RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 23/8/2025 Câmpus de São José do Rio Preto Letícia de Queiroz Mozaner Atividade Antifúngica de Derivados Anfifílicos de Quitosana sobre agentes etiológicos de dermatomicoses São José do Rio Preto 2024 Letícia de Queiroz Mozaner Atividade Antifúngica de Derivados Anfifílicos de Quitosana sobre agentes etiológicos de dermatomicoses Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Nome do Programa, junto ao Programa de Pós- Graduação em Nome do Programa, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Orientador: Profª. Drª. Margarete Teresa Gottardo de Almeida São José do Rio Preto 2024 Letícia de Queiroz Mozaner Atividade Antifúngica de Derivados Anfifílicos de Quitosana sobre agentes etiológicos de dermatomicoses Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Nome do Programa, junto ao Programa de Pós- Graduação em Nome do Programa, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Comissão Examinadora Profª. Drª. Margarete Teresa Gottardo de Almeida UNESP – São José do Rio Preto Profª. Drª. Marcia Maria Costa Nunes Soares Instituto Adolfo Lutz – São José do Rio Preto Profª. Drª. Elza Maria Castilho FAMERP- São José do Rio Preto Profª. Drª. Mariela Domiciano Ribeiro FAMERP – São José do Rio Preto Profª. Drª. Cátia Rezende UNIFEV – Votuporanga São José do Rio Preto 23 de Fevereiro de 2024 AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus pois sei que onde estou só foi possível porque Ele me guiou até aqui. À minha família e namorado, pois eles deram o apoio emocional necessário para eu alcançar meus objetivos. À minha orientadora, uma pessoa maravilhosa profissionalmente e pessoalmente, sempre me acolheu e estava disponível para as dúvidas e problemas. Aos meus colegas de trabalho, ou melhor, amigos, pois são pessoas extraordinárias que pretendo ter o resto da vida. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001, à qual agradeço. RESUMO As infecções fúngicas afetam milhares de pessoas com ocorrências superficiais e/ou invasivas. Nos últimos anos, tem sido observado que as infecções são causadas por fungos com padrão resistente aos antimicrobianos. A terapêutica delas estão cada vez mais prolongadas e com altas taxas de recorrência. As micoses cutâneas ou dermatomicoses apresentam variedade de agentes etiológicos, tais como dermatófitos, leveduras e fungos filamentosos não dermatófitos. A busca por compostos não tóxicos, inibidores do crescimento de fungos, tem impulsionado a pesquisa nesta área. Nesse cenário, a quitosana é considerada um agente antimicrobiano promissor, cuja atividade tem sido parcialmente atribuída à interação eletrostática com a parede celular e membrana celular dos microrganismos. Estudos recentes têm mostrado que a estrutura da quitosana pode ser modificada para potencializar seus efeitos. Nesse sentido, o presente projeto teve por objetivo investigar a atividade antimicrobiana dos derivados, com conteúdos fixos de grupos dietilaminoetil (DEAE) ou grupos quaternários de amônio e dodecil (DD), com massas moleculares variadas. Esses derivados foram selecionados devido as suas atividades de inibição comprovadas contra os fungos Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Alternaria alternata, Alternaria solanie, Penicillium expansum, Candida glabrata, Candida krusei, entre outros. Busca-se otimizar a atividade antimicrobiana contra fungos de grande impacto na área da saúde, especificamente, contra cepas padrão e isolados clínicos de Trichophyton, Epidermophyton, Microsporum, Candida e Fusarium. Foram determinadas as Concentrações Inibitórias Mínima (CIM) e Fungicida Mínima (CFM) para todos os derivados e a cinética de morte (time-kill) para derivados selecionados. Além disso, foi testada a toxicidade dos derivados selecionados pelo modelo de Galleria mellonella. Os derivados apresentaram CIM e CFM entre 100-2000 µg/mL. Os polímeros substituídos com DEAE, e com DEAE e DD, de baixa massa, inibiram totalmente todas as cepas, no máximo, em 12 horas. Os menores tempos de ação (1 hora) foram observados com esses polímeros contra Candida krusei ATCC, Candida krusei 6347, Candida parapsilosis 6272, Candida parapsilosis 6186 e Candida parapsilosis ATCC. Todos os polímeros testados contra Trichophyton rubrum inibiram totalmente em 8 horas de contato. Os ensaios de toxicidade com Galleria mellonella demonstraram baixa toxicidade dos derivados. Palavras-chave: Onicomicoses, antimicrobianos, Galleria mellonella, quitosana ABSTRACT Fungal infections affect thousands of people with superficial and/or invasive occurrences. In recent years, it has been observed that infections are caused by fungi with a pattern resistant to antimicrobials. Their therapy is increasingly prolonged and with high rates of recurrence. Cutaneous mycoses or dermatomycoses have a variety of etiological agents, such as dermatophytes, yeasts and non-dermatophyte filamentous fungi. The search for non-toxic compounds that inhibit fungal growth has driven research in this area. In this scenario, chitosan is considered a promising antimicrobial agent, whose activity has been partially attributed to the electrostatic interaction with the cell wall and cell membrane of microorganisms. Recent studies have shown that the structure of chitosan can be modified to enhance its effects. Then, the present project aimed to investigate the antimicrobial activity of derivatives with fixed contents of diethylaminoethyl groups (DEAE) or quaternary ammonium and dodecyl groups (DD), with varied molecular weights. These derivatives were selected due to their proven inhibition activities against the fungi Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Alternaria alternata, Alternaria solanie, Penicillium expansum, Candida glabrata, Candida krusei, among others. The aim is to optimize the antimicrobial activity against fungi with a great impact on health, specifically against standard strains and clinical isolates of Trichophyton, Epidermophyton, Microsporum, Candida and Fusarium. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the Minimum Fungicide Concentration (MFC) were determined for all derivatives and time-kill for selected derivatives. In addition, the toxicity of derivatives selected by the Galleria mellonella model was tested. Derivatives showed MIC and MFC between 100-2000 µg/mL. DEAE, DEAE and DD substituted polymers totally inhibited all strains within 12 hours at most. The shortest action times (1 hour) were observed with these polymers against Candida krusei ATCC, Candida krusei 6347, Candida parapsilosis 6272, Candida parapsilosis 6186 and Candida parapsilosis ATCC. All polymers tested against Trichophyton rubrum were completely inhibited within 8 hours of contact. Toxicity tests with Galleria mellonella showed low toxicity of the derivatives. Keywords: Onychomycosis, antimicrobial, Galleria mellonella, chitosan LISTA DE ILUSTRAÇÕES Capítulo 1 Figura 1 – Layout das placas de microdiluição...............................................................23 Figura 2 – Placa de Ágar Sabouraud após a realização do procedimento.......................25 Figura 3 – Esquema do procedimento de time-kill.........................................................26 Figura 4. Derivados da série 1 contra Candida tropicalis ATCC....................................28 Figura 5 – Gráficos log UFC/mL vs tempo contra Candida spp.....................................32 Figura 6 – Gráficos log UFC/mL vs tempo contra filamentosos....................................35 Figura 7: Gráfico da taxa de sobrevivência (%) das larvas de Galleria mellonella inoculadas com os derivados de quitosana......................................................................37 Capítulo 2 Figura 1 - Esquema de determinação da cinética de morte...............................................43 LISTA DE TABELAS Capítulo 1 Tabela 1 – Estrutura e propriedades dos polímeros da série 1...........................................20 Tabela 2 – Estrutura e propriedades dos polímeros da série 2..........................................21 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ABD Agar Batata Dextrose ASD Agar Sabouraud Dextrose ATCC American Type Culture Collection CFM Concentração Fungicida Mínima CIM Concentração Inibitória Mínima CLSI Clinical Laboratory Standard Institute CS Caldo Sabouraud Dextrose M Molar mL Mililitro RPMI Rosen Park Memorial Institute UFC Unidades Formadoras de Colônias µg Microgramas SUMÁRIO CAPÍTULO 1.....…………………………………………………………………....…11 1.INTRODUÇÃO…………………………………………………………………..…11 2. REVISÃO DE LITERATURA………………………………………………….....12 2.1. Infecções fúngicas: dermatomicoses e agentes etiológicos……………………..…13 2.2.Terapêutica……………………………………………………………......…..……14 2.3. A quitosana e suas aplicações……………………………………………………...16 3. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA…………………………………………...…17 4. OBJETIVOS………………………………………………………………………..19 4.1. Objetivos específicos………………………………………………………………19 5. MATERIAIS E MÉTODOS……………………………………………………….21 5.1. Derivados anfifílicos………………………………………………………………21 5.2. Ensaios Microbiológicos…………………………………………………………..20 5.2.1. Cepas…………………………………………………………………………….21 5.2.2. Determinação de CIM…………………………………………………………...21 5.2.3. Determinação de CFM…………………………………………………………..24 5.2.4. Determinação da cinética de morte (time-kill)......................................................25 5.3. Teste de toxicidade em Galleria mellonela………………………………………….....26 6.RESULTADOS………………………………………………………………...……27 6.1.CIM…………………………………………………………………………………27 6.2.CFM………………………………………………………………………………...31 6.3. Avaliação da cinética de morte (time-kill)................................................................31 6.4. Teste de toxicidade em Galleria mellonella……………………………………………37 CAPÍTULO 2:artigo I……..........……………………………………...………….….38 Resumo............................................................................................................................39 Introdução........................................................................................................................39 Objetivos..........................................................................................................................40 Metodologia.....................................................................................................................40 Resultados........................................................................................................................42 Discussão e conclusão.....................................................................................................43 Referências......................................................................................................................46 CAPÍTULO 3: artigo II................................................................................................49 Abstract............................................................................................................................50 Introduction.....................................................................................................................50 Lay summary.................................................................................................................. .51 Materials and Methods....................................................................................................54 Results.............................................................................................................................54 Discussion and conclusion..............................................................................................55 References.......................................................................................................................57 7.CONCLUSÃO…………………………………………………………………….…59 REFERÊNCIAS…………………………………………………………………….…60 APÊNDICE A......................................................................................................... .......66 APÊNDICE B................................................................................................................72 APÊNDICE C................................................................................................................79 11 CAPÍTULO 1 1.INTRODUÇÃO As dermatomicoses são micoses superficiais que acometem grande parte da população, tornando-se uma causa importante de morbidade. Apesar de, na maioria das vezes, apresentarem risco de vida apenas em pacientes com comorbidades, geram efeitos debilitantes, diminuindo a qualidade de vida, ocasionando vários problemas psicossociais, além de grandes despesas em saúde pública (VLAHOVIC, 2016; GUPTA et al., 2020). Aquelas de ocorrência mais comum são as dermatofitoses ou tineas, infecções resultantes do acometimento de fungos aos tecidos queratinizados da pele, pelos e unhas. Leveduras comensais da pele, como Malassezia furfur e Candida spp. também são importantes agentes causais de dermatomicoses. A onicomicose é uma das ocorrências fúngicas mais comuns, definida como infecção fúngica das unhas, que representa mais de 50% de todas as onicopatias e cerca de 30% de todas as infecções superficiais. Três gêneros são a causa principal de onicomicose com 80 a 90% das ocorrências: Trichophyton, Epidermophyton e alguns casos Microsporum (GHANNOUM; ISHAM, 2014; BABAYANI. et al., 2018). A terapêutica das dermatomicoses geralmente envolvem antifúngicos orais, como terbinafina, itraconazol e fluconazol, que possuem altas taxas de efetividade, porém, podem apresentar efeitos adversos severos como danos hepatotóxicos. Os antifúngicos tópicos, tais como efinaconazol, tavaborol, ciclopirox e amorolfina, possuem menos efeitos adversos, mas são de baixa permeação devido à alta queratinização dos tecidos atingidos, obtendo-se baixas taxas de cura (PERUSINHA, C.; ROSADO, C.; LENCASTRE, A., 2019; GUPTA, A.K. et al., 2020). A baixa permeabilidade dos antifúngicos utilizados topicamente devido aos locais acometidos que possuem alta queratinização, atuando assim como uma barreira, e a toxicidade de antifúngicos sistêmicos como a terbinafina que pode causar náusea, vômito, perda do paladar, eczema, cefaleia, visão turva, pancitopenia, entre outros efeitos adversos, contribuem para baixa adesão aos tratamentos e alta reincidência. Por esse motivo a busca por novos fármacos é crescente. Nesse sentido, os derivados de 12 quitosana são polímeros que apresentam características únicas e atrativas: biodegradabilidade, baixa toxicidade, efeitos antimicrobianos, antioxidantes, capacidade de formar biofilmes, entre outros, que os faz serem explorados em diversas pesquisas, para diferentes objetivos (RUIZ-CRUZ, S. et al., 2019; SANTOS, V.S., et al., 2021; EL-ADLY, A.M., 2022). 59 7.CONCLUSÃO Os derivados apresentaram CIM e CFM entre 100-2000 µg/mL, entre eles, os derivados: CHL, DEAE_CHL_DD, S1_116, S1_136, S2_13 E S2_46 foram os mais eficazes, com médias geométricas de CIM e CFM contra cepas de Candida, filamentosos dermatófitos e Fusarium entre 100-500 mg/mL. A cinética de morte estudada contra as cepas de Candida comprovou que os polímeros CHL e DEAE_CHL_DD inibiram totalmente todas as cepas, no máximo, em 12 horas e os menores tempos de ação (1 hora) foram observados com esses polímeros contra C.K.ATCC, o CHL contra C.K.6347 e DEAE_CHL_DD contra C.P.6272, C.P.6186 e C.P. ATCC. Para os filamentosos, a cinética demonstrou que todos os polímeros contra as cepas de F.solani e T.rubrum inibiram em, no máximo, 8 horas de contato, enquanto para T.mentagrophytes todos inibiram em, no máximo, 24 horas, porém, em 8 horas o S2_13 inibiu todas as cepas. Os polímeros citados demonstram boa atividade antifúngica e são atóxicos, como demonstrado no modelo com Galleria. Os derivados que apresentam em sua estrutura uma porção hidrofílica (DEAE ou PENTIL) e outra hidrofóbica (Dodecil), de baixa e média massa molar, foram os com melhores atividades antifúngicas. 60 REFERÊNCIAS ALFARO, L. et al. 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