UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU MODULAÇÃO DA MICROBIOTA E INTESTINAL DE PERUS DE CORTE DESAFIADOS COM Salmonella HEIDELBERG E SUBMETIDOS A DIFERENTES PROGRAMAS DE CONTROLE TARCÍSIO MACEDO SILVA Botucatu-SP 2017 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU MODULAÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL DE PERUS DE CORTE DESAFIADOS COM Salmonella HEIDELBERG E SUBMETIDOS A DIFERENTES PROGRAMAS DE CONTROLE TARCÍSIO MACEDO SILVA Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Mestre. Orientador: Prof. Dr. Raphael Lucio Andreatti Filho Coorientadora: Dra. Elisane Lenita Milbradt Botucatu-SP 2017 iii FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651 Silva, Tarcísio Macedo. Modulação da microbiota intestinal de perus de corte desafiados com Salmonella Heidelberg e submetidos a diferentes programas de controle / Tarcísio Macedo Silva. - Botucatu, 2017 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: Raphael Lucio Andreatti Filho Coorientador: Elisane Lenita Milbradt Capes: 50503014 1. Ácidos orgânicos. 2. Probióticos. 3. Salmonella. 4. Microbiota. 5. Peru (Ave). 6. Morfometria. Palavras-chave: Àcido orgânico; Microbiota intestinal; Peru; Probiótico; Salmonella; Produto de exclusão competitiva. iii Tarcisio Macedo Silva MODULAÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL DE PERUS DE CORTE DESAFIADOS COM Salmonella HEIDELBERG E SUBMETIDOS A DIFERENTES PROGRAMAS DE CONTROLE COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Dr. Raphael Lucio Andreatti Filho Presidente e Orientador Departamento de Clínica Veterinária FMVZ – UNESP – Botucatu – SP Prof. Dr. Adriano Sakai Okamoto Membro Departamento de de Clínica Veterinária FMVZ – UNESP – Botucatu – SP Prof. Dra. Terezinha Knölb Membro Departamento de Patologia (VPT) FMVZ/USP - São Paulo - SP. 14 de outubro de 2017. iv Dedico Aos meus pais Terezinha e Rufino que são o alicerce de todas as minhas conquistas, mesmo não me apoiando nas minhas decisões, alguns ensinamentos levo para a vida. v AGRADECIMENTOS À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa de estudo e suporte para financiamento do projeto de pesquisa (Processos: 2015/16428-5; 2015/18350-3). Ao Professor e Orientador Dr. Raphael Lucio Andreatti Filho, pela orientação e pela oportunidade concedida para realização do curso e por contribuir com o meu desenvolvimento pessoal e profissional. À Dra Elisane Lenita Milbradt, pela co-orientação, pelos ensinamentos, paciência, apoio e amizade. Te levarei para minha vida. À Priscila Aparecida Boff, agradeço a você pelo incentivo e pela essencial ajuda durante o desenvolver do curso. A vida nos proporcionou caminhos diferentes, hoje e sempre a minha eterna gratidão. Ao Prof Dr. Vasco Azevedo e ao Dr. Bruno Campos pelo apoio na importação do material genético do microrganismo estudado. Aos professores do serviço de Patologia e Ornitopatologia da faculdade de Medicina Veterinária FMVZ-UNESP-Botucatu, Adriano Sakai Okamoto, Júlio Lopes Sequeira, Noeme Souza Rocha, Rennée Laufer Amorim e Alessandre Hataka, por toda a colaboração, pela disposição em sempre ajudar no que fosse possível, conselheiros em decisões importantes da vida, À Dra Barbara Cristina Fernandes e ao Diogo Joaquim pela imprescindível ajuda na condução dos experimentos. Aos meus amigos, Igor Vellano, Maria Claudia Cordiolli, Isamery Machado, Priscila Kobayashi, Carlos Eduardo, Diogo Zanoni, Caio Gimenez, Talia Missen, Ana Claúdia Albuquerque e professor Daniel pelo apoio, pela companhia, pelos conselhos e pelas caronas, grandes amigos, minha eterna gratidão. vi Aos companheiros Felipe Onofre, Carlos Augusto Alves, Edgleison e Ciro Possi pela convivência e irmandade durante os anos do mestrado. À minha namorada Voniclesse Melo pelo apoio na fase final dessa caminhada. Aos meus grandes amigos Cikele Oliveira e Édipo Dantas pelo apoio em momentos difíceis dessa caminhada. À Maria Valéria Dalanezi e ao José Dalanezi pela ajuda no processamento do material histológico. Aos funcionários Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia FMVZ-UNESP- Botucatu, Carlos Godoy, Amaury Raul, Caudinei Rodrigues e dona Deise por toda colaboração e companheirismo. À empresa Brasil Foods pela doação das aves experimentais. À Família Boff, eterna gratidão e respeito pelo alicerce e por me incentivar a seguir em frente na minha realização profissional. A toda minha família pelo amor incondicional. vii LISTA DE TABELAS CAPÍTULO 2 Página Tabela 1. Colonização do inglúvio e ceco por Salmonella Heidelberg em perus de corte desafiados no terceiro e no décimo dia de vida...............................................54 Tabela 2. Incidência (isolamento) de Salmonella Heidelberg no inglúvio e no ceco de perus de corte desafiados no terceiro e no décimo dia de vida com 0,5 mL de 107 UFC de SH/mL, e 0,5 mL de 105 UFC de SH/mL respectivamente......................................................................................................55 Tabela 3. Incidência da excreção fecal de Salmonella Heidelberg durante o período experimental (0-35 dias) em perus de corte desafiados no terceiro e no décimo dia de vida com 0,5 mL de 107 UFC de SH/mL, e 0,5 mL de 105 UFC de SH/mL respectivamente......................................................................................................56 Tabela 4. Efeito de diferentes aditivos na morfologia intestinal de perus de corte desafiados no terceiro e no décimo dia de vida com Salmonella Heidelberg..............................................................................................................57 Tabela 5. Quantidade relativa de Faecalibacterium prausnitzii no conteúdo cecal de perus de corte desafiados no terceiro e no décimo dia de vida com Salmonella Heidelberg e submetidos ao tratamento com diferentes aditivos...................................................................................................................58 viii SUMÁRIO RESUMO ................................................................................................................. x ABSTRACT............................................................................................................xi CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS .................................................... 1 Introdução ............................................................................................................ 2 Revisão de Literatura ............................................................................................ 4 Microbiota intestinal de aves .......................................................................... 4 Salmoneloses aviárias e saúde pública ........................................................... 6 Dieta e a microbiota intestinal de aves.............................................................9 Faecalibacterium prausnitzii e microbiota intestinal....................................11 Exclusão Competitiva ................................................................................... 12 Probióticos .................................................................................................... 14 Ácidos Orgânicos .......................................................................................... 15 Objetivos ............................................................................................................ 18 Referências Bibliográficas..................................................................................19 Proposta de Estudo..............................................................................................35 CAPITULO 2 MODULAÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL DE PERUS DE CORTE DESAFIADOS COM Salmonella HEIDELBERG E SUBMETIDOS A DIFERENTES PROGRAMAS DE CONTROLE ................................................ 36 RESUMO ........................................................................................................... 38 Introdução .......................................................................................................... 39 Material e Métodos ............................................................................................ 40 Declaração de Ética no uso de animais ......................................................... 41 Amostras bacterianas e condições de cultivo ............................................... 41 Aves, instalações e manejo ............................................................................ 42 Dieta .............................................................................................................. 43 ix Aditivos .......................................................................................................... 43 Delineamento Experimental .......................................................................... 44 Quantificação de Salmonella Heidelberg ..................................................... 44 Análise de suabe cloacal para determinação da incidência de Salmonella Heidelberg ............................................................................................................. 44 Análise histológica dos vilos e profundidade de cripta ............. ....................45 Quantificação relativa do F. prausnitzii..........................................................45 Tempo-Real qPCR.........................................................................................46 Análise Estatística ......................................................................................... 46 Resultados...........................................................................................................47 Discussão ............................................................................................................ 48 Conclusão ............................................................................................................ 53 Referências Bibliográficas .................................................................................. 60 ANEXO x RESUMO - SILVA, T.M. Modulação da microbiota intestinal de perus de corte desafiados com Salmonella Heidelberg e submetidos a diferentes programas de controle. Botucatu, 2017. Dissertação 89p (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. O presente estudo avaliou uso de ácidos orgânicos (AOs), probiótico e produto de exclusão competitiva (EC) administrados continuadamente, via ração, no controle de Salmonella Heidelberg (SH) e a ação sobre a microbiota e morfometria intestinal. Cento e setenta perus de corte fêmeas foram distribuídas, aleatoriamente, em cinco tratamentos com quatro repetições de oito aves cada. No terceiro e no décimo dia de vida, os animais foram submetidos ao desafio oral de SH. No sétimo, 19º e 35º de vida as aves foram eutanasiadas (n=10 por tratamento) e colhido amostras de segmentos do inglúvio, duodeno, jejuno, íleo e ceco para quantificação de SH, quantificação relativa do microrganismo Faecalibacterium prausnitzii e análise morfométrica. No decorrer do período experimental foram realizadas colheitas de suabes cloacais para pesquisa de SH. A administração do probiótico e produto de EC foi capaz de reduzir a incidência e a colonização de SH no inglúvio. Nos cecos os tratamentos reduziram a colonização de SH somente aos 19 dias de idade. Somente a dieta suplementada com AOs influenciou positivamente na quantidade de F. prausnitizii no ceco (19 e 35 dias) e não houve correlação entre a quantidade relativa desse microrganismo e o número de UFCs de SH. A excreção fecal de SH, foi influenciada pelos tratamentos a partir dos 26 dias de vida das aves, aos 34 dias todos os tratamentos reduziram a excreção fecal. A morfometria intestinal foi influenciada pelos tratamentos somente aos sete dias de vida, onde os animais que receberam AOs apresentaram maiores alturas de vilosidades de jejuno quando comparado com o grupo controle positivo. A administração dos aditivos via ração demonstrou eficácia no controle e na persistência da infecção por SH. No entanto, o uso de AOs foi mais eficaz para modular a microbiota cecal, provando que a composição da dieta pode modular populações de bactérias benéficas, mas tais microrganismos podem não estar correlacionadas com a redução da colonização cecal por SH. Palavras chave: ácido orgânico, microbiota intestinal, peru, probiótico, produto de exclusão competitiva, Salmonella. xi ABSTRACT - SILVA, T.M. Modulation of intestinal microbiota of commercial turkeys challenged with Salmonella Heidelberg and submitted to different control programs. Botucatu, 2017. Dissertation 89p (Master) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. The present study evaluated the use of organic acids (AOs), probiotic and competitive exclusion (CE) product administered continuously in the feed on the control Salmonella Heidelberg (SH) and action microbiota and morphometry intestinal. One hundred and seventy poults females were randomly distributed in five treatments with four replicates of eight birds each. In the 3rd and 10th day of life, the animals were submitted to the challenge with SH. In the 7th, 19th and 35th of life the birds were euthanized (n = 10) and samples of the crop, duodenum, jejunum, ileum and caeca were removed to quantification of SH, quantification relative of the Faecalibacterium prausnitzii and morphometric analysis. During the experimental period were perfomerd clocal swabs for SH research. The administration of probiotic and CE product was able to reduce the incidence and colonization of SH in the crop. In the caecum the treatments reduced SH only 19 days of age. Only the diet supplemented with AOs influenced positively on amount of F. prausnitizii in the cecum (19 and 35 days) and there was no correlation between the amount on the microorganism and the number of UFCs of SH. Fecal excretion of SH, was influenced by the treatments from 26 days of life, at 34 days all treatments reduced faecal excretion. The intestinal morphometry was influenced by the treatments only to seven days of age, where the animals that received AOs had higher jejunal villus heights of villi when compared with the positive control. The feed additives administration demonstrated effectiveness in controlling and in the persistence of the infection by SH. However, the use of AOs was most effective to modulate the cecal microbiota, proving that the composition of the diet can modulate populations of beneficial bacteria, but such microorganisms may not be correlated with the reduction of the SH. Key words: competitive exclusion product, intestinal microbiota, organic acid, probiotic, turkey, Salmonella. http://www.bv.fapesp.br/en/bolsas/161533/modulation-of-intestinal-microbiota-of-commercial-turkeys-challenged-with-salmonella-heidelberg-and/ http://www.bv.fapesp.br/en/bolsas/161533/modulation-of-intestinal-microbiota-of-commercial-turkeys-challenged-with-salmonella-heidelberg-and/ http://www.bv.fapesp.br/en/bolsas/161533/modulation-of-intestinal-microbiota-of-commercial-turkeys-challenged-with-salmonella-heidelberg-and/ CAPÍTULO 1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS 2 INTRODUÇÃO Em constante evolução e expansão, a avicultura industrial é um importante segmento do agronegócio brasileiro. Decorrente a expressiva produtividade desse setor, o Brasil ocupa lugar de destaque no cenário mundial em termos de produção de proteína animal. Nesse contexto, a criação comercial de perus vem crescendo em ritmo considerável. Em 2016, foram produzidas 367.994 mil toneladas de carne da espécie, apontando um crescimento de 12,54% em relação a 2015. Do total produzido, 38% foram destinados à exportação, sendo a União Europeia (UE) o principal importador de cortes e industrializados, oriundos da criação (ABPA, 2017). O crescimento dessa atividade é fruto de grandes avanços e melhorias tecnológicas em toda cadeia produtiva (DECKER e GOMES, 2016), mas assume- se que a saúde animal constitua o fator de maior importância na criação comercial de perus (DANZEISEN et al., 2013). O trato gastrointestinal (TGI) das aves abriga uma comunidade microbiana complexa e suas interações possuem uma relação simbiótica crítica com a saúde da espécie (DANZEISEN et al., 2013; WEI et al., 2013), podendo modular o estado nutricional, fisiológico, imunológico, o desenvolvimento do animal e a proteção contra patógenos (BRISBIN et al., 2008; ZHAO et al., 2012; PAN e YU, 2014). Cada vez mais, a importância do TGI e da microbiota intestinal para a melhoria da eficiência produtiva desses animais tem sido reconhecida, sendo alvo de interesse para a saúde e nutrição animal, segurança do alimento e saúde pública (OAKLEY et al., 2014). Entre os fatores determinantes para a produção avícola moderna, estão as condições de criação, dietas rigorosamente controladas, vacinas, drogas anticoccidianas, fungicidas e antimicrobianos promotores de crescimento (APC) e terapêuticos (SCUPHAM et al., 2008). Esses mesmos fatores que tornam esse segmento economicamente viável, trazem consigo novos desafios. Um dos desafios amplamente questionável, implica no uso de antimicrobianos em concentrações subterapêuticas, objetivando melhorias na saúde e bem-estar animal, bem como a promoção de resultados significativos no desempenho e na melhoria dos índices zootécnicos, maximizando a produção por meio da modulação da microbiota 3 intestinal ou supressão da resposta imune inata do hospedeiro (MOORE et al., 1946; NIEWOLD, 2007). Evidências apontam que a microbiota intestinal aviária pode servir como reservatório de genes de resistência aos antimicrobianos, bem como disseminar essa resistência à agentes patogênicos zoonóticos, como Salmonella spp. (DIBNER e RICHARDS, 2005; SILVA et al., 2016; CARD et al., 2017). Devido à emergência de bactérias resistentes aos antibióticos, as quais podem representar riscos para a saúde pública, preocupações sobre o uso de APC, na alimentação animal, têm aumentado (AARESTRUP et al., 2008). Essa polêmica questão da resistência bacteriana em humanos, fenômeno, em partes (LAXMINARAYAN et al., 2015), atribuído ao uso de APC, levou a UE, em 2006, e alguns países asiáticos a restringirem o uso desses na alimentação animal (EUROPEAN COMMISSION, 2003; LILLEHOJ e LEE, 2012). Em razão disso, países exportadores de produtos de origem animal, para a UE, baniram o uso de APC na alimentação (EUROPEAN COMMISSION, 2003a). Baseando-se nos novos conceitos de segurança do alimento, cresce a urgência por alternativas ao uso dos APC, as quais sejam capazes de estimular o desenvolvimento de microrganismos benéficos, controlar e eliminar agentes patogênicos, garantindo benefícios para a saúde animal. Outras aplicações incluem o máximo desempenho animal e redução da exposição humana aos agentes patogênicos transmitidos pelos alimentos sem comprometer a qualidade do produto final. Desta forma, diversas pesquisas vêm sendo desenvolvidas. Uma das estratégias consiste na utilização de aditivos alternativos aos APC na alimentação animal. Dentre outros aditivos utilizados na nutrição de perus, cita- se o uso de probióticos, produtos de exclusão competitiva (EC) e ácidos orgânicos AOs), os quais consistem em abordagens previamente reportadas com potencial para controlar Salmonella spp. (MENCONI et al., 2011; MILBRADT et al., 2014a; FORKUS et al., 2017). No entanto, a compreensão prática da microbiota intestinal e suas respectivas interações microbianas para a implementação de estratégias alimentares efetivas, objetivando melhorar a saúde intestinal de perus comerciais frente às condições de dieta, idade, ambiente, antimicrobianos e desafios de doenças ainda se faz necessária. 4 REVISÃO DE LITERATURA Microbiota intestinal de aves As diferentes secções que compõem o TGI de aves exercem funções na digestão alimentar, absorção de nutrientes, saúde intestinal e na saúde e bem-estar animal (GONG et al., 2007). Por sua vez, tais segmentos são colonizados por uma vasta e complexa microbiota (DANZEISEN et al., 2013; WEI et al., 2013; OAKLEY et al., 2014; PAN e YU, 2014; WEI et al., 2016), predominantemente composta por bactérias (GABRIEL et al., 2006), podendo, inclusive, abrigar microrganismos patogênicos (AMIT-ROMACH et al., 2004). Em condições normais, a microbiota intestinal fornece benefícios ao hospedeiro, além de conferir proteção contra patógenos. Ela é responsável por modular o desenvolvimento epitelial intestinal e também pela funcionalidade metabólica direta ou indireta de outros sistemas orgânicos (GAGGÌA et al., 2010; PAN e YU, 2014). Diversos fatores determinam a homeostase e a composição microbiana presente no TGI, dentre outros, citam-se: agentes infecciosos (bactérias, vírus, parasitas), toxinas, idade, ambiente, características anatômicas e morfológicas do TGI, pH, tempo de trânsito intestinal e as características químicas e físicas da dieta. Esses fatores explicam as variações encontradas na composição microbiana intestinal e no desempenho de aves submetidas a diferentes condições de criação (REHMAN et al., 2007; YEGANI e KORVER, 2008). Assim como em outros vertebrados, a colonização microbiana no TGI de aves varia entre 108 e 1011 células/g de digesta presente no intestino delgado e nos cecos, respectivamente. Essa densidade permanece relativamente estável durante os primeiros 30 dias de vida (BARNES, 1972b; APAJALAHTI et al., 2004), tornando-se mais diversificada e uniforme com o aumento da idade do animal (LU et al., 2003; PEDROSO et al., 2016). Segundo Stanley et al. (2013), essa colonização parece ter início imediatamente após a eclosão, porém outros autores lançam a hipótese de que a colonização inicia-se com a formação do embrião, por transmissão vertical, pela ingestão do líquido amniótico e internalização do saco da gema (PEDROSO e LEE, 2015). 5 Em aves, o inglúvio e os cecos constituem os principais locais de atividade bacteriana, e, em menor grau, o intestino delgado (GABRIEL et al., 2006). De modo geral, ocorre um aumento na diversidade e na complexidade bacteriana do TGI superior para secções mais distais (GONG et al., 2007; REHMAN et al., 2007). No intestino delgado, tem-se a presença de bactérias Gram-positivas anaeróbicas facultativas, enquanto que, nos cecos, há o predomínio de bactérias estritamente anaeróbicas (BARNES et al., 1972a). Tradicionalmente, essa composição foi estudada baseando-se em técnicas de cultivo clássicas (BARNES, 1979). Diante das limitações dessas metodologias, bem como das condições estritas de crescimento, parte considerável dos microrganismos permaneceu desconhecida e inexplorada. Com os avanços no campo da metagenômica, análises baseadas no 16S rRNA gene, utilizando tecnologias de sequenciamento de alto rendimento e última geração tem-se fornecido novos estudos, mais detalhados, da microbiota intestinal e das respectivas interações microbianas ocorridas no TGI (MOHD SHAUFI et al., 2015; DEUSCH et al., 2015). Wei et al. (2013) elaboraram um consenso sobre a comunidade microbiana intestinal de frangos e perus saudáveis. Em perus, a análise do 16S rRNA gene (duodeno, jejuno e íleo) revela a existência de 69 gêneros bacterianos, os quais pertencem principalmente aos filos Bacterioidetes (28,8%) e Firmicutes (60,4%). Entre os gêneros mais predominantes, encontram-se: Lactobacillus, Bacteroides, Clostridium e Ruminococcus. Na microbiota cecal também é predominante a presença dos filos Bacterioidetes (55%) e Firmicutes (37%), sendo identificados 50 gêneros pertencentes a ambos os filos. No filo Bacteroidetes, mais de 80% das sequências gênicas avaliadas corresponderam a bactérias do gênero Bacteroides seguidas pelos gêneros Prevotella, Paraprevotella, Capnocytophaga, Elizabethkingia, Flavobacterium e Ornithobacterium. No filo Firmicutes, os gêneros Ruminococcus, Clostridium, Megamonas e Faecalibacterium representaram maior parte das sequências gênicas. Em menor escala, observam-se bactérias dos gêneros Blautia, Butyrivibrio, Butyricoccus, Alkaliphillus, Eubacterium e Pectinatus. Enfatiza-se para as distinções presentes no microbioma intestinal e cecal de perus e frangos de corte, ambos compartilham baixa similaridade em nível filogenético (16 – 19% de similaridade em nível de espécie) (WEI et al., 2013; Wei et al., 2016). 6 Embora o mapeamento genético forneça informações cruciais sobre a estrutura da microbiota intestinal e cecal de perus, abordagens sobre a funcionalidade dessa comunidade, ou mesmo de membros individuais na espécie em questão, ainda estão limitadas. Sabe-se que em perus comerciais a idade é um fator de influência na diversidade bacteriana intestinal, além disso ocorrem diferenças no perfil microbiano de lotes pesados e leves, onde mudanças na composição da microbiota intestinal de perus visto como saudáveis podem acarretar em menor desempenho (DANZEISEN et al., 2013), também, é discutível o papel da dieta como um fator de impacto sobre a microbiota (PAN e YU, 2014). A presença gênica reportada na microbiota intestinal e cecal, por sua vez, associa-se a bactérias específicas, as quais estão associadas com a capacidade de ativação do sistema imune intestinal, nutrição e com o aumento da resistência do hospedeiro à colonização por enteropatógenos, incluindo patógenos veiculados por alimentos, como Salmonella (OAKLEY et al., 2014). Em geral, o gênero Lactobacillus é descrito como bactérias probióticas relacionadas com a produção de vitaminas essenciais e por contribuírem com o metabolismo e a recirculação de ácidos biliares (LUO et al., 2013), atuando também na imunomodulação e no controle de Salmonella (BAPTISTA et al., 2014; DONATO et al., 2015; PENHA FILHO et al., 2015). Bacteroides exercem efeitos benéficos sobre o hospedeiro, sendo um gênero com alta atividade hidrolítica na degradação de carboidratos indigeríveis, amido e celulose (LAN et al., 2005). Bactérias do gênero Ruminococcus encontram-se envolvidas na degradação de polissacarídeos (SERGEANT et al., 2014), espécies de Clostridium incluindo o gênero Faecalibacterium podem induzir a expansão de células T reguladoras, ou estimular a produção de citocinas anti-inflamatórias (ATARASHI et al., 2011), sugere-se que Faecalibacterium tenha significativa atuação na produção de ácido butírico no lúmen cecal de frangos (EECKHAUT et al., 2011). Salmoneloses aviárias e saúde pública Salmonella consiste em um patógeno bacteriano de origem alimentar responsável por quadros gastroentéricos e infecções sistêmicas em humanos e animais (MAJOWICZ et al., 2010; GUNN, 2011). 7 No gênero Salmonella são descritos mais de 2.650 sorovares pertencentes a duas espécies Salmonella enterica e S. bongori (ISSENHUTH-JEANJEAN et al., 2014). Os sorovares Gallinarum (SG), Pullorum (SP), Enteritidis (SE) e Typhimurium (ST) pertencentes à espécie Salmonella enterica e destacam-se por serem objetos de monitoramento pelo Programa Nacional de Saúde Animal (BERCHIERI JUNIOR e FREITAS NETO, 2009; BRASIL, 2009). Alimentos de origem avícola (ovos, carne e outros derivados) estão relacionados a maioria dos surtos de salmoneloses, em seres humanos (JACKSON et al., 2013; PIRES et al., 2014). Na UE e nos EUA, os principais sorovares isolados, em criações comerciais de perus, são: Heidelberg, Saintpaul, Kottbus, Typhimurium, Newport, Reading, Bredeney, Enteritidis, Derby, Senftenberg e Agona (EFSA, 2008; HAFEZ, 2013). Entre os 20 sorovares relacionados a casos de salmonelose em humanos, cinco são frequentemente isolados de perus, sendo eles: Enteritidis, Heidelberg, Montevideo, Munchen e Agona (CDC, 2016). Sabe-se que o consumo de carne de aves e ovos encontra-se em franca expansão, por serem considerados fontes proteicas de qualidade e de baixo custo. Nessa perspectiva, o aumento no consumo desses produtos e seus derivados aumenta o risco de exposição à Salmonella (FOLEY et al., 2011). Em países como EUA, onde existe rígido controle na área de saúde pública, estima-se que a Salmonella enterica seja responsável por 1.028 milhões de casos, 19 mil internações em hospitais e cerca de 400 mortes por ano (SCALLAN et al., 2011). Nos últimos anos, têm ocorrido significativas alterações na ecologia e dinâmica das populações de Salmonella enterica relacionadas a aves comerciais e nos casos de infecções humanas ocasionadas por sorovares de origem avícola. No início do século XX, os sorovares Pullorum e Gallinarum estavam disseminados nos rebanhos avícolas dos EUA (SHIVAPRASAD e BARROW, 2013), chegando ao plantel brasileiro por meio de importação de material genético contaminado. Esses sorovares eram responsáveis por infecções denominadas de pulorose (SP) e tifo aviário (SG), as quais causavam alta mortalidade e, dessa forma, grandes prejuízos ao setor avícola. Por esse motivo foram alvos de programas de erradicação instituídos por órgãos governamentais (Programa Nacional de Sanidade Avícola, 8 Regulamento 2160/2003 e 584/2008/UE) e empresas privadas (medidas rigorosas de biosseguridade; vacinação; boas práticas de produção/fabricação) (BRASIL, 1994; EUROPEAN COMMISSION, 2003b; EUROPEAN COMMISSION, 2008; BERCHIERI JÚNIOR e FREITAS NETO, 2009). Acredita-se que quando um sorovar é erradicado, outros sorovares possam emergir, ocupando seu nicho ecológico. Sendo assim, uma das consequências da erradicação da SG foi a emergência da Salmonella enterica sorovar Enteritidis (SE), o que acarretou em problemas para o setor e de saúde pública, devido ao aumento dos surtos, em humanos, associados ao consumo de produtos avícolas contaminados por SE (BÄUMLER et al., 2000; FOLEY et al., 2011). Gradualmente, ao longo dos últimos anos o controle de SE e ST tem mostrado progresso, mas os desafios ainda persistem e alterações na prevalência e na dinâmica dos sorovares envolvidos em surtos de infecções associado a carne e derivados de perus continuam ocorrendo (KINROSS et al., 2014). Nos EUA, no ano de 2014 a Salmonella Heidelberg (SH) figurou como o segundo sorovar mais comumente isolado em surtos de infecções ocorridas em perus (USAHA, 2015). Em 2013, o sorovar Heidelberg foi o sexto mais isolado em casos de infecções humanas, nos EUA (CDC, 2016). A ingestão de carne contaminada e derivados de frangos, perus e ovos são as principais fontes de contaminação por SH nos surtos envolvendo a bactéria (CHITTICK et al., 2006; FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2010). No Brasil, tem sido relatado o isolamento de SH em aves e derivados avícolas desde o ano de 1962 (HOFER et al., 1997). Pulido-Landínez et al. (2013) conduziram uma pesquisa, na região sul do Brasil, a qual objetivou avaliar a diversidade de sorovares isolados em frangos de corte e no ambiente de produção, o Heidelberg foi o principal sorovar associado a contaminação na produção. Outros resultados comprovam prevalência do sorovar Heidelberg na avicultura de corte em alguns estados brasileiros. Pandini et al. (2014) realizando uma pesquisa de Salmonella em granjas localizadas no estado do Paraná, constataram a prevalência do sorovar Heidelberg, representando 12,3% entre os isolados. Segundo Voss-Rech et al. (2015), nos estados do Paraná, Mato Grosso do Sul e Santa Catarina, o sorovar Heidelberg foi o terceiro mais frequentemente isolado, 7,31% do total de 82 9 isolados oriundos de três diferentes empresas. O perfil de susceptibilidade aos agentes antimicrobianos apresentado pelos isolados, em ambos os estudos, corroboram com o conhecimento sobre a condição de resistência antimicrobiana do sorovar. O resultado da infecção por microrganismos do gênero Salmonella varia de acordo com o sorovar envolvido, idade, exposição e, em menor grau, com genótipo da ave (SMITH e BEAL, 2008). Em geral, o inglúvio e os cecos constituem os principais locais de colonização por Salmonella em aves (IMPEY et al., 1984; DURANT et al., 1999). Infecções por sorovares paratíficos resultam em colonização intestinal, bacteremia e disseminação sistêmica, sem sinais clínicos evidentes (GAST, 2013). Comparando com outros sorovares do gênero que causam quadros de infecções gastroentéricas, em seres humanos, inclusive com SE, a SH tende a ser mais invasiva e mais patogênica, pois pode causar alterações sistêmicas, como sepse e miocardite (WILMSHURST e SUTCLIFFE, 1995; GAST, 2013). Nos casos de infecções que ocorrem em frangos e perus jovens, bactérias do gênero Salmonella podem colonizar o TGI, sendo isoladas com alta frequência e excretadas por várias semanas. Embora ocorra um declínio na eliminação, quando a ave atinge a maturidade, esses microrganismos podem persistir na mucosa intestinal por meses (SMITH e BEAL, 2008; GAST, 2013). A persistência da infecção por Salmonella pode levar ao desequilíbrio da microbiota intestinal, além de causar danos à saúde e ao desempenho da ave (SADEYEN et al., 2006). Dieta e a microbiota intestinal de aves Na dieta estão presentes uma gama de nutrientes essenciais para a manutenção do TGI saudável, o que é fundamental para a adequada digestão, absorção, metabolismo de nutrientes e para a regulação da resposta imune do hospedeiro (YEGANI e KORVER, 2008). A composição e a digestibilidade da dieta constituem fatores que podem influenciar a microbiota intestinal das aves, uma vez que os compostos presentes servem como substratos para o crescimento de microrganismos intestinais (APAJALAHTI e VIENOLA, 2016). 10 Níveis de nutrientes (gorduras, proteínas e carboidratos), aditivos, tamanho e tipo de alimento e a técnica de processamento, são alguns dos fatores capazes de determinar o equilíbrio microbiano intestinal e reduzir a colonização por patógenos entéricos (APAJALAHTI et al., 2004; YEGANI e KORVER, 2008). Desse modo, alterações na dieta têm efeitos sobre a microbiota intestinal, influenciando a habilidade do animal em digerir e absorver nutrientes essenciais para o crescimento e desempenho animal (COWIESON et al., 2006). Durante muitos anos os APC têm sido rotineiramente utilizados como aditivos na alimentação animal, seja para prevenir doenças ou como melhoradores de crescimento, garantindo a máxima eficiência alimentar e apresentando impactos significativos no desempenho animal e na modulação da microbiota intestinal (HUYGHEBAERT et al., 2011; DANZEISEN et al., 2015; APAJALAHTI e VIENOLA, 2016). Diversos estudos têm avaliado o impacto do uso de APC sobre a microbiota intestinal. É sugerido que o efeito promotor de crescimento ocorra devido à alterações benéficas na microbiota do hospedeiro, por meio da redução no número de bactérias e redução na competição por nutrientes no intestino delgado. Pode ocorrer também pela inibição da produção e excreção de mediadores inflamatórios para o controle de patógenos ou pela seleção de bactérias capazes de extrair maior energia da dieta (DIBNER e RICHARDS, 2005; NIEWOLD, 2007). Ainda que a interação entre o uso de antimicrobianos e a microbiota intestinal esteja relacionada a benefícios para a saúde, desempenho animal, meio ambiente e com a rentabilidade da avicultura intensiva, o uso subterapêutico frequente de APC tem sido muito questionado por preocupações relacionadas a saúde humana, face ao aumento da prevalência e disseminação de resistência entre bactérias patogênicas, o que vem comprometendo potencialmente a eficácia terapêutica em seres humanos (AARESTRUP et al., 2008; HUYGHEBAERT et al., 2011; LILLEHOJ e LEE, 2012; HAO et al., 2014). Devido a influência da dieta na composição microbiana intestinal, o manejo da microbiota, por meio de alterações na dieta, desempenha um papel importante na saúde e no desempenho do hospedeiro (CHOCT, 2009; APAJALAHTI e VIENOLA, 2016). Em princípio, a ampliação de estratégias nutricionais 11 sustentáveis aplicadas na dieta, incluindo uma seleção adequada de matérias-primas para a produção da ração e o uso de aditivos, podem servir como moduladores de microbiota eficientes, capazes de inibir o crescimento de bactérias patogênicas e assim melhorar a saúde intestinal (RINTILÄ e APAJALAHTI, 2013). Faecalibacterium prausnitzii e microbiota intestinal Faecalibacterium prausnitzii pertence ao gênero Faecalibacterium, o qual inicialmente foi denominado como Fusobacterium prausnitzii, esse microrganismo é um bacilo Gram negativo, imóvel, extremamente sensível ao oxigênio, o que dificulta seu cultivo, mesmo em anaerobiose. Os produtos finais da fermentação do microrganismo F. prausnitzii, a partir da glicose, consistem em ácido butírico, acético, fórmico e D-lactato (DUNCAN et al., 2002). Semelhante a outras bactérias, presentes na microbiota intestinal, sensíveis ao oxigênio, até o presente momento, ainda pouco se sabe acerca da biologia, microbiologia e do efeito benéfico de F. prausnitzii para aves. Ressalta-se, seu importante papel na manutenção das funções vitais da microbiota intestinal humana e na prevenção de doenças intestinais (MIQUEL et al., 2014). Trabalhos relacionados a função desse microrganismo com foco na produção e sanidade avícola ainda são escassos, sendo sugerida significativa atuação na produção de ácido butírico, no lúmen cecal de frangos (LUND et al., 2010; EECKHAUT et al., 2011). Em frangos de corte, foi demonstrado que a suplementação com microrganismos do gênero Lactobacillus pode modular o equilíbrio intestinal, proporcionando alterações nas concentrações de ácidos graxos voláteis (AGVs) e redução do pH ao longo do TGI (MEIMANDIPOUR et al., 2011). Sugere-se que a administração Lactobacillus exerça uma cooperação simbiótica para o aumento da população bacteriana de F. prausnitzii na microbiota cecal (GÉRARD et al., 2008). Resultados obtidos por Meimandipour et al. (2010a), por meio da simulação do ambiente cecal, in vitro, demonstraram que a suplementação com um probiótico à base de Lactobacillus aumentou a concentração de bactérias do mesmo gênero e também a população de Bifidobacterium spp. e F. prausnitzii, consequentemente, houve aumento na concentração de ácido butírico e inibição do crescimento de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5492426/#B29 12 Salmonella. Nesse sentido, o uso de probiótico à base de bactérias láticas, principalmente do gênero Lactobacillus, seria de grande valia, uma vez que essas apresentam efeitos butirogênicos, sugerindo a proliferação bactérias butirogênicas via cross feeding (MEIMANDIPOUR et al., 2010b). Acredita-se que a proliferação de bactérias butirogênicas, como F. prausnitzii, seja uma das formas de controle da Salmonella spp., mas avaliações mais aprofundadas sobre interferência dos aditivos alternativos aos APC na microbiota cecal, mais especificamente sobre as populações do microrganismo F. prausnitzii devem ser realizadas. Exclusão Competitiva Exclusão competitiva refere-se ao fenômeno pelo qual a microbiota intestinal normal se estabelece e confere proteção ao hospedeiro para resistir a colonização por patógenos (FULLER, 1989). O conceito de EC, inicialmente foi proposto por Nurmi e Rantala, em 1973. Esses pesquisadores observaram que, a administração oral de microbiota intestinal, derivada de aves adultas, para aves recém eclodidas poderia acelerar a colonização intestinal por microrganismos benéficos, impedindo a colonização por Salmonella (NURMI e RANTALA, 1973). Desde então, o princípio de EC vem sendo adaptado e aplicado em produtos de EC, como medida profilática com potencial para prevenir e controlar infecções por Salmonella spp. e outros patógenos, na avicultura comercial (KERR et al., 2013). Produtos de EC são produzidos diretamente a partir do ceco de aves adultas, isentas de patógenos, ou por meio do cultivo microbiológico de conteúdos cecais (PEDROSO e LEE, 2015). Suas composições, comumente, variam conforme a abordagem de preparo. Dentre outros aspectos, o efeito protetor desses produtos depende da administração de culturas viáveis, cultivadas tanto sob condições aerobiose ou anaerobiose, podendo as mesmas serem de composição definida (poucas espécies bacterianas) ou indefinida (várias espécies), ambas eficazes na redução significativa de Salmonella (PASCUAL et al., 1999; ANDREATTI FILHO et al., 2003; REVOLLEDO et al., 2006). 13 As interações microbianas e o mecanismo exato de proteção promovido pela microbiota competitiva, em partes, ainda são desconhecidos. Acredita-se que, inicialmente, a proteção seja resultado da redução na competição pelos sítios de ligação entéricos, competição por nutrientes, produção de compostos antimicrobianos como AGVs e de efeitos indiretos como a estimulação da imunidade do hospedeiro (GABRIEL et al., 2006; LA RAGIONE e MEAD, 2013). Segundo Revolledo et al. (2006), é sugerido que os AGVs produzidos pela microbiota saudável, após a administração de EC, sejam responsáveis por estimular a imunidade da mucosa intestinal, porém, poucos estudos foram conduzidos para esclarecer esse mecanismo de ação. Além dos benefícios, produtos de EC são amplamente reconhecidos por serem produtos naturais, alternativos aos APC. Em termos de biosseguridade, particularmente o tratamento com EC em criações de frangos e perus é preconizado antes da eclosão (in ovo), ou nas primeiras horas de vida, podendo também serem veiculados aos animais por meio de aplicação por spray, através da ração ou pelo tratamento via água de bebida (SCHNEITZ, 2005). Muitos estudos demonstram a eficácia da ação de produtos de EC sobre a microbiota de perus comerciais, em condições de laboratório, ensaios de campo e em condições comerciais, ocorrendo variações na eficácia da EC contra Salmonella (LLOYD et al.,1977; HOFACRE et al., 2000; BIELKE et al., 2003; MILBRADT et al., 2014). Segundo Lloyd et al. (1977) a inoculação de microbiota intestinal, em perus, aumenta a resistência à colonização por ST. Hofacre et al. (2000) investigando a ação do conteúdo cecal fresco proveniente de perus adultos, reportam que este demonstra efeito protetor significativo na proteção de perus de um dia de idade, contra desafio de Salmonella. Bielke et al. (2003) selecionaram microbiota cecal de frangos adultos, e avaliaram a importância do estabelecimento intestinal precoce por microbiota benéfica na prevenção da colonização por SE em perus jovens. A maior proteção ocorreu com a administração em baixas concentrações de microbiota competitiva. Segundo Milbradt et al. (2014a), a dieta suplementada com produto de EC, composto por microbiota específica de perus, pode influenciar positivamente a 14 quantidade de bactérias ácido-láticas presentes no inglúvio e nos cecos de perus comerciais de corte, além de elevar a concentração de ácido butírico e reduzir a quantidade de membros da família Enterobacteriaceae e a colonização por SE nos cecos. Em alguns países a utilização da EC como parte integrante de um programa biosseguridade demonstrou ser um método eficaz para o controle de Salmonella (MEAD et al., 2010). Probióticos Por definição, probióticos são culturas de microrganismos vivos benéficos que, quando suplementados na alimentação, são capazes de conferir efeitos benéficos para o hospedeiro e melhorar o equilíbrio microbiano intestinal (FULLER, 1989). Probióticos implicam em efeitos sobre a saúde e a produtividade. Dentre outras implicações, os mesmos são sugeridos para aumentar a resistência à colonização por agentes patogênicos, reduzir a incidência de doenças, promover a maturação e manutenção da integridade intestinal, modular o sistema imunológico, melhorar o metabolismo e a atividade de enzimas digestivas, o crescimento animal, a conversão e a eficiência alimentar (KABIR, 2009; HUYGHEBAERT et al., 2011). Na avicultura, probióticos são rotineiramente utilizados como aditivos alimentares, objetivando modular a microbiota intestinal em benefício do hospedeiro (CHAMBERS e GONG, 2011). Uma variedade de bactérias probióticas, tais como Lactobacillus, Bacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Escherichia, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Saccharomyces spp. são empregadas em preparações para aves, demonstrando capacidade para exercer efeitos sobre a saúde e a performance, auxiliando na proteção e controle de patógenos (KABIR, 2009; ARI et al., 2016). Alguns dos mecanismos pelos quais os probióticos conferem a proteção e o controle de patógenos referem-se à estimulação de resposta imune intestinal, sistema de exclusão competitiva e produção de metabólitos antimicrobianos, tais como: AGVs, peróxido de hidrogênio e de carbono, substâncias antimicrobianas de 15 baixo peso molecular, bacteriocinas e inibidores de adesão/produção de mucinas (SERVIN, 2004; LEE et al, 2010). A estabilização da barreira epitelial, adesão ao epitélio e habilidades de agregação também são fatores determinantes à atividade probiótica (CISEK e BINEK, 2014). Geralmente, probióticos são aplicados na nutrição de aves com base no conceito do fenômeno de EC (GAGGÌA et al., 2010). O efeito da EC com diferentes bactérias probióticas sobre a microbiota intestinal tem sido extensivamente estudado em frangos, desempenhando um importante papel na prevenção da colonização e na redução de Salmonella spp. e outros patógenos intestinais na espécie. Até o momento, pouco se sabe sobre a influência de bactérias probióticas sobre a microbiota de perus. Grande parte dos estudos existentes nessa espécie foram conduzidos com formulações provenientes da microbiota intestinal de frangos (VICENTE et al., 2007; MENCONI et al., 2011; WOLFENDEN et al., 2011). Além disso, devido a diferenças existentes entre ambas as espécies, variações na eficácia de alguns produtos e a existência de dados inconsistentes, os resultados de estudos conduzidos em frangos não devem ser aplicados em perus (CALLAWAY et al., 2008; OTUTUMI et al., 2012). Ácidos Orgânicos Assim como os produtos de EC e probióticos, AOs têm sido propostos para atuar na homeostase da microbiota intestinal, com efeitos benéficos, além de potencial para controlar patógenos intestinais e atividade semelhante à dos APC (DIBNER e RICHARDS, 2005). Como um grupo químico, AOs compreendem a quaisquer ácidos que contenham uma carboxila em sua estrutura geral, incluindo AGVs e aminoácidos (KHAN e IQBAL, 2016). Em geral, AOs relacionados com atividade antimicrobiana associam-se principalmente a ácidos graxos de cadeia curta (C1 a C7) (DIBNER e BUTTIN, 2002) e média (C8 a C14) (SKRIVANOVA et al., 2006; KOLLANOOR-JOHNY et al., 2012). Os mesmos são amplamente encontrados na natureza como constituintes normais de plantas ou tecidos animais. Alguns ácidos graxos de cadeia curta como acético, propiônico e butírico são produzidos pela microbiota intestinal, por meio 16 da fermentação microbiana dos polissacarídeos não amiláceos (MEIMANDIPOUR et al., 2011). AOs são utilizados como aditivos acidificantes de água de bebida ou da alimentação (DIBNER e BUTTIN, 2002), ambas as formas, objetivam diminuir o pH do alimento/água e do TGI. Uma vez presente no intestino, na forma não dissociada (lipossolúvel), esses são transportados através da membrana celular e dissociam-se no interior mais alcalino, acidificando o citoplasma bacteriano. Assim, suprimem a atividade de enzimas e inibem o crescimento de microrganismos patogênicos (VAN IMMERSEEL et al., 2006; DHAMA et al., 2014). Além das alterações no pH do citoplasma bacteriano, é também descrito que determinadas concentrações de AOs tenham potencial para regular a capacidade de virulência inibindo a expressão de genes invasão de patógenos entéricos, como Salmonella (SUN e O'RIORDAN, 2013). Em conjunto com efeito antimicrobiano, o uso de AOs apresentam efeitos positivos sobre a proliferação de vilosidades e criptas intestinais (KHAN e IQBAL, 2016), particurlarmente, o ácido butírico é bem conhecido por sua atividade antimicrobiana e pela sua ação sobre o desenvolvimento do epitélio intestinal (LEESON et al., 2005). É proposto que a suplementação com AOs de cadeia curta exerça efeito antimicrobiano no inglúvio e ausência de efeitos nas porções inferiores do TGI (THOMPSON e HINTON, 1997), já os AOs de cadeia média são inicialmente ativos apartir do duodeno, onde podem exercer atividade antimicrobiana, principalmente contra bactérias Gram positivas (VAN DER AAR et al., 2016). Atualmente, existem várias combinações de AOs disponíveis comercialmente no mercado, dentre outros fatores que influenciam a ótima ação antimicrobiana dessas formulações, destaca-se a forma química (esterificada ou não, ácido, sal, revestida ou não) (PATTEN e WALDROUP, 1988; THOMPSON e HINTON (1997), principalmente para os AOs de cadeia curta são empregadas diferentes técnicas, tal como o processo revestimento e/ou a micro-encapsulação, os quais auxiliam no transporte desses compostos até o TGI inferior, evitando a liberação no TGI superior, assim permitem, que a microbiota intestinal possa ser modificada (VAN IMMERSEEL et al., 2005; BEDFORD E GONG, 2017). 17 Na avicultura, dentre outros AGVs de cadeia média, o ácido caprílico (AC) tem apresentando resultados satisfatórios, quando utilizado no controle da Salmonella spp., em frangos e poedeiras. De acordo com Kollanoor-Johny et al. (2012), a suplementação com AC, na dieta de frangos, foi eficaz na regulação e na expressão de genes de virulência e na invasão intestinal por SE. Upadhyaya et al. (2015) relataram que o uso profilático de AC, na alimentação de poedeiras, reduziu a colonização por SE, nos órgãos internos, bem como a contaminação da gema e casca do ovo. Segundo Pickler et al. (2012), a eficácia dos AOs frente a Salmonella varia de acordo com a via de administração do produto e o sorovar envolvido. A ação ótima dos AOs é limitada conforme o local de absorção, sendo que o processo de microencapsulação limita a absorção nas porções superiores do TGI, assegurando o transporte desses até as porções mais distais, reduzindo a colonização de patógenos, nesses sítios (VAN IMMERSEEL et al., 2005). Milbradt et al. (2014a) avaliaram o uso continuado de um blend comercial de AOs de cadeia curta e média (ácido acético, fórmico e ácidos graxos vegetais - 2g/kg de alimento) adicionados a ração de perus de corte desafiados com SE. Segundo os autores, o tratamento com AOs foi capaz de reduzir o número de bactérias da família Enterobacteriaceae, no inglúvio e nos cecos, aumentar a concentração de ácido butírico e reduzir o número de unidades formadoras de colônias de SE, nos cecos. 18 OBJETIVOS Objetivo Geral Avaliar os efeitos de AOs, probiótico e produto de EC em uma população microbiana intestinal e na morfometria intestinal de perus de corte desafiados com SH. Objetivos específicos Avaliar o uso dos aditivos, acima mencionados, no controle da infecção por SH, bem como sobre a persistência da excreção da mesma nas fezes; Avaliar o efeito dos aditivos no desenvolvimento do epitélio intestinal; Avaliar o efeito dos aditivos na quantidade relativa da bactéria F. prausnitzii no conteúdo cecal e a sua correlação com o controle da infecção por SH. 19 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AARESTRUP, F.M.; WEGENER, H.C.; COLLIGNON. P. Resistance in bacteria of the food chain: epidemiology and control strategies. Expert Review of Anti- infective Therapy, v.6, n.5, p.733-750, 2008. AMIT-ROMACH, E.; SKLAN, D.; UNI, Z. Microflora ecology of the chicken intestine using 16S ribosomal DNA primers. Poultry Science, v.83, n.7, p.1093– 1098, 2004. ANDREATTI FILHO, R.L.; SAMPAIO, H.M.; BARROS, M.R.; GRATÃO, P.R.; CATANEO, A. Use of cecal microflora cultured under aerobic or anaerobic conditions in the control of experimental infection of chicks with Salmonella Enteritidis. Veterinary Microbiology, v.92, n.3, p.237-244, 2003. ARI, M.M.; IJI, P.A.; BHUIYAN, M.M. Promoting the proliferation of beneficial microbial populations in chickens. World's Poultry Science Journal, v.72, n.4, p.785-792, 2016. APAJALAHTI, J.; KETTUNEN, A.; GRAHAM, H. Characteristics of the gastrointestinal microbial communities, with special reference to the chicken. World's Poultry Science Journal, v.60, n.2, p.223-232, 2004. APAJALAHTI, J.; VIENOLA, K. Interaction between chicken intestinal microbiota and protein digestion. Animal Feed Science and Technology, v.221, p.23–330, 2016. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE PROTEÍNA ANIMAL – ABPA – Relatório Anual 2017, 68p, São Paulo. ATARASHI, K.; TANOUE, T.; SHIMA, T.; IMAOKA, A.; KUWAHARA, T.; MOMOSE, Y.; CHENG, G.; YAMASAKI, S.; SAITO, T.; OHBA, Y.; TANIGUCHI, T.; TAKEDA, K.; HORI, S.; IVANOV, I.I.; UMESAKI, Y.; ITOH, K.; HONDA, K. Induction of colonic regulatory T cells by indigenous Clostridium species. Science, v.331, n.6015, p.337-341, 2011. BAPTISTA, A.A.S.; DONATO, T.C.; GARCIA, K.C.O.D.; GONÇALVES, G.A.M.; COPPOLA, M.P.; OKAMOTO, A.S.; SEQUEIRA, J.L.; ANDREATTI FILHO, R.L. Immune response of broiler chickens immunized orally with the 20 recombinant proteins flagellin and the subunit B of cholera toxin associated with Lactobacillus spp. Poultry science, v.93, n.1, p.39-45, 2014. BARNES, E.M. The avian intestinal flora with particular reference to the possible ecological significance of the cecal anaerobic bacteria. American Journal of Clinical Nutrition, v.25, n.12, p.1475–1479, 1972a. BARNES, E.M.; MEAD, G.C.; BARNUML, D.A.; HARRY, E.G. The intestinal flora of the chicken in the period 2 to 6 weeks of age, with particular reference to the anaerobic bacteria. British Poultry Science, v.13, n.3, p.311-326, 1972b. BARNES, E.M. The intestinal microflora of poultry and game birds during life and after storage. Journal of Applied Bacteriology, v.46, n.3, p.407-419, 1979. BEDFORD, A.; GONG, J. Implications of butyrate and its derivatives for gut health and animal production. Animal Nutrition, 2017. BERCHIERI JÚNIOR, A.; FREITAS NETO, O. C. Salmoneloses. In: BERCHIERI JÚNIOR, A.; SILVA, E.P.; DI FÁBIO, J.; SESTI, L.; FAGNANI ZUANAZE, M.A. (Ed). Doenças das aves. 2. ed. Campinas: FACTA, 2009. cap. 4.1, p.434- 454. BIELKE, L. R.; ELWOOD, A. L.; DONOGHUE, D. J.; DONOGHUE, A. M.; NEWBERRY, L. A.; NEIGHBOR, N. K.; HARGIS, B. M. Approach for selection of individual enteric bacteria for competitive exclusion in turkey poults. Poultry Science, v.82, n.9, p.1378-1382, 2003. BÄUMLER, A.J.; HARGIS, B.M.; TSOLIS, R.M. Tracing the origins of Salmonella outbreaks. Science, v.287 n.5450, p.50-52, 2000. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Secretaria da Defesa Agropecuária. Portaria SDA n. 194, de 19 de setembro de 1994. Institui o programa nacional de sanidade avícola no âmbito da SDA e cria o comitê consultivo do programa de sanidade avícola. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, DF, 1994. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Departamento de Saúde Animal. Secretaria de Defesa Agropecuária. Manual de legislação: programas nacionais de saúde animal do Brasil. Brasília, 2009. 440p. 21 BRISBIN, J.T.; GONG, J.; SHARIF, S. Interactions between comensal bacteria and the gut-associated immune system of the chicken. Animal Health Research Reviews, v.9, n.1, p.101–110, 2008. CALLAWAY, T.R.; EDRINGTON, T.S.; ANDERSON, R.C.; HARVEY, R.B.; GENOVESE, K.J.; KENNEDY, C.N.; NISBET, D.J. Probiotics, prebiotics and competitive exclusion for prophylaxis against bacterial disease. Animal Health Research Reviews, v.9, n.2, p.217-225, 2008. CARD, R.M.; CAWTHRAW, S.A.; NUNEZ-GARCIA, J.; ELLIS, R.J.; KAY, G.; PALLEN, M.J.; WOODWARD, M.J.; ANJUM, M.F. An in vitro chicken gut model demonstrates transfer of a multidrug resistance plasmid from Salmonella to commensal Escherichia coli. m.Bio, v.8, n.4, e00777-17, 2017. CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (CDC). 2016. National Enteric Disease Surveillance: Salmonella Annual Report, 2013: Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, 89p. Disponível em: Acesso em: 28 fev. 2017. CHAMBERS, J.R.; GONG, J. The intestinal microbiota and its modulation for Salmonella control in chickens. Food Research International, v.44, n.10, p.3149- 3159, 2011. CHITTICK, P.; SULKA, A.; TAUXE, R.V.; FRY, A.M. A summary of national reports of foodborne outbreaks of Salmonella Heidelberg infections in the United States: clues for disease prevention. Journal of Food Protection, v.69, n.5, p.1150- 1153, 2006. CHOCT, M. Feed non-starch polysaccharides: Chemical structures and nutritional significance. Feed Milling International, v.191, p.13-26, 1997. CHOCT, M. Managing gut health through nutrition. British Poultry Science. v.50, n.1, p.9–15, 2009. CISEK, A.A.; BINEK, M. Chicken intestinal microbiota function with a special emphasis on the role of probiotic bacteria. Polish journal of veterinary sciences, v.17, n.2, p.385-394, 2014. https://www.cdc.gov/nationalsurveillance/pdfs/salmonella-annual-report-2013-508c.pdf https://www.cdc.gov/nationalsurveillance/pdfs/salmonella-annual-report-2013-508c.pdf 22 DANZEISEN, J.L.; CALVERT, A.J.; NOLL, S.L.; MCCOMB, B.; SHERWOOD, J.S.; LOGUE, C.M.; JOHNSON, T.J. Succession of the turkey gastrointestinal bacterial microbiome related to weight gain. PeerJ, v.2013, n.1, 2013. DANZEISEN, J.L.; CLAYTON, J.B.; HUANG, H.; KNIGHTS, D.; McCOMB, B.; HAYER, S.S., JOHNSON, T.J. Temporal relationships exist between cecum, ileum, and litter bacterial microbiomes in a commercial Turkey flock, and subtherapeutic penicillin treatment impacts ileum bacterial community establishment. Frontiers in Veterinary Science, v.2, n.56, 2015. DECKER, S.R.F.; GOMES, M.C. Análise do desempenho e participação da agricultura familiar na avicultura de corte na região sul do Rio Grande do Sul/Brasil. Revista Brasileira de Agropecuária Sustentável, v.6, n.1, p.15-25,2016. DEUSCH, S.; TILOCCA, B.; CAMARINHA-SILVA, A.; SEIFERT, J. News in livestock research — use of Omics -technologies to study the microbiota in the gastrointestinal tract of farm animals. Computational and Structural Biotechnology Journal, v.13, p.55–63, 2015. DHAMA, K.; TIWARI, R.; KHAN, R.U.; CHAKRABORTY, S.; GOPI, M.; KARTHIK, K.; SAMINATHAN, M.; DESINGU, P. A.; SUNKARA, L.T. Growth promoters and novel feed additives improving poultry production and health, bioactive principles and beneficial applications: The trends and advances-A Review. International Journal of Pharmacology, v.10, n.3, p.129-159, 2014. DIBNER, J.J.; BUTTIN, P. Use of organic acids as a model to study the impact of gut microflora on nutrition and metabolism. Journal Applied Poultry Research, v.11, n.4, p.453–463, 2002. DIBNER, J.J.; RICHARDS, J.D. Antibiotic Growth Promoters in Agriculture: History and Mode of Action. Poultry Science, v.84, n.4, p.634-643, 2005. DONATO, T.C.; BAPTISTA, A.A.S.; GARCIA, K.C.O.D.; SMANIOTTO, B.D.; OKAMOTO, A.S.; SEQUEIRA, J.L.; ANDREATTI FILHO, R.L. Effects of 5- hydroxytryptophan and m-hydroxybenzylhydrazine associated to Lactobacillus spp. on the humoral response of broilers challenged with Salmonella Enteritidis. Poultry Science, v.94, n.9, 2081-2087, 2015. 23 DUNCAN, S. H.; HOLD, G.L.; HARMSEN, H.J.M.; STEWART, C.S.; FLINT, H.J. Growth requirements and fermentation products of Fusobacterium prausnitzii, and a proposal to reclassify it as Faecalibacterium prausnitzii gen. nov., comb. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v.52, n.6, p.2141-2146, 2002. DURANT, J.A.; CORRIER, D.E.; BYRD, J.A.; STANKER, L.H.; RICKE S.C. Feed deprivation affects crop environment and modulates Salmonella enteritidis colonization and invasion of Leghorn hens. Applied and Environmental Microbiology, v.65, p.1919–1923, 1999. EECKHAUT, V.; VAN IMMERSEEL, F.; CROUBELS, S.; De BAERE, S.; HAESEBROUCK, F.; DUCATELLE, R.; LOUIS, P.; VANDAMME, P. Butyrate production in phylogenetically diverse Firmicutes isolated from the chicken caecum. Microbial Biotechnology, v.4, n.4, p.503–512, 2011. EFSA (European Food Safety Authority). Report of the task force on zoonoses data collection on the analysis of the baseline survey on the prevalence of Salmonella in turkey flocks, in the EU, 2006-20071. Part A: Salmonella prevalence estimates. The EFSA Journal, v.134, p.1-91, 2008. EUROPEAN COMMISSION. Regulation (EC) Nº 1831/2003 Of the European parliament and of the council of 22 September 2003. On additives for use in animal nutrition. Official Journal of the European Union. European Parliament and The Council of The European Union, Bruxelas, 22 sep. 2003a. EUROPEAN COMMISSION. Regulation (EC) Nº 2160/2003 Of the European parliament and of the Council of 17 November 2003. On the control of salmonella and other specified food-borne zoonotic agentes. Official Journal of the European Union. European Parliament and The Council of The European Union, Bruxelas, 17 nov. 2003b. EUROPEAN COMMISSION. Regulation (EC) N.º 584/2008 Of the Comission of the European communities of 20 June 2008. Implementing Regulation (EC) N º 2160/2003 of the European Parliament and of the Council as regards a Community target for the reduction of the prevalence of Salmonella enteritidis and Salmonella 24 typhimurium in turkeys. Official Journal of the European Union. European Parliament and The Council of The European Union, Bruxelas, 20 jun. 2008. FDA, Food and Drug Administration. National Antimicrobial Resistance Monitoring System-enteric bacteria (NARMS): 2007 executive report. U.S. Department of Health and Human Services, Rockville, MD, 2010. FOLEY, S.L.; NAYAK, R.; HANNING, I.B.; JOHNSON, T.J.; HAN, J.; RICKE, S.C. Population dynamics of Salmonella enterica serotypes in commercial egg and poultry production. Applied and Environmental Microbiology, v.77, n.13, p.4273-4279, 2011. FORKUS, B.; RITTER, S.; VLYSIDIS, M.; GELDART, K.; KAZNESSIS, Y.N. Antimicrobial probiotics reduce Salmonella enterica in turkey gastrointestinal tracts. Scientific Reports, v.7, n.40695, 2017. FULLER, R. Probiotics in man and animals. A review. Journal of Applied Bacteriology, v.66, n.5, p.365-378, 1989. GABRIEL, I.; LESSIRE, M.; MALLET, S.; GUILLOT, J.F. Microflora of the digestive tract: Critical factors and consequences for poultry. World's Poultry Science Journal, v.62, n.3, p.499–511, 2006. GAGGÌA, F.; MATTARELLI, P.; BIAVATI, B. Probiotics and prebiotics in animal feeding for safe food production. International Journal of Food Microbiology, v.141, p.S15–S28, 2010. GAST, R.K. Salmonella infections. In: SWAYNE, D. E.; GLISSON, J.R.; McDOUGALD, L.R.; NOLAN, L.K.; SUAREZ, D.L.; NAIR, V. (Eds). Diseases of poultry. 13. ed. Ames Iowa: Wiley-Blackwell, 2013. cap. 16, p.677- 736. GÉRARD, P.; BRÉZILLON, C.; QUÉRÉ, F.; SALMON, A.; RABOT, S. Characterization of cecal microbiota and response to an orally administered lactobacillus probiotic strain in the broiler chicken. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, v.14, n1-3, p.115-122, 2008. GONG, J.; SI, W.; FORSTER, R. J.; HUANG, R.; YUL, H.; YIN, Y, YANG, C.; HAN, Y. 16S rRNA gene-based analysis of mucosa-associated bacterial 25 community and phylogeny in the chicken gastrointestinal tracts: from crops to ceca. FEMS Microbiol Ecology, v.59, n.1, p.147–157, 2007. GUNN, J.S. Salmonella host–pathogen interactions: a special topic. Frontiers in Microbiology, v.2, n.191, 2011. HAFEZ, H.M. Salmonella infections in turkeys. In: Barrow, P.A.; Methner, U. (Eds). Salmonella in domestic animals. 2.ed. Wallingsford: CABI Publishing, 2013. cap. 10, p.193-220. HAO, H.; CHENG, G.; IQBAL, Z.; AI, X.; HUSSAIN, H.I.; HUANG, L.; DAI, M.; WANG, Y.; LIU, Z.; YUAN, H. Benefits and risks of antimicrobial use in food- producing animals. Frontiers in Microbiology, v.5, n.288, 2014. HOFACRE, C.L.; PRIMM, N.D.; VANCE, K.; VANCE, K.; GOODWIN, M.A.; BROWN, J. Comparison of a lyophilized chicken-origin competitive exclusion culture, a lyophilized probiotic, and fresh turkey cecal material against Salmonella colonization. Journal of Applied Poultry Research, v.9, n.2, p.195–203, 2000. HOFER, E.; SILVA FILHO, S.J.; REIS, E.M.F. Prevalência de sorovares de Salmonella isolados de aves do Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.17, n.2, p.55-62, 1997. HUYGHEBAERT, G.; DUCATELLE, R.; VAN IMMERSEEL, F. An update on alternatives to antimicrobial growth promoters for broilers. The Veterinary Journal, v.187, n.2, p.182-188, 2011. IMPEY, C.S.; MEAD, G.C.; GEORGE, S.M. Evaluation of treatment with defined and undefined mixture of gut microorganisms for preventing Salmonella colonization in chicks and turkey poults. Food Microbiology, v.1, n.2, p.143-147, 1984. ISSENHUTH-JEANJEAN, S.; ROGGENTIN, P.; MIKOLEIT, M.; GUIBOURDENCHE, M.; DE PINNA, E.; NAIR, S.; FIELDS, P, WEILL, F.X. . Supplement 2008-2010 (No. 48) to the White-Kauffmann-Le Minor scheme. Research in Microbiology, v.165, n.7, p.526-530, 2014. 26 JACKSON, B.R.; GRIFFIN, P.M.; COLE, D.; WALSH, K.A.; CHAI, S.J. Outbreak-associated Salmonella enterica serotypes and food commodities, United States, 1998-2008. Emerging Infectious Diseases. v.19, n.8, p.1239–1244, 2013. KABIR, S.M. The role of probiotics in the poultry industry. International Journal of Molecular Sciences, v.10, n.8, p.3531-3546, 2009. KERR, A. K.; FARRAR, A.M.; WADDELL, L.A.; WILKINS, W.; WILHELM, B.J.; BUCHER, O.; WILLS, R.W.; BAILEY, R.H.; VARGA, C.; McEWEN S.A.; RAJIĆ, A. A systematic review-meta-analysis and meta-regression on the effect of selected competitive exclusion products on Salmonella spp. prevalence and concentration in broiler chickens. Preventive Veterinary Medicine, v.111, n.1, p.112-125, 2013. KHAN, S.H.; IQBAL, J. Recent advances in the role of organic acids in poultry nutrition. Journal of Applied Animal Research, v.44, n.1, p.359-369, 2016. KINROSS, P.; van ALPHEN, L.; MARTINEZ URTAZA, J.; STRUELENS, M.; TAKKINEN, J.; COULOMBIER, D.; MÄKELÄ, P.; BERTRAND, S.; MATTHEUS, W.; SCHMID, D.; KANITZ, E.; RÜCKER, V.; KRISZTALOVICS, K.; PÁSZTI, J.; SZÖGYÉNYI, Z.; LANCZ, Z.; RABSCH, W.; PFEFFERKORN, B.; HILLER, P.; MOOIJMAN, K.; GOSSNER, C. Multidisciplinary investigation of a multicountry outbreak of Salmonella Stanley infections associated with turkey meat in the European Union, August 2011 to January 2013. EuroSurveillance, v.19, n.19, p.1-9, 2014. KOLLANOOR-JOHNY, A.; MATTSON, T.; ANANDA BASKARAN, S.; AMARLARADJOU, M.A.R.; HOAGLAND, T.A.; DARRE, M.J.; KHAN, M.I.; SCHREIBER, D.T.; DONOGHUE, A.M.; DONOGHUE, D.J.; VENKITANARAYANAN, K. Caprylic acid reduces Salmonella Enteritidis populations in various segments of digestive tract and internal organs of 3- and 6- week-old broiler chickens, therapeutically1,2. Poultry Science, v.91, n.9, p.1686– 1694, 2012. LAN, P.T.N.; SAKAMOTO, M.; SAKATA, S.; BENNO, Y. Bacteroides barnesiae sp. nov., Bacteroides salanitronis sp. nov. and Bacteroides gallinarum sp. nov., 27 isolated from chicken caecum. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v.56, n.12, p.2853-2859, 2006. LA RAGIONE, E.; MEAD, G. Competitive exclusion. In: BARROW, P.A.; METHNER, U. (Eds). Salmonella in domestic animals. 2.ed. Wallingsford: CABI Publishing, 2013. cap. 21, p.426-454. LAXMINARAYAN, R.; MATSOSO, P.; PANT, S.; BROWER, C.; RØTTINGEN, J.A.; KLUGMAN, K.; DAVIES, S. Access to effective antimicrobials: a worldwide challenge. The Lancet, v.387, n.10014, p.168-175, 2015. LEE, K.; LILLEHOJ, H.S.; SIRAGUSA, G.R. Direct-fed microbials and their impact on the intestinal microflora and immune system of chickens. The Journal of Poultry Science, v.47, n.2, p.106-104, 2010. LEESON, S.; NAMKUNG, H.; ANTONGIOVANNI, M.; LEE, E.H. Effect of butyric acid on the performance and carcass yield of broiler chickens. Poultry Science, v.84, n.9, p.1418–1422, 2005. LILLEHOJ, H.S.; LEE, W.K. Immune modulation of innate immunity as alternatives-to-antibiotics strategies to mitigate the use of drugs in poultry production. Poultry Science, v.91, n.6, p.1286-1291, 2012. LLOYD, A.B.; CUMMING, R.B.; KENT, R.D. Prevention of Salmonella typhimurium infection in poultry by pretreatment of chickens and poults with intestinal extracts. Australian Veterinary Journal, v.53, n.2, p.82–87,198, 1977. LU, J.; IDRIS, B.; HARMON, B.; HOFACRE, C.; MAURER, J.J.; LEE, M.D. Diversity and succession of the intestinal bacterial community of the maturing broiler chicken. Applied and Environmental Microbiology, v.69, n.11, p.6816- 6824, 2003. LUND, M.; BJERRUM, L.; PEDERSEN, K. Quantification of Faecalibacterium prausnitzii-and Subdoligranulum variabile-like bacteria in the cecum of chickens by real-time PCR. Poultry Science, v.89, n.6, p.1217-1224, 2010. LUO, Y.H.; PENG, H.W.; WRIGHT, A.D.G.; BAI, S.P.; DING, X.M.; ZENG, Q.F.; LI, H.; ZHENG, P.; SU, Z.Y.; CUI, R.Y.; ZHANG, K.Y. Broilers fed dietary vitamins harbor higher diversity of cecal bacteria and higher ratio of Clostridium, 28 Faecalibacterium, and Lactobacillus than broilers with no dietary vitamins revealed by 16S rRNA gene clone libraries. Poultry Science, v.92, n.9, p.2358– 2366, 2013. MAJOWICZ, S.; MUSTO, J.; SCALLAN, E.; ANGULO, F.J.; KIRK, M.; O’BRIEN, S.J.; JONES, T.F.; FAZIL, A.; HOEKSTRA, R.M. The global burden of nontyphoidal Salmonella gastroenteritis. Clinical Infectious Diseases v.50, n.6, p.882–889, 2010. MEAD, G.; LAMMERDING, A.M.; COX, N.; DOYLE, M. P.; HUMBERT, F.; KULIKOVSKIY, A.; PANIN, A.; do NASCIMENTO, V.P. WIERUP, M. Scientific and technical factors affecting the setting of Salmonella criteria for raw poultry: a global perspective. Journal of Food Protection, v.73, n.8, p.1566-1590, 2010. MEIMANDIPOUR, A.; SHUHAIMI, M.; SOLEIMANI, A.F.; AZHAR, K.; HAIR-BEJO, M.; KABEIR, B.M.; JAVANMARD, A.; MUHAMMAD ANAS, O.; YAZID, A.M. Selected microbial groups and short-chain fatty acids profile in a simulated chicken cecum supplemented with two strains of Lactobacillus. Poultry Science, v.89, n.3, p.470–476, 2010a. MEIMANDIPOUR, A.; HAIR-BEJO, M.; SHUHAIMI, M.; AZHAR, K.; SOLEIMANI, A.F.; RASTI, B.; YAZID, A.M. Gastrointestinal tract morphological alteration by unpleasant physical treatment and modulating role of Lactobacillus in broilers. British Poultry Science, v. 51, n.1, p.52-59, 2010b. MEIMANDIPOUR, A.; SOLEIMANI, A.F.; HOUSHMAND, M.; KASIM, A.; HAIR-BEJO, M.; SHUHAIMI, M.; YAZID, A. M. Effects of rough handling on short chain fatty acid production and gastrointestinal pH in broilers and modulatory role of Lactobacilli. African Journal of Biotechnology, v.10, n.74, p.17030- 17037, 2011. MENCONI, A.; WOLFENDEN, A.D.; SHIVARAMAIAH, S.; TERRAES, J.C.; URBANO, T.; KUTTEL, J.; KREMER, C.; HARGIS, B.M.; TELLEZ, G. Effect of lactic acid bacteria probiotic culture for the treatment of Salmonella enterica serovar Heidelberg in neonatal broiler chickens and turkey poults. Poultry Science, v.90, n.3, p.561-565, 2011. 29 MILBRADT, E.L.; OKAMOTO, A.S.; GARCIA, E.A.; SANFELICE, C.; CENTENARO, L.P.; ANDREATTI FILHO, R.L. Use of organic acids and competitive exclusion product as an alternative to antibiotic as a growth promoter in the raising of commercial turkeys. Poultry Sience, v.93, p.1855–1861, 2014. MILBRADT, E.L.; ZAMAE, J.R.; ARAÚJO JÚNIOR, J.P.; MAZZA, P.; PADOVANI, C.R.; CARVALHO, V.R.; SANFELICE, C.; RODRIGUES, D.M, OKAMOTO, A.S.; ANDREATTI FILHO, R.L. Control of Salmonella Enteritidis in turkeys using organic acids and competitive exclusion product. Journal Applied Microbiology, v.117, n.2, p554–563, 2014a. MIQUEL, S.; MARTIN, R.; BRIDONNEAU, C.; ROBERT, V.; SOKOL, H.; BERMÚDEZ-HUMARÁN, L.G.; THOMAS, M.; LANGELLA, P. Ecology and metabolism of the beneficial intestinal commensal bacterium Faecalibacterium prausnitzii. Gut Microbes, v.5, n.2, p.146-151, 2014. MOORE, P.R.; EVENSON, A.; LUCKEY, T.D.; McCOY, E.; ELVEHJEM, C.A.; HART, E.B. Use of sulfasuxidine, streptothricin and streptomycin in nutritional studies with the chick. Journal of Biological Chemistry, v.165, p.437-441, 1946. MOHD SHAUFI, M.A.M.; SIEO, C.C.; CHONG, C.W., GAN, H.M.; HO, Y.W. Deciphering chicken gut microbial dynamics based on high-throughput 16S rRNA metagenomics analyses. Gut Pathogens, v.7, n.4, 2015. NIEWOLD, T. A. The nonantibiotic anti-inflammatory effect of antimicrobial growth promoters, the real mode of action? A hypothesis. Poultry Science, v.86, p.605–609, 2007. NURMI, E.; RANTALA, M. New aspects of Salmonella infection in broiler production. Nature, v.241, n.5386, p.210-1, 1973. OAKLEY, B.B.; LILLEHOJ, H.S.; KOGUT, M.H.; KIM, W.K.; MAURER, J.J.; PEDROSO, A.; LEE, M.D.; COLLET, S.R.; JOHNSON, T.J.; COX, N.A. The chicken gastrointestinal microbiome. FEMS Microbiology Letters, v. 360, n. 2, p.100-112, 2014. OTUTUMI, L.C.; GÓIS, M.B.; DE MORAES GARCIA, E.R.; LODDI, M.M. Variations on the efficacy of probiotics in poultry. In: RIGOBELO, E.C, (Ed). Probiotics in animals. Rijeka: InTech, 2012. Cap. 9, p. 203–230. 30 PANDINI, J. A.; da SILVA PINTO, F.G.; MULLER, J.M.; WEBER, L.D.; de MOURA, A.C. Ocorrência e perfil de resistência antimicrobiana de sorotipos de Salmonella spp. isolados de aviários do Paraná, Brasil. Arquivos do Instituto Biológico, v.82, p.1-6, 2014. PAN, D.; YU, Z. Intestinal microbiome of poultry and its interaction with host and diet. Gut Microbes. v.5, n.1, p.108–119, 2014. PASCUAL, M.; HUGAS, M.; BADIOLA, J.I.; MONFORT, J.M.; GARRIGA, M. Lactobacillus salivarius CTC2197 prevents Salmonella enteritidis colonization in chickens. Applied and Environmental Microbiology, v.65, n. 11, p. 4981-4986, 1999. PATTEN, J.D.; WALDROUP, P.W. Use of organic acids in broiler diets. Poultry Science, v.67, p.1178–1182, 1988. PEDROSO, A.A.; BATAL, A B.; LEE, M.D. Effect of in ovo administration of an adult-derived microbiota on establishment of the intestinal microbiome in chickens. American Journal of Veterinary Research, v.77, n.5, p.514-526, 2016. PEDROSO, A.A.; LEE, M.D. The composition and role of the microbiota in chickens. In: Niewold, T. (Ed.) Intestinal Health. Wageningen: Wageningen Academic Publishers, 2015. cap.2, p. 21-50. PENHA FILHO, R.A.C.; DÍAZ, S.J.A.; FERNANDO, F.S.; CHANG, Y.F.; ANDREATTI FILHO, R. L.; BERCHIERI JÚNIOR, A. Immunomodulatory activity and control of Salmonella Enteritidis colonization in the intestinal tract of chickens by Lactobacillus based probiotic. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.167, n.1, 64-69, 2015. PICKLER, L.; HAYASHI, R.M.; LOURENÇO, M.C.; MIGLINO, L.B.; CARON, L.F.; BEIRÃO, B.C.B; SILVA, A.V.F.; SANTIN, E. Avaliação microbiológica, histológica e imunológica de frangos de corte desafiados com Salmonella Enteritidis e Minnesota e tratados com ácidos orgânicos. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.32, n.1, p.27-36, 2012. PIRES, S.M.; VIEIRA, A.R.T.; HALD, T.; COLE, D. Source attribution of human salmonellosis: an overview of methods and estimates. Foodborne pathogens and Disease, v.11, n.9, p.667-676, 2014. 31 PULIDO-LANDÍNEZ, M.; SÁNCHEZ‐INGUNZA, R.; GUARD, J.; do NASCIMENTO, V.P. Assignment of serotype to Salmonella enterica isolates obtained from poultry and their environment in southern Brazil. Letters in Applied Microbiology, v.57, n.4, p.288-294, 2013. REHMAN, H.U.; VANHJEN W.; AWAD, W.A.; ZENTEK J. Indigenous bacteria and bacterial metabolic products in the gastrointestinal tract of broiler chickens. Archives of animal nutrition, v.61, n.5, p.319-335, 2007. REVOLLEDO, L.; FERREIRA, A.J.P.; MEAD, G.C. Prospects in Salmonella control: competitive exclusion, probiotics, and enhancement of avian intestinal immunity. The Journal of Applied Poultry Research, v.15, n.2, p.341-351, 2006. RINTTILÄ, T.; APAJALAHTI, J. Intestinal microbiota and metabolites - implications for broiler chicken health and performance. Journal of Applied Poultry Research v.22, n.3, p.647-658, 2013. SADEYEN, J.R.; TROTEREAU, J.; PROTAIS, J.; BEAUMONT, C.; SELLIER, N.; SALVAT, G.; VELGE, P.; LALMANACH, A. C. Salmonella carrier-state in hens: study of host resistance by a gene expression approach. Microbes and Infection, v.8, n.5, p.1308-1314, 2006. SCHNEITZ, C. Competitive exclusion in poultry: 30 years of research. Food Control, v.16, n.8, p.657–667, 2005. SCUPHAM, A.J.; PATTON, T.G.; BENT, E.; BAYLES, D.O. Comparison of the cecal microbiota of domestic and wild turkeys. Microbial Ecology, v.56, n.2, p.322-331, 2008. SERGEANT, M.J.; CONSTANTINIDOU, C.; COGAN, T.A.; BEDFORD, M.R.; PENN, C.W.; PALLEN, M. J. Extensive microbial and functional diversity within the chicken cecal microbiome. PLoS ONE, v.9, n.3, p.e91941, 2014. SERVIN, A. L. Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens. FEMS Microbiology Reviews, v.28, n.4, p.405–440, 2004. SHIVAPRASAD, H.L.; BARROW, P. Pullorum disease and fowl typhoid. In: SWAYNE, D. E.; GLISSON, J.R.; McDOUGALD, L.R.; NOLAN, L.K.; 32 SUAREZ, D.L.; NAIR, V. (Ed). Diseases of poultry. 13. ed. Ames Iowa: Wiley- Blackwell, 2013. cap. 16, p.678- 693. SILVA, T.M.; MILBRADT, E.L.; ZAMAE, J.C., ANDREATTI FILHO, R.L.; OKAMOTO, A.S. Transferência de resistência antimicrobiana entre enterobactérias patogênicas de importância aviária-Impactos em saúde pública. Archives of Veterinary Science, v.21, n.2, p. 9-20, 2016. SKRIVANOVA, E.; MAROUNEK, M.; BENDA, V.; BREZINA, P. Susceptibility of Escherichia coli, Salmonella sp. and Clostridium perfringens to organic acids and monolaurin. Veterinarni Medicina, v.51, n.3, p.81–88, 2006. SMITH, A.L.; BEAL, R. The avian enteric immune system in health and disease. In: DAVISON, F.; KASPERS, B.; SCHAT, K.A. (Ed) Avian Immunology. 1.ed. Oxford: Elsevier, 2008. cap. 13, p. 243-270. STANLEY, D.; GEIER, M.S.; HUGHES, R.J.; DENMAN, S.E.; MOORE, R.J. Highly variable microbiota development in the chicken gastrointestinal tract. PLoS ONE, v.8, n.12, p.e84290, 2013. SUN, Y.; O'RIORDAN, M.X.D. Regulation of bacterial pathogenesis by intestinal short-chain fatty acids. Advances in Applied Microbiology, v.85, p.93-118, 2013. THOMPSON, J.L.; HINTON, M. Antibacterial activity of formic and propionic acids in the diet of hens on Salmonellas in the crop. British. Poultry. Science, v38, p.59–65, 1997. UNITED STATES ANIMAL HEALTH ASSOCIATION (USAHA). 2015. Report of the committee on salmonella: united states animal health association. Disponível em Acesso em: 28 de fev. 2017. UPADHYAYA, I.; UPADHYAY, A.; YIN, H.B.; NAIR, M.S.; BHATTARAM, V.K.; KARUMATHIL, D.; KOLLANOR-JOHNY, A.; KHAN, M.I.; DARRE, M.J CURTIS, P.A.; VENKITANARAYANAN, K. Reducing colonization and eggborne transmission of Salmonella Enteritidis in layer chickens by in-feed supplementation of caprylic acid. Foodborne Pathogens and Disease, v.12, n.7, p.591-597, 2015. http://www.usaha.org/Portals/6/Reports/2015/report-sal-2015.pdf 33 VAN IMMERSEEL, F. BOYEN, F.; GANTOIS, I.; TIMBERMONT, L.; BOHEZ, L.; PASMANS, F.; HAESEBROUCK, F.; DUCATELLE, R. Supplementation of coated butyric acid in the feed reduces colonization and shedding of Salmonella in poultry. Poultry Science, v.84, n.12, p.1851-1856, 2005. VAN DER AAR, P. J.; Molist, F.; Van Der Klis, J. The central role of intestinal health on the effect of feed additives on feed intake in swine and poultry. Animal Feed Science and Technology, 2016. VAN IMMERSEEL, F.; RUSSELL, J. B.; FLYTHE, M. D.; GANTOIS, I.; TIMBERMONT, L.; PASMANS, F.; HAESEBROUCK, F.; DUCATELLE, R. The use of organic acids to combat Salmonella in poultry: a mechanistic explanation of the efficacy. Avian Pathology, v.35, n.3, p. 182–188, 2006. VICENTE, J.; HIGGINS, S.; BIELKE, L.; TELLEZ, G.; DONOGHUE, D.; DONOGHUE, A.; HARGIS, B. Effect of probiotic culture candidates on Salmonella prevalence in commercial turkey houses. Journal of Applied Poultry Research, v.16, n.3, p.471–476, 2007. VOSS-RECH, D.; VAZ, C.S.L.; ALVES, L.; COLDEBELLA, A.; LEÃO, J.A.; RODRIGUES, D.P.; BACK, A. A temporal study of Salmonella enterica serotypes from broiler farms in Brazil. Poultry Science, v.94, n.3, p.433-441, 2015. WEI, S.; MORRISON, M.; YU, Z. Bacterial census of poultry intestinal microbiome. Poultry Science, v.92, n.3, p.671-683, 2013. WEI, S.; LILBURN, M.; YU, Z. The bacteriomes of ileal mucosa and cecal content of broiler chickens and turkeys as revealed by metagenomic analysis. International Journal of Microbiology, v.2016, 2016. WILMSHURST, P.; SUTCLIFFE, H. Splenic abscess due to Salmonella Heidelberg. Clinical Infectious Diseases, v.21, n.4, p.1065-1066, 1995. WOLFENDEN, R.E.; PUMFORD, N.R.; MORGAN, M.J.; SHIVARAMAIAH, S.; WOLFENDEN, A.D.; PIXLEY, C.M.; GREEN, J.; TELLEZ, G.; HARGIS, B.M. Evaluation of selected direct-fed microbial candidates on live performance and Salmonella reduction in commercial turkey brooding houses. Poultry Science v.90, n11, p.2627–2631, 2011. 34 ZHAO, L.; WANG, G.; SIEGEL, P.; HE, C.; WANG, H.; ZHAO, W.; ZHAI, Z.; TIAN. F.; ZHAO, J.; ZHANG, H.; SUN, Z.; CHEN, W.; ZHANG, Y.; MENG, H. Quantitative genetic background of the host influences gut microbiomes in chickens. Scientific reports, v.3, n.1163, 2012. YEGANI, M.; KORVER, D.R. Factors affecting intestinal health in poultry. Poultry Science, v.87, n.10, p. 2052-2063, 2008. 35 PROPOSTA DE ESTUDO A sanidade avícola, embora tenha sofrido profunda evolução, continua sendo dinâmica e desafiadora. Problemas anteriormente amenizados, como a alta incidência de SE nos plantéis de aves de corte, matrizes e abatedouros, deram lugar a outros, como a emergência de um novo sorovar, o Heidelberg, o qual tem demonstrado ser altamente patogênico para humanos. Sendo assim, estudos envolvendo o mesmo fazem-se urgentes, a fim de obter formas de controle e redução da bactéria. Assim como os demais sorovares, SH, coloniza os cecos, portanto a homeostase da microbiota intestinal e cecal é determinante no sucesso ou insucesso da colonização do agente. Em humanos, F. prausnitzii é considerado um microrganismo comensal altamente funcional, devido à importância metabólica que o mesmo exerce. Em animais, não deve ser diferente, mas é necessário o aprofundamento das pesquisas para melhor compreensão da atividade dessa bactéria, bem como da melhor forma de interferir para que não ocorram prejuízos nas concentrações da mesma. Nesse sentido, a biologia molecular tem sido de grande valia, pois atualmente, o uso de ferramentas capazes de identificar e quantificar o DNA e RNA, como a qPCR (Polymerase Chain Reaction) em tempo real, possibilita uma visão ampla da microbiota intestinal, bem como da sua resposta a agentes patogênicos e mudanças na dieta, como a inclusão de aditivos alternativos aos antimicrobianos promotores de crescimento. Nesse contexto, realizou-se um experimento, o qual é apresentado no capítulo 2, denominado de Modulação da microbiota intestinal de perus de corte desafiados com Salmonella Heidelberg e submetidos a diferentes programas de controle. Esse manuscrito seguiu-se as diretrizes editoriais preconizadas pela revista Journal of Applied Microbiology (ISSN 1364-5072) e teve como objetivo avaliar a resposta da microbiota intestinal e da morfologia intestinal de perus de corte alimentados com dieta acrescida de AOs, probiótico e produto de EC e posteriormente, infectados com SH. CAPITULO 2 MODULAÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL DE PERUS DE CORTE DESAFIADOS COM Salmonella Heidelberg E SUBMETIDOS A DIFERENTES PROGRAMAS DE CONTROLE 37 Modulação da microbiota intestinal de perus de corte desafiados com Salmonella Heidelberg e submetidos a diferentes programas de controle T.M. Silva1, E.L. Milbradt1, M.L.C. Arcuri2, A.S. Okamoto1, B.C. Silva3, J.L. Sequeira1, C.R. Padovani4, V. Azevedo3, R.L. Andreatti Filho1 Autor correspondente: andreatti@fmvz.unesp.br Universidade Estadual Paulista- UNESP Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia- FMVZ Hospital Veterinário s/n Departamento de Clínica Veterinária Laboratório de Ornitopatologia – Fone/Fax: 055-14-3880-2067 Rua Prof. Doutor Walter Maurício Corrêa, s/n Bairro: Unesp Campus de Botucatu, Botucatu - São Paulo, Brasil CEP: 18618-681, Caixa Postal- 560 1Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Botucatu, São Paulo, Brasil. 2Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Botucatu, São Paulo, Brasil. 3Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil. 4Departamento de Bioestatística, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Botucatu, São Paulo, Brasil. mailto:andreatti@fmvz.unesp.br 38 RESUMO: Objetivo: Avaliar o uso de ácidos orgânicos (AOs), Exclusão competitiva (EC) e probióticos administrados continuadamente na ração no controle de Salmonella enterica subspecie enterica sorovar Heidelberg (SH) e a ação sobre a microbiota e morfometria intestinal Métodos e Resultados: Foi avaliada a influência dos tratamentos sobre a população do microrganismo Faecalibacterium prausnitzii, morfometria intestinal, colonização de SH no inglúvio e no ceco e persistência da eliminação da bactéria nas fezes. No 3º e no 10º dia de vida, as aves foram desafiadas oralmente, via gavagem com 0,5 mL de 107 UFC de SH/mL, e 0,5 mL de 105 UFC de SH/mL respectivamente. No 7º, 19º e 35º de vida, foram eutanasiadas 10 aves por grupo experimental, sendo colhido segmentos de inglúvio, duodeno, jenuno, íleo e ceco. O probiótico e o produto de EC administrados continuadamente na ração reduz a incidência e a colonização de SH no inglúvio. Nos cecos os tratamentos reduziram a colonização de SH somente aos 19 dias. A dieta suplementada com AOs influenciou positivamente na quantidade de F. prausnitizii no ceco e não houve correlação entre a quantidade relativa desse microrganismo com o controle da infecção por SH. A excreção fecal de SH, foi influenciada pelos tratamentos a partir dos 26 dias de vida das aves, aos 34 dias todos os grupos reduziram a excreção fecal. Aos sete dias, os animais que receberam AOs apresentaram maior altura das vilosidades no jejuno comparando com o grupo controle positivo. Conclusão: A suplementação contínua dos aditivos via ração apresentou eficácia no controle e na redução da persistência da infecção por SH. O uso de AOs foi mais eficaz para modular a população microbiana da bactéria F. prausnitzii na microbiota cecal. Importância e impacto do Estudo: A composição da dieta pode modular populações de bactérias butirogênicas, mas tais microrganismos podem não estarem correlacionados com a redução da colonização cecal por SH. Palavras chave: ácido orgânico, Faecalibacterium prausnitzii, microbiota intestinal, peru, probiótico, produto de exclusão competitiva, Salmonella. 39 INTRODUÇÃO O trato gastrointestinal (TGI) de perus é predominantemente composto por uma microbiota dinâmica, metabolicamente ativa e complexa, a qual desempenha papel vital na manutenção da função intestinal, saúde e desempenho animal (Danzeisen et al. 2013; Wei et al. 2016; Wilkinson et al. 2017). Nesse ambiente, está presente uma alta densidade de bactérias comensais (Barnes 1972), que em diferentes situações interagem diretamente com agentes patogênicos, modulando a colonização bacteriana intestinal. Diversos estudos já demonstraram papeis cruciais relacionados a microbiota intestinal aviária, tais como: digestão, absorção de nutrientes e imuno modulação (Gong et al. 2007; Yeoman et al. 2012; Xiao et al. 2016), além de relevância para garantir a segurança do alimento, saúde animal e saúde pública (Oakley et al. 2014). No entanto, análises detalhadas que possibilitem compreender a funcionalidade da microbiota intestinal de perus, ou mesmo que forneceçam informações sobre a predominância e a potencial importância de cada membro dessa comunidade frente aos desafios por agentes patogênicos ainda estão muito limitadas e pouco estudadas. Reconhece-se que microrganismos do gênero Faecalibacterium representam cerca de 6% da microbiota cecal de perus adultos saudáveis (Wei et al 2013). Uma das principais espécies membro desse gênero é o microrganismo Faecalibacterium prausnitzii, este, é consistentemente relatado como um importante produtor de ácido butírico nos cecos de aves (Bjerum et al. 2006; Lund et al. 2010) e como um indicador de saúde e alterações intestinais (Lopez-Siles et al. 2017). Devido a sua importância, se faz necessário ampliar a compreensão das interações desse microrganismo frente aos desafios intestinais, buscando melhor eficiência alimentar. Salmoneloses causadas por sorovares não tifóides de Salmonella enterica são uma das causas mais importantes de infecções transmitidas por alimentos e um dos principais problemas de saúde pública, em termos globais, de alta morbidade e mortalidade (Majowicz et al. 2010). Esses sorovares constituem preocupação relevante para a produção avícola, pois a colonização por S. enterica no TGI de aves, principalmente frangos e perus, constituem reservatórios primários e https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wilkinson%20TJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28690591 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4490257/#B3 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5479886/#B42 40 potenciais fatores de risco para contaminação do produto final (Behravesh et al. 2014). Salmonella enterica subsespecie enterica sorovar Heidelberg, figura como um sorovar não tifóide emergente em diversos países (Foley et al. 2011). No Brasil, sua prevalência vem aumentando em criações comerciais avícolas, em diversos estados brasileiros (Hofer et al. 1997; Pulido-andínez et al. 2013; Voss-Rech et al. 2015). Esse sorovar tem sido reportado como responsável por surtos de infecções ocorridos em perus (USAHA 2015), casos humanos de salmoneloses invasivas (Burt et al. 1990; Vugia et al. 2004). Em surtos recentes, o agente tem apresentado perfil de múltipla resistência antimicrobiana, o que desperta preocupação, pois trata-se de uma zoonose, portanto, um problema de saúde pública (CDC 2011; CDC 2016; Gieraltowski et al. 2016). Atualmente, um dos desafios enfrentados pela indústria avícola mundial tem sido a busca por alternativas focadas no controle da SH, em toda a cadeia produtiva (Muniz et al. 2017; Voss-Rech et al. 2017). A problemática se faz maior devido a proibição do uso de antibióticos, como promotores de crescimento na alimentação animal. Alternativas como ácidos orgânicos (AOs), probióticos e produtos de exclusão competitiva (EC), prebióticos e enzimas, comumente estudadas, continuam em pauta, porém com diferentes combinações e enfoque são propostos na área de sanidade e nutrição para atuarem como moduladores de microbiota intestinal e para controlar Salmonella e outros patógenos intestinais. O presente estudo objetivou avaliar o uso de probiótico, produto de EC, AOs administrados continuamente, via ração, sobre a morfometria intestinal, população de F. prausnitzii nos cecos e o controle da colonização e eliminação da SH. MATERIAL E MÉTODOS Declaração de Ética no uso de animais O protocolo experimental foi submetido à aprovação pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) estando de acordo com os princípios éticos na experimentação animal adotados pelo 41 Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) (Protocolo Número: 87/2016). Amostras bacterianas e condições de cultivo Probiótico O probiótico foi composto por 11 amostras de bactérias ácido-láticas (Lactobacillus reuteri n= 9, Lactobacillus frumenti n= 1, Lactobacillus johnsonii n= 1), provenientes da microbiota cecal de perus de corte e selecionadas in vitro, no Laboratório de Ornitopatologia FMVZ-UNESP (Altarugio et al. 2017). Culturas das cepas selecionadas foram preparadas, separadamente, em 7 mL deMan, Rogosa and Sharpe caldo (MRS; Acumedia, Lansing, MI, USA) e incubadas a 37°C, durante 24 horas. Após o crescimento bacteriano, foi formado um pool das espécies cultivadas. Para determinar o número de unidades formadoras de colônias (UFCs) do probiótico, foram realizadas diluições decimais seriadas em solução tampão de salina fosfatada (PBS) (10mM Na2HPO4, 1mM KH2PO4, 140mM NaCl, 3mM KCl) pH 7,2, as quais foram plaqueadas em duplicata em deMan, Rogosa and Sharpe ágar (MRSA; Acumedia, Lansing, MI, USA). Salmonella Heidelberg e desafio experimental Amostras de SH isoladas de perus de corte e matrizes de perus de corte foram previamente avaliadas in vitro e in vivo. Selecionou-se a cepa que apresentou características de virulência ou patogenicidade como: positividade para os genes de virulência invA, agfA e lpfA, resistência aos antibióticos: Ampicilina (10 μg); Amicacina (30 μg); Ceftiofur (30 μg); Ciprofloxacina (5 μg); Doxiciclina (30 μg); Gentamicina, (10 μg); Norfloxacina (10 μg); Tetraciclina (30 μg) (SENSIDISC; DME, Niterói, Brasil); resistência ao calor (55°C) (0,0848% após uma hora e 0,0009% após duas horas de exposição) e resistência ácida (pH 2,5, 6M HCL) (5,1087% após uma hora e 1,1957% após duas horas de exposição) conforme Berk et al. (2005). A cepa foi marcada com ácido nalidíxico (Nal - WINTOMYLON®; Sanofi- Aventis, São Paulo, Brasil) e rifampicina (Rif - RIFALDIN®; Sanofi-Aventis, São Paulo, Brasil) por meio de cultivos sucessivos em ágar verde brilhante (AVB; 42 Oxoid, Basingstoke, UK) contendo doses crescentes de Nal e Rif conforme preconizado por Andreatti Filho et al. (1997). Para o desafio experimental, a cepa foi incubada a 40ºC por 18 horas, em caldo infusão cérebro coração (Brain Heart Infusion Broth) (BHI; Acumedia, Lansing, MI, USA) contendo Nal/Rif 100 µg/mL. A quantificação de UFCs do inóculo foi realizada por meio de diluições decimais seriadas em PBS pH 7,2 e posterior plaqueamento, em duplicata, em AVB contendo Nal/Rif 100 µg/mL. No terceiro e no décimo dia de vida, exceto as aves do grupo controle negativo, todas as demais foram desafiadas oralmente, via gavagem com 0,5 mL de 107 UFC de SH/mL, e 0,5 mL de 105 UFC de SH/mL respectivamente. Para as aves do grupo controle negativo foi administrado 0,5 mL de PBS, pH 7.2. Aves, instalações e manejo As instalações, equipamentos e ração foram monitorados para a presença de Salmonella spp., conforme protocolos preconizados Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL 1995; BRASIL 2003). Para garantir que aves eram livres de Salmonella spp., no momento do alojamento, foi realizada a colheita de mecônio e retirada de 10 aves para eutanásia e posterior pesquisa de Salmonella spp. por meio da metodologia preconizada por Mallinson e Snoeyenbos (1989). Cento e setenta perus de corte, fêmeas, de um dia de idade, da linhagem Nicholas (Aviagen, Brasil) foram adquiridas de um incubatório privado. As aves eram provenientes de matrizes certificadas como livres de Salmonella Pullorum, Salmonella Gallinarum, Salmonella Typhimurium, Micoplasma synoviae, Micoplasma gallisepticum, Micoplasma Meleagridis. No incubatório, as mesmas foram vacinadas contra as doenças de Newcastle, bouba aviária e rinotraqueíte infecciosa dos perus. Medidas rigorosas de higiene e biosseguridade (separação lateral dos tratamentos, uso de equipamentos de proteção individual como botas, luvas e vestimentas de uso exclusivo de cada tratamento, bem como materiais para o manejo diário das aves, como baldes, esponjas e ancinho), foram tomadas para evitar contaminação cruzada durante a execução do experimento. 43 As aves foram distribuídas, aleatoriamente, em boxes de 5m2, previamente cobertos com uma fina camada de maravalha e equipados com comedouro manual e bebedouro pendular. Os procedimentos de alojamento, alimentação e manejo foram similares para todas as aves, de acordo com o Manual da linhagem Nicholas (AVIAGEN Turkeys 2017a). Dieta O fornecimento de água e ração foi ad libitum. As dietas experimentais foram isonutritivas, formuladas à base de milho e farelo de soja, de acordo com níveis de exigências nutricionais recomendados pelo manual da linhagem Nicholas (AVIAGEN Turkeys 2017b). Todas as dietas eram livres de drogas anticoccidianas e promotores de cr