VINÍCIUS DIAS KÜMPEL ENVOLVIMENTO DE RECEPTORES 5-HT1A NO HIPOCAMPO VENTRAL NA REGULAÇÃO DE COMPORTAMENTOS DEFENSIVOS RELACIONADOS COM A ANSIEDADE GENERALIZADA E COM O PÂNICO ASSIS 2016 VINÍCIUS DIAS KÜMPEL ENVOLVIMENTO DE RECEPTORES 5-HT1A NO HIPOCAMPO VENTRAL NA REGULAÇÃO DE COMPORTAMENTOS DEFENSIVOS RELACIONADOS COM A ANSIEDADE GENERALIZADA E COM O PÂNICO Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências e Letras de Assis – UNESP – Universidade Estadual Paulista para a obtenção do título de Mestre em Biociências (Área de Conhecimento: Caracterização da Diversidade Biológica) Orientadora: Profa. Dra. Telma Gonçalves Carneiro Spera de Andrade ASSIS 2016 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca da F.C.L. – Assis – Unesp K96e Kümpel, Vinícius Dias Envolvimento de receptores 5-HT1A no hipocampo ventral na regulação de comportamentos defensivos relacionados com a ansiedade generalizada e com o pânico / Vinícius Dias Kümpel. Assis, 2016. 99 f. : il. Dissertação de Mestrado – Faculdade de Ciências e Letras de Assis – Universidade Estadual Paulista. Orientadora: Profa. Dra. Telma G. C. Spera de Andrade 1. Hipocampo (Cérebro). 2. Labirinto em T Elevado. 3. Midazolam. 4. 8-Hidroxi-2-(di-n-propilamino)tetralina. 5. Transtornos da ansiedade. 6. Síndrome do pânico. I. Título. CDD 616.8522 Agradecimentos Em primeiro lugar ao meu Deus, companheiro e auxiliador, maior responsável por minha existência, saúde e sucesso. Aos meus pais, mais que qualquer outra pessoa, pela educação e incentivos pessoais e materiais. Por representarem com excelência papel fundamental em todos os momentos da minha vida. À minha orientadora e grande amiga Profª Dr.ª Telma, pelas palavras e ações de orientação, instrução, apoio, aconselhamento, ânimo e reconhecimento, dentro e fora do ambiente universitário, sem as quais não seria possível conquistar a atual etapa de minha formação acadêmica. Ao Dr. Hélio Zangrossi Jr, pela parceria nesta linha de pesquisa. Aos meus colegas pesquisadores, Matheus, Amaryllis e Sérgio, amigos valorosos que somaram esforços para a realização desta pesquisa. Aos demais amigos do Laboratório de Fisiologia, companheiros, auxiliadores e torcedores, sua amizade realmente é uma das minhas maiores gratificações. Aos meus amigos também de fora do ambiente acadêmico, que mesmo sem compreender direito o que faço nesta área de atuação, me consideram muito inteligente, demonstrando toda sua gentiliza. Suas amizades e companheirismo são para mim de valor imensurável. Aos pesquisadores membros da banca de avaliação, por aceitarem o convite, tornando este momento ainda mais caro e significativo. Muito obrigado! “Cast all your anxiety on God, because he cares for you” Holy Bible, 1 Peter 5:7 (New International Version) KÜMPEL, Vinícius Dias. Envolvimento de receptores 5-HT1A no hipocampo ventral na regulação de comportamentos defensivos relacionados com a ansiedade generalizada e com o pânico. 2016. 99 f. Dissertação (Mestrado em Biociências). – Faculdade de Ciências e Letras, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Assis, 2016. RESUMO Ainda pouco se conhece a respeito da atividade serotonérgica sobre receptores 5- HT1A no hipocampo ventral na regulação de diferentes tipos de ansiedade. O Labirinto em T elevado (LTE) é um teste que avalia separadamente dois subtipos de ansiedade: a ansiedade generalizada e o pânico, respectivamente através da avaliação dos comportamentos defensivos de esquivas inibitórias e das fugas. Assim, este estudo teve por objetivo investigar o envolvimento de receptores 5-HT1A no HV sobre a manifestação dos transtornos de ansiedade generalizada (TAG) e pânico (TP) no LTE, tendo como parâmetro a ativação de receptores gabaérgicos (GABAA) nessa área do hipocampo. Foram conduzidos dois experimentos em ratos Wistar: o Experimento 1, visando avaliar o efeito do midazolam (10, 20 ou 40nmol) - um benzodiazepínico que potencializa a ação do GABA em receptores GABAA; e o Experimento 2, para avaliar o efeito de 8-OH-DPAT (0,6, 3 ou 15nmol) – um agonista de receptores 5-HT1A. Animais dos grupos controles nos dois experimentos foram tratados com salina. Dez minutos após as microinjeções foram submetidos ao LTE para avaliação das latências (em segundos) para esquivas e fugas. Imediatamente após, os animais foram colocados no centro da arena para avaliação da atividade motora (número de quadrados percorridos). Os resultados apontaram que a maior dose de midazolam microinjetada no hipocampo ventral causou ansiólise, comprovada pela diminuição na latência das esquivas em relação aos animais controles e àqueles tratados com 10nmol do mesmo fármaco. Resultado semelhante foi constatado nas três doses de 8-OH-DPAT. Não se observou qualquer alteração nas fugas, e nem na atividade motora dos animais tratados com qualquer um dos fármacos testados. Essas evidências comportamentais indicam que a ativação de receptores 5-HT1A no HV diminuiu o comportamento de esquiva dos animais, sem afetar as respostas de fugas, semelhantemente ao que se observou em decorrência da ação do midazolam sobre receptores GABAA. Esses resultados indicam um envolvimento desses receptores na regulação do TAG, mas não do TP. Palavras-chave: Hipocampo Ventral. Labirinto em T Elevado. Midazolam. 8-OH- DPAT. Transtorno de Ansiedade Generalizada. Transtorno do Pânico. GABAA. 5- HT1A. KÜMPEL, Vinícius Dias. Involvement of the 5-HT1A receptors in ventral hippocampus on anxiety- and panic- related defensive behaviors. 2016. 99 f. Dissertation (Masters in Bioscience). – Faculdade de Ciências e Letras, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Assis, 2016. ABSTRACT The little is known about the serotoninergic activity on 5-HT1A receptors in the ventral hippocampus in the regulation of different types of anxiety. The Elevated T Maze (ETM) is a test that evaluates separately two subtypes of anxiety: generalized anxiety and panic, respectively by evaluating the defensive behaviors of inhibitory avoidance and escapes. Therefore this study aimed to investigate the involvement of 5-HT1A receptors in VH on the manifestation of generalized anxiety disorder (GAD) and Panic (PD) in ETM, having as parameter the activation of gabaergic receptors (GABAA) in that area of the hippocampus. Two experiments were conducted in rats: Experiment 1, to evaluate the effect of midazolam (10, 20 or 40nmol) – a benzodiazepine that potentiates the action of the GABA on GABAA receptors; and Experiment 2 to evaluate the effect of 8-OH-DPAT (0.6, 3 or 15nmol) - an agonist of 5-HT1A receptors. Animal control groups in both experiments were treated with saline. Ten minutes after microinjection, the animals were submitted for evaluation to the ETM latencies (in seconds) for avoidances and escapes. Immediately after, the animals were placed in the center of the arena to eavaluation of motor activity (number of covered squares). The results showed that the highest dose of midazolam microinjected in the ventral hippocampus caused anxiolysis, evidenced by the decrease in latency of avoidances compared to controls and those treated animals 10nmol of the same drug. A similar result was observed at all three doses of 8-OH-DPAT. There was no change in the escapes, nor the motor activity of animals treated with any of the drugs tested. These behavioral evidence indicates that activation of 5-HT1A receptors in VH decreases the behavior of avoidance of the animals without affecting the escape response, similar to what was observed due to the action of midazolam on the GABAA receptors. These results indicate an involvement of these receptors in the regulation of GAD, but not of PD. Keywords: Ventral Hippocampus, Elevated T Maze, Midazolam, 8-OH-DPAT, Generalized Anxiety Disorder, Panic Disorder, GABAA, 5-HT1A. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ABL: Amígdala baso-lateral Ami: Amígdala ANOVA: Análise de variância BNDF: Brain-derived neurotropphic factor, ou fator neurotrófico derivado do cérebro CA: Cornus Ammonus cAMP: Adenilato monofosfato cíclico CAPES: Coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior CC: Condicionamento contextual CE: Teste claro-escuro CEUA: Comissão de ética no uso de animais CPF: Córtex pré-frontal CPFm: Córtex pré-frontal medial CRF: Fator de liberação de corticotropina DA: Ratos Dark Agouti EAC: Teste de estímulo aversivo de choque EP: Teste de esquiva passiva ETM: Elevated T maze GABA: Ácido gama-aminobutírico GAD: Generalized anxiety disorder GD: Giro denteado HD: Hipocampo dorsal HM: Hipotálamo medial HV: Hipocampo ventral IAF: Inibidor de acetilcolinesterase fisostigmina IS: Teste de interação social LCE: Labirinto em cruz elevado LE: Ratos Long Evans LH: Ratos Lister Hooded LTE: Labirinto em T elevado MCPD: Matéria cinzenta periaquedutal dorsal MK-212: 6-chloro-2(1-piperazinyl)pyrazine NDR: Núcleo dorsal da rafe NLET: Núcleo leito da estria terminal NMDA: N-methyl-D-aspartate NMR: Núcleo mediano da rafe PD: Panic disorder PVPI: Polivinilpirrolidona-iodo, 1% SD: Rato Spragle-Dawley S-Hip: Sistema septo-hipocampal SNC: Sistema nervoso central SW: Camundongos Swiss-Webster TAG: Transtorno de ansiedade generalizada TERSC: Teste de enterramento em reação à sonda de choque TFMPP: Trifluoromethyl-phenylpiperazine TP: Transtorno do pânico VH: Ventral hippocampus VU: Teste de vocalização ultrassônica Way 100635: N-[2-methoxyphenyl]-1-piperazinyl-ethyl]-N-2- pyridinylcyclohexanecarboxamine 5-HT: 5-hidroxitriptamina ou serotonina 5-MeODMT: 5-methoxy-N,N-dimethyltryptamine 8-OH-DPAT: 8-Hydroxy-2-(di-n-propylamino) tetralin hydrobromide SUMÁRIO INTRODUÇÃO ...........................................................................................................13 REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 26 RESEARCH REPORT............................................................................................... 39 RESUMO .................................................................................................................. 40 ABSTRACT ............................................................................................................... 41 1. Introdução ............................................................................................................. 42 2. Métodos ................................................................................................................ 45 2.1. Animais .................................................................................................... 46 2.2. Equipamentos ......................................................................................... 46 2.2.1. Labirinto em T Elevado (LTE) ......................................................... 46 2.2.2. Arena .............................................................................................. 47 2.2.3. Caixa de transporte individual ......................................................... 47 2.2.4. Cânulas-guia e agulhas para microinjeção ..................................... 47 2.3. Drogas ..................................................................................................... 48 2.3.1. Midazolam ..................................................................................... 48 2.3.2. 8-OH-DPAT ................................................................................... 48 2.4. Procedimentos ......................................................................................... 48 2.4.1. Cirurgia estereotáxica .................................................................... 48 2.4.2. Habituação dos animais ao pesquisador ....................................... 49 2.4.3. Exposição prévia ao braço aberto do LTE (confinamento prévio) .. 49 2.4.4. Microinjeção de drogas no hipocampo ventral ............................... 50 2.5. Testes comportamentais ......................................................................... 50 2.5.1. Avaliação no LTE ........................................................................... 51 2.5.2. Avaliação na arena ........................................................................ 51 2.6. Perfusão e identificação dos sítios de microinjeção ................................. 51 2.7. Análise dos dados .................................................................................... 52 3. Resultados ............................................................................................................ 53 3.1. Experimento 1 – Análise do efeito do midazolam microinjetado no HV ... 54 3.2. Experimento 2 – Análise do efeito do 8-OH-DPAT microinjetado no HV . 57 4. Discussão .............................................................................................................. 60 5. Conclusões ........................................................................................................... 68 6. Agradecimentos ................................................................................................... 68 7. Referências .......................................................................................................... 68 8. Anexo I ................................................................................................................. 83 9. Anexo II ................................................................................................................ 97 13 1. INTRODUÇÃO Diante da marcante explosão tecnológica a necessidade de agilidade e de alto desempenho implicam em grande competitividade e aumentam a pressão psicológica sobre os indivíduos. Como consequência, os transtornos psiquiátricos, que afligem aproximadamente 450 milhões de pessoas mundialmente (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2001), passam a ter destaque, causando grande preocupação no que tange à promoção da saúde. Dentre eles, a ansiedade merece destaque, pois além de afetar a qualidade de vida dos indivíduos no seu cotidiano, também os predispõe à manifestação da depressão e de outras afecções orgânicas. A prevalência de ansiedade alcança 31,2% da população geral, considerando todo o período de vida das pessoas, mas principalmente entre 30 e 44 anos, quando chega a 37% (NATIONAL COMORBITY SURVEY REPLICATION – NCR-S, 2007). Ademais, os transtornos relacionados à ansiedade afetam mais mulheres que homens (ANGST; DOBLER-MIKOLA, 1985; BRUCE et al., 2005; DONNER; LOWRY, 2013; REGIER; NARROW; ERA, 1990). Sabe-se que a ansiedade é imprescindível para a sobrevivência (GRAEFF, 2012, 2014). No entanto, a ansiedade patológica, prejudica o desempenho e afeta a qualidade de vida, culminando no elevado consumo de drogas ansiolíticas. A ansiedade pode ser compreendida como um estado emocional que envolve subjetividade, dificultando sua compreensão teórica. Segundo Graeff (2012, 2014), é uma emoção que apresenta similaridades com o medo. Entretanto, este está mais atrelado a ameaças reais, enquanto que a ansiedade, a sinalizadores potenciais do perigo. Para Robert e Caroline Blanchard (1988), a ansiedade está intimamente ligada à capacidade de avaliação dos riscos diante de situações em que o perigo é incerto, seja por trazer à tona estímulos do perigo vivenciados alguma vez no passado ou por um contexto novo. Para o seu desencadeamento, é necessário um impulso que se aproxima do estímulo do perigo, gerando um conflito de aproximação e evasão (ZANGROSSI; GRAEFF, 2012). Assim, a ansiedade é considerada patológica quando é desproporcional à situação que a desencadeia, ou quando não existe um motivo específico ou real para o seu aparecimento, ou ainda, quando se trata de uma resposta inadequada à determinada ameaça, em virtude de sua intensidade ou duração (CORREIA; LINHARES, 2007). 14 Dentre os vários subtipos descritos de ansiedade (AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION - DSM-V, 2013), de particular interesse no presente estudo são os transtornos de ansiedade generalizada (TAG) e do pânico (TP). O TAG é caracterizado por preocupação e tensão contínuas sobre eventos cotidianos, de maneira incontrolável e com longa duração, tendo sua incidência e intensidade ocorrendo desproporcionalmente à probabilidade atual ou ao impacto da experiência. É frequentemente acompanhada por sintomas psíquicos como irritabilidade, déficit de atenção e concentração, ou somáticos como fadiga, tensão muscular e sono debilitado, o que torna difícil um diagnóstico preciso (BERGER et al., 2011; HETEM, 2012; KESSLER; KELLER; WITTCHEN, 2001; SANDERSON; BARLOW, 1990; WITTCHEN, 2002). Por outro lado, o TP caracteriza-se pela recorrência de ataques inesperados de pânico, nos quais o indivíduo se sente persistentemente preocupado, podendo ou não ser acompanhado de agorafobia, que é a ansiedade ou esquiva a locais ou situações em que poderia ser difícil ou embaraçoso escapar, ou para as quais pode não estar disponível um auxílio, no caso de ter um ataque de pânico. É caracterizado na ocorrência de ao menos quatro dentre os seguintes sintomas: taquicardia, sudorese, tremores, sensação de sufocamento, dores no peito, náuseas, tontura, calafrios, formigamentos ou coceiras na pele, medo de “perder o controle” e medo de morrer (adaptado de: AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION’S - DSM- V, 2013). Os ataques costumam ser repetidos, intensos, com repentina ativação do sistema nervoso simpático, provocando sudorese, taquicardia e tremores (DEL-BEM; UCHIDA, 2012). Dentre as várias abordagens de estudo sobre a ansiedade, a neurobiologia, um campo da neurociência, procura conhecer quais substratos neurais estão envolvidos na gênese desses transtornos, obviamente visando a proposição de medidas profiláticas e terapêuticas eficazes, já que a ansiedade ainda se constitui em grande desafio para a humanidade, conforme já mencionado. Em 1991, Deakin e Graeff propuseram uma hipótese na qual sugeriram que o sistema nervoso central possui mais de um mecanismo de controle sobre a ansiedade, e que estes são diferentemente modulados pela neurotransmissão serotonérgica. De acordo com esses autores, a via prosencefálica que se origina no Núcleo Dorsal da Rafe (NDR) e se projeta para a amígdala, córtex frontal e hipocampo ventral, facilitaria os comportamentos defensivos expressos em resposta aos perigos potencial ou distal, por exemplo, a esquiva inibitória. Por outro lado, a via NDR-periventricular, com 15 projeções para a Matéria Cinzenta Periaquedutal Dorsal (MCPD), inibiria reações de fuga e luta em resposta ao perigo proximal. A Figura 1 ilustra essa hipótese. Outros autores também descreveram que a liberação de serotonina (5-HT) no hipocampo é proveniente dos núcleos da rafe (SCHIMITZ et al., 1998; SEGAL, 1990). O mau funcionamento dos sistemas serotonérgicos nessas vias levaria a distúrbios específicos de ansiedade. Assim, a disfunção da via NDR/amígdala/córtex/hipocampo ventral ocasionaria a manifestação do TAG e a disfunção da via NDR/MCPD ocasionaria a manifestação do TP. Subtipos celulares em regiões distintas do NDR seriam as responsáveis por essa dupla atuação (HALE; SHEKHAR; LOWRY, 2012; PAUL; LOWRY, 2013; SPIACCI, 2012; ZANGROSSI; GRAEFF, 2014). De acordo com Spiacci (2012), corroborando estudos anteriores e evidenciando novos achados (GRAHN et al., 1999; PAUL et al., 2011; STAUB; EVANS; LOWRY, 2006), neurônios serotonérgicos nos subnúcleos caudal, dorsal e interfascicular do NDR estariam envolvidos com comportamentos relacionados à ansiedade, enquanto que células não serotonérgicas das asas laterais do NDR e da região ventro-lateral da MCPD estariam ligadas a comportamentos de pânico, já que esta região é a principal fonte de projeção serotonérgica inibitória a estruturas relacionadas ao pânico (HALE; SHEKHAR; LOWRY, 2012), e neurônios do subnúcleo dorsomedial do NDR participaria da regulação de comportamentos defensivos relacionados a ambos os transtornos (SPIACCI et al., 2015). 16 Figura 1: Hipótese proposta por Deakin e Graeff (1991) ressaltando as duas vias de controle do Sistema Nervoso Central sobre a ansiedade (adaptado de BRANDÃO; GRAEFF, 2014). TAG: transtorno de ansiedade generalizada; CPF: córtex pré-frontal; Ami: amígdala; S-Hip: sistema septo- hipocampal; HM: hipotálamo medial; MCPd: matéria cinzenta periaquedutal dorsal; LTE: labirinto em T elevado; 5-HT: serotonina. Alguns estudos têm buscado testar estas duas possibilidades, no entanto, em grande parte deles os modelos experimentais utilizados não permitem a discriminação entre os dois subtipos de ansiedade. Avaliações realizadas através do Labirinto em T Elevado (LTE) possibilitam esta análise separadamente, pois as esquivas inibitórias e as fugas têm sido associadas, respectivamente, aos comportamentos defensivos relacionados com a ansiedade generalizada e com o pânico (GRAEFF; FERREIRA NETTO; ZANGROSSI, 1998; GRAEFF; VIANA; TOMAZ, 1993; POLTRONIERI; ZANGROSSI; VIANA, 2003; VIANA; TOMAZ; GRAEFF, 1994; ZANGROSSI; GRAEFF, 2014; ZANGROSSI; GRAEFF, 1997). Recentemente, muitas investigações utilizando esse modelo tem sido mais direcionadas à compreensão da via que se projeta para a MCPD (Graeff, 2004). Não 17 obstante existam pesquisas que já demonstraram o papel do Hipocampo Ventral na ansiedade (BALLESTEROS et al., 2014; BANNERMAN et al., 2002, 2003; CHUDASAMA; WRIGHT; MURRAY, 2008; FILE; GONZALEZ, 1996; GRAY; MCNAUGHTON, 2000; NUNES-DE-SOUZA et al., 2002; KJELSTRUP et al., 2002; MCHUGH et al., 2004; PENTKOWSKI et al., 2006; TRENT; MENARD, 2010; TRIVEDI; COOVER, 2004; TU et al., 2014; ZHANG et al., 2014), ainda não foram identificados estudos que tenham utilizado o LTE com o objetivo de avaliar o papel funcional desta sub-região do Hipocampo na manifestação do TAG e do TP. Para uma revisão, efeitos de manipulações experimentais no HV sobre comportamentos de defesa associados à ansiedade são resumidos na Tabela 1. Tabela 1 - Intervenções no Hipocampo Ventral e análise da manifestação da ansiedade em diferentes testes de comportamento animal Intervenção Experimental Teste Espécie/ linhagem Ansiedade Referências Inativação do HV Lesão eletrolítica Cond contextual LTE Odor de gato Presença do gato SD SD SD SD - - - 0 TRIVEDI; COOVER, 2004 TRIVEDI; COOVER, 2004 TRIVEDI; COOVER, 2004 TRIVEDI; COOVER, 2004 Lesão neurotóxica (Ác. Ibotênico) (NMDA) LCE Claro-escuro Interação-social Cond contextual LCE LE LE DA LH LH LE LE - - - - - - - KJELSTRUP et al., 2002; PENTKOWSKI et al., 2006 BANNERMAN et al., 2003; MCHUGH et al., 2004 MCHUGH et al., 2004 PENTKOWSKI et al., 2006 TRENT; MENARD, 2010; NASCIMENTO HÄCKL; CAROBREZ, 2007 IAF LCE SP - DEGROOT; TREIT, 2002 Muscimol Cond contextual LCE Wistar Wistar - - ZHANG et al., 2014 ZHANG et al., 2014 Lidocaína LCE Wistar - BERTOGLIO; JOCA; GUIMARAES, 2006 Tetrotoxina LCE SP - DEGROOT; TREIT, 2004 Tertatolol WAY 100635 LCE LCE LH SW - - FILE; GONZALEZ, 1996 NUNES-DE-SOUZA; CANTO-DE-SOUZA; RODGERS, 2002 Ativação do HV Estimulação Elétrica LCE LE 0 DRINGENBERG; LEVINE; MENARD, 2008 CRF LCE SD + KAGAMIISHI; YAMAMOTO; WATANABE, 2003 + aumento; - diminuição; 0 inalterado LCE (Labirinto em Cruz Elevado); NMDA (N-methyl-D-aspartate); 8-OH-DPAT (8-hydroxy-2-(di-n- propylamino) tetralina); CRF (Fator de Liberação de Corticotropina); IAF (Inibidor de Acetilcolinesterase Fisostigmina); SP (Ratos Sprague-Dawley); LE (Ratos Long Evans); DA (Ratos Dark Agouti); LH (Ratos Lister Hooded), SW (Camundongos Swiss-Webster). 18 Anatomicamente, o hipocampo humano pode ser descrito como uma pequena estrutura alongada e curva, bilateral e situada em profundidade no centro do cérebro, na base do lobo temporal medial, junto a diversas associações nervosas (BRANDÃO et al., 2001). As duas massas hipocampais são conectadas pelas comissuras hipocampais ventral e dorsal, na linha mediana (O’KEEFE; NADEL, 1978). A composição estrutural do hipocampo possui considerável semelhança entre as diversas espécies de mamíferos, desde os mais basais até os mais complexos (WEST, 1990). Em roedores, o hipocampo pode, para fins descritivos, ser dividido em uma porção dorsal, localizada logo posteriormente ao septo, e uma porção ventral, situada na região temporal do cérebro (O’KEEFE; NADEL, 1978). A localização do hipocampo no encéfalo humano está ilustrada na Figura 2 e a localização da mesma estrutura no rato está ilustrada na Figura 3. O hipocampo é subdividido em quatro sub-regiões. Três são denominadas CA1, CA2 e CA3 devido ao seu nome em latim, cornus Ammonus, e são compostas principalmente por corpos celulares de neurônios piramidais. A quarta sub-região é denominada Giro Denteado (ou Giro Dentado, GD). CA3 é adjacente ao GD, enquanto que CA1 é adjacente ao subiculum (FINK, 2007). Neurônios de CA1 do HV tem projeções para o subiculum e córtex entorrinal, estruturas adjacentes ao hipocampo, mas também possuem projeções adicionais para amígdala, nucleus accumbens e córtex pré-frontal medial (ADHIKARI; TOPIWALA; GORDON, 2010 e 2011; CENQUIZCA; SWANSON, 2007; TYE et al., 2011). 19 Figura 2 – Relativa localização do hipocampo no encéfalo humano. É enfatizado um corte transversal mostrando, entre outras estruturas, as sub-regiões do hipocampo CA1 e CA3 (Adaptado de SQUIRE; KANDEL, 2000). Figura 3 – Relativa localização do hipocampo no encéfalo do rato. São enfatizadas as sub-regiões CA1, CA3 e Giro Denteado (GD) (Adaptado de AMARAL; WITTER, 1989). 20 Quanto ao funcionamento dessa estrutura cerebral, já é conhecida a distinção entre as subregiões dorsal e ventral do hipocampo (FANSELOW; DONG, 2010; MOSER; MOSER, 1998). O hipocampo dorsal (HD) possui participação principal na criação e consolidação de memória espacial, mas também na ansiedade (ANDRADE; ZANGROSSI; GRAEFF, 2013), enquanto que o HV participa preferencialmente na modulação de comportamentos de ansiedade (ALVES, et al., 2005; BANNERMAN et al., 2003; BANNERMAN et al., 2004; FANSELOW; DONG, 2010; MCHUGH et al., 2004; MOSER; MOSER, 1998; SAHAY; HEN, 2007; SAMUELS; HEN, 2011; TU et al., 2014; WEEDEN et al., 2015), hipótese corroborada por outros estudos com lesões (KJELSTRUP et at., 2002; MCHUGH et al., 2004; MOSER et al., 1995; MOSER; MOSER; ANDERSEN, 1993). A pesquisa conduzida por Adams, Kusljic e Van Den Buuse (2008) concluiu que a depleção de 5-HT no HV leva à desregulação de comportamentos de ansiedade, sem, contudo, afetar a memória espacial. Ciocchi et al. (2015) encontrou grande quantidade de neurônios em CA1 no HV relacionados à modulação de comportamentos de ansiedade, contra uma quantidade bem menor no HD de neurônios com a mesma atuação. Lesões neurotóxicas no GD no HV provocou ansiólise no LCE e na arena, resultado não apresentado por animais que sofreram lesão semelhante no GD do HD (WEEDEN et al., 2015). Já está bem descrita na literatura a participação, em todo o hipocampo, dos neurotransmissores glutamato e do ácido gama-aminobutírico (GABA) (KNOWLES, 1992; SANDLER; SMITH, 1991; SIRVIO et al., 1996; WALKER; RUIZ; KULLMANN, 2002). Outros sistemas de neurotransmissão também já foram descritos, incluindo a noradrenalina, a partir do locus coeruleus, a acetilcolina, advinda dos núcleos septais e a serotonina (5-hidroxtriptamina ou 5-HT), proveniente dos núcleos da rafe, especialmente do NDR (VERTES; FORTIN; CRANE, 1999; VERTES, 1991; ENGIN; TREIT, 2008; VIZI; KISS, 1998). Os receptores gabaérgicos GABAA são ionotrópicos, ou seja, possuem um poro entre suas subunidades que se abre quando sob ação do neurotransmissor. Uma vez aberto, o canal permite maior influxo de íons cloreto (Cl-), estabelecendo um gradiente eletroquímico, hiperpolarizando o neurônio num efeito tipicamente inibitório (OLSEN; DELOREY, 1999). Entre suas subunidades há um sítio de ligação alostérico para benzodiazepinas, que, uma vez ligadas, causam maior frequência na abertura dos canais de cloro (HANSON; CZAJKOWSKI, 2008; TWYMAN; ROGERS; MACDONALD, 1989). Existe uma ampla distribuição de receptores GABAA e de suas 21 diferentes subunidades no Hipocampo como um todo (LEE; MAGUIRE, 2014; MCEOWN; TREIT, 2013; MCKERNAN; WHITING, 1996; PIRKER et al., 2000; SPERK et al., 1997; YU et al., 2006), sendo que no hipocampo ventral existe uma maior expressão das subunidades α2/β1/γ2 (SARANTIS et al., 2008; SOTIRIOU; PAPATHEODOROPOULOS; ANGELATOU, 2005). Além de propiciar os efeitos inibitórios do GABA endógeno, receptores GABAA medeiam os efeitos ansiolíticos de um grande número de compostos terapêuticos (BORMANN, 2000; MCEOWN; TREIT, 2013). O midazolam, um benzodiazepínico que age sobre os sítios alostéricos para benzodiazepinas desses receptores, tem sido utilizado em estudos experimentais visando a inibição neuronal (GEORGOPOULOS et al., 2008; KOBAYASHI et al., 2005). Acredita-se que os neurotransmissores monoaminérgicos tenham um papel fundamental na fisiopatologia da ansiedade, até porque são sintetizados e liberados em decorrência da exposição a estressores, um dos fatores relacionados com a gênese da ansiedade (SAKURAI-YAMASHITA et al., 1989; VAHABZADEH; FILLENZ, 1994; YOSHIOKA et al., 1995), já que tanto o estresse físico como o psicológico são capazes de provocar o aumento da liberação de serotonina em regiões límbicas, incluindo o hipocampo ventral (KAGAMIISHI; YAMAMOTO; WATANABE, 2003). Sabe-se que a maior densidade de corpos celulares de neurônios serotonérgicos encontra-se nos núcleos da rafe, cujos axônios são direcionados praticamente para todo o cérebro, especialmente para o hipocampo, dentre todas as demais regiões do conhecido sistema límbico. Em todo o sistema serotonérgico há expressão de receptores serotonérgicos, com destaque à alta densidade de receptores da família 5-HT1, especialmente o subtipo 5-HT1A. Estes receptores são metabotrópicos, ou seja, desencadeiam as respostas através de mecanismos intracelulares. Estão ligados à proteína G específica (Gα1/α0) e, ao serem conectados ao 5-HT1, alteram sua conformação estrutural, inibindo a formação de adenilato monofosfato cíclico (cAMP) pela adenilato ciclase. Uma cascata de reações é conduzida de modo a produzir a resposta adequada (BERUMEN et al., 2012). Os receptores 5-HT1A são encontrados tanto pré-sinapticamente nos corpos celulares de neurônios serotonérgicos dos núcleos dorsal e mediano da rafe, quanto pós-sinapticamente, predominantemente em estruturas límbicas como o hipocampo, o septo e a amígdala, mas também no neocórtex e hipotálamo (HAMON, 1997; BARNES; SHARP, 1999). A ativação de receptores 5-HT1A pré-sinápticos resulta na javascript:void(0); 22 inibição do disparo celular e em um consequente declínio da neurotransmissão serotonérgica nas áreas de projeção (HJORTH; MAGNUSSON, 1988; SHARP; HJORTH, 1990; SPROUSE; AGHAJANIAN, 1988). Já a ativação de receptores pós- sinápticos resulta na inibição neuronal de partes selecionadas do sistema límbico. Devido a esta distribuição particular, os receptores 5-HT1A oferecem a possibilidade de controlar a transmissão serotonérgica de uma maneira geral e a atividade neuronal no sistema límbico. Especialmente no hipocampo, alguns estudos demonstraram que agonistas de receptores 5-HT1A suprimiam a ativação neuronal serotonérgica e diminuíram a liberação de 5-HT nos terminais (KAGAMIISHI; YAMAMOTO; WATANABE, 2003). Esta família de receptores se mostrou interessante em particular devido a estarem envolvidos na regulação de comportamento emocional e afetivo e, possivelmente, no mecanismo de ação de tratamentos de ansiedade (SCHREIBER; DE VRY, 1993). Os núcleos mediano e dorsal da rafe (NMR e NDR, respectivamente) enviam projeções serotonérgicas para áreas cerebrais envolvidas na regulação de comportamentos defensivos. A maioria das projeções serotonérgicas se origina no NDR (cerca de 80%), sendo o restante originário do NMR (DESCARRIES et al., 1982). As projeções serotonérgicas que alcançam o HD são principalmente provenientes do NMR, ao passo que amígdala, matéria cinzenta periaquedutal dorsal (MCPD) e HV recebem projeções provenientes do NDR, muito embora existam descrições a respeito de fibras provenientes do núcleo mediano da rafe que chegam ao HV (MCKENNA; VERTES, 2001). Manipulações experimentais ativando ou inibindo a atividade neuronal no NDR e NMR, e no hipocampo foram apresentadas na revisão conduzida por Andrade, Zangrossi e Graeff (2013). Lesões seletivas de neurônios do NDR com 5,7-DHT prejudicaram a esquiva inibitória e, simultaneamente, facilitaram a fuga, isto é, apresentaram efeitos ansiolítico e panicogênico (SENA et al., 2003). Quando o mesmo foi repetido no NMR, o prejuízo das esquivas também foi observado, sem, contudo, afetar as fugas (ANDRADE et al., 2004). Os mesmos efeitos foram observados na administração de 8-OH-DPAT (DOS SANTOS; ANDRADE; ZANGROSSI, 2005; VICENTE et al., 2008). Nesse caso, a inativação de neurônios serotonérgicos do NMR e NDR foi conduzida através da estimulação de receptores 5-HT1A inibitórios localizados no corpo celular e nos dendritos destas células, resultando na inibição do disparo neuronal e na redução da liberação de serotonina nas terminações sinápticas. 23 Entretanto, quando se utilizou antagonista de receptores 5-HT1A no NMR em doses mais altas constatou-se o aumento de comportamentos de esquiva inibitória no LTE e, consequentemente, o efeito ansiogênico, sem interferência nas fugas (Dos Santos et al., 2008). A ativação de neurônios serotonérgicos no NMR pelo bloqueio da ação da serotonina sobre receptores 5-HT1A somatodendríticos ocasionou provavelmente o aumento da liberação de 5-HT no HD causando aumento das esquivas. Injetando diretamente 8-OH-DPAT no HD observou-se o mesmo resultado, o que foi sugerido por esses pesquisadores que a 5-HT no HD causaria aumento das esquivas por agir sobre receptores 5-HT1A nessa região. Outras pesquisas foram conduzidas visando compreender o papel da serotonina no HD e as mesmas foram listadas na Tabela 2. Todavia percebe-se também em relação a esta estrutura nenhum resultado ou efeitos paradoxais ao encontrado através do labirinto em T elevado. 24 Tabela 2 - Intervenções no Hipocampo Dorsal e análise da manifestação da ansiedade em diferentes testes de comportamento animal Intervenção Experimental Teste Ansiedade Referências Estimulação elétrica LCE TERSC - - DRINGENBERG et al., 2008 DRINGENBERG et al., 2008 Zimelidina (inibidor da recaptação da 5-HT) (20 e 100nmol) LCE 0 + GUIMARÃES et al., 1993* PADOVAN; GUIMARÃES, 1993 BNDF (200pg) (facilitação do GABA) LTE CE + + CASAROTTO et al., 2012 CASAROTTO et al., 2012 Lesão eletrolítica LTE CC 0 - 0 TRIVEDI; COOVER, 2004 MAREN et al., 1997 TRIVEDI; COOVER, 2004 Tetrodotoxina (5mg) (neurotoxina) LCE TERSC 0 - DEGROOT; TREIT, 2004 DEGROOT; TREIT, 2004 Lidocaína (2%) (bloqueia canais de Sódio) LCE 0 BERTOGLIO et al., 2006 Agonista de receptores 5-HT 5-MeODMT (20nmol) LCE 0 - MENDONÇA-NETTO; GUIMARÃES, 1996 MENDONÇA-NETTO; GUIMARÃES, 1996* Agonista de receptores 5-HT1A – 8-OH-DPAT 3 e 15 nmol LTE + DOS SANTOS et al., 2008 0,1 μg e 5 μg/100 ng LCE TERSC EAC CE + - 0 0 + CHEETA et al., 2000; FILE; GONZALEZ, 1996 MENARD; Treit 1998 MENARD; Treit 1998 MENARD; Treit 1998 ROMANIUK et al., 2001 0,05, 0,1 e 0,2 μg/3 nmol LCE IS 0 0 BELCHEVEA et al., 1994; FILE; GONZALEZ, 1996 GUIMARÃES et al., 1993* 1 nmol CC - ALMADA et al., 2009 1-5 μg, 10 μg VU - SCHREIBER; DeVry 1993; JOLAS et al., 1995 50 ng IS Geller-Seifter EP 0 0 - PICAZO et al., 1995 CERVO et al., 2000 CARLI et al., 1993 100 ng IS + ANDREWS et al., 1994; CHEETA et al., 2000; FILE; GONZALEZ, 1996 Outros agonistas (parciais) de receptores 5-HT1A Tandospirona (30ug,60ug) Vogel - KATAOKA et al., 1991 Buspirona (2,5 μg) (15-30 μg) LCE VU - - KOSTOWSKI et al., 1989 SCHREIBER; DEVRY 1993 Ipsapirona (0,1 μg) (40 μg, 10-20 μg) LCE VU 0 - PICAZO et al., (1995) SCHREIBER; DEVRY 1993; JOLAS et al., 1995 Outros antagonistas de receptores 5-HT1A WAY-100635 (0,18, 0,37 e 0,74 nmol) LTE 0 DOS SANTOS et al., 2008 Tertatolol (3 μg) LCE IS + 0 + ANDREWS et al., 1994 FILE; GONZALEZ, 1996 ANDREWS et al., 1994 Agonista de receptores 5-HT1C MK-212 (1 μg, 0,3 μg) LCE 0 ALVES et al. (2004) Agonistas e antagonistas de receptores Gabaérgicos Inibidor de recaptação FrPbAII (174 Da) (EC50=0,09 μg) (EC50=0,03 μg) LCE CE - - LIBERATO et al. (2006) LIBERATO et al. (2006) Agonista de receptor GABAA – Muscimol (0,05 μg, 0,25 μg, 0,5 μg) LCE - REZAYAT et al. (2005) Antagonista de receptor GABAA – Bicucullina (0.5 μg, 1 μg, 2 μg) LCE 0 REZAYAT et al. (2005) Agonistas e antagonistas de receptores Benzodiazepínicos Midazolam (1 μg, 2 μg)/agonista Midazolam (10 μg) LCE IS LCE TERSC EAC - - - 0 0 GONZALEZ et al. (1998) GONZALEZ et al. (1998) MENARD; TREIT (2001) MENARD; TREIT (2001) MENARD; TREIT (2001) Flumazenil (100 ng, 500 ng)/antagonista Flumazenil (500 ng) LCE IS 0 0 GONZALEZ et al. (1998) GONZALEZ et al. (1998) + aumento; - diminuição; 0 inalterado LTE (Labirinto em T elevado); LCE (Labirinto em cruz elevado); CE (Claro-escuro); CC (Condicionamento Contextual); TERSC (Teste de enterramento em reação à sonda de choque); EAC (Estímulo Aversivo de choque); VU (Vocalização Ultrassônica); IS (Interação Social); EP (Esquiva Passiva); BNDF (Brain-derived neurotropphic factor, ou fator neurotrófico derivado do cérebro); 5-MeODMT (5-methoxy-N,N-dimethyltryptamine); Way 100635: N-[2-methoxyphenyl]-1-piperazinyl-ethyl]-N-2- pyridinylcyclohexanecarboxamina; 8-OH-DPAT (8-hydroxy-2-(di-n-propylamino) tetralina); *drogas reverteram o efeito de restrição prévia de 2 horas. 25 Considerando que estudos discriminativos envolvendo esquivas e fugas ainda não foram conduzidos no HV, pergunta-se: será que a ativação de receptores serotonérgicos do tipo 5- HT1A no HV teriam papel inibitório similar ao efeito do midazolam sobre receptores gabaérgicos em relação à manifestação de comportamentos em testes de ansiedade? Será que o HV, uma das principais projeções do NDR teria papel modulatório sobre o TAG? Caso se confirme esta possibilidade, seriam os receptores gabaérgicos (GABAA) e serotonérgicos (5-HT1A) partícipes desse efeito? O estudo sequencialmente apresentado teve por objetivo responder a tais questionamentos. Considerando o pressuposto teórico apresentado por Deakin e Graeff (1991) (1991), fundamentando-se no fato de que o HV recebe uma grande densidade de projeções serotonérgicas ascendentes (BANNERMAN et al., 2003; CARABELLI et al., 2015) e tendo como base achados que apontam que a expressão das emoções estaria mais relacionada com a parte ventral do hipocampo (BANNERMAN et al., 2004; KJELSTRUP et al., 2002; MCHUGH et al., 2004), especialmente em respostas que envolvem o condicionamento, formula-se a hipótese que o HV exerceria um papel sobre a modulação das esquivas inibitórias no LTE e que, portanto, poderia estar mais relacionado à manifestação do TAG. Já se conhece que o hipocampo ventral também possui papel no processamento e retenção da informação espacial e na consolidação da memória (KJELSTRUP et al., 2008), embora o HD seja mais reconhecido por essas funções (BRANDÃO, 2012; BROADBENT; SQUIRE; CLARK, 2004; EICHENBAUM; OTTO; COHEN, 1992; EKSTROM et al., 2003; O’KEEFE; NADEL, 1978). Assim, esta investigação teve por objetivo avaliar o papel do hipocampo ventral na modulação do Transtorno de Ansiedade Generalizada e do Transtorno do Pânico e, mais especificamente, verificar o envolvimento dos receptores serotonérgicos 5- HT1A localizados nesta região pela administração de 8-OH-DPAT, um agonista desses receptores, tendo como parâmetro o efeito da microinjeção do midazolam, um benzodiazepínico com ação conhecida em receptores gabaérgicos (GABAA), sobre a apresentação de esquivas e fugas no labirinto em T elevado. 26 2. REFERÊNCIAS ADAMS, W.; KUSLJIC, S.; VAN DEN BUUSE, M. 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Research Report Envolvimento de receptores 5-HT1A no hipocampo ventral na regulação de comportamentos defensivos relacionados com a ansiedade generalizada e com o pânico Involvement of the 5-HT1A receptors in ventral hippocampus on anxiety- and panic- related defensive behaviors Vinícius Dias Kümpela, Matheus Fitipaldi Batistelaa, Amaryllis Garcia Almeidaa, Sérgio Mosquim Júniora, Hélio Zangrossi, Juniorb, Telma Gonçalves Carneiro Spera de Andradec* a Laboratory of Physiology – UNESP – Assis – São Paulo – Brazil b USP – University of São Paulo, FMRP – Ribeirão Preto – São Paulo - Brazil c UNESP – University of the State of São Paulo, FCL, Department of Biological Science - Avenida Dom Antonio, 2100 – 19.806-900 – Assis – São Paulo – Brazil *Corresponding author: same address as above. E-mail address: vinicius.biotec.assis@gmail.com mailto:vinicius.biotec.assis@gmail.com 40 RESUMO Ainda pouco se conhece a respeito da atividade serotonérgica sobre receptores 5- HT1A no hipocampo ventral na regulação de diferentes tipos de ansiedade. O Labirinto em T elevado (LTE) é um teste que avalia separadamente dois subtipos de ansiedade: a ansiedade generalizada e o pânico, respectivamente através da avaliação dos comportamentos defensivos de esquivas inibitórias e das fugas. Assim, este estudo teve por objetivo investigar o envolvimento de receptores 5-HT1A no HV sobre a manifestação dos transtornos de ansiedade generalizada (TAG) e pânico (TP) no LTE, tendo como parâmetro a ativação de receptores gabaérgicos (GABAA) nessa área do hipocampo. Foram conduzidos dois experimentos em ratos Wistar: o Experimento 1, visando avaliar o efeito do midazolam (10, 20 ou 40nmol) - um benzodiazepínico que potencializa a ação do GABA em receptores GABAA; e o Experimento 2, para avaliar o efeito de 8-OH-DPAT (0,6, 3 ou 15nmol) – um agonista de receptores 5-HT1A. Animais dos grupos controles nos dois experimentos foram tratados com salina. Dez minutos após as microinjeções foram submetidos ao LTE para avaliação das latências (em segundos) para esquivas e fugas. Imediatamente após, os animais foram colocados no centro da arena para avaliação da atividade motora (número de quadrados percorridos). Os resultados apontaram que a maior dose de midazolam microinjetada no hipocampo ventral causou ansiólise, comprovada pela diminuição na latência das esquivas em relação aos animais controles e àqueles tratados com 10nmol do mesmo fármaco. Resultado semelhante foi constatado nas três doses de 8-OH-DPAT. Não se observou qualquer alteração nas fugas, e nem na atividade motora dos animais tratados com qualquer um dos fármacos testados. Essas evidências comportamentais indicam que a ativação de receptores 5-HT1A no HV diminuiu o comportamento de esquiva dos animais, sem afetar as respostas de fugas, semelhantemente ao que se observou em decorrência da ação do midazolam sobre receptores GABAA. Esses resultados indicam um envolvimento desses receptores na regulação do TAG, mas não do TP. Palavras-chave: Hipocampo Ventral, Labirinto em T Elevado, Transtorno de Ansiedade Generalizada, Transtorno do Pânico, GABAA, 5-HT1A. 41 ABSTRACT The little is known about the serotoninergic activity on 5-HT1A receptors in the ventral hippocampus in the regulation of different types of anxiety. The Elevated T Maze (ETM) is a test that evaluates separately two subtypes of anxiety: generalized anxiety and panic, respectively by evaluating the defensive behaviors of inhibitory avoidance and escapes. Therefore this study aimed to investigate the involvement of 5-HT1A receptors in VH on the manifestation of generalized anxiety disorder (GAD) and Panic (PD) in ETM, having as parameter the activation of gabaergic receptors (GABAA) in that area of the hippocampus. Two experiments were conducted in rats: Experiment 1, to evaluate the effect of midazolam (10, 20 or 40nmol) – a benzodiazepine that potentiates the action of the GABA on GABAA receptors; and Experiment 2 to evaluate the effect of 8-OH-DPAT (0.6, 3 or 15nmol) - an agonist of 5-HT1A receptors. Animal control groups in both experiments were treated with saline. Ten minutes after microinjection, the animals were submitted for evaluation to the ETM latencies (in seconds) for avoidances and escapes. Immediately after, the animals were placed in the center of the arena to evaluation of motor activity (number of covered squares). The results showed that the highest dose of midazolam microinjected in the ventral hippocampus caused anxiolysis, evidenced by the decrease in latency of avoidances compared to controls and those treated animals 10nmol of the same drug. A similar result was observed at all three doses of 8-OH-DPAT. There was no change in the escapes, nor the motor activity of animals treated with any of the drugs tested. These behavioral evidence indicates that activation of 5-HT1A receptors in VH decreases the behavior of avoidance of the animals without affecting the escape response, similar to what was observed due to the action of midazolam on the GABAA receptors. These results indicate an involvement of these receptors in the regulation of GAD, but not of PD. Keywords: Ventral Hippocampus, Elevated T Maze, Generalized Anxiety Disorder, Panic Disorder, GABAA, 5-HT1A. Highlights:  Midazolam in ventral hippocampus (VH) damaged the avoidances but not the escapes  8-OH-DPAT in VH also damaged the avoidances but not the escapes in elevated T maze  5-HT1A receptors in VH are related with generalized anxiety but not panic 42 1. Introdução Deakin e Graeff (1991) propuseram uma hipótese na qual sugeriram que o sistema nervoso central possui mais de um mecanismo de controle sobre a ansiedade, e que estes são diferentemente modulados pela neurotransmissão serotonérgica. De acordo com esses autores, a via prosencefálica que se origina no Núcleo Dorsal da Rafe (NDR) e se projeta para a amígdala, córtex frontal e hipocampo ventral, facilitaria os comportamentos defensivos expressos em resposta aos perigos potencial ou distal, por exemplo, a esquiva inibitória. Por outro lado, a via NDR-periventricular, com projeções para a MCPD (Matéria Cinzenta Periaquedutal Dorsal), inibiria reações de fuga e luta em resposta ao perigo proximal. O mau funcionamento dos sistemas serotonérgicos nessas vias levaria a distúrbios específicos de ansiedade. Assim, a disfunção da via NDR/amígdala/córtex/hipocampo ventral ocasionaria a manifestação do Transtorno de Ansiedade Generalizada (TAG) e a disfunção da via NDR/MCPD ocasionaria o Transtorno do Pânico (TP). Subtipos celulares em regiões distintas do NDR seriam responsáveis por essa dupla atuação (Grahn et al., 1999; Hale et al., 2012; Paul et al., 2011; Paul e Lowry, 2013; Spiacci, 2012; Staub et al., 2006). O NDR pode ser subdividido em diferentes subregiões conforme sua anatomia e projeções celulares. Os subnúcleos dorsomedial e caudal representam importante fonte de neurotransmissão serotonérgica a estruturas límbicas relacionadas com a modulação de comportamentos de ansiedade como ABL, córtex pré-frontal medial (CPFm) e núcleo leito da estria terminal (NLET) (Spiacci et al., 2015). Também há evidências de uma via conectando o subnúcleo dorsomedial do NDR à MCPD (Stezhka e Lovick, 1997). Estas subregiões estão anatômica e funcionalmente ligadas e recebem projeções de estruturas como habênula lateral, NLET e amígdala, regiões conhecidas por sua participação no controle de comportamentos relacionados à ansiedade (Hale et al., 2012). A sub-região interfascicular recebe projeções dos núcleos pré-óptico mediano e parabraquial lateral, e envia projeções para regiões corticais como dorsolateral pré-frontal, medial orbital e anterior cingulado, conhecidas também por atuar no controle de respostas comportamentais ao estresse, além de enviar projeções ao tálamo médio dorsal e hipocampo (Hale et al., 2012). Portanto, os subnúcleos associados ao controle de comportamentos ligados à ansiedade seriam o caudal e o dorsomedial, enquanto as subregiões interfascicular e as asas laterais 43 estariam associadas a efeitos antidepressivos e antipânico (Hale et al., 2012; Spiacci et al., 2015). Alguns estudos têm buscado testar estas duas possibilidades, no entanto, os modelos experimentais utilizados não permitem a discriminação entre os dois subtipos de ansiedade. Avaliações realizadas através do Labirinto em T Elevado (LTE) possibilitam esta análise separadamente, pois as esquivas inibitórias e as fugas têm sido associadas, respectivamente, aos comportamentos defensivos relacionados com o TAG e com o TP (Graeff et al., 1998; Graeff et al., 1993; Poltronieri et al., 2003; Viana et al., 1994; Zangrossi e Graeff, 1997). Muitas investigações utilizando esse modelo tem sido mais direcionadas à compreensão da via que se projeta para a MCPD (Graeff, 2004). Não obstante existam pesquisas que já demonstraram o papel do Hipocampo Ventral (HV) na ansiedade (Ballesteros et al., 2014; Bannerman et al., 2003; Bannerman et al., 2002; Chudasama et al., 2008; File e Gonzalez, 1996; Gray e Mcnaughton, 2000; Nunes-De-Souza et al., 2002; Kjelstrup et al., 2002; Mchugh et al., 2004; Pentkowski et al., 2006; Trent e Menard, 2010; Trivedi e Coover, 2004; Tu et al, 2014; Zhang et al., 2014), ainda não foram identificados estudos que tenham utilizado o LTE com o objetivo de avaliar o papel funcional desta sub-região do Hipocampo no TAG e no TP. Na Tabela 1 é possível a visualização desses resultados de forma sucinta. 44 Tabela 1: Intervenções no Hipocampo Ventral e análise da manifestação da ansiedade em diferentes testes de comportamento animal Intervenção Experimental Teste Espécie/ linhagem Ansiedade Referências Inativação do HV Lesão eletrolítica Cond contextual LTE Odor de gato Presença do gato SD SD SD SD - - - 0 Trivedi; Coover, 2004 Trivedi; Coover, 2004 Trivedi; Coover, 2004 Trivedi; Coover, 2004 Lesão neurotóxica (Ác. Ibotênico) (NMDA) LCE Claro-escuro Interação-social Cond contextual LCE LE LE DA LH LH LE LE - - - - - - - Kjelstrup et al., 2002; Pentkowski et al., 2006 Bannerman et al., 2003; Mchugh et al., 2004 Mchugh et al., 2004 Pentkowski et al., 2006 Trent; Menard, 2010; Nascimento Häckl e Carobrez, 2007 IAF LCE SP - Degroot; Treit, 2002 Muscimol Cond contextual LCE Wistar Wistar - - Zhang et al., 2014 Zhang et al., 2014 Lidocaína LCE Wistar - Bertoglio; Joca; Guimaraes, 2006 Tetrotoxina LCE SP - Degroot; Treit, 2004 Tertatolol WAY 100635 LCE LCE LH SW - - File; Gonzalez, 1996 Nunes-De-Souza; Canto-De- Souza; Rodgers, 2002 Ativação do HV Estimulação Elétrica LCE LE 0 Dringenberg; Levine; Menard, 2008 CRF LCE SD + Kagamiishi; Yamamoto; Watanabe, 2003 + aumento; - diminuição; 0 inalterado. LCE (Labirinto em Cruz Elevado); NMDA (N-methyl-D- aspartate); 8-OH-DPAT (8-hydroxy-2-(di-n-propylamino) tetralina); CRF (Fator de Liberação de Corticotropina); IAF (Inibidor de Acetilcolinesterase Fisostigmina); SP (Ratos Sprague-Dawley); LE (Ratos Long Evans); DA (Ratos Dark Agouti); LH (Ratos Lister Hooded), SW (Camundongos Swiss- Webster). Considerando o pressuposto teórico apresentado por Deakin & Graeff (1991) e tendo como base achados que apontam que a expressão das emoções estaria mais relacionada com a parte ventral do hipocampo (Bannerman et al., 2004; Kjelstrup et al., 2002; Mchugh et al., 2004), especialmente em respostas que envolvem o condicionamento, como também possui papel no processamento e retenção da informação espacial e na consolidação da memória (Kjelstrup et al., 2008), formulou- se a hipótese que o Hipocampo Ventral exerceria um papel sobre a modulação das esquivas inibitórias no LTE e que, portanto, poderia estar mais relacionado à manifestação do TAG. 45 Assim, esta investigação teve por objetivo avaliar o papel do hipocampo ventral na modulação do Transtorno de Ansiedade Generalizada e do Transtorno do Pânico e, mais especificamente, verificar o envolvimento dos receptores serotonérgicos 5- HT1A localizados nesta região pela administração de 8-OH-DPAT, um agonista desses receptores, tendo como parâmetro o efeito da microinjeção do midazolam, um benzodiazepínico com ação conhecida em receptores gabaérgicos (GABAA), sobre a apresentação de esquivas e fugas no labirinto em T elevado. 2. Métodos O estudo foi desenvolvido no Laboratório de Fisiologia do Departamento de Ciências Biológicas, na Faculdade de Ciências e Letras da UNESP, Campus de Assis. Uma síntese do delineamento experimental pode ser visualizada através da Figura 1. Figura 1 – Delineamento experimental do presente estudo 46 2.1. Animais Foram utilizados ratos (machos) Wistar, obtidos do biotério central da UNESP – Botucatu, pesando 200-250g no início das sessões experimentais. Os animais foram alojados em caixas de polipropileno (32 x 38 x 18 cm) forradas com maravalha (cinco ratos por caixa), recebendo comida e água ad libitum, exceto durante as avaliações. As caixas ficaram alocadas no biotério do Laboratório de Fisiologia, que possui temperatura constante (aproximadamente 23ºC +/- 2ºC) e iluminação controlada por timer, com intensidade luminosa de 50 lux no centro da sala (as luzes foram acesas diariamente às 7h00 e apagadas às 19h00). Após a chegada dos animais e agrupamento dos mesmos, estes permaneceram em ambientação no biotério por um período mínimo de 1 semana, sendo submetidos à manipulação somente 3 vezes por semana durante as trocas das caixas. Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as normas da Sociedade Brasileira de Neurociência e Comportamento, visando minimizar o sofrimento animal. O projeto inicial foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Ciências e Letras da UNESP – Assis (Registro 028/2011-15/03/2012, ver anexo II). 2.2. Equipamentos 2.2.1. Labirinto em T elevado (LTE) No LTE, as respostas de esquiva inibitória e fuga foram medidas em um modelo que consiste de três braços elevados 50 cm em relação ao solo – um fechado e dois abertos, feitos de madeira, com as mesmas dimensões (50 cm de comprimento por 12 cm de largura). Um dos braços, o fechado, é circundado por paredes laterais (40 cm de altura) e está disposto perpendicularmente aos dois outros braços que permanecem desprovidos de paredes. Para evitar a queda dos animais, os braços abertos são delimitados por uma proteção de 1 cm de altura (Graeff et al., 1993). Este aparato pode ser visualizado na Figura 2. 47 Figura 2 – Labirinto em T Elevado 2.2.2. Arena A Arena é um aparato também constituído de madeira medindo 60 x 60cm, lateralmente cercada por paredes de 30cm de altura. No piso deste aparato, encontram-se demarcados nove quadrados (20 x 20cm). 2.2.3. Caixa de transporte individual Para o transporte dos animais até a sala de avaliação comportamental, adjacente ao biotério, foi utilizada uma caixa de polipropileno (28 x17 x 13cm) forrada com maravalha e coberta com tela plástica e flanela. 2.2.4. Cânulas-guia e agulhas para microinjeção As cânulas-guia afixadas ao crânio dos ratos foram produzidas pelos próprios pesquisadores a partir de agulhas descartáveis (0,60x25-23G, KDL do Brasil), cortadas nas medidas necessárias para acesso ao hipocampo ventral (12mm de comprimento e 0,6mm de diâmetro externo) após a retirada da porção plástica e limpeza de resíduos. Um pequeno fio de aço (n.30) foi preparado para ser posicionado no interior de cada cânula a fim de impedir contaminação ou obstrução da mesma após ser posicionada no animal. Semelhantemente, as agulhas utilizadas para a microinjeção foram confeccionadas a partir de agulhas descartáveis (0,60x25-23G, KDL do Brasil) e 48 gengival (0,3x25-30G, Injecta Produtos Odontológicos) com diâmetro externo de 0,3mm e a porção que será inserida no animal contendo 15mm de comprimento. 2.3. Drogas 2.3.1. Midazolam Foi utilizado midazolam (Roche), diluído em salina 0,9%, de acordo com estudo prévio (Strauss et al., 2013). Ratos controles receberam microinjeções no HV apenas com salina estéril (NaCl diluído à concentração de 0,9%). O midazolam (C18H13ClFN3) pertence ao grupo dos benzodiazepínicos e é conhecido por seus efeitos hipnóticos e sedativos em humanos, dentre outros efeitos, utilizado como indutor anestésico ou adjuvante à anestesia geral. Como outros benzodiazepínicos, o midazolam é capaz de se ligar a receptores farmacológicos ligados ao receptor GABA do subtipo A, aumentando a afinidade do receptor pelo GABA, potencializando seus efeitos (Kobayashi et al., 2005; Georgopoulos et al., 2008; Graeff, 2012). 2.3.2. 8-OH-DPAT Foi utilizado 8-OH-DPAT, ou 8-Hydroxy-2-(di-n-propylamino) tetralin hydrobromide (SIGMA), um agonista de receptores 5-HT1A, diluídos em solução salina. Ratos controles receberam microinjeções no HV apenas com solução salina estéril. O 8-OH-DPAT (C16H25NO · HBr) é um agonista seletivo de receptores 5-HT1 com maior afinidade pelo subtipo 5-HT1A (Middlemiss e Fozard, 1983; Peroutka, 1986). 2.4. Procedimentos 2.4.1. Cirurgia estereotáxica Sob efeito anestésico do 2,2,2-Tribromoethanol (250mg/kg) (Fluka), foram implantadas duas cânulas-guia (cirurgia bilateral) para acesso ao hipocampo ventral a 3,0mm acima da região alvo (Bertoglio et al., 2006). Após a tricotomia da região dorsal do crânio, os ratos foram fixados a um aparelho estereotáxico (David - Kopff) pelo rochedo temporal e incisivos superiores. Após o procedimento de antissepsia com polivinilpirrolidona-iodo a 1% (PVPI)(Rioquímica) e injeção subcutânea de lidocaína (2%) com vasoconstritor epinefrina (0.2ml) (Cristália), foi efetuada uma 49 incisão de 1,5 cm removendo-se pele, excesso de lidocaína acumulado, tecido subcutâneo e periósteo. Com a superfície craniana exposta e ajustada em posição horizontal, foram realizados dois orifícios nos ossos parietais para implantação das cânulas. Tendo o bregma como referência, foram seguidas as seguintes coordenadas para acesso ao hipocampo ventral: antero-posterior = - 5,0mm; lateral (ambos os lados) = 5,2mm; e dorso-ventral = 4,0mm, com inclinação da haste de 0° graus (Bertoglio et al., 2006; Paxinos e Watson, 2007). Após o posicionamento das cânulas, estas permaneceram fixadas aos orifícios através de um capacete de acrílico feito de resina autopolimerizante (Polímero Metil Etil Metacrilato)(Clássico LTDA) estabilizado por dois parafusos odontológicos fixados ao crânio. Por fim, 0,2ml de uma associação antibiótica de largo espectro (Pentabiótico veterinário, Fontoura-Wyeth-Brasil) foi aplicada para a profilaxia de eventuais infecções. Os ratos foram realojados em suas caixas com os demais (5 animais/caixa), sem modificação do agrupamento inicial. A fim de prevenir possíveis choques envolvendo as cânulas recém fixadas e a grade superior das caixas foi adicionado um extensor de alumínio, elevando-as a uma altura mais segura (7 cm) sem, contudo, prejudicar o acesso à água e comida. 2.4.2. Habituação dos animais ao pesquisador No 4º e no 5º dia pós-cirúrgico os animais foram submetidos a um procedimento de habituação com o experimentador (“handling”). Este esteve utilizando luvas e individualmente tomou cada animal em suas mãos, sem permitir que o mesmo ficasse desprotegido, e ao longo de 5 minutos realizou movimentos com leve pressão com uma das mãos na região dorsal, no sentido crânio-caudal. 2.4.3. Exposição prévia ao braço aberto do LTE (confinamento prévio) No dia anterior à avaliação comportamental, todos os ratos foram mantidos individualmente por trinta minutos, em um dos braços abertos do LTE. Os braços abertos foram separados dos demais por uma parede de madeira, disposta na linha entre a área central do labirinto e a porção proximal do braço aberto. Após este procedimento foram conduzidos a uma nova caixa em outra sala, conforme realizaram o procedimento, evitando assim que promovessem comunicação com os demais ratos do grupo antes que todos fossem confinados. Uma vez recomposto o grupo na mesma caixa, após o término do procedimento, os animais retornaram ao biotério até o dia 50 seguinte. As condições das salas são as mesmas descritas para a ambientação e para a avaliação comportamental (Teixeira et al., 2000). 2.4.4. Microinjeção de drogas no hipocampo ventral Sete dias após a cirurgia estereotáxica os fios de aço foram removidos das cânulas para a inserção das agulhas de microinjeção de 15mm de comprimento no hipocampo ventral. As microinjeções foram realizadas com o auxílio de duas microseringas (Hamilton, EUA) conectadas às agulhas de microinjeção através de uma extensão de polietileno (PE 10 – Intramedic). As microseringas foram conectadas à uma bomba microinjetora (Fisher Scientific Company, EUA). Um volume de 0,2l de solução foi injetado durante 1 minuto, aguardando-se o mesmo tempo para retirada da agulha, evitando o refluxo da solução. Foram realizados dois experimentos. O primeiro (Experimento 1) teve como objetivo avaliar o efeito do midazolam no HV. Os grupos foram determinados conforme a dose de midazolam (10 nmol, n=9; 20 nmol, n=9; ou 40 nmol, n=9). Animais do grupo controle receberam microinjeção de solução salina (n=9). O segundo experimento (Experimento 2) foi destinado à avaliação do efeito do 8-OH-DPAT no HV. Os grupos foram constituídos de acordo com a dose aplicada (0,6 nmol, n=11; 3 nmol, n=13; ou 15 nmol, n=11). De forma similar ao experimento 1, os animais controles foram tratados com solução salina (n=12). Dez minutos após a microinjeção os ratos foram submetidos aos testes comportamentais. 2.5. Testes Comportamentais As sessões experimentais foram conduzidas entre 14 e 17 horas em uma sala com controle de temperatura (aproximadamente 23ºC +/- 2ºC) e com luminosidade igual a 50 lux no centro do LTE ou arena. Os ratos foram levados do biotério para a sala de avaliação em caixas de separação individuais, um a um, e apenas no momento em que foram avaliados. A cada troca de animal os aparelhos foram limpos com álcool 20% para minimizar odores. Após a colocação dos ratos nos aparelhos o experimentador saía da sala. O comportamento do animal foi registrado por meio de um sistema de vídeo. A exemplo de pesquisas semelhantes e visando a não interferência da presença do avaliador na sala, toda a avaliação foi gravada para posterior análise (Graeff et al., 1993; Viana et al., 1994). 51 2.5.1. Avaliação no LTE O teste no LTE foi iniciado pela tomada das esquivas inibitórias. Para verificar este comportamento, cada animal foi colocado na extremidade distal do braço fechado. Foi registrado o tempo em segundos (medida de latência) gasto pelo mesmo para sair deste braço (Linha de base). A mesma medida foi tomada por mais duas vezes com intervalos de trinta segundos entre elas (Esquiva 1 e Esquiva 2). Trinta segundos após o término da tomada da Esquiva 2 foi avaliado o comportamento de fuga. Para isso, cada animal foi colocado na extremidade de um dos braços abertos (no mesmo em que foi confinado na véspera). O mesmo procedimento foi adotado, ou seja, foi registrado o tempo de latência (em segundos) de saída de um dos braços abertos. Essa medida foi tomada por três vezes (Fuga 1, Fuga 2 e Fuga 3) com intervalos de trinta segundos entre elas. O tempo máximo de permanência do animal na esquiva ou na fuga foi de trezentos segundos (cinco minutos). Entre cada avaliação o animal foi recolocado em sua caixa individual aguardando a próxima exposição ao teste. O critério de “saída” de um dos braços foi que as quatro patas do animal tivessem ultrapassado totalmente a linha divisória do braço onde foi colocado inicialmente. 2.5.2. Avaliação na arena Os ratos foram avaliados na Arena, por um período de cinco minutos, 30 segundos após sua avaliação no LTE, com o objetivo de avaliar a atividade geral e motora do animal. Cada animal foi colocado no quadrante central da caixa. Os resultados foram obtidos através da contagem do número de quadrados percorridos durante o teste. 2.6. Perfusão e identificação dos sítios de injeção Após o término dos testes comportamentais, os ratos foram anestesiados com Thiopental sódico (Thiopentax – Cristália) em dose letal. Por meio de uma agulha de microinjeção foi injetado 0,2 L de corante hematoxilina pelas cânulas guias. Na sequência os animais foram perfundidos (perfusão intracardíaca) com salina e em seguida por formol a 10%. Logo após a perfusão, os encéfalos foram removidos e armazenados em formol a 10% para identificação do sítio de microinjeção através dos cortes histológicos (50 µm). Posteriormente, as porções do tecido coletado foram depositadas em lâminas gelatinizadas e coradas através do método de Nissl. As 52 imagens foram analisadas através de microscopia. Animais cujas cânulas guia atingiram o hipocampo apenas unilateralmente ou em estruturas cerebrais em área adjacentes foram excluídos das amostras. Uma visão representativa do sítio de microinjeção no HV pode ser visualizada através da Figura 3. Figura 3: Representação diagramática dos sítios de injeção na região ventral do hipocampo, em seção coronal (5,2mm posterior ao bregma) do cérebro do rato (Adaptado de Paxinos e Watson, 2007). Os pontos escuros ilustram locais aproximados de microinjeção, apontando a região considerada no estudo como hipocampo ventral. A parte superior ilustra o local em que foi feita a dissecção para obtenção do corte. 2.7. Análise dos dados As latências de esquiva inibitória e de fuga foram submetidas à análise de variância de medidas repetidas (ANOVA), tendo como fator independente o tratamento, e como medidas repetidas as diferentes exposições efetuadas (Linha de base, Esquiva 1 e Esquiva 2 ou Fuga 1, Fuga 2 e Fuga 3) visando avaliar se houve efeito das repetições. Foram realizadas também análises independentes de cada esquiva e de cada fuga através da ANOVA de uma via. Quando apropriado, foram conduzidas comparações múltiplas utilizando o teste de Duncan. Os resultados da atividade motora na arena foram também analisados através da ANOVA de uma via. Em todos os casos um “p” com valor menor que 0,05 foi considerado significativo. 53 3. Resultados Foram considerados no estudo somente os resultados dos animais cujos sítios de microinjeção atingiram a região ilustrada através da Figura 4, que apresenta um corte frontal do encéfalo corado com hematoxilina evidenciando exatamente o ponto da infusão das soluções, visualizado através de microscopia óptica. (a) (b) Figura 4: Corte frontal do encéfalo de rato a -5,2 mm a partir do Bregma (Paxinos e Watson, 2007). Em (a), sítio de microinjeção demarcado com hematoxilina na região ventral do hipocampo, visualizado através de microscopia óptica (aumento de 50x), imagem representando a região delimitada em (b). 54 3.1. Experimento 1 – Análise do efeito do midazolam microinjetado no HV. Na análise do efeito do midazolam microinjetado no HV sobre as esquivas inibitórias no LTE (Figura 5), a ANOVA de Medidas Repetidas mostrou que houve efeito do tratamento entre os grupos [F(3,32)=5,18; p=0,005] e efeito das repetições [F(2,64)=11,