RESSALVA
Atendendo solicitação do(a)
autor(a), o texto completo desta
dissertação será disponibilizado
somente a partir de 25/07/2017.
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
(BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR)
ALTERAÇÕES NO CÉREBRO E NO VENTRÍCULO DE
ABELHAS Apis mellifera EXPOSTAS AO IMIDACLOPRIDO
ALINE FERNANDA CATAE
Julho - 2016
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO
Dissertação apresentada ao Instituto
de Biociências do Câmpus de Rio
Claro, Universidade Estadual
Paulista, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre
em Ciências Biológicas (Biologia
Celular e Molecular).
ALINE FERNANDA CATAE
ALTERAÇÕES NO CÉREBRO E NO VENTRÍCULO DE
ABELHAS Apis mellifera EXPOSTAS AO IMIDACLOPRIDO
Orientador: Prof. Dr. Osmar Malaspina
Co-Orientadora: Dra. Thaisa Cristina Roat
Rio Claro
2016
Dissertação apresentada ao Instituto
de Biociências do Câmpus de Rio
Claro, Universidade Estadual
Paulista, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre
em Ciências Biológicas (Biologia
Celular e Molecular).
Agradecimentos
Inicio os agradecimentos pela minha família, que sempre esteve presente em todos os
momentos, me apoiando e me dando forças para enfrentar todos os desafios e seguir em frente
em busca dos meus objetivos. Agradeço especialmente aos meus pais, Eliana e Carlos, que
com muito amor e esforço, batalharam ao longo de todos esses anos para que os meus sonhos
pudessem ser alcançados; e ao meu irmão Eduardo, pelo apoio em todas as fases de minha
vida.
Ao Murilo, meu porto seguro e abrigo, meu melhor amigo e meu amor. Por me ajudar
em todos os momentos, por me fazer acreditar que as coisas dariam certo e por tornar meus
dias mais felizes.
Ao CEIS e ao Departamento de Biologia pelo suporte oferecido e extremamente
importante para a realização desse trabalho.
À FAPESP, pela concessão da bolsa de estudo e suporte financeiro à pesquisa (Nº
Processos: 2014/14070-3; 2012/13370-8; 2012/50197-2).
Ao Prof. Dr. Osmar Malaspina, pela orientação desde o meu primeiro ano de
faculdade, quando eu ainda dava os meus primeiros passos na ciência. Tenho muito orgulho
de poder trabalhar ao seu lado, e agradeço pelos ensinamentos e pelas oportunidades ao longo
de todos esses anos (e já são 7 anos!).
À Thaisa Cristina Roat, minha co-orientadora e muito mais do que isso! Não tenho
nem palavras para descrever o quanto você foi importante nessa minha trajetória, me
apoiando em todos os momentos, acreditando e confiando em mim, me ensinando
diariamente. Você é muito especial e um grande exemplo pra mim! Obrigada por tudo!
À Roberta Cornélio Ferreira Nocelli, que também me acompanha desde o início e está
sempre por perto disposta a me ajudar, dar conselhos e discutir resultados. Você foi
fundamental para que eu conseguisse chegar até aqui!
Ao Laboratório de Biologia Estrutural e Zooquímica, em especial ao Prof. Dr. Mário
Sérgio Palma pela colaboração e auxílio com a técnica do MALDI. Agradeço também ao
Marcel Pratavieira e à Anally Menegasso por toda a disponibilidade e ajuda. Sem vocês a
realização desta pesquisa não teria sido possível.
Ao pessoal do LECA, em especial à Pamela, Pri Friol, Hellen, Tati, Jéssica, Adna,
Ana, Lucas, Patrícia, Isabella, Gabi, Elisangela, Daiana e Pri Socolowski, pela amizade e
companheirismo. É muito bom poder trabalhar com vocês!!
Ao Antônio Sérgio Pascon, fundamental para a realização dos experimentos. Sei que
não deve ser fácil nos aguentar com tantas coletas imensas e de última hora, por isso, muito
obrigada! Agradeço também aos técnicos: Gérson Mello Souza, Antônio Yabuki e Mônika
Iamonte por todo apoio e auxílio.
À Necis Miranda de Lima, sempre super eficiente, atenciosa e disposta a me ajudar.
Agradeço também ao pessoal do CBI 2009 principalmente à Elen e Lais por serem
amigas tão especiais e presentes até hoje em minha vida.
Às minhas amigas queridas Livinha e Bruna, por estarem sempre por perto, torcendo
por mim, ouvindo meus desabafos e angústias e comemorando minhas vitórias.
Agradeço a Deus por me dar forças e por permitir que eu realizasse mais esse sonho.
RESUMO GERAL
As abelhas Apis mellifera se destacam expressivamente no contexto econômico e ecológico
pelos produtos apícolas fornecidos como própolis, geleia real, mel, cera e apitoxina, e pela
extrema importância que o processo de polinização representa para o equilíbrio dos
ecossistemas. Estudos atuais indicam que algumas substâncias sintéticas, utilizadas no
controle de pragas na agricultura, podem estar envolvidas em casos de intoxicação de abelhas.
Os efeitos desses produtos podem não ser imediatamente notados, mas podem causar sérios
efeitos fisiológicos e comportamentais que acabam por comprometer a viabilidade da colônia,
de uma maneira geral. Diante do exposto, este trabalho teve como objetivos principais: avaliar
a toxicidade oral do imidacloprido para A. mellifera por meio da determinação da
concentração letal média (CL50), e analisar os efeitos de uma concentração subletal (CL50/100)
no intestino e no cérebro por meio de de microscopia eletrônica de transmissão, bem como na
distribuição de proteínas no cérebro, por meio da técnica do MALDI-Imaging. O valor da
CL50 estabelecido foi de 1,4651 ng imidacloprido/μL de dieta. A exposição à CL50/100 (0,0146
ng imidacloprido/μL alimento) causou alterações bastante significativas nas células do
ventrículo, principalmente a partir do quarto dia de exposição, como redução do tamanho do
núcleo, condensação cromatínica, alterações mitocondriais e aumento de vacúolos digestivos
e citoplasmáticos. No cérebro, destacaram-se os danos mitocondriais, espaçamento entre as
células, núcleos irregulares e dilatação do espaço perinuclear. Essa concentração subletal
afetou também a distribuição espacial de diversas proteínas no cérebro de abelhas, envolvidas
principalmente com processos de sinapses, suprimento de oxigênio, estresse químico e
oxidativo, degeneração neuronal e aprendizado e memória, demonstrando que esse inseticida
causa alterações bioquímicas que podem inviabilizar funções neuronais importantes.
Palavras-chave: Inseticida. Toxicidade. Ultraestrutura. Espectrometria. Proteína.
ABSTRACT
The bees Apis mellifera stand out significantly in the economic and ecological context for
products supplied as propolis, royal jelly, honey, beeswax and venom, and because the
extreme importance that the pollination process is for the equilibrium of ecosystems. Current
studies indicate that some synthetic substances used to control pests in agriculture may be
involved in cases of intoxication of bees. The effects of these products may not be
immediately noticeable, but they can cause serious physiological and behavioral effects that
can compromise the viability of the colony. Given the above, this work had as main
objectives: to evaluate the oral toxicity of imidacloprid to A. mellifera through the
determination of the lethal concentration (LC50), and analyse the effects of a sublethal
concentration (LC50/100) in the midgut and brain through transmission electron microscopy as
well as the distribution of proteins in the brain, by MALDI-Imaging technique. The LC50
value established to imidacloprid was 1.4651 ng/μL diet. The exposure to LC50/100 (0.0146 ng
imidacloprid/μL diet) caused quite significant alterations in ventricular cells, especially after
the fourth day of exposure, such as reduction of the size of the nucleus, chromatin
condensation, mitochondrial alterations and increased of digestive and cytoplasmic vacuoles.
In the brain, it was possible to observe mitochondrial damages, spacing among cells, irregular
nuclei and dilation in the perinuclear space. This sublethal concentration also affected the
spatial distribution of several proteins in the brains of bees, mainly involved in synapse
processes, oxygen supply, chemical and oxidative stress, neuronal degeneration, learning and
memory, demonstrating that this insecticide cause biochemical changes that can derail
important neuronal functions.
Keywords: Insecticide. Toxicity. Ultrastructure. Spectrometry. Proteins.
Sumário
1 INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................................................ 8
2 OBJETIVOS .......................................................................................................................................... 13
3 CAPÍTULO 1 ......................................................................................................................................... 14
3.1 RESUMO ............................................................................................................................................ 15
3.2 INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 16
3.3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................... 18
3.3.1 MATERIAL BIOLÓGICO ............................................................................................................... 18
3.3.2 COLETA E ACONDICIONAMENTO DAS ABELHAS ................................................................ 18
3.3.3 EXPOSIÇÃO CONTÍNUA À CONCENTRAÇÃO SUBLETAL DO IMIDACLOPRIDO............. 19
3.3.4 BIOENSAIOS DE INTOXICAÇÃO DAS ABELHAS .................................................................... 20
3.3.5 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO .................................................................. 20
3.4 RESULTADOS ................................................................................................................................... 21
3.4.1 TOXICIDADE AGUDA ................................................................................................................... 21
3.4.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO .................................................................. 22
3.4.2.1 VENTRÍCULO .............................................................................................................................. 22
3.4.2.2 CÉREBRO: CÉLULAS DE KENYON DOS CORPOS PEDUNCULADOS .............................. 25
3.5 DISCUSSÃO ....................................................................................................................................... 28
3.6 REFERÊNCIAS ................................................................................................................................. 32
4 CAPÍTULO 2 ......................................................................................................................................... 35
4.1 RESUMO ............................................................................................................................................ 36
4.2 INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 37
4.3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................... 39
4.3.1 EXPOSIÇÃO CONTÍNUA A CONCENTRAÇÃO SUBLETAL DE IMIDACLOPRIDO ............ 39
4.3.2 TÉCNICA DE IMAGEAMENTO QUÍMICO (MALDI-IMAGING) ............................................. 40
4.3.3 IDENTIFICAÇÕES DE PROTEÍNAS ........................................................................................... 42
4.3.4 PROCESSAMENTO DOS DADOS DE IMAGEAMENTO ESPECTRAL ................................... 42
4.3.5 ANÁLISE DAS IMAGENS – CRIAÇÃO DE MAPAS DE CONTORNOS.................................... 43
4.4 RESULTADOS ................................................................................................................................... 45
4.5 DISCUSSÃO ....................................................................................................................................... 61
4.6 REFERÊNCIAS ................................................................................................................................. 71
5 DISCUSSÃO GERAL ........................................................................................................................... 79
6 CONCLUSÕES GERAIS ..................................................................................................................... 81
7 REFERÊNCIAS .................................................................................................................................... 82
8
1 INTRODUÇÃO GERAL
A abelha A. mellifera africanizada, introduzida no Brasil em 1839, é resultante de um
cruzamento entre Apis mellifera scutellata (originária da África), Apis mellifera mellifera
(originária do norte da Europa), Apis mellifera ligustica (originária da Itália e norte da
Iugoslávia) e Apis mellifera iberica (provinda da Europa Ocidental) (RUTTNER, 1988).
Essa espécie é hoje, uma das mais estudadas, possuindo grande importância
econômica pelo fornecimento de produtos apícolas de alto valor agregado tais como, própolis,
geleia real, mel, cera e apitoxina (CARVALHO; MARCHINI; ROS, 1999; KEVAN, 1999).
Elas se destacam também por sua importância cultural através dos produtos oferecidos com
finalidades alimentícia, religiosa, cosmética e medicinal (COSTA-NETO, 1998;
RODRIGUES, 2006).
As abelhas africanizadas apresentam maior eficiência na coleta de alimentos, maior
produtividade de mel, maior eficiência na transmissão de informações e comportamento de
forrageamento mais longo durante o dia, quando comparadas às abelhas europeias (KERR et
al., 1970; MALASPINA, STORT, 1987).
Por utilizarem os recursos florais, especialmente néctar e pólen, como fonte de
alimento e energia, as abelhas são extremamente importantes para o processo de polinização
de áreas nativas e cultivadas (KEARNS; INOUYE, 1997; NOGUEIRA-NETO, 1997).
A polinização é um processo essencial para a reprodução cruzada e consequente
manutenção da diversidade nas plantas, aumentando desta maneira, a produtividade de
culturas importantes para a alimentação (EARDLEY et al., 2006; KLEIN et al., 2007).
Uma pesquisa desenvolvida pela FAO (Organização das Nações Unidas para
Alimentação e Agricultura) (2015) mostra a eficácia do uso de abelhas no processo de
polinização em sete países. No Brasil, as culturas de algodão e tomate foram as que
apresentaram suas produtividades aumentadas significativamente pela visita das abelhas.
9
Alguns registros mostram que 73% das espécies vegetais de interesse agrícola mundial são
polinizadas pelas abelhas, 19% por moscas, 6,5% por morcegos, 5% por vespas, 5% por
besouros, 4% por aves e 4% por borboletas e mariposas (FAO, 2004).
Fatores como ampla extensão territorial, variabilidade climática e de flora fazem do
Brasil um país de destaque no cenário agrícola, já que, diferentemente dos demais países, as
colheitas ocorrem ao longo de praticamente o ano todo (MARCHINI; SODRÉ; MORETI,
2004).
As áreas contínuas cultivadas vêm sendo ampliadas a cada dia em busca do aumento
na produção agrícola e este crescimento da agricultura tornou-se cada vez mais dependente do
uso de agrotóxicos para a eliminação de pragas agrícolas. Como resultado, o consumo anual
de inseticidas no Brasil tem sido superior a 300 mil toneladas. Expresso em quantidade de
ingrediente ativo, é consumido anualmente no país cerca de 130 mil toneladas, representando
um aumento no consumo de inseticidas de 700% nos últimos quarenta anos, enquanto a área
agrícola aumentou 78% nesse período (SPADOTTO et al., 2004).
O Brasil começou a utilizar os agrotóxicos em grande escala a partir dos anos 70, não
havendo neste período, maiores preocupações relacionadas ao seu emprego (EMBRAPA,
2014). Seu uso, nos últimos anos, aumentou de forma expressiva. No cenário mundial, o
crescimento desse mercado foi de 93%, enquanto que no Brasil, é estimado um aumento de
190% (CARNEIRO et al., 2012). O consumo na safra de 2010/2011 foi de 936 mil toneladas,
movimentando desta maneira, 8,5 bilhões de dólares entre dez empresas líderes desse
segmento no país (ANVISA, 2013). Este uso de inseticidas vem provocando diversos
impactos sobre o ambiente, gerando resíduos no solo, na água, no ar e nas plantas
(FERNÁNDEZ et al., 2001).
O fenômeno conhecido como “Colony Collapse Disorder” (CCD) vem sendo alvo de
inúmeros trabalhos, pois dados apontados por apicultores indicam perda de até 75% das
10
colônias de A. mellifera (STOKSTAD, 2007; NEUMANN; CARRECK, 2010). Um dos
fatores mais apontados como provável causador do CCD relatado por apicultores é o uso
indiscriminado de agrotóxicos (CHAUZAT et al., 2006; HO; CUMMINS, 2007; OLDROYD,
2007; YANG et al., 2008).
O sumiço de abelhas é um motivo de preocupação também no Brasil, principalmente
nas regiões Sudeste e Centro-Oeste. Este fenômeno pode estar relacionado com infecções por
protozoários ou fungos e com o intenso uso de inseticidas nas plantações (GUIMARÃES,
2007; WESTIN, 2007).
Muitos relatos de apicultores alertam sobre a mortalidade de abelhas. No interior de
São Paulo, por exemplo, diversas cidades já apresentam tal problema, como Araras, Boa
Esperança do Sul, Brotas, Mogi Mirim, Piracicaba, Pirassununga, Rio Claro, Santa Rita do
Passa Quatro, São Carlos e Tabatinga (MALASPINA; SOUZA, 2008).
O desmatamento dos habitats naturais das abelhas faz com que essas ampliem suas
atividades de forrageamento para áreas agrícolas, o que resulta numa maior exposição aos
inseticidas utilizados nas culturas para o controle de insetos-praga (MALASPINA; SILVA-
ZACARIN, 2006). Além disso, a deriva ocasionada pelas correntes de vento, que pode levar
os agrotóxicos para apiários, meliponários ou colônias silvestres próximos aos locais de
aplicação desses compostos, é um fator preocupante para as abelhas (KERR et al., 2001).
A EMBRAPA realizou estudos que mostram o alto risco da pulverização aérea, já que
esse procedimento é responsável por deixar 32% dos agrotóxicos pulverizados retidos nas
plantas, 49% no solo, sendo que 19% sofrem deriva para outras áreas nos arredores do local
alvo da aplicação (CHAIM, 2004).
Diversos agrotóxicos possuem ação sistêmica, tendo a capacidade de se translocar
através da seiva de uma parte da planta para outra, podendo ser detectado em todos os tecidos
vegetais (MARICONI, 1983; SCHMUCK et al., 2001; GALLO et al., 2002; BONMATIN et
11
al., 2003). Com base nisto, uma forma de contaminação das abelhas se dá através da presença
de ingredientes ativos e de seus metabólitos no pólen e no néctar (SCHMUCK; NAUEN;
EBBINGHAUS-KINTSCHER et al., 2003; RORTAIS et al., 2005)
As abelhas campeiras, apesar de estarem em contato direto com a área externa à
colônia, não são as únicas a se exporem aos inseticidas. Os indivíduos que desenvolvem suas
atividades dentro da colmeia, como as larvas, também podem se contaminar ao entrarem em
contato com pólen e néctar contaminados com agrotóxicos (RORTAIS et al., 2005).
Os efeitos dos agrotóxicos sobre as abelhas, em muitos casos, não são imediatos, já
que pequenas doses podem não causar a morte das abelhas, entretanto, podem resultar em
mudanças fisiológicas e comportamentais, tais como, desorientação e diminuição da atividade
de forrageamento (GUEZ; ZHANG; SRINIVASAN, et al., 2005; van ENGELSDORP;
MEIXNER, 2010).
Os inseticidas neonicotinoides são neurotóxicos e se destacam dentre os diversos
grupos de inseticidas, por serem muito utilizados para o controle de pragas (TOMIZAWA;
CASIDA, 2003; ELBERT et al., 2008). Essa classe de inseticidas substituiu os compostos
organofosforados e metilcarbamatos, que tiveram seu uso restrito devido à toxicidade em
mamíferos e pela diminuição da eficiência dos mesmos no controle de pragas agrícolas
(TOMIZAWA; CASIDA, 2003).
Os neonicotinoides são agonistas da acetilcolina e ligam-se aos receptores nicotínicos
de acetilcolina dos insetos (nAChRs), agindo principalmente nas subunidades α do receptor
(BUCKINGHAM et al., 1997), localizados nos neurônios pós-sinápticos (BUCKINGHAM et
al., 1997; SUCHAIL; DEBRAUWER; BELZUNCES, et al., 2004). Ao contrário da
acetilcolina, que é hidrolisada pela acetilcolinesterase, esse composto não é degradado
imediatamente, portanto, os impulsos nervosos são transmitidos de forma contínua e levam a
hiperexcitação do sistema nervoso do inseto (GALLO et al., 2002). A afinidade entre os
12
receptores colinérgicos e os neonicotinoides é relativamente maior em insetos do que em
mamíferos, tornando-os mais tóxicos para o primeiro grupo (CARVALHO, 2008).
Os mais relevantes inseticidas dessa classe são o acetamiprido, o tiametoxam e o
imidacloprido (YAMAMOTO; CASIDA, 1999; NAUEN; BRETSCHNEIDER, 2002;
TOMIZAWA; CASIDA, 2003). O imidacloprido é amplamente utilizado no Brasil para o
controle de pragas aéreas e do solo das culturas de cana-de-açúcar, algodão, café e citrus. Este
inseticida, que é conhecido comercialmente como Confidor, Connect, Cropstar, Evidence,
Gaucho, Kohinor, Premier, Provado, Warrant e Winner (BRASIL, 2008), é bastante utilizado
no tratamento de sementes, do solo e de plantações, matando os insetos via ingestão ou
contato. Apresenta alta tendência de sofrer lixiviação e dissipação no ambiente devido sua
baixa adsorção em matéria orgânica do solo e elevada suscetibilidade em água (FOSSEN,
2006). A olefina e o 5-hidroxiimidaclopride são alguns dos metabólitos resultantes da
degradação desse composto na planta, sendo estes, tóxicos ao sistema nervoso dos insetos
(SUCHAIL; GUEZ; BELZUNCES et al., 2001).
Seu uso, desde a sua introdução em meados dos anos 90, tem aumentado
consideravelmente, sendo considerado atualmente, o inseticida possivelmente mais usado no
controle de pragas e doenças agrícolas (FREITAS; PINHEIRO, 2010; BLACQUIÈRE et al.,
2012).
81
Este compromentimento demonstra que não houve desintoxicação das células nervosas, já que
as proteínas envolvidas neste processo, como a GST e a P450, não apresentaram grandes
alterações em suas expressões relativas. Além disso, as HSPs que podem desempenhar papel
protetivo nas células frente a diversos fatores estressantes, também não apresentaram
alterações na expressão.
As alterações referentes à expressão relativa de proteínas foram geralmente observadas
nas regiões dos corpos pedunculados, dos lobos ópticos e dos lobos antenais. Tais estruturas
estão relacionadas com o processamento de informações no sistema nervoso, captação de
estímulos visuais e recepção de estímulos olfatórios, respectivamente. Dessa forma, as
alterações promovidas pelo imidacloprido estão relacionadas com prováveis danos na
memória, aprendizagem e orientação, o que se confirma pela alteração na expressão de
proteínas envolvidas nesses processos (proteína quinase C, Leonardo 14-3-3, actina 5C e
transferrina), bem como pelas alterações ultraestruturais observadas nas células de Kenyon
dos corpos pedunculados.
6 CONCLUSÕES GERAIS
A partir dos resultados obtidos nesse trabalho conclui-se que:
- A CL50 do imidacloprido para abelhas A. mellifera africanizada é de 1,46 ng
imidacloprido/μL de dieta;
- A CL50/100 promoveu alterações ultraestruturais nas células do ventrículo e do
cérebro;
- A CL50/100 afetou a distribuição de proteínas específicas no cérebro de abelhas
indicando presença de estresse químico, alterações no suprimento de oxigênio, em sinapses
nervosas, degeneração neuronal e deficiência em processos de aprendizagem e memória;
82
- As regiões dos corpos pedunculados, dos lobos ópticos e dos lobos antenais foram as
que mais apresentaram alterações de expressão relativa referentes às proteínas avaliadas, não
havendo, entretanto, um padrão de alterações nessas estrututras, mesmo a partir da análise de
proteínas pertencentes a um mesmo processo biológico.
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