UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus Araraquara Programa de Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia Identificação, caracterização e síntese peptídica associada à enolase de Sporothrix schenckii: aplicação em plataforma imunossensora eletroquímica portátil para o diagnóstico da Esporotricose Felina. BRUNA MATEUS DE CASTILHO Araraquara-SP 2022 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus Araraquara Programa de Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia Identificação, caracterização e síntese peptídica associada à enolase de Sporothrix schenckii: aplicação em plataforma imunossensora eletroquímica portátil para o diagnóstico da Esporotricose Felina. Identification, characterization and peptide synthesis associated with Sporothrix schenckii enolase: application in a portable electrochemical immunosensor platform for the diagnosis of Feline Sporotrichosis. Bruna Mateus de Castilho Tese apresentada ao programa de Pós Graduação em Biociências e Biotecnologias Aplicadas à Farmácia, área de Imunologia Clínica, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” UNESP, para obtenção do título de doutora em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia. Orientador: Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa Coorientadora: Prof.ª Dr.ª Iracilda Zeppone Carlos Araraquara-SP 2022 Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Campus Araraquara-SP RODOVIA ARARAQUARA - JAÚ, Km 1, 14800903 Telefone: +55 16 3301-5740 CNPJ: 48.031.918/0025-00. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus Araraquara Programa de Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia CERTIFICADO DE APROVAÇÃO TÍTULO DA TESE: Identificação, caracterização e síntese peptídica associada à enolase de Sporothrix schenckii: aplicação em plataforma imunossensora eletroquímica portátil para o diagnóstico da esporotricose felina. AUTORA: BRUNA MATEUS DE CASTILHO ORIENTADOR: Prof. Dr. PAULO INÁCIO DA COSTA COORIENTADORA: Prof.ª Dr.ª IRACILDA ZEPPONE CARLOS Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Doutora em BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA, área: Imunologia pela Comissão Examinadora. Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa (Participação Virtual) Departamento de Análises Clínicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF-Unesp), Araraquara. Prof. Dr. Sandro Antônio Pereira (Participação Virtual) Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos, Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas, Rio de Janeiro. Prof. Dr. João Pessoa Araújo Júnior (Participação Virtual) Departamento de Microbiologia e Imunologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ-Unesp), Botucatu. Prof. Dr. Ana Marisa Fusco de Almeida (Participação Virtual) Departamento de Análises Clínicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF-Unesp), Araraquara. Araraquara, 22 de março 2022. http://www2.fcfar.unesp.br/%23!/pos-graduacao/ciencias-farmaceuticas/CNPJ ESSA TESE FOI DESENVOLVIDA: FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Campus Araraquara, São Paulo, Brasil. LABORATÓRIO DE IMUNOLOGIA CLÍNICA E BIOLOGIA MOLECULAR, DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS. PARCERIAS Dr. Deivys Leandro Fuentes Portuondo Laboratório de Imunologia Clínica, Departamento de Análises Clínicas, FCF- UNESP. Prof. Dr. Sandro Antônio Pereira FIOCRUZ - RJ Prof. Dr. André Gonzaga dos Santos Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Fármacos e Medicamentos, FCF-UNESP. Profa. Dra. Ana Marisa Fusco Almeida Núcleo de Proteômica, Departamento de Análises Clínicas, FCF-UNESP. Dr. Paulo César Gomes Núcleo de Proteômica, Departamento de Análises Clínicas, FCF-UNESP. O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior, Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. DEDICATÓRIA Aos meus amados pais, Lúcia e João e meu irmão Rodolpho. Aos meus estimáveis Antônio e Aparecida. Ao Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa. A minha fiel amiga Cássia. A minha numerosa família MATEUS & CASTILHO, meus tios e primos, este título dedico a vocês. AGRADECIMENTOS A Deus, na Santíssima Trindade, a Virgem Maria, ao meu Anjo e Santos de devoção, Se cheguei até aqui, foi porque Deus permitiu. Me sustentou em todo o caminho, colocou pessoas maravilhosas em minha vida, me inspirou pelo Espírito Santo, me deu sua mãe, como minha amada mãe, Nossa Senhora Aparecida, Rainha, Protetora, Intercessora e Medianeira de todas a Graças, que incontáveis vezes rogou por mim junto a Jesus, meu Salvador. Aos Santos de minha devoção, agradeço a cada intercessão neste período a Santa Rita de Cássia, Santa Luzia, Santa Gemma Galgani, São Benedito, São José, São Lucas, São Paulo, São João Paulo II e Beato Carlo Acutis. Ao Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa, Meus eternos agradecimentos, desde o momento que me aceitou como sua aluna de doutorado aos dias atuais, e antecipadamente pelos dias que virão. Profissional íntegro, honesto, batalhador, perseverante, sempre disposto a ajudar o próximo, cuida de nós, seus alunos, como se fossemos seus filhos. Agradeço, especialmente, pela infinita paciência, compreensão e apoio que teve comigo neste período, esta conduta foi fundamental para que eu não desistisse, adoecesse e continuasse seguindo em frente. Por toda confiança depositada em mim, por me fazer acreditar que em pouco tempo conseguiríamos fazer um excelente trabalho e assim fizemos. O Senhor, sem dúvidas, foi o melhor orientador que eu poderia ter. E essa VITÓRIA, é NOSSA!! A Profa. Dra. Iracilda Zeppone Carlos, Minha coorientadora, agradeço pela confiança e por permitir que eu seguisse em sua linha de pesquisa. Ao Dr. Deivys Leandro Fuentes Portuondo, Pela parceria, paciência em esclarecer minhas dúvidas e ensinar, e por toda disposição em me ajudar. A todos do Laboratório de Imunologia Clínica, Marisa, Thaís, Damiana e Alexander, foi uma honra conhecê-los e aprender com vocês. Ao LICBM - Laboratório de Imunologia Clínica e Biologia Molecular, Neste agradecimento é impossível conter a emoção, a melhor equipe que já trabalhei, conseguimos de fato formar uma família. Começo agradecendo ao Rafael Bianchini Fulindi, meu primeiro amigo do LICBM, meu parceiro de diversos momentos. Quantas risadas, atrapalhadas e momentos engraçados, nós vivemos. A Lorrane Davi Brito, nossa Lô, sou muito grata por todos momentos que tivemos, em especial, por me convidar para morar com você, foi uma mudança brusca no meu estilo de vida, e repentina, mas sem dúvidas, meu período mais feliz, e parte dessa felicidade foi pelo acolhimento que tive por você. Ao Anderson Amendola Pinheiro pela enorme contribuição neste trabalho. Anderson, você é brilhante, e certamente, terá um futuro grandioso pela frente. A Nicoly Simões de Melo, pela ajuda enquanto IC, e a Anna Carolina Toledo Borges, pela ajuda, pela hospedagem em vários momentos, pelas conversas, mas sem dúvidas por todo momento com você serem engraçados e de muitas risadas. Com certeza Anna, nos divertimos muito. A Aline Reis, agradeço por se preocupar e manter nosso ambiente de trabalho muito bem organizado, tenho certeza que cientificamente virão muitas contribuições de você. A Elisandra e Rualdo, pela amizade e disposição. Ao Felipe, pela paciência em ensinar e ajuda com os Softwares. E a Eloise, pela amizade repleta de bom humor e companheirismo. A todos vocês, meus sinceros agradecimentos por cada momento juntos, pelo apoio, motivação, amizade e por todas contribuições. A Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP, como instituição, pelo acolhimento, e aos seus funcionários, em geral. A Profa. Dra. Maria José Soares Mendes Giannini, uma mulher inspiradora e fabulosa, agradeço as oportunidades concedidas, apoio e confiança durante o doutorado. A Profa. Dra. Ana Marisa Fusco Almeida, agradeço por se preocupar e estar à disposição, por todas contribuições neste trabalho, e por aceitar meu convite na qualificação e defesa. Ao Dr. Paulo César Gomes, pelas valiosas contribuições. Ao Prof. Dr. Cristiano Gallina Moreira, nos anos inicias, o que seria de mim sem sua ajuda. Aproveitando, estendo os meus agradecimentos a sua equipe, em especial, a Bruna Cardinali Lustri, a Fernanda Zani Manieri e a Tamara Machado. Ao Prof. Dr. André Gonzaga dos Santos, por concretizar meu desejo de aprender e com paciência me ensinar sobre HPLC. A Profa. Dra. Leila Aparecida Chiavacci Favorin, por permitir o uso de equipamentos, e a sua ex-aluna e minha amiga Dra. Bruna Lallo da Silva. A Profa. Dra. Taís Maria Bauab, pela confiança e carinho. E a Profa. Dra. Patrícia de Carvalho Mastroianni, pela amizade, incentivo e torcida, seguimos treinando para o caminho da fé. Ao Prof. Dr. Jean Leandro dos Santos, pela disponibilidade e colaboração. A Profa. Dra. Kelly Johana Dussán Medina, pela disponibilidade, colaboração e ensinamentos. As funcionárias da Seção Técnica de pós-Graduação, Claudia Molina, Aniele Vilella, Daniela Tita Altieri e Denise Daré Hatanaka, a vocês minha gratidão, por todos esses anos, por estarem disponíveis, pelos conselhos e por me ouvirem pacientemente em muitos momentos. A nossa secretária do Departamento de Análises Clínicas, Cristina de Fátima Maria. Aos funcionários da Biblioteca-FCF, por todo auxílio. Aos funcionários terceirizados que zelam pela nossa limpeza, em especial, a Samira, e os que zelam por nossa segurança, em especial a Viviane, o Sr. Paulo e o Leandro. Recebam meu carinho, respeito e admiração!! Agradeço ao Prof. Dr. Sandro Antônio Pereira, pela valiosa contribuição em minha qualificação, por sua presença em minha defesa e pela doação de amostras. Ao Prof. Dr. João Araújo Pessoa Júnior, agradeço pela doação de amostras e pela participar da minha defesa. Ao Ministério da Educação e a CAPES pelo financiamento desse estudo que me possibilitou dedicação exclusiva durante esse período. Saindo do âmbito institucional e acadêmico, agradeço à minhas amigas Rhayane Margutti e Clécia Andrade, das coisas boas que me aconteceram nos últimos anos, conhecer vocês, sem dúvidas estão entre as melhores. Dividir apartamento com vocês nos últimos meses foi divertidíssimo. A minha amiga de longa data Karina Oliveira, vivendo há anos na França, nunca se esquece de mim, e a cada país novo que conhece, me envia novos postais. A minha amiga Lidiane Siqueira, presente nos melhores momentos de minha vida, mesmo morando distante, mantemos viva nossa amizade. Minha amiga Cássia Oliveira, a quem também dedico esse trabalho, pelos anos de amizade, por ser para mim exemplo de disciplina e perseverança, por ser a primeira pessoa que eu recorro nas mais diversas situações, por abrir as portas de sua casa sem hesitar, e especialmente, pelo trabalho voluntário que você realiza diariamente, com fidelidade admirável, cuidando dos gatos sem lar. A minhas amigas, Diamila Furlanetto, Rafaela Bevilacqua e Luciane Cioffi. A Carolina Manzato, da faculdade ao nosso reencontro em 2021, e a Mariana Rosa. Aos meus amados Eduardo Miranda e Patrícia Vieira, com nossas alegrias Yasmin e Isis. Vocês foram meu suporte nesse período, minha fortaleza diária. As meninas do “Quarteto” me acompanharam desde o início dessa jornada. Os demais chegaram na hora exata, nos momentos mais difíceis, me trazendo ânimo, tornando a minha caminhada mais leve. Obrigada pela presença, por desejarem estar comigo, pelo cuidado. A minha prima Damires Helena, presente nos bastidores de toda minha vida acadêmica, da graduação aos dias atuais, embarcou comigo em muitas aventuras, juntas colecionamos momentos únicos. Na minha vida pessoal, é amiga e irmã, muito amada por mim. Aos meus padrinhos, que eu carinhosamente os chamo de Sr. Antônio e D. Cida. Agradeço por todas orações, por me instruir por bons caminhos, aconselhar e ensinar. Sou honrada por conhecê-los e agradecida a Deus a todo momento por tê-los em minha vida. Finalizo agradecendo aos meus pais, Lucia & João Castilho e meu irmão Rodolpho Castilho pelo suporte financeiro e de apoio, cuidados, dedicação e infinito amor. "Porque, quando me sinto fraco, então é que sou forte." Paulo Apóstolo 2 Co 12:10. RESUMO CASTILHO, Bruna Mateus de. Identificação, Caracterização e Síntese Peptídica associada à Enolase de Sporothrix schenckii: Aplicação em Plataforma Imunossensora Eletroquímica Portátil para o Diagnóstico da Esporotricose Felina. Orientador: Paulo Inácio da Costa. 2022. 98 f. Tese (Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Araraquara, São Paulo, 2022. A esporotricose é uma infecção causada por fungos de espécies pertencentes ao gênero Sporothrix, afetando humanos e animais. Esta infecção apresenta ampla distribuição mundial, mas no Brasil é considerada emergente e representa importante agravo à saúde humana e animal. O diagnóstico laboratorial precoce e com maior acurácia torna-se imprescindível como medida epidemiológica de controle de novas infecções e disseminação da doença nas populações humana e animal. Para medidas de controle eficazes é fundamental métodos de diagnóstico acurados e precoces. Nesse contexto, com grande potencial para aplicação em diagnósticos, os imunossensores eletroquímicos são vistos como ferramentas inovadoras. Assim, o objetivo desta tese foi desenvolver uma plataforma imunodiagnóstica a partir da proteína enolase do Sporothrix schenckii (EnoSs), usando sensor eletroquímico, para o diagnóstico da esporotricose felina. Com base em estudos prévios sobre o potencial imunogênico da proteína recombinante enolase do Sporotrhix schenckii (rSsEno), determinamos a imunorreatividade da rSsEno frente a amostras de soros de gatos positivos (n=20) e negativos (n=6) para esporotricose, aplicando o ensaio imunoenzimático indireto (ELISA). A SsEno demonstrou atividade com concentrações de 1µg. A partir desses resultados com a rSsEno, propomos o emprego deste antígeno em um novo método sorológico para esporotricose. A predição de epítopos mais imunogênicos e antigênicos da EnoSs em célula B foi realizada com o propósito de diminuir possíveis reações inespecíficas da proteína recombinante em plataforma mais sensível baseada em sensor eletroquímico. Os servidores web de predição utilizados foram: BEPIpred 2.0, DLBEtope, IBCEL-EL e Lbtope. O melhor epítopo da EnoSs obtido foi sintetizado por Síntese Química em Fase Sólida usando a estratégica Fmoc/tBut, posteriormente caracterizado por Espectrometria de Massas ms/ms e analisado e purificado por HPLC. A plataforma diagnóstica com sensor eletroquímico foi desenvolvida empregando o sensor DRP-220AT da Metrohm/DropSens, pela imobilização do peptídeo em monocamada organizada, sobre o eletrodo de trabalho, com cistamina (20 mM) e glutaraldeído (5 mM). As reações imunoquímicas ocorreram com os soros positivos e negativos previamente analisados pelo método de ELISA, observando redução da corrente entre 0 e - 0,5 mA e com o Potencial/V entre 0,0 e 0,15V da transdução do sinal eletroquímico. A plataforma eletroquímica desenvolvida é promissora como novo método imunodiagnóstico para a esporotricose felina. Palavras-chave: Sporothrix brasiliensis. Felinos. Bioinformática. Biossensor. Diagnóstico. ABSTRACT CASTILHO, Bruna Mateus de. Identification, Characterization and Peptide Synthesis Associated with Sporothrix schenckii Enolase: Application in a Portable Electrochemical Immunosensor Platform for the Diagnosis of Feline Sporotrichosis. Orientador: Paulo Inácio da Costa. 2022. 98 f. Tese (Biosciences and Biotechnology Applied to Pharmacy) - School of Pharmaceutical Science, São Paulo State University “Júlio de Mesquita Filho”, Araraquara, São Paulo, 2022. Sporotrichosis is an infection caused by fungi of species belonging to the genus Sporothrix, affecting humans and animals. This infection has a worldwide distribution, but in Brazil it’s considered emerging and represents an important threat to human and animal health. Early and more accurate laboratory diagnosis is essential as an epidemiological measure to control new infections and the spread of the disease in humans and animals. For effective control measures we need accurate and early diagnostic methods. In this context, with great potential for application in diagnostics, electrochemical immunosensors are seen as innovative tools. The aim of this thesis was to develop an immunodiagnostic platform from the Sporothrix schenckii protein enolase (EnoSs), using an electrochemical sensor, for the diagnosis of feline sporotrichosis. Based on previous studies on the immunogenic potential of the recombinant protein enolase from Sporotrhix schenckii (rSsEno), we determined the immunoreactivity of rSsEno against sera samples from positive (n=20) and negative (n=6) sporotrichosis cats, applying the indirect enzyme immunoassay (ELISA). SsEno demonstrated activity at concentrations of 1µg. From these results with rSsEno, we propose the use of this antigen in a new serological method for sporotrichosis. The prediction of more immunogenic and antigenic epitopes of EnoSs in B cells was performed with the purpose of reducing possible nonspecific reactions of the recombinant protein in a more sensitive platform based on an electrochemical sensor. The prediction web servers used were: BEPIpred 2.0, DLBEtope, IBCEL- EL and Lbtope. The best epitope of EnoSs obtained was synthesized by Solid Phase Chemical Synthesis using the Fmoc/tBut strategy, later characterized by Mass Spectrometry ms/ms and analyzed and purified by HPLC. The diagnostic platform with an electrochemical sensor was developed using the Metrohm/DropSens DRP-220AT sensor, by immobilizing the peptide in an organized monolayer, on the working electrode, with cystamine (20 mM) and glutaraldehyde (5 mM). The immunochemical reactions occurred with the positive and negative sera previously analyzed by the ELISA method, observing a reduction in the current between 0 and - 0.5 mA and with the Potential/V between 0.0 and 0.15V of the electrochemical signal transduction. The electrochemical platform developed is promising as a new immunodiagnostic method for feline sporotrichosis. Keywords: Sporothrix brasiliensis. Felines. Bioinformatics. Biosensor. Diagnosis. LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES µL microlitro µm micrometro Å Angstrom D. O. Densidade Óptica Da Dalton IgG Imunoglobulinas G Kd Constante de dissociação Kd Kilodalton MM Massa Molecular mM Milimolar ºC Graus Celsius 2PG 2-fosfoglicerato APC Antigen Presenting Cells ATP adenosina trifosfato BHI Brain Heart Infusion BSA Bovine Serum Albumin C. albicans Candida albicans CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência DCM Diclorometano DIC diisopropilcarbodiimida DMF N,N Dimetilformamida DOTA 2,2’ - (Etilenodioxi) dietil etiol ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EnoSs Enolase do Sporothrix Schenckii ESI Electrospray Ionization ESI-MS1 Espectro de Massa/Carga do Peptídeo FCF-Unesp Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Unesp Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz Fmoc 9-fluorenilmetiloxicarbonila GMS Grocott Methenamine Silver H2CO3 Tampão carbonato H2SO4 Ácido Sulfurico HBTU N, N, N’, N’-tetrametil O-(1H-benzotriazol-1-il)urônio HCTU O-(1H-6-Colorobenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametiluroniu hexafluorofosfato HF anidro Ácido Fluorídrico anidro HOBt 1-hidroxibenzotriazol HPLC High Performance Liquid Chromatography IBB Instituto de Biociências de Botucatu INI Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas L. brasiliensis Leishmania brasiliensis Lapclin-Dermzoo Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos LDMVet Laboratório de Diagnóstico Molecular Veterinário MALDI Matrix-Assisted Laser Desorpition/Ionization MS Mass Spectrometry mA Mili Ampère nA Nano Ampère PAS Periodic Acid-Schiff PBS-T Phosphate Buffered Saline PEP Fosfoenolpiruvato PESs01 Peptídeo obtido da predição de célula B da enolase S. schenckii Rink Amida Ácido 4-(2’-4’-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoxiacético rSsEno proteína recombinante enolase do S. schenckii RT-qPCR Polymerase Chain Reaction, Real Time SAM Self-Assembled Monolayer S. brasiliensis Sporothrix brasiliensis S. chilensis Sporothrix chilensis S. globosa Sporothrix globosa S. luriei Sporothrix luriei S. Mexicana Sporothrix mexicana S. schenckii Sporothrix schenckii SPFS Síntese de Peptídeos em Fase Sólida SPPS Solid Phase Peptide Synthesis SsCBF Fração de ligação da concanavalina A do S. schenckii TBTU tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il) 1,1,3,3tetrametilurônio tBut terc-butila TFA Ácido Trifluoroacético TIS Triisopropilsilano TMB 3,3’5,5-tetrameiltbenzidina V Volts LISTA DE QUADROS, EQUAÇÕES E TABELAS Quadro 1. Características do peptídeo PESs1. ............................................... 75 Quadro 2. Massas teóricas total do PESs01 e fragmentos. ............................ 75 Equação 1. Fator de Escalonamento da coluna analítica para a coluna semi- preparativa. ...................................................................................................... 58 Tabela 1. Epítopos de célula B da enolase do Sporothrix schenkii identificadas em cada servidor, com a posição de onde começa e termina na sequência. .. 70 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Expansão do número de casos de esporotricose humana e felina entre 1998 e 2019. .................................................................................................... 25 Figura 2. Morfotipo micelial de Sporothrix schenckii EH-143........................... 26 Figura 3. Morfotipo de levedura Sporothrix schenckii EH-143 ......................... 27 Figura 4. Morfotipo de levedura Sporothrix schenckii EH-143 ......................... 27 Figura 5. Imobilização do peptídeo ao suporte sólido via Linker. .................... 40 Figura 6. Descrição detalhada das principais etapas do ELISA para enolase do Sporothrix schenckii ......................................................................................... 53 Figura 7. Sequência em formato FASTA da enolase do Sporothrix schenckii 58251. .............................................................................................................. 54 Figura 8. Modelo do Sensor Eletroquímico fabricado pela Metrohm DropSens. ......................................................................................................................... 60 Figura 9. Amostras positivas doadas pelo Lapclin-Dermzoo e analisadas individualmente pelo Sporothrix-ELISA Felino. ................................................ 62 Figura 10. Amostras doadas pelo LDMVet e analisadas individualmente usando o Sporothrix-ELISA Felino. ............................................................................... 63 Figura 11. Média das amostras negativas nas diluições 1:400 e 1:800. ......... 63 Figura 12. Valores de média e desvio padrão das amostras (A) negativas (SN) e (B) positivas (SP) para o antígeno (Enolase) na concentração de 1 µg. ....... 64 Figura 13. Valores da média e desvio padrão das densidades ópticas a 450 nm das amostras em pool, diluídas em 1:50 e 1:100, com o antígeno concentrado em 1µg, 100 ng e 10 ng. .................................................................................. 65 Figura 14. Valores da média e desvio padrão das densidades ópticas a 450 nm das amostras em pool, diluídas em 1:50, 1:100 e 1:500, com o antígeno concentrado em 1µg/poço, 100 ng/poço e 10ng/poço...................................... 66 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627749 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627749 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627751 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627752 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627753 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627754 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627754 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627755 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627755 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627756 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627756 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627757 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627757 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627758 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627758 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627759 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627760 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627760 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627761 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627761 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627761 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627762 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627762 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627762 Figura 15. Valores da média e desvio padrão das densidades ópticas a 450 nm das amostras diluídas em pool nas proporções de1:50, 1:100 e 1:500 com o antígeno concentrado em 1µg/poço e 100 ng/ poço. ....................................... 67 Figura 16. Resultado alinhamento completo MAFFT, processados no ESPript. ......................................................................................................................... 71 Figura 17. Localização dos epítopos de célula B na proteína enolase do S. schenckii........................................................................................................... 72 Figura 18. Posição do epítopo linear de célula B na proteína enolase do Sporothrix schenckii ......................................................................................... 73 Figura 19. Espectro MS1 para o peptídeo PESs01 1737,97 Da, antes da purificação. Os picos de m/z 869,99 e 580,33 corresponde aos íons moleculares [M+2H]2+ e [M+3H]3+, respectivamente, indicados pelas setas azuis. ........... 76 Figura 20. Cromatogramas PESs01. (A) Purificação do PESs01 em condições analítica e (B) Purificação do PESs01 em condições semi-preparativa. .......... 77 Figura 21. Cromatograma PESs01 após a purificação, realizado usando as condições analítica. .......................................................................................... 78 Figura 22. Espectro MS1 para o peptídeo PESs01 1737,96 Da, após a purificação. Os picos de m/z 869,99 e 580,33 corresponde aos íons moleculares [M+2h]2+ e [M+3H]3+, respectivamente, indicados pelas setas azuis. ............ 78 Figura 23. Medidas amperométricas da curva de redução, expressa em módulo. ......................................................................................................................... 79 Figura 24. Medidas amperométricas. Cada medida está representada por uma cor. As setas na cor preta indicam a medida de uma amostra positiva, a única diferente estatisticamente das demais, em duplicata (lilás e verde claro). ....... 80 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627763 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627763 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627763 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627764 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627764 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627765 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627765 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627766 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627766 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627767 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627767 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627767 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627768 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627768 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627771 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627771 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627772 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627772 file:///G:/Meu%20Drive/DEFESA/Tese%20Bruna%20M%20Castilho%20FINAL.docx%23_Toc99627772 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 23 1.1 Histórico de Esporotricose .......................................................................... 23 1.2 Aspectos Epidemiológicos .......................................................................... 24 1.3 Espécies Sporothrix ................................................................................... 26 1.4 Esporotricose Felina ................................................................................... 30 1.5 Diagnóstico para esporotricose felina ........................................................ 32 1.6 Proteínas Sporothrix Schenkii .................................................................... 35 1.7 Peptídeos Antigênicos ................................................................................ 35 1.8 Síntese Química de Peptídeos ................................................................... 38 1.8.1 Purificação de peptídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência .. 43 1.8.2 Espectrometria de Massas ...................................................................... 44 1.9 Imunossensores Eletroquímicos ................................................................ 45 2. JUSTIFICATIVA ........................................................................................... 47 3. OBJETIVOS ................................................................................................. 49 3.1 Objetivo Geral ............................................................................................ 49 3.2 Objetivo Específicos ................................................................................... 49 4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 50 4.1 Amostras Biológicas ................................................................................... 50 4.2 Imunorreatividade da proteína SsEno ........................................................ 50 4.2.1 Obtenção da Proteína Recombinante Enolase do Sporothrix schenckii . 50 4.2.2 Concentração da proteína rSsEno .......................................................... 50 4.2.3 Padronização do ELISA .......................................................................... 51 4.3 Analise in silico da enolase de Sporothrix schenkii .................................... 53 4.3.1 Predição do epítopo de célula B do Sporothrix schenkii ......................... 54 4.4 Síntese de peptídeo antigênico .................................................................. 55 4.4.1 Preparação do reator para a síntese peptídica ....................................... 56 4.4.2 Desproteção de N-terminal com o grupo Fmoc ....................................... 56 4.4.3 Acoplamento dos aminoácidos ................................................................ 56 4.4.4 Clivagem peptídica .................................................................................. 57 4.4.5 Purificação por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ........................ 57 4.4.6 Espectrometria de Massas ...................................................................... 59 4.5 Imobilização do peptídeo no sensor ........................................................... 60 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 62 5.1 Identificação da presença de anticorpos IgG para o Sporothrix schenckii nas amostras clínicas .............................................................................................. 62 5.2 Imunorreatividade da SsEno ...................................................................... 64 5.3 Epítopos de célula B obtidos após predição da SsEno .............................. 70 5.4 Síntese de Peptídeo, Purificação e Espectrometria de Massas ................. 74 5.4 Imunorreatividade amperométricas do Peptídeo PESs01 .......................... 79 6. CONCLUSÕES ............................................................................................ 81 7. HISTÓRICO, LIMITAÇÕES E FORÇA DESTE ESTUDO ............................ 82 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 84 APÊNDICE A ................................................................................................... 97 Cálculos usados na síntese peptídica .............................................................. 97 23 1. INTRODUÇÃO 1.1 Histórico de Esporotricose O fungo Sporothrix schenckii (S. schenckii) foi descrito pela primeira vez, em 1898, por Benjamin Schenck, no Hospital Johns Hopkins, em Baltimore, Maryland, Estados Unidos. Benjamin Schenck descreveu precisamente as características morfológicas, o método e resultados da inoculação, e posteriormente foram estudadas pelo micologista Erwin Smith, que concluiu pelas características fenotípicas que o fungo pertencia ao gênero Sporotrichum (CARLOS & BATISTA-DUHARTE, 2015; RODRIGUES et al., 2020). Dois anos depois, Hektoen e Perkins também isolaram esse agente etiológico de lesões cutâneas de outros dois pacientes e por meio de estudos morfológicos propuseram o gênero Sporothrix, divisão Ascomycota e ordem Ophiostomatales, sendo o S. schenckii a espécie de maior importância patogênica da ordem (HEKTOEN & PERKINS, 1900; BONIFAZ & VÁZQUEZ-GONZÁLEZ, 2010). Os primeiros casos de esporotricose no Brasil foram descritos por Adolfo Lutz e Affonso Splendore, em 1907, após a identificação do S. schenckii em humanos e ratos. Lutz e Splendore descreveram que a infecção ocorria de forma natural entre ratos e era transmitida por mordidas de ratos infectados que inoculava o agente etiológico no tecido do hospedeiro (LUTZ et al., 1907). Conhecida como “doença do Jardineiro de Rosas”, pela forma de infecção através da inoculação traumática do fungo na pele após contato direto com o solo e plantas com a presença do fungo, a esporotricose está associada a profissões relacionadas a agricultura e atividades como jardinagem. Essa associação é feita devido S. schenckii e outras espécies do gênero Sporothrix habitar a natureza e estar presente no solo, na vegetação, nos troncos de árvores ou madeiras em decomposição, nos espinhos, nos musgos, nas palhas e no feno (BARROS, ALMEIDA & SCHUBACH, 2011; CHAKRABARTI et al., 2015). Desde sua descoberta nos Estados Unidos, casos de esporotricose humana foram registrados em outros países e aumentaram com o passar dos anos. No ano de 1952, em Nova York, EUA, foi descrito o primeiro caso de transmissão zoonótica envolvendo gatos. Este registro possibilitou a 24 identificação e descrição do primeiro caso de transmissão zoonótica no Brasil, ocorrido em 1955 (RODRIGUES et al., 2020). No período entre as décadas de 1950 e 1990, havia predominância nos casos de esporotricose humana. Após identificado o primeiro caso de transmissão zoonótica por gatos, em 1998, no Rio de Janeiro, a doença tornou- se emergente no estado, para esporotricose humana e felina (BARROS et al., 2010a; GREMIÃO et al., 2020). 1.2 Aspectos Epidemiológicos Os fungos do gênero Sporothrix possuem distribuição geográfica mundial, com maior prevalência em regiões tropicais e subtropicais com alta temperatura e umidade (BONIFAZ & VÁZQUEZ-GONZÁLEZ, 2010). Nas Américas, iniciando pela América do Sul, além do Brasil, há ocorrência principalmente nos países fronteiras Argentina, Paraguai e Uruguai, e relatos na Bolívia, Colômbia, Peru, Venezuela, seguindo pela Guatemala, na América Central e México e Estados Unidos, na América do Norte. Na Europa, as principais ocorrências foram na França, na Itália e no Reino Unido, além de relatos na África do Sul, no continente africano e na Ásia, principalmente no Japão, Tailândia, Malásia e China (RODRIGUES et al., 2014; CARLOS & BATISTA-DUHARTE, 2015; CÓDORBA et al., 2018; DUANGKAEW et al., 2018; HAN & KANO, 2020; ROSSOW et al., 2020). Desde sua descrição inicial, há relatos de esporotricose em diversos países, no entanto, por se tratar de uma doença negligenciada, sem notificação compulsória na maioria dos estados brasileiros e outros países, sua prevalência exata é desconhecida. Sabe-se que as espécies de Sporothrix se diferem quanto à distribuição geográfica (CHAKRABARTI et al., 2015; CAVALCANTI et al., 2017). Sporothrix globosa (S. globosa) é relatada em vários países com frequência baixa, variando de 5% a 28% em países das Américas, da África e da Europa, sendo 56% das infecções predominante na Ásia (YU et al., 2013). Infecções em humanos por S. luriei foram relatadas na África, na Itália e na Índia, e infecções caninas, no Brasil (AJELLO et al., 1969; OLIVEIRA et al., 2011). 25 De acordo com o número de casos relatados no mundo, desde 1898, há três países em que a esporotricose é endêmica, sendo liderada pelo Brasil, seguidas pela China e África do Sul (ZHANG et al., 2015). No Brasil, há circulação de várias espécies do gênero Sporothrix, principalmente as espécies patogênicas, no entanto, Sporothrix brasiliensis (S. brasiliensis) é a espécie emergente e a principal espécie associada a transmissão zoonótica (RODRIGUES et al., 2013; RODRIGUES et al., 2014; GREMIÃO et al., 2021). Dados epidemiológicos observados no período de 1998 a 2019 mostram Rio de Janeiro, seguidos de São Paulo, Paraná, Espírito Santo e Rio Grande do Sul possuem alta prevalência para esporotricose humana. Na figura 1, é possível observar a frequência e expansão dos casos de esporotricose no país (RODRIGUES et al., 2020; OLIVEIRA et al., 2021). Referência: Rodrigues et al., 2020. DOI:10.1007/s11046-020-00425-0 O estado do Rio de Janeiro atualmente é endêmico para esporotricose felina. Seguido do Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul, São Paulo, Paraná, Minas Gerais e Espírito Santo são outras regiões do país com aumento alarmante no número de casos. Recentemente, surtos de esporotricose felina foram registrados no Recife, em 2018, na Paraíba, em 2019 e 2021 e no Rio Grande do Norte, em 2020. Também foram relatados aumento no número de casos nos Figura 1. Expansão do número de casos de esporotricose humana e felina entre 1998 e 2019. 26 estados de Santa Catarina, Bahia, Alagoas e Distrito Federal (BARROS et al., 2010; RODRIGUES et al., 2016; GONZALES et al., 2018; RODRIGUES et al., 2020; GREMIÃO et al., 2020; GREMIÃO et al., 2021). 1.3 Espécies Sporothrix As espécies do gênero Sporothrix pertencem ao filo Ascomycota, classe Sordariomycetes, ordem Ophiostomatales e família Ophiostomataceae (GUARRO, GENÉ & STCHIGEL, 1999; ROMEO & CRISEO, 2013; RODRIGUES et al., 2016a; RODRIGUES et al., 2020). De modo geral, as espécies do gênero Sporothrix são fungos dimórficos que em vida saprofítica ou cultivados em ágar Sabouraud a 25°C, apresentam forma filamentosa, com hifas delgadas, septadas e ramificadas com 1 a 2 μm de diâmetro e aglomerados de conídios, em forma de margarida ou crisântemo, indicada pela figura 2 (BARROS et al., 2011). Em parasitismo ou quando cultivado a 37°C em meios ricos, tais como ágar infusão cérebro-coração, cresce como levedura unicelular ovalada, globosa e em forma de charuto, com 2 a 6 μm de diâmetro podendo apresentar um ou mais brotamentos, conforme a figura 3 (LOPES-BEZERRA et al., 2006; BARROS et al., 2011). Figura 2. Morfotipo micelial de Sporothrix schenckii EH-143. (A) Hifas hialinas, septadas, finas, com conídios simpodiais. (B) Conídios sésseis castanho- escuros de paredes espessas ao longo dos lados da hifa. Barra = 10 µm. Referência: CARLOS & BATISTA-DUHARTE, 2015. 27 Referência: CARLOS & BATISTA-DUHARTE, 2015. Curiosamente, durante anos pensou-se que S. schenckii era o único agente etiológico causador da esporotricose, porém esses conceitos mudaram a partir de 2006, quando uma série de trabalhos publicados por Rita Marimon e colaboradores (2006, 2007 e 2008) sugeriram a existência de novas espécies no gênero Sporothrix, causadoras da esporotricose. Esses estudos se basearam no sequenciamento do gene da calmodulina, características nutricionais e fenotípicas de aproximadamente 60 isolados clínicos e ambientais de países da Europa, África e América do Sul, inclusive no Brasil (MARIMON et al., 2006). Assim S. schenckii sensu stricto unido à novas espécies identificadas, como Sporothrix brasiliensis, Sporothrix globosa e Sporothrix mexicana (S. mexicana) foram reconhecidas como um complexo de espécies crípticas ou complexo Sporothrix (MARIMON et al., 2007). Derivado desses estudos, outras duas espécies também foram identificadas, Sporothrix luriei (S. luriei) e Sporothrix pallida (S. pallida) mas não agrupadas dentre do complexo Sporothrix schenckii (MARIMON et al; 2008, OLIVEIRA et al., 2014). A terminologia complexo de espécie crípticas é indicada àquelas espécies dentre de um gênero que apesar de suas diferenças genéticas causam manifestações clínicas da doença de maneira similar no hospedeiro (CHAKRABARTI et al., 2015). Figura 3. Morfotipo de levedura Sporothrix schenckii EH-143. (A) Células em brotamento de levedura a 37 °C em YPG (extrato de levedura- peptona-glicose). (B) Células de levedura únicas (corpos de charuto) dentro de macrófagos e neutrófilos, mas abundantes células de levedura PAS-positivas são observadas dentro de uma célula de espuma em Camundongos infectados com S. schenckii EH-143 em 8 semanas de infecção. Barra = 10 μm. Figura 4. Morfotipo de levedura Sporothrix schenckii EH-143. (A) Células em brotamento de levedura a 37 °C em YPG (extrato de levedura- peptona-glicose). (B) Células de levedura únicas (corpos de charuto) dentro de macrófagos e neutrófilos, mas abundantes células de levedura PAS-positivas são observadas dentro de uma célula de espuma em Camundongos infectados com S. schenckii EH-143 em 8 semanas de infecção. Barra = 10 μm. 28 As descobertas citadas anteriormente sobre as espécies proporcionaram novos conhecimentos sobre características específicas de cada e associaram a forma com que a esporotricose se manifesta, por exemplo, ARRILLAGA- MONCRIEFF et al., (2009) realizou um estudo comparativo sobre a patogenicidade experimental do Sporothrix albicans (S. albicans) unida às quatro espécies clínicas principais do gênero Sporothrix e demonstrou que o perfil de virulência de cada uma dessas espécies em camundongos BALB/c era diferente. O S. brasiliensis mostrou ser a espécie mais virulenta em termos de mortalidade e carga fúngica nos órgãos acometidos, seguido por S. schenckii, S. globosa, S. mexicana e S. albicans. Em contraste, FERNANDES et al. (2009) encontraram diferenças na secreção de proteínas e imunogenicidade de diferentes isolados pertencentes a S. schenckii sensu stricto em relação a S. brasiliensis e S. globosa. Revisões recentes demonstraram ao reunir diversos estudos sobre polimorfismo genético e diferenças morfológicas, que as espécies do gênero Sporothrix não formam um complexo, mas pertencem à clados. De acordo com a revisão, o gênero Sporothrix é formado por 53 espécies, e são divididas em espécies que pertencem ao clado patogênico e espécies que pertencem ao clado ambiental (figura 4). As espécies do clado patogênico, são as espécies de interesse clínico, ou seja, as que causam esporotricose, sendo: S. schenckii, S. brasiliensis, S. globosa e S. luriei. O clado ambiental, por sua vez, é dividido em dois clados, o primeiro é o complexo S. pallida, representado por Sporothrix chilensis (S. chilensis), Sporothrix mexicana (S. mexicana), Sporothrix humicola (S. humicola) e S. pallida, e pelo segundo, o complexo Sporothrix stenocera (S. stenocera), compõe as espécies que raramente causam a doença por estarem associadas ao solo, materiais vegetais e em decomposição (RODRIGUES, HOOG & CAMARGO, 2016; RODRIGUES et al., 2016a; RODRIGUES et al., 2020). 29 Figura 4. Relação Filogenética entre as espécies do gênero Sporothrix que compõe o clado clínico e o clado ambiental, com base no sequenciamento da calmodulina. Referência: Rodrigues et al., 2020. DOI: 10.1007/s11046-020-00425-0 No Brasil, geralmente mulheres, com idade adulta, do lar ou que exercem atividades domésticas, são as mais acometidas pela doença. Atribui a esse perfil epidemiológico o fato dessas mulheres passarem mais tempo em casa, e 30 consequentemente, terem contato mais próximo com gatos (BARROS et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2021). A esporotricose humana manifesta-se clinicamente por uma das quatros formas a seguir, conforme sua classificação: 1) Cutânea Fixa ou Localizada: neste caso a manifestação é restrita a pele e caracterizada por uma única lesão na forma de nódulo avermelhado, recoberto por crostas ou no formato de úlcera, podendo ter discreto comprometimento dos vasos linfáticos. Essa forma também atinge mucosas, como boca e olhos. 2) Cutânea Linfática ou Linfocutânea: é a forma clínica mais frequente da esporotricose. Inicialmente, a lesão aparece na forma de nódulo e evolui em tamanho, adquirindo aspecto ulceroso com exsudato, e forma um cordão endurecido que segue pelo vaso linfático. 3) Cutânea Disseminada: essa forma ocorre principalmente em pacientes imunocomprometidos, e é caracterizada pela formação de múltiplas lesões ulceradas ou verrucosas, espalhadas pela pele. E 4) Forma Extracutânea: de ocorrência rara e difícil diagnóstico, essa forma se manifesta quando há inalação dos conídios ou disseminação por via hematogênica do fungo e atinge os órgãos como pulmões, ossos e fígados, comprometendo suas funções. (FREITAS et al., 2015; OROFINO-COSTA et al., 2017; RAMOS et al., 2021). O tratamento da esporotricose humana é feito com medicamentos antifúngicos, o itraconazol é o de primeira escolha, pelos resultados eficazes apresentados, associados a antibióticos, como cloranfenicol, e imunoduladores, como β-glucana, nos casos mais graves (GUTERREZ et al., 2014). 1.4 Esporotricose Felina Além de humanos, a esporotricose já foi descrita em várias espécies de animais, no entanto, os gatos são os animais mais acometidos e de maior importância epidemiológica, seguido pelos cachorros, estes de menor importância epidemiológica até o momento, porém frequentemente monitorados por serem animais domésticos. Cerca de 96% dos casos de esporotricose felina são causados pela espécie S. brasiliensis, a espécie mais virulenta do clado clínico (SCHUBACH et al., 2004; CASTRO et al., 2013; RODRIGUES et al., 2013; PEREIRA et al., 2014; GREMIÃO et al., 2015). Enquanto as espécies S. schenckii e S. globosa são transmitidas por via sapronótica, ou seja, pelo contato direto com o habitat natural desses fungos, 31 como solo e plantas, o S. brasiliensis nunca foi observado nas plantas como fonte de infecção, sendo os gatos responsáveis pela transmissão para outros gatos e humanos (TÉLLEZ-MARTÍNEZ et al., 2014; RODRIGUES et al., 2016). RODRIGUES et al. (2014a), após encontrar uma estrutura clonal na fase inicial da expansão da epidemia gato-humano no sudeste do Brasil, sugere que houve uma mudança de habitat de S. brasiliensis de planta para gato, sendo esse o fator principal para o surgimento da epidemia de S. brasiliensis por transmissão zoonótica, desvinculando a ocorrência da doença à ocupação profissional. Sporothrix brasiliensis está associado a epizootias e zoonoses, e o gato desempenha papel central na transmissão para outros gatos, cachorros, ratos e humanos (RODRIGUES et al., 2016; SANCHOTENE et al., 2015). A transmissão zoonótica do S. brasiliensis era restrita ao Brasil, mas recentemente, foram relatados casos de transmissão zoonótica na Argentina (ETCHECOPAZ, et al., 2020). No gato, as infecções começam após inoculação traumática do fungo através de lesões, adquiridos habitualmente pelo contato com outros animais infectados, pelo comportamento de gatos serem animais domésticos e possuírem o costume de sair pelas ruas e se envolverem em brigas com outros gatos e cachorros ou em contato direto com solo ou casca de árvores, por outros hábitos comuns dos gatos, de enterrar as fezes no solo e de arranhar superfícies e troncos para subir em árvores. Após a infecção, o fungo deixa de apresentar morfologia filamentosa e adquire morfologia de levedura nos hospedeiros. Um dos mecanismos sugeridos para adaptação do S. brasiliensis aos gatos, é o fato do S. brasiliensis ser termotolerante e os gatos possuírem elevada temperatura corporal, 39 ºC. As leveduras são encontradas em abundância nos tecidos lesionados, nas unhas e na cavidade oral. O hábito dos gatos se lamberem contribuem para a disseminação do fungo para outros tecidos e mucosas (TÉLLEZ-MARTÍNEZ et al., 2014; ALMEIDA-PAES et al., 2015; CARLOS & BATISTA-DUHARTE, 2015) O perfil dos gatos acometidos pela esporotricose são em sua maioria gatos domésticos, machos, mestiços e não castrados (PEREIRA et al., 2014; MACÊDO-LOPES et al., 2018). E diferente da esporotricose humana, onde a infecção é classificada conforme as manifestações clínicas, nos gatos a 32 classificação dos sinais clínicos torna-se difícil pelo fato de frequentemente elas se apresentarem de forma simultânea (SILVA et al., 2022). As lesões mais frequentes são nas mucosas, olhos e boca, e cutâneas, principalmente nas patas e orelhas, nas formas de fístulas ou úlceras, com alopecia no local e liberando exsudato sanguinolento. Fortemente acometidos pela esporotricose felina, as lesões provocadas pela infecção são visíveis, os gatos ficam notavelmente debilitados, sendo com frequência fatal (LLORET et al., 2013; MACÊDO-SALES et al., 2018a). Nos felinos, o tratamento medicamentoso com antifúngicos, sendo o itraconazol de primeira escolha e o cetoconazol como segunda opção, associado a iodeto de potássio demonstraram ser eficazes, no entanto, além de precisar administrar os medicamentos corretamente por meses, dificultando a adesão e consequentemente acarretando em falhas terapêuticas, há necessidade de isolar o gato infectado (KANO et al., 2005). Quando não há possibilidades de tratamento, é recomendada eutanásia e cremação (ROCHETTE, ENGELEN & VANDEN BOSSCHE, 2003; BARROS et al., 2011). 1.5 Diagnóstico para esporotricose felina Testes diagnósticos laboratoriais são necessários para confirmação da infecção, em virtude dos sinais clínicos da esporotricose felina serem característicos de infecções fúngicas e similares à outras doenças, como câncer e doenças infecciosas em animais com significante prevalência no Brasil, por exemplo, a leishmaniose. Outros relevantes motivos que fundamentam a necessidade de testes diagnósticos laboratoriais, é o início do tratamento medicamentoso, que só começa após o diagnóstico laboratorial, e geram dados que contribuem no direcionamento das políticas públicas de saúde e nas ações voltadas ao manejo clínico da doença nos felinos (LARSSON, 2011; RODRÍGUEZ-BRITO et al., 2015) Atualmente, o padrão de referência para o diagnóstico da esporotricose felina é o teste micológico feito a partir do isolamento do Sporothrix spp em meio de cultura. Em amostras obtidas por tecido de biópsia, exsudato ou aspirado de lesões, isola o fungo e observa suas características morfológicas e o dimorfismo (SCHUBACH et al., 2006; GREMIÃO et al., 2021). 33 A cultura, inicialmente é feita usando os meios ágar Sabourad Dextrose com cloranfenicol ou ágar Mycosel, a 25 ºC, por cinco a oito dias, observando o crescimento do fungo filamentoso. Após o crescimento do fungo, é feito a inculação em meio Infusão Cérebro Coração (Brain Heart Infusion, BHI, forma como é conhecido este meio rotineiramente), incubado a 37ºC, e novamente pelo período de cinco a oito dias é observado se há a conversão da forma filamentosa para forma leveduriforme, e se possuem aspecto cremoso e coloração amarelada, concluindo-se dessa forma o diagnóstico micológico (SCHUBACH et al., 2011). O isolamento de fungos é um método confiável com 95,2% de sensibilidade e 100% de especificidade (MACÊDO-SALES et al., 2018). Entretanto, há limitações relacionadas a execução do teste micológico como à impossibilidade de execução do procedimento no local de atendimento ambulatorial, necessidade de laboratório com nível de Biossegurança 2, contaminações secundárias e maior tempo, até 30 dias, para a liberação dos resultados (SCHWARTZ, KENYON & THOMPSON, 2016; MACÊDO-SALES et al., 2018; GREMIÃO et al., 2021). O método usado rotineiramente na medicina veterinária para o diagnóstico da esporotricose felina é o exame citopatológico, também conhecido como citopatologia imprint (PEREIRA et al., 2011; MACÊDO-SALES et al., 2018). Com sensibilidade e especificidade de 78,9% a 84,9% do citopatológico em relação à cultura micológica, a citopatologia imprint é considerado um método satisfatório no diagnóstico de esporotricose felina. Os gatos apresentam altas quantidades de leveduras nos tecidos e lesões, tornando fácil a identificação, além disso é de fácil execução, baixo custo e obtenção de resultados rápidos. O príncipio da técnica consiste na “impressão” da amostra em uma lâmina de vidro, por isso o nome citopatologia imprint ou decalque, seguido de coloração da lâmina, geralmente, por Wright ou Romanowsky, e da análise direta de estruturas fúngicas no microscópio, onde grandes quantidade de estruturas leveduriformes de formato arredondadas, ovaladas ou em charutos são observadas no interior de neutrófilos, macrófagos e no meio extracelular (PEREIRA et al., 2011; SILVA et al., 2015; MACÊDO-SALES et al, 2018; ROSSOW et al., 2020). 34 Exames histopatológicos também são empregados com frequência no diagnóstico preliminar da esporotricose felina. São indicados em casos onde há lesões granulomatosas com granulomas em formação e purulentas, típicas dos felinos, pois nessas lesões há predomínio de macrófagos com leveduras de Sporotrhix spp em seu interior (PEREIRA et al., 2011). As amostras para histopatológicos são obtidas de biópsia ou necrópsia. Os tecidos coletados são fixados em formol tamponado a 10% embebidos blocos de cera parafina, micrótomo seccionado a 5 µm de espessura e corados especificamente com Metenamina de Prata de Grocott (GMS, Grocott Methenamine Silver) e Ácido Periódico de Schiff (PAS, Periodic Acid-Schiff) (MIRANDA et al., 2013). Nos últimos anos, novas ferramentas diagnósticas para esporotricose felina estão em desenvolvimento, a maioria dos estudos direcionam para métodos sorológicos ou métodos envolvendo a Reação em Cadeia Polimerase em tempo real (PCR, Polymerase Chain Reaction) (GREMIÃO et al., 2020; ROSSOW et al., 2020). Testes sorológicos desenvolvidos inicialmente para esporotricose humana e posteriormente validado para esporotricose felina usando método por ensaio imunoenzimático (ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), foram desenvolvidos a partir da descoberta de um antígeno derivado do Sporotrhix spp, a fração de ligação da concanavalina A (SsCBF), demonstrando durante a validação sensibilidade satisfatória ao avaliar imunorreatividade em soros de gatos de locais endêmicos, previamente confirmados por outros métodos (PENHA & LOPES-BEZERRA, 2000; FERNANDES et al., 2011; BERNARDES- ENGEMAN et al., 2015). O SsCBF-ELISA também permite a detecção sorológica e quantificação de IgG (BAPTISTA et al., 2020). Apesar de ainda não ser usado com fins diagnósticos em rotinas, a análise molecular por PCR, é uma importante ferramenta diagnóstica, especialmente por permitir a identificação de espécies pelo uso de primers específicos (KANO et al., 2005; RODRIGUES et al 2014; RODRIGUES et al., 2015). RODRIGUES et al., (2014a) desenvolveram um método diagnóstico por amplas variações de PCR, a partir do sequenciamento do gene calmodulina, e identificaram com sucesso espécies do gênero Sporothrix a partir amostras clínicas e isoladas de 35 cultura. Os prováveis motivos do PCR não ser a realidade em rotinas diagnósticas são por exigir aparelhos específicos para análise, reagentes que possuem custo elevado, profissionais especializados e local adequado, especialmente para manipulação da amostra (GREMIÃO et al., 2020). 1.6 Proteínas Sporothrix Schenkii Nos últimos anos, pesquisadores têm demonstrado interesse na identificação de alvos antigênicos de S. schenckii com fins vacinais, terapêuticos e para o desenvolvimento de ferramentas de diagnósticos que possam identificar Sporothrix spp de maneira rápida e precisa, em humanos e animais (GUTIERREZ-GALHARDO, FREITAS & VALLE, 2015; OROFINO-COSTA et al., 2017). A glicoproteína 3-carboximuconato ciclase de 60 kDa em S. schenckii e sua forma glicosilada de 70 kDa, conhecida como gp70, presente em S. brasiliensis (RUIZ-BACA et al., 2011; CASTRO et al., 2013; FERNANDEZ et al., 2013) tem sido utilizada como proteína alvo para ambos fins mencionados anteriormente (ALMEIDA et al., 2012). Outra proteína do S. schenckii, de antigenicidade e imunogenicidade comprovada em camundongos BALB/c é a enolase de 47kDa (PORTUONDO et al., 2016; 2017; 2019 e TÉLLEZ-MARTÍNEZ et al., 2019). O fato de uma forma recombinante dessa proteína (rSsEno) e peptídeos sintéticos derivados delas terem mostrado reatividade perante sangue de gatos infectados fundamenta o uso de ambas as fontes antigênicas para o diagnóstico da esporotricose felina1. 1.7 Peptídeos Antigênicos Peptídeos são definidos como biomoléculas formadas por ligações peptídicas de duas ou mais moléculas de aminoácidos. Os aminoácidos possuem em sua estrutura geral um grupo amina (-NH2) e um grupo carboxila (- COOH). A ligação peptídica ocorre quando o grupo amina de um aminoácido reage por ligação covalente ao grupo carboxila de outro aminoácido, e libera uma molécula de água (H2O). Proteínas e peptídeos são diferenciados pelas quantidades de aminoácidos que possuem, sendo a proteínas, macromoléculas, formadas por uma ou mais cadeias polipeptídicas, enquanto os peptídeos, são 1 Dados submetidos para publicação em dezembro de 2021 por Portuondo, DLF et al. 36 formados por dois a 80 aminoácidos (SU et al., 2013). Consideradas essenciais e de importância vital, as proteínas estão envolvidas em inúmeros processos bioquímicos, e exercem funções variadas no organismo (TAMURA & ALEXANDER, 2004). No sistema imune, os anticorpos são proteínas circulantes produzidas por células de defesa que agem em respostas à exposição a estruturas estranhas, os antígenos. Um antígeno, pode ser qualquer molécula biológica, inclusive macromoléculas, como ácidos nucléicos e, novamente, proteínas, que induzem respostas imunológicas específicas (ABBAS, 2012). Na imunidade adquirida, há dois tipos de respostas imunológicas, a resposta imune humoral e a resposta imune celular. A imunidade humoral é mediada por anticorpos, que se ligam as imunoglobulinas presentes na membrana da superfície dos linfócitos B (ou células B), atuando como receptores de antígenos, ou presentes na circulação, tecidos e mucosas, que ao reconhecer os antígenos, conectam-se a eles, neutralizando as toxinas, evitando a entrada e disseminação dos microrganismos nas células e preparando para eliminá-los (ALLISON & LAINER, 1987; CHAPLIN, 2010). Somente macromoléculas são capazes de estimular os linfócitos B para gerar e iniciar a resposta imune humoral (ABBAS, 2012; CANO & LOPERA, 2013). A imunidade celular é mediada por linfócitos T. Os anticorpos, as moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) e os receptores de antígenos das células T (TCR), compõem a classe de moléculas usadas no reconhecimento dos antígenos na imunidade celular. As moléculas MHC e TCR reconhecem os peptídeos como antígenos (MANOLIOS et al., 1997). As macromoléculas, como proteínas, ácidos nucleicos e polissacarídeos, geralmente são maiores do que a região de ligação do antígeno ao anticorpo. Por essa razão, qualquer anticorpo se liga apenas a uma parte da macromolécula, denominada epítopo (GERSHONI et al., 2007). Epítopos antigênicos são definidos como partes do antígeno com características químicas e físicas peculiares, favoráveis ao reconhecimento de 37 regiões específicas dos linfócitos B ou TCRs, promovendo ativação da resposta imune (ZHAO, WONG & LI, 2011). Um epítopo pode ser classificado como linear ou conformacional. Os epítopos lineares, também conhecidos como contínuos, são formados por trechos lineares de resíduos na sequência da proteína do antígeno. Enquanto os epítopos conformacionais, ou descontínuos, são formados pela estrutura secundária, terciária ou quaternária de uma proteína, ou pelo dobramento tridimensional normal de polissacarídeos (DHANDA et al., 2017) Enquanto os TCRs só se ligam à epítopos que formam complexos com as moléculas de MHC, sendo necessário o processamento por Células Apresentadoras de Antígenos (APCs, do inglês, Antigen Presenting Cells), os epítopos de linfócitos B não necessitam ser processados por APCs, por estarem localizados na superfície das proteínas, são capazes de ligar diretamente às moléculas de Imunoglobulinas (MANOLIOS et al., 1997). Os antígenos são amplamente empregados em desenhos de vacinas, novos fármacos e métodos diagnósticos, no entanto, obter quantidades suficientes de antígeno bruto para experimentos, ou produção de vacinas, fármacos e ferramentas diagnósticas é completamente inviável, para isso, a alternativa de sucesso para produção de antígenos é a síntese de peptídeos, que mimetizam o epítopo de proteínas antigênicas dos microrganismos (OLIVE, TOTH & JACKSON, 2001; JARADAT, 2018; APOSTOLOPOULOS et al., 2021; PRADA et al., 2021). As dificuldades inerentes ao mapeamento de peptídeos por métodos experimentais culminaram na busca por métodos alternativos, e atualmente a predição de peptídeos é feita por ferramentas de Bioinformática. Métodos de analises in silico que empregam algoritmos de inteligência artificial e aprendizado de máquina são usados para identificação de peptídeos com potencial antigênico (JESPERSEN et al., 2017; MANAVALAN et al., 2018; LIU, SHI & LI, 2020). O fato dos antígenos se ligarem diretamente aos epítopos de linfócitos B, de forma altamente seletiva, e por sua capacidade de reconhecimento, conferir proteção a longo prazo contra microrganismos, a identificação desses epítopos é feita por servidores de predição de epítopos de células B, e partir dessa predição, os epítopos são sintetizados (ZHAO, WONG & LI, 2011). 38 Basicamente, os peptídeos podem ser sintetizados por quatro métodos: 1) Síntese em Solução; 2) Síntese de Peptídeos em Fase Sólida; 3) Síntese Enzimática e 4) Síntese por DNA recombinante. Estes métodos encontram-se divididos em dois grupos: 1) Convergente, onde ocorre a condensação de peptídeos sintetizados e protegidos e 2) Linear, construída adicionando aminoácido por aminoácido, de forma sequencial (MACHADO et al., 2004). 1.8 Síntese Química de Peptídeos Historicamente, os primeiros estudos sobre ligações peptídicas iniciaram no século XIX. Porém, foi no início do século XX, mais precisamente em 1901, que a síntese foi descrita por Fischer, considerado “pai” da química dos peptídeos, e por Ernest Fourneau. As primeiras sínteses químicas de peptídeos com importância biológica e estruturas determinadas, ocorrem em 1935, com a síntese da Glutationa e da Carnosina. Essa descoberta despertou interesse nos pesquisadores, e em poucos anos, no início da década de 50, vários outros peptídeos de importância biológica haviam sido sintetizados, e suas estruturas determinadas. Desde então, dada a versatilidade química dos peptídeos comparada às proteínas, o interesse em obtê-los, caracterizá-los, aperfeiçoar os métodos envolvidos a cada etapa de síntese passaram a ser minuciosamente estudados, e permanece até os dias atuais (WIELAND E BODANSZKY, 2012; HARINGTON & MEAD, 1935; DU VIGNEAUD & HUNT, 1936; MACHADO et al., 2004). Os primeiros peptídeos sintetizados foram em solução. Conhecido como método “clássico”, tem como príncipio a esterificação ou amidação da α- carboxila do receptor de acila, ou seja, o acoplamento dos aminoácidos acontece entre seus grupos α-amino-carboxi por ligação peptídica com o auxílio de um reagente acoplante, responsável pela ligação peptídica e liberação de água no meio. Isso permite que a síntese em solução ocorra tanto na direção N-C terminal ou C-N terminal (MARCO, 2013) Na síntese em solução, as etapas sintéticas são feitas em solução homogênea, havendo necessidade de purificação a cada intermediário obtido, tornando a síntese de peptídeos em solução com poucos resíduos de aminoácidos trabalhosa e demorada (KHAN, 2016) 39 Em 1963, Robert Bruce Merrifield inovou o método de síntese química dos peptídeos ao desenvolver a Síntese Química de Peptídeos em Fase Sólida, (SPFS, do inglês, Solid Phase Peptide Synthesis [SPPS]), usando polímeros insolúveis aos reagentes empregados na síntese como suporte sólido (Merrifield, 1964). O princípio do método criado por Merrifield, a SPFS, consiste inicialmente na desproteção do grupo α-amino, enquanto o grupo carboxílico C-terminal encontra-se unido ao suporte sólido por ligações covalentes, através de uma ligação éster, seguido do acoplamento de aminoácido por aminoácido N- protegido até a obtenção da sequência completa, finalizando com a clivagem do suporte sólido-peptídeo (MERRIFIELD, 1964; ALBERICIO & KATES 2000; ISIDRO-LLOBET, ALVAREZ & ALBERICIO, 2009) Os suportes sólidos obrigatoriamente necessitam ser insolúveis aos reagentes usados durante à síntese e apresentar estabilidade físico/química perante esses reagentes. O uso de suportes sólidos permite que as reações de acoplamento dos aminoácidos ocorram mais rápidas e com melhores rendimentos, uma vez que é possível usar excessos de aminoácidos e removê- los facilmente ao final de cada etapa, pelo simples processo de lavagem do suporte e filtração (CHAN & WHITE, 2000). Por esses motivos, embora há diversas opções disponíveis no mercado, os suportes sólidos recomendados na SPFS, são os copolímeros de poliestireno com 1% a 2% de divinilbenzeno. Estes suportes sólidos poliméricos estão ligados permanentemente à um ligante (Linker), que facilita a ancoragem temporária do primeiro aminoácido ao suporte polimérico (figura 5). Apresentam- se na forma de grãos, e seu tamanho é referenciado em tamanho de malha (mesh), variando geralmente de 100 mesh a 200 mesh e de 200 mesh a 400 mesh (ZALIPSKY et al., 1994; CILLI et al., 2017; VAINO & JANDA, 2000; MITCHELL, 2008). 40 Referência: Jaradat, 2018. DOI: 10.1007/s00726-017-2516-0. O grão seco do suporte sólido possui em média cerca de 35 µm e 150 µm de diâmetro, correspondente à 100 mesh e 400 mesh, respectivamente, porém, na presença de solventes, esse tamanho aumenta em até seis vezes, possibilitando que os ligantes presentes no interior da rede polimérica fiquem expostos, e consequentemente favoreçam as reações de acoplamento dos aminoácidos e o acesso dos solventes (CILLI et al., 2017; MARQUARDT & EIFLER-LIMA, 2001). Há duas estratégias empregadas na SPFS, a primeira proposta por Merrifield (1964), a terc-Butilcarbonil/Benzil (Boc/Benzil), onde o grupo Boc é o protetor do grupo α-amino dos aminoácidos, e a segunda proposta por CARPINO & HAN (1972), a 9-Fluorenilmetiloxicarbonil/tButil (Fmoc/tBut), onde o grupo Fmoc é o responsável pela proteção do grupo α-amino dos aminoácidos. Mesmo após décadas, e com pesquisas que visam melhorar a aplicação dessas estratégias e simplificar os processos químicos envolvidos, elas permanecem sendo as estratégias padrão da SPFS (MERRIFIELD, 1964; JARADAT, 2018; SHINBARA et al., 2020). A principal diferença das estratégias Boc/Benzil e Fmoc/tBut são as condições de desproteção dos grupos α-amino. Na química Boc, a desproteção ocorre com o Ácido Trifluoroacético (TFA) em Diclorometano (DCM), que provoca uma espécie de protonação do grupo α-amino. Pelas condições ácidas em que as reações ocorrem, entre as etapas de desproteção e o acoplamento dos aminoácidos, é necessário que ocorra neutralização, normalmente feita com N, N’-diisopropylethylamine (DIEA) em DCM, para liberar a função amina protonada. Outra particularidade da estratégia Boc/Benzil, são as cadeias Figura 5. Imobilização do peptídeo ao suporte sólido via Linker. 41 laterais dos aminoácidos estarem protegidos pelo grupo Benzila, e para desproteção desses grupos no processo de clivagem, há necessidade de usar ácidos ainda mais fortes, sendo o de primeira escolha, o Ácido Fluorídrico anidro (HF anidro). Embora o uso de ácidos de intensidade moderada à forte faz com que as etapas de desproteção e clivagem da estratégia Boc/Benzil sejam bem- sucedidas, essas condições são desfavoráveis à duas situações: 1) a degradação aminoácidos e toda cadeia peptídica, e 2) a dificuldade em sintetizar por meios mecânicos, pois o uso de ácidos corrói os equipamentos (SCHNÖLZER et al., 1992; MARCHETTO et al., 2001; NAKAIE et al., 2007; JARADAT, 2018). As condições químicas menos agressivas aplicadas à estratégia Fmoc/tBut quando comparadas à estratégia Boc/Benzil, tornaram a estratégia Fmoc/tBut a mais utilizada desde sua implementação, podendo ser empregada de forma manual ou automatizada (MÄDE, ELS-HEINDL E BECK-SICKINGER, 2014; WILSON et al., 2016). Figura 4. Na química Fmoc/tBut os solventes de primeira escolha são N,N- Dimetilformamida (DMF) e DCM, utilizados nas etapas de desproteção, acoplamento e lavagens. O DMF trata-se de solvente orgânico polar, e por essa razão favorece as reações de desproteção do grupo Fmoc, enquanto o DCM, solvente não polar, é usado para eliminar os resíduos de DMF após as lavagens (FIELDS & NOBLE,1990). Além desses solventes, faz parte da química Fmoc/tBut os reagentes de acoplamento, que atuam favorecendo a ocorrência das ligações peptídicas. Eles encontram-se divididos em dois grupos: 1) Carbodiimidas, cujo o mecanismo básico é a formação da O-acilisoureia, que por aminólise da amina forma ligações amidas. Exemplos de ativadores dessa classe, usados em nossas sínteses, é o diisopropilcarbodiimida (DIC) que quando associado ao ativador secundário, o 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), reage com o intermediário O- acilisoureia formado pelo DIC, produzindo éster ativo que é menos reativo e pouco propenso à racemização, conferindo maior eficiência ao acoplamento. 2) Sais de ônio, são os sais de fosfônio e amino/urônio, N, N, N’, N’-tetrametil O- (1H-benzotriazol-1-il)urônio (HBTU), O-(1H-6-Colorobenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetrametiluroniu hexafluorofosfato (HCTU), tetrafluoroborato de O-(benzotriazol- 42 1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (TBTU) são outros acopladores frequentemente usados em síntese (CARPINO et al.,1994; CHAN & WHITE, 2000). A síntese peptídica por Fmoc, inicia-se quando porção N-terminal do primeiro aminoácido com grupo α- amino protegido Fmoc é ligado ao grupo reativo da resina, com os reagentes de acoplamento, seguido de lavagens com o solvente (MERRIFIELD, 1964; ALBERICIO & KATES 2000; ISIDRO-LLOBET, ALVAREZ & ALBERICIO, 2009). A desproteção do grupo Fmoc ocorre facilmente ao utilizar uma base, geralmente a Piperidina (PP) ou seu análogo, 4-metil-piperidina (4MP), sem interferir no ligante entre a resina e o peptídeo ou demais grupos protetores das cadeias laterais dos aminoácidos, seguidas de lavagens com DMF, cuja a função é imobilizar a cadeia lateral protetora dos aminoácidos (FIELDS & NOBLE, 1990; LUNA et al., 2016). O aminoácido seguinte com o grupo α-amino protegido é ativado no grupo carboxil na presença dos acopladores, por exemplo, DIC e HOBt. O grupo α- amino do aminoácido anterior (neste caso, o primeiro aminoácido) ataca o grupo carboxil ativado do segundo aminoácido, formando a ligação peptídica. Essas etapas são frequentemente repetidas até que ocorra o acoplamento do último aminoácido da sequência peptídica (FIELDS & NOBLE, 1990). A qualidade das etapas de desproteção e acoplamento são acompanhadas pelo teste colorimétrico de ninidrina. O teste de Ninidrina é fundamentado na reação da ninidrina com aminas. Quando os grupos α-amino estão livres para receber o aminoácido, durante a desproteção, as aminas resultantes da reação com a ninidrina são aminas primárias, e adquirem coloração azul intensa. E, quando estão protegidas, após o acoplamento do aminoácido, as aminas são secundárias, e adquirem coloração entre amarelo e castanho, pouco intensa. Pelo teste de Ninidrina é possível evitar a formação de sequências peptídicas incompletas (KAISER et al.,1970). O peptídeo completo é desprotegido, e a clivagem do peptídeo-resina é feita com solução contendo TFA, denominada solução de clivagem, que rompe a ligação éster formada entre o peptídeo e a resina. Ao final do processo de clivagem, o peptídeo encontra-se dissolvido na solução de clivagem, e a separação ocorre primeiro com a filtração da solução de clivagem para 43 separação das partículas de resina, seguida pela precipitação do peptídeo na solução de clivagem com várias lavagens usando éter gelado (FIELDS & NOBLE, 1990; CHAN & WHITE, 2000). 1.8.1 Purificação de peptídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE, em português, ou em inglês, HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC -, é a técnica mais comum usada atualmente para purificação de peptídeos (ISIDRO- LLOBET et al., 2019). O princípio da cromatografia na purificação de peptídeos consiste na separação do peptídeo de possíveis compostos não desejáveis formados durante a síntese, com base em sua afinidade relativa as duas fases que compõe o método cromatográfico, conhecidos como fase móvel e fase estacionária (MANT et al., 2007). Na fase móvel os componentes, quando isolados, movem-se por um solvente fluído - líquido ou gasoso, e na fase estacionária, a substância a ser purificada ficará fixa na superfície de outro material - líquido ou sólido (MÜLLER- SPÄTH et al., 2013). O método base da CLAE consiste na passagem da fase móvel líquida contendo a amostra a ser purificada, de forma com que ela flua pela fase estacionária, localizada no interior de uma coluna, após a aplicação de alta pressão acionada por bombas que compõe o sistema CLAE e são responsáveis pela movimentação da fase móvel sobre a fase estacionária (MAN et al., 2007). O sistema de bombas é o diferencial e o mecanismo mais importante da CLAE, pois é através desse sistema associado a aplicação de pressão, que ocorre o movimento dos solventes com a amostra pela coluna até o detector. Geralmente, em operações normais no CLAE, a pressão aplicada varia entre 2000 e 5000 PSI. Dada a importância do sistema de bombeamento, afim de garantir qualidade e eficiência na purificação, e reprodutibilidade nas corridas subsequentes, é fundamental que a taxa de bombeamento de fluxo seja uniforme e constante (SNYDER, 2000). As colunas cromatográficas usadas na purificação de peptídeos em sua maioria são formadas por partículas de sílica, porosas e esféricas, e sua 44 estrutura permite o uso de alta pressão para conduzir a amostra pela fase móvel, em curto intervalo de tempo (ALI et al., 2012). A purificação é obtida pela interação diferencial das biomoléculas peptídicas com a matriz da coluna. Os sinais das biomoléculas separadas são detectados por um detector cromatográfico, conectado ao final da coluna cromatográfica, que imediatamente após o contato com as biomoléculas, emitem sinais elétricos na forma de picos (JADAUN et al., 2017). Os detectores mais utilizados em CLAE são os detectores de UV-visível. Esses detectores são formados por espectrofotômetro, que mede a absorção de luz dos compostos em determinados comprimentos de onda, abrangendo as regiões visível e ultravioleta do espectro eletromagnético (NIKOLIN et al., 2004). 1.8.2 Espectrometria de Massas A caracterização pós-síntese de peptídeos é uma etapa de extrema importância para verificar e garantir que a estrutura molecular foi produzida corretamente. Dos vários métodos analíticos que compõe as análises proteômicas, a espectrometria de massas, em inglês Mass Spectrometry (MS), fornece a medição molecular mais eficiente (GRIFFIN & AEBERSOLD, 2001; AEBERSOLD & MANN, 2003). O desenvolvimento da MS foi em 1910, onde o ilustre físico inglês Joseph J. Thompson separou moléculas de gás conforme suas massas, a partir de análises com raios positivos. Francis W. Aston, aperfeiçoou o método desenvolvido por Thompson, afim de alcançar uma separação ainda maior de íons de diferentes massas, no entanto, com a mesma relação carga/massa (SQUIRES, 1998). O primeiro espectrômetro moderno foi desenvolvido em 1918, por Arthur J. Dempster, e melhorado no ano seguinte por Francis W. Aston. Os conceitos desenvolvidos por Dempster e Aston permanecem essenciais no desenvolvimento de espectrômetros modernos (GLISH & VACHET, 2003). A evolução das técnicas aplicadas à MS começou na década de 50. No entanto, o avanço da MS com aplicações em biomoléculas foi na década de 80, com o desenvolvimento das técnicas Matrix-Assisted Laser Desorpition/Ionization (MALDI) e da Electrospray Ionization (ESI) (BURDICK & STULTS, 1997). 45 O espectrômetro de massas, é formado por um compartimento operado em condições de alto vácuo, e este compartimento é composto pelas seguintes partes: 1) Sistema injetor de amostras, 2) Fonte de íons, em que os componentes analisados são convertidos em íons, 3) Analisador, onde os íons são separados em função da relação massa e carga (m/z) e 4) Detector de íons, responsável por transformar a corrente de íons detectadas em sinais elétricos e transmiti-los para um sistema de processamento de dados no formato de espectros de massas (CANTÚ et al., 2008). 1.9 Imunossensores Eletroquímicos Sensores são dispositivos capazes de detectar um analito formados por: (1) unidade receptora, de natureza biológica, orgânica ou inorgânica, que terá interação com o analito; (2) por arquitetura de interface fabricado em diversos materiais como polímeros e nanopartículas, onde acontecerá reações específicas e será emitido um sinal mensurável; (3) elemento transdutor, como eletrodos, onde o sinal transdutor será convertido em sinal eletrônico e amplificador por um circuito detector presente no equipamento de leitura e (4) software que processará os dados (GRIESHABER et al., 2008). Compreendido a composição dos sensores, biossensores se difere por possuírem uma unidade receptora formada por componentes biológicos, os biorreceptores, acoplados à um transdutor, que emitirá sinal em nanoescala (RICCARDI, COSTA & YAMANAKA, 2002). A interação de um biorreceptor e seu ligante depende da afinidade entre eles, medida pela constante de dissociação (Kd). Antígenos e anticorpos possuem alta afinidade (Kd= 10-12 a 10-8 mol L-1), e a interação que ocorre entre eles é semelhante ao modelo de interação chave-fechadura, onde os antígenos ligam somente a anticorpos específicos. A ligação antígenos- anticorpos resulta em alterações físico-químicas e emitem sinais que produzem pequenas correntes elétricas identificadas por transdutores (NELSON & COX, 2014; RANJAN et al., 2021). Imunossensor é um tipo de biossensor que possui como biorreceptores antígeno ou anticorpo imobilizado na superfície do transdutor. A variedade de transdutores permitiu o desenvolvimento de diversos imunossensores nos últimos anos, no entanto, os imunossensores eletroquímicos ganharam notoriedade dentre os demais, pela sensibilidade das medidas eletroquímicas 46 associada a seletividade das reações entre antígeno e anticorpo (RICCARDI, COSTA E YAMANAKA, 2002; AYDIN, AYDIN & SEZGINTÜRK, 2019). Imunossensores eletroquímicos têm sido desenvolvidos e aplicados com sucesso no diagnóstico de diversas doenças que vão dos mais diversos tipos de câncer, por exemplo, na detecção do antígeno CA-125 em câncer de ovário, as doenças infecciosas, como na identificação de proteínas epimastigota presente na membrana do Trypanossoma cruzi no diagnóstico da doença de Chagas (FERREIRA et al., 2005; GASPAROTTO et al., 2017; RANJAN et al., 2021). A grande vantagem dos imunossensores eletroquímicos é a possibilidade de fazer as medidas em qualquer local, sem necessidade de estruturas laboratoriais complexas, principalmente, pelo fato de atualmente os dados serem processados diretamente por meio de conexão com celular, além de oferecer resultados rápidos, usando pequenos volumes (µL) de amostras, com alta sensibilidade e especificidade, e custo acessível (AYDIN, AYDIN & SEZGINTÜRK, 2019). Trazendo essa alternativa de método diagnóstico para infecções que acometem animais, imunossensores eletroquímicos foram desenvolvidos para diagnósticos da leishmaniose (CORDEIRO et al., 2019; MARTINS et al., 2020). Até o presente momento não verificamos pesquisas publicadas ou testes diagnósticos comerciais disponíveis de plataformas diagnósticas baseadas em imunossensor eletroquímico para esporotricose felina. 47 2. JUSTIFICATIVA Os gatos possuem papel importante e são os principais responsáveis por epizootias e zoonoses na esporotricose. O Brasil, é o país com o maior número de casos de esporotricose felina no mundo, e nos últimos anos, observa-se além do aumento de casos, a expansão da doença de regiões endêmicas para não endêmicas, e para outros países da América do Sul, sobretudo os que fazem fronteira com o Brasil. O histórico de esporotricose felina no Rio de Janeiro e os consequentes problemas associados à doença como maltrato e abandono de gatos infectados despertou a atenção de pesquisadores de renomados centros de pesquisas como o Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas e a Fundação Oswaldo Cruz, e há décadas são pesquisados desde aspectos clínicos e epidemiológicos a formas de controle da doença. Desde então, essas pesquisas contribuem de forma expressiva por meio de ações de extensão implementadas pelas próprias instituições voltadas para atendimento e cuidados dos animais e auxiliam o setor público no desenvolvimento de políticas públicas e ações voltadas para controle e manejo adequado da esporotricose felina (ALBUQUERQUE et al., 2020). Porém, as epidemias de esporotricose felina nos demais estados brasileiros são recentes, assim como a atenção voltada à doença em relação a criação de políticas públicas e a oferta de serviços de assistência. Dentre os serviços de assistência, para ideal manejo clínico, o diagnóstico confirmado por métodos laboratoriais é indispensável. Dessa forma, melhorias no diagnóstico precoce é fundamental para combater a esporotricose. O Laboratório de Imunologia Clínica - FCF, Unesp, coordenado pela Profa. Dra. Iracilda Zeppone Carlos, atua no desenvolvimento de vacina para gatos contra esporotricose, e em meio aos estudos, fizeram uma relevante contribuição sobre o potencial antigênico da proteína enolase do Sporothrix schenckii (SsEno), e estão direcionando as pesquisas para o uso de peptídeos antigênicos derivados da SsEno em vacinas (Portuondo et al., 2016; Portuondo et al., 2019). Unindo as pesquisas do grupo da Profa. Dra. Iracilda Z. Carlos a experiência do Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa, coordenador do Laboratório de 48 Imunologia Clínica e Biologia Molecular - FCF, Unesp, no desenvolvimento de métodos diagnósticos a partir de imunossensor eletroquímicos, desenvolvemos essa tese com o intuito de criar um método e desenvolver plataforma diagnóstica através de imunossensor eletroquímico usando peptídeos antigênicos derivados da SsEno para esporotricose felina. 49 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Identificar epítopos lineares de células B na proteína enolase do Sporothrix schenckii 58251, sintetizar, caracterizar, verificar a imunorreatividade, desenvolver um método e aplicá-lo a plataforma portátil baseada em imunossensor eletroquímico para o diagnóstico da esporotricose felina. 3.2 Objetivo Específicos 1. Confirmação por diagnóstico laboratorial das amostras positivas e negativas para esporotricose felina; 2. Desenvolver método diagnóstico sorológico por ELISA usando a proteína enolase recombinante do Sporothrix schenckii (rSsEno); 3. Predição da enolase do Sporothrix schenckii e obtenção de potencial epítopo linear de célula B (PssE01); 4. Sintetizar o peptídeo PssE01; 5. Caracterizar a imunorreatividade do PssE01, frente as amostras controles positivos e negativos para esporotricose felina. 6. Preparação do biossensor eletroquímico para a imobilização do peptídeo sintético PssE01; 7. Determinar a reatividade do biossensor eletroquímico em condições tamponadas na ausência e presença da ligação do peptídeo; 8. Avaliar as imunorreatividades por leituras amperométricas pelo sistema portátil desenvolvido. 50 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Amostras Biológicas Para o desenvolvimento da plataforma diagnóstica foram usados como amostras clínicas sangue de gatos positivos (n=20) e sangue de gatos negativos (n=6) para esporotricose. As amostras positivas esporotricose foram doadas gentilmente pelo Dr. Sandro Antônio Pereira, Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos (Lapclin-Dermzoo), Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas (INI), Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro- RJ, Brasil. As amostras negativas para esporotricose foram doadas gentilmente pelo Prof. Dr. João Pessoa Araújo Júnior, Laboratório de Diagnóstico Molecular Veterinário (LDMVet)/Instituto de Biociências de Botucatu (IBB), UNESP, campus Botucatu. 4.2 Desenvolvimento de método diagnóstico sorológico por ELISA Ao verificamos a imunorreatividade da rSsEno (antígeno) frente aos soros de gatos (anticorpos), padronizamos pelo método pelo ELISA, desenvolvendo um novo método de diagnóstico sorológico para esporotricose felina usando a proteína enolase recombinante do S. schenckii. 4.2.1 Obtenção da Proteína Recombinante Enolase do Sporothrix schenckii O vetor plasmidial pET28a recombinante contendo o gene da enolase do S. schenckii 58251, massa molecular de 47 kDa, foi sintetizado pela Epoch Life Science Inc. (Missouri, Texas, EUA) e otimizado para produção em Escherichia coli BL21. O inserto foi clonado nos sítios das enzimas de restrição Ndel e EcoRI em fusão com um His-tag no terminal N. O plasmídeo resultante (pET28a::SsEno) foi capaz de expressar um polipeptídeo rSsEno contendo uma cauda histidina, com uma massa molecular de aproximadamente 50 kDa (PORTUONDO et al., 2019). 4.2.2 Concentração da proteína rSsEno A rSsEno foi expressa em sistema procarioto em suspensão de células de E. coli BL2/DE3 após indução com IPTG 1mM, durante 3horas a 37°C. O produto expresso foi purificado por afinidade em coluna de Niquel e posteriormente a amostra concentrada usando o dispositivo ultrafiltrante com membrana de 51 celulose regenerada Amicon Ultra-15 (Merck Amicon™, Darmstadt, Alemanha), e em seguida centrifugado com rotação de 4000 x g, à 6ºC por 25 minutos. A concentração da proteína rSsEno recombinante purificada foi de 446,7 µg/mL. 4.2.3 Padronização do ELISA Antes da descrição do método, é importante ressaltar que as amostras usadas, tanto positivas quanto negativas foram todas procedentes do Lapclin- Dermzoo, doadas gentilmente pelo Prof. Dr. Sandro Antônio Pereira para o Laboratório de Imunologia Clínica, FCF-UNESP, coordenado pela Profa. Dra. Iracilda Zeppone Carlos. As reações foram feitas em triplicatas, usando Microplacas High Binding, 96 poços (Corning Inc.®, Massachusetts, EUA). A microplaca foi sensibilizada com 100 µL/poço com as seguintes concentrações de antígeno: 1µg/poço e 100 ng/poço, em tampão carbonato (H2CO3), mantido em temperatura de 4ºC, pelo período de 18 horas. Após, a solução de antígeno foi descartada, e a placa lavada por 3 vezes, com o tampão PBS-Tween 0,2% e em seguida aplicados 200 µL/poço de tampão de bloqueio PBS-Tween 0,2% + BSA 3% (Bovine Serum Albumin - Albumina de Soro Bovino), e foi colocada na estufa à 37ºC por 1 hora. Os anticorpos primários foram os soros dos gatos. Foi usado pool de 5 amostras com soros de gatos positivos para esporotricose felina e pool de 5 amostras de soro de gatos negativos para esporotricose felina, diluído em tampão de bloqueio, nas seguintes diluições: 1:50, 1:100 e 1:500. Foi adicionado 100 µL/poço do anticorpo primário, e foi mantida em estufa à 37°C por 1 hora. Como controle foi usado apenas o antígeno e o anticorpo secundário, no substituindo o anticorpo primário pela solução de tampão de bloqueio. Ao final dessa etapa, a placa foi lavada por 3 vezes com o tampão PBS-Tween 0,2% e em seguida adicionado 100 µL/poço do anticorpo secundário, Anti IgG de gato em cabra conjugado (Goat Anti-Cat IgG Fc [Abcam, Cambridge, Reino Unido]), diluído em 1:15.000 e a placa incubada 37°C por 1 hora. Passado o tempo de incubação, a placa foi lavada por 3 vezes com o tampão PBS-Tween 0,2%. A revelação da reação foi feita pela adição de 100 µL/poço do substrato peroxidase e o 3,3’5,5-tetrametilbenzidina (TMB), protegido da luz por 20 minutos. A reação foi interrompida pela acidificação com a solução Stop Ácido Sulfúrico (H2SO4) 1N 52 ao aplicar 50 µL/poço. Ao final, a leitura da placa foi realizada no espectrofotômetro com absorbância a 450 nm usando filtro de referência em 620 nm/630 nm (figura 6). Os dados foram analisados usando GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, São Diego, Califórnia, EUA), as diferentes concentrações e diluições foram analisadas por variância One-Way (ANOVA), os resultados são apresentados como a média ± desvio padrão e a significância estatística foi determinada por ANOVA One Way, usando Teste de Tukey e intervalo de confiança de 95%. Os valores p considerados foram *(p < 0,05), **(p < 0,01), ***(p < 0,001) e ****(p < 0,0001) para comparação com o grupo controle ou conforme indicado. 53 Figura desenvolvida por Bruna M. Castilho. 4.3 Analise in silico da enolase de Sporothrix schenkii A sequência usada foi a enolase do Sporothrix schenckii 58251 (figura 7). Com 438 aminoácidos, possui registro ERS97971.1 no Genbank (National Center for Biotechnology Information [NCBI], U. S. National Library of Medicine). Link de acesso: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ERS97971.1. Figura 6. Descrição detalhada das principais etapas do ELISA para enolase do Sporothrix schenckii. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ERS97971.1 54 4.3.1 Predição do epítopo de célula B do Sporothrix schenkii Ao escolher os servidores para localizar as possíveis regiões antigênicas da enolase do S. schenckii, dois fatores foram levados em consideração: (1) Construído a partir de algoritmos de inteligência artificial ou aprendizado de máquina e (2) Treinado previamente com dados experimentais validados. O epítopo de célula B de Sporothrix schenckii foi obtido pelo uso de quatro servidores de predição baseados em algoritmos de inteligência artificial: 1) BEPIpred 2.0 (DTU Health Tec, Dinamarca); 2) DLBEpitope (Academy of Military Sciences of PLA, China); 3) iBCEL-EL (Ajou University Medical Center, Coréia do Sul) e 4) LBtope (Indraprastha Institute of Information Technology, Índia). As configurações usadas foram as recomendadas pelos desenvolvedores, e as particularidades de cada servidor estão descritas abaixo. 1) BepiPred 2.0 Foram considerados regiões iguais ou acima de 50% de probabilidade de ser epítopo. Regiões nas quais as sequências eram menores que 10 resíduos de aminoácidos, foram descartadas (JESPERSEN et al., 2017). Link do servidor: https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?BepiPred-2.0 2) DLBEpitope O servidor possui score formado por 11 classificadores, que quando selecionados e encontra-se mais próximo possível de 11, mais forte é o indício da região ser um epítopo. Neste servidor, também é possível selecionar o tamanho dos peptídeos, ou seja, por quantos aminoácidos eles serão formados, neste caso, com a experiência das predições em outros servidores, selecionamos o tamanho de 16 resíduos de aminoácidos. (LIU, SHI & LI, 2020). Figura 7. Sequência em formato FASTA da enolase do Sporothrix schenckii 58251. MAITKIHARYVYDSRGNPTVEVDVVTETGLHRAIVPSGASTGQHEACELRDGDKEKWGGKGVLTAVKNV NEIIGPAIIKEAVDVKDQSKVDKFLIDLDGTPNKTKLGANAILGVSLAIAKAGAAEKGVPLYAHVSDLA GTKKPYVLPVPFMNVLNGGSHAGGRLAFQEFMIVPSDAPSFSEALRWGAEVYQQLKSLAKKKYGQSAGN VGDEGGVAPDIQTADEALELIAEAIEKAGYTGRMNIAMDVASSEFYKEDVKKYDLDFKNPESDPTKWIT YEQLAQIYSDLSKKYPIVSIEDPFAEDDWEAWSYFYKTQNIQIVGDDLTVTNPLRIKKAIELKACNALL LKVNQIGTLTESIQAAKDSYADGWGVMVSHRSGETEDVTIADIVVGIRSGEIKTGAPARSERLAKLNQL LRIEEELGENAVYAGKNFRTSVNI MAITKIHARYVYDSRGNPTVEVDVVTETGLHRAIVPSGASTGQHEACELRDGDKEKWGGKGVLTAVKNV NEIIGPAIIKEAVDVKDQSKVDKFLIDLDGTPNKTKLGANAILGVSLAIAKAGAAEKGVPLYAHVSDLA GTKKPYVLPVPFMNVLNGGSHAGGRLAFQEFMIVPSDAPSFSEALRWGAEVYQQLKSLAKKKYGQSAGN VGDEGGVAPDIQTADEALELIAEAIEKAGYTGRMNIAMDVASSEFYKEDVKKYDLDFKNPESDPTKWIT YEQLAQIYSDLSKKYPIVSIEDPFAEDDWEAWSYFYKTQNIQIVGDDLTVTNPLRIKKAIELKACNALL LKVNQIGTLTESIQAAKDSYADGWGVMVSHRSGETEDVTIADIVVGIRSGEIKTGAPARSERLAKLNQL LRIEEELGENAVYAGKNFRTSVNI https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?BepiPred-2.0 55 Link do servidor: http://ccb1.bmi.ac.cn:81/dlbepitope/index.php?r=site%2Findex 3) iBCEL-EL Regiões acima de 85% foram as consideradas epítopos. O iBCEL-EL retorna regiões sobrepostas, e ao final da predição foi feito alinhamento no MAFFT (Universidade de Osaka, Japão) afim de obter os epítopos (MANAVALAN et al., 2018; KATOH, ROZEWICKI & YAMADA, 2019). Link do servidor: http://www.thegleelab.org/iBCE-EL/iBCE.html 4) LBtope A configuração usada no LBtope foi a “LBtope_fixed”. Foram consideradas regiões acima de 60% de probabilidade de serem epítopos. No entanto, regiões acima de 80% indicam percentual de probabilidade de predição mais correta quando comparado a percentuais de valores menores. As regiões retornadas pelo LBtope se sobrepõem, e ao final da predição foi realizado alinhamento no MAFFT afim de eliminar as regiões sobrepostas (SINGH, ANSARI & RAGHAVA, 2013). Link do servidor: https://webs.iiitd.edu.in/raghava/lbtope/contact.php As sequências obtidas em cada servidor foram alinhadas no MAFFT e as sequências finais desse alinhamento foram processadas no ESPript 3.0, SBGrid Consortium, Boston, EUA (ROBERT & GOUET, 2014). Selecionamos como potencial epítopo de célula B para proteína enolase do Sporothrix schenckii, a região em comum a todos servidores usados. A estrutura da enolase do S. schenckii e os todos potenciais epítopos lineares de célula B localizados foram feitos no Chimera X 1.2.5 (RVBI - Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics, Universidade da Califórnia, São Francisco, EUA). 4.4 Síntese de peptídeo antigênico O peptídeo antigênico foi sintetizado manualmente utilizando a estratégia de síntese Fmoc/tBut em fase sólida (MERRIFIELD, 1963). Conforme a estratégia adotada, a síntese ocorreu a partir do N-Terminal. Todos os reagen