UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CAMPUS DE BOTUCATU ENXERTIA NO CONTROLE DA MURCHA BACTERIANA, NA ATIVIDADE DE ENZIMAS E PRODUÇÃO EM TOMATEIRO EDVAR DE SOUSA DA SILVA Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP – Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia – Horticultura. BOTUCATU – SP Março 2013 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CAMPUS DE BOTUCATU ENXERTIA NO CONTROLE DA MURCHA BACTERIANA, NA ATIVIDADE DE ENZIMAS E PRODUÇÃO EM TOMATEIRO EDVAR DE SOUSA DA SILVA Orientadora: Profa. Drª. Rumy Goto Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP – Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia – Horticultura. BOTUCATU – SP Março 2013 BIOGRAFIA DO AUTOR EDVAR DE SOUSA DA SILVA – Nasceu em Sítio Novo do Tocantins – TO, no dia 14 de julho de 1984. Cursou da pré-escola até a 8º serie do ensino fundamental na Escola Estadual Manoel Estevão de Souza em Sítio Novo do Tocantins. Entre 2001 e 2003 cursou o ensino médio e técnico agrícola na antiga Escola Agrotécnica Federal de Aráguatins-TO (EAFA-TO), atualmente Instituto Federal do Tocantins, campus Araguatins. Em abril de 2004, iniciou o curso de graduação em Licenciatura em Ciências Agrícolas na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRuralRJ), localizada em Seropédica – RJ. Durante o curso foi bolsista de Iniciação Científica no programa PIBIC/CNPq - UFRuralRJ entre agosto de 2005 e julho de 2007, e monitor na disciplina de Didatica de Ciências Agrícolas do Departamento de Teoria e Planejamento de Ensino do Instituto de Educação da UFRuralRJ de junho a agosto de 2007. Concluiu o curso de Licenciatura em Ciências Agrícolas em 2007. Obteve título de mestre em Agronomia/Horticultura pela Universidade Estadual Paulista (Unesp), campus de Botucatu, o qual foi cursado entre 2008 e 2010, com orientação da Profª Drª Rumy Goto. Nesta mesma instituição e com a mesma orientadora, cursou o doutorado também em Agronomia/Horticultura, entre 2010 e 2013, que gerou esta tese. Ainda em 2013, ingressou como professor no Instituto Federal do Acre. I DEDICO Aos meus pais, Joaci da Silva e Francisca Bernardo de Sousa (In memoriam), responsáveis pelos verdadeiros valores da vida que tenho. À Luciana Castello Branco, pelo apoio, incentivo, companheirismo e compreensão em todos os momentos. Aos meus irmãos, Eduardo, Edvaldo, Edvan, Edna, Edileuza, Zilda, Maria, Odete, Joseane, Joceane, Josilene, a minha madrasta Anizete, por me fazerem sempre compreender como é bom ter uma família e por serem em muitos momentos minha inspiração e minha força, principalmente quando eu acordo todas as manhãs e olho a foto deles. AGRADEÇO À DEUS, Por estar presente na minha vida em todos os momentos e também na vida daqueles que fazem parte da minha caminhada. Por me mostrar que ao vê-lo no próximo, eu consigo observar além dos que os olhos podem vê e encarar tudo como aprendizagem. II AGRADECIMENTOS À Faculdade de Ciências Agronômicas / Universidade Estadual Paulista – Júlio de Mesquita Filho; À CAPES pela concessão da bolsa para minha manutenção no curso; À Fundunesp e ao CNPq pelo auxílio financeiro para realização da pesquisa; À Profa Dra Rumy Goto, pela orientação, por passar seus preciosos conhecimentos em horticultura e pela amizade construída em meio à sinceridade, amor pela horticultura e pela docência; À Profa Dra Giuseppina Pace Pereira Lima, por ter compartilhado seus conhecimentos em bioquímica, pelo espaço em seu laboratório e em seu precioso tempo, além de participar na realização dos experimentos; Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Maringoni, por ter compartilhado seus conhecimentos em fitopatologia e estruturas laboratoriais, além de participar na realização dos experimentos; Às bolsistas de iniciação cientifica (Pibic-Cnpq) Daniele Vieira de Menezes (Instituto de Biociências – UNESP/Botucatu) e Laís Busca Consoline (Faculdade de Ciências Agronômicas – UNESP/Botucatu) pela amizade, trabalho e comprometimento comigo e com o projeto; Às empresas: Nunhems, Takii do Brasil Ltda, Sakata Seed Sudamerica Ltda, pelo fornecimento de materiais e estrutura; Aos funcionários da Fazenda Experimental de Pesquisa e Produção (FEPP) da UNESP em São Manuel – SP, pelo auxílio prestado durante o experimento e por passarem seus conhecimentos durante os proveitosos e agradáveis dias de convivência; Aos amigos, como diz a Adelana, Hermanos Ewerton Gasparetto, Miguel Sandri, Adelana Santos, Thais Botamede, estagiários Jéssica, Leonardo Tatsuo, Lucas Guimarães, Victor Montanaro, Tárik Hanai, Milton Vinicius, Lucas Isidoro, Daniel, Carine Zanfirov, Aline Retz, Fernando Martini, que fazem parte do Grupo de Estudos em Produção de Hortaliças (GEPH), filhos da formação da nossa querida professora Rumy Goto. III A todos coorientados, agregados, estagiários da Professora Rumy Goto e colegas de pós-graduação em Agronomia-Horticultura que de forma direta e indireta contribuíram com este estudo e principalmente com a minha formação através de momentos inesquecíveis que sempre farão parte da minha vida; Aos colegas Miguel, Willian, Arleneo e Rene pela as análises de pós- colheita dos frutos do tomateiro; Aos colegas do laboratório de Bioquímica da professora Fina – IB. pelo acolhimento, auxílio, amizade e momentos agradáveis de descontração; Ao funcionário José Marcelo Soman do laboratório de Bacteriologia – Departamento de Proteção Vegetal – UNESP Botucatu, por auxiliar e passar seu precioso conhecimento em bacteriologia; Aos meus amigos e companheiros de república, Manoel, Luís Vieira (Braquiária), Arleneo por terem compartilhado diversos momentos, como a amizade de família e contribuírem muito para meu desenvolvimento como pessoa; À Ana Claudia pelo auxílio, principalmente nas avaliações de trocas gasosas das plantas; Aos que já não chamo mais de amigos, mas de irmãos da Renovação Carismática Católica de Botucatu, Jackson e Adriana, Arthur e Nilce, Renata Marques, Eleide, Amilton, Maila Brito, Paulo Luvizutto, Tiago Alexandre, Meirinha, e demais irmãos que nasceram pela fé. IV Sumário LISTA DE TABELAS ............................................................................................................ VII LISTA DE FIGURAS ...............................................................................................................IX 1 RESUMO ............................................................................................................................ 1 2 ABSTRACT ........................................................................................................................ 3 3 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 5 4 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 7 5 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 8 5.1 A cultura do tomateiro .................................................................................................. 8 5.2 Murcha Bacteriana (Ralstonia solanacearum) ........................................................... 10 5.3 Enxertia em hortaliças ................................................................................................ 12 5.4 Enzimas antioxidativas e os mecanismos de defesa da planta .................................... 14 5.5 Trocas gasosas em plantas .......................................................................................... 19 6 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 21 6.1 EXPERIMENTO 1: Avaliação do estresse causado pela enxertia em tomateiro através da variação da atividade enzimática e teor de fenóis ................................................ 21 6.1.1 Produção de mudas e condução do experimento ................................................. 21 6.1.2 Delineamento do experimento 1 e avaliação da cicatrização das mudas enxertadas .......................................................................................................................... 23 6.1.3 Coletas das plantas para análises bioquímicas dos experimentos 1 e 2............... 24 6.1.4 Determinação da atividade enzimática e teor de fenóis totais dos experimentos 1 e 2...................... ................................................................................................................ 24 6.1.5 Superóxido dismutase (SOD) .............................................................................. 24 6.1.6 Catalase (CAT) e polifenoloxidase (PPO)........................................................... 25 6.1.7 Peroxidase (POD) ................................................................................................ 25 6.1.8 Fenilalanina amônia liase (PAL) ......................................................................... 25 6.1.9 Fenóis totais ......................................................................................................... 26 6.2 EXPERIMENTO 2: Incidência da murcha bacteriana do tomateiro, trocas gasosas, atividade de enzimas antioxidantes e teor de fenóis em plantas de tomateiro enxertadas e inoculadas com R. solanacearum .......................................................................................... 26 6.2.1 Delineamento experimental ................................................................................. 27 V 6.2.2 Transplante das plantas ........................................................................................ 28 6.2.3 Preparo do inóculo de R. solanacearum .............................................................. 28 6.2.4 Inoculação das plantas ......................................................................................... 29 6.2.5 Avaliação da incidência da murcha bacteriana.................................................... 29 6.2.6 Medidas de trocas gasosas nas plantas ................................................................ 29 6.2.7 Coletas das plantas do experimento 2.................................................................. 30 6.3 EXPERIMENTO 3: Avaliação da produção do tomateiro em função de três métodos de enxertia e pé-franco .......................................................................................................... 30 6.3.1 Preparo da área e produção das mudas ................................................................ 30 6.3.2 Condução do experimento ................................................................................... 31 6.3.3 Delineamento experimental ................................................................................. 32 6.3.4 Avaliação das características quantitativas da produção ..................................... 32 6.3.5 Avaliação das características qualitativas da produção ....................................... 33 6.3.6 Vitamina C ........................................................................................................... 33 6.3.7 Licopeno e β-caroteno ......................................................................................... 33 6.3.8 Firmeza ................................................................................................................ 34 6.3.9 Acidez titulável (AT) ........................................................................................... 34 6.3.10 pH ........................................................................................................................ 34 6.3.11 Sólidos solúveis (SS) ........................................................................................... 34 6.3.12 Relação SS/AT (“Ratio”)..................................................................................... 34 6.3.13 Análise estatística dos experimentos 1, 2 e 3 ...................................................... 35 7 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 37 7.1 EXPERIMENTO 1: Avaliação do estresse causado pela enxertia em tomateiro através da variação da atividade enzimática e teor de fenóis ................................................ 37 7.1.1 Cicatrização do local da enxertia das mudas em função do método de enxertia . 37 7.1.2 Atividade das enzimas SOD, CAT, POD, teor de Fenóis e PPO em função dos métodos de enxertia e do dia após a enxertia .................................................................... 38 7.2 EXPERIMENTO 2: Incidência da murcha bacteriana do tomateiro, trocas gasosas, atividade de enzimas antioxidantes e teor de fenóis em plantas de tomateiro enxertadas e inoculadas com R. solanacearum .......................................................................................... 45 VI 7.2.1 Incidência da murcha bacteriana em plantas de tomateiro enxertadas e pé-franco de tomateiro ....................................................................................................................... 45 7.2.2 Trocas gasosas em plantas de tomateiro enxertadas e pé-franco e inoculadas com R. solanacearum ................................................................................................................ 47 7.2.3 Atividade de enzimas antioxidantes e teor de fenóis em plantas de tomateiro enxertadas e inoculadas com R. solanacearum ................................................................. 52 7.3 EXPERIMENTO 3: Produção do tomateiro em função de três métodos de enxertia e pé-franco ................................................................................................................................ 64 7.3.1 Produtividade comercial, não comercial e total do tomateiro em função dos métodos de enxertia e pé-franco ........................................................................................ 64 7.3.2 Características qualitativas da produção de tomateiro em função dos métodos de enxertia e pé-franco ........................................................................................................... 70 8 CONSIDERAÇÕES GERAIS ........................................................................................... 71 9 CONCLUSÕES ................................................................................................................. 73 10 REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 74 VII LISTA DE TABELAS Tabela 1. Arranjo dos tratamentos para avaliação das atividades enzimáticas e teor de fenóis. UNESP-FCA, Botucatu, SP, 2011. ........................................................................................... 28 Tabela 2. Análise química do solo e teores de macro e micronutrientes. FEPP/FCA/UNESP, 2011. .......................................................................................................................................... 31 Tabela 3. Esquema da análise de variância dos experimentos. ................................................. 36 Tabela 4. Atividade da enzima SOD (U g-1 proteína) em função do método de enxertia e do dia após enxertia. UNESP-FCA, 2010. ........................................................................................... 39 Tabela 5. Atividade da enzima CAT (μmol H2O2 min-1mg-1 proteína) em função do método de enxertia em tomateiro. UNESP-FCA, 2010. ............................................................................. 40 Tabela 6. Atividade da enzima POD (μmol H2O2 decomposto min-1 mg-1 proteína) em função do método de enxertia e do dia após enxertia. UNESP-FCA, 2010. ......................................... 41 Tabela 7. Teor de fenóis (mg g-1 massa fresca) em função do método de enxertia e do dia após enxertia. UNESP-FCA, 2010. ................................................................................................... 42 Tabela 8. Atividade da enzima PPO (µmol catecol oxidado min-1 µg-1 proteína) em função do método de enxertia e do dia após enxertia. UNESP-FCA, 2010. .............................................. 44 Tabela 9. Porcentagem de folhas murchas em tomateiro ‘Pizzadoro’ pé-franco e enxertado em porta-enxerto ‘Guardião’, inoculado e não-inoculado com R. solanacearum. UNESP-FCA, Botucatu, SP, 2011. ................................................................................................................... 46 Tabela 10. Massa fresca (g) e massa seca (g) em tomateiro ‘Pizzadoro’ pé-franco e enxertado em porta-enxerto ‘Guardião’, inoculado e não-inoculado com R. solanacearum, aos 15 DAI. UNESP-FCA, Botucatu, SP, 2011. ........................................................................................... 47 Tabela 11. Trocas gasosas (gs: condutância estomática; E: taxa de transpiração; A: Taxa de assimilação liquida de CO2) em plantas de tomateiro enxertadas e pé-franco aos 0 e 15 dias após a inoculação com R. solanacearum. UNESP-FCA, Botucatu, SP, 2011. ......................... 49 Tabela 12. Correlação linear entre características porcentagem de folhas murchas (%), massa fresca (MF), massa seca (MS), condutância estomática (gs), transpiração (E) e taxa de assimilação liquida de CO2 (A), baseado no coeficiente de correlação (%). UNESP-FCA, Botucatu, SP, 2011. ................................................................................................................... 51 VIII Tabela 13. Atividade da enzima SOD (U g-1 proteína) em função da enxertia e do dia após a inoculação com R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011. ........................................................... 53 Tabela 14. Atividade da enzima CAT (μmol H2O2 min-1 mg-1 proteína) em função da enxertia e do dia após a inoculação de R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011. ..................................... 54 Tabela 15. Atividade da enzima POD (μmol H2O2 decomposto min-1 mg-1 proteína) em função da enxertia e do dia após a inoculação com R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011. ................ 56 Tabela 16. Atividade da enzima PAL (μmols min-1 mg-1 de proteína) em função da enxertia e do dia após a inoculação com R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011. ..................................... 59 Tabela 17. Teor de fenóis (mg g-1 massa fresca) em função da enxertia e do dia após a inoculação de R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011. .............................................................. 61 Tabela 18. Atividade da enzima PPO (µmol catecol oxidado min-1 µg-1 proteína) em função da enxertia e do dia após a inoculação com R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011. .................... 63 Tabela 19. Produtividade comercial, não comercial e total do tomateiro em função dos métodos de enxertia, baseado no número e massa dos frutos por m2. UNESP-FCA-FEPP, São Manuel, SP, 2011. ..................................................................................................................... 65 Tabela 20. Produtividade comercial do tomateiro, baseado no número, massa (kg) dos frutos comerciais por m2 e na classe do fruto (CQH-CEAGESP 2003), em função dos métodos de enxertia e pé-franco. UNESP-FCA-FEPP, São Manuel, SP, 2011. .......................................... 69 Tabela 21. Produtividade não comercial do tomateiro em função dos métodos de enxertia e pé- franco, baseado na massa dos frutos por m2. UNESP-FCA-FEPP, São Manuel, SP, 2011. ..... 69 Tabela 22. Ácido ascórbico (AA - mg de ácido ascórbico 100 g-1 de polpa), licopeno, β- caroteno, acidez titulável (AT - g de ácido málico 100g-1), sólidos solúveis (SS - °Brix), relação sólidos solúveis/acidez titulável (SS/AT - Ratio), potencial hidrogeniônico (pH), Firmeza (N), em função de métodos de enxertia de tomateiros, Botucatu – SP, 2011. ............ 70 IX LISTA DE FIGURAS Figura 1. Câmara úmida de enxertia. UNESP/FCA, Botucatu, SP. Foto: Edvar Silva, 2010. .. 23 Figura 2. Vista geral do segundo experimento. UNESP/FCA, Botucatu, 2011. Foto: Edvar Silva. .......................................................................................................................................... 27 Figura 3. Vista do experimento 3. UNESP/FCA/FEPP, São Manuel, SP, 2011. Foto: Edvar Silva. .......................................................................................................................................... 32 Figura 4. Porcentagem de cicatrização do local da enxertia em função dos métodos de enxertia em tomateiro. UNESP-FCA, 2010. ........................................................................................... 38 Figura 5. Planta de tomateiro enxertada pelo método Fenda garfagem. Foto: Edvar Silva, 2010. .......................................................................................................................................... 41 Figura 6. Planta de tomateiro enxertada pelo método Encostia. Foto: Edvar Silva, 2010. ....... 41 Figura 7. Porcentagem de frutos comerciais e não comerciais na produção de tomateiro em função do método de enxertia e pé-franco. UNESP-FCA-FEPP, São Manuel, SP, 2011. ........ 66 Figura 8. Porcentagem da massa fresca (kg m-2) dos frutos comerciais e não comerciais na produção de tomateiro em função do método de enxertia e pé-franco. UNESP-FCA-FEPP, São Manuel, SP, 2011. ..................................................................................................................... 67 X Anexos Anexo 1. Temperatura máxima, mínima e média dentro do ambiente protegido de 23/06/2011 a 16/11/2011, UNESP/FCA/FEPP, São Manuel, SP, 2011. ...................................................... 87 Anexo 2 . Umidade relativa do ar máxima, mínima e média dentro do ambiente protegido de 23/06/2011 a 16/11/2011, UNESP/FCA/FEPP, São Manuel, SP, 2011. .................................. 88 1 ENXERTIA NO CONTROLE DA MURCHA BACTERIANA, NA ATIVIDADE DE ENZIMAS E PRODUÇÃO EM TOMATEIRO. Botucatu, 2013. 88 p.Tese (Doutorado em Agronomia/Horticultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas. Universidade Estadual Paulista. Autor: EDVAR DE SOUSA DA SILVA Orientadora: RUMY GOTO 1 RESUMO A enxertia é uma técnica utilizada com a finalidade de controlar patógenos de solo, como a R. solanacearum, porém em porta-enxerto resistente tem-se observado sintomas da doença no enxerto, devido a passagem do patógeno. A enxertia e a bactéria podem causar estresse na planta de tomateiro e algumas enzimas e o teor de fenóis podem ser usados como respostas bioquímicas a estes estresses. Para avaliar a eficiência desta técnica sobre a bactéria e na produção de tomateiro foram medidas, a incidência da doença, trocas gasosas das plantas, a atividade de algumas enzimas como superoxido dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD), fenilalanina amônia-liase (PAL), polifenoloxidase (PPO), teor de fenóis e produção em plantas de tomateiro ‘Pizadoro’ pé-franco e enxertadas no porta-enxerto ‘Guardião’. Para tanto foram realizados dois experimentos na Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP de Botucatu-SP e um experimento na Fazenda de ensino, pesquisa e produção (FEPP) em São Manuel, SP. No primeiro experimento foi avaliada a variação da atividade enzimática (SOD, CAT, POD, PPO) e teor de fenóis em mudas do tomateiro, em função dos métodos de enxertia Contato em bisel, Fenda garfagem, Encostia, enxerto pé-franco e cinco coletas das plantas, aos 0, 3, 6, 9 e 12 dias após a enxertia (DAE). No segundo, foram avaliadas a incidência da murcha bacteriana, trocas gasosas nas folhas, além da atividade das enzimas SOD, CAT, POD, PAL, PPO e teor de fenóis, aos 0, 2, 4, 6, 8 e 15 dias após a inoculação com R. solanacearum, em plantas enxertadas de tomateiro conduzidas em casa de vegetação. No terceiro experimento foram avaliados três métodos de enxertia (Contato em bisel, Fenda garfagem e Encostia) e pé-franco na produção de tomateiro sob ambiente protegido. O método Fenda garfagem é melhor para cicatrização do local da 2 enxertia e produção de tomateiro ‘Pizzadoro’ enxertado em ‘Guardião’. A murcha das folhas causada pela infecção de R. solanacearum reduz as trocas gasosas em tomateiro ‘Pizzadoro’ pé-franco e enxertado no porta-enxerto ‘Guardião’. A enzima PAL pode ser utilizada como marcador bioquímico em plantas de tomateiro ‘Pizzadoro’ pé-franco e enxertadas no porta- enxerto ‘Guardião’ em resposta à infecção de R. solanacearum. ______________________ Palavras chave: Solanum lycopersicum, Ralstonia solanacearum, estresse, atividade enzimática e trocas gasosas 3 GRAFTING TO CONTROL BACTERIAL WILT, ENZYME ACTIVITY AND YIELD IN THE TOMATO PLANTS. Botucatu, 2013. 88 p. Thesis (PhD in Agronomy/Horticulture) – College of Agronomical Sciences. State University of São Paulo. Author: EDVAR DE SOUSA DA SILVA Supervisor: RUMY GOTO 2 ABSTRACT Grafting is a technique used in order to control soil pathogens, such as R. solanacearum bacteria. The symptoms of the disease, however, have been observed in resistant rootstock, due to the passage of the pathogen to the graft. Both grafting and the bacteria can cause stress in tomato plant and some enzymes and phenols can be used as biochemical marker to this stress. In order to evaluate the efficiency of grafting to control the bacteria in the tomato yield, the disease incidence, plant gas exchange, phenol contents and the activity the enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD), phenylalanine ammonia lyase (PAL), polyphenoloxidase (PPO), as well as tomato fruit yield were measured. The study considered ungrafted and grafted tomato plants 'Pizzadoro' on rootstock 'Guardian' in two experiments carried out at the College of Agricultural Sciences, UNESP, in Botucatu-SP, and one experiment at the Farm of Teaching, Research and Production (FEPP), in São Manuel-SP. The enzymes activity of SOD, CAT, POD, PPO and phenol content in tomato seedlings were evaluated in the first experiment, as a function of the grafting methods Contact bevel, Cleft grafting, Supported grafting, graft ungrafted in five harvests at 0, 3, 6, 9 and 12 days after grafting (DAG). In the second experiment, the incidence of bacterial wilt, leaf gas exchange, as well as the activity of enzymes SOD, CAT, POD, PAL, PPO and phenol content were evaluated, at 0, 2, 4, 6, 8 and 15 days after inoculation with R. Solanacearum, in grafted tomato plants growing at greenhouse. In the third experiment, three grafting methods (Contact bevel, Cleft grafting and Supported grafting) and ungrafted tomato were evaluated considering the production under protected environment. The Cleft grafting method was the best for the site healing of grafting and tomato fruit yield, on the 'Pizzadoro' plants grafted in 'Guardian'. The leaves wilt caused by the bacterium R. Solanacearum 4 infection decreases the gas exchange in tomato plants 'Pizzadoro' ungrafted and grafted on rootstock 'Guardian'. The enzime PAL can be used as a biochemical marker in tomato plants 'Pizzadoro' ungrafted and grafted on rootstock 'Guardian' in response infection of R. solanacearum. ______________________ Keywords: Solanum lycopersicum, Ralstonia solanacearum, stress, enzyme activity and gas exchange 5 3 INTRODUÇÃO O cultivo do tomateiro no Brasil até 2011 ocupava uma área de aproximadamente 45 mil hectares de tomate para mesa e 20 mil hectares de tomate para indústria, com uma produção de 2.667.232 toneladas para mesa e 1.436.202 toneladas para indústrias e produtividade média de 62,88 t ha-1. Isto é resultante do uso das tecnologias geradas pelas pesquisas de instituições oficiais e privadas em parceria com os tomaticultores, tanto no cultivo em ambiente protegido quanto em campo aberto. O sistema de produção do tomateiro demanda muitas tecnologias, dentre as quais, condução, entendimento da fisiologia da cultura, nutrição, manejo fitossanitário, são muito importantes. O uso intensivo do ambiente protegido causam problemas de salinização do solo e infestação de fitopatógenos, que podem inviabilizar o cultivo de hortaliças neste ambiente como, por exemplo, a bactéria Ralstonia solanacearum (Smith), causadora da murcha bacteriana na cultura do tomateiro. A murcha bacteriana é uma das mais importantes doenças de solo em solanáceas no Estado de São Paulo e nos demais estados do Brasil. Devido a bactéria R. solanacearum atuar no sistema vascular, ser habitante do solo e estar associado a um grande número de espécies botânicas e o controle da doença se torna extremamente difícil. No cultivo de hortaliças, dentre elas o tomateiro, a enxertia é um técnica realizada através de vários métodos, praticada comercialmente em diversos países do 6 mundo, com a finalidade de controle de patógenos de solo, dentre eles R. solanacearum e aumento da produtividade . Em 2009, foram comercializadas nos principais viveiros de hortaliças do estado de São Paulo, 2.347.670 mudas enxertadas de pimenteiro, 1.972.210 de pepineiro, 776.010 de tomateiro 70.400 de berinjeleira, 3.400 de jiló, 7.500 de abobrinha Mini. Tem-se observado que híbridos de tomateiro enxertados em porta- enxertos resistentes a R. solanacearum têm apresentado sintomas da murcha bacteriana, que ao decorrer do tempo pode afetar a produção comercial das plantas. Algumas formas de avaliar até quando o porta-enxerto resiste à doença e a sua presença no enxerto seriam a avaliação da incidência da doença, trocas gasosas nas folhas das plantas, observação da alteração da atividade de enzimas antioxidantes e teores de fenóis totais. No entanto, poucos estudos relacionam a incidência da murcha bacteriana com trocas gasosas nas folhas, atividade de enzimas antioxidativas e teores de fenóis totais em plantas de tomateiro enxertado e inoculado com R. solanacearum. 7 4 OBJETIVOS Avaliar a fixação da enxertia em função do método de enxertia utilizado. Avaliar a enxertia no controle da murcha bacteriana, através da incidência da doença e trocas gasosas nas folhas das plantas de tomateiro. Avaliar atividade das enzimas superoxido dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD), fenilalanina amônia liase (PAL), teor de fenóis e polifenoloxidase (PPO) como respostas bioquímicas aos estresses da enxertia e àquele relacionado à defesa contra R. solanacearum em tomateiro. Avaliar métodos de enxertia na produção do tomateiro sob ambiente protegido. 8 5 REVISÃO DE LITERATURA 5.1 A cultura do tomateiro A primeira descrição botânica do tomateiro foi feita por Píer Andréa Mattioli, do jardim botânico de Pádua, Itália, onde publicou em seu herbário em 1554. O tomateiro, cuja espécie é Solanum lycopersicum L. pertencente à família solonaceae, originou- se da espécie andina e silvestre Lycopersicon esculentum var. cerasiforme (TAYLOR, 1986), a qual produz frutos tipo cereja (FILGUEIRA, 2007). Tem como centro de origem a região andina, desde o Equador, passando pela Colômbia, Peru, Bolívia, até o norte do Chile. Nesta área, crescem espontaneamente diversas espécies do gênero Solanum (NUEZ, 2001). Parece não haver dúvidas de que à sua domesticação ocorreu no México (NUEZ, 2001). Na chegada dos espanhóis à América, o tomateiro já estava integrado à cultura asteca e era conhecido como “tomatl”, originando o nome tomate. Esses primeiros tempos os frutos eram muito pequenos e altamente perecíveis, apodrecendo em poucas horas depois de colhidos. Os espanhóis levaram as sementes para o velho mundo e após rejeição em que muitos consideravam o tomateiro uma planta tóxica, foi incorporado à culinária europeia, retornando às Américas e hoje é um alimento cosmopolita (NUEZ, 2001). Segundo Filgueira (2007), o tomateiro é uma planta herbácea com caule flexível e incapaz de suportar a massa dos frutos e manter a posição vertical. A forma 9 natural lembra uma moita, com abundante ramificação lateral, sendo profundamente modificada pela poda. Embora sendo uma planta perene, a cultura comporta-se como anual: da semeadura até a produção de novas sementes, o ciclo biológico varia de quatro a sete meses, incluindo-se um a três meses de colheita; em casa de vegetação, o ciclo pode prolongar-se ainda mais. Primeiro ocorre a fase vegetativa, e em seguida esta fase ocorre junto com a floração e frutificação. As folhas, pecioladas, são compostas por número ímpar de folíolos. A planta de tomateiro apresenta dois hábitos de crescimento, os quais são: determinado e indeterminado. A maioria das cultivares e híbridos de hábito determinado são as consideradas para cultivo rasteiro, com finalidade agroindustrial, porém alguns híbridos para mesa. As cultivares e híbridos de hábito indeterminado são as consideradas para cultivo tutorado e com realização de podas, com finalidade para mesa, ou seja, consumo in natura (FILGUEIRA, 2007). A planta se desenvolve bem em ampla escala de latitudes, tipos de solos, temperaturas e modos de cultivo, é também moderadamente tolerante a salinidade. Prefere ambientes quentes, com boa iluminação e drenagem. A exposição prolongada a temperaturas inferiores a 10oC e uma iluminação diurna inferior a 12 horas, afetam desfavoravelmente a planta (ALVARENGA 2004b), podendo ocorrer encurtamento dos entrenós, diminuição do porte da planta, inibição da formação de frutos e, consequentemente, uma colheita tardia (FILGUEIRA, 2007). A composição dos frutos de tomate varia de acordo com a cultivar, nutrição, condições de cultivo e com as condições ambientais nas quais foi produzido. O fruto fresco apresenta baixo poder calórico, baixo teor de matéria seca e é muito rico em sais minerais e vitamina C (ALVARENGA, 2004b). O tomate é um alimento altamente nutritivo, rico em licopeno, sadio, apresenta excelente palatabilidade e o seu baixo valor energético torna-o recomendável àqueles em dieta, ou que precisam de um alimento de baixa digestão (RAO, 2002; SHAMI & MOREIRA, 2004). O tomateiro foi introduzido no Brasil por imigrantes europeus no fim do século XIX (CANÇADO JÚNIOR et al., 2003) e o surgimento do tomate Santa Cruz no Rio de Janeiro, por volta de 1940, que assinalou um importante marco na trajetória do tomateiro no país (ALVARENGA, 2004c). Desde então, o seu cultivo consolidou-se, 10 tornando-se a hortaliça de fruto mais importante do Brasil, a ponto de ocupar o primeiro lugar em valor e volume de produção (SCHMIDT, 2000; AGRIANUAL, 2012). Os maiores produtores do Brasil são, Goiás com área de 17.860 ha e produção de 1.384.181 toneladas (produtividade igual a 77,50 t ha-1) sendo este mais voltado para agroindústria, em seguida, São Paulo com área de 10.160 ha e 651.256 toneladas (64,1 t ha-1), Minas Gerais com 7.327 ha de área e 480.069 toneladas (65,52 t ha-1) (AGRIANUAL, 2012). É importante ressaltar que em Goiás a maior parte do tomate produzido é para a indústria. 5.2 Murcha Bacteriana (Ralstonia solanacearum) Ralstonia solanacearum (Smith) (YABUUCHI et al., 1995), agente causal da murcha bacteriana, é uma bactéria habitante do solo, aeróbica, em forma de bastonetes Gram-negativos, com aproximadamente 0,5 x 1,5 μm, não formadora de esporos. Isolados virulentos são essencialmente não flagelados e não móveis, enquanto os isolados avirulentos têm alta mobilidade sendo providos de 1 a 4 flagelos. A bactéria é tolerante a sais e cresce em temperatura entre 25 a 35°C, variando de acordo com os isolados (MEHAN et al., 1994). Tradicionalmente, a espécie tem sido agrupada em cinco raças e cinco biovares, com base na gama de hospedeiros e nas propriedades bioquímicas, respectivamente (FEGAN & PRIOR, 2005). Em tomateiro, R. solanacearum raça 1, biovares 1 e 3, causa a murcha bacteriana, a mesma que causa a doença em pimenteiro e outras solanáceas. Esta raça está amplamente disseminada pelas principais áreas de produção no Brasil, principalmente nas regiões norte, nordeste, centro-oeste e sudeste (MARQUES et al., 1994; MALAVOLTA JR. et al., 2008). A murcha bacteriana é uma das mais importantes e prejudiciais doenças de plantas no Brasil e no mundo. Esta importância está relacionada ao grande número de espécies afetadas, possuindo mais de 200 hospedeiros distribuídos em cerca de 50 famílias botânicas, e as perdas econômicas difíceis de quantificar. É particularmente limitante em áreas 11 de clima úmido, com altitudes baixa a média, em regiões tropicais e subtropicais (HAYWARD, 1991). A epidemiologia da murcha bacteriana é considerada complexa, por envolver a interação de vários fatores (BUDDENHAGEN & KELMAN, 1964). R. solanacearum penetra por ferimentos nas raízes invade os espaços intercelulares do córtex da raiz em menos de 4 horas e após 2 a 3 dias coloniza inteiramente esses espaços e o parênquima vascular (SAILE et al., 1997), movimentando-se em direção à parte superior da planta. A presença do grande número de células bacterianas e a produção de exopolissacarídio (EPS), considerado o principal fator de virulência deste patógeno, resulta na redução do transporte de água e conseqüente murcha das folhas (HIKICHI et al., 2007) progredindo para morte da planta, sem alteração na coloração, semelhantemente ao que ocorre na deficiência hídrica. Após corte transversal do caule, observa-se o escurecimento do sistema vascular. Quando o teste do copo é realizado, revela a exsudação do pus bacteriano (LOPES & QUEZADO-SOARES, 1997). Os fitopatógenos podem afetar a eficiência fotossintética de seus hospedeiros de diversas maneiras (JOHNSON, 1987; SHTIENBERG, 1992). No caso da R. solanacearum, sua presença inibe o transporte de água na planta, ocasionando déficit hídrico, e segundo Souza et al. (2010), este estresse aumenta a resistência à difusão de vapor de água planta-atmosfera, em razão do fechamento dos estômatos, reduzindo a transpiração e, conseqüentemente, o seqüestro de CO2, o que limita o processo fotossintético. O controle de R. solanacearum é extremamente difícil, principalmente devido a ampla gama de hospedeiros, a alta variabilidade genética e à sobrevivência no solo por longos períodos em grandes profundidades tornando o controle químico inviável e antieconômico (LOPES et al., 1994; LOPES & REIFSCHNEIDER, 1999). Estudos sobre hortaliças no Estado de São Paulo mostraram que a principal demanda levantada por extensionistas, foi a necessidade de novos híbridos resistentes a pragas e doenças como, por exemplo, à murcha bacteriana e que estes sejam mais produtivos e adaptados às condições locais de cultivo. Acrescenta-se, ainda, a ineficiência do controle químico da maioria das doenças bacterianas por agrotóxicos, além do seu alto custo e 12 riscos ao meio ambiente, produtores e trabalhadores rurais, bem como ao consumidor através da contaminação do produto final (RIBEIRO & CRUZ, 2001). 5.3 Enxertia em hortaliças Enxertar é unir duas porções de tecido vegetal vivo visando o desenvolvimento de uma única planta. Seu sucesso é representado pela união morfológica e fisiológica dessas duas partes. Para tal efeito, é fundamental que o câmbio do enxerto fique em contato estreito com o câmbio do porta-enxerto (JANICK, 1966). O início da enxertia em hortaliças ocorreu em melancia (Citrullus lanatus) no Japão e na Korea, em 1920, com objetivo de controlar de forma preventiva, a doença ocasionada por Fusarium oxysporum, utilizando porta-enxertos resistentes (YAMAKAWA, 1982). A partir de 1970, a enxertia em hortaliças tem sido muito valorizada, desenvolvendo-se vários trabalhos objetivando o controle de patógenos de solo, modificação da expressão sexual, compatibilidade, nutrição, desenvolvimento, produção e qualidade de frutos (CAÑIZARES, 2001), como por exemplo, o controle de Ralstonia solanacearum, Fusarium oxysporum, Pyrenochaeta lycopersici, Meloidogyne incognita, Verticillium dahliae na cultura do tomateiro (ODA, 1995). No Brasil, começou-se a utilizar enxertia em hortaliças a partir da década de 80, por produtores de pepino da extinta Cooperativa Agrícola de Cotia (CAC-CC) e tem sido adotada comercialmente nas culturas do pimenteiro, tomateiro e pepineiro. As regiões sul e sudeste do Brasil são as que mais utilizam esta técnica. Os primeiros estudos no Brasil foram na década de 90, com trabalhos relacionados à resistência/tolerância a doenças e efeitos da enxertia na qualidade e produtividade. Observou-se níveis de resistência entre diferentes porta-enxertos de tomateiro à Verticillium dahliae (Kobori, 1994). Em 1999, este mesmo autor estudou a viabilidade do uso de porta-enxertos de Capsicum annuum resistentes a Phytophthora capsici no controle da murcha de fitóftora em pimenteiro. Santos (2001) confirmou a estabilidade de resistência desses porta-enxertos e a capacidade produtiva das plantas enxertadas. Posteriormente ficou 13 comprovada a tolerância dos mesmos porta-enxertos a M. incognita, raça 2 ( SANTOS et al., 2002). Existem estudos relacionando a enxertia com a nutrição e fisiologia das hortaliças, como por exemplo: resistência de meloeiro rendilhado a Didymella bryoniae, em função da enxertia e concentrações de potássio (SILVA et al., 2012); acúmulo de nutrientes e desempenho agronômico do pimenteiro (Capsicum annum L.), em função dos métodos de enxertia (SILVA, 2012); ação conjunta de citocinina, giberelina e auxina em pimenteiro enxertado e não enxertado sob cultivo protegido (PALANGANA et al., 2012). Em ambiente protegido, os patógenos de solo têm se constituído um desafio, devido à utilização intensa deste ambiente. Em razão do surgimento de raças fisiológicas, estirpes ou grupos de diferentes patógenos, a obtenção de variedades resistentes tem sido morosa. Com base nisso, a adoção da enxertia utilizando porta-enxertos resistentes, porém, com boas características comerciais, constitui-se em alternativa de controle a curto prazo (SANTOS et al., 2003). A enxertia é mais interessante quando comparadas às outras formas de controle isolado na tolerância à temperaturas adversas, à salinidade do solo, ao vigor, à desordens fisiológicas das plantas e à produção de frutos de melhor qualidade (GOTO et al., 2003). A cultura do tomateiro é uma das mais estudadas com relação a técnica da enxertia. Porém o foco dos estudos têm sido principalmente objetivando o controle de doenças. Existem relatos de que na Amazônia, em pequenas culturas, a enxertia de tomateiro em jurubeba é uma prática utilizada há muito tempo, para controle da murcha bacteriana (SANTOS & GOTO, 2004). Obteve-se resultados interessantes em solos infestados com R. solanacearum com produção 800% maior em plantas da cultivar Santa Clara enxertadas no porta enxerto acesso CNPH 1048, comparadas ao pé-franco (MENDONÇA et al., 2005). Entretanto em solos com condições favoráveis à cultura do tomateiro, são menores as diferenças de produção entre as plantas enxertadas e o pé-franco, segundo valores obtidos por Lopes et al. (2003). A resistência proporcionada pela enxertia está relacionada à melhoria da fotossíntese e ao aumento da atividade de enzimas antioxidantes (HE et al., 2009). Em 14 estudo com tomateiro enxertado em um porta-enxerto tolerante a salinidade, foi observado que as plantas enxertadas tiveram maior eficiência fotossíntética com relação à condutância estomática (gs) e eficiência do uso da água (EUA), além de manterem maior atividade fotoquímica do fotossistema II (PSII) e aumento das atividades das enzimas peroxidase e catalase (HE et al., 2009). Porém, não foi observado influência da enxertia nas trocas gasosas em um estudo com meloeiro rendilhado inoculado com Didymella bryoniae e comparado com plantas não enxertadas (SILVA, 2010). A enxertia é uma técnica muito utilizada em hortaliças no Brasil, além de ser um dos segmentos que mais utiliza tecnolgias e aumenta rendimento nos viveiros produtores de mudas de hortaliças. Em 2009, foram comercializadas nos principais viveiros de hortaliças do estado de São Paulo, 2.347.670 mudas enxertadas de pimenteiro, 1.972.210 de pepineiro, 776.010 de tomateiro 70.400 de berinjeleira, 3.400 de jiló, 7.500 de abobrinha Mini (GOTO, 2010)1. Com relação aos métodos de enxertia, alguns autores comentam que não existe nenhum capaz de predizer o resultado de uma enxertia, entretanto, em linhas gerais, se pode dizer que quanto maior a afinidade botânica entre as espécies, maior a probabilidade de sobrevivência do enxerto (PEIL, 2003). Existe uma variedade de métodos de enxertia para hortaliças. Os mais utilizados são fenda garfagem, aproximação ou contato em bisel, encostia e perfuração. A eleição do método de enxertia deve considerar, além da espécie, as vantagens e desvantagens de cada um e relacioná-las com a realidade do produtor de mudas (PEIL, 2003). 5.4 Enzimas antioxidativas e os mecanismos de defesa da planta Nas plantas sob estresse, seja por injúrias causadas por patógenos ou hídrico, salino, osmótico, temperatura, luminosidade, efeito de herbicidas, ocorre a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO’s). Em folhas de tomateiro foi observado aumento da 1 GOTO, R. (Departamento de Produção Vegetal, Faculdade de Ciências Agronômicas, UNESP – Campus de Botucatu, SP). Comunicação pessoal, 2010. 15 concentração de ERO’s, em função do aumento da concentração de R. solanacearum, medida em unidade formadora de colônia (UFC) (FLORES-CRUZ & ALLEN, 2009). Estas ERO’s, como o peróxido de hidrogênio (H2O2), radical superóxido (O-2) e o radical hidroxila (OH-) são conhecidos por oxidar importantes constituintes celulares, tais como ácidos nucléicos, fosfolipídeos de membrana (camada bipolar) e proteínas, podendo levar as células à morte (SAROWAR et al., 2005). O superóxido formado tem algumas transformações, na redução a hidroxila (OH¯, radical que tem grande afinidade por moléculas biológicas em seu sítio de produção) (SOARES & MACHADO, 2007), conversão a H2O e O2 pela ação da catalase e conversão a H2O pela ação oxidação de substratos, como ascorbato, via peroxidases. A consequência imediata da formação de ERO traduz-se em alterações da permeabilidade seletiva e efluxo de íons (ALSCHER et al., 1997). Segundo os mesmos autores, no complexo protéico, pode ocorrer mudança na estrutura conformacional. No caso de enzimas, pode haver alterações no sítio ativo, influenciando a atividade e consequentemente, outras alterações metabólicas, como aumento da síntese de proteases, responsáveis pela degradação das proteínas. Para combater os danos causados pelo estresse oxidativo, as plantas desenvolveram um sistema de defesa, em que se destaca as variações nas atividades de enzimas do sistema antioxidativo, que agem como eliminadores (YOSHIMURA et al., 2004) das formas reativas de oxigênio (MURGIA et al., 2004). Esta defesa é de natureza química e podem atuar entre outros, na síntese de metabólitos secundários tóxicos aos patógenos, espécies reativas de oxigênio e ativação de genes que codificam PR-proteínas (proteínas que se acumulam em resposta a um ataque de patógenos) (VAN LOON et al., 2006), tratamento com indutores de resistência ou outro tipo de estresse (WHALEN, 2005). Dentre as enzimas relacionadas ao estresse da patogênese se destacam peroxidase, ß-1,3-glucanase, quitinase, fenilalanina amônia liase e polifenoloxidase (CAVALCANTI et al., 2005) e relacionadas ao estresse causado pela enxertia, se destaca a peroxidase e catalase (FERNÁNDEZ-GARCIÁ et al., 2004). Nas plantas em geral, como por exemplo, em tomateiro, a POD é uma das enzimas envolvidas no último passo na lignificação (NICHOLSON & HAMMERSCHMIDT, 1992), em resposta ocorrida logo depois do estresse causado por ferimentos e ataque de patógenos. Em plantas de tomateiro, quando infectadas por 16 R. solanacearum, algumas enzimas apresentam alterações nas atividades, como as peroxidases, quitinase, fenilalanina amônia liase e polifenoloxidase (SILVA et al., 2007). A superóxido dismutase (SOD) (EC 1.15.1.1) é responsável pela dismutação do O2 - em H2O2, influenciando na concentração de O2 - e H2O2 na célula. Três tipos distintos de isoenzimas SOD têm sido detectados em plantas, que são classificados de acordo com seu metal cofator Fe, Mn e Cu/Zn (GRATÃO et al., 2005). Fe-SOD tem se mostrado associada com os cloroplastos; Mn-SOD está localizada na mitocôndria e peroxissomos, enquanto a Cu/Zn-SOD está localizada no citosol, cloroplastos e peroxissomos (GRATÃO et al., 2005). A SOD constitue a primeira linha de defesa contra ERO dentro de uma célula (ALSCHER et al., 2002). Kawaradani et al. (1994) ao estudarem atividade de algumas enzimas em plantas de berinjela contra patógenos de solo, observaram atividade elevada da SOD nas plantas infectadas com R. solanacearum. Em plantas de tomateiro enxertadas e não enxertadas submetidas a três temperaturas 10°C, 25°C e 35°C, Rivero et al. (2003) observaram elevada atividade da SOD em função da temperatura 35°C, porém a enxertia não influenciou na variação da atividade da enzima. A catalase (CAT) (EC 1.11.1.6) é outra enzima importante do sistema de defesa em plantas. Como resposta antioxidativa esta enzima decompõe o H2O2 gerado nos peroxissomos durante a fotorrespiração, reduzindo-o à água, assim como o H2O2 gerado da reação da SOD, ou seja, esta enzima funciona como canal de limpeza do H2O2 celular (BREUSEGEM et al., 2001). As peroxidases (POD) (EC 1.11.1.7) são enzimas que utilizam o H2O2 para oxidar um grande número de doadores de hidrogênio nos compostos fenólicos, os quais participam de vários processos fisiológicos, como na síntese da lignina e na incompatibilidade do enxerto com porta-enxerto (GASPAR et al., 1982) e defesa da planta a patógenos (VAN LOON et al., 2006). Há relatos que durante a formação da lignina, a POD fornece H2O2 necessário para oxidação do ácido cinâmico e convertem o ácido ferúlico em diferúlico, o qual age na ponte de hemicelulose unindo o ácido cinâmico às proteínas e aos carboidratos da parede celular favorecendo a consolidação (GASPAR et al., 1982). Existem relatos que POD e CAT têm suas atividades alteradas após a enxertia, uma técnica agronômica que pode promover estresse em plantas (FERNÁNDEZ- 17 GARCIÁ et al., 2004). Em plantas de pimenteiro foi observado aumento da transcrição (alteração da atividade) de POD após as plantas serem infectadas com Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Nestas plantas a atividade da POD atingiu um pico de atividade em 18 horas (h) após a infecção e em seguida, entre 24 e 30 h diminuiu, quando o acúmulo de H2O2 foi máximo (DO et al., 2003). Outra enzima relacionada com estresse de plantas atacadas por microrgarnismos e que tem sua atividade alterada é a fenilalanina amônia liase (PAL) (EC 4.1.3.5), a principal enzima na via dos fenilpropanóides, que leva à conversão de fenilalanina em ácido trans-cinâmico com a eliminação de amônia. PAL tem sido demonstrada na atividade metabólica de muitas plantas superiores e considerada a enzima chave na síntese de vários compostos secundários como fenóis e ligninas relacionados com a defesa (HEMM et al., 2004). A presença de compostos fenólicos em plantas e sua síntese em resposta à infecção, está associada com resistência a doenças. Isto tornou a enzima PAL uma das mais estudadas no metabolismo secundário de plantas (WHETTEN & SEDEROFF, 1995). A atividade da PAL pode ser alterada por fatores ambientais, tais como baixos teores de nutrientes, luz e infecção por patógenos (ENGELBERTH, 2009). Em muitas espécies vegetais, a regulação da atividade da PAL tornar-se mais complexa pela existência de múltiplos genes que codificam essa enzima, alguns dos quais são expressos somente em tecidos específicos ou sob certas condições ambientais (LOGEMANN et al., 1995) Em cultivares de tomateiro resistentes à murcha bacteriana e inoculadas com R. solanacearum foi observado aumento significativo da atividade das enzimas PAL, PPO e do teor de fenóis totais (VANITHA, et al., 2009). Os mesmos autores indicaram que as enzimas PAL e PPO foram envolvidas no desenvolvimento da resistência a murcha bacteriana e podem ser usadas como marcadores bioquímicos a resitência/suscetibilidade de tomaterio a R. solanacearum. Os compostos fenólicos se originam do metabolismo secundário das plantas, sendo essenciais para o seu crescimento e reprodução, além de atuarem como agente antipatogênico e contribuírem na pigmentação (NACZK & SHAHIDI, 2004). Eles se formam em condições de estresse como, infecções, ferimentos, radiação ultravioleta, dentre outros (SHAHIDI & NACZK, 1995). Estes compostos fenólicos interagem com as EROs e são consumidas durante a reação (ANGELO & JORGE, 2007). 18 Os compostos fenólicos são encontrados abundantemente em plantas e são um grupo muito diversificado de fitoquímicos derivados da fenilalanina e tirosina (SHAHIDI & NACZK, 1995). A fenilalanina é um produto da rota do ácido chiquímico, rota a qual se localiza a enzima PAL (ENGELBERTH, 2009). Outra enzima que também apresenta alteração na atividade é a polifenoloxidase (PPO) (EC 1.14.18.1), uma classe conhecida como tirosinase, cresolase, catecolase, difenolase e fenolase. São enzimas intracelulares que ocorrem em plantas, animais e fungos (WHITAKER, 1994). Estas enzimas contêm cobre no centro ativo e catalisam dois tipos de reações, ambas envolvendo oxigênio. A primeira reação corresponde a hidroxilação de monofenóis formando orto-difenóis e a segunda, à oxidação de orto-difenóis formando orto-quinonas (VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981). PPO’s catalisam a oxidação de compostos fenólicos próximo ao local da degradação celular provocada por patógenos. Um dos resultados mais estudados deste fenômeno é o aparecimento de substâncias escuras provenientes da polimerização oxidativa das quinonas (THIPYAPONG et al., 2007; VANITHA, et al., 2009). A PPO tem participação na defesa da planta contra patógenos, porém existem poucos relatos do seu papel nesta defesa (VANITHA, et al., 2009). Plantas transgênicas de tomate têm a sua resistência reforçada a Pseudomonas syringae com expressão de PPO (LI & STEFFENS, 2002). A detecção e quantificação de ERO’s em sistemas biológicos são particularmente difíceis devido à rápida destruição e detoxificação (eliminação) desses radicais (RESENDE et al., 2003). Além disso, segundo os mesmos autores, as ERO’s não podem ser medidas diretamente por métodos espectrofotométricos ou CLAE (Cromatografia liquida de alta eficiência), normalmente aplicados ao estudo de compostos de carbono. Por isso, a maioria das técnicas de detecção de ERO’s baseia-se na oxidação ou redução de certos compostos pelas próprias ERO’s. Isto pode ser evidenciado através da determinação da atividade de enzimas antioxidantes. Por exemplo, na medição de H2O2, o mais comum é utilizar a enzima peroxidase e um substrato oxidável (MOLLER, 2001). A dificuldade de monitoramento das ERO’s em células vegetais deve- se ao fato de que muitas são de vida curta e sujeitas aos mecanismos antioxidantes celulares tais como compostos fenólicos, enzimas PAL, PPO, POD, SOD, CAT e ciclo do ascorbato/glutationa (RESENDE et al., 2003). 19 5.5 Trocas gasosas em plantas A produtividade das plantas é influenciada por características morfológicas e fisiológicas da fonte (órgãos fotossintetizantes) e do dreno (órgãos consumidores dos metabólitos fotossintetizados, carboidratos principalmente) (BRANDÃO FILHO et al., 2003). Toda produção de fitomassa depende da atividade fotossintética da fonte, porém a assimilação do CO2 é apenas um dos muitos fatores que influenciam o crescimento e desenvolvimento vegetal (FOYER & GALTIER, 1996). O estresse recebido pela planta pode afetar os processos fisiológicos e consequentemente a atividade fotossintética da fonte, como por exemplo, a murcha causada por R. Solanacearum, que afeta diretamente as folhas do tomateiro, a qual é importante fonte para a planta. Isto pode interferir na produção da matéria seca e sua produtividade da cultura. A fotossíntese é essencial para o metabolismo das plantas, que ocasiona uma ligação entre processos internos das plantas e o ambiente externo (FONTES, 2008). A avaliação das trocas gasosas podem ajudar no estudo da capacidade fotossintética das plantas, a qual tem sido muito utilizada, por ser um método não destrutivo que permite a análise qualitativa e quantitativa da fotossíntese das plantas. As trocas gasosas são medidadas pela taxa de assimilação líquida de CO2, condutância estomática e taxa de transpiração. No Brasil, existem estudos em hortaliças que relacionam trocas gasosas com enxertia, nutrição mineral, água enriquecida com CO2, doenças e fungicidas de efeitos fisiológicos (BRANDÃO FILHO, et al., 2003; CAÑIZARES, 2004; SILVA, 2010; AMARO, 2011; MACEDO, 2012). Em um trabalho relacionando a técnica da enxertia com trocas gasosas em dois híbridos de berinjeleira, foi observado que a enxertia não afetou a capacidade fotossintética dos mesmos, porém, as plantas enxertadas apresentaram menores valores de condutância estomática e transpiração nos dois híbridos, ocasionando maior eficiência no uso da água, efeito este que na prática pode resultar em menor demanda de água pelas plantas (BRANDÃO FILHO, et al., 2003). 20 Cañizares et al. (2004) estudaram o crescimento e índices de troca gasosa em plantas de pepino irrigadas com água enriquecida com CO2 e observaram que a produção pode ser influenciada pelo enriquecimento da água com CO2. Amaro (2011) e Macedo (2012) estudaram fungicidas com efeitos fisiológicos em pepino “japonês” e meloeiro rendilhado e baseado em dados de trocas gasosas e produção concluíram que os fungicidas testados apresentam efeitos fisiológicos positivos. Em estudo com doses de potássio e a doença crestamento gomoso do caule em meloeiro rendilhado, enxertado e pé-franco, Silva (2010) observou que as doses de potássio influenciaram de forma positiva na condutância estomática e transpiração das plantas. No entanto, não foi encontrado estudo relacionando murcha bacteriana e trocas gasosas em tomateiro. A capacidade fotossintética das plantas é influenciada por vários fatores: genética, condições climáticas (luz, umidade relativa do ar, temperatura), morfologia vegetal, condições nutricionais, disponibilidade de água, concentração de CO2 no ambiente. Esta capacidade fotossintética depende das trocas gasosas, as quais também são influenciadas por estes fatores. 21 6 MATERIAL E MÉTODOS 6.1 EXPERIMENTO 1: Avaliação do estresse causado pela enxertia em tomateiro através da variação da atividade enzimática e teor de fenóis 6.1.1 Produção de mudas e condução do experimento O experimento foi conduzido entre outubro e dezembro de 2010. As semeaduras do porta-enxerto ‘Guardião’® (Takii do Brasil) e híbrido Pizzadoro® (Nunhems) para enxertia foram feitas 30 dias antes da enxertia e o híbrido Pizzadoro® pé-franco 15 dias, na Fazenda Experimental São Manuel da FCA/UNESP – Botucatu – SP. Foi utilizado substrato comercial Tropstrato® HT Hortaliças para a semeadura e desenvolvimento das mudas nas bandejas. O hibrido Guardião® é considerado resistente a Murcha bacteriana (Ralstonia solanacearum); Verticillium (Verticillium dahliae); Fusarium raças 1 e 2 (Fusarium oxysporum f. SP. lycopersici 1 & 2); Fusarium (Fusarium oxysporum f. SP radicis- lycopersici); Vírus do Mosaico do Tomate (ToMV) (Tomato Mosaic Virus, Tm-2a.); Nematóides Meloidogyne arenaria (Ma); Meloidogyne javanica (Mj); Meloidogyne incógnita (Mi) (TAKII, 2013). O ‘Guardião’® é compatível com híbridos que apresentam resistência ao 22 Tomato Mosaic Virus - estirpe 2. Em épocas de temperaturas mais baixas, a empresa produtora recomenda semear entre 2 a 3 dias antes do cavaleiro (enxerto). O híbrido Pizzadoro® é um tomate para mercado fresco do tipo Saladete (Italiano) com hábito de crescimento indeterminado. Apresenta elevada resistência a Murcha de verticílio (Va e Vd), Murcha de fusário (Fol:0,1), Pinta bacteriana (Pst), Vírus do Mosaico do Tomate (ToMV) e resistência intermediária aos nematóides (Ma, Mi, Mj) (NUNHEMS, 2013). As enxertias foram feitas no Departamento de Horticultura da FCA/UNESP-Botucatu – SP, de acordo com Goto et al. (2003), utilizando-se três métodos de enxertia (Contato em bisel, Fenda garfagem, Encostia). Os cortes foram realizados com auxilio de lâminas, acima das folhas cotiledonares do porta-enxerto para os métodos Contato em bisel e Fenda garfagem, e acima da primeira folha definitiva para método da Encostia. No enxerto deixou-se três folhas definitivas. Os enxertos foram fixados pelo clipe de enxertia recomendado para o tomateiro e tutoradas com um palito de bambu colocado na célula da muda enxertada, passando através do grampo de enxertia para melhor fixar a planta. Após o processo da enxertia, as mudas enxertadas foram recolocadas em bandejas e juntamente com as mudas pé-franco (testemunha) foram rapidamente acondicionadas em câmara úmida e cobertas por tela de sombreamento de 75% (Figura 1). Houve o cuidado de manter câmara de enxertia com umidade relativa sempre próxima a 100% e temperatura entre 26 e 29ºC, fazendo a troca de ar, ou seja, abertura da câmara duas a três vezes por dia, quando a temperatura estava muito elevada. Foi feito também o molhamento dos jornais que forraram a base da câmara, para suprir a necessidade de água e umidade das plantas. Para evitar estresse das plantas pertencentes às coletas posteriores foi feita uma câmara úmida de enxertia para cada coleta no experimento 1 (Figura 1). 23 Figura 1. Câmara úmida de enxertia. UNESP/FCA, Botucatu, SP. Foto: Edvar Silva, 2010. 6.1.2 Delineamento do experimento 1 e avaliação da cicatrização das mudas enxertadas Foi utilizado delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 4 x 5. Os 20 tratamentos resultaram das plantas enxertadas através dos métodos Contato em bisel, Fenda garfagem, Encostia e enxerto pé-franco (testemunha) com cinco épocas de coletas das plantas (0, 3, 6, 9 e 12 dias após a enxertia) para análise enzimática. Foram utilizadas quatro plantas por repetição. Foi avaliada a porcentagem de cicatrização baseado na quantidade total de plantas enxertadas e quantidade de plantas que obtiveram a cicatrização da região de enxertia e que estavam aptas para transplante. 24 6.1.3 Coletas das plantas para análises bioquímicas dos experimentos 1 e 2 As plantas ao serem coletadas, para análise da atividade enzimática, foram lavadas em água, secas com papel para retirada do excesso de umidade, envoltas em papel alumínio, etiquetadas e congeladas em nitrogênio líquido. Em seguida foram levadas em caixas térmicas para o laboratório de Analises Bioquímicas, pertencente ao Departamento de Química e Bioquímica, do Instituto de Biociências, UNESP, Campus de Botucatu. As amostras foram acondicionadas em freezer -80 oC, para posterior determinação da atividade das enzimas e teor de fenóis totais. 6.1.4 Determinação da atividade enzimática e teor de fenóis totais dos experimentos 1 e 2 As atividades enzimáticas e teor de fenóis foram determinadas entre os anos de 2011 e 2012. Estas determinações foram feitas em espectrofotômetro. No experimento 1, as amostras foram os caules das mudas e no experimento 2, as amostras das plantas enxertadas também foram os caules, porém em três partes nas plantas enxertadas, acima, abaixo e no local da enxertia. 6.1.5 Superóxido dismutase (SOD) A atividade da SOD (EC 1.15.1.1) (Beauchamp & Fridovich, 1973) foi avaliada pela capacidade da enzima em inibir a fotorredução do azul de nitrotetrazólio (NBT) em um meio de reação composto por metionina 5 mmol L-1, EDTA 0,66 mmol L-1, NBT 33 µmol L-1 e riboflavina 0,00165 mmol L-1, em 3,0 mL de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,8). A produção de formazana azul, resultante da fotorredução do NBT foi determinada pela absorção a 560 nm. Uma unidade de SOD foi definida como a quantidade de enzima necessária para a inibição de 50% da fotorredução do NBT. A atividade enzimática foi expressa em U g-1 de proteína. 25 6.1.6 Catalase (CAT) e polifenoloxidase (PPO) A atividade da CAT (EC 1.11.1.6) foi determinada por adaptação do método de Kar & Mishra (1976), o ensaio foi composto de 150 μL de amostra, que foi extraída em tampão fosfato de potássio + EDTA + DTT + PVPP 100 mmol L-1 pH 7,5. Utilizou – se 1950 μL de tampão fosfato de potássio 100 mmol L-1 (pH 7,5) como tampão de determinação e 750 μL solução de peróxido de hidrogênio 50 mM como substrato enzimático. As leituras foram feitas a 240 nm. A atividade enzimática foi expressa em μmol H2O2 min-1 mg-1 de proteína. A atividade da PPO (EC 1.14.18.1) também foi determinada pelo método adaptado de Kar & Mishra (1976), pela mensuração da conversão do catecol em quinona. O substrato utilizado foi composto por catecol 0,1 M em tampão acetato de sódio (pH 5,0). Para a reação, que ocorreu a 30 ºC por 30 minutos foi utilizado 0,3 mL da amostra + 1,85 mL de catecol 0,1 M. As leituras foram feitas após a adição de 0,8 mL de ácido perclórico, a 395 nm. A atividade enzimática foi obtida em µmol catecol oxidado min-1 µg-1 de proteína. 6.1.7 Peroxidase (POD) A atividade da POD (EC 1.11.1.7) foi estimada pelo método de Lima et al. (1999). O ensaio foi realizado em 5,0 mL de tampão acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0). O substrato utilizado foi composto por 0,5 mL de 30% peróxido de hidrogênio em tampão fosfato de potássio 0,2 M (pH 6,7) e 0,5 mL de solução de fenol e aminoantipirina. A reação iniciou-se pela adição do extrato bruto e após cinco minutos, adicionou-se 2 mL de álcool etílico absoluto. A atividade enzimática foi realizada em 505 nm e expressa em µmol H2O2 decomposto min-1 mg-1 de proteína. 6.1.8 Fenilalanina amônia liase (PAL) A atividade da PAL (EC 4.3.1.5) foi determinada somente no segundo experimento, pois segundo a literatura esta enzima tem grande relação com estresse causado por doenças. Utilizou-se o método adaptado de Peixoto et al., 1999. Foi misturado 200 mg de 26 amostra com 10 mL de 0,1 M de tampão de borato (pH 8,8) contendo 1,2 mL de β mercaptoetanol, 50g (5%) de polivinilpolipirrolidona (PVPP). Esta mistura foi centrifugado por 20 minutos à 4oC (12.500 x g) e depois filtrado em lã de vidro, gerando o extrato. A reação foi iniciada pela adição 1mL do extrato + 1mL de tampão borato 0,2M (pH 8,8) e 1 mL de fenilalanina após 5 minutos de banho-maria. Na amostra controle, o extrato foi substituído por 1 mL tampão borato 0,1M. A reação foi finalizada pela adição de 0,1mL (100�L) de HCl 6N. A leitura foi feita a 290 nm. Um coeficiente de extinção de 104 mM-1 cm-1 foi utilizada para calcular a atividade de PAL, que foi expressa como μmols min-1 mg-1 de proteína. 6.1.9 Fenóis totais A análise de fenóis totais foi realizada de acordo com o método espectrofotométrico, usando o reativo de Folin-Ciocalteu (SINGLETON & ROSSI JR., 1965). As amostras do material fresco e moídas foram pesadas e colocadas em tubos de centrífuga, que continham acetona a 50% em água. As amostras foram incubadas em banho de ultra-som durante 20 minutos e depois centrifugada a 6000 × g (Hettich Zentrifugen, Mikro220R), durante 10 minutos. Os sobrenadantes foram re-extraídos e combinados. Foi adicionado o reagente de Folin-Ciocalteau e após 3 minuots a 25ºC, uma solução saturada de Na2CO3 foi adicionada, e a mistura de reação foi incubada durante 1 h. A absorbância foi medida a 760 nm (Pharmacia Biotech, Ultrospec 2000) e os resultados foram expressos em fenóis mg g-1 de massa fresca (MF) em equivalentes de ácido gálico. 6.2 EXPERIMENTO 2: Incidência da murcha bacteriana do tomateiro, trocas gasosas, atividade de enzimas antioxidantes e teor de fenóis em plantas de tomateiro enxertadas e inoculadas com R. solanacearum O experimento foi conduzido entre outubro e dezembro de 2011, em casa de vegetação do Departamento de Horticultura da FCA/UNESP – Botucatu – SP (Figura 2), com temperatura ajustada para não ultrapassar 30oC e manutenção da umidade em torno de 70%. A produção das mudas foi com porta-enxerto ‘Guardião’® (Takii do Brasil) e híbrido 27 Pizzadoro® (Nunhems), como já descrito no item 6.1.1 e o método de enxertia utilizado foi o Contato em bisel. Figura 2. Vista geral do segundo experimento. UNESP/FCA, Botucatu, 2011. Foto: Edvar Silva. 6.2.1 Delineamento experimental O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado com dez repetições para a avaliação da incidência da murcha bacteriana, cinco repetições para avaliação das trocas gasosas e quatro repetições para avaliação das atividades enzimáticas e teor de fenóis. Foram utilizadas três plantas por repetição. Para avaliação da incidência da murcha bacteriana e trocas gasosas, os tratamentos foram: 1) plantas enxertadas inoculadas com R. solanacearum; 2) enxerto pé- franco inoculado com R. solanacearum; 3) porta-enxerto pé-franco inoculado com R. solanacearum e 4) enxerto pé-franco não-inoculado (Testemunha). Para avaliação das atividades enzimáticas e teor de fenóis foram acrescentados aos tratamentos acima, porta-enxerto e planta enxertada, ambos não-inoculado. 28 Além disso, as plantas enxertadas inoculadas e não inoculadas foram divididas em três amostras diferentes (Tabela 1). Os 60 tratamentos em esquema fatorial, foram resultantes do local da planta e dias após a inoculação (DAI), ou seja, as épocas de coleta das amostras (Tabela 1). Tabela 1. Arranjo dos tratamentos para avaliação das atividades enzimáticas e teor de fenóis. UNESP-FCA, Botucatu, SP, 2011. Fator 1: Local da amostra Fator 2: Dias após a inoculação (DAI) Épocas de coletas das amostras Acima enxertia inoculado 0 2 4 6 8 15 Local enxertia inoculado Abaixo enxertia inoculado Enxerto PF# inoculado Porta-enxerto PF# inoculado Enxerto PF# não-inoculado Porta-enxerto PF# não-inoculado Acima enxertia não-inoculado Local enxertia não-inoculado Abaixo enxertia não-inoculado # PF = Pé-franco 6.2.2 Transplante das plantas As plantas foram transplantadas em vasos de 4 L com substrato constituído de solo (67%), composto orgânico (22%), substrato comercial (11%), previamente autoclavado e enriquecido com 0,95 g de termofosfato + 0,85 g de superfosfato simples e 0,20 g de cloreto de potássio, por litro de substrato, visando a nutrição das plantas. 6.2.3 Preparo do inóculo de R. solanacearum Para o preparo do inóculo, foi utilizado o isolado TOM-3145 de Ralstonia solanacearum, proveniente da coleção de fitobactérias do Laboratório de Bacteriologia Vegetal, FCA/UNESP, oriundo da empresa Sakata Sudamérica Ltda. O mesmo foi cultivado em meio de Tetrazolium (peptona – 10,0g, glicose – 5,0g, caseína hidrolisada – 1,0g, solução de tetrazolium a 1% - 5,0mL, ágar – 15,0g, água destilada- q.s.p. 1000 mL, pH 29 7,0) durante 48 horas em estufa a 27 ºC. As colônias de bactérias patogênicas (brancas) foram selecionadas e repicadas para NSA (peptona – 5,0g, extrato de carne – 3,0g, sacarose – 5,0g, ágar – 15,0g, água destilada- q.s.p. 1000 mL) nas mesmas condições anteriores, para a obtenção do inóculo. 6.2.4 Inoculação das plantas Para a inoculação, foi preparada uma suspensão bacteriana em água destilada que foi ajustada por colorimetria (A540nm = 0,1) à concentração de 108 UFC.mL-1 (WILLIAMSON et al., 2002). A inoculação foi feita pela adição de 5 mL da suspensão de inóculo no solo, ao redor do colo de cada planta, cujas raízes foram previamente feridas pela introdução de um bisturi esterilizado (DEMOSTHENES & BENTES, 2011). 6.2.5 Avaliação da incidência da murcha bacteriana As avaliações da incidência da doença sobre as plantas de tomateiro enxertadas e pé-franco foram feitas aos 0, 5, 10, 15 dias após a inoculação com R. solanacearum, com base na porcentagem de folhas murchas (número de folhas murchas x 100 / número total de folhas da planta) e peso da massa fresca e seca das plantas de cada tratamento (SILVA et. al., 2007). 6.2.6 Medidas de trocas gasosas nas plantas As medidas foram realizadas sempre das 8:00 às 11:00 horas da manhã utilizando o medidor portátil de fotossíntese, com sistema aberto e analisador de CO2 por radiação infravermelha (“Infra Red Gas Analyser – IRGA”, modelo LI-6400 da LI-COR). Os parâmetros mensurados foram: taxa de assimilação líquida de CO2 nas folhas (A) em μmol m-2 s-1; condutância estomática (gs) em mol m-2 s-1 e taxa de transpiração nas folhas (E) em mmol m-2 s-1. 30 6.2.7 Coletas das plantas do experimento 2 No experimento 2 as plantas foram coletadas aos 0, 2, 4, 6, 8 e 15 dias após a inoculação com R. solanacearum, em plantas conduzidas em casa de vegetação, devido não haver estudos sobre épocas definidas para essas coletas. Foram amostradas três plantas por tratamento, em cada bloco. O procedimento das coletas das plantas para análise da atividade enzimática e teores de fenóis foram de acordo com a descrição no item 6.1.3 e a determinação da atividade enzimática e teor de fenóis como descrito nos itens 6.1.5.; 6.1.6; 6.1.7.; 6.1.8; 6.1.9.; 6.1.10. 6.3 EXPERIMENTO 3: Avaliação da produção do tomateiro em função de três métodos de enxertia e pé-franco 6.3.1 Preparo da área e produção das mudas Na preparação do solo, entre março e maio de 2012 fez-se o plantio de Crotalaria juncea L. visando controle preventivo de nematoides e utilização como adubação verde. A adubação de plantio foi realizada a base de composto orgânico (4 kg m-2). A nutrição mineral após o plantio foi feita via fertirrigação, a base de nitrato de amônio, fosfato monoamônico (MAP), nitrato de potássio, sulfato de magnésio e calcio e boro via foliar, de acordo com a análise de solo (Tabela 2). 31 Tabela 2. Análise química do solo e teores de macro e micronutrientes. FEPP/FCA/UNESP, 2011. Profundidade pH M.O. Presina Al3+ H+Al K Ca Mg SB CTC V% (cm) CaCl2 g/dm3 mg/dm3 _ _ _ _ _ _ mmolc/dm3 _ _ _ _ _ _ _ _ 0-20 6,7 9 125 0 10 2,6 64 6 72 82 88 20-40 6,6 7 83 0 10 1,7 32 3 36 46 78 BORO COBRE FERRO MANGANÊS ZINCO _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ mg/dm3 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 0-20 0,37 4,1 18 4,5 0,5 20-40 0,33 2,1 21 16,0 6,9 A produção das mudas foi de acordo com item 6.1.1. 6.3.2 Condução do experimento O experimento foi conduzido entre junho e novembro de 2011, sob ambiente protegido, estrutura tipo arco, de 7 x 25 m coberto por filme de polietileno de baixa densidade (PEBD) transparente de 100 µm de espessura, com 3,5 m de pé direito, em área da Fazenda Experimental de Ensino, Pesquisa e Produção (FEPP), no município de São Manuel, SP, pertencente à Faculdade de Ciências Agronômicas (FCA) da Universidade Estadual Paulista (UNESP) de Botucatu, nas coordenadas geográficas aproximadas de 22o44’ latitude sul e 48o34’de longitude oeste, com altitude em torno de 750 m. O clima local é do tipo mesotérmico, subtropical úmido (Cfa) e a precipitação média anual é de 1.445 mm, sendo a temperatura média anual de 21oC, com a temperatura do mês mais quente 23,8o C e do mês mais frio 17,5oC. As mudas foram transplantadas em espaçamento 1,0 x 0,4 m. Foram conduzidas com uma haste, eliminando os brotos excedentes quando necessário (Figura 3). Foi realizado também manejo fitossanitário de acordo com a necessidade da cultura. O ciclo da cultura do tomateiro neste trabalho durou aproximadamente 190 dias, desde a semeadura até a última colheita. 32 Figura 3. Vista do experimento 3. UNESP/FCA/FEPP, São Manuel, SP, 2011. Foto: Edvar Silva. 6.3.3 Delineamento experimental Foi utilizado delineamento em blocos casualizados, com quatro tratamentos e quatro repetições. Utilizaram-se quatro plantas por parcela. Os tratamentos foram três métodos de enxertia: Contato em bisel, Fenda garfagem e Encostia e mais as plantas pé-franco (testemunha). 6.3.4 Avaliação das características quantitativas da produção As características de produção avaliadas foram: diâmetro equatorial (mm), para classificação dos frutos em classe, de acordo com o programa brasileiro para modernização da horticultura (CQH/CEAGESP, 2003); produtividade comercial em frutos m-2 e quilogramas (kg) m-2; produtividade não comercial em kg m-2. 33 6.3.5 Avaliação das características qualitativas da produção Foram avaliadas teor de ácido ascórbico (vitamina C), licopeno, β- caroteno, acidez titulável (AT), sólidos solúveis (SS), relação sólidos solúveis/acidez titulável (“Ratio”), potencial hidrogeniônico (pH) e firmeza dos frutos. 6.3.6 Vitamina C O teor de vitamina C foi determinado pelo teor de ácido ascórbico, no qual 20 g de polpa foram homogeneizadas com 20 mL de ácido oxálico a 1% e tituladas com solução de 2,6-diclorofenol-indofenol (CARVALHO et al., 1990) e os resultados expressos em mg de ácido ascórbico por 100 g de polpa. 6.3.7 Licopeno e β-caroteno Para determinar o licopeno e o β-caroteno, foi utilizada a metodologia de Nagata & Yamashita (1992), em que a extração e reação foram feitas no escuro. A amostra do fruto de tomateiro foi macerada em nitrogênio líquido, em seguida pesou-se 1 g da amostra em um tubo falcon de 50 mL e adicionou-se a solução extratora a base de acetona absoluta (4 mL) e hexano absoluto (6 mL) e homogeneizou no “Turrax”. Depois de homogeneizado o extrato apresentou duas fases distintas e foi recolhido 4 mL da primeira fase e colocado em uma cubeta de vidro para fazer a leitura em espectrofotômetro em 663 nm (clorofila a), 645 nm (clorofila b), 505 nm (licopeno), 453 nm (β-caroteno). Clorofila a (mg/100 mL): 0,999 A663 – 0,0989 A645 Clorofila b (mg/100 mL): 0,328 A663 – 1,77 A645 Licopeno (mg/100 mL): - 0,0458 A663 + 0,204 A645 + 0,372 A505 – 0,0806 A453 β-Caroteno (mg/100 mL): 0,216 A663 – 1,22 A645 – 0,304 A505 + 0,452 A453 34 6.3.8 Firmeza A textura foi medida nos frutos inteiros utilizando-se texturomêtro Stevens LFRA Texture Analyser, com ponta de prova A 9/1000. A velocidade de penetração foi de 2,0 mm/seg a uma profundidade de 5mm. Através destes dados foi determinada a firmeza dos frutos e expressa em Newtons (N). 6.3.9 Acidez titulável (AT) A acidez titulável (AT) foi determinada de acordo com metodologia recomendada pelo Instituto Adolfo Lutz (2005), utilizando-se 2 gramas de polpa homogeneizada e diluída em 100 mL de água destilada. Em seguida foi feita a titulação com solução padronizada de NaOH 0,1N, usando como indicador o ponto de viragem da fenolftaleína. Os resultados foram expressos em g de ácido málico 100g-1 da amostra. 6.3.10 pH O pH foi determinado na polpa, utilizando medidor de pH digital (AOAC, 1992). 6.3.11 Sólidos solúveis (SS) Determinou-se o conteúdo de sólidos solúveis (SS) por leitura em refratômetro digital, modelo PR - 100 Schmidt (Haensch Co., LTD. Japão) com compensação automática de temperatura. Os conteúdos de SS foram expressos em ºBrix (AOAC, 1992). 6.3.12 Relação SS/AT (“Ratio”) Para avaliar o equilíbrio doce-ácido do fruto durante o amadurecimento, foi calculada a relação entre sólidos solúveis e a acidez titulável (SS/AT = “Ratio”). Os resultados foram expressos em número puro, com duas casas decimais. 35 6.3.13 Análise estatística dos experimentos 1, 2 e 3 A análise estatística dos experimentos foi realizada por meio da análise de variância (teste F) a 5% de probabilidade (Tabela 3). O teste de Tukey a 5% de probabilidade foi utilizado para comparar as médias (Tabela 3). 36 T ab el a 3. E sq ue m a da a ná lis e de v ar iâ nc ia d os e xp er im en to s. C au sa d e va ri aç ão E X P 1 G L C . d e va ri aç ão E X P 2. 1 G L C . d e va ri aç ão E X P 2. 2 G L C . d e va ri aç ão E X P 2. 3 G L C . d e va ri aç ão E X P 3 G L M ét od os e nx er tia (F 1) 3 Tr at am en to s 3 Tr at am en to s 3 Lo ca l d a pl an ta (F 1) 9 B lo co s 3 D ia s a pó s e nx er tia (F 2) 4 R es íd uo 36 R es íd uo 16 D ia s a pó s i no cu la çã o (F 2) 5 Tr at am en to s 3 In te ra çã o F1 xF 2 12 To ta l 39 To ta l 19 In te ra çã o F1 xF 2 45 R es íd uo 9 Tr at am en to s 19 Tr at am en to s 59 To ta l 15 R es íd uo 60 R es íd uo 18 0 To ta l 79 To ta l 23 9 EX P 1 e EX P 3: E xp er im en to s 1 e 3 . EX P 2; E X P 2. 1 e EX P 2. 2: In ci dê nc ia d a m ur ch a ba ct er ia na ; t ro ca s g as os as ; a tiv id ad e da s e nz im as e te or d e fe nó is n o se gu nd o ex pe rim en to . G L: G ra u de li be rd ad e 37 7 RESULTADOS E DISCUSSÃO 7.1 EXPERIMENTO 1: Avaliação do estresse causado pela enxertia em tomateiro através da variação da atividade enzimática e teor de fenóis 7.1.1 Cicatrização do local da enxertia das mudas em função do método de enxertia O método de enxertia Fenda garfagem apresentou maior porcentagem de cicatrização no local da enxertia (95,8%). Porém o método Encostia obteve menor porcentagem de cicatrização (78,5%). O método Contato em bisel obteve porcentagem de cicatrização do local de enxertia de 89,6% (Figura 4). O método Fenda garfagem é bastante utilizado em culturas da família botânica solanácea, como por exemplo, tomateiro e pimenteiro. Os viveiristas e alguns produtores têm adotado principalmente o método Contato em bisel, o qual facilita principalmente a rapidez na realização da enxertia. Já o método de Encostia é raramente utilizado em solanáceas, o qual não seria recomendado para o tomateiro de acordo com os resultados deste estudo, pois apresentou a menor porcentagem de cicatrização no local de enxertia (Figura 4). 38 Figura 4. Porcentagem de cicatrização do local da enxertia em função dos métodos de enxertia em tomateiro. UNESP-FCA, 2010. 7.1.2 Atividade das enzimas SOD, CAT, POD, teor de Fenóis e PPO em função dos métodos de enxertia e do dia após a enxertia Houve interação do método de enxertia com o dia após a enxertia (DAE) na atividade das enzimas SOD, POD, teor de fenóis e PPO (Tabelas 4, 6, 7 e 8). Por outro lado, não ocorreu interação do método e do dia após enxertia na atividade da enzima CAT, porém a atividade dessa enzima variou em função do dia após a enxertia (Tabela 5). A maior atividade da SOD observada (1,22 U g-1 proteína) ocorreu nos métodos de enxertia Contato em bisel e Fenda garfagem no terceiro DAE (Tabela 4). Esta maior atividade pode ter sido em função do aumento do radical superóxido (O-2) que provavelmente deve ter sido formado em resposta ao estresse causado pelo corte e cicatrização do local da enxertia. A SOD é responsável pela a dismutação do O2 - em H2O2 (GRATÃO et al., 2005). Após o pico da atividade observado no terceiro dia, notou-se uma tendência de diminuição até os 12 DAE, época em que as plantas já podem ir para o transplante. A menor atividade da SOD (1,16 U g-1 proteína) ocorreu em função da interação entre os métodos de enxertia e aos 9 DAE (Tabela 4). 39 Tabela 4. Atividade da enzima SOD (U g-1 proteína) em função do método de enxertia e do dia após enxertia. UNESP-FCA, 2010. Dias após a enxertia (DAE) Métodos enxertia 0 3 6 9 12 Contato em bisel 1,20 aB 1,22 aA 1,19 aB 1,16 aC 1,18 aB Fenda garfagem 1,20 aB 1,22 aA 1,17 bC 1,16 aC 1,18 aBC Encostia 1,20 aA 1,17 bB 1,17 bB 1,16 aB 1,18 aB Enxerto pé-franco 1,19 aA 1,16 bBC 1,17 abBC 1,16 aC 1,18 aAB CV = 0,87 % F = 7,90* * Teste F significativo a 5 % de probabilidade. Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas. As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade. Como não ocorreu interação entre os fatores métodos de enxertia e dias após a enxertia para a atividade da enzima CAT, os resultados desta enzima foram apresentados por fator (Tabela 5) e não com interação como as demais. Não houve diferença na atividade da CAT entre os métodos de enxertia (Tabela 5), porém o DAE influenciou sobre a atividade da enzima. A maior atividade da CAT foi obtida aos 12 DAE, mas esta atividade não diferiu estatisticamente da ocorrida no dia da enxertia (Tabela 5). Esta maior atividade é possivelmente devido ao aumento de espécies radicalares, como H2O2, gerado em resposta a enxertia, ou ainda, pelo H2O2 resultante da reação da SOD. 40 Tabela 5. Atividade da enzima CAT (μmol H2O2 min-1mg-1 proteína) em função do método de enxertia em tomateiro. UNESP-FCA, 2010. Fatores Médias Métodos enxertia CAT1 Contato em bisel 2,0 x 10-09 a Fenda garfagem 1,8 x 10-09 a Encostia 1,8 x 10-09 a Enxerto pé-franco 2,0 x 10-09 a Dias após a enxertia (DAE) 0 2,2 x 10-09 a 3 1,8 x 10-09 b 6 1,6 x 10-09 b 9 1,6 x 10-09 b 12 2,3 x 10-09 a CV (%) = 13,97 F = 7,59* 1 Dados originais transformados em 1/√X * Teste F significativo a 5 % de probabilidade. As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade. Os dias após a enxertia influenciaram a atividade da POD ocorrida nos métodos Contato em bisel e Fenda garfagem (Tabela 6). Esta atividade diminuiu aos 3 DAE, quando então, ocorre aumento gradativo da atividade da peroxidase (Tabela 6). Este efeito pode ser atribuído ao enxerto ser totalmente desligado do sistema radicular (Figura 5) e no método Encostia, procedimento o qual é popularmente conhecido como desmame, este desligamento só foi realizado aos 12 DAE (Figura 6), e não foi observado diferenças entre as atividades enzimáticas. A maior atividade da POD (0,15 μmol H2O2 min-1 mg-1 proteína) foi observada na combinação Contato em bisel, Fenda garfagem, aos 12 DAE (Tabela 6). Entretanto, ao se comparar os valores obtidos nesses tratamentos com os demais (Encostia e Enxerto pé-franco), não foi observado diferença estatística neste dia (Tabela 6). 41 Tabela 6. Atividade da enzima POD (μmol H2O2 decomposto min-1 mg-1 proteína) em função do método de enxertia e do dia após enxertia. UNESP-FCA, 2010. Dias após a enxertia (DAE) Métodos enxertia 0 3 6 9 12 Contato em bisel 0,13 aAB 0,11 bB 0,13 aAB 0,14 aA 0,15 aA Fenda garfagem 0,13 aAB 0,11 bC 0,12 aBC 0,14 aAB 0,15 aA Encostia 0,14 aA 0,13 aA 0,13 aA 0,12 aA 0,14 aA Enxerto pé-franco 0,14 aA 0,14 aA 0,13 aA 0,12 aA 0,14 aA CV = 7,74 % F = 3,03* * Teste F significativo a 5 % de probabilidade. Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas. As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade. Figura 5. Planta de tomateiro enxertada pelo método Fenda garfagem. Foto: Edvar Silva, 2010. Figura 6. Planta de tomateiro enxertada pelo método Encostia. Foto: Edvar Silva, 2010. 42 A maior produção de fenóis (0,70 mg g-1 massa fresca) ocorreu nos tratamentos Contato em bisel e Fenda gafargem, ambos em interação com o nono DAE e nos tratamentos Fenda garfagem e Encostia, ambos em interação com os 12 DAE (Tabela 7). Esta maior produção de fenóis nestes tratamentos coincide com elevadas atividades da PPO nestas mesmas interações de tratamentos (Tabela 8). É importante ressaltar que a enzima PPO tem como substrato os fenóis, que se formam geralmente, em condições de estresse como, infecções, ferimentos, radiação ultravioleta, dentre outros (ANGELO & JORGE, 2007). Isto reforça a ocorrência deste maior teor de fenóis nas plantas enxertadas que sofreram maior estresse, devido ao corte para se fazer a enxertia e o processo da cicatrização do local da enxertia. A menor produção do teor de fenóis (0,62 mg g-1 massa fresca) foi observada na testemunha em interação com o dia da enxertia (Tabela 7), possivelmente porque as plantas deste tratamentos não sofreram corte para se fazer a enxertia, condição pela qual pode ter induzido nos demais tratamentos o aumento no teor de fenóis. Esta menor produção de fenóis na testemunha no dia da enxertia coincide com baixa atividade da PPO observada (tabela 8). Tabela 7. Teor de fenóis (mg g-1 massa fresca) em função do método de enxertia e do dia após enxertia. UNESP-FCA, 2010. Dias após a enxertia (DAE) Métodos enxertia 0 3 6 9 12 Contato em bisel 0,66 aAB 0,68 aAB 0,67 aAB 0,70 aA 0,63 bB Fenda garfagem 0,65 aB 0,66 aAB 0,65 aB 0,70 aA 0,70 aA Encostia 0,64 aB 0,65 aAB 0,64 aB 0,63 bB 0,70 aA Enxerto pé-franco 0,62 aB 0,69 aA 0,64 aB 0,64 bB 0,63 bB CV = 3,75 % F = 3,31* * Teste F significativo a 5 % de probabilidade. Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas. As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade. 43 Assim como na atividade da enzima POD e teor de Fenóis, a interação dos fatores métodos e dias após a enxertia também influenciaram sobre a atividade da enzima PPO (Tabela 8). Todos os métodos de enxertia apresentaram as maiores atividades da PPO aos 12 DAE (Tabela 8), sendo que neste dia, o método Fenda garfagem e Encostia apresentaram as maiores atividades da PPO (Tabela 8). De acordo com o desdobramento de DAE dentro dos métodos de enxertia, observou-se que a atividade da PPO diminuiu no terceiro DAE e aumentou logo em seguida nas plantas enxertadas pelos métodos Contato em bisel e Fenda garfagem (Tabela 8). Já as plantas enxertadas por Encostia e a testemunha apresentaram variação na atividade da PPO, sendo que a menor atividade das plantas enxertadas por Encostia foi no terceiro DAE e a da testemunha no sexto DAE (Tabela 8). No nono DAE, as mudas submetidas aos métodos de enxertia apresentaram maior atividade da PPO que a testemunha (Enxerto pé-franco), porém ao comparar Fenda garfagem e Encostia, não pode ser observada diferença (Tabela 8). A menor atividade da PPO ocorreu no terceiro DAE nas plantas enxertadas por Fenda garfagem, que não diferiram das plantas do método Contato em bisel (Tabela 8). A variação da atividade da PPO na testemunha pode ter sido devido ao calor dentro da câmara úmida, já que este tratamento não sofreu corte, pois o mesmo não era enxertado. 44 Tabela 8. Atividade da enzima PPO (µmol catecol oxidado min-1 µg-1 proteína) em função do método de enxertia e do dia após enxertia. UNESP-FCA, 2010. Dias após a enxertia (DAE) Métodos enxertia 0 3 6 9 12 Contato em bisel 128,08 aB 97,02 bcD 100,51 aD 109,70 aC 145,15 aA Fenda garfagem 129,09 aB 96,19 cD 105,58 aC 108,36 abC 149,96 aA Encostia 128,98 aB 103,67 abC 106,24 aC 104,43 abC 149,52 aA Enxerto pé-franco 127,08 aB 105,71 aC 99,50 aC 102,50 bC 145,97 aA CV = 3,24 % F = 3,12* * Teste F significativo a 5 % de probabilidade. Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas. As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade. Houve variações tanto da atividade das enzimas SOD, POD, PPO quanto do teor de fenóis em função do método de enxertia utilizado e do tempo após a realização da enxertia. Em boa parte destas variações foram observadas diferenças estatísticas significativas. As plantas enxertadas apresentaram maiores atividades das enzimas SOD, POD, PPO e teores de fenóis que as pé-franco (testemunha), sendo que as plantas enxertadas por Contato em bisel e Fenda garfagem se destacaram com valores maiores, principalmente na atividade das enzimas POD e PPO. As variações nas atividades da CAT e POD em função do tempo em plantas enxertadas de tomateiro também foram observadas por Fernandez-García et al. (2004), que constataram aumento na atividade de POD ao longo do período após a enxertia (4, 8 e 15 DAE). Porém, estes mesmos autores perceberam que neste período a atividade da CAT aumenta até os 8 DAE e diminui aos 15 DAE. Foram observadas variações parecidas na atividade da POD entre os 3 e 12 DAE nas plantas enxertadas por Contato em bisel e Fenda garfagem (Tabela 6), entretanto, não se observou o mesmo para atividade da CAT (Tabela 5). No período após a enxertia, a planta passa por estresse, que é o processo de cicatrização do local de enxertia, que exige gasto energético. Em situação de estresse, o metabolismo destas plantas sofre alterações e as enzimas também tem variações em 45 suas atividades fazendo com que a planta se recupere desse estresse com menor gasto energético. As enzimas POD e PPO foram as que melhor responderam ao estresse causado pela enxertia. Em tomateiro, a POD é uma das enzimas envolvidas no último passo na lignificação (NICHOLSON & HAMMERSCHMIDT, 1992), em resposta ocorrida logo depois do estresse causado, seja por ferimentos ou pelo ataque de patógenos. Com relação a PPO existem relatos da participação desta enzima na defesa da planta contra patógenos (SILVA et al., 2007; VANITHA, et al., 2009), porém não foi encontrado estudo relacionando a atividade desta enzima com estresse causado pela enxertia. Baseado no fato que esta enzima catalisa a oxidação de compostos fenólicos próximo ao local estressado, onde há degradação celular (THIPYAPONG et al., 2007), e de acordo com os resultados deste estudo da técnica da enxertia e enzimas, podemos afirmar que além da POD, há também participação da PPO na defesa ao estresse causado pela enxertia. 7.2 EXPERIMENTO 2: Incidência da murcha bacteriana do tomateiro, trocas gasosas, atividade de enzimas antioxidantes e teor de fenóis em plantas de tomateiro enxertadas e inoculadas com R. solanacearum 7.2.1 Incidência da murcha bacteriana em plantas de tomateiro enxertadas e pé- franco de tomateiro Não houve diferença da porcentagem de folhas murchas aos 0 e 5 dias após a inoculação (DAI) (Tabela 9). Nestes dias as plantas ainda não apresentavam sintomas da doença, porém aos 10 e 15 DAI foi observado diferença entre os tratamentos e elevada incidência da doença. As plantas enxertadas e o porta-enxerto pé-franco inoculados com R. solanacearum apresentaram menor porcentagem de folhas murchas, tanto aos 10 DAI, quanto aos 15 DAI (Tabela 9). Por outro lado, o enxerto pé-franco inoculado com R. solanacearum apresentou maior porcentagem de folhas murchas (Tabela 9) e, portanto, considerado suscetível. 46 O porta-enxerto pé-franco foi considerado resistente, pois aos 15 DAI não diferiu do enxerto não-inoculado (testemunha) quanto a porcentagem de folhas murchas (Tabela 9). Apesar das plantas enxertadas inoculadas diferirem do enxerto não-inoculado, as mesmas não diferiram do porta-enxerto pé-franco inoculado e apresentaram baixa incidência da murcha bacteriana, principalmente quando comparadas ao enxerto inoculado (Tabela 9). Isto caracteriza as plantas enxertadas como moderadamente resistentes, e dependendo da infestação da área por R. solanacearum, a enxertia pode ser uma alternativa de controle. Tabela 9. Porcentagem de folhas murchas em tomateiro ‘Pizzadoro’ pé-franco e enxertado em porta-enxerto ‘Guardião’, inoculado e não-inoculado com R. solanacearum. UNESP-FCA, Botucatu, SP, 2011. Tratamentos 0 DAI 5 DAI 10 DAI1 15 DAI Plantas enxertadas inoculadas 0,00 a 0,00 a 22,78 b 29,23 b Enxerto pé-franco inoculado 0,00 a 0,00 a 80,57 a 100,00 a Porta-enxerto pé-franco inoculado 0,00 a 0,00 a 15,41 b 14,91 bc Enxerto pé-franco não-inoculado 0,00 a 0,00 a 0,00 c 0,00 c F ns ns 26,78* 101,25* CV (%) 0,0 0,0 58,7 38,6 * ou ns Teste F significativo ou não significativo a 5 % de probabilidade Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. DAI: Dias após a inoculação. 1 Dados originais transformados para √X A resistência do porta-enxerto ‘Guardião’ foi reconfirmada, assim como o descrito no catalago da empresa Takii do Brasil. A moderada resistência das plantas enxertadas e a suscetibilidade do enxerto ‘Pizzadoro’ pode ser confirmada com a massa fresca e seca das plantas aos 15 DAI (Tabela 10). 47 Tabela 10. Massa fresca (g) e massa seca (g) em tomateiro ‘Pizzadoro’ pé-franco e enxertado em porta-enxerto ‘Guardião’, inoculado e não-inoculado com R. solanacearum, aos 15 DAI. UNESP-FCA, Botucatu, SP, 2011. Tratamentos Massa fresca1 Massa seca1 Plantas enxertadas inoculadas 115,87 a 12,76 ab Enxerto pé-franco inoculado 20,28 b 1,85 c Porta-enxerto pé-franco inoculado 123,99 a 10,53 b Enxerto pé-franco não-inoculado 141,93 a 15,16 a F 52,98* 40,35* CV (%) 15,9 19,7 * ou ns Teste F significativo ou não significativo a 5 % de probabilidade Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. DAI: Dias após a inoculação. 1 Dados originais transformados para √X A enxertia estudada neste trabalho ocasionou menor porcentagem de folhas murchas que os indutores de resistência acibenzolar-S-metil, extratos aquosos de Agaricus blazei e Lentinula edodes testados por Silva et al. (2007). Isto reforça a enxertia como uma boa alternativa de controle para a murcha bacteriana, p