RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 15/03/2023. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA-UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL ASPECTOS CLÍNICO-LABORATORIAIS E SONOGRÁFICOS NO DIAGNÓSTICO COMPLEMENTAR DE LESÕES FIBRÓTICAS EM PARÊNQUIMA MAMÁRIO DE FÊMEAS OVINAS Yuri da Silva Bonacin Médico Veterinário 2021 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA-UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL ASPECTOS CLÍNICO-LABORATORIAIS E SONOGRÁFICOS NO DIAGNÓSTICO COMPLEMENTAR DE LESÕES FIBRÓTICAS EM PARÊNQUIMA MAMÁRIO DE FÊMEAS OVINAS Discente: Yuri da Silva Bonacin Orientador: Prof. Dr. José Antonio Marques Coorientador: Prof. Dr. Paulo Aléscio Canola Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Cirurgia Veterinária. 2021 B697a Bonacin, Yuri da Silva Aspectos clínico-laboratoriais e sonográficos no diagnóstico complementar de lesões fibróticas em parênquima mamário de fêmeas ovinas / Yuri da Silva Bonacin. -- Jaboticabal, 2021 104 p. : il., tabs. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Araraquara, Jaboticabal Orientador: Prof. Dr. José Antonio Marques Coorientador: Prof. Dr. Paulo Aléscio Canola 1. Leite. 2. Mastite. 3. Leite Proteínas. 4. Ultrassonografia. 5. Doenças crônicas. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Araraquara. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Jaboticabal ASPECTOS CLÍNICO-LABORATORIAIS E SONOGRÁFICOS NO DIAGNÓSTICO COMPLEMENTAR DE LESÕES FIBRÓTICAS EM PARÊNQUIMA MAMÁRIO DE FÊMEAS OVINAS    TÍTULO DA TESE: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO AUTOR: YURI DA SILVA BONACIN ORIENTADOR: JOSÉ ANTONIO MARQUES COORIENTADOR: PAULO ALÉSCIO CANOLA Aprovado como parte das exigências para obtenção do Título de Doutor em CIRURGIA VETERINÁRIA, pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. PAULO ALÉSCIO CANOLA (Participaçao Virtual) Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária / FCAV / UNESP - Jaboticabal Prof. Dr. VALENTIM ARABICANO GHELLER (Participaçao Virtual) Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária-UFMG / Belo Horizonte/MG Prof. Dr. ANDRÉ MARCOS SANTANA (Participaçao Virtual) Departamento de Medicina Veterinária-UEM / Umuarama/PR Pós-doutorando VICTOR JOSÉ CORREIA SANTOS (Participaçao Virtual) Depto de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal / FCAV / UNESP - Jaboticabal Pós-Doutoranda DANIELA GOMES DA SILVA (Participaçao Virtual) Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária / FCAV - UNESP Jaboticabal Jaboticabal, 15 de março de 2021 Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - Câmpus de Jaboticabal - Via de Acesso Professor Paulo Donato Castellane, s/n, 14884900, Jaboticabal - São Paulo https://www.fcav.unesp.br/#!/pos-graduacao/programas-pg/cirurgia-veterinaria/CNPJ: 48.031.918/0012-87. p/ p/ p/ p/ DADOS CURRICULARES DO AUTOR YURI DA SILVA BONACIN – nascido em Santa Rosa de Viterbo /SP, em 1º de setembro de 1989, filho de Alvaro Antonio Bonacin e Carla Maria da Silva Bonacin. Ingressou no curso de Medicina Veterinária em 2008, pela Universidade Federal do Paraná, campus Palotina, recebendo o título de Médico Veterinário em 2012. Concluiu o Programa de Aprimoramento Profissional em Medicina Veterinária e Saúde Pública, na área de Clínica Cirúrgica e Anestesiologia de Grandes Animais, junto ao Hospital Veterinário "Governador Laudo Natel", com início em fevereiro de 2013 até fevereiro de 2015. Mestre em Cirurgia Veterinária (2015 - 2017) pelo Programa de Pós- Graduação em Cirurgia Veterinária da Faculdade de Ciência Agrárias e Veterinárias (FCAV) da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Unesp), bolsista CAPES, sob orientação do Prof. Dr. José Antonio Marques e coorientação do Prof. Dr. Sérgio Britto Garcia. “A ciência consiste em substituir o saber que parecia seguro por uma teoria, ou seja, por algo problemático” (José Ortega y Gasset) A Deus Aos Meus pais Carla e Alvaro e minha irmã Nabila AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus que iluminou meu caminho durante esta jornada e tornou a realização deste sonho possível. À minha mãe Carla e meu pai Alvaro, pelo dom da vida, amor incondicional, bem como pelos conselhos e total apoio em todas minhas escolhas pessoais e profissionais. Sem vocês nada disto seria possível. À minha irmã Nabila pelo amor fraterno e longas conversas sobre o futuro. À Samara, a qual me acompanhou por um longo período da minha vida, me apoiando e contribuindo de forma imprescindível para que me tornasse uma pessoa melhor e conseguisse lidar com todos os intemperes. Ao meu orientador e amigo, Prof. Dr. José Antonio Marques, por todos os ensinamentos, apoio, conselhos, amizade, paciência e pela oportunidade que me foi dada no ano de 2012, sem a qual não seria possível o caminho até aqui. Agradeço pela confiança em ceder sua sala para que eu pudesse continuar, mesmo que de forma modesta, o seu trabalho como docente e iniciar minha carreira. Ao meu coorientador Prof. Dr. Paulo Aléscio Canola, o qual considero um grande amigo. Agradeço por todo incentivo, pelas longas e produtivas conversas e grande auxílio na confecção deste trabalho. Não poderia deixar de agradecer as oportunidades e confiança em mim depositadas dentro da Universidade, sem as quais eu não seria metade do profissional que hoje sou. Muito obrigado. Aos amigos André Santana e Daniela Silva, por toda a disponibilidade e empenho nas análises das amostras lácteas realizadas durante o experimento, bem como por toda contribuição teórica. Sem a ajuda de vocês este trabalho não seria realidade. Ao Prof. Dr. José Jurandir Fagliari por ceder o laboratório, aparelhos e técnicos para análise das amostras lácteas. Aos amigos Victor Santos e Marjury Maronezi por toda a paciência, companheirismo e perseverança na obtenção das imagens e dados da elastografia. Vocês foram essências para a qualidade deste trabalho. Ao Prof. Dr. Marcus Feliciano, o qual disponibilizou seus orientados, tempo, bem como equipamento para a realização da elastografia. Obrigado pela confiança. À Roselia, Michele e Bia, as quais foram de grande auxílio durante a realização da fase prática deste trabalho, dispensando excelentes cuidados com os animais, além do companheirismo e amizade, este trabalho tem um pouco de vocês. À Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Unesp, Jaboticabal por ter me acolhido e contribuído para minha formação profissional, bem como a todos os colegas do Departamento de Clinica e Cirurgia Veterinária. A direção do Hospital Veterinário Governador Laudo Natel e funcionários do Setor de Grandes Animais por ceder alimentação e estadia aos animais, contribuindo para o bem-estar de todos. Ao Centro Universitário Moura Lacerda por ceder os animais utilizados e disponibilizar o laboratório para realização das análises microbiológicas, através do intermédio da Prof. Dra. Naiá Lago e sua orientada Ana Carolina. A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, o meu muito obrigado. O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de financiamento 001. i SUMÁRIO Página CERTIFICADO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS ........................... iii RESUMO.................................................................................................................... iv ABSTRACT ................................................................................................................ vi CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS .............................................................. 1 1. Introdução ............................................................................................................ 1 2. Revisão de Literatura ........................................................................................... 2 2.1 Anatomia ......................................................................................................... 3 2.2 Etiologia das mastites ..................................................................................... 6 2.3 Qualidade do leite e contagem de células somáticas ..................................... 8 2.4 Proteinograma .............................................................................................. 11 2.5 Elastografia ARFI .......................................................................................... 14 3. Objetivo Geral .................................................................................................... 16 3.1 Objetivos específicos .................................................................................... 16 4. Referências ........................................................................................................ 16 CAPÍTULO 2 – Análise da composição láctea e avaliação por técnicas de imagem da glândula mamária de ovelhas. Parte 1: A presença de lesões fibrosas no parênquima pode alterar a resposta de proteínas de fase aguda na mastite subclínica?1 ........... 31 Resumo.................................................................................................................. 31 1. Introdução .......................................................................................................... 32 2. Material e Métodos ............................................................................................ 36 2.1 Animais ......................................................................................................... 36 2.2 Colheita de amostras lácteas ........................................................................ 37 2.3 Contagem de células somáticas ................................................................... 38 2.4 Proteína total e fracionamento eletroforético por gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) ................................................................ 39 2.5 Análise Estatística......................................................................................... 40 3. Resultados ......................................................................................................... 41 3.1 Contagem de células somáticas ................................................................... 41 3.2 Proteína total e Fracionamento eletroforético (SDS-PAGE) ......................... 42 4. Discussão ....................................................................................................... 46 5. Conclusão ....................................................................................................... 54 ii 6. Referências ..................................................................................................... 54 CAPÍTULO 3 – Análise da composição láctea e avaliação por técnicas de imagem da glândula mamária de ovelhas. Parte 2: A elastografia ARFI da glândula mamária e linfonodo supramamário pode ser utilizada como ferramenta auxiliar ao diagnóstico de mastite subclínica em fêmeas ovinas naturalmente infectadas?1 ............................. 65 Resumo.................................................................................................................. 65 1. Introdução .......................................................................................................... 67 2. Material e Métodos ............................................................................................ 70 2.1 Animais ......................................................................................................... 70 2.2 Colheita de amostras lácteas ........................................................................ 70 2.3 Contagem de células somáticas ................................................................... 71 2.4 Ultrassonografia modo B de lesões fibrosas e parênquima mamário ........... 71 2.5 Elastografia ARFI de lesões fibrosas e parênquima mamário ...................... 72 2.6 Ultrassonografia modo B dos linfonodos supramamários ............................. 72 2.7 Elastrografia ARFI dos linfonodos supra-mamários ...................................... 73 2.8 Análise estatística ......................................................................................... 73 3. Resultados ......................................................................................................... 73 4. Discussão .......................................................................................................... 78 5. Conclusão .......................................................................................................... 82 6. Bibliografia ......................................................................................................... 83 iii CERTIFICADO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS iv ASPECTOS CLÍNICO-LABORATORIAIS E SONOGRÁFICOS NO DIAGNÓSTICO COMPLEMENTAR DE LESÕES FIBRÓTICAS EM PARÊNQUIMA MAMÁRIO DE FÊMEAS OVINAS RESUMO – O presente estudo avaliou 27 fêmeas ovinas e suas glândulas mamárias, no 60º dia de lactação. Os objetivos foram a detecção de alterações nas concentrações das proteínas do soro lácteo, contagem de células somáticas frente à mastite crônica e subclínica de ocorrência natural, bem como o possível uso da elastografia por impulso de força de radiação acústica (ARFI) como diagnóstico de mastite em glândulas com parênquima fibrosado. Os grupos experimentais foram divididos de acordo com a CCS em: GC com CCS < 500.000 cls/ml sem fibrose em parênquima; Baixa contagem de células somáticas (CB) com CCS < 500.000 cls/ml e presença de fibrose na glândula; CA com CCS > 500.000 cls/ml e presença de fibrose. Para a análise das proteínas e CCS, foram utilizadas 48 amostras de soro lácteo. A CCS obtida nos três grupos apresentou valores médios de 136,63 x 103 ± 98,09 cls/ml, 122,06 x 103 ± 94,83 cel/ml e 3.979,55 x 103 ± 2943,81 cls/ml. Através do método SDS-PAGE, foi possível identificar seis proteínas: Lactoferrina, Albumina Sérica, IgG Pesada, IgG Leve, β-lactoglobulina e α-lactoalbumina. Através da comparação entre grupos, notou-se aumento da Lactoferrina entre GC e CA, aumento da albumina sérica entre CB e CA e aumento da IgG de cadeia pesada entre GC e CA, bem como entre CB e CA. Acredita-se que o valor limite de CCS em 500.000 cls/ml seja seguro para a detecção de mastites subclínicas. O aumento da albumina sérica e IgG de cadeia pesada em animais que possuem lesões no parênquima e CCS alta, quando comparados aos demais grupos pode indicar a presença de mastite. Não houve diferenças na composição proteica avaliada que diferenciasse glândulas sadias de fibrosas, dentro da mesma faixa de CCS. Cabe ressaltar que há a necessidade de estudos avaliando outros componentes lácteos, bem como compará-los ao grau de fibrose da glândula. O parênquima mamário e linfonodos também foram submetidos à ultrassonografia em modo-B, com posterior elastografia ARFI, obtendo-se variáveis qualitativas (ecogenicidade e ecotextura) e quantitativas (velocidade de cisalhamento, profundidade e proporção eixo curto/longo) de 52 glândulas mamárias. Através da elastografia ARFI em áreas sadias da glândula nos grupos, foi possível observar aumento da velocidade de cisalhamento (p<0,05) no grupo CB quando comparado ao grupo GC, o que ocorreu também quando comparados CB e CA. Quando comparadas as áreas de fibrose nos grupos CB e CA, com suas respectivas áreas normais, a velocidade aumentou nos dois grupos: CB (p<0,05; t= 4,07) e CA (p<0,05; t= 6,92). Ao comparar as áreas de fibrose em CB e CA com o parênquima de GC, houve aumento em CB (p<0,05; t=4,95) e CA (p<0,05; t=5,49). Ao avaliar o linfonodo supramamário de cada glândula, a velocidade de cisalhamento aumentou quando comparados os grupos GC e CA (p<0,05, T=2,11), apresentando-se maior no último. Os resultados da ultrassonografia em modo-B apontam predomínio da ecogenicidade hipoecóica nos linfonodos, bem como redução da proporção do eixo curto/longo em casos de mastite subclínica ativa. A eslatografia ARFI pode indicar pontos de corte para que haja diferenciação de um processo de mastite ativa de mastites que já se curaram, seu uso é excelente ferramenta para diferenciação das áreas normais de v áreas fibrosadas em parênquima. A avaliação nos linfonodos supramamários, com altas velocidades de cisalhamento, podem indicar mastites, porém o comportamento no parênquima mamário é diferente, produzindo maiores valores em mastites já crônicas, necessitando de estudo com mais animais e mastites induzidas artificialmente, para padronização de valores de corte. Palavras-chave: Fibrose, Leite, Modo-B, Proteinograma, Proteoma, Ultrassom vi CLINICAL-LABORATORY AND SONOGRAPHIC ASPECTS IN THE COMPLEMENTARY DIAGNOSIS OF FIBROTIC LESIONS IN THE BREAST PARENCHY OF EWES ABSTRACT – The present study evaluated 27 ewes and their mammary glands, on the 60th lactation day. The aims were the detection in whey proteins, somatic cell count against chronic and subclinical mastitis, as well as the possible use of ARFI elastography as a diagnosis tool of mastitis in glands with fibrous parenchyma. The experimental groups were divided according to the SCC into: GC with SCC<500,000 cls/ml without parenchyma fibrosis; CB with SCC <500, cls/ml and presence of fibrosis; CA with CCS> 500,000 cls/ml and fibrosis. For proteins and SCC, 48 samples of milk serum were used. The SCC obtained in the three groups showed mean values of 136.63 x 103 ± 98.09 cell / ml, 122.06 x 103 ± 94.83 cell / ml and 3,979.55 x 103 ± 2943.81 cls/ml. Through the SDS-PAGE method, it was possible to identify six proteins: Lactoferrin, Serum Albumin, Heavy IgG, Light IgG, β-lactoglobulin, and α- lactoalbumin. According to the group's analysis, there was an increase in lactoferrin between GC and CA, an increase in serum albumin between CB and CA, and an increase in heavy IgG between GC and CA, as well as between CB and CA. The CCS high limit value of 500,000 cls/ml is believed to be safe for the detection of subclinical mastitis. The increase in serum albumin and heavy IgG in animals with lesions in the parenchyma and high CCS, when compared to the other groups, may indicate the presence of active mastitis. There were no differences in the protein composition evaluated that differentiated healthy and fibrous glands, using the same CCS range. Major studies evaluating other whey components, as well as comparing them to the degree of gland fibrosis are needed. The mammary parenchyma and supramammary lymph node were also submitted to B-mode ultrasonography, with subsequent ARFI elastography, obtaining qualitative (echogenicity and echotexture) and quantitative (shear speed, depth and short/long axis ratio) variables from 52 mammary glands. Through ARFI elastography in healthy areas of the gland in the groups, it was possible to observe an increase in shear velocity (p <0.05) in CB group when compared to the GC group, which also occurred when comparing CB and CA. When comparing the fibrous areas in the CB and CA groups, with their respective normal areas, the speed increased in the two groups: CB (p <0.05; t = 4.07) and CA (p <0.05; t = 6.92). When comparing the areas of fibrosis in CB and CA with the parenchyma of GC, there was an increase in CB (p <0.05; t = 4.95) and CA (p <0.05; t = 5.49). When assessing the supramammary lymph node of each gland, the shear velocity increased when the groups GC and CA were compared (p <0.05, T = 2.11), being higher in the last one. The results of B-mode ultrasonography indicate a predominance of hypoechoic echogenicity in nodes, as well as a reduction in the proportion of the short/long axis in cases of active subclinical mastitis. ARFI elastography can indicate cut off points for differentiating an active mastitis process from mastitis that has already healed, its use is an excellent tool for differentiating normal areas from fibrous areas in the parenchyma. The evaluation in the supramammary lymph nodes, with high shear speeds, may indicate active mastitis, but the behavior in the mammary parenchyma is different, producing higher values in already chronic mastitis, Further studies are needed using more animals and artificially induced mastitis, for standardization cut off values. vii Keywords: Fibrosis, Milk, B-mode, Proteinogram, Proteoma, Ultrassound 1 CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 1. Introdução A inflamação da glândula mamária, precedida ou não por processo infeccioso, é descrita como mastite, a qual é uma das mais importantes doenças em rebanhos leiteiros, podendo causar mortalidade e redução na produção leiteira, além de descarte antecipado dos animais (Bergonier e Berthelot, 2003). Quando quantificada a produção mundial de leite em todas as espécies animais, os ovinos contribuem com apenas 1,26% do montante final (FAO, 2018), porém é uma área em expansão no Brasil, o qual produziu 1.652.000 litros de leite em 2017, onde 60% é oriundo da agricultura familiar (IBGE, 2017). Em geral, o leite ovino é destinado à fabricação de queijos finos, com alto valor agregado (Manca et al., 2016), além de desempenhar importante papel na subsistência de comunidades carentes e países subdesenvolvidos (Wodajo et al., 2020). De forma majoritária, as mastites são de origem infecciosa, onde frequentemente é possível isolar bactérias do gênero Staphylococcus spp., promovendo mastites clínicas (Contreras et al., 2007; Arsenault et al., 2008), além de bactérias do gênero Streptococcus e outras menos incidentes, causando mastites subclínicas (Bergonier et al., 2003; Gonzalo et al., 2004; Contreras et al., 2007). Para o diagnóstico da mastite subclínica, utiliza-se a Contagem de Células Somáticas do leite (Gonzalo et al., 2010) e o California Mastits Test (Clements; Taylor; Fitzpatrick, 2003). Porém, o padrão ouro é resumido à cultura bacteriana das amostras lácteas (Fthenakis, 2004; Contreras et al., 2007; Fragkou; Boscos; Gonzalo et al., 2010; Fthenakis, 2014). Ademais, outras técnicas podem ser utilizadas no intuito de identificar componentes do leite, os quais possam determinar a ocorrência de um processo infeccioso ativo, tal como a identificação de proteínas inflamatórias em sangue e soro lácteo, dentre elas a técnica de fracionamento eletroforético em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) (Gordon, 1985), a qual possui eficiência comprovada em medicina veterinária (Hogarth et al., 2004; Alonso- Fauste et al., 2011; Santana et al., 2018). Outros métodos de detecção em tempo real do processo inflamatório da glândula mamária, tal como a ultrassonografia em modo- 2 B, podem ser utilizados e também possuem eficácia comprovada, ao diferenciar mastites em ovelhas (Hussein, El-Khabaz, Malek, 2015; Barbagianni et al., 2016). Além do parênquima mamário, os linfonodos supramamários são importante local a ser escaneado e segundo Bradley e colaboradores (2001), são representativos de processo inflamatório, quando apresentam linfadenomegalia. Hodiernamente, houve o aperfeiçoamento de técnicas ultrassonográficas, sendo possível, através de software e aparelho específico, a mensuração de forma qualitativa e quantitativa, da força de cisalhamento do impulso sônico, técnica descrita como elastografia por Força de Impulso de Radiação Acústica (ARFI) (Nightingale, 2011). Esta técnica é utilizada na medicina humana, para diferenciação em tempo real de tumores mamário malignos de benignos (Zhou et al., 2016), bem como para o mesmo propósito, em medicina veterinária (Feliciano et al., 2017). De acordo com a literatura consultada (Bergonier, Berthelot, 2003; Radaelli et al., 2011), as mastites podem causar perdas quantitativas e qualitativa na produção leiteira, através da substituição do parênquima normal, por tecido fibroso, diminuindo assim a capacidade produtiva, porém não existem estudos comparando a qualidade do leite em ovinos portadores crônicos. No intuito de diagnosticar mastites crônicas em glândulas mamárias de fêmeas ovinas, bem como diferenciar este processo em animais que ainda apresentam processo inflamatório ativo, o proteoma de soro lácteo de glândulas com alta contagem de CCS e fibrose, comparado a glândulas com baixa CCS, pode prover importantes informações quanto à qualidade do leite. Auxiliar ao proteinograma, a elastografia ARFI, pode compor uma importante ferramenta diagnóstica auxiliar, em tempo real, no intuito de diferenciar processos crônicos ainda ativos, podendo auxiliar no acompanhamento de tratamentos e manutenção de animais no rebanho, evitando o descarte precoce. 16 4. Referências ADAM, Z. A.; RAGAB, G. A.; AWAAD, A. S.; TAWFIEK, M. G.; MAKSOUD, M. K. M. Abdel. Anatomical and radiographical studies on the arterial supply of the udder in goat and their. Beni-Suef University Journal of Basic and Applied Sciences, v. 5, n. 3, p. 291–298, 2016. DOI: 10.1016/j.bjbas.2016.08.001. AKERS, E. M. A 100-Year Review: Mammary development and lactation. Journal of Dairy Science, v.100, n.12, p.10332-10352, 2017. doi: 10.3168/jds.2017-12983 17 ALBA, D. F.; ROSA, G.; HANAUER, D.; SALDANHA, T. F.; SOUZA, C. F.; BALDISSERA, M. D.; SANTOS, D. S.; PIOVEZAN, A. P.; GIRARDINI, L. K.; SILVA. A. S. 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