Jpn. J. Med. Mycol Vol. 31, 51-58, 1990 ISSN 0583-0516 原 著 paracoccidioides brasiliensis, Pb-18株 にお け る厚 膜 胞 子 の形 成 条件 佐 野 文 子 Marcello de Franco*竹 尾 漢 治 西 村 和 子 宮 治 誠 千葉大学真核微 生物研 究セ ンター 感染研 究部 門 *Dept. Pathology, Fac. Medicine, Sao Paulo State University 〔受付6月10日, 1989年, 受理10月13日, 1989年 〕 要 旨 Paraccoccidioides brasiliensisは 南米のパ ラコクシジオイデス症の原 因菌 で, 温度依 存性 の二 形 性菌であ り, 室温 では菌糸形, 37℃で は酵母形 となる. また菌糸形か ら酵 母形 に変換す る過程で厚膜 胞 子 を形成する. 本菌 の厚膜胞子形成 に及 ぼす温度, 栄養条件 は一定の見解が得 られていない. そ こで厚 膜胞子の形 成条件 をP. brasiliensis Pb-18株 を用 いて調べ た. シャー レで寒天培 地 と混釈培 養 を し たところ, 1. 培 地は富栄養 よりも貧 栄養 の方 が厚膜 胞子 形成 に都 合が よか ったが, 無栄養(water agar)で は厚膜胞子形成 は起 こ らなかった. 2.25℃以 上, 30℃ま で は, 温度 上昇 に比例 して厚 膜胞 子 形成が進 んだ. 3. 菌 濃度 が106units/mlの ときに厚 膜胞子形成 は最 もよかった. 4. 寒 天濃 度 は1.0 ない しは2.0%で, 最 も厚膜胞子形成が み られた. 本菌 の厚膜胞子形成 は, 単 に温度 に よる影 響 だけで な く, 培地, 菌量, 寒天濃度等 の要 因が複雑 に関与 していた. Key wards: Praacoccidioides brasiliensis, 厚膜胞子(chlamydospore), 菌量(cell popula- tion) 緒 言 Parcossidioides brasiliensisは 南 米 に お け る 重 要 な深在 性 真 菌症, パ ラ コ ク シ ジ オ イ デ ス症 の 原 因 菌 で, 温 度 依 存 性 の二 形性 菌 で あ る こ とは 良 く知 られ て い る. なか で も本 菌 の厚 膜 胞 子 も し くは厚 膜 胞 子 様 構 造(chlamydospore-like structures)は, 菌 糸 形 か ら酵 母 形 へ の変 換 過 程 で 出 現 す る こ とがPat面o ら1), Salazar and Restrepo 2), Carbonell and Rodrlguez 3)ら に よっ て指 摘 さ れ て い る. ま たMi- yaji and Nishimura4)は 寒 天 埋 没 法 を用 い て, 本 菌の菌糸形から酵母形への変換は主に厚膜胞子 を 経由 して起こると報告 している. 厚膜胞子 とはAlexopoulos and Mims5)に よ ると, 細胞壁の厚いthallic conidium(葉 状胞子 もしくは菌糸状胞子)で, 一般に機能が休止状態 にある胞子である. 一方, Kendrick 6)は厚膜胞子 を細胞壁の厚い, 末梢性 もしくは介在性に菌糸か ら形成される胞子 として定義 し, 特 に機能につい ては限定せず, 広義に使用 している. その他の成 書7)に よっても, 菌糸の一部が腫大 してほぼ球形 になり厚い細胞壁をもつに至った菌要素 を厚膜胞 子 としている点は共通 している. P. brasiliensisは条件によっては菌糸の一部が 丸 く膨 らみ, 厚い細胞壁 をもつようになる1-4). この菌要素は37℃に おいては, multiple budding を示すため, 研究者によって表現が微妙に異なる 別刷請求先: 佐野文子 〒280 千葉市亥鼻1-8-1 千葉大学真核生物研究センター感染研 究部門 52 真菌誌 第31巻 第1号 平成2年 が, 形 態 学 的 に は厚 膜 胞 子 で あ り, 厚 膜 胞 子 と呼 ばれ る こ とが多 い. 著 者 ら もKendrickの 定 義 に 従 い, この菌 要 素 を厚 膜 胞 子 と呼 ぶ こ とに した. こ の よ う にP. brasiliensisの 厚 膜 胞 子 は 菌 糸 形 か ら酵 母 形 へ 移行 す る 中 間構造 物 と して重 要 な 菌 要 素 で あ り, 厚 膜 胞 子 は感 染 に重 要 な役 割 を 果 た し て い る と思 わ れ る. Mc-Ewen 8)ら は本 菌 の分 節 型 分 生 子 を吸 収 す る こ とに よ って 感 染 が 成 立 す る と指 摘 して い るが, Francoら9)は 厚 膜 胞 子 を 吸 入 す る こ と に よ っ て 肺 感 染 を引 き起 こす可 能 性 を示 唆 して い る. した が っ て本 菌 の厚 膜胞 子 形 成 の下 限 温 度 を検 討 す る こ とはパ ラ コ ク シ ジオ イ デ ス症 の発 症 機 序 の 解 明 に重 要 で あ る. ブ ラ ジル か らの逆 移 民 が 増 加 して い る 日本 の現 状 を考 える と, 輸 入 真 菌 症 で あ る 本 症 の原 因菌 が 日本 の 自然 界 に輸 入 さ れ, 生 存 す る 可 能 性 も考 え な くて は な らな い. 本 研 究 で は50年 以 上 も前 に分 離 され た に もか か わ らず, い ま だ に 感 染 能 力 を 維 持 し て お り10), 形 態 学 的研 究11), 感 染 実 験12-16), 抗 原 作 製17, 18)な どに お い て, 使 用 頻 度 の 高 いPb-18株 を用 い て, 種 々 の温 度 で の厚 膜 胞子 の形 成 を検 討 した. さ ら に市 販 の培 地 やSabouraud's dextrose agar, pep- toneとdextrose含 量 が 非 常 に 少 な い 培 地, お よ び培 養 に用 い る菌 量 や 寒 天濃 度 が厚 膜 胞 子 形 成 に 及 ぼ す影 響 に つ い て も検 討 した. 材 料 と方 法 1. 使 用 菌 株 ブ ラ ジ ル の 患 者 分 離 株Pb-18で, Burger博 士 (Departmento de Imunologia, Instituto de Cien- cias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil)よ り譲 渡 され た菌 株 で あ る. 2. 培 地 2%dextrose(和 光 純 薬)を 含 むSabouraud's dextrose agar(SDAと 略母), 0.1%dextrose, 0.1%peptone(和 光 純 薬)を 含 む0.1%Sabou- raud's dextrose agar(0.1%SDAと 田各), 1%de- xtrose添 加brain heart infusion agar (Difco, BHIAと 略), potato dextrose agar(Difco, PDA と略), water agar(agarはDifco, WAと 略)19) を使 用 した. この 実験 に 関 して の寒 天 濃 度 は, 全 て2.0%に 調 製 した. 温度, 菌 量 に 関 す る実 験 に は, 0.1%SDAの み を用 い た. 寒 天 濃 度 に 関 し て は, dextroseとpeptoneを0.1%SDAと 同 様 の 組 成 に し, 寒 天 濃 度 を0(液 体 培 地), 0.5, 1.0, 2.0, 4.0%に 調 製 した. 3. 菌 液 の 調 製 及 び培 養方 法 菌 液 の調 製 に は, 37℃, BHIA斜 面 培 地 で保 存 され て い る酵 母 形 を用 い, こ れ を さ ら に37℃, BHIA斜 面 培 地 で1週 間培 養 して用 い た. この 斜 面 培 地 に滅 菌 した1/15Mphosphate buffered salineを 駒 込 ピペ ッ トで注 ぎ, 数 回 ピペ ッ テ ィ ン グ を して酵 母 様 細 胞 を採 集 した. この酵 母 様 細 胞 浮遊 液 は, 6枚 の滅 菌 ガ ー ゼ を通 過 させ た後, 2,000 rpm 5分 間 の遠 沈操 作 を行 い, 上 清 を捨 て, 再 び1 /15M phosphate buffered salineに 懸 濁, 浮 遊 させ た. 菌 数 はThomaの 血 球 計 算 盤 を用 い て 数 え た. 菌 数 の 計 算 に際 し, 本 菌 は 酵 母 様 細 胞 に multiple buddingが み られ る こ と か ら, Kashino ら10,11), Zachariasら13), Hoyosら20)の 方 法 に準 じて, 複 数 細 胞 の 小 集 団(multiple buddingの 細 胞)もsingle cellも1 unitと して 数 え, 所 定 の濃 度(104～107units/ml)に 調 製 した. 培 地, 温 度, 寒 天 濃 度 に関 す る実 験 に は, 106units/mlを 用 い た. 培 養 方 法 は所 定 濃 度 の菌 液1mlに 各 培 地25ml を加 え, 直 径90mm, 厚 さ20mmの プ ラ ス チ ッ ク シ ャー レ内 で混 釈 し, 各 温 度(15, 25, 28, 30, 35 ℃)で 培 養 した. 観 察 期 間 は, 接 種 後20日 間 と した. 但 し, 培 地, 菌 量, 寒 天 濃 度 に関 す る実 験 は, 25℃で 行 った. こ れ らの実 験 に使 用 した 菌 の 生 菌 数 の算 定 は, 106units/mlの 菌 液1mlと0.1%SDA 25mlと を 混 釈 した シ ャー レを25℃で 培 養 し, 培 養3日 目, 5日 目 に小 片 を取 り, 300nuits中 の 菌 糸 形 発 育 の 認 め られ るunits数 を数 えた. 培 養3日 目 に 菌 糸 を発 育 させ て い るunitsは239/300(79.3%), 培 養5日 目で は249/300(83.0%)で あ っ た. 4. 厚 膜 胞 子 の 分 類 San-Blas 21)の 観 察 方 法 に準 じ, 0.1%SDAに お い て25℃ で3日 間 培 養 した と き に み られ る よ う な厚 膜 胞 子 未 形 成 の菌 糸 を 一(Fig. 1a), 同 様 条 件 で5日 間 培 養 した と き にみ られ る よ う な菌 糸 の 一 部 が膨 らん だ形 成 過 程 に あ る厚 膜 胞子 を ± (Fi g. 1b), 同様 条件 で7日 間培 養 し た と き に み られ る球 形 に発 達 し, 細 胞 壁 が厚 い, 成 熟 した厚 膜 胞 Jpn. J. Med. Mycol, Vol. 31 (No. 1), 1990 53 子を+(Fig. 1c)と した. 判定は厚膜胞子を形成 した部位が末梢性の場合も, 介在性 の場合 も, 上 記の基準に従った. 5. 寒天濃度 0.1%SDAに 対する寒天濃度を0.5, 1.0, 2 0, 及 び4.0%と した. 各 寒 天 濃 度 の 培 地 と106units /mlの 菌 液1mlを 混 釈 し, 25℃で 培 養 し た. ま た, 寒 天 を全 く含 ま な い培 地 と して, 0.1%dextro se, 0.1%peptoneを 含 むSabouraud's dextrose broth 100mZに106 units/mlの 菌 液4mlを 加 え, 25℃で14日 間 静・置 し た. さ ら に 同 様 の フ ラ ス コ をバ イ オ シ ェー カー(BR-30L: 太 洋工 業)に か け, 120rpm, 25℃で14日 間培 養 した. 6. 観 察 方 法 寒 天 小 片 また は培 養 液 を ラク トフェ ノー ル ・コ ッ トンブ ル ー で 固定 染 色 し, カバ ー グ ラ スで 圧 ぺ い, 鏡 検 した. 結 果 1. 培地 に よ る影 響 酵 母様 細 胞106nuitsをSDA, 0.1%SDA, BHIA, PDA, WAに て25℃で 培 養 す る と, いず れ の 培 地 にお いて も酵 母 様 細 胞 は発 芽 し, 菌 糸 が 発 育 し て きた. しか し, 厚 膜 胞 子 の 形 成 は培 地 に よ り形 成 時 期 と部 位 に差 異 が生 じた. SDAに お け る厚 膜 胞 子 は, 培 養7日 目 に形 成 が 始 ま り, 培 養10日 目以 後 に細 胞 壁 が 厚 く, 丸 く成 熟 した厚 膜 胞 子 とな り, そ の形 成 部 位 は 主 に, 介 在 性 で, 連 珠 状 で あ っ た(Fig. 2). 一 方, 0.1%SDAに お け る 厚 膜 胞 子 は, 培 養5 Fig. la. Hyphae with no chlamydospores in 0.1% SDA at 25C on day 3. Score-. x 400. Fig. lb. Hyphae with immature chlamydo- spores in 0.1% SDA at 251C on day 5. Score. X400. Fig. lc. Hyphae with mature chlamydospo- res in 0.1% SDA at 25C on day 7. Score +. Note the thickness of the cell wall. X400. 54 真菌誌 第31巻 第1号 平成2年 日目に形成が始 まり(Fig. 1b), 培養7日 目か ら 10日 目にかけては, 成熟 した形態を示 し, 主 に末 梢性に存在 した(Fig. 1c, 3). しかし, 培養14日 目には厚膜胞子及び菌糸のコットンブルーによる 細胞質の染色性が消失 し, 細胞壁の輪郭 を認め う るのみ となった. 一方, 菌糸を発芽 しないで酵母 形のまま残存 していた一部の細胞は, 細胞質の染 色性を維持 していた. BHIA, PDAに おける厚膜胞子 の形成 はSDA の場合 とほぼ同様に, 培養7日 目に出現 し, 培養 Fig. 2. Intercalary chlamydospores in Sabouraud's dextrose agar at 251C on day 10. X400. Fig. 3. Terminal chlamydospores in 0.1%SDA at 25C on day 7. x100. Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 31 (No. 1), 1990 55 10日 目に成熟 した形態 となり, 形成部位は介在性 であった. WAで は菌糸の発育は起 こるが, 厚膜 胞子の形成は起 こらず, 培養5日 目より菌糸の染 色性が消失 し始め, 培養10日 目ではほとんどの菌 糸 が輪 郭 の み とな っ た(Table 1). 2. 温 度 に よ る影 響 0.1%SDAに106 units/mlの 菌 液1mlを 混 釈 して15℃, 25℃, 28℃, 30℃, 35℃で 培 養 す る と, 35℃で 酵 母 形 発 育 を示 し, これ 以 外 の 温度 で は 菌 糸 形発 育 を示 した. 厚 膜 胞子 の形 成 は, 15℃で は10日 目 に菌 糸 の 末 梢 部 分 で 始 ま った. 25℃で7日 目, 28℃, 30℃ で は5日 目 に成 熟 した厚 膜 胞 子 が 形 成 さ れ た. し か し, こ れ らの 厚 膜 胞 子 はmultiple buddingに は至 ら なか った. 28℃, 30℃で は培 養7日 目 に 厚 膜 胞 子 及 び 菌 糸 の染 色 性 が消 失 した(Table 2). 3. 菌 量 に よ る影 響 濃 度104,105,5×105,106, 107units/mlの 菌 液1mlと0.1%SDA 25mlと 混 釈 し て25℃で 培 養 した とこ ろ, 104units/mlで は培 養10日 目 に 介 在 性 の厚 膜 胞 子 が 形 成 され 始 め, 14日 目 に は成 熟 した. 105,5×105units/mlで は培 養7日 目 よ り厚 膜 胞 子 の形 成 を認 め, そ れ ぞ れ10日 目 に は成 熟 した. 105units/mlで は 介 在 性 に厚 膜 胞 子 を 形 成 し, 5×105units/mlで は末 梢 性 に形成 した. しか し, 5×105units/mlで は培 養14日 目 に菌 糸 の染 色 性 が 消 失 した. 106units/mlで は培 養5日 目 よ り厚 膜 胞 子 の形 成 が 始 ま り, 7日 目 に末 梢 性 に成 熟 した厚 膜 胞 子 の形 成 を認 め, 14日 目 に は厚 膜 胞 子 及 び菌 糸 の染 色 性 が 消 失 した. 一 方, 107 units/mlで は菌 糸 形 発 育 は す る が, 厚 膜 胞 子 の 形 成 は ほ とん ど認 めず, 培 養10日 目に菌 糸 の 染 色 性 が消 失 した(Table 3). Table 1. Medium and chlamydospore forma- tion Temperature: 25t Cell population: 106 units/25ml of medium ND: Not detected Table 2. Temperature and chlamydospore formation Medium: 0.1% SDA, 25ml Cell population: 106 units/25ml of medium ND: Not detected YG: Yeast-like growth Table 3. Cell population and chlamydospore formation Medium: 0.1% SDA, 25ml Temperature: 25t ND: Not detected Table 4. Agar solidity and chlamydospore formation Medium: 0.1% SDA, 25ml Temperature: 25t ND: Not detected *: 0.1% Sabouraud's dextrose broth ...: Not observed 56 真 菌誌 第31巻 第1号 平成2年 4. 寒天濃度による影響 寒天濃度が0.5%の 場合, 培養後7日 目と10日 目に介在性の厚膜胞子を形成 した. 寒天濃度が1. 0%の 場合は, 2.0%と ほぼ同様で末梢性の成熟 し た厚膜胞子 を形成 したが, 1.0%の 場合10日 目に は菌糸の染色性が消失 した. さらに寒天濃度が4.0 %の 場合は, 菌糸伸長も遅 く, 10日 目のscoreを ±としたのち14日 目には菌糸の染色性が消失した. いずれの寒天濃度 においても, 培養後10日 ないし 14日 目に菌糸および厚膜胞子の染色性は消失した. 一方, 液体培地における厚膜胞子の形成 は, 静 置, 振 とういずれの培養方法において も, み られ なかった(Table 4). 考 察 Paracoccidioides brasiliensisの 厚膜胞子形成 は温度上昇とともに促進す るとPatinoら1)が 報 告 している. 今回, 我々の実験で も同様 に28℃, 30℃に おいて厚膜胞子の形成促進 を認めた. 一方, 菌糸形はsoil extractsを 用いて15℃で 培養 した 場合, 菌糸形発育 をするが, 酵母形 を同様 に培養 した場合の発育は起こらなかったとRestrepoら22) は報告 している. 我々の実験では15℃で 酵母形 から菌糸形への変換, および形成過程にある厚膜 胞子を認めた. Restrepoら23)に よれば本症の分 布は雨の多い, 年間平均気温が10-28℃の 地方 と言われており, 上記の結果 とあわせると日本に 移入された場合には, 気象条件の面か らは自然界 で生 き延びる可能性 もある. P. brasiliensisの厚膜胞子 は, 培養 日数が少な く, 培地の栄養が豊富で, 菌糸が成長 している時 にも形成 されると述べ られている21). 我々の実験 でも, SDA, 0.1%SDA, PDA, BHIAの いずれの 培地においても106units/mlの 菌液1mlと25ml の各培地を混釈 し25℃で 培養 した場合, 20日 以 内に厚膜胞子 を形成 したことから, 前報 を9)再 確 認するとともにこの見解に賛成 したい. しか しながら, SDAと0.1%SDAと では, 0.1 %SDAの 方が厚膜胞子形成が早期に起 こること, 0.03%SDA (dextrose, peptoneと もに0.03%, 寒天濃度 は2.0%. 未発表)や, 胞子形成がよく, 我々の示す厚膜胞子と類似のbulging arthroconi- diumを 形成 したとBustamante-Simonが 報告 し たWA 24)においては厚膜胞子は形成されなかった こと, 0.1%SDA中 でも接種菌量 に影響 を受 ける ことか ら, 接種菌1unitあ た りの栄養源の絶対量 が厚膜胞子形成に影響 していると推測された. 今 回の実験か らは, 栄養源の質の差 と厚膜胞子形成 との関係は明らかではなく, 今後の課題 としたい. またWAに おいて厚膜胞子形成が起こらなかっ た理由として, スライ ドカルチャー法 と混釈培養 法 との違いが挙げられる. 本菌は環境が厳 しいと きや形態変換のときに, 多量の菌がある場合 には 菌体に別の菌体が入 り込んで生 きながらえてい く 性質がある25,26). スライドカルチャー法では, あ る程度 まとまった菌塊 として培養されるので1unit 当 りの菌数が多 く, 隣接 した菌体 よ り栄養分を取 入れることも可能である. このように本菌 は接種 菌量によっても厚膜胞子形成が左右 されている. Kashinoら11), Goihman-Yahrら27), Parisら28) などによると, 本菌は, ある一定の実験系 には適 する菌量がある と述べている. 今 回の実験では, 菌量により厚膜胞子の形成部位や, 形成時期 も異 なった. 今後, 本菌の厚膜胞子形成や二形性 を研 究する場合 には, 菌量 も重要な鍵となろう. これらに加えて, 寒天濃度も厚膜胞子形成の一 要因となっていることも明らかになった. 0.1% SDAに おける末梢性の厚膜胞子形成 には, 1.0な い し2.0%の 寒天濃度が適していた. 0.5%や4.0 %の 場合 には, 厚膜胞子形成は不良で, 液体培養 では全 く形成されなかった事から, 厚膜胞子形成 には適当な硬度の支持体が必要 と推測された. Alexopoulos and Mims29)に よると, 厚膜胞子 は菌糸がス トレス状態に置かれた時や, 有害 な要 因が加わった時に形成 される一種の耐久形 とみな されている. しかし, P. brasiliensis, Pb-18株 の 厚膜胞子の形成は, 栄養状態が良 く, 室温でも起 こり, 単なる耐久形 と考えられない. またこれ ら の実験で形成 されたPb-18株 の厚膜胞子は35℃ に置 くと24時 間でmultiple buddingを して酵母 形に変わることから9), 病原性発現に重要な発育 形態 と推測される. Pb-18株 の厚膜胞子形成は, 単 に温度によるス トレスだけでなく, 培地, 菌量, 寒天濃度 などの 要因が複雑に絡み合って関与 していた. 文 献 1) Patino MM, Burgos LC and Restrepo A: Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 31 (No. 1), 1990 57 Effect of temperature on the mycelium to yeast transformation of Paracoccidioides brasiliensis. Sabouraudia 22: 509-511, 1984. 2) Salazar ME and Restrepo A: Mor pho- genesis of the mycelium to yeast trans formation in Paracoccidioides brasiliensis. Sabouraudia 23: 7-11, 1985. 3) Carbonell LM and Rodriguez J: Trans- formation of mycelial and yeast forms of Paracoccidioides brasiliensis in cultures and in experimental inoculations. J Bac- teriol 90: 504-519, 1965. 4) Miyaj i M and Nishimura K: Experimen- tal fungal infections. In Animal models in medical mycology. (Miyaji, M. ed.), p.12- 15, CRC Press Inc. Boca Raton, Florida, 1986. 5) Alexopoulos CJ and Mims CW: Glossary. In Introductory Mycology. Third edition, p.591, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1979. 6) Kendrick B.: Conclusions and recommen- dations. In Taxonomy of fungi imperfecti. p.258, University of Toronto Press., Tronto and Buffalo, 1971. 7) 山口英世, 宮治 誠, 西村和 子共著: 病原真 菌学. p. 378, 南山堂, 1987. 8) McEwen JG, Bedoya V, Patino MM, Sa- lazar ME and Restrepo AM: Experimental murine paracoccidioidomycosis induced by the inhalation of conidia. J Med Vet Mycol 25: 165-175, 1987. 9) Franco M, Sano A, Kera K, Nishimura K, Takeo K and Miyaji M: Chlamydospore formation by Paracoccidioides brasiliensis mycelial form. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 31: 151-157, 1989. 10) Kashino SS, Calich VLC, Burger E and Singer-Vermes, L. M.: In vivo and in vitro characteristics of six Paracoccidioides brasiliensis strains. Mycopathologia 92 173-178, 1985. 11) Kashino SS, Calich VLC, Singer-Vermes, LM, Abrahamsohn PA and Burger E: Grow- th curves, morphology and ultrastructure of ten Paracoccidioides brasiliensis iso- lates. Mycopathologia 99: 119-128, 1987. 12) Tani EM, Franco M, Paracoli MTS and Montenegro MR: Experimental pulmonary paracoccidioidomycosis in the Syrian ham- ster: morphology and correlation of lesions with the immune response. J Med Vet Mycol 25: 291-300, 1987. 13) Zacharias D, Ueda A, Moscardi-Bacchi M, Franco M and San-Blas G: A comparative histopathological, immunological and bio- chemical study of experimental intravenous paracoccidioidomycosis induced in mice by three Paracoccidioides brasiliensis isolates J Med Vet Mycol 24: 445-454, 1986. 14) Mota NGS, Viero RM, Rezkallah -Iwasso MT, Paracoli MTS, Soares A MV C and Montenegro MR: The effect of ketoconazole on experimental paracoccidioidomycosis in the Syrian hamster: immunological and histopathological study. Mycopsthologia 88: 141-144, 1984. 15) Defaveri J, Rezkallah-Iwasso MT and Fra- nco M: Experimental pulmonary paraco- ccidioidomycosis in mice: Morphology and correlation of lesions with humoral and cellular immune response. Mycopathologia 77: 3-11, 1982. 16) Paracoli MTS, Mota NGS and Montenegro MR: Experimental paracoccidioidomycosis in the Syrian hamstr: Morphology and orrelation of lesions with humoral and cell-mediated immunity. Mycopathologia 79: 7-17, 1982. 17) Rezkallah-Iwasso MT, Mota NGS, Gomes, MCG and Montenegro MR: Effect of leva- misole experimental paracoccidioidomyco- sis in the Syrian hamster: Immunologic and histopathologic correlation. Mycopa- thologia, 84: 171-180, 1984. 18) Kamegasawa A, Viero RM, Rezkallah- Iwasso MT and Franco MF: Protective effect of prior immunization on ocular paracoccidididomycosis in guinea pigs. Mycopathologia 103: 35-42, 1988. 19) Ellis JJ and Ajello L: An unusual source for Apophysomyces elegans and a method for stimulating sporulation of Saksenaea vasiformis. Mycologia 74: 144-145, 1982. 20) Hoyos GL, McEwen JG, Brummer E, Castaneda E, Restrepo A and Stevens DA: Chronic murine paracoccidioidomycosis effect of ketoconazole on clearance of Paracoccidioides brasiliensis and immune response. Sabouraudia 22: 419-426, 1984. 21) San-Bias F: Uitrastructure of spore for- mation in Paracoccidioides brasiliensis. 58 真菌誌 第31巻 第1号 平成2年 J Med Vet Mycol 24: 203-210, 1986. 22) Restrepo A, Moncada LH and Quintero M: Effect of hydrogen ion concentration and of temperature in the growth of P. bra- siliensis in soil extracts. Sabouraudia 7: 207-215, 1969. 23) Restrepo AM: The ecology of Paracocci- dioides brasiliensis a puzzle still unsolved. Sabouraudia 23: 323-334, 1985. 24) Bustamante-Simon B, McEwen JG, Taba- res AM, Arango M and Restrepo-Moreno, A: Characteristics of the conidia produced by the mycelial form of Paracoccidioides brasiliensis. Sabouraudia 23: 407-414, 1985. 25) Bedout C, Cano LE, Tabares AM, Van de Ven M and Restrepo A: Water as a sub- strate for the development of Paracoccidi- oides brasiliensis mycelial form. Mycopa- thologia 96: 123-130, 1986. 26) Carbonell LM: Ultrastructure of dimor- phic transformation in Paracoccidioides brasiliensis. J Bacteriol 100: 1076-1082, 1969. 27) Goiman-Yahr M, Pine L, Albornoz MC, Yarzabal L, De Gomez MH San Martin B, Ocanto A, Molina T and Convit J: Studies on plating efficiency and estimation of via- bility of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia, 71: 73-83, 1980. 28) Paris S, Duran-Gonzalez S and Mariat, F: Nutritional studies on Paracoccidioides brasiliensis: the role of organic sulfur in dimorphism. Sabouraudia, 23: 85-92, 1985. 29) Alexopoulos CJ and Mims CW: Chapte 27. Subdivision Deuteromycotina. In Intro- ductory Mycology, Third edition, p. 548, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1979. Chlamydospore formation of Paracoccidioides brasiliensis strain Pb-18 Ayako Sano, Marcello de Franco *, Kanji Takeo, Kazuko Nishimura and Makoto Miyaji Department of Fungal Infection, Research Center for Pathogenic Fungi and Microbial Toxicoses, Chiba University, 1-8-1 Inohana, Chiba, 280, Japan *Department Pathology, Faculty of Medicine, Sao Paulo State University, 18,610 Botucatu, Sao Paulo, Brazil Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis and is known as a temperature-dependent dimorphic fungus. Even though several routes of transformation from a mycelial to yeast forms have been repor- ted, the route via chlamydospore is the most important. At this time, conditions of temperature, nutrients, population of yeast cells and concentration of agar which influence chlamydospore formation are examined. P. brasiliensis strain Pb-18 was used in this experiment. Its yeast cells were mixed with agar media, and were cultured at various temperatures. The results were as follows: 1. At 25t, more chlamydospores were formed in poor media than in rich ones. 2. At over 25t, the number of chlamydospores increased in proportion to the increase in tem- perature. 3. Chlamydospores were most frequently formed when 106 yeast cell units were mixed with 25m1 of medium. 4. One and 2.0% agars were the most adequate concentrations for chlamydospore formation.