RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 27/07/2022. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Biociências de Botucatu Programa de Pós-Graduação em Farmacologia e Biotecnologia Juliana de Jesus Andrade Papel das proteínas do plasma seminal SVS2 e SVS3 sobre a motilidade de espermatozoides de camundongos: repercussões para a função espermática e fertilidade Botucatu-SP 2020 Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Biociências de Botucatu Programa de Pós-Graduação em Farmacologia e Biotecnologia Juliana de Jesus Andrade Papel das proteínas do plasma seminal SVS2 e SVS3 sobre a motilidade de espermatozoides de camundongos: repercussões para a função espermática e fertilidade Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Farmacologia e Biotecnologia do Instituto de Biociências de Botucatu Candidata: Juliana de Jesus Andrade Orientador: Prof. Dr. Erick José Ramo da Silva Botucatu-SP 2020 Palavras-chave: Espermatozoide; Glândula seminal; Motilidade; SVS2; SVS3. Andrade, Juliana de Jesus. Papel das proteínas do plasma seminal SVS2 e SVS3 sobre a motilidade de espermatozoides de camundongos : repercussões para a função espermática e fertilidade / Juliana de Jesus Andrade. - Botucatu, 2020 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: Erick José Ramo da Silva Capes: 21000000 1. Espermatozoides. 2. Proteínas de plasma seminal. 3. Motilidade espermática. 4. Camundongos como animais de laboratório. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. Auxílio Financeiro CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Processo #2015/08227-0) Aos meus pais, Amadeu e Elenice, por serem a minha maior fonte de inspiração e coragem. E meu esposo Gilmar por ser meu porto seguro. AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus por me dar força e coragem para vencer todas as dificuldades e obstáculos. À minha mãe Elenice por todo apoio e carinho nas horas mais difíceis, e ao meu pai Amadeu (in memorian) que sempre acreditou que eu seria capaz. Ao meu esposo Gilmar pelo grande apoio, força e por compreender minha ausência. Aos meus irmãos e sobrinhos pelo incentivo. Aos meus grandes amigos Noemia Partelli Mariani, Tamiris Rocha Fanti Raimundo, Alan Andrew dos Santos Silva, Alexandre Dorth Andrade, Hélio Kushima, Priscila Almeida, Leonardo Rokita, Gledson Miranda, Isabela Andrade e Janete por todo apoio, ensinamentos e por tornarem meus dias mais alegres e me mostrarem o verdadeiro sentido de amizade e trabalho em equipe. Ao meu orientador Erick José Ramo da Silva por ser um excelente profissional, por todo ensinamento, pela paciência e principalmente por acreditar em mim e me dar todo apoio para a conclusão de um sonho. A todos os professores e funcionários do departamento de Biofísica e Farmacologia do Instituto de Biociências da Unesp/Botucatu, em especial ao professor Carlos Alan Candido Dias Junior, assim como suas alunas Ediléia Souza, Gabriela Zochio e Letícia Polônio pela contribuição para a minha formação e ótima convivência. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 e pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) - Processo #2015/08227-0. I RESUMO Proteínas do plasma seminal possuem o importante papel de regular a função espermática, sendo fundamentais para a fertilidade masculina. Em primatas e roedores, as proteínas mais abundantes do plasma seminal são as semenogelinas (SEMG1 e SEMG2) e as SVS’s (SVS2 e SVS3; seminal vesicle-secretory proteins), respectivamente, as quais possuem similaridades funcionais e estruturais. Essas proteínas fazem parte de uma família conhecida como REST (Rapidly-evolving seminal vesicle-transcribed), sendo abundantemente expressas pela glândula seminal de mamíferos. A SEMG1 interage com o espermatozoide ejaculado e inibe a sua motilidade, capacitação e reação acrossômica. Por sua vez, a SVS2 também inibe a capacitação e a reação acrossômica no espermatozoide murino, sendo estes efeitos inibitórios potencializados pela SVS3. Entretanto, pouco se sabe sobre os efeitos da SVS2 e SVS3 na motilidade espermática. Neste estudo, testamos a hipótese que a SVS2 inibe a motilidade espermática em camundongos, e que a SVS3 facilita esses efeitos inibitórios. Também caracterizamos o perfil de expressão e distribuição da SVS2 e SVS3 (RNAm e proteína) no sistema reprodutor de camundongos machos, bem como sua regulação por androgênios. Para isto, processamos órgãos reprodutivos para ensaios de RT-PCR, RT-qPCR, Western blot e imuno-histoquímica, e espermatozoides epididimários para ensaios de imunofluorescência após incubação com a SVS2 e SVS3A murinas recombinantes (SVS2m e SVS3m) ou fluído da glândula seminal. Além disso, para avaliar o impacto da SVS2m e SVS3Am sobre a motilidade espermática, incubamos espermatozoides da cauda do epidídimo com diferentes concentrações de SVS2m e SVS3m recombinantes, isoladas ou em associação, e avaliamos a motilidade pela plataforma CASA (computer-assisted sperm analysis). Nossos resultados demonstraram que SVS2 e SVS3 (RNAm e proteína) são diferencialmente expressos em tecidos reprodutivos de camundongos machos. Os transcritos Svs2 e Svs3 foram detectados na glândula seminal, mas também em outros tecidos do sistema reprodutor, como cauda do epidídimo, ducto deferente, próstata ventral, e no testículo (somente Svs3). Os resultados de Western blot revelaram a expressão da SVS2 pela presença de uma banda única, com massa molecular aparente de 45 kDa na glândula seminal (tecido e fluido). Na cauda do epidídimo, entretanto, observamos a presença de uma banda menor, de ~11 kDa. Para a SVS3, observamos a presença de uma banda de 35 kDa no fluído da glândula seminal. Já em amostras de testículo, cauda do epidídimo e glândula seminal, observamos a presença de múltiplas bandas com massas moleculares aparentes de 40-43, 28-29 e 14 kDa, respectivamente. Análises de RT-qPCR e imuno- histoquímica utilizando amostras da glândula seminal de animais em diferentes fases da maturação sexual ou submetidos à orquiectomia bilateral com ou sem reposição hormonal com testosterona (8 mg/kg, s.c.) demonstraram a correlação positiva entre a expressão da SVS2 e SVS3 com os níveis plasmáticos de androgênios. Tanto a SVS2m quanto a SVS3m interagiram com espermatozoides maduros, apresentando sítios de ligação específica na cabeça e flagelo. Observamos que a SVS2m inibiu os parâmetros de motilidade e cinemática espermática de forma dependente da concentração (IC50 = ~5 µM) e tempo de incubação, os quais afetaram a motilidade progressiva e hiperativada. Por outro lado, a SVS3m apresentou apenas efeitos modestos sobre a motilidade hiperativada. Em adição, a SVS3m não demonstrou efeito sinérgico sobre os efeitos inibitórios da SVS2m sobre a motilidade de espermatozoides de camundongos. Em conjunto, nossos dados demonstram que a SVS2 é um fator endógeno do plasma seminal de camundongos com atividade inibitória da motilidade espermática. Considerando que a SVS2 é a ortóloga murina à SEMG1 humana, propomos a existência de mecanismos conservados para o controle da motilidade espermática a partir de proteínas oriundas do plasma seminal em primatas e roedores. Nossas descobertas abrem novas fronteiras para o estudo do papel das proteínas da família REST na regulação das funções espermáticas, principalmente nos parâmetros de motilidade espermática, bem como sua exploração como alvos para contracepção masculina, utilizando modelos murinos. II ABSTRACT Seminal plasma proteins play important roles on the regulation of sperm function and male fertility. In primates and rodents, the most abundant proteins in the seminal plasma are the semenogelins (SEMG1 and SEMG2) and seminal vesicle-secreted proteins (SVS2 and SVS3), respectively, which display functional and structural similarities. These proteins are members of the REST (Rapidly-evolving seminal vesicle-transcribed) family, which are abundantly expressed in the seminal vesicles. SEMG1 interacts with the ejaculated spermatozoa, thus inhibiting its motility, capacitation and acrosomal reaction. In turn, SVS2 inhibits capacitation and acrosome reaction in murine spermatozoa. SVS2 inhibitory effects on mouse sperm capacitation and acrosome reaction are potentiated by SVS3. However, little is known about the effects of SVS2 and SVS3 on sperm motility. In this study, we tested the hypothesis that SVS2 inhibits mouse sperm motility, and that SVS3 facilitates these inhibitory effects. We also characterized the expression and distribution profile of SVS2 and SVS3 (mRNA and protein) in the male mouse reproductive tract, as well as their regulation by androgens. We processed reproductive tissues for RT-PCR, qPCR, Western blot and immunohistochemistry assays, and epididymal spermatozoa incubated with recombinant murine SVS2 and SVS3A (SVS2m and SVS3m) or seminal vesicle fluid for immunofluorescence assays. To assess the impact of SVS2m and SVS3m on sperm motility, we incubated spermatozoa with different concentrations of recombinant SVS2m and SVS3m, isolated or in combination, and evaluated their motility parameters using the computer-assisted sperm analysis (CASA). Our results demonstrated that SVS2 and SVS3 (mRNA and protein) are differentially expressed in male mouse reproductive tissues. Svs2 and Svs3 transcripts were detected in the seminal vesicle, but also testis (only Svs3), cauda epididymis, vas deferens and ventral prostate. Western blot results revealed the expression of SVS2 by the presence of a single band, with apparent molecular mass of 45 kDa in the seminal vesicle (tissue and fluid). In cauda epididymis protein extracts, however, we observed the presence of a smaller band with apparent molecular mass of 11 kDa. For SVS3, we observed the presence of a 35-kDa-band in the seminal vesicle fluid. In testis, epididymis and seminal vesicle samples, however, we observed the presence of multiple bands with apparent molecular masses of 40-43, 28-29 and 14 kDa depending on the tissue analyzed. RT- qPCR and immunohistochemistry analyzes using seminal vesicle samples from animals at different stages of sexual maturation or subjected to bilateral orchiectomy with or without hormone replacement with testosterone (8 mg/kg, s.c.) demonstrated that both Svs2 and Svs3 are androgen-dependent genes. Both SVS2m and SVS3m bound to the head and flagellum of mature spermatozoa. We observed that SVS2m inhibited sperm motility and kinematics in a concentration- (IC50 = ~5 µM) and time-dependent manner, thus leading to an inhibition of progressive motility and hyperactivation. On the other hand, SVS3m displayed modest effects on hyperactivated, but not progressive, motility. Furthermore, SVS3m did not demonstrate a synergistic effect on the inhibitory effects of SVS2m on mouse sperm motility. Altogether, our data demonstrate that SVS2 is a seminal plasma-derived inhibitory factor of mouse sperm motility. Since SVS2 is the murine orthologue of human SEMG1, we propose the existence of conserved mechanisms for the control of sperm motility endogenous to the seminal plasma in primates and rodents. Our findings open new frontiers for the study on the roles of REST proteins on the regulation of sperm functions, which could be explored for the development of new targets for male contraception, using murine models. III LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS AR: receptores de andrógenos ACs: adenilato ciclase solúvel AMPc: adenosina monofosfato cíclico BSA: albumina de soro bovina CASA: computer-assisted sperm analysis, do inglês Ct: cycle threshold, do inglês EPPIN: Inibidor de protease epididimário iRMI: índice de inibição relativa da motilidade mAChR: Muscarinic acetylcholine receptors, do inglês PKA: protein Kinase A, do inglês Ppia: ciclofilina A PSA: antígeno prostático específico REST: Rapid evolving seminal-vesicle-transcribed, do inglês Rps18: proteína ribossomal S18 SEMG1: semenogelina-1 SEMG2: semenogelina-2 SVS1: seminal vesicle secretory protein 1, do inglês SVS2: seminal vesicle secretory protein 2, do inglês SVS3A: seminal vesicle secretory protein 3A, do inglês SVS3B: seminal vesicle secretory protein 3B, do inglês SVS4: seminal vesicle secretory protein 4, do inglês SVS5: seminal vesicle secretory protein 5, do inglês SVS6: seminal vesicle secretory protein 6, do inglês SVS7: seminal vesicle secretory protein 7, do inglês TCEP: tris(2-carboxietil) fosfina Sumário 1. Introdução .............................................................................................................................. 7 1.1. Espermatozoides ............................................................................................................. 7 1.2. Processos pós-testiculares de maturação espermática: aquisição de motilidade e capacidade de fertilização ..................................................................................................... 12 1.3. Glândula seminal ........................................................................................................... 16 1.4. Proteínas REST’s (Rapidly-evolving seminal vesicle-transcribed) .................................. 18 2. Objetivos .................................................................................................................... 25 2.1. Objetivo geral ................................................................................................................. 25 2.2. Objetivos específicos ..................................................................................................... 25 3. Material e métodos ..................................................................................................... 26 3.1. Estratégias experimentais .............................................................................................. 26 3.2. Reagentes ..................................................................................................................... 28 3.3. Animais .......................................................................................................................... 30 3.4. Orquiectomia bilateral .................................................................................................... 30 3.5. Coletas dos órgãos ........................................................................................................ 31 3.6. Extração do RNA total .................................................................................................... 31 3.7. Reação de transcriptase reversa (RT) e reação de polimerização em cadeia convencional (PCR) .............................................................................................................. 32 3.8. Ensaios de PCR em tempo real (qPCR) ........................................................................ 32 3.9. Ensaios Western blot ..................................................................................................... 35 3.10. Ensaios de imuno-histoquímica.................................................................................... 36 3.11. Ensaios de Imunofluorescência.................................................................................... 37 3.12. Ensaios de análise da motilidade espermática ............................................................. 38 3.13. Análise estatística ........................................................................................................ 41 4. Resultados...............................................................................................................................42 4.1. Os genes Svs2 e Svs3 são diferencialmente expressos em tecidos reprodutivos de camundongos machos .......................................................................................................... 42 4.2. A expressão dos genes Svs2 e Svs3 é diferencialmente regulada por androgênios na glândula seminal ................................................................................................................... 45 4.3. SVS2 nativa e recombinante e SVS3A recombinante interagem com espermatozoides maduros................................................................................................................................ 49 4.4. SVS2 murina recombinante inibe a motilidade de espermatozoides de camundongos in vitro ...................................................................................................................................... 52 4.5. SVS3A murina recombinante reduz parâmetros de vigorosidade, mas não afeta a motilidade de espermatozoides de camundongos ................................................................. 54 4 6. A SVS3A recombinante não possui efeito sinérgico sobre os efeitos inibitórios da SVS2 recombinante sobre a motilidade espermatozoides de camundongos .................................. 57 5. Discussão ................................................................................................................... 60 6. Conclusão ................................................................................................................... 70 7. Referências bibliográficas ........................................................................................... 71 Anexo I ........................................................................................................................................ I Anexo II ...................................................................................................................................... II Anexo III .................................................................................................................................... III 1. Introdução 7 1. Introdução 1.1. Espermatozoides Os espermatozoides são células flageladas, altamente especializadas, que apresentam características morfológicas e funcionais únicas, as quais os tornam capazes de entregar o material genético masculino ao oócito durante a reprodução (Eddy, 2006). Em mamíferos, os espermatozoides são as únicas células especializadas produzidas pelo macho cujo objetivo final é alcançado no organismo da fêmea (Freitas et al., 2017). A produção dos espermatozoides se dá no epitélio dos túbulos seminíferos e envolve uma série de processos de divisão celular mitótica e meiótica e de citodiferenciação, conhecida como espermatogênese (Figura 1). Este processo é finamente regulado por fatores endócrinos, parácrinos e autócrinos, dentre os quais os androgênios (testosterona e diidrotestosterona) são absolutamente fundamentais (O'Donnell et al., 2006). Em humanos, a espermatogênese é concluída no início da puberdade e continua ao longo da vida. Em homens adultos férteis, esse processo resulta na produção de cerca de 1.000 espermatozoides por segundo, os quais são liberados do epitélio seminífero para a luz tubular (O’ BRYAN, 2016, p. 2328). A duração da espermatogênese varia conforme a espécie, sendo de aproximadamente 64 e 35 dias no homem e camundongo, respectivamente (O'Donnell et al., 2006; de Kretser et al., 2016; Neto et al., 2016). Durante a espermatogênese de mamíferos, observa-se a presença de diversos tipos de células germinativas: espermatogônias, espermatócitos e espermátides. Essas células são distribuídas de maneira altamente organizada ao longo do epitélio seminífero, formando arranjos específicos de diferentes tipos celulares do compartimento basal para o apical, conhecidos como estágios da espermatogênese (de Kretser et al., 2016). Em humanos e camundongos são conhecidos 12 estágios da espermatogênese, os quais compõem um ciclo espermatogênico (Figura 1) (Hess & de Franca, 2008; Muciaccia et al., 2013). Localizadas no compartimento basal do epitélio seminífero, as espermatogônias são as células mais imaturas da linhagem espermatogênica, sendo classificadas em dois tipos: A e B, 8 de acordo com o padrão da cromatina nuclear (Figura 1). Em humanos, as espermatogônias tipo A são subdivididas em Ad (do inglês, dark) e Ap (do inglês, pale). As espermatogônias tipo Ap se dividem por mitose, renovando sua população e dando origem às espermatogônias tipo B (Figura 1) (Schlatt & Ehmcke, 2014). As espermatogônias tipo B se proliferam por uma série de divisões mitóticas, originando uma grande população de células germinativas disponíveis para a próxima etapa da espermatogênese (O'Donnell et al., 2006). Esta ocorre pelo início da primeira divisão meiótica (meiose I), caracterizada pela produção do espermatócito primário preleptóteno a partir da espermatogônias tipo B (O'Donnell et al., 2006). Conforme a fase da meiose I, o espermatócito preleptóneno se diferencia sequencialmente em espermatócito zigóteno, paquíteno e diplóteno. O final da meiose I gera os espermatócitos secundários, que rapidamente passam pela segunda divisão meiótica (meiose II), originando as espermátides redondas haploides, estágio a partir do qual não há mais divisão celular. A espermiogênese é o processo caracterizado por diferentes etapas de citodiferenciação, no qual as espermátides redondas se diferenciam em espermátides alongadas (Figura 1). As etapas da espermiogênese variam conforme a espécie, sendo identificadas 14 e 16 etapas em humanos e camundongos, respectivamente (Figura 1) (O'Donnell et al., 2006). A espermiogênese envolve a formação e desenvolvimento do acrossoma e flagelo, condensação da cromatina, remodelamento e alongamento nuclear (Figura 1) (Eddy, 2006; Schlatt & Ehmcke, 2014). A fase final da espermatogênese é a espermiação, na qual ocorre a perda do excesso de citoplasma da espermátide, e a liberação do espermatozoide na luz do túbulo seminífero (Eroschenko, 2013; Schlatt & Ehmcke, 2014; de Kretser et al., 2016; Neto et al., 2016). 9 Figura 1. Diagrama da espermatogênese em homens (A) e camundongos (B), demonstrando os tipos de células espermatogênicas presentes em cada estágio do epitélio seminífero. Ad (espermatogônia tipo Ad – do inglês dark); Ap (espermatogônia tipo Ap – do inglês pale); B (espermatogônia tipo B); pL (espermatócitos preleptótenos); L (espermatócitos em fase leptóteno); Z (espermatócitos zigótenos); eP (espermatócitos paquítenos iniciais); mP (espermatócitos paquítenos intermediáros); lP (espermatócitos paquítenos finais); D (espermatócitos diplótenos); SS (espermatócitos secundários); 1-14 (painel A, estágios da espermiogênese humana); 1-16 (painel B, estágios da espermiogênese murina). Adaptado de Russell et al. (1990); Muciaccia et al. (2013). 10 Os espermatozoides são divididos morfologicamente em dois compartimentos principais: cabeça e flagelo, separados pela peça de conexão (Figura 2A). A cabeça é dividida em região acrossômica, segmento equatorial e região pós-acrossômica (Figura 2A) (Mortimer, 2018). O acrossoma possui lisossomos e diversas enzimas proteolíticas, como hialuronidases e proteases que auxiliam a penetração do espermatozoide nas células do cumulus e zona pelúcida que circundam o oócito (Eroschenko, 2005, p. 410). O núcleo da cabeça do espermatozoide é composto por uma cromatina altamente condensada, na qual protaminas formam ligações conferindo alta estabilidade ao DNA, protegendo-o contra danos (Mortimer, 2018). O flagelo é dividido em peça intermediária, peça principal e peça final (Figura 2A). Estas regiões contêm um complexo central de microtúbulos formando o axonema, que é cercado por fibras densas que se estendem até o final da peça principal (Figura 2B). As fibras densas externas da peça intermediária são envolvidas pela bainha mitocondrial, enquanto que na peça principal, as fibras densas externas são envolvidas pela bainha fibrosa (Figura 2B). Assim como a cabeça, o flagelo é circundado pela membrana plasmática contendo pequena quantidade de citoplasma. Apesar da maioria dos espermatozoides de mamíferos possuírem características gerais semelhantes, há diferenças no formato da cabeça e comprimento flagelar (Eddy, 2006). Por exemplo, a cabeça dos espermatozoides humanos possui formato espatular enquanto que a cabeça dos espermatozoides de roedores (como ratos e camundongos) possui formato falciforme (Figura 2C) (Eddy, 2006). 11 Figura 2. Aspectos morfológicos e estruturais do espermatozoide humano e murino. (A) Características gerais do espermatozoide. A cabeça do espermatozoide é conectada ao flagelo pela peça de conexão. As regiões do flagelo são a peça intermediária, peça principal e peça final (B) Componentes do citoesqueleto do flagelo de espermatozoides. O axonema se estende da peça de conexão até extremidade distal do flagelo. Consiste em nove pares externos de microtúbulos cercando um par central de microtúbulos. As fibras densas externas se estendem da peça de conexão até a região posterior da peça principal. A bainha fibrosa é composta por duas colunas conectadas por “ranhuras” circunferenciais e envolve o axonema e as fibras densas externas na região da peça principal do flagelo. (C) A região acrossomal da cabeça de espermatozoides de camundongos possui formato falciforme enquanto que em espermatozoides humanos possuem formato espatular. Adaptado de Eddy (2006). 12 1.2. Processos pós-testiculares de maturação espermática: aquisição de motilidade e capacidade de fertilização Os espermatozoides recém-liberados pelo epitélio seminífero são células morfologicamente diferenciadas, contudo, ainda incapazes de se mover progressivamente e fertilizar o oócito. Para se tornarem funcionalmente maduros, os espermatozoides precisam passar por dois processos pós-testiculares de maturação: o primeiro, ainda no trato reprodutor masculino, ocorre durante sua passagem pelo epidídimo, sendo denominado maturação espermática; e o segundo ocorre no trato reprodutor feminino, e envolve um conjunto de mudanças funcionais conhecido como capacitação espermática (Freitas et al., 2017; Gervasi & Visconti, 2017). O epidídimo é responsável por transportar, concentrar, maturar e estocar os espermatozoides até a ejaculação. Este órgão é altamente segmentado, podendo ser dividido anatomicamente em quatro principais regiões: segmento inicial, cabeça, corpo e cauda. Cada região epididimária exibe expressão gênica diferenciada e mantém composições distintas de proteínas, íons e outros componentes do conteúdo luminal, os quais desempenham papeis fundamentais na maturação espermática (Gervasi & Visconti, 2017). De fato, durante o trânsito pelo epidídimo, espermatozoides sofrem alterações em seu teor de açúcares, proteínas e lipídeos (Robaire & Hinton, 2015). Outro processo importante que ocorre nos espermatozoides durante a maturação no epidídimo é a alteração no estado de fosforilação de diferentes proteínas, como por exemplo, a IZUMO1, uma proteína essencial para a fusão do espermatozoide com o oócito (Inoue et al., 2005). Como resultado final do processo de maturação espermática epididimária, os espermatozoides adquirem a habilidade do movimento progressivo, para sua ascensão pelo trato reprodutor feminino, bem como de passar pela segunda etapa da maturação pós-testicular: a capacitação (Robaire & Hinton, 2015). Os espermatozoides maduros são armazenados em estado quiescente na cauda do epidídimo até a ejaculação. Após a ejaculação, os espermatozoides precisam permanecer um determinado período no sistema reprodutor feminino antes de se tornarem capazes de fertilizar o oócito. Esta 13 3 3 observação, primeiramente descrita por Chang (1951) e Austin (1952), foi denominada capacitação espermática. Trata-se de um evento fundamental para a fertilidade, pois confere ao espermatozoide a capacidade de sofrer reação acrossômica e fertilizar o oócito. Durante a capacitação, os espermatozoides passam por alterações fisiológicas e bioquímicas, incluindo mudanças na composição da membrana plasmática e em seu potencial elétrico, além de ativação de vias de sinalização intracelular, que culminam dentre outros efeitos na fosforilação de proteínas do citoesqueleto e de membrana (FLORMAN; DUCIBELA, 2006, p. 57). De fato, a capacitação espermática está correlacionada com, dentre outras mudanças, aumento do pH intracelular e alterações na fluidez da membrana plasmática (Visconti et al., 1995; Florman & Ducibella, 2006; Ickowicz et al., 2012). O aumento da fluidez da membrana plasmática é promovido pela remoção de esteróis por moléculas como a albumina (Davis, 1980). A alteração da fluidez da membrana facilita o aumento de sua permeabilidade aos íons cálcio (Ca2+) e bicarbonato (HCO -), componentes importantes para a ativação da via adenilato ciclase solúvel (ACs)/adenosina monofosfato cíclico (AMPc)/proteína quinase A (PKA, do inglês, protein kinase A) e consequentemente a fosforilação de resíduos de serina e treonina (Davis, 1980; Visconti et al., 1995; Visconti et al., 2011; Aitken & Nixon, 2013). Além disso, fosforilação de resíduos de tirosina também está correlacionada à capacitação e à regulação da motilidade espermática (Visconti et al., 1995; Mizrahi & Breitbart, 2014). Sabe-se que a sinalização associada à capacitação pode ser regulada (estimulada ou inibida) por eventos mediados por interações proteína-proteína na superfície espermática, incluindo aquelas que envolvem a ligação de proteínas do plasma seminal com proteínas espermáticas. Vale ressaltar que a capacitação pode ser mimetizada in vitro utilizando meios de cultura apropriados, contendo Ca2+, HCO - e albumina de soro bovino (BSA, do inglês bovine serum albumin), dentre outros componentes (Visconti et al., 2002; Lu et al., 2010). A motilidade é uma característica primordial do espermatozoide maduro, sendo definida como a propagação de ondas transversais ao longo do flagelo no sentido proximal-distal em relação à cabeça do espermatozoide produzindo uma ação que o impulsiona durante sua jornada pelo trato reprodutor feminino ou após seu isolamento e manutenção em condições 14 adequadas in vitro (Turner, 2005). É reconhecido que a motilidade espermática está diretamente relacionada à capacidade de fertilização do oócito (Guzick et al., 2001). De fato, homens que apresentam alterações na motilidade espermática são subférteis ou inférteis e, geralmente necessitam recorrer às técnicas de reprodução assistida para engravidarem suas parceiras (Turner et al., 1999). Os espermatozoides de mamíferos, incluindo humanos e camundongos, apresentam padrões distintos de motilidade, sendo que os principais são motilidade ativada (também conhecida como progressiva) e hiperativada (Figura 3). A motilidade progressiva é adquirida durante a maturação dos espermatozoides no epidídimo, e é caracterizada por movimentos flagelares relativamente simétricos e vigorosos, resultando em movimentos rápidos e progressivos (Figura 3) (Suárez & Osman, 1987; Mortimer, 2000; Eddy, 2006). Os espermatozoides que atingem a motilidade hiperativada exibem curvas flagelares assimétricas, batimentos flagelares de alta amplitude e trajetória circular ou irregular (Figura 3). A motilidade hiperativada está correlacionada à capacitação espermática, apesar de serem considerados processos distintos, porém sobrepostos, quanto aos seus respectivos mecanismos moleculares (Suárez & Osman, 1987; Mortimer, 2000; Eddy, 2006). São atribuídos papéis importantes para a fertilidade a este perfil de motilidade, como: eficiência na passagem espermática em ambientes viscosos como o muco do oviducto e, posteriormente, na interação com o oócito (Turner, 2005; Freitas et al., 2017). Além disso, a hiperativação atua como um fator de seleção, pois permite que somente os espermatozoides que passaram pelo processo de capacitação atinjam o local da fertilização (Eddy, 2006; Florman & Ducibella, 2006; Freitas et al., 2017). 15 Figura 3. Principais padrões de motilidade de espermatozoides humanos e murinos. A motilidade progressiva é observada em espermatozoides recém ejaculados ou isolados da cauda do epidídimo, caracteriza-se por movimentos flagelares simétricos e vigorosos. A motilidade hiperativada está associada ao processo de capacitação espermática, é caracterizada por curvas flagelares assimétricas, batimentos flagelares de alta amplitude e trajetória circular ou irregular. Adaptado de Florman & Ducibella (2006). Diversas proteínas espermáticas estão envolvidas na regulação da motilidade, como por exemplo, proteínas de citoesqueleto, canais iônicos e proteínas que atuam na sinalização de cálcio, metabolismo e fosforilação (Turner, 2005). Até o momento, o principal mecanismo de sinalização que regula a motilidade espermática em mamíferos envolve a ativação da ACs pelo Ca2+ e HCO3- e, consequentemente, o aumento dos níveis intracelulares de AMPc, resultando na fosforilação de resíduos de serina/treonina de proteínas do flagelo pela PKA (Suárez & Osman, 1987; Turner, 2005; Xia et al., 2007). Apesar da importância da motilidade e da capacitação espermática para a reprodução, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares envolvidos na sua regulação. Dessa forma, avançar no conhecimento sobre os fatores envolvidos no seu desencadeamento e regulação é de suma importância para o entendimento da fisiologia do espermatozoide e, consequentemente da fertilidade masculina (Eddy, 2006). Essas descobertas podem, por exemplo, ser exploradas para o desenvolvimento de novas terapias para infertilidade ou ainda como alvos farmacológicos para a contracepção masculina. Um ponto que merece destaque é o papel regulatório de proteínas presentes no plasma seminal, incluindo aquelas secretadas pela glândula seminal, sobre a motilidade e capacitação espermáticas. 16 1.3. Glândula seminal A glândula seminal é uma das glândulas sexuais acessórias integrantes do sistema reprodutor masculino de alguns mamíferos, incluindo homens e camundongos. Nessas espécies, um par de glândulas seminais está localizado posteriormente à bexiga urinária e superiormente à próstata. Cada glândula mede aproximadamente 6 cm e 2,5 cm em humanos e camundongos, respectivamente (Setchell & Breed, 2006). O ducto excretor da glândula seminal se conecta à região terminal do ducto deferente através da próstata desembocando na uretra prostática (Figura 4) (Eroschenko, 2013). Em camundongos, anexas à curvatura menor das glândulas seminais encontram-se as glândulas coaguladoras (Figura 4B). Nessa espécie, a combinação das secreções das glândulas seminal e coaguladora formam o plugue copulatório vaginal, que atua como uma barreira física, prevenindo que outros machos copulem com a fêmea, e como reservatório de espermatozoides no trato reprodutor feminino (Schneider et al., 2016). Assim como o epidídimo e o ducto deferente, a glândula seminal é derivada do ducto mesonéfrico (também conhecido como ducto de Wolff) durante o desenvolvimento embrionário. Em camundongos após o 15o dia de gestação é possível observar a expansão do epitélio distal do ducto mesonéfrico, marcando a estrutura que, posteriormente, dará origem a glândula seminal (Curry & Atherton, 1990). O desenvolvimento tecidual e a função secretora da glândula seminal são dependentes da secreção de androgênios testiculares (Curry & Atherton, 1990; Gonzales, 1994). As células da glândula seminal expressam o receptor de androgênios (AR), que são alvos da di-hidrotestosterona (DHT), metabólito ativo da testosterona, que atua como um potente agonista do AR (Simanainen et al., 2008; Welsh et al., 2010). De fato, a orquiectomia em ratos e camundongos adultos resulta em alterações morfológicas, fisiológicas e bioquímicas na glândula seminal, como atrofia, aumento no índice apoptótico das células epiteliais, remodelamento dos componentes da matriz extracelular, e interrupção da atividade secretora do epitélio (Chung & Ferland-Raymond, 1975; Nishino et al., 2004; Justulin et al., 2006). A reposição hormonal com testosterona promove a restauração da arquitetura e da 17 atividade secretora da glândula seminal (Chung & Ferland-Raymond, 1975; Nishino et al., 2004; Justulin et al., 2006). O epitélio da glândula seminal é altamente convoluto e irregular (Figura 4C). Sua mucosa possui dobras que se ramificam em várias dobras secundárias, formando cavidades irregulares, estas dobras se estendem até a luz tubular (Figura 4C). Seu epitélio é pseudoestratificado e colunar ou cuboide e suas células epiteliais contêm grânulos secretores e núcleo basal (Eroschenko, 2013). O músculo liso da glândula seminal consiste em uma camada muscular circular interna e uma camada muscular longitudinal externa (Figura 4C). A camada adventícia circunda o músculo liso e se funde com o tecido conectivo (Figura 4C) (Eroschenko, 2013). As camadas musculares lisas são inervadas por fibras noradrenérgicas e colinérgicas. As funções da inervação autônoma na glândula seminal envolvem o controle da contratilidade da musculatura lisa e da atividade secretora do epitélio (Mendes et al., 2004). No músculo liso da glândula seminal de ratos estão presentes os subtipos M2 e M3 do receptor muscarínico de acetilcolina (mAChR) (Hamamura et al., 2006; Avellar et al., 2009). Receptores adrenérgicos também foram detectados em células epiteliais e da musculatura lisa da glândula seminal de ratos, de forma predominantemente o receptor α1-adrenérgico (Shima, 1992; Queiróz et al., 2008). Os três subtipos de adrenoceptores-α1 (α1A, α1B e α1D) estão presentes na glândula seminal de ratos, no entanto, a contração da glândula seminal é predominantemente induzida via adrenoceptores-α1A (Silva et al., 1999). Os fluídos secretados pelos órgãos sexuais acessórios estão envolvidos na regulação da função espermática, incluindo motilidade, capacitação e fertilização, além de atuarem na proteção do espermatozoide contra ameaças patogênicas, metabólicas e imunológicas durante sua jornada pelo trato reprodutor feminino (Robert & Gagnon, 1999; Mendes et al., 2004; Simanainen et al., 2008; Juyena & Stelletta, 2012). A glândula seminal é responsável por secretar aproximadamente 70% do volume do plasma seminal, fração do sêmen que exclui os espermatozoides, o qual é composto por 1) íons; 2) compostos de baixo peso molecular, como frutose e prostaglandinas; e 3) proteínas diversas. Estes componentes proporcionam um ambiente propício para a viabilidade e potencial fértil dos espermatozoides (Curry & Atherton, 18 1990; Aumüller & Riva, 1992; Robert & Gagnon, 1999; Stark et al., 2005; de Lamirande, 2007). De fato, a remoção cirúrgica da glândula seminal em camundongos implica em subfertilidade, em consequência de falha da formação do plugue copulatório e redução do número de espermatozoides viáveis para fertilização no sistema reprodutor feminino (Peitz & Olds-Clarke, 1986; Kawano et al., 2014). Este efeito negativo para a fertilidade está relacionado com ausência de proteínas secretadas pela glândula seminal, que são essenciais para o controle da função espermática, como por exemplo, as proteínas da família REST (do inglês, Rapidly- evolving seminal vesicle-transcribed), que serão destacadas a seguir. Figura 4. Glândula seminal e outras glândulas sexuais acessórias de roedores e humanos. (A, B) Visão frontal superior de glândulas sexuais acessórias humana (A) e murina (B). (C) Secção histológica transversal da glândula seminal humana. Corte longitudinal corado com hematoxilina e eosina demonstrando as principais regiões da glândula seminal. Adaptado de Setchell & Breed (2006), Eroschenko (2013); e (McKay et al., 2020). 1.4. Proteínas REST’s (Rapidly-evolving seminal vesicle-transcribed) Na maior parte dos mamíferos, incluindo roedores e primatas, as proteínas codificadas pelos genes da família REST, secretadas pela glândula seminal, são os componentes mais 19 abundantes do plasma seminal, sendo essenciais para a formação do coágulo de sêmen e para a fertilidade (Peitz & Olds-Clarke, 1986; Kawano et al., 2014). Os efeitos das proteínas REST’s sobre a função espermática são mediados pela sua interação com o gameta masculino. De fato, estudos demonstraram a capacidade de proteínas REST’s humanas e de roedores de se ligarem à superfície de espermatozoides maduros (Manco & Abrescia, 1988; Bjartell et al., 1996; Carballada & Esponda, 1998; Yoshida et al., 2003; Wang et al., 2005; Kawano & Yoshida, 2007; Araki et al., 2016). Em humanos, as principais proteínas REST’s são as semenogelinas (SEMGs), que se destacam do ponto de vista clínico. São conhecidas duas isoformas: SEMG1 e SEMG2, codificadas por genes distintos localizados no cromossomo 2 humano (Peitz & Olds-Clarke, 1986; Ulvsback et al., 1992; Robert & Gagnon, 1999) (Figura 6). A SEMG1 e SEMG2 foram detectadas na cabeça (região acrossômica e pós-acrossômica) e no flagelo (peças intermediária e principal) de espermatozoides recém-ejaculados (Bjartell et al., 1996; Yoshida et al., 2003; Wang et al., 2005), onde atuam no controle da função espermática. Durante a ejaculação, as contrações da musculatura lisa da cauda do epidídimo e do ducto deferente empurram os espermatozoides em direção ao canal ejaculatório, onde são banhados pela secreção da vesícula seminal. Em seguida, o fluído seminal contendo os espermatozoides entra na uretra prostática, mistura-se com as secreções da próstata e da glândula bulbouretral, sendo finalmente ejetado pelo pênis (Robert & Gagnon, 1999). Imediatamente após a ejaculação, o sêmen forma uma massa viscosa conhecida como coágulo de sêmen, que mantém os espermatozoides imóveis no seu interior (Robert & Gagnon, 1999). A SEMG1 é um dos componentes integrais do coágulo se sêmen, sendo sua interação com os espermatozoides um evento crucial para mantê-los estáticos (Robert & Gagnon, 1996; Mitra et al., 2010). Fisiologicamente, a motilidade do espermatozoide humano é ativada após a degradação da SEMG1 pela serino-protease prostática PSA, processo que resulta na liquefação do sêmen (O'Rand et al., 2011). Um esquema sobre o destino da SEMG1 após a ejaculação foi apresentado na figura 5. 20 Figura 5: Diagrama simplificado das funções espermáticas no sistema reprodutor masculino e feminino de mamíferos. Proteínas SEMG1, PSA e Zn2+ misturam-se durante a ejaculação. SEMG1 coagula o sêmen e imobiliza os espermatozoides. Diminuição da concentração de Zn2+ no coágulo pode ativar a PSA. PSA cliva SEMG1 e liquefaz o coágulo do sêmen ocasionando a ativação da motilidade espermática. A remoção dos fragmentos de SEMG1 da superfície dos espermatozoides permite sua capacitação e, posterior fertilização do oócito. Adaptado de Yoshida et al. (2008b). A relevância da SEMG1 para a fertilidade foi reconhecida por: 1) quadros de infertilidade ou subfertilidade em homens com alterações no tempo de liquefação do sêmen (Robert & Gagnon, 1999); e 2) correlação positiva entre o nível de expressão do transcrito SEMG1 e infertilidade masculina associada à baixa motilidade espermática de origem idiopática (Yu et al., 2013). A modulação negativa na motilidade dos espermatozoides pela SEMG1 ocorre via interação com a proteína de superfície espermática EPPIN (do inglês, Epididymal peptidase inhibitor). Os mecanismos pelos quais a SEMG1 inibe a motilidade espermática via interação com a EPPIN ainda carecem de elucidação, mas parecem envolver a modulação dos níveis de cálcio e AMPc intracelulares (O'Rand et al., 2009; O'Rand & Widgren, 2012). Devido ao seu papel crucial no controle da motilidade espermática, a sequência da EPPIN responsável pela interação com a SEMG1 vem sendo explorada para o desenvolvimento de fármacos contraceptivos masculinos que mimetizam os efeitos da SEMG1 no espermatozoide (O'Rand et al., 2011; O'Rand et al., 2016). 21 Em camundongos, os membros da família REST são as SVS’s (do inglês, seminal vesicle- secretory proteins). Oito SVS’s (SVS1, SVS2, SVS3A, SVS3B, SVS4, SVS5, SVS6 e SVS7) foram descritas no sêmen de camundongos, sendo codificadas por genes diferentes. Os genes Svs2, Svs3a, Svs3b, Svs4, Svs5 e Svs6 estão localizados em um cluster no cromossomo 2 murino em loci gênicos ortólogos aos dos genes SEMG1 e SEMG2, que por sua vez, estão no cromossomo 20 humano (Clauss et al., 2005) (Figura 6). Apesar de codificadas por genes diferentes, a SVS3A e SVS3B são altamente conservadas, apresentando o mesmo número de resíduos de aminoácidos (265), dos quais apenas cinco são diferentes (Anexo II). Por questões didáticas, a seguir nos referimos a ambas as proteínas como SVS3, exceto quando indicado. Os genes Svs evoluíram rapidamente por duplicação e apresentam várias funções, estando envolvidos na: 1) formação do plugue copulatório (SVS1-SVS3) (Mangels et al., 2015); 2) regulação da resposta anti-inflamatória e imunológica (SVS4) (Galdiero et al., 1989) (Metafora et al., 1989); 3) inibição da atividade de serino-proteases (SVS5 e SVS6) (Clauss et al., 2005); e 4) modulação das funções espermáticas, incluindo motilidade (SVS7) e capacitação (SVS2 e SVS3) (Kawano & Yoshida, 2007; Kawano et al., 2014; Araki et al., 2016). Apesar do baixo grau de conservação da sequência primária dos seus produtos proteicos, os genes Svs2 e Svs3 (Svs3a e Svs3b) murinos são considerados ortólogos aos SEMG1 e SEMG2 humanos, respectivamente, pois compartilham similaridades estruturais e funcionais (Tabela 1). Assim como a SEMG1 humana, SVS2 é o componente mais abundante do plasma seminal murino e, em associação com SVS1 e SVS3, atua na formação do plugue copulatório (Kawano & Yoshida, 2007; Mangels et al., 2015). Dentre as similaridades estruturais entre os genes SEMG1 e SEMG2 humanos e Svs2 e Svs3 murinos estão: a composição de três éxons e dois íntrons curtos, no qual o primeiro éxon codifica o peptídeo sinal, o segundo, a proteína madura, e o terceiro, a região 3’-UTR (Ulvsback et al., 1992; Lundwall & Clauss, 2011). Além disso, as SEMG1 e SEMG2 humanas, e SVS2 e SVS3 murinas são substratos para calicreínas da família da PSA e transglutaminases, possuem alto ponto isoelétricos (SEMG1: 9,30; SVS2: 9,89; SVS3A: 9,39 e SVS3B: 9,37), seus resíduos de aminoácidos com repetições imperfeitas in tandem em sua estrutura primária, são ricas em glutamina, serina, glicina e lisina e contêm 22 de um a três resíduos de cisteína em sua estrutura primária (SEMG1: C239; SEMG2: C159 e C360; SVS2: C97; e SVS3: C98, C249 e C 251) (Figura 6) (Jensen-Seaman & Li, 2003; Kawano & Yoshida, 2007; Lundwall & Clauss, 2011; Shindo et al., 2019). Camundongos machos com deleção do gene Svs2 são subférteis devido à ausência do plugue copulatório e morte prematura dos espermatozoides no útero, o que indica o seu papel essencial para a fertilidade masculina (Kawano et al., 2014; Araki et al., 2015; Shindo et al., 2019). Em adição, Kawano et al. (2007) demonstraram que espermatozoides murinos recém- ejaculados, coletados da vagina e do útero, apresentaram a SVS2 em sua superfície. Em contrapartida, esses autores não detectaram a SVS2 em espermatozoides capacitados, coletados do oviducto, sugerindo que SVS2 pode atuar como fator decapacitante, prevenindo a capacitação precoce até que o espermatozoide alcance o oviduto (Kawano & Yoshida, 2007). O mecanismo de ação da SVS2 neste evento envolve, pelo menos em parte, a manutenção dos níveis de colesterol da membrana espermática (Araki et al., 2015). Dados recentes do nosso laboratório sugeriram um novo possível mecanismo pelo qual a SVS2 modula a função do espermatozoide murino: via interação com a EPPIN (Mariani et al., 2020). Demonstramos que a SVS2 e a EPPIN são proteínas de interação na superfície do espermatozoide murino, sustentando a hipótese de conservação funcional entre a interação EPPIN-SEMG1 humana e EPPIN-SVS2 murina na função espermática (Mariani et al., 2020). Interessantemente, a SVS3 interage diretamente com a SVS2 na superfície espermática facilitando seus efeitos inibitórios sobre a capacitação in vitro (Araki et al., 2016). Resultados do nosso grupo corroboraram essa observação pela demonstração de que a SVS3 faz parte de um complexo proteico juntamente com a SVS2 e a EPPIN no espermatozoide de camundongos (Mariani et al., 2020). Esses dados sustentam a hipótese de uma ação sinérgica entre proteínas SVS’s no controle da função espermática (Araki et al., 2016). 23 Figura 6. Aspectos estruturais das proteínas REST’s: SEMG1 e SEMG2 humanas e SVS2 e SVS3 murinas. (A) Localização dos genes SEMG1 e SEMG2 sub-locus centromérico do cromossomo 20 humano. Os genes Svs2, Svs3a e Svs3b murinos estão localizados em loci ortólogos cromossomo 2, juntamente com outros genes da família Svs. (B) Sequências primárias da SEMG1 (NP_002998), SEMG2 (NP_002999), SVS2 (NP_059086) e SVS3A (NP_001298043). Os peptídeos sinais são as sequências mais conservadas entre as SEMGs humanas e SVSs murinas e estão representados em letras minúsculas cinzas. As sequências sublinhadas, em negrito, em laranja, em azul ou em vermelho representam repetições in tandem de sequências de aminoácidos nas suas estruturas primárias (LIN et al., 2012). As sequências com realce amarelo na SEMG1 e SEMG2 representam sequências que se repetem nas suas estruturas primárias (LILJA et al., 1989). O resíduo único de cisteína da SEMG1 está contornado em formato de caixa na posição 239, enquanto na SEMG2, os resíduos de cisteína estão localizados nas posições 159 e 360. O resíduo único de cisteína da SVS2 está contornado em formato de caixa na posição 97, enquanto na SVS3A, os resíduos de cisteína estão contornados em formato de caixa nas posições 98, 249 e 251. 24 Tabela 1. Semelhanças estruturais e funcionais entre SVS2-3 murinas e SEMG1-2 humanas Os dados apresentados demonstram as semelhanças funcionais entre a SEMG1 e SEMG2 humanas com a SVS2 e SVS3 murinas. De fato, considerando o caráter multifuncional das proteínas REST’s para a reprodução, avançar no conhecimento dos seus efeitos sobre eventos pré-fertilização associados à função espermática é importante para o melhor entendimento sobre a evolução dos mecanismos que regulam a fertilidade masculina. Pesquisas nessa área apresentam potencial para descobertas de novos alvos terapêuticos tanto para o tratamento da infertilidade quanto para a contracepção masculina, representando fontes de inovação em Farmacologia da Reprodução. Até o momento, entretanto, os estudos acerca da SVS2 e a SVS3 focaram no seu efeito modulador sobre a capacitação espermática, sendo que seus efeitos sobre a aquisição de motilidade ativada pelos espermatozoides ainda carecem de elucidação. Considerando nossa descoberta recente de que a EPPIN murina atua como uma “plataforma” para a ligação da SVS2 e SVS3 na superfície do espermatozoide, neste trabalho testamos a hipótese que a SVS2 e a SVS3 atuam como fatores inibitórios da motilidade espermática. Além disso, também investigamos o perfil de expressão e regulação androgênica da SVS2 e SVS3 em camundongos. Semelhanças estruturais Semelhanças funcionais Três éxons e dois íntrons Formação coágulo de sêmen Sequência primária contendo repetições in tandem Substratos da PSA Sequência primária contendo resíduos de cisteína Interação com o espermatozoide maduro Alto ponto isoelétrico Modulação da capacitação espermática 6. Conclusão 6. Conclusão Neste trabalho, demonstramos que a SVS2 atua como um fator endógeno do plasma seminal para a inibição da motilidade espermática, adicionando mais um papel para essa proteína no controle da função do gameta masculino. O efeito inibitório da SVS2 sobre a motilidade ativada e hiperativada do espermatozoide murino não depende da presença da SVS3. Por outro lado, a SVS3 apresentou efeitos modestos sobre parâmetros que controlam o vigor do movimento espermático, sugerindo que ela pode atuar como uma moduladora da motilidade hiperativada. Tendo em vista que a SEMG1 e a SVS2 são proteínas homólogas, propomos a existência de fatores similares derivados do plasma seminal para o controle motilidade espermática em primatas e roedores. Nossas descobertas abrem novas fronteiras para o estudo do papel das proteínas da família REST na regulação das funções espermáticas, principalmente nos parâmetros que controlam a motilidade ativada e hiperativada. Portanto, novas estratégias experimentais com potenciais aplicações para potencialização ou inibição da fertilidade masculina poderão ser exploradas, favorecendo ao desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico e tratamento da infertilidade ou ao desenvolvimento de um novo contraceptivo masculino não-hormonal. 7. Referências bibliográficas 7. Referências bibliográficas Abbott, D. E.; Pritchard, C.; Clegg, N. J.; Ferguson, C. et al. Expressed sequence tag profiling identifies developmental and anatomic partitioning of gene expression in the mouse prostate. Genome Biol, v. 4, n. 12, p. R79, 2003. doi. 10.1186/gb-2003-4-12-r79. Aitken, R. J.; Nixon, B. Sperm capacitation: a distant landscape glimpsed but unexplored. Mol Hum Reprod, v. 19, n. 12, p. 785-93, 2013. doi. 10.1093/molehr/gat067. Araki, N.; Kawano, N.; Kang, W.; Miyado, K. et al. Seminal vesicle proteins SVS3 and SVS4 facilitate SVS2 effect on sperm capacitation. 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