UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA ―JÚLIO DE MESQUISTA FILHO‖ FACULDADE DE ENGENHARIA CAMPUS DE ILHA SOLTEIRA JÉSSICA JULIAN FERNANDES LIMA Zootecnista Desenvolvimento e desempenho reprodutivo de lambaris (Astyanax lacustris) cultivados em sistema de bioflocos e em sistema de recirculação com água clara ILHA SOLTEIRA 2022 JÉSSICA JULIAN FERNANDES LIMA Desenvolvimento e desempenho reprodutivo de lambaris (Astyanax lacustris) cultivados em sistema de bioflocos e em sistema de recirculação com água clara ILHA SOLTEIRA 2022 Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia – Unesp, Campus Ilha Solteira, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia Animal. Orientador: Prof. Dr. Alexandre Ninhaus Silveira Coorientadora: Profa Dra. Hellen Buzollo Pazzini DEDICO À sociedade brasileira que, apesar de todas as dificuldades, consegue ter esperança de um futuro melhor e continua lutando a cada dia. À Ciência Brasileira que tem se desenvolvido muito, ainda que não tenha o investimento que merece. Aos cientistas brasileiros que se esforçam todos os dias para melhorar o cenário científico do país e não desistem perante as dificuldades. E de forma exclusiva as mulheres do país. Mulheres que são estudantes ou trabalhadoras, têm filhos ou não, mas principalmente as mulheres que resistem e lutam dia após dia por seu lugar na sociedade, sem renunciar seus direitos e que levantam, se impõem e inspiram outras mulheres, afinal, quando uma mulher avança, todas avançam também. AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço aos meus familiares que me apoiaram durante toda minha trajetória e foram minhas inspirações e pilares para que eu continuasse meu caminho, conseguindo direcionar cada passo meu, rumo ao meu objetivo e desejo de vida. À minha mãe Alexandra e minha avó Mara que foram as principais responsáveis pela conclusão deste curso. Elas sempre serão as mulheres mais incríveis que conheci, as quais me inspiro todos os dias e vejo que desistir não é uma opção. Minha filha Maitê Jahzara que é meu maior presente, meu maior bem e chegou em minha vida para me mostrar o que é amor, responsabilidade e principalmente o significado de persistência e resiliência. Às minhas amigas Isis Parise, Geise Santos e Giovana Gonçalves que, ao longo de minha jornada me incentivam, apontam meus erros para minha melhora, acreditam em mim e que estão sempre próximas apesar da distância física. A Malbelys Padilha que foi minha parceira desde que cheguei ao Laboratório e sem dúvidas foi uma de minhas fontes de inspiração por toda sua força, disposição e determinação. Aos amigos Maiara Olivio, Laicia Leite, Luciane Gomes, Stella Indira, Gabrielli Tornoi, Valdomiro Colavite, Malu Magri e Jackeline Pricilla, que ganhei durante meu período de mestrado, que foram bastante receptivos em minha chegada na cidade e durante esse período alegraram meus dias. Aos professores Alexandre Ninhaus Silveira e Rosicleire Veríssimo Silveira que me aceitaram em seu laboratório, me ensinaram quais caminhos percorrer e confiaram em mim para o desenvolvimento de um projeto incrível. À professora Hellen Buzollo que me coorientou e auxiliou para o melhor desenvolvimento de minha dissertação. Aos professores Jayme Aparecido Povh e Marcelo Mattos Pedreira por todo auxílio em minha qualificação para melhoria do meu trabalho. À CAPES pelo auxílio financeiro durante o período de mestrado, à UNESP de Ilha Solteira por disponibilizar seus laboratórios para desenvolvimento de minha pesquisa. E por fim, agradeço a mim mesma, pela luta em chegar aqui, pela insistência, por ter aprendido minhas lições de vida e por ter me tornado essa mulher com muita garra, força e persistência que sempre fez questão de mostrar que uma mulher que é mãe, apesar das dificuldades, pode atingir seus objetivos. ―A mulher nasceu com todos os requisitos para ser vencedora. Só precisa tomar conhecimento do valor que representa a coragem de querer.‖ Roberta Miranda SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO GERAL 7 2 CAPÍTULO 1 – REVISÃO DE LITERATURA 8 2.1 Tecnologia de bioflocos (BFT) 8 2.2 Tecnologia de recirculação (RAS) 10 2.3 Astyanax lacustris 10 2.4 Avaliação de parâmetros ligados a produção e reprodução 12 2.5 Objetivos 14 2.5.1 Geral 14 2.5.2 Específicos 15 REFERÊNCIAS 3 CAPÍTULO 2 – DESENVOLVIMENTO E DESEMPENHO REPRODUTIVO DE LAMBARIS (ASTYANAX LACUSTRIS) CULTIVADOS EM SISTEMA DE BIOFLOCOS E EM SISTEMA DE RECIRCULAÇÃO COM ÁGUA CLARA 22 3.1 Introdução 23 3.2 Material e Métodos 24 3.2.1 Local e animais 24 3.2.2 Delineamento experimental 24 3.2.3 Pré-cultivo de bioflocos 25 3.2.4 Alimentação e análise de água 26 3.2.5 Coletas e variáveis analisadas 27 3.2.5.1 Desempenho zootécnico 28 3.2.5.2 Análise bromatológica dos bioflocos e análise bromatológica corporal dos peixes 28 3.2.5.3 Determinação dos Índices Gonadossomático, Índice Hepatossomático e Fatores de Condição 29 3.2.5.4 Análise histológica de gônadas 29 3.2.5.5 Análise dos caracteres reprodutivos 30 3.2.5.6 Aspectos cinéticos da motilidade espermática 30 3.2.5.7 Concentração espermática (espermatozoides/mm 3 ) 31 3.2.6 Análises estatísticas 32 3.3 Resultados 32 3.3.1 Qualidade de água 32 3.3.2 Desempenho Zootécnico 35 3.3.3 Bromatologia dos Peixes 35 3.3.4 Índice Gonadossomático e Fator de Condição Gonadal 36 3.3.5 Análise histológica das gônadas 37 3.3.6 Qualidade Seminal 37 3.4 Discussão 39 3.5 Conclusão 44 3.6 Agradecimentos 45 REFERÊNCIAS 46 7 1 INTRODUÇÃO GERAL O experimento foi conduzido no Laboratório de Ictiologia Neotropical, Departamento de Biologia e Zootecnia da UNESP, Campus de Ilha Solteira, durante 365 dias. Foram utilizados um total de 1600 indivíduos juvenis de lambari-do-rabo- amarelo (A. lacustris) com idade inicial de dois meses (peso: 2,43±0,86 g; comprimento total: 5,14±0,68), que foram distribuídos e cultivados em oito tanques de polietileno de 1000 litros. Os peixes foram submetidos a dois sistemas: tecnologia de bioflocos e recirculação com água clara (controle) com o delineamento inteiramente ao acaso. Foi considerado a relação C:N de 12:1 para desenvolvimento dos bioflocos. A alimentação foi realizada com base na porcentagem 3% da biomassa total de cada tanque, sendo corrigida mensalmente e diminuída para 1% quando os animais completaram quatro meses de vida. Foram analisados parâmetros de ganho de biomassa, taxa de crescimento específico, conversão alimentar, sobrevivência, taxa de eficiência proteica, fatores de condição, índice hepatossomático (IHS), índice gonadossomático (IGS), análises bromatológicas dos bioflocos e corporal dos peixes, histologia de gônada e características seminais. O IGS foi superior para os animais do cultivo em RAS no terceiro mês. O IHS foi superior no sistema BFT nos últimos dois meses. A composição corporal dos lambaris apresentou diferenças em relação valor de extrato etéreo que foi maior em machos da tecnologia BFT, enquanto os animais do sistema RAS obtiveram maior porcentagem de proteína bruta e cinzas. Todas as gônadas analisadas histologicamente estavam aptas a reprodução. Na primeira coleta a qualidade seminal dos animais cultivados em RAS foi superior quanto as variáveis de progressividade total e espermatozoides rápidos, na segunda coleta quanto à frequência de batimento flagelar e aos quatorze meses os animais do RAS tiveram espermatozoides com maior motilidade total, VSL (Velocidade curvilinear), VSL (Velocidade linear) e VAP (Velocidade média de trajetória). De acordo com os resultados obtidos pode-se concluir que o sistema de bioflocos é eficiente para o cultivo e manutenção de reprodutores de Astyanax lacustris, porém com leve melhoria da qualidade seminal para os machos mantidos no sistema RAS. 8 2 CAPÍTULO 1 – REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Tecnologia de bioflocos (BFT) Estima-se que em breve a população mundial chegará a nove bilhões de pessoas em poucos anos, portanto um dos grandes desafios no setor de produção alimentícia é o desenvolvimento de metodologias sustentáveis para a produção agropecuária, que tenham grande produtividade e menor impacto possível ao meio ambiente (FAO, 2020). Para o setor alimentício, a carne de peixe é um alimento de alta qualidade que apresenta baixos teores de gordura e altos teores de aminoácidos essenciais, minerais e vitaminas (FAO, 2016) e em relação a produção de organismos aquáticos, o relatório da FAO referente ao ano de 2008 (FAO, 2009) já considerava que o setor da produção piscícola no Brasil poderia ser um dos maiores produtores mundiais de pescado a curto prazo. Atualmente a maioria da produção de peixes de água doce realizada no Brasil tem base em sistemas de produção que utilizam viveiros escavados e tanques-rede. Nestes sistemas são necessários a utilização de alta quantidade de água de boa qualidade e este fato pode se tornar um grande entrave na questão de produção sustentável, pois se não forem seguidos manejos adequados de produção podem afetar a biodiversidade local e a qualidade de água de forma negativa, uma vez que, os insumos, medicamentos e excretas dos animais podem ser potenciais poluentes (SCHULTER; VIEIRA FILHO, 2017). Dentre as tecnologias sustentáveis para produção de peixes, uma que vem ganhando bastante destaque é a tecnologia de bioflocos (BFT), visto que é um sistema alternativo que possibilita criação em locais com restrição de espaço e de disponibilidade de água (VICENTE, 2014). Trata-se de um sistema fechado de cultivo e que para uma mesma quantidade de produção, quando comparado ao sistema tradicional (tanque escavado) com água clara, economiza cerca de 50 mil litros de água/dia, reduz custos com captação de água, elimina problemas com descarte de efluentes e possibilita economia no fornecimento de ração (AVNIMELECH, 2014; WASIELESKY, 2014). Na BFT se utiliza a relação C:N para conversão de resíduos nitrogenados, formando massas de conglomerados microbianos como fitoplâncton, bactérias e partículas orgânicas vivas e mortas (AHAMAD et al., 2017). Essa conversão é realizada em duas etapas, sendo a primeira, a oxidação da amônia em nitrito que é efetuada por bactérias amônia oxidantes e a segunda, é a metabolização do nitrito em nitrato realizada pelas bactérias nitrito oxidantes (FENCHEL; BLACKBURN, 1979). Para o desenvolvimento desse processo essas bactérias precisam de íons de carbonato e bicarbonato como nutrientes, ocorrendo então, consumo de alcalinidade (EBELING et al. 2006). A alcalinidade tem influência direta no pH da água, que tem a faixa entre 7 e 9 como ideal para o desenvolvimento das bactérias nitrificantes (CHEN et al., 2006). Outros parâmetros de grande importância para o processo de formação da biomassa microbiana são temperatura e oxigênio, pois segundo Burforf (2003) o oxigênio no ambiente, além de ser importante para os animais, é fundamental para respiração dos microorganismos presentes na água e de acordo com Cervantes et al. (2000) a faixa ótima de temperatura é entre 15 e 32°C. Essa biomassa fornece uma fonte complementar de alimento, que contém também diversos compostos bioativos que são úteis para melhorar os valores indicadores de bem-estar animal e apresenta compostos derivados que servem como probióticos e imunoestimulantes naturais (AHAMAD et al., 2017). A biomassa microbiana produzida no sistema BFT possui uma vasta gama de nutrientes como, proteínas, lipídeos, carboidratos, ácidos graxos, vitaminas e fibras, que poderão complementar as necessidades nutricionais dos peixes de cultivo. O estado nutricional dos peixes é uma importante variável que está atrelada diretamente ao processo reprodutivo destes, possibilitando o funcionamento adequado dos órgãos que controlam hormonalmente à reprodução, o desenvolvimento das gônadas e a produção dos gametas (NAVARRO et al., 2010; CRAB et al., 2012). Os bioflocos apresentam nutrientes que são apresentados como adequados para sua utilização como alimento na piscicultura, mas ainda são necessários mais estudos sobre a composição de ácidos graxos e aminoácidos neste alimento natural, já que ácidos graxos essenciais que influenciam na produção de prostraglandina, e a associação de qualidade proteica com a concentração de ácidos graxos altamente insaturados, resultaram em melhor desempenho reprodutivo em diversas espécies de peixes. (BELL et al. 1997; IZQUIERDO et al., 2001; CRAB et al., 2010a). Estudos com espécies nativas do Brasil cultivadas em sistema de bioflocos são escassas e publicações científicas que correlacionem o cultivo em sistema de bioflocos com qualidade seminal e desempenho reprodutivo para nativos não foram encontradas. Como este sistema de cultivo é interessante para preservação ambiental e apresenta características técnicas importantes para o contínuo desenvolvimento da produção piscícola, sendo necessário que mais estudos relacionados sejam feitos, para que certifiquemos que a BFT, não só seja eficiente na engorda de peixes, como também na manutenção de reprodutores, dando assim maior suporte para maior desenvolvimento da piscicultura de espécies nativas do país. 2.2 Tecnologia de recirculação (RAS) O sistema de recirculação é visto como um sistema sustentável de produção, pois permite que sejam produzidos organismos aquáticos durante todo o ano, com boa capacidade de estocagem, capacitando o controle de variáveis climáticas em pequenos espaços e permitindo a reutilização de água após processos de purificação (TIMMONS & EBELING, 2010). Por ser um sistema de produção fechado é considerado um sistema de maior biossegurança pois, diferente dos sistemas abertos, impede que ocorram fuga de espécies exóticas para o meio externo e minimiza também a disseminação de microogranismos patógenos nos ecossistemas locais (HELDBO, 2015). Este sistema utiliza até 99% menos água do que um sistema de cultivo tradicional, pois ocorre a reutilização da mesma água que é tratada através de cultivos físico- químicos mecânicos ou biológicos. Este tratamento tem como base a nitrificação e desnitrificação da amônia, onde as bactérias nitrificantes oxidam a amônia até transformá-la em nitrato, componente este, com menor toxicidade para os organismos do cultivo (SLIEKERS et al., 2002; MICHELS, 2011; NAZAR et al., 2013). O RAS tem mostrado projeções interessantes para o cultivo de espécies exóticas e nativas, tanto por questões ambientais, quanto por questões de grande eficiência produtiva (SOUSA et al., 2020; MEDINA et al., 2021; SANTOS et al., 2021), indicando, portanto, que estudos na área são fundamentais para desenvolvimento piscícola nacional e mundial. 2.3 Astyanax lacustris Trata-se de uma espécie de pequeno porte com tamanho entre 7,8 e 10,4 cm de comprimento total, ciclo de vida rápido, com boa adaptação para produção em cativeiro, onívoro com predominância para o consumo de detritos e vegetais superiores, reproduz o ano todo, desde que, com prevalência nos meses quentes, apresentando desova descontínua, periódica e anual (NOMURA, 1975; AGOSTINHO et al., 1984; SANTOS et al., 1991; RODRIGUES et al., 1992; EVANGELISTA, 2015) (Figura 1). A reprodução em cativeiro do lambari pode ser realizada de forma natural ou por meio de indução hormonal, permitindo assim o controle total do processo reprodutivo: ovulação e espermiação e fertilização, possibilitando o monitoramento das fases de fertilização e eclosão das larvas, facilitando o gerenciamento da produção de larvas, da alevinagem e da engorda (ANDRADE & YASUI, 2003; PORTO-FORESTI et al., 2010). Figura 1 – Exemplar de Astyanax lacustris. Fonte: Arquivo pessoal. Com o passar dos anos o lambari tem ganhado espaço na produção aquícola brasileira e hoje é visto como uma espécie de alta capacidade produtiva (ABIMORAD & CASTELLANNI, 2011). O lambari é aceito na culinária como petisco e na pesca esportiva como isca viva, na pesca de peixes carnívoros de maior porte (GARUTTI, 2003). Sua produção apresentou grande aumento entre o ano de 2013 e 2020 como apresentado na Tabela 1. 12 Tabela 1 – Comparação da produção de lambari (quilograma) no Brasil nos anos de 2013 e 2020. Fonte: IBGE (2022). 2.4 Avaliação de parâmetros ligados a produção e reprodução O ganho de biomassa é um dos fatores mais utilizados na produção piscícola e se trata da quantidade de animais produzido vezes o peso médio deles e este dado é bastante correlacionado à conversão alimentar, que faz referência a quantidade de ração que foi aproveitada pelos animais e convertida em massa corporal (MOHSENI et al., 2006; PEREIRA, 2021). O conhecimento da composição corporal do peixe é necessário para sua aceitação no mercado competitivo e em questão reprodutiva, esta composição tem grande influência no desenvolvimento do aparelho reprodutivo, portanto ter essas informações pode facilitar a correlação do estado nutricional do indivíduo à sua capacidade de mobilização energética para manutenção de suas atividades fisiológicas (BAZZOLI et al., 1996; DE BRITTO et al., 2014). Para o monitoramento do desenvolvimento zootécnico e reprodutivo dos peixes, são utilizados como indicadores o índice de fator de condição e, os índices hepatossomático e gonadossomático. O Fator de condição (LE CREN, 1958), é uma forma de indicar o bem-estar dos peixes, refletindo condições recentes aos quais tenham https://sidra.ibge.gov.br/Tabela/3940 sido submetidos, sendo considerados nesse sentido, por exemplo, condições ambientais e alimentação tendo influência direta aos aspectos reprodutivos do animal (AGOSTINHO, 1990) e este fator é determinado pela razão entre a massa total do indivíduo e o seu comprimento total, podendo ser calculado com ou sem o peso da gônada. A diferença entre o valor do fator de condição com e sem influência de gônada é chamado de fator de condição gonadal (VAZZOLER, 1996) e pode ser utilizado para observar o período reprodutivo do peixe, podendo ter relação direta com os índices gonadossomático e hepatossomático (BRANCO, 1992). O índice gonadossomático é a relação percentual da massa da gônada em relação a massa do animal e é utilizado como indicador do período reprodutivo dos peixes, devido ao fato de que a maturação das células reprodutivas ocorre juntamente com aumento da massa das gônadas (AGOSTINHO et al., 1990). Índice hepatossomático é a relação percentual do peso de fígado em relação ao peso do animal e é utilizado como forma indicativa de estoque de energia, que no caso é o glicogênio (CYRYNO et al., 2000; NAVARRO, et al. 2006). Este índice é importante quando relacionado ao fator de condição e índice gonadossomático, uma vez que, sua reserva energética é fonte de metabólitos para maturação gonadal. O indicador reprodutivo mais utilizado para machos em peixes é a avaliação seminal. As análises das características da morfologia espermática e análise de aspectos da motilidade dos espermatozoides, são pontos imprescindíveis para avaliação da qualidade seminal. Quanto as análises de motilidade espermática, até a poucos anos atrás somente eram realizadas por meio de avaliação subjetiva (MATOS, 2008), porém essa avaliação mesmo sendo eficiente, propiciava variações de 30 a 60% nos resultados, pois depende da experiência do observador, como também da limitação do olho humano em quantificar as diferentes subpopulações espermáticas de uma amostra (AMANN; HAMMERSTEDT, 1980; VERSTEGEN et al., 2002). Por conta de as análises subjetivas apontarem grandes variações, desde o início da década de 40 começaram a ser desenvolvidas metodologias para avaliações mais seguras e objetivas quanto a qualidade seminal de uma amostra (MATOS, 2008). Em 1985 foi desenvolvido o primeiro sistema CASA (Computer Assisted Sperm Analysis) para comercialização (MACK et al. 1988) tornando as análises seminais mais acuradas, práticas e rápidas (MATOS, 2008). O sistema CASA permite a observação, digitalização, análise sucessiva de imagens capturadas e, apesar o flagelo ser a estrutura necessária para motilidade, a avaliação do dos sistemas automáticos é realizada a partir do movimento da cabeça (AMANN; KATZ, 2004). Este sistema também tem capacidade para avaliar outras características em uma amostra seminal, como a morfologia do gameta, concentração espermática e a integridade de membrana (MATOS, 2008). Os parâmetros cinéticos avaliados por este sistema são: Velocidade Curvilínea (VCL) que avalia a velocidade da trajetória do espermatozoide; Velocidade Linear Progressiva (VSL) que analisa a velocidade obtida entre o ponto inicial e o ponto final da trajetória do espermatozoide; Velocidade Média de Trajetória (VAP), responsável pela averiguação da velocidade média de espermatozoides que apresentam trajetórias irregulares; Amplitude de Deslocamento Lateral da Cabeça (ALH) que representa a amplitude de deslocamento da cabeça do espermatozoide; Frequência de Batimento Flagelar Cruzado (BCF) que indica a quantidade de vezes que o espermatozoide transpassa a direção de seu movimento; Retilinearidade (STR) que é a associação percentual entre VSL e VAP, estima a proximidade do percurso da célula a uma linha reta; e Linearidade (LIN) que apresenta a associação percentual entre VSL e VCL (VERSTEGEN et al., 2002). A partir das avaliações citadas é possível observar a qualidade seminal em pontos como a hiperativação espermática que está ligado ao processo de capacitação e fertilização (VERSTEGEN et al., 2002), os danos espermáticos que podem ser ocasionados por agentes físicos ou químicos, por meio de análise morfológica (VERSTEGEN et al, 2002; GARCIA-HERREROS et al, 2006) e a fertilidade que pode ser correlacionada com os parâmetros cinéticos (MATOS, 2008). 2.5 Objetivos 2.5.1 Geral O objetivo deste projeto foi avaliar desempenho zootécnico e reprodutivo no cultivo de Astyanax lacustris em dois sistemas de cultivo: tecnologia de bioflocos (BFT) e sistema de recirculação de água clara (RAS). 2.5.2 Específicos  Analisar o desempenho zootécnico de A. lacustris mantidos em sistema BFT e em sistema RAS;  Avaliar desenvolvimento gonadal de machos de A. lacustris mantidos em sistema BFT e em sistema RAS;  Verificar histologicamente se a metodologia de cultivo interferiu no desenvolvimento de gônadas de machos de A. lacustris;  Avaliar se os sistemas de cultivo BFT e RAS influenciariam na qualidade espermática de machos de A. lacustris;  Determinar se os bioflocos influenciam na composição corporal de A. lacustris;  Determinar da composição nutricional dos bioflocos. 16 REFERÊNCIAS ABIMORAD, E. 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A alimentação foi realizada com base na porcentagem 3% da biomassa total de cada tanque e diminuída para 1% quando os animais completaram quatro meses de vida. O fator gonadal e IGS foi superior para os animais do cultivo em RAS no terceiro mês de cultivo, porém todas as gônadas analisadas histologicamente, dos animais do BFT e RAS, estavam aptas a reprodução. O IHS foi superior no sistema BFT no terceiro meses de cultivo. Os machos do BFT obtiveram maior porcentagem de matéria seca e extrato etéreo em sua composição corporal, enquanto os animais do sistema RAS obtiveram maior porcentagem de proteína bruta e cinzas. Aos cinco meses de idade os animais do RAS obtiveram as variáveis de progressividade total e espermatozoides rápidos e frequencia de batimento flagelar superiores aos machos do BFT. Aos quatorze meses de idade aos animais do RAS tiveram espermatozoides com maior motilidade total, VSL (Velocidade curvilinear), VSL (Velocidade linear) e VAP (Velocidade média de trajetória) comparados aos animais do BFT. De acordo com os resultados obtidos pode-se concluir que o sistema de bioflocos é eficiente para o cultivo e manutenção de reprodutores de Astyanax lacustris, porém com leve melhoria da qualidade seminal para os machos mantidos no sistema RAS. Palavras-chave: aquicultura sustentável; características seminais; cinética espermática; reprodução de peixes. ABSTRACT A total of 1600 juvenile lambari-do-rabo-amarelo with an initial age of two months were used. Fish were subjected to two systems: biofloc technology (BFT) and clear water recirculation (RAS) with a completely randomized design. Feeding was performed based on the percentage 3% of the total biomass of each tank and reduced to 1% when the animals completed four months of life. The gonadal factor and IGS were superior for the animals of the RAS culture in the third month of culture, but all the gonads analyzed histologically, from the animals of the BFT and RAS, were capable of reproduction. The IHS was higher in the BFT system in the third month of cultivation. BFT males had a higher percentage of dry matter and ether extract in their body composition, while RAS animals had a higher percentage of crude protein and ash. At five months of age, the RAS animals obtained the variables of total progressivity and fast spermatozoa and frequency of flagellar beating superior to the males of the BFT. At fourteen months of age, the RAS animals had sperm with higher total motility, VSL (Curvilinear Velocity), VSL (Linear Velocity) and VAP (Average Trajectory Velocity) compared to the BFT animals. According to the results obtained, it can be concluded that the biofloc system is efficient for the cultivation and maintenance of Astyanax lacustris reproducers, but with a slight improvement in seminal quality for males kept in the RAS system. 23 Keywords: fish reproduction; sustainable aquaculture; seminal traits; sperm kinetics. 3.1 Introdução A tecnologia de bioflocos (BFT) tem como princípio a transformação de compostos nitrogenados dissolvidos na água, mediante a adição de fontes de carbono e, através dessa transformação, ocorre uma produção de biomassa microbiana na água, que pode ser aproveitada pelos animais e geralmente apresentam alto teor de proteína bruta (FÓES, GAONA, POERSCH, 2012). Esta tecnologia vem apresentando vantagens no cultivo de camarões como o aumento da produtividade, utilização de menores áreas de cultivo, aumento da biossegurança, diminuição ou isenção da renovação de água, maior estabilidade do sistema, diminuição da quantidade de proteína nas rações, maior disponibilidade de alimento natural, comunidade microbiana atuando como probiótico, menores unidades de cultivo com maior controle, menor impacto ambiental e possibilidade de cultivo em regiões afastadas da costa no caso de espécies marinhas (WASIELESKY et al, 2013). Com peixes foi possível constatar que os exóticos como carpa e tilápia se adaptam bem ao BFT (SAMPAIO et al, 2011) e que estudos ou aplicação de espécies nativas brasileiras em bioflocos são poucos ou nulos (ABAD et al., 2014; POLI et al., 2015; BARRERO et al., 2012; SGNAULIN et al., 2018; DANTAS et al., 2018). Não foi encontrado estudo de lambaris cultivados em tecnologia de bioflocos, porém trata-se de um peixe de pequeno porte, com ciclo de vida rápido, e boa adaptação para produção em cativeiro, que é definido como onívoro com predominância para o consumo de detritos e vegetais superiores e que possui boa aceitação no mercado, podendo ser vendido como petisco, isca para pesca esportiva ou matéria-prima para produção de farinha de peixe (NOMURA, 1975; AGOSTINHO et al., 1984; SANTOS et al., 1991; PORTO-FORESTI et al., 2001; HAYASHI et al., 2004; SALARO et al., 2008; EVANGELISTA, 2015), características então que o tornam um peixe interessante para estudos dentro deste sistema. Emereciano et al. (2011) ressaltam que os componentes contidos no sistema de bioflocos influenciam para formação da gônada em animais jovens e que a disponibilidade contínua de alimento pode promover a incorporação de nutrientes essenciais resultando em uma melhor atividade de formação e produção de tecidos 24 sexuais. Estudos com o camarão azul (Litopenaeus stylirostris) e o camarão rosa (Farfantepenaeus dourarum) também demonstraram resultados interessantes quando comparados ao sistema tradicional de cultivo, com aumento do número de ovos e da atividade de desova e, com isso, foi suposto que essa melhoria ocorreu devido ao melhor controle dos parâmetros físico-químicos da água, juntamente com a disponibilidade contínua de nutrientes proporcionada pelos bioflocos, sob a forma de ácidos graxos, vitaminas, fosfolipídios e proteínas, enquanto em sistemas convencionais os animais ficam limitados à alimentação fornecida (ração) (EMERECIANO et al., 2011; EMERECIANO et al., 2012). Estudos recentes em torno da reprodução com peixes neste sistema heterotrófico apresentam resultados superiores para as variáveis do ciclo reprodutivo, morfologia dos ovários, fecundidade e desempenho reprodutivo de tilápia-do-Nilo Oreochromis niloticus (EKASARI et al., 2013; ALVARENGA et al., 2017). A escassez de informações correlacionando reprodução e BFT torna importante essa pesquisa desenvolvida e, com isso, a mesma teve como objetivo verificar se houve diferença no desenvolvimento reprodutivo nos machos de lambari cultivados em tecnologia de bioflocos e em sistema de recirculação com água clara. 3.2 Material e Métodos 3.2.1 Local e animais Para o estudo, foram utilizados exemplares alevinos de Astyanax lacustris, pertencentes ao Laboratório de Ictiologia Neotropical (L.I.NEO), Universidade Estadual Paulista ―Júlio de Mesquita Filho‖, Campus de Ilha Solteira, onde foi realizado o experimento. O experimento foi realizado dentro das normas para uso de animais em estudos científicos após aprovação pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais (CEUA- FEIS/UNESP 02/2021). 3.2.2 Delineamento experimental O experimento foi conduzido por um período de um ano (365 dias), iniciando com a seleção de 1600 juvenis de Astyanax lacustris com idade de dois meses (peso inicial: 25 2,43±0,86 g; comprimento total: 5,14±0,68; comprimento padrão: 4,28±0,61), que foram distribuídos em dois sistemas de produção: tecnologia de bioflocos (BFT) e recirculação (RAS). Em casa sistema foram utilizados quatro tanques de 1000 L (quatro unidades experimentais) compostos tanques de 1000L cada, caracterizando quatro repetições por tratamento. O sistema de recirculação com água clara (RAS) foi composto por quatro tanques em sistema de circulação fechada, com aeração continua e aquecedor com termostato para controle de temperatura (27ºC), o sistema bioflocos (BFT) foi composto por quatro tanques individualizados, com aeração contínua e aquecedor com termostato para controle da temperatura (27ºC) em cada um deles, sendo o delineamento experimental inteiramente ao acaso (Figura 1). Figura 1 – Representação dos Sistemas de Cultivo. Nota: *RAS – Sistema de recirculação de água clara; BFT – Sistema de bioflocos. Fonte: Próprio autor. 3.2.3 Pré-cultivo de bioflocos Foram montados dois tanques (1000 L) para o pré-cultivo de água com bioflocos, antes do início de período experimental. Os dois tanques de 1000 litros foram preenchidos com água clara, com aeração individual contínua, onde foram inseridos 25 lambaris adultos. Nos primeiros dez dias de cultivo foram adicionados diariamente 300 gramas de melaço em pó e, após esse período, o melaço de cana foi adicionado com base na relação C:N 12:1, quando a concentração de amônia tóxica ultrapassava 1 mg/L - 26 1 , utilizando o cálculo de correção (AVNIMELECH, 1999; AVNIMELECH, 2007; SAMOCHA et al, 2007). Para as unidades experimentais da BFT foi utilizado 10% de água de um BFT previamente formado e 90% de água clara. 3.2.4 Alimentação e análise de água Os animais foram alimentados duas vezes ao dia (09:00 a.m. e 17:00 p.m.), com ração comercial de 32% de PB, inicialmente na proporção de 3% da biomassa total e aos quatro meses de idade dos animais houve readequação de alimentação para 1% da biomassa total de peixes/ tanque/dia. Mensalmente foi realizada biometria de 20% dos animais de cada tanque para correção da quantidade de ração fornecida a serem fornecido a estes. Parâmetros de qualidade de água como: oxigênio dissolvido (OD), temperatura (ºC) e pH foram analisados duas vezes por dia (09:00 a.m. e 17:00 p.m.) com utilização equipamento multiparâmetro (AKSO – AK88). As concentrações de amônia, nitrito e nitrato foram avaliadas três vezes por semana (às 08:30 p.m., antes da primeira alimentação do dia) utilizando kit Labcon Test Amônia Tóxica - Água Doce, Kit Labcon Test Nitrito - Água Doce e KitNutriflora Test Nitrato - Água Doce. Ao início do experimento foi adicionado 1 kg de sal (NaCl) em cada tanque de BFT, para controle do Nitrito. Nas unidades com sistema de bioflocos, o ajuste da quantidade de carbono foi feito pela adição do melaço em pó, utilizando a relação C:N 12:1 e foi realizada mensuração de sólidos suspensos sedimentáveis (SS) (mL L -1 ) uma vez por semana (entre 07:00 a.m. e 9:00 a.m.). Para mensuração de sólidos suspensos sedimentáveis foram coletadas, de cada unidade experimental, amostras de 1000 mL da água de cultivo em cone Imhoff, que eram deixadas imóveis em estrutura adequada por uma hora até que os sólidos decantassem e fossem feitas as leituras em mL.L -1 através da marcação presente no cone. 27 3.2.5 Coletas e variáveis analisadas As análises de qualidade de água, desempenho zootécnico, determinação de índice gonadossomático, índice hepatossomático, fatores de condição, análise histológica de gônada e análise seminal foram realizadas nos três primeiros meses experimentais. Após um ano de experimento repetiu-se apenas as análises seminais que eram o foco do estudo em questão. 3.2.5.1 Desempenho zootécnico Mensalmente, nos três primeiros meses de cultivo, 20% dos peixes de cada tanque foram pesados (g), com balança de precisão (0,1 g de precisão) e medidos os comprimentos total e padrão (cm) com paquímetro (precisão 0,02 mm) e, a partir destes dados, foram calculados o ganho de biomassa, taxa de crescimento específico, conversão alimentar aparente e taxa de eficiência proteica, com vistas a avaliar o desempenho de A. lacustris, sendo ao final quantificados os seguintes itens: Ganho de Biomassa Total (GBT) = (Biomassa média final - Biomassa média inicial) Taxa de Crescimento Específico (TCE) = [100 x (ln do peso final - ln do peso inicial) / (tempo de cultivo)]; Taxa de sobrevivência (S) = [100 x (população final - população inicial)]; Conversão Alimentar Aparente (CAA) = (Quantidade de alimento fornecido/ ganho de biomassa); Ta a de efici ncia proteica (TEP) ganho em peso vivo prote na ruta consumida 28 3.2.5.2 Análise bromatológica dos bioflocos e análise bromatológica corporal dos peixes Para que verificação da composição química nutricional dos bioflocos e o que alterou na composição estrutural dos peixes foram realizadas análises bromatológicas dos bioflocos e dos peixes inteiros (machos) ao final do terceiro mês de cultivo (animais com cinco meses de idade), tanto do sistema RAS, como do BFT. As amostras de bioflocos foram coletadas ao final do experimento com auxílio de uma rede feita de tecido de nylon branco de 68 micras que capturou somente os flocos para análise e para análise dos peixes inteiros, foram amostrados oito machos de cada tanques. As amostras foram armazenadas em recipientes de plástico identificados e conservados em congelador a -10º C para as posteriores análises. Os bioflocos e os peixes coletados (com vísceras) foram moídos para determinação de matéria seca, cinzas, porcentagem de proteína bruta pelo método Kjeldahl e porcentagem de gordura pelo método de Soxhlet de acordo com a metodologia da A. O. A. C. (2000). Os bioflocos dos quatro tanques de cultivo apresentaram valores médios 6,65% de matéria seca, 45,71% de cinzas, 0,61% de extrato etéreo e 20,36% de proteína bruta (Tabela 1). TABELA 1 – Análise bromatológica dos bioflocos. Tanque Componentes MS (%) CZ (%) EE (%) PB (%) 1 6,03 45,63 0,62 20,45 2 7,13 46,55 0,45 20,72 3 7,37 47,36 0,62 19,35 4 6,05 43,29 0,73 20,93 Nota: MS = Matéria seca; CZ = Cinzas; EE = Extrato etéreo; PB = Proteína bruta. Fonte: Próprio Autor 29 3.2.5.3 Determinação dos Índices Gonadossomático, Índice Hepatossomático e Fatores de Condição Foram realizadas coletas de fígado e gônada dos machos no primeiro, segundo e terceiro mês de cultivo (quando os animais tinham três, quatro e cinco meses de idade respectivamente). Foram amostrados três machos de cada tanque, totalizando doze gônadas e doze fígados coletados por mês de cada sistema. Os animais foram eutanasiados por meio de exposição prolongada à solução de benzocaína (1g de benzocaína:10 mL de ácool absoluto) sendo extraídos os órgãos, para análise. Os parâmetros analisados foram: Fator de condição (K) = Wt/Lt b (Vazzoler, 1996); Fator de condição sem a influência da massa de gônada (K’) = Wc/Lt b (Vazzoler, 1996). Fator de condição gonadal (∆K) = K-K’ Wg/Lt b (Vazzoler et al., 1989b). Wt = Massa total (g); Lt = Comprimento total (mm); b = Coeficiente angular da regressão entre Wt/Lt; Wg = Massa da gônada (g); Wc (Massa corporal – massa da gônada) = Wt – Wg. Índice Hepatossomática (IHS%) – [(Massa do fígado (g)/massa total do peixe (g) X 100]. Índice gonadossomático (IGS%) – [(Massa da gônada (g)/massa total do peixe (g) X 100]. 3.2.5.4 Análise histológica de gônadas Foram processadas e analisadas oito gônadas dos machos que chegaram com dois meses de idade e depois, mensalmente, oito gônadas por sistema de cultivo. As amostras foram seccionadas e fixadas em solução de 4% e glutaraldeído a 2,5% em tampão fosfato Sorensen 0,1 M a pH 7,2 (Karnovsky). Posteriormente secções da região 30 medial dos testículos foram desidratados em concentrações crescentes de álcool (70% e 95%) inclu dos em glicol metacrilato historesina (LEICA ®), seccionados a 3.0μm de espessura com auxílio do micrótomo (LEICA RM 2145; Leica Instruments GmbH, Nussloch Heidelberg, Alemanha) equipado com lâmina de vidro (LEICA RM 2245) e coradas em Hematoxilina e Eosina (HE). Para o fotoprocessamento e análises foi utilizado microscópio de luz Zeiss - Scope.A1 equipado com câmera AXIOCAM MRC5. Para a caracterização das fases do ciclo reprodutivo seguiu-se o proposto por Brown-Peterson et al. (2011). 3.2.5.5 Análise dos caracteres reprodutivos Foram realizadas coletas de sêmen ao final do terceiro mês de cultivo (quando os animais tinham cinco meses de idade) e após doze meses de cultivo (quando os animais tinham quatorze meses de idade), mantidos nas condições acima descritas para o BFT e RAS. Para obtenção do sêmen, cinco machos de cada tanque foram capturados, anestesiados com anestesia (2 g de eugenol:20 mL de álcool absoluto), pesados, medidos com ictiômetro e submetidos à indução hormonal. A aplicação foi feita na base da nadadeira peitoral e para indução foi aplicado extrato de hipófise de carpa (EBHC) na dosagem de 3 mg/kg de peixe vivo, diluída em soro fisiológico, em dose única (BEM et al. 2012; YASUI et al., 2014; NASCIMENTO et al., 2017; CARNEIRO-LEITE et al., 2020). A liberação dos gametas foi controlada utilizando a relação hora-grau de 226 UTA para extrusão, quando o sêmen foi retirado por massagem abdominal no sentido antero-posterior e disposto em microtubo limpo e esterilizado. 3.2.5.6 Aspectos cinéticos da motilidade espermática Foi utilizado o sistema C.A.S.A. (ISAS ® Integrated Semen Analysis System, Proiser, Valência, Espanha), composto por um computador acoplado a uma câmera analógica (ISAS 782C, Proiser, Espanha) conectada a um microscópio (UB200i (UOP / Proiser) com um objetiva de contraste de fase negativa de 10x. O software foi calibrado 31 para captura de 25 imagens / segundo (FPS), considerando a velocidade espermática mínima de 10µm/s, sendo que as capturas ocorreram a cada 10 segundos após a ativação do sêmen com água destilada. Os parâmetros cinéticos avaliados foram: Motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e as velocidades espermáticas: velocidade curvilinear (VCL, μm/s); velocidade linear (VSL, μm/s); velocidade média (VAP, μm/s); porcentagem de espermatozóides rápidos, médios e lentos; coeficiente de linearidade (LIN, %; calculado como VSL/VAP); coeficiente de retilinearidade (STR, %; calculado como VSL/VCL); oscilação média da trajetória espacial do espermatozoide, oscilação e WOB (%); amplitude do movimento lateral da cabeça (ALH, μm); frequência de batimento flagelar (BCF, Hz). Para a análise seminal o sêmen era disposto em uma Câmara de Makler (Sefi – Medicals Instruments), sendo ativado com água destilada na proporção 1:30 µl (sêmen:ativador). 3.2.5.7 Concentração espermática (espermatozoides/mm 3 ) Para estimar a concentração espermática, foi utilizada a câmara hematimétrica tipo Neubauer Improved (Bright-line; HBG). O sêmen foi coletado de três exemplares por tanque e diluído em solução de formol-salina na proporção de 1:1000 µl (sêmen:solução). A contagem foi realizada em cinco quadrados da câmara superior e cinco quadrados da câmara inferior, como demonstrado na figura 2. Figura 2 – Delineamento da contagem dos espermatozóides. Fonte das figuras: agroads.com.br e qconcursos.com https://www.agroads.com.br/ 32 Os dados obtidos de cada espécime eram colocados na equação abaixo para determinação da concentração espermática média individual. Sptz/mL = [(∑n ((∑grade superior + inferior / 2) ∑3 repetições por amostra / 3)) * 50.000 # ] * 1000 # Fator de diluição 1:1000. 3.2.6 Análises estatísticas As variáveis dependentes foram submetidas aos testes de normalidade de Shapiro- Wilk e de Levene para homogeneidade de variâncias. Foi utilizado o Peso inicial (g) como covariável para analisar Peso final (g), Ganho de massa (g), Ganho de massa diário (g), Conversão Alimentar Aparente. Foi utilizado a Biomassa inicial como covariável para analisar Biomassa final (kg) e o Ganho de biomassa (kg). Foram utilizados o Comprimento Total inicial (cm) e o Comprimento Padrão Inicial (cm) como covariável para analisar Comprimento total final (cm) e o Comprimento Padrão Final (cm) respectivamente. Sendo verificado normalidade e homogeneidade de variâncias, as variáveis dependentes foram analisadas por um modelo com uma variável independente (Anova - One Way). Cada caixa foi considerada como uma unidade experimental e cada tratamento recebeu quatro caixas. Todas as análises foram feitas seguindo as recomendações de Zar (2010) e utilizando o Sistema de Análise Estatística (Sas, 2002). O nível de significância utilizado em todos os testes foi de 0,05. 3.3 Resultados 3.3.1 Qualidade de água Os parâmetros de oxigênio dissolvido, temperatura e pH não diferiram (p>0,05) entre os cultivos BFT e RAS (Tabela 2) e no cultivo de bioflocos os sólidos sedimentáveis do sistema de bioflocos estiveram entre 4,5 mL/L e 20,5 mL/L, sendo os picos mais elevados no primeiro mês experimental (Figura 3). 33 Tabela 2. Valores médios (±desvio padrão) dos parâmetros de qualidade de água dos cultivos do lambari-de-rabo-amarelo Astyanax lacustris em tecnologia de bioflocos e recirculação durante os três meses. SISTEMA PARÂMETROS Oxigênio Dissolvido (mg/L) Temperatura (ºC) pH BFT 6,59±1,07 25,92±2,39 8,64±0,28 RAS 6,74±0,93 26,47±2,27 8,65±0,33 Fonte: Próprio autor Figura 3 – Variação dos sólidos sedimentáveis (mL/L) na tecnologia de bioflocos aos quais os machos de Axtyanax lacustris foram submetidos Fonte: Próprio autor No primeiro mês experimental a amônia (NH3) do sistema de recirculação variou entre 0 e 0,5 mg/L -1 e posteriormente zerou e não tornou a aumentar, enquanto na tecnologia de bioflocos o maior pico foi no primeiro mês chegando a 3,5 mg/L -1 e depois baixou e teve valor máximo de 1.0 mg/L -1 . O nitrito (NO2-) do sistema de recirculação ficou entre 0 e 0,5 mg/L -1 durante os três meses e no BFT os valores mais altos foram apresentados no segundo mês após o valor da amônia baixar, chegando a 2,2 mg/L -1 e baixando no início do terceiro mês. Os valores de nitrato (NO3-) tiveram maior conformidade entre os dois sistemas, aumentando no segundo mês chegando a 100 mg/L -1 no BFT e 50 mg/L -1 no RAS e baixando no terceiro mês obtendo os valores 34 máximos de 36,2 mg/L -1 na tecnologia de bioflocos e 25,0 mg/L -1 na tecnologia de recirculação (Figura 4). Figura 4 – Variação dos compostos nitrogenados (mg/L -1 ) nos tanques experimentas aos quais os machos de Axtyanax lacustris foram cultivados Fonte: Próprio autor 35 3.3.2 Desempenho Zootécnico Após três meses de cultivo o ganho de biomassa total não diferiu (P>0,05) entre os sistemas de produção em BFT (5,23±0,24 kg) e RAS (5,37±0,68 kg). Da mesma forma, a conversão alimentar, taxa de crescimento específico, taxa de eficiência proteica e os fatores de condição com e sem influência da gônada não diferiram (P>0,05) entre os dois sistemas de produção. No entanto, o índice hepatossomático foi maior (P=0,007) nos peixes produzidos em BFT (0,90±0,21 %) em relação aos peixes produzidos em RAS (0,64±0,21 %) (Tabela 3). Tabela 3 – Parâmetros biológicos (média±desvio padrão) de lambari-do-rabo-amarelo Astyanax lacustris (cinco meses de idade) após três meses de cultivo sob tecnologia de bioflocos e recirculação com água clara. Características Sistema BFT RAS Valor P CV (%) GBT (kg) 5,23±0,24 5,37±0,68 0,575 6,13 CAA 1,92±0,08 1,98±0,32 0,666 9,62 TCE (%) 1,28±0,04 1,30±0,04 0,636 3,31 TEP (%) 0,86±0,03 0,83±0,14 0,895 11,12 IHS (%) 0,90±0,21 a 0,64±0,21 b 0,007 12,27 K 1,17±0,14 1,22±0,06 0,14 3,51 K’ 1,14±0,14 1,19±0,06 0,18 3,59 SOB (%) 100 100 - - Nota: GBT = Ganho de biomassa total; CAA = Conversão alimentar aparente TCE = Taxa de crescimento específico; TEP = Taxa de eficiência proteica; IHS = Índice hepatossomático; K = Fator de condição sob influência do peso de gônada; K’ = Fator de condição sem influência do peso de gônada; SOB = Sobrevivência. Médias na mesma linha diferem estatisticamente entre si quando P<0,05. Fonte: Próprio autor 3.3.3 Bromatologia dos Peixes A matéria seca e extrato etéreo foram maiores (P=0,001 e P=0,0004, respectivamente) nos peixes produzidos em BFT comparativamente aos peixes produzidos em RAS. Por outro lado, cinza (P=0,006) e proteína foram maiores (P=0,025) nos peixes produzidos em RAS. 36 Tabela 3 – Análise bromatológica corporal de machos de Astyanax lacustris cultivados em tecnologia de bioflocos e recirculação (média±desvio padrão). Sistema Componentes MS (%) CZ (%) EE (%) PB (%) BFT 34,05±0,09 a 12,84±0,61 b 39,09±2,20 a 49,68±1,94 b RAS 30,88±0,47 b 14,69±0,10 a 30,88±2,45 b 53,35±1,63 a Valor P 0,001 0,006 0,0004 0,025 CV (%) 1,75 4,30 7,50 4,25 Nota: MS = Matéria seca; CZ = Cinzas; EE = Extrato etéreo; PB = Proteína bruta. Médias na mesma coluna diferiram estatisticamente entre si quando P<0,05. Fonte: Próprio autor 3.3.4 Índice Gonadossomático e Fator de Condição Gonadal Não houve diferença estatística (P>0,05) entre os fatores de condição gonadal entre os animais dos dois sistemas de cultivo, porém o índice gonadossomático foi superior (P=0,031) no sistema de Recirculação (RAS) no terceiro mês de cultivo (Figura 5). Figura 5 – Índice gonadossomático de machos de Astyanax lacustris cultivados em tecnologia de bioflocos e recirculação (média±desvio padrão) Nota: Letras minúsculas fazem comparação entre as médias do sistema BFT e RAS a cada mês. Médias diferiram estatisticamente entre si quando P<0,05. Fonte: Próprio autor 37 3.3.5 Análise histológica das gônadas Todos os animais que tiveram suas gônadas analisadas apresentaram foram classificados como aptos à reprodução, mostrando também que os animais do estudo já haviam desenvolvido os testículos desde o início do experimento e o sistema de cultivo avaliados de cultivo testados possibilitaram que os animais realizassem seu ciclo reprodutivo, em suma tivessem o desenvolvimento das células espermáticas adequadamente. 3.3.6 Qualidade Seminal No final do terceiro mês de cultivo, os lambaris criados em água clara (RAS) apresentaram valores maiores para aos parâmetros de cinética espermática de: progressividade (P=0,048), porcentagem de espermatozoides rápidos (P=0,042) e, frequência de batimento flagelar (P=0,010). Enquanto para os parâmetros de motilidade total, quantidade de espermatozoides médios e lentos, velocidade curvilinear, velocidade linear e velocidade média de trajetória, coeficiente de linearidade, coeficiente de retilinearidade, oscilação média da trajetória espacial do espermatozoide, amplitude do movimento lateral da cabeça e concentração não foi detectada diferença significativa entre os tratamentos (Tabela 4). Tabela 4 – Parâmetros de qualidade seminal de lambari-do-rabo-amarelo (cinco meses de idade), no terceiro mês de cultivo em BFT e RAS. Características Sistema RAS BFT Valor P CV MOT (%) 75,45±0,19 57,08±0,11 0,061 16,29 PROG (%) 56,97±0,17 a 40,68±0,09 b 0,048 18,09 SPTZ RAP (%) 53,72±0,17 a 33,91±0,14 b 0,042 23,52 SPTZ MÉD (%) 15,51±0,07 15,44±0,05 0,977 21,02 SPTZ LEN (%) 6,21±0,02 7,72±0,02 0,138 17,41 VCL (µm/s) 59,25±7,29 51,02±7,00 0,065 8,93 VSL (µm/s) 49,82±6,77 43,22±5,58 0,083 9,30 VAP (µm/s) 55,98±7,57 48,48±6,00 0,079 9,21 LIN (%) 84,71±2,90 83,70±3,47 0,425 1,95 STR (%) 88,83±2,06 88,30±2,63 0,567 1,38 38 WOB (%) 95,30±1,39 94,72±1,28 0,322 0,79 ALH (µm) 1,21±0,04 1,20±0,05 0,588 2,54 BCF (Hz) 7,49±0,22 a 7,36±0,17 b 0,010 0,63 CONC (x10^9 sptz/mL) 8,16±3,07 10,28±1,67 0,150 19,09 Nota: BFT = MOT = Motilidade total; PROG = Progessividade; SPTZ RAP = Espermatozóides rápidos; SPTZ MÉD = Espermatozóides médios; SPTZ LEN = Espermatozóides lentos; VCL = Velocidade curvilinear; VSL = Velocidade linear; VAP = Velocidade média de trajetória; LIN = Coeficiente de linearidade; STR = Coeficiente de retilinearidade; WOB = Oscilação média da trajetória espacial do espermatozoide; ALH = Amplitude do movimento lateral da cabeça; BCF = Frequência de batimento flagelar; CONC = Valor de concentração espermática x10^9. Médias na mesma linha diferem estatisticamente entre si quando P<0,05. Fonte: Próprio autor Após um ano de cultivo, os lambaris criados em água clara (RAS) com quatorze meses de idade apresentaram valores significativamente maiores para os fatores motilidade (P=0,031), velocidade curvilinear (P=0,028), velocidade linear (0,023) e velocidade média de trajetória (P=0,049), enquanto na tecnologia BFT o único fator maior foi de quantidade de espermatozoides de velocidade média (P=0,034) (Tabela 5). Tabela 5 – Parâmetros de qualidade seminal de lambari-do-rabo-amarelo (quatorze meses de idade), no décimo segundo mês de cultivo em BFT e RAS. (média±desvio padrão). Características Sistema RAS BFT Valor P CV MOT (%) 85,95±0,07 a 80,4±0,04 b 0,031 7,05 PROG (%) 68,1±0,07 61,0±0,05 0,096 10,20 SPTZ RAP (%) 72,15±0,23 57,90±0,09 0,198 28,18 SPTZ MÉD (%) 8,85±0,22 b 14,55±0,06 a 0,034 131,89 SPTZ LEN (%) 4,80±0,02 4,55±0,02 0,212 41,63 VCL (µm/s) 75,05±13,02 a 63,0±5,52 b 0,028 15,71 VSL (µm/s) 62,70±12,76 a 52,80±4,79 b 0,023 17,93 VAP (µm/s) 69,90±13,35 a 58,80±5,57 b 0,049 17,14 LIN (%) 85,25±4,21 82,80±2,37 0,325 3,96 STR (%) 89,95±2,06 88,35±2,63 0,364 4,30 WOB (%) 94,70±3,20 94,10±0,79 0,344 2,42 ALH (µm) 1,10±0,03 1,10±0,00 0,449 1,82 39 BCF (Hz) 14,5±0,82 14,21±0,55 0,371 4,81 CONC (x10^9 sptz/mL) 12,90±4,75 10,93±5,12 0,546 38,29 Nota: BFT = MOT = Motilidade total; PROG = Progessividade; SPTZ RAP = Espermatozóides rápidos; SPTZ MÉD = Espermatozóides médios; SPTZ LEN = Espermatozóides lentos; VCL = Velocidade curvilinear; VSL = Velocidade linear; VAP = Velocidade média de trajetória; LIN = Coeficiente de linearidade; STR = Coeficiente de retilinearidade; WOB = Oscilação média da trajetória espacial do espermatozoide; ALH = Amplitude do movimento lateral da cabeça; BCF = Frequência de batimento flagelar; CONC = Valor de concentração espermática x10^9. Médias na mesma linha diferem estatisticamente entre si quando P<0,05. Fonte: Próprio autor 3.4 Discussão Neste estudo Astyanax lacustris é uma espécie que se adaptou na tecnologia BFT, com potencial produtivo a ser explorado, como demonstrado pelos parâmetros biológicos obtidos que indicaram uma similaridade do conjunto de respostas quando comparado ao sistema tradicional de cultivo (RAS). Os animais foram cultivados em ambientes que atendem as necessidades para A. lacustris em relação a valores de oxigênio dissolvido, temperatura, como observado nos trabalhos de desenvolvimento de larvas da espécie (STEVANATO; OSTRENSKY, 2018; DOS SANTOS et al. 2020) e condições de sua ocorrência natural onde se reproduz (MERÇON, 2021), apesar do pH estar ligeiramente acima do observado para os referidos autores. Na tecnologia de bioflocos, Emereciano et al. (2017) indicam que o nível de sólidos sedimentáveis para criação de alevinos de Tilápia-do-Nilo devem estar entre 5 e 20 mL -1 , portanto os valores dos sólidos sedimentáveis deste estudo estiveram dentro dessa faixa. Os fatores de condição, com e sem influência de gônada, são bons indicadores de bem-estar dos peixes (AGOSTINHO, 1990) e pelo fato de não ter havido diferença neste indicador entre os animais dos dois sistemas, juntamente com o fato de não ter havido mortalidade, é possível considerar que os animais se desenvolveram em ambientes com parâmetros de qualidade de água adequados. Peixes onívoros têm menor exigência de proteínas, devido ao fato de terem intestino com maior comprimento, com o alimento ficando em contato com enzimas por um tempo maior (BOOTH et al., 2013). Sendo os lambaris onívoros eles não apresentam necessidade de alimento com alto valor de proteína para seu desenvolvimento (COTAN et al., 2006), como observado por Massago e Silva (2020) 40 ao estudarem níveis proteico (26,5%, 28,6% e 31,2% de PB) para o Astyanax bimaculatus. Os peixes se desenvolveram de forma semelhante para os índices de massa final, ganho de massa semanal, taxa de crescimento específico e produtividade. Como o crescimento foi semelhante nos dois sistemas, RAS e BFT, é possível considerar que A. lacustris criado em sistema BFT pode ser testado com menores taxas de arraçoamento ou com ração que contenha menor porcentagem de proteína bruta e vale ressaltar que a alimentação equivale de 60 a 70% do custo na produção de peixes e a proteína é o item mais caro na dieta dos animais, o que seria uma forma de baratear custos (SILVA; MASSAGO, 2019; SENAR, 2019). Os valores mais altos de índice hepatossomático para os animais do sistema BFT já eram esperados, uma vez que, a alta quantidade de proteína (ração + biomassa do bioflocos) disponível no ambiente pode ocasionar um aumento de peso no fígado, já que este órgão é um dos principais sítios de desaminação dos aminoácidos (BOMBARDELLI et al, 2003). O fígado é o órgão que apresenta diversas funções no organismo, como secreção biliar, metabolismo de lipídeos, carboidratos e proteínas, hematopoese durante fase larval e produção de anticorpos (HIBIYA, 1982) e segundo Costa (2005) o fígado possui atividade metabólica que ocorre a partir da alimentação dos animais e das reservas energéticas dispostas no organismo, relacionando peso de fígado com metabolismo do animal. Cyrino et al (2000) demonstraram dados que dietas com teores médios de 42% de proteína bruta ocasionaram um aumento de acúmulo de glicogênio hepático, e aumento do índice hepatossomático em juvenis de Black Bass Micropterus salmoides, assim como um estudo com tilápia do Nilo (ABDEL- TAWWAB et al., 2010) concluíram que o excesso de proteína na alimentação foi desaminada e utilizada como fonte de energia e este acúmulo interferiu na desaminação por parte de enzimas, já que não houve uma necessidade de mobilização destes aminoácidos para suprimento de demandas energéticas e isto ocasionou excesso de glicose que foi armazenada como glicogênio no fígado, aumentando o índice lipossomático no peixe, que por fim, acumulou maior taxa de gordura visceral nos animais, portanto, corrobora com os dados observados neste experimento, em que os maiores índices hepatossomáticos foram dos peixes do sistema de bioflocos que apresentaram maior porcentagem de extrato etéreo em sua composição corporal. Os valores de IHS podem ser relacionados com uma provável utilização do fígado como órgão para reserva energética e, o aumento do IGS juntamente com a diminuição 41 do IHS pode ser ocasionado por uma possível mobilização de proteínas e lipídeos do fígado para as gônadas com intuito de auxílio no desenvolvimento gonadal em fêmeas (SAYER et al., 1995), porém, para machos, o estudo de Barreto et al. (1998) indicou que essa correlação inversa entre IHS e IGS não deve ser levada em consideração, como também notado por Cardoso et al. (2013), já que em períodos reprodutivos os machos demonstraram tendência semelhante de IHS e IGS e neste estudo em questão é possível que a alimentação tenha sido o fator de maior influência para maior IHS dos animais do BFT, pois eles tiveram acesso as partículas de bioflocos constantemente, que poderiam servir de alimento e neste estudo foi observado através de histologia que os animais de ambos os sistemas tiveram desenvolvimento de gônadas adequado. O valor de índice gonadossomático foi mais alto no segundo e terceiro meses experimentais para os peixes do sistema de recirculação que apresentaram uma menor concentração de extrato etéreo (gordura) em sua composição corporal. O fator de condição gonadal tem como fundamento expressar a transferência de reservas para as gônadas, indicando período reprodutivo (ISAAC NAHUM; VAZZOLER, 1983; VAZZOLER, et al, 1989) e corroborando com o valor mais alto de índice gonadossomático encontrado no mês de junho para os peixes do sistema de recirculação. Para os peixes Salminus hilarii, a gordura abdominal apresenta uma relação inversa com IGS, indicando que existe uma influência disso no desenvolvimento dos gametas (ANDRADE et al., 2004) e isso também é observado em outras diversas espécies de peixes (LAI; SINGH, 1987). Desta maneira, observando o desenvolvimento os peixes A. lacustris deste experimento, é possível notar que os animais com maior concentração de extrato etéreo no corpo, obtiveram menores índices gonadossomáticos, indicando que eles provavelmente realizaram pouca mobilização energética para desenvolvimento gonadal. Segundo Porto-Foresti et al. (2010) a maturidade sexual de A. lacustris é atingida com a idade de 4 meses, porém os animais do presente estudo estiveram aptos a reprodução nos três meses de coleta, como demonstrado pelas análises histológicas realizadas. Fato este que pode estar relacionado a que a espécie tem um longo período reprodutivo, pela presença de fêmeas, como citado por Navarro (2006) para Astyanax scabripinnis e, pelas boas condições nutricionais e ambientais que foram proporcionadas. A menor porcentagem de proteína e maior de extrato etéreo na composição corporal dos Astyanax lacustris machos cultivados no BFT pode ser explicada, pelos 42 animais estarem todo o período experimental com disponibilidade do bioflocos no ambiente (valor proteico médio de 20,36%), além do alimento artificial (ração com 32% de PB), já que os níveis de alimento acima do demandado, proporciona excesso energético (extrato etéreo) na alimentação que pode ocasionar o acúmulo de gordura visceral e muscular (NRC, 1993) e o excesso de proteína, que inicialmente é direcionada para a formação de tecido muscular, pode acabar sendo convertida em energia (NRC, 2011; FRACALOSSI; CYRINO, 2013; SAKOMURA et al., 2014) acentuando o acúmulo de extrato etéreo na carcaça e o desbalanço com os níveis de proteína. Os peixes do sistema de recirculação obtiveram maior porcentagem de proteína na composição corporal, portanto maior porcentagem de tecidos musculares, quando comparado aos animais da tecnologia de bioflocos, pois segundo Guimarães & Adell (1995) a maioria das proteínas no organismo estão localizadas nos músculos e nos tecidos conectivos, constituindo de 16 a 22% da massa muscular, verificando-se então uma maior eficiência de conversão proteica dos peixes sob sistema de recirculação. Quanto a qualidade do sêmen observada neste experimento, os melhores resultados obtidos nos peixes no sistema de recirculação podem estar associados a uma alimentação mais equilibrada que proporcionou uma menor porcentagem de extrato etéreo na composição corporal. Apesar dos peixes acumularem gordura para o início do processo de reprodução (VAZZOLER 1996; COSTA et al, 2005; TELETCHEA et al., 2009), para atender a demanda de ATPs necessárias para suportar a hiperatividade dos espermatozoides (Cosson et al., 2008), o que tornaria o acúmulo de gordura um bom indicador, o excesso pode ser prejudicial à capacidade reprodutiva (DONELSON et al., 2010; HAYDEN et al. 2018), o que poderia explicar os resultados observados. Altos valores do índice de gordura celomática em Astyanax scabripinnis paranae foram observados sugerindo uma preparação do indivíduo para o período reprodutivo, por meio do acúmulo de reservas energéticas, preparando, assim, o peixe para o processo migratório, quando haverá necessidade de maior gasto energético (COSTA et al, 2005). Assim sendo, o armazenamento inicial de gordura de machos como observado para Pike perch, Sander lucioperca (alto nível de reservas periviscerais) antes do início do ciclo reprodutivo é fortemente recomendado, sendo um importante fator na qualidade do esperma, aumentando a concentração de espermatozoides, a motilidade, além de antecipar o momento de espermiação no período da desova (TELETCHEA et al., 2009). Entretanto, o excesso de gordura pode ser prejudicial à reprodução, visto que é conhecido que a obesidade diminui a taxa de fertilização para humanos em função de 43 uma menor concentração de esperma (HAYDEN et al., 2018). Para Acanthochromis polyacanthus a proporção média de espermatozoides em gônadas masculinas alimentados diariamente com 1,0% do peso corporal, com uma ração de alto nível de proteina (55% de proteina, 9% gordura, 1,9% fibra), foi menor do que quando alimentados diariamente com 0,5% do peso corporal, quando cultivados a 30° C, enquanto o peso da gordura visceral mostrou comportamento inverso, sendo maior para a maior taxa de alimentação (DONELSON et al., 2010), sendo essa, portanto, uma possível explicação para os animais do BFT terem valores inferiores para algumas características seminais importantes, quando comparados aos peixes do RAS, já que tiveram maior taxa de gordura corporal. A maior porcentagem de espermatozoides rápidos nos animais de cinco meses, com maior valor de motilidade progressiva e maior frequência de batimento flagelar dos animais do sistema RAS, podem indicar uma melhor qualidade seminal. Maiores taxas de motilidade progressiva têm relação com maior índice de fertilidade em peixes segundo estudo de Gallego et al. (2013) e segundo Layek et al. (2016) uma das características que garantem maior eficácia de fertilização é a motilidade progressiva e em peixes a rapidez dos espermatozoides apresentam grande conexão com altos índices de fertilização e fecundação (RURANGWA et al., 2004; GALLEGO et al., 2013). O BCF é um parâmetro que se apresenta em espermatozoides com maior capacidade e hiperatividade e apesar de apresentar poucas referências bibliográficas que o ligam a melhor qualidade seminal, sabe-se que a velocidade do espermatozoide pode ser influenciada por este fator (GIL et al, 2009; LÓPEZ, LEAL; VIVEIROS, 2015; NEUMANN et al., 2017). Essas informações corroboram com o ocorrido neste estudo, já que a maior porcentagem de espermatozoides rápidos, foi do sêmen dos peixes em sistema RAS que apresentaram maior valor para o índice de frequência de batimento flagelar. A qualidade seminal está diretamente ligada com a capacidade de fertilização dos oócitos e a qualidade de gametas masculinos produzidos é influenciado por fatores como alimentação, fisiologia, bem-estar, genética e fatores ambientais (ESTAY et al., 1994; VALDEBENITO et al., 2013; ZIMBA, 2016). A maior porcentagem de espermatozoides rápidos, com maior valor de motilidade progressiva e maior frequência de batimento flagelar dos animais de cinco meses do sistema RAS, podem indicar uma melhor qualidade seminal. 44 Os animais com quatorze meses de idade do RAS apresentaram valores superiores para variáveis importantes ligados a qualidade seminal. Os parâmetros de motilidade e velocidade curvilinear refletem a condição fisiológica do espermatozoide (PEÑA; LINDE-FORSBERG, 2000; KOWALSKI; CEJKO, 2019) e a motilidade espermática geralmente é indicada como um dos fatores mais importantes relacionados ao sucesso na fertilização de um espermatozoide, porém é importante que sejam realizadas avaliações mais detalhadas do movimento espermático correlacionado com a capacidade fertilizante (LIU et al., 1991; COX et al., 2006). A velocidade curvilinear está relacionada a melhores índices de fertilização, levando em conta que os espermatozoides que têm uma trajetória com mais movimentos circulares, geralmente possuem maior facilidade para penetrar no oócito (CHIACCHIO et al., 2017; LEITE et al., 2018). Os parâmetros de coeficiente de linearidade, coeficiente de retilinearidade, oscilação média da trajetória espacial do espermatozoide, amplitude do movimento lateral da cabeça e batimento flagelar cruzado são fatores pouco utilizados para determinação de qualidade seminal em peixes e apresentam poucos valores de referência (NEUMANN et al., 2017). A determinação de concentração espermática consiste na quantidade de espermatozoides por mL, sendo um dado bastante importante, pois permite o controle da relação espermatozóide:ovócito e oferece informações básicas que auxiliam no desenvolvimento de técnicas para reprodução artificial adequada para cada espécie (BOMBARDELLI et al., 2006; SANCHES et al., 2011). Para os dados de qualidade seminal dos animais, os valores dos parâmetros seminais dos animais criados em sistema de recirculação e em tecnologia de bioflocos encontrados neste estudo estiveram dentro de níveis encontrados em trabalhos com lambaris (YASUI et al., 2014; NASCIMENTO, 2015; ZIMBA, 2016; ZIMBA et al., 2017; LEITE, 2019; LEITE et al., 2020). 3.5 Conclusão A espécie Astyanax lacustris se adaptou ao sistema de bioflocos e, para fins produtivos, os animais apresentaram bom desenvolvimento dentro dos dois sistemas de cultivo, onde não apresentaram diferença de ganhos zootécnicos. Para fins reprodutivos os sistemas não influenciaram na maturação gonadal, porém os animais da tecnologia de bioflocos obtiveram maior ganho de gordura corporal que pode ter causado desempenho 45 espermático levemente inferior quando comparado aos animais do sistema de recirculação em água clara. Em face aos dados obtidos pode-se concluir que os animais dos dois sistemas apresentaram valores adequados de crescimento e desenvolvimento reprodutivo, porém com leve melhoria da qualidade seminal para os machos mantidos no sistema RAS. 3.6 Agradecimentos O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. 46 REFERÊNCIAS ABAD, D.; RINCÓN, D.; POLEO, G. Índices de rendimiento corporal en morocoto Piaractus brachypomus cultivado en sistemas Biofloc. Zootecnia Tropical, Maracay, v. 32, n. 2, p. 119-130, 2014. ABDEL-TAWWAB, M.; AHMAD, M.H.; KHATTAB, Y.A.E.; SHALABY, A.M.E. Effect of dietary protein level, initial body weight, and their interaction on the growth, feed utilization, and physiological alterations of Nile tilapia, Oreachromis niloticus. Aquaculture, Amsterdam, v. 298, p. 267-274, 2010. AGOSTINHO, A. A.; BARBIERI, G.; VERANI, J. R. 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