultados.......................................................................................................... 42 Discussão........................................................................................................... 45 Conclusões......................................................................................................... 48 Referências........................................................................................................ 50 Anexo................................................................................................................. 68 Capítulo 1Capítulo 1Capítulo 1Capítulo 1 16 1. Introdução O consumo habitual de frutas e hortaliças na dieta tem sido associado com a redução do risco de doenças crônicas, como o câncer e a doença arterial coronariana (KRIS- ETHERTON et al., 2002; ERDMAN et al., 2007). Os efeitos benéficos para a saúde têm sido atribuídos à ação das vitaminas, minerais e flavonoides, naturalmente presentes em pequenas quantidades nos alimentos vegetais (LIU, 2004, CHUN; CHUNG; SONG, 2007; GARDNER; RUXTON; LEEDS, 2007; WATKINS; HANNON; FERRUZZI, 2007). Estudos têm evidenciado que as frutas cítricas contêm compostos biologicamente ativos que desempenham funções anti-inflamatórias, antioxidantes, hipolipidêmicas, hipoglicêmicas e anticarcinogênicas em modelos in vivo e in vitro. Tais efeitos têm sido atribuídos à vitamina C, aos carotenoides e às flavanonas (KUROWSKA et al., 2000; KUROWSKA e MANTHEY, 2004; GORISTEIN et al., 2007; VINUEZA et al. 2008; TITTAL et al., 2009; JAIN e PARMAR, 2010; AKIYAMA et al., 2010). Estudo recente mostrou que a ingesta de suco de laranja por indivíduos saudáveis submetidos a uma dieta rica em gorduras e carboidratos previne o estresse oxidativo e inflamatório, que pode levar à resistência insulínica (GHANIM et al., 2010). Outros estudos têm mostrado consistentemente que o consumo crônico de suco de laranja reduz os níveis séricos de colesterol total e LDL-C e melhora da função endotelial, levando à diminuição do risco de aterosclerose (CESAR et al., 2010; GUARNIERI et al., 2007) e de hipertensão arterial (MORAND et al., 2010). Outros mostraram que beber cerca de 500 mL/dia, aumenta a vitamina C no plasma e reduz as concentrações de marcadores de estresse oxidativo (SÁNCHEZ-MORENO et al., 2003). Além disso, foi sugerido que a ingesta de suco de laranja melhora o perfil lipídico e reduz o risco de doenças cardiovasculares (BRESSAN e COELHO, 2008; KUROWSKA et al., 2000; LIU et al., 2000) podendo suprimir espécies reativas de oxigênio e processos inflamatórios (KUROWSKA e MANTHEY, 2004). Segundo Ghanim et al. (2007) o suco de laranja possui efeito anti-inflamatório, sendo capaz de diminuir a geração de espécies reativas de oxigênio e que este efeito é, provavelmente, atribuído aos flavonoides: naringina e hesperidina. Estudos clínicos mostraram que os flavonoides cítricos agem em sinergia com a vitamina C, potencializando seu efeito antioxidante nas lipoproteínas do sangue (JOHNSTON; CANDICE; STRONG, 2003; SÁNCHEZ-MORENO et al., 2003a; FRANKE et al., 2005). Bonifácio e César (2009) destacaram que o consumo regular de suco de laranja elevou o aporte de vitamina C na dieta e foi associado à menor incidência de hipertensão arterial e obesidade em homens, sugerindo que o suco, ou seus componentes, auxilia na prevenção da hipertensão. Aptekmann e César (2010) relataram que o consumo de suco de 17 laranja associado ao treinamento aeróbio em mulheres com sobrepeso diminuiu o risco de doença cardiovascular, pela redução dos níveis de LDL-C e aumento dos níveis de HDL-C. Riso et al. (2005) demonstraram que o consumo de suco de laranja vermelha aumenta eficazmente concentrações plasmáticas de antioxidantes. O estilo de vida e as facilidades do mundo contemporâneo influenciaram sobremaneira os hábitos alimentares, favorecendo uma dieta calórica com sobrecarga de carboidratos ou lipídios, conhecida como dieta “ocidentalizada” ou de “fast-food” (CESARETTI e KOHLMANN JUNIOR, 2004; MENDONÇA e ANJOS, 2004). A quantidade de pessoas com sobrepeso e obesidade vem aumentando de forma significativa no Brasil e no mundo, como consequência de fatores endógenos (hereditariedade, fatores congênitos, psicogênicos, neurológicos e endócrinos) e exógenos (dieta, sedentarismo, etc.). Este último comporta a maioria dos casos, relacionados a fatores ambientais, principalmente a falta de atividade física e hábitos alimentares inadequados (ARAÚJO et al., 2009). Com isso, há aumento das taxas de mortalidade e interferência na qualidade de vida dos indivíduos (D’ORÁSIO e MOURA, 2007; HARDMAN, 1999; MENDONÇA e ANJOS, 2004; ZAMBON et al., 2009), tornando-se um assunto preocupante para a saúde pública mundial, pois pode aumentar a mortalidade geral (RIBEIRO FILHO et al., 2006; SBC, 2005). A ingesta calórica acima das recomendações energéticas é um fenômeno das sociedades modernas, e tem, em longo prazo, consequências negativas como o aumento da incidência de doenças crônicas degenerativas. Em roedores, os experimentos têm verificado os efeitos da ingesta hiperlipídica a fim de reproduzir o comportamento nutricional humano e esclarecer esta abordagem alimentar, e suas intercorrências a nível bioquímico e fisiológico (CESARETTI e KOHLMANN JUNIOR, 2004; DINIZ et al., 2008; DUARTE et al., 2006; ESTADELLA et al., 2004; PRADA et al., 2004). Com base nas evidências aqui descritas, a hipótese deste estudo é que o suco de laranja vermelha tem benéfico no perfil lipídico, na manutenção da composição corporal e proteção hepática contra os efeitos deletérios de uma dieta hiperlipídica. ObjetivosObjetivosObjetivosObjetivos 19 2. Objetivo Geral Avaliar o efeito protetor do suco de laranja vermelha sobre o consumo alimentar, na composição corporal, perfil lipídico, e parâmetros fisiológicos em ratos alimentados com dieta hipercalórica. 2.1 Objetivos Específicos Verificar o efeito protetor do suco de laranja vermelha através dos seguintes parâmetros: a) Consumo alimentar e hídrico b) Ganho de peso corpóreo c) Avaliação da obesidade (peso da gordura abdominal) d) Avaliação da massa relativa dos órgãos: fígado, rins e baço e) Análise quantitativa de lipídios hepáticos f) Dosagens bioquímicas de glicose, triglicerídeos, colesterol total e frações g) Avaliação do estresse oxidativo h) Atividade das enzimas aspartato e alanina aminotransferase, e fosfatase alcalina. Revisão da literaturaRevisão da literaturaRevisão da literaturaRevisão da literatura 21 3. Revisão de Literatura As frutas cítricas fazem parte da dieta usual dos brasileiros e, além de serem importante fonte de vitaminas e fibras, as frutas e sucos cítricos recentemente vêm sendo reconhecidos por conterem metabólitos secundários incluindo antioxidantes como ácido ascórbico, compostos fenólicos, flavonoides, limonoides que são importantes para a nutrição humana (JAYAPRAKASHA e PATIL, 2007). As frutas cítricas foram introduzidas no Brasil em 1530 pelos portugueses e espalharam-se por todo o país. No início dos anos 2000, o Brasil possuía mais de um milhão de hectares de plantas cítricas, sendo a maior parte da produção de laranjas: cerca de 70%, proveniente do estado de São Paulo, destinadas à fabricação de suco concentrado para exportação (BUBLITZ et al., 2013). 3.1. Laranja Clara (Amarela) e Laranja Vermelha De acordo com Bitters (1961), as laranjas podem ser divididas pela coloração das polpas, em brancas ou claras e em laranjas sanguíneas. As claras são caracterizadas pela cor laranja na polpa e no suco, devido à presença de carotenoides, que são pigmentos com cor que podem variar entre o amarelo e o vermelho. As variações de cor da polpa de frutos observadas entre as variedades deste grupo seriam devidas as flutuações na quantidade dos diferentes carotenoides presentes. De modo geral, os carotenoides possuem baixa solubilidade em água e elevada solubilidade em solventes orgânicos. A este grupo pertencem quase que a totalidade das laranjas comerciais cultivadas no mundo, incluindo as variedades de mesa (laranjas Baías, Navel, Baianinhas e outras), laranjas com baixa acidez (Laranja Lima, Serra d´agua, por exemplo) e aquelas usadas para a extração de suco (Pera, Natal, Hamlin, Valência, e outras) (Figura 1), Figura 1. Fruto de laranja da variedade Valência, do grupo das variedades claras. 22 As laranjas sanguíneas são caracterizadas pela coloração vermelho-intensa (violácea) da polpa e do suco, devido à presença do pigmento antocianina, solúvel em água. As antocianinas são pigmentos pertencentes à família dos flavonoides e possuem uma série de funções na natureza, tais como a proteção de plantas contra o ataque de patógenos, proteção contra os danos causados pela radiação UV e a pigmentação de flores, frutos e sementes, com as finalidades de atração de insetos polinizadores e de dispersão de sementes. Estes compostos têm grande importância na dieta humana, pois participam da constituição de cores e sabores dos alimentos e podem ser consideradas também como agentes terapêuticos (LATADO, 2009). As antocianinas possuem ainda a capacidade de proteção contra o estresse oxidativo, doenças do coração, certos tipos de câncer e outras doenças relacionadas, devido a sua capacidade de inativação de radicais livres (FANCIULLINO et al., 2006). Como exemplos de variedades mais conhecidas e utilizadas de laranjas sanguíneas podem ser citados: Tarroco, Moro (Figura 2), Sanguíneo doppio, Sanguinella e Sanguinelo, dentre outras, que são mais cultivadas nas regiões do mediterrâneo e na Índia, por apresentarem maior aceitação comercial (LATADO, 2009). Figura 2. Fruto de laranja da variedade Moro, do grupo das variedades sanguíneas. Há também as laranjas de polpa vermelha, conhecidas como laranjas vermelhas, falsas sanguíneas ou sanguínea de Mombuca (Figura 3). Os carotenoides licopeno, betacaroteno, xantinas e outros são responsáveis pela coloração avermelhada da polpa, sendo que não são detectadas antocianinas nestas variedades (LATADO, 2009). Estudos sobre a variedade da laranja sanguínea de Mombuca têm sido realizados no Centro APTA Citros Sylvio Moreira, Instituto Agronômico de Campinas da Secretaria de Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo, onde foram caracterizadas as propriedades físico- 23 químicas da fruta, que se mostrou semelhante à composição da variedade Pera do Rio (GHILARDI, 2012). Figura 3. Fruto de laranja vermelha de Mombuca, do grupo das variedades falsas sanguíneas. 3.2. Composição do Suco de Laranja Clara e Laranja Vermelha O suco de laranja constitui um produto complexo, formado por uma solução aquosa de vários componentes orgânicos voláteis e instáveis, responsáveis pelo seu sabor e aroma, além de açúcares, ácidos, sais minerais, vitaminas e pigmentos. É um líquido límpido ou turvo, extraído do fruto da laranjeira (Citrus sinensis), através de processo tecnológico adequado, não fermentado, submetido a um tratamento que assegura sua apresentação e comercialização até o momento do consumo (NETO, 1999). O suco de laranja é o suco de fruta mais consumido no mundo (PEREZ-CACHO e ROUSEFF, 2008) e é rico em vitaminas, como a vitamina C e o folato, bem como minerais como potássio e em açúcares naturais e flavonoides cítricos, denominados hesperidina e naringenina. A ingesta média de flavonoides oriundos dos alimentos vegetais é de cerca de 25 mg/dia em muitos países da Europa, com variações em função dos hábitos alimentares. As laranjas e seus sucos são boas fontes destes flavonoides e contêm cerca de 40 mg/100g do alimento, mas perdas consideráveis ocorrem com a remoção da casca, antes do consumo ou no processo industrial (ARABBI, 2001). Dos nutrientes mais prevalentes no suco de laranja clara, a vitamina C merece destaque, pois é encontrada em fontes alimentares específicas como as frutas, especialmente as cítricas (USDA, 2014). A vitamina C, também denominada ácido ascórbico, é um antioxidante hidrossolúvel, capaz de reagir diretamente contra os radicais 24 livres superóxido, hidroxilas e oxigênio singlet que podem causar danos a membranas celulares, DNA e lipídeos plasmáticos (SAUBERLICH, 1994). Além disso, participa como cofator na biossíntese do colágeno, da carnitina e de neurotransmissores e está associada à redução do risco de doenças como câncer e doença cardiovascular (SILALAHI, 2002). Os principais nutrientes presentes em um copo de 200 mL de suco de laranja clara são mostrados no Quadro 1. Quadro 1: Informação nutricional do suco de laranja clara integral e pasteurizado. Nutriente 250 mL g mg µg Kcal Energia - - - 120 Água 222 - - - Proteína 1,5 - - - Gordura total 0,4 - - - Carboidrato 29 - - - Fibra dietética 0,5 - - - Cálcio - 20 - - Ferro - 1,1 - - Magnésio - 27 - - Fósforo - 1,1 - - Potássio - 436 - - Sódio - - 0,2 - Zinco - 0,2 - Vitamina A - 22 - Vitamina C - 86 - - B-caroteno - - 20 - Hesperitina - 13,75 - - Naringenina - 3,86 - - Fonte: USDA, 2014. No Brasil são cultivadas variedades de laranjas doces de polpa vermelha, cuja polpa se distingue devido à presença do licopeno na sua composição de carotenoides em relação às laranjas de polpa clara. O Quadro 2 mostra a composição média de carotenoides em 250 25 mL do suco de laranja vermelha das variedades Sanguínea de Mombuca, Baia Cara-Cara e Valência Puka em relação ao suco de laranja clara (Valencia) (MERUSSI et al., 2012). Quadro 2: Composição de carotenoides presentes em 250 mL de suco de laranja vermelha e clara, integral e pasteurizado. Carotenoides Vermelha Clara Carotenoides totais 2800 µg 1761 µg Beta-caroteno 300 µg 20 µg Criptoxantina 101 µg 67 µg Luteína + Zeoxantina 92 µg 67 µg Licopeno 430 µg 0 µg Latado et al., 2009. O licopeno é um potente antioxidante natural capaz de suprimir o oxigênio singlet (ARAB e STECK, 2000) prevenindo a lesão endotelial, reduzindo a síntese do colesterol e a resposta inflamatória, entre outros (PALOZZA et al., 2010). De acordo com Merussi et al. (2012) o conteúdo de carotenoides totais do suco de laranja de polpa vermelha é 48% maior do que a variedade Valencia de laranjas claras. Especificamente, as concentrações médias de β-caroteno, β-criptoxantina e luteína do suco de laranja vermelha são 302%, 50% e 37% maiores, respectivamente, do que nas laranjas claras. 3.3. Efeitos Fisiológicos e Metabólicos do Consumo do Suco de Laranja Clara e Laranja Vermelha Tem sido sugerido que a ingesta de suco de laranja, ou mesmo de flavonoides cítricos isolados, pode reduzir a hipercolesterolemia em animais de experimentação. Experimento em ratos com hipercolesterolemia induzida que receberam dieta com 1% de flavanonas polimetoxiladas, resultou em diminuição do colesterol de VLDL, colesterol de LDL e triglicerídeos (KUROWSKA e MANTHEY, 2004). Um estudo com homens e mulheres moderadamente hipercolesterolêmicos, que consumiam quantidades crescentes de suco de laranja por semanas consecutivas, mostrou que 750 mL/dia de suco de laranja aumentou 21% o HDL-C, enquanto diminuiu 30% os triglicerídeos e 16% a razão LDL-C/HDL-C (KUROWSKA et al., 2000b). 26 Estudos prévios verificaram um aumento significativo do HDL-C em homens normolipidêmicos suplementados com suco de laranja (CARNEIRO, 2004) e uma melhora no perfil lipídico de mulheres suplementadas com suco de laranja e praticantes de exercício físico (BONIFÁCIO, 2007). Também, a razão LDL/HDL e os radicais livres diminuíram em homens e mulheres que ingeriram 750 mL de suco de laranja durante três semanas (FRANKE et al., 2005). Devaraj et al. (2006) verificaram que o suco de laranja suplementado com fitoesteróis promoveu a redução significativa do colesterol total e colesterol de LDL, e aumentou o colesterol de HDL em indivíduos saudáveis após 8 semanas de ingesta. Em relação aos níveis de glicemia, foi mostrada diminuição significativa na glicose de jejum entre os participantes normolipidêmicos que ingeriram 750 mL de suco de laranja durante 8 semanas (RODRIGUES, 2007; BASILE et al., 2010). Um estudo recente mostrou ainda que a ingesta de suco de laranja por indivíduos saudáveis submetidos à dieta rica em gorduras e carboidratos (dieta inflamatória) previne o estresse oxidativo e inflamatório, que pode levar à resistência insulínica (GHANIM et al., 2010). Outros estudos têm mostrado consistentemente que o consumo crônico de suco de laranja reduz os níveis séricos de colesterol total e LDL-C e melhora a função endotelial, levando à diminuição do risco de aterosclerose (CESAR et al., 2010; GUARNIERI et al., 2007) e de hipertensão arterial (MORAND et al., 2010, LIMA et al., 2012). Também foi relatado que a ingesta de 500 mL de suco de laranja por 14 dias aumentou a vitamina C plasmática e diminuiu os radicais livres (8-hidroxideoxiguanosina) em humanos (SÁNCHEZ-MORENO et al., 2003a, b). Estes autores demonstraram que beber dois copos de suco de laranja (500 mL/dia) aumentou a vitamina C no plasma e reduziu as concentrações de marcadores de estresse oxidativo. Segundo Ghanim et al. (2007) o suco de laranja possui um potencial efeito anti-inflamatório e supõem que o suco é capaz de diminuir a geração de espécies reativas de oxigênio e este efeito é provavelmente atribuído aos flavonoides: naringina e hesperidina. BONIFÁCIO e CESAR (2009) destacaram que o consumo regular de suco de laranja elevou o aporte de vitamina C na dieta e foi associado à menor incidência de hipertensão arterial e obesidade em homens, sugerindo que o suco, ou seus componentes, auxilia na prevenção da hipertensão. APTEKMANN e CESAR (2010) relataram que o consumo de suco de laranja associado ao treinamento aeróbio em mulheres com sobrepeso diminuiu o risco de doença cardiovascular, pela redução dos níveis de LDL-C e aumento dos níveis de HDL-C. Um estudo relatou a associação dos flavonoides cítricos ou flavanonas com redução do risco de doença arterial coronariana, redução do colesterol sanguíneo, inibição da oxidação da LDL e ácidos graxos e ainda redução da agregação plaquetária. A hesperidina 27 é o principal componente flavonoide encontrado exclusivamente nas frutas cítricas e em quantidades apreciáveis no suco de laranja. A hesperidina juntamente com a naringenina, o segundo mais importante flavonoide das frutas cítricas, exibem ação cardioprotetora indireta por exercer efeito supressor sobre as espécies reativas de oxigênio in vitro (GHANIM, 2007). Foi sugerido que as flavanonas são capazes de reduzir os níveis de colesterol sanguíneo por dois mecanismos básicos: 1) inibição da Enzima Acetil-Coenzima-A Acil Transferase (ACAT), responsável pela esterificação do colesterol hepático, e 2) aumento da atividade dos receptores celulares de LDL-C (BOK, 1999). Em relação ao suco de laranja vermelha, apenas um estudo de RISO et al. (2005) abordou os efeitos deste suco no metabolismo lipídico, verificando que seu consumo aumentou eficazmente as concentrações plasmáticas de antioxidantes, ou seja, de vitamina C, criptoxantina, zeaxantina, e cianidina 3-glucosídeo. Recentemente, o Laboratório de Nutrição da FCFar/UNESP tem realizado estudos sobre a ação metabólica do suco de laranja vermelha em pacientes com síndrome metabólica e outros com hepatite C crônica. Nestes estudos foi mostrado que o tratamento crônico com o suco de laranja vermelha diminuiu 10% o colesterol total, 11% o LDL-C, 20% a proteína C reativa e 5% a pressão arterial, além de aumentar em 140% a atividade antioxidante no soro dos voluntários (DOURADO et al., 2011). De forma similar, o consumo do suco de laranja vermelha por pacientes com hepatite C crônica reduziu em 44,5% a peroxidação lipídica sanguínea e aumentou 2,5% a capacidade antioxidante no soro dos indivíduos (LIMA et al., 2013). Assim, tem sido sugerido que a ingesta regular do suco de laranja vermelha reduz a peroxidação lipídica e aumenta a capacidade antioxidante no soro de indivíduos com síndrome metabólica e de pacientes com hepatite C crônica. Isto se deve provavelmente à ação antioxidante da vitamina C, dos flavonoides e carotenoides presentes neste suco. Vale ressaltar, que o consumo do suco de laranja vermelha não alterou a peso corpóreo ou a porcentagem de gordura corporal dos participantes dos estudos realizados. Assim, o suco de laranja vermelha apresentou propriedades hipolipidêmicas, anti-inflamatória e antioxidantes, que contribuem para a prevenção ou melhora dos do quadro clínico relacionado à síndrome metabólica e à hepatite C crônica (SILVEIRA, J. C., 2011; MANJATE, NASSER e CÉSAR, 2013). Devido à escassez de estudos sobre as propriedades funcionais do suco de laranja vermelha, e ao seu potencial já detectado, o objetivo deste estudo foi investigar o efeito protetor do suco de laranja vermelha, da variedade Mombuca, contra as ações deletérias de uma dieta hiperlipídica em ratos. ReferênciasReferênciasReferênciasReferências 29 Referências APTEKMANN N.P., CESAR T.B. Orange juice improved lipid profile and blood lactate of overweight middle-aged women subjected to aerobic training. Maturitas . 2010 Aug 20. ARAB, L.; STECK, S. 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Artigo Título: Efeito protetor do suco de laranja vermelha nos parâmetros fisiológicos e marcadores bioquímicos em ratos tratados com dieta hiperlipídica Protective effect of red orange juice in the physiological parameters and biochemical markers in rats treated with high fat diet Short title: Suco de laranja vermelha na dieta Red Orange juice on diet Autores: Gisele Massaferaa Maria Fernanda Molinari Blottab Telma M. Braga Costab Thais B. Cesara* a Departamento de Alimentos e Nutrição, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, Brasil. * Autor correspondente: Endereço: Rodovia Araraquara-Jau km 1, Araraquara, SP, Brasil, 14802-901 , Tel.: 55-16-3301-6927; fax: 55-16-3301-6020. E-mail:tcesar@fcfar.unesp.br b Curso de Nutrição, Universidade de Ribeirão Preto, Avenida Costábile Romano 2201, Ribeirão Preto 14096-400, Brasil 36 Resumo Objetivo Investigar o efeito do suco de laranja vermelha no perfil lipídico, composição corporal e proteção hepática, em ratos tratados com dieta hiperlipídica. Métodos Foram utilizados 60 ratos adultos, divididos em seis grupos que foram tratados com dieta padrão ou hiperlipídica associado a três tipos de ingesta hídrica: água, SLV ou bebida teste (solução aquosa com açúcar). O tratamento durou 30 dias e foram coletadas medidas da massa corporal e ingesta alimentar. Ao final do período os animais foram eutanasiados e o sangue utilizado para determinação dos parâmetros bioquímicos. Os órgãos (rins, baço e fígado) e a gordura abdominal foram coletados para analises posteriores. Resultados Os grupos tratados com dieta hiperlipídica ganharam maior peso corporal. Todos os grupos que receberam dieta padrão, independente da ingesta hídrica (água, SLV, ou bebida teste), apresentaram maior consumo de dieta. Os animais tratados com SLV apresentaram menor consumo de ração e maior consumo hídrico em comparação aos seus controles. Tanto a glicemia como triglicérides do soro sanguíneo foram diminuídos nos grupos tratados com a dieta hiperlipídica. O colesterol sérico foi aumentado pela dieta hiperlipídica, mas foi levemente reduzido pela ingesta do SLV. As enzimas hepáticas, aspartato aminotransferase e alanina aminotransferase não mostraram efeitos da dieta ou da ingesta hídrica, mas a fosfatase alcalina foi reduzida nos animais que receberam SLV, independente do tipo de dieta. Houve acúmulo de gordura abdominal e de gordura hepática nos grupos tratados com dieta hiperlipídica, mostrando o efeito deletério da dieta hiperlipídica. Conclusões O suco de laranja vermelha mostrou benéfico no perfil glicêmico e uma leve proteção no tecido hepático na vigência de dieta hiperlipídica. Termos de indexação: Suco de laranja vermelha, dieta hiperlipídica, colesterol sérico, gordura hepática, rato. 37 Abstract Objective: The objective of this study was to investigate the effect of red pulp orange juice on the lipid profile, body composition and hepatic protection in rats treated with high-fat diet. Methods: Adult rats (n=60) were divided into 6 groups that were treated with standard or high-fat diet associated with water, RPOJ or test drink, the treatment lasted 30 days and measurements of body weight and food intake were made. At the end of the period the animals were euthanized and the blood serum, organs (kidney, spleen and liver) and abdominal fat were collected for further analysis. Results: The groups treated with high-fat diet gained more body mass. All groups that received standard diet, regardless of fluid intake have showed higher feed intake. Animals treated with RPOJ showed lower feed intake and increased water consumption compared to their controls. Both glucose and triglycerides in blood serum was decreased in the groups treated with the fat diet. Serum cholesterol was increased by high-fat diet but was smooth reduced by the intake of RPOJ. Liver enzymes, aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase, showed no effects of diet or water intake, but the alkaline phosphatase was reduced in animals receiving RPOJ, regardless of the type of diet. There was accumulation of abdominal fat and liver fat in groups treated with high fat diet, showing deleterious effect of high fat diet. Conclusions: In conclusion, the RPOJ have shown beneficial lipid profile and partial lightweight protection in liver tissue in the presence of high-fat diet. Indexing terms: Red pulp orange juice (RPOJ), hyperlipidic diet, blood serum cholesterol, fat liver, rat model 38 Introdução Estudos epidemiológicos sugerem que o consumo de frutas e hortaliças está inversamente correlacionado com o risco de algumas doenças crônicas. Grande parte deste efeito protetor tem sido atribuído à atividade biológica dos metabólitos secundários de plantas1. Neste sentido, a laranja que é uma importante fonte de vitaminas e fibras, vêm sendo recentemente reconhecida por conter metabólitos secundários antioxidantes como ácido ascórbico, compostos fenólicos, flavonoides e limonoides2. O suco de laranja constitui um produto complexo, formado por uma solução heterogênea aquosa de vários componentes orgânicos, voláteis e instáveis, responsáveis pelo seu sabor e aroma, além de açúcares, ácidos, sais minerais, vitaminas e pigmentos. É um líquido extraído do fruto da laranjeira (Citrus sinensis) sendo o suco de fruta mais consumido no mundo todo, rico em vitaminas, como vitamina C e folato, em minerais como potássio, em açúcares naturais e em flavonoides cítricos, denominados hesperidina e naringenina3, 4. Estudos têm comprovado que a ingesta regular de suco de laranja têm ação benéfica na saúde. Um estudo relatou a associação dos flavonoides cítricos ou flavanonas com redução do risco de doença arterial coronariana, redução do colesterol sanguíneo total e de LDL, inibição da oxidação da LDL e ácidos graxos e ainda redução da agregação plaquetária5. A hesperidina é o principal componente flavonoide encontrado exclusivamente nas frutas cítricas e em quantidades apreciáveis no suco de laranja. A hesperidina juntamente com a naringenina, o segundo mais importante flavonoide das frutas cítricas, exibem ação cardioprotetora indireta por exercer efeito supressor sobre as espécies reativas de oxigênio in vitro6. O suco de laranja e a hesperidina isolada mostraram efeito hipolipidêmico sobre o colesterol total, LDL-C e triacilgliceróis, e aumento do colesterol de HDL-C 7. Há relatos de diminuição significativa na glicemia de jejum entre os participantes normolipidêmicos que ingeriram 750 mL de suco de laranja durante 8 semanas8. Estudo prévio tem sugerido que a ingesta do suco melhora o perfil lipídico e reduz o risco de doenças cardiovasculares9, 10 podendo suprimir espécies reativas de oxigênio e processos inflamatórios6. As laranjas podem ser divididas em brancas ou claras, em sanguíneas, e vermelhas ou falsas sanguíneas. As claras são caracterizadas pela cor amarela da polpa e suco, devido à presença de carotenoides. A este grupo pertencem quase que a totalidade das laranjas comerciais cultivadas no mundo, incluindo as variedades de mesa (Baía, Navel, Baianinha), variedades usadas para a extração de suco (Pêra, Valência, Natal, Hamlin), 39 laranjas sem acidez (Lima, Serra d´agua). As laranjas sanguíneas são caracterizadas pela coloração vermelho-intensa (violácea) da polpa e suco, devido à presença do pigmento antocianina. Como exemplos de variedades mais utilizadas podem ser citados: Tarroco, Moro, Sanguinella e Sanguinelo, e elas são mais cultivadas nas regiões do mediterrâneo e na Índia. O grupo chamado “falsas sanguíneas” que apresentam polpa e suco avermelhados devido à presença de carotenoides, especialmente beta caroteno e licopeno. Um exemplo típico desta laranja é a sanguínea de Mombuca, que vem sendo cultivada na região de Cordeirópolis, SP11. Os carotenoides e em especial o licopeno são antioxidantes naturais, capazes de suprimir o oxigênio singlete prevenindo a lesão endotelial, reduzindo a síntese do colesterol e a resposta inflamatória12. Estudo com pacientes portadores da hepatite C crônica, que ingeriram suco de laranja vermelha regularmente durante dois meses, mostrou redução da peroxidação lipídica e aumento da capacidade antioxidante no soro sanguíneo13. Outro verificou que a ingesta do suco de laranja vermelha por indivíduos saudáveis submetidos à dieta rica em gorduras e carboidratos (dieta inflamatória) preveniu o estresse oxidativo e inflamatório2. Outros estudos tem demonstrado consistentemente que o consumo crônico de suco de laranja vermelha reduz os níveis séricos de colesterol total e LDL-C e melhorou a função endotelial, levando à diminuição do risco de aterosclerose13, 14 e de hipertensão arterial15. Com base nas evidências aqui descritas, o objetivo deste estudo foi mostrar em modelo experimental que o suco de laranja vermelha tem efeito benéfico no perfil lipídico, na manutenção da composição corporal, e proteção hepática contra os efeitos deletérios de uma dieta hiperlipídica. 40 Material e Métodos Animais Foram utilizados 60 ratos machos, Wistar, pesando 420-440g, com 150 dias de idade, que foram alojados individualmente em gaiolas de polipropileno (30 cm x 19 cm x 13 cm), com tampa gradeada de aço inoxidável. O ambiente do biotério é climatizado com temperatura constante de 23 ± 1ºC, foto período artificial de 12/12 horas e umidade relativa do 60 ± 5%, alimentados com dieta padrão para roedores e água ad libitum. A Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade de Ribeirão Preto - UNAERP, aprovou o protocolo experimental e todos os animais foram tratados de acordo com os princípios e diretrizes deste conselho (Protocolo no 110/2011). Dietas e bebidas A dieta padrão formulada continha 22% de proteína, 4% de gordura, 56% de carboidratos e 2% de fibra bruta em 100g de ração e 3,5kcal/g energia metabolizável (NUVILAB® CR-1, Colombo, PR, Brasil). A dieta hiperlipídica consistiu de uma mistura de alimentos hipercalóricos, na seguinte proporção: 100g de amendoim torrado moído sem casca, 100g de chocolate branco e 50 g de biscoito de amido de milho (MAIZENA®) e 150g de ração NUVILAB® 16. Estes ingredientes foram moídos, misturados e oferecidos na forma de péletes contendo: 25% de proteína, 15% de gordura, 46% de carboidratos e 5% de fibra dietética em 100g de ração padrão, perfazendo um total de 4,3kcal/g de energia metabolizável. As dietas e os suprimentos hídricos (água, suco de laranja vermelha ou bebida teste) foram oferecidos ad libtum e os animais monitorados diariamente para a ingesta dietética e hídrica, sendo monitorada a massa corporal três vezes por semana. Um único lote de suco de laranja vermelha (12º Brix) foi fornecido pela Citrosuco S/A (Matão, Brasil) e utilizado em todo o experimento. O suco de laranja vermelha foi armazenado em garrafas de 1L a -20oC. A concentração de hesperidina em suco de laranja vermelha foi de 135mg /L. A composição nutricional do suco de laranja vermelha em 100 ml foi de: Energia (45 kcal), proteína (0,67g), carboidratos (10g), lipídeos (0,27g), açúcar total (8,4g), ácido fólico (30µg), ferro (0,27mg), vitamina C (27mg) a hesperidina (12mg), carotenoides (1240µg) e licopeno (172µg)11. Foi utilizada uma bebida teste, com o objetivo de se ter uma mistura de açúcares semelhantes ao suco, porém sem os compostos com ação funcional, e ela foi obtida pela mistura de 52g de sacarose, 25g de frutose, 21g de glicose, 7,5g de ácido cítrico e 2,5g ácido málico em 1L de água. O consumo de bebida foi medido diariamente. 41 Desenho Experimental Os ratos foram divididos aleatoriamente em seis grupos de 10 animais cada, conforme seguem: (1) Dieta padrão + água, (2) Dieta padrão + suco de laranja vermelha, (3) Dieta padrão + bebida teste, (4) Dieta hiperlipídica + água, (5) Dieta hiperlipídica + suco de laranja vermelha e (6) Dieta hiperlipídica + bebida teste. No final do período experimental (4 semanas), todos os animais foram sacrificados com injeção intraperitoneal contendo Thiopentax® (40mg/kg peso corporal). Após a anestesia, foi feita laparotomia peritoneal para coleta de sangue, dos órgãos (fígado, rins, baço) e da gordura abdominal, que foram em seguida pesados. O sangue foi imediatamente centrifugado e o soro sanguíneo congelado para análises posteriores. A glicose, triglicerídeos, colesterol total, colesterol HDL e a atividade das enzimas aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e fosfatase alcalina (ALP), foram quantificados com kits comerciais Biotecnica® (Varginha, MG, Brasil), utilizando um analisador automático (MINDRAY BS-380) no Laboratório Clínico UNAERP. A quantidade de lipídeos no fígado foi determinada pelo método Soxhlet17. A atividade antioxidante total do soro foi determinada usando o ABTS, de acordo com o método de Misra e Fridovich18, modificado por Boveris et al19. As análises foram realizadas em triplicatas. A eficiência das dietas (TED) foi calculada através da fórmula 20: TED= média de ganho de peso diário (g) média de consumo de dieta diário (g) Analise estatística Os resultados individuais foram expressos como média ± desvio padrão para todos os grupos experimentais. Os conjuntos de dados foram testados quanto à normalidade e em seguida realizada análise de Variância (ANOVA) para a comparação entre os grupos, estabelecendo a significância das diferenças observadas. O nível de significância estatística foi 5% em todas as comparações efetuadas. 42 Resultados A composição química e o valor energético das dietas padrão e hiperlipídica utilizadas neste experimento são apresentadas na Tabela 1. A dieta padrão seguiu a composição da dieta AIN93-G para roedores21 e foi confeccionada pela NUVLAB, Varginha, MG. A dieta hiperlipídica foi elaborada artesanalmente no laboratório, e continha amendoim torrado, chocolate branco, biscoito tipo maisena, complementada com dieta padrão, conforme descrito anteriormente16. De acordo com a análise centesimal realizada a dieta hiperlipídica apresentou um teor 58% menor de umidade do que a dieta padrão. Vale ressaltar que na dieta hiperlipídica foi adicionado o aglutinante PVP-K30 (All Chemistry do Brasil Ltda.) na mistura dos ingredientes, seguido de secagem em estufa a 70ºC por 24h, o que diminuiu seu teor de umidade. Da mesma forma, foi detectada menor proporção de cinzas na dieta hiperlipídica, o que era esperado, desde que a dieta hiperlipídica foi confeccionada pela mistura de três alimentos (chocolate branco, amendoim e biscoito doce) adicionada à dieta padrão, sem haver reposição dos sais minerais. Por outro lado, as duas dietas foram similares em relação aos teores de proteína (p>0.05). Ao comparar o teor de lipídeos das duas dietas, observa-se que a hiperlipídica foi quatro vezes superior à dieta padrão (p<0.05), apresentando assim o valor pretendido para uma dieta rica em gorduras. Da mesma forma, a dieta hiperlipídica continha 2,5 vezes mais fibras do que a dieta padrão (p<0.05), devido à contribuição dos ingredientes naturais utilizados na confecção, como por exemplo, o amendoim e a bolacha maizena® que contem 8,5% e 2,3% de fibras, respectivamente. Já para os teores de carboidratos, a dieta hiperlipídica apresentou cerca de 16% menos do que a dieta padrão. Para os valores energéticos houve diferença significativa entre as duas dietas, onde a hiperlipídica forneceu 20% mais energia que a dieta padrão (p<0.05). A avaliação dos parâmetros fisiológicos, tais como, a peso corpóreo inicial e final, o ganho de massa, a ingesta hídrica e o consumo de dieta dos animais tratados com dieta padrão e hiperlipídica, adicionadas de água, suco de laranja ou bebida teste, são mostrados na Tabela 2. Os resultados mostraram que os grupos tratados com dieta hiperlipídica ganharam maior massa corporal ao longo do experimento, e apresentaram, em geral, maior massa corporal final. Por outro lado, todos os grupos que receberam dieta padrão (água, suco de laranja vermelha, e bebida teste) apresentaram um consumo médio estatisticamente maior do que nos grupos que receberam a dieta hiperlipídica (água, suco de laranja vermelha, e bebida teste). (Tabela 2). Observou-se que os animais tratados com 43 dieta padrão mais suco de laranja vermelha e, dieta hiperlipídica mais suco de laranja vermelha ou água, apresentaram em média menor consumo de ração, comparados aos demais grupos (p<0.05). Resultados similares foram encontrados para o consumo total da dieta. A avaliação da eficiência das dietas, que expressa a eficiência da dieta em propiciar ganho de peso, mostrou que a dieta hiperlipídica foi em média 2.5 vezes mais eficiente que a dieta padrão. Ao avaliar o consumo de água, suco de laranja vermelha ou de bebida teste, é claramente notado que os grupos tratados com suco de laranja tiveram um consumo hídrico significativamente maior do que os grupos tratados com água ou bebida teste (p<0.05) (Tabela 2). Independente do tipo de dieta, o volume médio consumido de suco de laranja vermelha foi maior 2,9 vezes que a água e 1,6 vezes que a bebida teste. Foi também significativa a diferença entre o consumo médio de bebida teste e água, sendo que a ingesta de água e bebida teste foi maior na vigência de dieta padrão do que com a dieta hiperlipídica (p<0.05). Os níveis glicêmicos no soro sanguíneo dos ratos foram significativamente maiores nos grupos tratados com a dieta hiperlipídica (p<0.05), no entanto, os grupos tratados com esta dieta e que consumiram suco de laranja vermelha ou bebida teste apresentaram valores significativamente menores quando comparados ao grupo que consumiu água. Por outro lado, os triglicérides foram aumentados pela presença da dieta hiperlipídica, mas também foram influenciados pelo consumo do suco de laranja vermelha, que reduziu significativamente (p<0,05) este parâmetro. A dieta hiperlipídica não influenciou o colesterol sérico apresentando valores levemente aumentados neste grupo e com uma leve redução causada pela ingesta do suco de laranja vermelha. O HDL-C parece não ter sido influenciado pelo tipo de suplemento hídrico ou pelo tipo de dieta, pois não apresentou uma diferença significativamente detectável para estes fatores. Estes resultados são apresentados na Tabela 3. A capacidade antioxidante do soro sanguíneo foi significativamente menor nos grupos tratados com dieta hiperlipídica (p<0.05) (Tabela 3). Já as concentrações das enzimas hepáticas, aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) não variaram significativamente entre os diferentes grupos analisados. Entretanto, a concentração da ALP foi significativamente aumentada nos grupos tratados com dieta hiperlipídica (p<0.05). Entre os animais tratados com dieta padrão, o grupo que recebeu suco de laranja vermelha apresentou os menores valores de ALP. Efeito similar foi observado nos grupos tratados com dieta hiperlipídica, cujos menores teores de ALP foram encontrados nos ratos que receberam suco de laranja vermelha (p<0.05) (Tabela 3). A 44 menor massa relativa dos rins (massa do órgão/peso corpóreo) foi observada nos grupos tratados com dieta hiperlipídica mais água, ou suco de laranja vermelha, e dieta padrão mais água, seguidos pela dieta hiperlipídica mais bebida teste (valor intermediário) e dieta padrão mais suco ou bebida teste (Tabela 4). Por outro lado, não foram detectadas diferenças nas massas relativas do baço entre os grupos estudados (p>0.05). A massa relativa do fígado nos animais dos grupos tratados com dieta padrão foram, em geral, mais elevadas que dos animais tratados com dieta hiperlipídica (p<0.05) (Tabela 4). Adicionalmente, a avaliação da gordura hepática mostrou um acúmulo muito maior de tecido adiposo nos grupos tratados com dieta hiperlipídica, sugerindo um efeito da quantidade de gordura sobre o peso do órgão. Finalmente, a gordura abdominal mostrou uma prevalência do efeito deletério da dieta hiperlipídica, pois os grupos tratados com esta dieta foram os que apresentaram maiores quantidades deste parâmetro. 45 4. Discussão Estudos sobre o efeito do suco de laranja amarela na saúde, realizados com modelos experimentais e no ser humano, tem sido mais intensamente realizados nos últimos anos6, 22, 23, 24. Há, entretanto, raros estudos sobre a influência do suco de laranja vermelha em parâmetros fisiológicos e bioquímicos, especialmente sobre a interação deste com a dietas ricas gorduras e calorias. A laranja vermelha (falsa sanguínea) se diferencia das laranjas claras e das sanguíneas, por apresentar em sua composição uma quantidade excepcionalmente maior de carotenoides (52%), entre eles, a presença de licopeno11. Desta forma, neste trabalho buscamos responder a questões específicas sobre o efeito do suco de laranja vermelha e sua interação com dieta hiperlipídica, mimetizando uma condição dietética ambiental pela qual uma grande parte dos indivíduos está sujeita hoje em dia, o chamado “ambiente obesogênico”. Verificou-se que no início do experimento a massa corporal dos ratos foi compatível com a de animais adultos (≅ 400g) que, em geral, estavam em estado de equilíbrio metabólico. Esta condição foi fundamental para que as modificações observadas durante o período experimental fossem atribuídas aos efeitos das dietas e das ingestões hídricas. Ao final do experimento foi verificado que a dieta hiperlipídica apresentou efeito preponderante, elevando significativamente a massa corporal nos animais tratados com a dieta rica em lipídios. Corroborando estes resultados, a avaliação da eficiência da dieta, que é uma importante ferramenta para avaliar a ingesta de nutrientes e sua biodisponibilidade nos tecidos20, mostrou que a dieta hiperlipídica apresentou alta eficiência, de fato mais que o dobro da dieta padrão, o que é esperado para dietas com maior teor de calorias, não havendo diferenças estatísticas no tipo de suplemento hídrico utilizado. Porém, com a dieta padrão, o suplemento com suco de laranja aumentou levemente a eficiência da dieta (valor intermediário), mas não houve diferenças entre os grupos que receberam a dieta padrão mais a água ou a bebida teste (p>0.05). É fato que os roedores apresentam um padrão endógeno do consumo de dieta em função do teor energético25, apresentando menor consumo com dietas mais calóricas, como ocorreu com a dieta hiperlipídica. A ingesta hídrica é influenciada pela sensação de sede e pelo aumento de osmolalidade no sangue, ou seja, pela menor quantidade de água intravascular. A água estimula os receptores de estiramento na mucosa gástrica enviando sinais nervosos para o cérebro interrompendo o ato de beber e inibindo a sensação de sede. Os hormônios antidiuréticos atuam nos túbulos renais, aumentando a reabsorção de água para o sangue 46 até o retorno da osmolalidade sanguínea. A secreção de hormônios antidiuréticos é inibida quando o plasma se torna hipotônico26. Há de fato duas razões que justificam o aumento da ingesta hídrica nos animais tratados com suco de laranja vermelha. Primeiro, a alta densidade nutricional do suco27, ou seja, a enorme quantidade de nutrientes em relação às calorias fornecidas, e em segundo lugar, devido à concentração de sólidos solúveis dissolvidos no suco, especialmente a sacarose (12o Brix). Por causa dessas condições, sugere-se que o suco de laranja vermelha causou uma polidispsia, fazendo com que os animais assim tratados a necessitarem de mais líquido para suprir sua necessidade de hidratação. Em relação ao perfil glicêmico, foi observado que as concentrações séricas de glicose foram alteradas com o consumo da dieta hiperlipídica, e a ingesta do suco da laranja vermelha e/ou da bebida teste apresentaram uma redução significativamente sobre a glicemia sanguínea, já para os grupos que tratados com dieta padrão, não houve diferença significativa independente do tipo de suplemento hídrico. Estes resultados concordam com estudos que mostraram em humanos que o consumo regular de suco de laranja não afeta a concentração da glicemia em jejum8, 15, no presente estudo podemos sugerir que o suco de laranja tem uma ação positiva sobre o perfil glicêmico quando associado a uma dieta hiperlipídica. O suco de laranja é um alimento que possui índice glicêmico moderado, apresentando cerca de 22g de açúcares totais em 250mL, na proporção de 2:1:1 de sacarose/frutose/glicose4. Outros autores observaram que a ingesta aguda do suco de laranja associado a uma refeição rica em carboidratos e lipídeos foi capaz de manter a glicemia em níveis normais e neutralizar as espécies reativas de oxigênio (EROS) e a inflamação provocada por esta dieta com suco em comparação com a dieta associada com glicose ou água28. Outro estudo mostrou que suco de frutas, ao contrário de refrigerantes comuns ou com adoçantes artificiais, não aumentou a resposta glicêmica, provavelmente devido à ação de vitaminas, minerais, fibras solúveis e vários compostos flavonoides em adição aos açúcares naturais29. A análise do perfil lipídico mostrou que a ingesta do suco de laranja vermelha dos animais tratados com dieta padrão manteve os níveis de triglicérides. Entretanto, nos grupos tratados com dieta hiperlipídica os animais que consumiram suco de laranja vermelha tiveram uma redução significativa, o que representa um efeito positivo do suco sobre este parâmetro, alguns autores não observaram este efeito em humanos suplementados com suco de laranja clara5. Já o colesterol sérico foi levemente reduzido com o suco de laranja vermelha tanto na dieta padrão como na dieta hiperlipídica. Os efeitos hipolipidêmicos promovidos pela flavanonas do suco de laranja têm sido observados em estudo prévios e os 47 mecanismos de ação descritos incluem: diminuição da atividade da HMG-CoA e ACAT levando à redução na secreção de VLDL e consequente diminuição de apo B circulante e aumento da atividade dos receptores hepáticos de LDL, que reduzem esta lipoproteína na circulação30, 31. Entre os indicadores do processo inicial de lesão do fígado estão as enzimas AST, ALP e ALT32. Quando o órgão é lesado ou há necrose do tecido, essas enzimas são liberadas no soro sanguíneo, onde podem ser detectadas por exames de rotina. A elevação da ALP total no sangue pode estar relacionada a várias condições patológicas, como esteatose hepática, cirrose, coléstase, colecistite, entre outras. Neste estudo, foi detectado aumento significativo da ALP sérica nos ratos tratados com dieta hiperlipídica, independente do tipo de ingesta hídrica, mostrando assim que esta dieta foi deletéria aos animais. Por outro lado, nos animais tratados com dieta padrão e o suco de laranja vermelha foi observada uma redução dos teores de ALP mostrando que o suco é um protetor do tecido hepático nesta condição. A alteração de ALP relaciona-se diretamente à obstrução biliar de causas intra e extra hepáticas, e/ou à lesão hepatocelular32, 33. Assim, é sugerido que a dieta hiperlipídica deve ter provocado este tipo de lesão. No presente estudo pode-se observar ainda que a dieta hiperlipídica foi um fator preponderante para o acúmulo de gordura hepática e abdominal nos animais, e que os suprimentos hídricos, água, suco de laranja vermelha ou bebida teste, não influenciaram neste parâmetro. Estudos sugerem que o aumento da massa corporal é reflexo do ganho de massa gorda 34, fisiologicamente, dentre todos os outros macronutrientes, os lipídios são os que apresentam a maior densidade energética e a maior capacidade de estoque no organismo35. Alguns autores associam o aumento da adiposidade abdominal em ratos tratados com dieta hipercalórica como uma das características da síndrome metabólica humana, e consequentemente a riscos de desenvolvimento de outras doenças crônicas21. Portanto, no presente estudo, sugere-se que a dieta foi o principal determinante para o aumento dos tecidos adiposo nos animais tratados com dieta hiperlipídica. 48 Conclusões Em conclusão, neste estudo foi mostrado que a dieta hiperlipídica levou a um ganho significativo de peso corpóreo, com aumento do tecido adiposo. O suco de laranja vermelha aumentou a saciedade dos animais o que levou à menor ingesta de dieta. O suco de laranja vermelha teve um efeito positivo nos níveis de glicemia e no perfil lipídico dos animais, promovendo redução dos triglicérides, e não alterando os níveis e do colesterol e HDL-C séricos nos grupos tratados com dieta hiperlipídica. Observou-se também, que o suco de laranja vermelha teve um efeito positivo na ALP nos grupos tratados com dieta hiperlipídica. 49 Agradecimentos A Universidade de Ribeirão Preto pelo suporte financeiro, a empresa Citrosuco S.A. pela doação do suco de laranja vermelha. Autores: G. MASSAFERA participou da definição da composição da dieta e elaboração do protocolo experimental, executou a elaboração das dietas e acompanhamento da ingesta alimentar e determinações de aspectos nutricionais das dietas ministradas, participou da análise estatística dos resultados e da elaboração e discussão de figuras e tabelas de resultados de todos os experimentos e redação do manuscrito. M. F. M. Blotta executou a elaboração das dietas e acompanhamento da ingesta alimentar e determinações de aspectos nutricionais das dietas ministradas. T. M. BRAGA COSTA foi o coorientador da pesquisa, participou do delineamento experimental. T.B. CÉSAR foi orientador da execução da pesquisa, delineador do projeto e participou da discussão dos resultados (análise estatística, elaboração e discussão de figuras e tabelas de resultados de todos os experimentos) e redação do manuscrito. 50 Referencias 1. KUJAWSKA, M.; IGNATOWICZ, E.; EWERTOWSKA, M.; MARKOWSKI, J. e JODYNIS- LIEBERT, J. Cloudy apple juice protects against chemical-induced oxidative stress in rat. Eur J Nutr . Feb;50(1):53-60. doi: 10.1007/s00394-010-0114-y. 2011 2. JAYAPRAKASHA, G.K.; PATIL, B. S. In vitro evaluation of the antioxidant activities in fruit extracts from citron and blood orange. Food Chemistry , v. 101, n. 1, p. 410-418, 2007. 3. NETO, R. da SC, and J. de AF FARIA. "Fatores que influem na qualidade do suco de laranja." Ciência e Tecnologia de Alimentos , 19 (1), 1999. 4. USDA. United State Departament of Agriculture. National Nutrient Database for Standard Reference, Release 2 , 2014. 5. CESAR, T.B.; RODRIGUES, L.U.; ARAUJO, M.S.P. and APTEKMANN, N.P. 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Parâmetro Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica Umidade (g/100g) 8,9± 0,07ª 3,7 ± 0,03b Cinzas (g/100g) 6,8± 0,05ª 3,5 ± 0,03b Proteínas (g/100g) 22,4 ± 2,6 ns 25,4 ± 1,6 ns Lipídeos (g/100g) 4,5 ± 0,14ª 15,9 ± 2,6b Fibras Dietéticas 2,0 ± 0,62ª 4,9± 0,7b Carboidratos Totais* (g/100g) 55,6 ± 2,7ª 46,7 ± 0,49b Valor calórico (Kcal/100 g) 352 ± 3ª 431 ± 16b Media ± desvio padrão * Calculado por diferença Diferenças estatísticas entre as dietas detectadas por ANOVA, onde valores seguidos por letras diferentes nas linhas diferem significativamente entre si (p<0,05). 55 Tabela 2: Parâmetros fisiológicos (Peso corpóreo inicial e final, ganho de peso corpóreo), consumo dietético e sua eficiência, consumo hídrico em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos, Ribeirão Preto, 2013. Grupos Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica Água Suco Laranja Bebida Teste Água Suco Laranja Bebida Teste Peso corpóreo inicial (g) 423±20ns 429±12ns 422±16ns 424±17ns 438±13ns 414±32ns Peso corpóreo final (g) 445±24a 453±19a 448±20a 466±25b 475±24b 458±43b Ganho de peso corpóreo (g) 22±7a 24±10a 27±8a 45±20b 36±16b 44±14b Consumo médio diário de dieta (g/d) 54±3e 39±4c 49±3d 31±3b 29±3a 38±5c Consumo total de dieta (g/30 d) 696±38d 506±48b 632±39c 401±42a 373±44a 547±70b Eficiência da dieta (%) 1,36±0,4a 2,01±0,7a 1,83±0,5a 4,82±1,9b 4,12±1,6b 3,87±0,9b Ingesta hídrica (mL/d) 41 ± 4a 108 ± 8b 72± 8c 32 ± 3a 107 ± 3b 62± 5c Ingesta calórica (kcal/d) 188±10c 137±13a 171±10b 133±14a 124±15a 162±21b Media ± desvio padrão Diferenças estatísticas entre grupos e tratamentos detectadas por ANOVA, onde valores seguidos nas linhas por letras diferentes diferem significativamente entre si (p<0,05). 56 Tabela 3: Parâmetros bioquímicos plasmáticos (Glicemia, perfil lipídico), capacidade antioxidante (CAET) e enzimas hepáticas em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos, Ribeirão Preto, 2013. Grupos Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica Água Suco Laranja Bebida Teste Água Suco Laranja Bebida Teste Glicose (mg/dL) 169±2a 180±8a 186±7a 268±24c 221±1b 220±8b Triglicérides (mg/dL) 77±10a 67±1a 94±13ab 121±21b 77±8a 111±6b Colesterol (mg/dL) 62±7ab 55±4a 59±7ab 79±10b 64±5ab 71±4b HDL (mg/dL) 28±4ab 30±4b 35±6b 21±6a 24±6a 37±3b CAET (mM) 1,87±0,0a 1,87±0,0a 1,86±0,0a 1,81±0,1b 1,81±0,1b 1,83±0,0ab AST (U/L) 58±8b 56±7ab 57±8ab 50±5ab 48±4a 49±4ab ALT (U/L) 27±4ab 22±8a 35±8b 28±4ab 24±9a 21±4a ALP (U/L) 92±22ab 75±13a 119±15bc 185±31d 137±2c 131±10c Media ± desvio padrão Diferenças estatísticas entre grupos e tratamentos detectadas por ANOVA, onde valores seguidos por letras diferentes diferem significativamente entre si (p<0,05). 57 Tabela 4: Avaliação dos órgãos em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos, Ribeirão Preto, 2013. Grupos Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica Água Suco Laranja Bebida Teste Água Suco Laranja Bebida Teste Rins (g) 0,60±0,0a 0,70±0,1b 0,65±0,1b 0,56±0,1a 0,59±0,0a 0,62±0,1ab Baço (%) 0,19±0,0a 0,18±0,0ab 0,16±0,0ab 0,16±0,0ab 0,16±0,0ab 0,14±0,1b Fígado (%) 3,11±0,2a 2,98±0,3a 2,93±0,3a 2,66±0,4b 2,44±0,2b 2,62±0,2b Gordura no fígado (%) 4,30±1,5a 6,25±1,9a 5,06±1,9a 11,6±1,2b 10,9±1,2b 12,1±3,2b Gordura abdominal (g) 5,32±1,6a 6,51±1,1a 5,24±0,1a 9,26±1,8b 11,1±2,4b 10,3±3,8b Media ± desvio padrão Diferenças estatísticas entre grupos e tratamentos detectadas por ANOVA, onde valores seguidos por letras diferentes diferem significativamente entre si (p<0,05). Figura 4: Massa corporal inicial em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. Figura 5: Massa corporal final em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. 0 100 200 300 400 500 600 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica M a ss a c o rp o ra l In ic ia l (g ) 0 100 200 300 400 500 600 Água Suco Verm Bebida Teste Água Suco Verm Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica M a ss a c o rp ó ra l f in a l (g ) a a a b b b 59 Figura 6: Ganho de peso corpóreo em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. Figura 7: Consumo diário de dieta em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. 0 10 20 30 40 50 60 70 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica G an h o d e m as sa c o rp o ra l ( g) 0 10 20 30 40 50 60 70 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica C o n su m o d e d ie ta d iá ri o ( g) e c d b a c a a b b b a 60 Figura 8: Eficiência da dieta em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. Figura 9: Ingesta hídrica diária em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica Ef ic iê n ci a d a d ie ta a a a b b b 0 20 40 60 80 100 120 140 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica In ge st a h íd ri ca d iá ri a (m L) b c a b c a 4 61 Figura 10: Glicemia em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. Figura 11: Triglicérides em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. 0 50 100 150 200 250 300 350 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica G lic o se ( m g/ d L) a a a c b b 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica Tr ig lic ér id es ( m g/ d L) a a ab b a b 62 Figura 12: Colesterol em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. Figura 13: HDL em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica C o le st er o l ( m g/ d L) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica H D L (m g /d L) ab ab b ab b a ab b b b a a 63 Figura 14: Atividade antioxidante (CAET) em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. Figura 15: Atividade da enzima fosfatase alcalina (ALP) em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica C A ET ( m M ) a a b b ab 0 50 100 150 200 250 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica A LP ( U /L ) ab a bc d c c a 64 Figura 16: Massa relativa dos rins (massa órgão/peso corpóreo) em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. Figura 17: Massa relativa do baço (massa órgão/peso corpóreo) em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica M as sa r el at iv a d o s ri n s (m as sa ó rg ão /p es o c o rp ó re o ) a b b a a ab 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica M as sa r el at iv a d o b aç o ( m as sa d o ó rg ão /p es o c o rp ó re o ) a ab ab ab ab b 65 Figura 18: Massa relativa do fígado (massa órgão/peso corpóreo) em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. Figura 19: Teor de gordura no fígado (g/100g) em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica M as sa r el at iv a (m as sa d o ó rg ão /p es o c o rp ó re o ) d o f íg ad o 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica G o rd u ra f íg ad o ( % ) a a a b b b a a a b b b 66 Figura 20: Massa relativa da gordura abdominal (massa órgão/peso corpóreo) em ratos tratados com dieta padrão e hiperlipídica com diferentes suplementos hídricos. a, b Letras diferentes significam diferença estatística com p<0.05. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Água Suco de Laranja Vermelha Bebida Teste Dieta Padrão Dieta Hiperlipídica G o rd u ra A b d o m in al ( g) a a a b b b AnexoAnexoAnexoAnexo ANEXO