UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL INFLUÊNCIA DA PALHA E TEMPO DE PREPARO DA CALDA ANTES DA HIDRÓLISE DA CANA-DE- AÇÚCAR EM DIETAS DE VACAS LEITEIRAS Viviane Endo Zootecnista 2016 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL INFLUÊNCIA DA PALHA E TEMPO DE PREPARO DA CALDA ANTES DA HIDRÓLISE DA CANA-DE- AÇÚCAR EM DIETAS DE VACAS LEITEIRAS Viviane Endo Orientador: Prof. Dr. Mauro Dal Secco de Oliveira Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Zootecnia. 2016 Endo, Viviane E56i Influência da palha e do tempo de prepare da calda antes da hidrólise da cana-de-açúcar em dietas de vacas leiteiras. / Viviane Endo. – – Jaboticabal, 2016 xix, 73 p. : il. ; 29 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2016 Orientador: Mauro Dal Secco de Oliveira Banca examinadora: Atushi Sugohara, Márcia Saladini Vieira Sales, Paulo Figueiredo Vieira, Paulo Roberto Leme Bibliografia 1. Cana-de-açúcar hidrolisada. 2. Palha. 3.Vacas leiteiras. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 636.086.8:637.12 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. ABOUT THE AUTHOR VIVIANE ENDO – daughter of Antonio Toshihar Endo and Marilúcia Emico Endo, she was born in Apucarana, Paraná State, Brazil on the 25th of September 1986. In March 2005, Viviane started a Bachelor Program in Animal Science at Universidade Estadual de Maringá (UEM), where she was a fellow of Initiation Research by the National Council for Scientific and Technological Development (PIBIC / CNPq), under the supervision of Francisco de Assis Fonseca de Macedo, graduating in January 2010. In March 2010, Viviane started a Masters program in Animal Science, major in Animal Production at Faculty of Agricultural Sciences and Veterinary, São Paulo State University (FCAV, UNESP), campus of Jaboticabal, where she was a fellow of CNPq, under the supervision of Américo Garcia da Silva Sobrinho, defending her thesis in February 2012. In March 2012, Viviane started a PhD program in Animal Science, major in Animal Nutrition, at FCAV, UNESP, campus of Jaboticabal, where she was a fellow of CNPq, under the supervision of Mauro Dal Secco de Oliveira. By the Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, Sweden, Viviane was a fellow of CNPq sandwich doctorate from October 2014 to September 2015, under the supervision of Rolf Spörndly. In February, 16th, 2016, Viviane successfully defended her PhD thesis. EPIGRAPH “You may never know what results come of your actions, but if you do nothing, there will be no results.” Mahatma Gandhi “Education is the most powerful weapon which you can use to change the world.” Nelson Mandela “The great thing in this world is not so much where we stand, as in what direction we are moving.” Oliver Wendell Holmes https://www.goodreads.com/author/show/5810891.Mahatma_Gandhi DEDICATION To my parents, Antônio Toshihar Endo and Marilúcia Emico Endo. To my fiancé, André Marubayashi Hidalgo. To my brothers, Wagner Endo and Evandro Endo. To my sisters-in-law, Thaís C.C. Guimarães Endo and Thaís M. Zequim Endo. I love you guys so much! ACKNOWLEDGEMENTS The São Paulo State University, campus of Jaboticabal, for the opportunity to develop my PhD studies and the experimental work. The National Council of Scientific and Technological Development (CNPq), for the scholarship. The experimental dairy cows, which contributed to this research. My main supervisor, Mauro Dal Secco de Oliveira, for leading my professional growing, all the theoretical and practical teachings, as well as dedication as supervisor. My internship supervisor, Rolf Spörndly, for the incomparable orientation, for the trust and professional growth opportunity during my internship period at Swedish University of Agricultural Sciences (SLU), Uppsala, Sweden. Eva Spörndly, for teaching me about grazing systems and so on. Margareta Emanuelson for being my first contact and opening the doors to my internship at SLU. All the professors, lecturers, researchers, laboratory managers (mainly Borjë and Jorge) and students in general, as well as other staff from SLU I had the pleasure to meet, work with and share the same workplace. Américo Garcia da Silva Sobrinho and Francisco de Assis Fonseca de Macedo, for being part of my professional growth. Ever after supervisors. Jane Maria Bertocco Ezequiel, Atushi Sugohara, Luiz Carlos Roma Junior, Márcia Saladini Vieira Salles, Paulo Figueiredo Vieira, Paulo Roberto Leme and Jaime Maia dos Santos, for assistance and suggestions in the thesis for the qualifying and defending stages. All the laboratory staff from the Animal Nutrition Laboratory Analysis at São Paulo State University, for the numerous doubts clarified. The work team from Dairy cattle Sector, Vanessa Amaro Vieira, Maria Luiza de Souza e Silva, Viviane Borba Ferrari, Mariana de Paula Rossi Sforcini. The Bachelor internship students, Gabriela Azevedo Araujo, Gabriela Costa Magioni, Flávia Caroline Gatti, Thaís Paixão Suleiman, Andres Nelsis Oscar Navarro, Breno Máximo, Ítalo Masson Estima, Mariana Rodrigues Jacomino Piratelo for all help during the heavy work experiment, mainly cutting many kilos of sugarcane every other day. I also thank you Josimari Regina Paschoaloto, Marco Túlio Costa Almeida, Henrique Leal Perez and Jane Maria Bertocco Ezequiel for the availability, helping me with the digestibility analysis. The barn staff, Denis, Marrom, Badeco, Biro, Debonis, Gazeta and Hulk. My flatmates, Angela Regina Arduino, Sheila Tavares Nascimento, Marcos Davi de Carvalho, Lucas Henrique, Jacqueline Arduino, Fabiana Alves de Almeida and Mrs. Benedita for the companionship, conversations, advice, a lot of funny stories, lots of laughs and happy moments. André Marubayashi Hidalgo, for all the help correcting the English language in the thesis, but especially thank you for the affection, encouragement, companionship, dedication and patience. My family for always supporting me in my moments and for being my close advisers. Including also Mr. (Dr.) Osvaldo Hidalgo da Silva and Mrs. (Dr.) Mirian Marubayashi Hidalgo for encouraging me. All colleagues of PhD course who contributed to this further stage in my professional career. x CONTENTS Page INFLUÊNCIA DA PALHA E DO TEMPO DE PREPARO DA CALDA ANTES DA HIDRÓLISE DA CANA-DE-AÇÚCAR EM DIETAS DE VACAS LEITEIRAS RESUMO................................................................................................................... xiii ABSTRACT .............................................................................................................. xiv TABLE LIST .............................................................................................................. xv FIGURE LIST ........................................................................................................... xvi CERTIFICADO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS ......................... xix CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS .............................................................. 1 1. Introdução ........................................................................................................... 1 2. Revisão de literatura ........................................................................................... 2 2.1 Cana-de-açúcar na alimentação de ruminantes ........................................... 2 2.1.1 Desempenho de vacas leiteiras alimentadas com cana-de-açúcar hidrolisada ................................................................................................ 3 2.1.2 Digestibilidade da cana-de-açúcar hidrolisada ........................................ 5 2.1.2.1 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ................................. 6 2.2 Palha da cana-de-açúcar como forragem ..................................................... 7 3. Objetivos gerais .................................................................................................. 9 4. Referências ...................................................................................................... 10 CHAPTER 2 – EVALUATING THE INFLUENCE OF STRAW AND THE TIME OF LIME PREPARATION BEFORE THE HYDROLYSIS OF SUGARCANE ................................................................................... 13 ABSTRACT ............................................................................................................... 13 RESUMO................................................................................................................... 14 1. Introduction ....................................................................................................... 15 2. Material and methods ....................................................................................... 16 3. Results and discussion ..................................................................................... 19 4. Conclusions ....................................................................................................... 32 xi 5. Acknowledgments ............................................................................................. 32 6. References ........................................................................................................ 32 CHAPTER 3 – EVALUATING THE INFLUENCE OF STRAW AND TIME OF LIME PREPARATION BEFORE THE HYDROLYSIS OF SUGARCANE ON NUTRIENT DIGESTIBILITY AND PERFORMANCE OF DAIRY COWS ............................................... 35 ABSTRACT ............................................................................................................... 35 RESUMO................................................................................................................... 36 1. Introduction ....................................................................................................... 37 2. Material and methods ........................................................................................ 38 2.1 Location and management ......................................................................... 38 2.2 Experiment 1 – in vitro digestibility .............................................................. 39 2.2.1 Treatments ............................................................................................. 39 2.2.2 Procedures and data collection .............................................................. 39 2.2.3 Statistical analysis .................................................................................. 40 2.3 Experiment 2 – Performance ...................................................................... 40 2.3.1 Diet and animals ..................................................................................... 41 2.3.2 Treatments ............................................................................................. 42 2.3.3 Procedures and data collection .............................................................. 42 2.3.4 Statistical analysis .................................................................................. 43 3. Results and discussion ..................................................................................... 44 3.1 Experiment 1 – In vitro digestibility .............................................................. 44 3.2 Experiment 2 – Performance ...................................................................... 45 4. Conclusions ....................................................................................................... 50 5. References ........................................................................................................ 50 CHAPTER 4 – FINAL CONSIDERATIONS ............................................................... 54 APPENDIX ................................................................................................................ 55 Internship report at Swedish University of Agricultural Sciences .......................... 55 ABSTRACT ............................................................................................................... 55 RESUMO................................................................................................................... 56 xii 1. Introduction ....................................................................................................... 57 2. Background of the project ................................................................................. 58 3. Presentation of the project ................................................................................ 59 4. Material and methods ........................................................................................ 59 4.1 Animals ....................................................................................................... 59 4.2 Handling of animals .................................................................................... 60 4.3 Diet and treatments ..................................................................................... 60 4.4 Sampling protocol ....................................................................................... 61 4.5 Pasture management and measures (grazing season) .............................. 61 4.6 Experimental design ................................................................................... 63 5. Preliminary results ............................................................................................. 63 5.1 Early lactation ............................................................................................. 63 5.2 Mid lactation ................................................................................................ 64 6. Activity report .................................................................................................... 66 6.1 Field experiments ........................................................................................ 66 6.2 Laboratory ................................................................................................... 66 6.3 Conferences, courses, seminars, lectures and other .................................. 66 7. Conclusions ....................................................................................................... 73 xiii INFLUÊNCIA DA PALHA E DO TEMPO DE PREPARO DA CALDA ANTES DA HIDRÓLISE DA CANA-DE-AÇÚCAR EM DIETAS DE VACAS LEITEIRAS RESUMO RESUMO – A cana-de-açúcar tem papel importante no agronegócio brasileiro para a produção de etanol e açúcar. A palha da cana-de-açúcar é um resíduo orgânico pobre em sacarose para produção de etanol e de baixo valor nutritivo para a alimentação animal. Devido a isso, o processo de queima dos canaviais ocorre em larga escala com intuito de facilitar a colheita da cana-de-açúcar, além de limpar o canavial para a próxima safra. Entretanto, a queima causa danos à saúde e impacto ambiental. No estudo foram avaliados dois fatores da cana-de-açúcar: a influência da palha e a influência dos tempos de preparo da calda de hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) antes da hidrólise da cana-de-açúcar. Os parâmetros avaliados neste estudo foram: composição bromatológica, temperatura e pH da cana-de-açúcar, digestibilidade de nutrientes, desempenho de vacas leiteiras e uso de imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) da cana-de-açúcar antes e após a digestão in vitro. O primeiro estudo foi um arranjo fatorial 2 x 5 [cana-de-açúcar com ou sem palha e cinco tempos de preparo da calda de Ca(OH)2 antes da hidrólise da cana-de-açúcar (72, 48, 24, 0,5 horas e sem preparo)]. No segundo estudo foi avaliado a digestibilidade in vitro dos nutrientes em um delineamento inteiramente casualizado, com cinco tratamentos: cana-de-açúcar fresca sem palha, HPT0,5 (cana-de-açúcar hidrolisada com palha e a calda preparada 0,5 horas antes da hidrólise), HPT72 (cana-de-açúcar hidrolisada com palha e a calda preparada 72 horas antes da hidrólise), HT0,5 e HT72, cana-de-açúcar hidrolisada sem palha usando os mesmos procedimentos de preparo da calda na cana-de-açúcar com palha. Posteriormente, utilizou-se um delineamento em quadrado latino 5 x 5 (cinco vacas em lactação e cinco tratamentos) para estudo de desempenho. Imagens de MEV foram feitas como complemento para visualização da cana-de-açúcar com e sem digestão in vitro. Como resultados, a cana-de-açúcar fresca sem palha e hidrolisada com palha e a calda preparada 72 horas antes apresentou menor teor de fibra em detergente neutro (FDN). O pH da cana-de-açúcar hidrolisada, devido à presença do agente alcalinizante foi maior em comparação à cana-de-açúcar fresca independente da palha. A temperatura foi influenciada pela palha, apresentando-se maior quando esta estava presente. Em relação à digestibilidade dos nutrientes, a cana-de-açúcar hidrolisada com palha, quando comparada à hidrolisada sem palha, apresentou menor digestibilidade in vitro de matéria seca (MS) e maior digestibilidade in vitro da FDN. Para o desempenho das vacas, houve menor consumo de MS para a cana-de-açúcar com palha em comparação à cana-de- açúcar sem palha. A produção de leite manteve-se constante entre os tratamentos, assim como a sua composição. Nas imagens da MEV, algumas pequenas partículas de cana-de-açúcar que foram observadas nas amostras não digerida, após a digestão in vitro parecem ter sofrido alguma digestão. O que permaneceu foram partículas maiores, ou seja, partículas indigestíveis. A utilização da cana-de-açúcar com palha e a calda de Ca(OH)2 preparada 72 horas antes da hidrólise é recomendada devido à melhor eficiência alimentar das vacas, além de facilitar a mão-de-obra. Palavras-chave: eficiência alimentar, hemicelulose, pH, temperatura xiv INFLUENCE OF STRAW AND TIME OF LIME PREPARATION BEFORE THE HYDROLYSIS OF SUGARCANE IN DAIRY COW DIET ABSTRACT ABSTRACT – Sugarcane has an important role in agribusiness because of ethanol and sugar production. Straw of sugarcane is an organic residue, it has low nutritional value to animal feed and a poor sucrose content which is used to produce ethanol. Because of this, burning of the sugarcane is performed on a large scale aiming to facilitate the sugarcane harvest, besides cleaning the sugarcane fields for the next crop. Burning, however, is not safe for health and causes harmful environmental impact. The study evaluated two sugarcane factors: the influence of straw and the time of lime preparation on the sugarcane hydrolysis. The variables analyzed on this study were: chemical composition, temperature and pH of sugarcane, nutrient digestibility, performance of dairy cows and the use of scanning electron microscopy (SEM) images of sugarcane before and after in vitro digestion. First study was arranged as a factorial 2 x 5 [sugarcane with or without straw and five times of the lime preparation before hydrolysis of sugarcane (72, 48, 24, 0.5 hours and no lime used)]. The lime used was calcium hydroxide (Ca(OH)2. In the second study the in vitro digestibility of nutrients was evaluated and arranged as a completely randomized design with five treatments: fresh sugarcane without straw, HST0.5 (hydrolyzed sugarcane with straw and the lime prepared 0.5 hours before the hydrolysis), HST72 (hydrolyzed sugarcane with straw and the lime prepared 72 hours before the hydrolysis), HT0.5 (hydrolyzed sugarcane without straw and the lime prepared 0.5 hours before the hydrolysis) and HT72 (hydrolyzed sugarcane without straw and the lime prepared 72 hours before the hydrolysis). Posteriorly, a Latin square design 5 x 5 five lactating cows and five treatments was arranged for performance of dairy cows. As complement, SEM images of sugarcane before and after the in vitro digestion were done. As results, fresh sugarcane without straw and hydrolyzed with straw and the lime prepared 72 hours in advance presented lower neutral detergent fiber (NDF) content. The pH of hydrolyzed sugarcane was higher compared to fresh sugarcane, due to the presence of the alkalizing agent, regardless of straw. Temperature was higher when the straw was present. Regarding the digestibility of nutrients, sugarcane with straw showed lower in vitro digestibility of dry matter (DM) and higher in vitro digestibility of NDF compared with hydrolyzed sugarcane. For the cow’s performance, a lower DM intake was observed for sugarcane with straw compared with sugarcane without straw. Milk production was similar among treatments, as well as its composition. Providing sugarcane with straw and the lime of Ca(OH)2 prepared 72 hours before hydrolysis of sugarcane is recommended because it provided better feed efficiency to the cows. Additionally, it facilitates the labor. Keywords: feed efficiency, hemicellulose, pH, temperature xv TABLE LIST Page CHAPTER 2 Table 1. Unfolding the interaction, straw and time of lime preparation of neutral detergent fiber ash-free (NDFa) of sugarcane (g/kg in DM basis) 22 Table 2. Unfolding the interaction, straw and time of lime preparation of non-fiber carbohydrates (NFC) of sugarcane (g/kg in DM basis) 23 Table 3. Unfolding the interaction, straw and time of lime preparation of total carbohydrates (TC) of sugarcane (g/kg in DM basis) 24 Table 4. Unfolding the interaction, straw and time of lime preparation of ash of sugarcane (g/kg in DM basis) 25 Table 5. Unfolding the interaction, time of lime preparation within treatment for pH 28 CHAPTER 3 Table 1. Chemical composition of concentrate and sugarcane (g/kg in DM basis) 41 Table 2. Chemical composition of the diets (ratio roughage concentrate, 50:50) (g/kg in DM basis) 41 Table 3. Percentages of in vitro dry matter (IVDMD), neutral detergent fiber (IVNDFD) and acid detergent fiber (IVADFD) digestibilities of sugarcane under treatments 45 Table 4. Nutrient intake (kg/day) of cows fed sugarcane according to treatments 46 Table 5. Milk production and composition from dairy cows fed the experimental diets 47 Table 6. Blood parameters according to treatments 48 CHAPTER 4 Table 1. Intake and milk production average of early lactation (1-3 64 xvi months) Table 2. Intake and milk production average of first lactation month 64 Table 3. Intake and milk production average of second lactation month 64 Table 4. Intake and milk production average of third lactation month 64 Table 5. Intake and milk production average of mid lactation (4-7 months) 65 Table 6. Intake and milk production average of fourth lactation month 65 Table 7. Intake and milk production average of fifth lactation month 65 Table 8. Intake and milk production average of sixth lactation month 65 Table 9. Intake and milk production average of seventh lactation month 66 FIGURE LIST Page CHAPTER 2 Figure 1. Specimen holder with the double-sided copper tape and sugarcane samples (1.0 mm particle size) 19 Figure 2. Machine (JEOL JFC 1100) on the left and scanning electron microscope on the right (JSM5410) 19 Figure 3. Chemical composition of sugarcane with or without straw. Dry matter (DM), neutral detergent fiber ash-free (NDFa), acid detergent fiber (ADF), non-fiber carbohydrates (NFC), total carbohydrates (TC) and ash (g/kg in DM basis). Tukey test (p<0.05) 20 Figure 4. Chemical composition of fresh sugarcane or hydrolyzed sugarcane (mean ± SEM) using the lime prepared 72h, 48h, 24h and 0.5h before the hydrolysis: (a) dry matter (DM) and neutral detergent fiber ash-free (NDFa), (b) acid detergent fiber (ADF), (c) non-fiber carbohydrates (NFC), total carbohydrates (TC) and ash (g/kg in DM basis) 21 xvii Figure 5. Interaction of straw and time of lime preparation of neutral detergent fiber ash-free (NDFa) of sugarcane (g/kg in DM basis) (mean ± SEM). Treatments: Fresh sugarcane i.e. no lime used, HT0.5, HT24, HT48, HT72, i.e. hydrolyzed sugarcane and time 0.5, 24, 48 and 72 hours of lime preparation before the hydrolysis. Different capital letters are significantly different between straw. Different small letters are significantly different between the times of lime preparation before the hydrolysis, Tukey test 22 Figure 6. Interaction of straw and time of lime preparation of non fiber-carbohydrates (NFC) of sugarcane (g/kg in DM basis) (mean ± SEM). Treatments: Fresh sugarcane i.e. no lime used, HT0.5, HT24, HT48, HT72, i.e. hydrolyzed sugarcane and time 0.5, 24, 48 and 72 hours of lime preparation before the hydrolysis. Different capital letters are significantly different between straw. Different small letters are significantly different between the times of lime preparation before the hydrolysis, Tukey test 23 Figure 7. Interaction of straw and time of lime preparation of totan carbohydrates (TC) of sugarcane (g/kg in DM basis) (mean ± SEM). Treatments: Fresh sugarcane i.e. no lime used, HT0.5, HT24, HT48, HT72, i.e. hydrolyzed sugarcane and time 0.5, 24, 48 and 72 hours of lime preparation before the hydrolysis. Different capital letters are significantly different between straw. Different small letters are significantly different between the times of lime preparation before the hydrolysis, Tukey test 24 Figure 8. Interaction of straw and time of lime preparation of ash of sugarcane (g/kg in DM basis) (mean ± SEM). Treatments: Fresh sugarcane i.e. no lime used, HT0.5, HT24, HT48, HT72, i.e. hydrolyzed sugarcane and time 0.5, 24, 48 and 72 hours of lime preparation before the hydrolysis. Different 25 xviii capital letters are significantly different between straw. Different small letters are significantly different between the times of lime preparation before the hydrolysis, Tukey test Figure 9. pH values (mean ± SEM) according to the treatments over time 26 Figure 10. pH values (mean ± SEM) according to the treatments. Treatments: Fresh sugarcane i.e. no lime used, HT0.5, HT24, HT48, HT72, i.e. hydrolyzed sugarcane and time 0.5, 24, 48 and 72 hours of lime preparation before the hydrolysis 26 Figure 11. pH values of sugarcane (mean ± SEM) (a) with or (b) without straw, using the lime prepared 72h, 48h, 24h and 0.5h before the hydrolysis 27 Figure 12. Internal and external temperatures (mean ± SEM) according to the treatments over time 28 Figurre 13. Internal temperature of sugarcane (mean ± SEM) with (a) or without (b) straw, using the lime prepared 72h, 48h, 24h and 0.5h before the hydrolysis. External temperature of sugarcane with (c) or without (d) straw, using the lime prepared 72h, 48h, 24h and 0.5h before the hydrolysis 29 Figure 14. Fresh sugarcane (a) and (b), hydrolyzed sugarcane with straw (c) and (d), hydrolyzed sugarcane without straw (e) and (f) 31 CHAPTER 4 Page Figure 1. Regression equation made during summer season at the experimental farm belonging to SLU, 2013 62 xix Certificado da comissão de ética no uso de animais 1 CAPÍTULO 1 – Considerações gerais 1. Introdução A cana-de-açúcar tem importante impacto no agronegócio brasileiro e com isso, altas tecnologias são empregadas anualmente para o desenvolvimento da produção. A sustentabilidade é tema atual e vem ganhando espaço tanto no mercado, quanto na comunidade científica. Com isso, a busca do aproveitamento de todo e qualquer tipo de resíduo gerado pelas culturas é pertinente. A palha da cana- de-açúcar é um resíduo agrícola, produzido em larga escala nos canaviais, e tem gerado preocupação de produtores por ser um resíduo pobre em carboidratos solúveis para produção de etanol (primeira geração) e pobre em nutrientes para produção animal. A prática de queima da palha da cana-de-açúcar vem sendo proibida nos últimos anos em âmbito regional, estadual e nacional devido, principalmente, aos malefícios que esta prática provoca à saúde humana, animal, bem como ao meio ambiente. Há constante esforço na redução das queimadas da palha da cana-de-açúcar devido à busca da sustentabilidade nos sistemas de produção. Com a diminuição e proibição das queimadas, surge um problema, a excessiva quantidade de palha que permanece nos canaviais sem destino aparente. Alguma palha é utilizada para manutenção do solo para a safra seguinte de cana-de-açúcar, mesmo assim, a quantidade que permanece sem destino ainda é grande. Para se ter uma ideia, a produção de palha nos canaviais é de aproximadamente 12 toneladas de palha por hectare em revisão feita por Santos e colaboradores sobre o opotencial da palha da cana-de-açúcar para produção de etanol. O uso da palha para a produção de energia dentro da própria usina é um destino interessante do ponto de vista econômico e de sustentabilidade. Além da produção de etanol de segunda geração e a produção de papel a baixo custo a partir da palha da cana-de-açúcar. O fornecimento da cana-de-açúcar como volumoso para os animais geralmente é recomendada para pequenos e médios produtores. Nestes casos, normalmente o corte da cana-de-açúcar é manual com uso de facão ou mecânico com uso trator para os pequenos e médios produtores, 2 respectivamente. Economicamente, não se justifica o transporte da palha que permanece nestes canaviais para produção de energia ou etanol de segunda geração. Diante disso, o setor de produção animal sente-se estimulado a desenvolver estudos que utilize este resíduo agrícola na alimentação animal para produção de leite. É uma tarefa de todas as áreas pesquisar mais sobre os resíduos agrícolas e encontrar destinos economicamente e logisticamente aplicáveis. 2. Revisão de literatura 2.1 Cana-de-açúcar na alimentação de ruminantes A cana-de-açúcar é uma forrageira de clima tropical, e vem ganhando interesse pelos produtores por apresentar custo de produção reduzido, boa disponibilidade nos períodos de escassez de forragem, além de possuir altos teores de matéria seca e energia (Oliveira, 2010). Para a escolha da variedade de cana-de-açúcar na alimentação animal, Siqueira et al. (2012) recomendam utilizar variedades que apresentem alta digestibilidade da fração fibrosa e boa produção de massa. Como exemplo temos as variedades de cana-de-açúcar IAC 86-2480 e a IACSP 93-3046. A maior produção de matéria seca digestível por hectare é uma característica importante na escolha da variedade de cana-de-açúcar, pois leva em conta aspectos quantitativos e qualitativos (Siqueira et al., 2012). Além do baixo teor de proteína bruta (PB) da cana-de-açúcar, o seu modo de fornecimento limita o uso na alimentação animal pela necessidade de cortes diários. Esta prática se torna inviável por não haver mão-de-obra disponível e/ou equipamentos adequados para a realização desta tarefa. Como alternativa para os produtores, a hidrólise da cana-de-açúcar com cal virgem (CaO) ou hidratada (Ca(OH2)) prolonga o tempo de armazenamento do volumoso. Este procedimento atua na melhoria da digestibilidade da cana-de-açúcar ao agir na porção fibrosa da parede celular (Oliveira, 2010). A ação do agente alcalinizante eleva a taxa de digestão da fibra presente na cana-de-açúcar, provavelmente devido as quebras nas ligações das frações do complexo celulose-hemicelulose-lignina, tornando-as mais disponíveis para os microrganismos ruminais. 3 Segundo Jackson (1977) e Klopfenstein (1980), a celulose quando tratada com agentes alcalinizantes, sofre expansão e quebra das ligações intermoleculares das pontes de hidrogênio, que ligam essas moléculas. Coombre (1979) relatou que os produtos alcalinos provocaram redução na fibra em detergente neutro (FDN) devido à solubilização de parte da hemicelulose (HEM). Segundo este mesmo autor, a celulose se torna mais degradável no ambiente ruminal também em função da sua deslignificação. A ação hidrolisante dos agentes alcalinos no sentido de reduzir os teores de FDN, HEM e de fibra em detergente ácido (FDA) da cana-de-açúcar já é bastante antiga e está relacionada com a melhoria na digestibilidade e no aumento do consumo, o que possibilita melhor desempenho animal. 2.1.1 Desempenho de vacas leiteiras alimentadas com cana-de-açúcar hidrolisada O desempenho animal está relacionado com o seu consumo de matéria seca e a produção. O consumo de alimentos determina o nível de nutrientes ingeridos, com efeito sobre a resposta animal (Van Soest, 1994). Entender os mecanismos que controlam o consumo de alimentos é importante, pois dependerá da quantidade total de nutrientes que o animal deverá receber para o crescimento, a saúde e a produção (Berchielli et al., 2011). A quantidade de nutrientes absorvidos está sujeita a variações tanto da digestibilidade dos nutrientes quanto no seu consumo. O consumo é regulado pelo alimento quanto a sua densidade energética, teor de nutrientes, necessidade de mastigação, capacidade de enchimento e regulado pelo animal quanto ao peso corporal, ao estado fisiológico e ao nível de produção, além das condições de alimentação, como o espaço no comedouro, a disponibilidade de alimento, o tempo de acesso aos alimentos e frequência de alimentação (Mertens, 1992). Corrêa et al. (2003) avaliaram o desempenho de vacas holandesas alimentadas com cana-de-açúcar ou silagem de milho de diferentes texturas de grão. Como resultados, obtiveram redução no consumo, na digestibilidade da FDN e na produção de leite em vacas alimentadas com cana-de-açúcar em comparação às vacas que receberam silagem de milho, porém a digestibilidade da matéria orgânica 4 foram semelhantes entre os tratamentos. Os autores concluíram que a cana-de- açúcar, como volumoso, na dieta aparenta ser boa alternativa para vacas em lactação nas fases de menor demanda nutricional. Ao avaliarem o desempenho produtivo de vacas mestiças Girolanda, com média de 508 kg de peso corporal, alimentadas com cana-de-açúcar fresca e hidrolisada, Alves et al. (2010) não encontraram diferença no consumo de matéria seca (MS) entre os tratamentos. Porém, vacas alimentadas com cana-de-açúcar hidrolisada apresentaram maior produção de leite (16,5 litros/dia) quando comparadas às vacas alimentadas com cana-de-açúcar fresca (14,8 litros/dia), ou seja, aumento de 10,4% na produção de leite. Estes resultados demonstram melhor aproveitamento dos nutrientes quando a cana-de-açúcar foi hidrolisada. A avaliação de diferentes volumosos na dieta de vacas mestiças (Holandesa x Gir) com 14,4% de PB e produção média de leite de 13,60 kg/dia, Martins et al. (2011) encontraram maior consumo de MS para a cana-de-açúcar (17,8 kg/dia) em comparação à silagem de girassol (13,3 kg/dia), maior consumo de carboidratos não fibrosos (7,3 kg/dia) em relação à silagem de girassol (3,6 kg/dia), à silagem de sorgo (1,8 kg/dia) e ao capim-tanzânia (1,9 kg/dia). Estes mesmos autores encontraram menor consumo de FDN da cana-de-açúcar (5,8 kg/dia) em comparação à silagem de sorgo (10,6 kg/dia) e ao capim-tanzânia (11,6 kg/dia). No desempenho de vacas leiteiras mestiças (Holandesa x Gir) alimentadas com cana- de-açúcar associada à ureia e tratada com cal virgem e 13,1% de PB, Silva Junior et al. (2015) encontraram 11,9 kg/dia para consumo de MS, 4,9 kg/dia de consumo de FDN e 13,5 kg de produção de leite. O aumento na produção de leite em si não significa muito se a sua qualidade for prejudicada com o uso do alimento testado. O leite é constituído de aproximadamente 87% de água e 13% de sólidos totais (todos os elementos do leite, menos a água). Dos sólidos totais, aproximadamente 3,5% são de proteínas, 3,6% de gordura, 4,9% de lactose e 0,7% de cinzas (minerais) (PRATA, 2001). O leite é levemente ácido, com pH variando de 6,5 a 6,7. Trabalhos têm demonstrado semelhante produção e composição do leite de vacas alimentadas com cana-de- açúcar hidrolisada em comparação com a dieta padrão com silagem de milho e outros volumosos (CORRÊA et al., 2003, MARTINS et al., 2011). 5 2.1.2 Digestibilidade da cana-de-açúcar hidrolisada O tratamento químico de volumosos é relativamente antigo e a utilização de agentes alcalinizantes é realizada com o intuito de melhorar a digestibilidade e o consumo de alimentos fibrosos (Ezequiel et al., 2005). Outro propósito é aumentar o tempo de armazenamento da cana-de-açúcar, dispensando necessidade de cortes diários (Oliveira, 2010). O hidróxido de cálcio é um agente alcalinizante de fácil aplicação e de custo baixo quando comparado ao hidróxido de sódio, mas a digestibilidade da cana-de-açúcar é menor quando esta é hidrolisada com o Ca(OH)2 (Rodrigues e Souza, 2005; Oliveira 2010). As variedades de cana-de-açúcar distinguem-se com a época de maturação, que pode ser precoce, média ou tardia. A época de colheita da cana-de-açúcar para o seu fornecimento aos animais é importante, pois quando colhida antes da maturação irá apresentar baixo teor de carboidratos solúveis e alto teor de fibras (Siqueira et al., 2012). A cana-de-açúcar apresenta baixa porcentagem de FDN (40-50%); porém a fração fibrosa indegradável da cana-de-açúcar é elevada (Siqueira et al., 2012). Como consequência, é observado baixo consumo devido ao enchimento ruminal. Sendo assim, o estudo da digestibilidade dos nutrientes dos alimentos fornecidos é importante e está relacionado com a cinética e a taxa de passagem da digesta pelo trato digestivo. Porém, a avaliação do seu valor nutritivo e as formas de aproveitamento pelo trato gastrintestinal ainda permanecem como um desafio para os pesquisadores da área de nutrição animal. A digestão é o processo de quebra das macromoléculas de nutrientes em compostos mais simples (Van Soest, 1994). Estes compostos mais simples são absorvidos pelo trato gastrintestinal dos animais. As medidas de digestibilidade qualificam os alimentos quanto ao seu valor nutritivo. É expressa pelo coeficiente de digestibilidade e indica a quantidade percentual de cada nutriente que o animal pode aproveitar. Alguns trabalhos têm analisado o efeito da cal virgem ou hidratada na estabilidade, na composição bromatológica da cana-de-açúcar e na digestibilidade dos nutrientes (Silva et al., 2006; Oliveira et al., 2007; Oliveira et al., 2008; Domingues, 2009; Oliveira, 2010). Após a aplicação da cal, observaram melhora 6 tanto na estabilidade, quanto na DIVMS e na composição bromatológica (redução nos teores de FDN, FDA e de HEM). Apesar dos benefícios citados, há necessidade de estudos visando o efeito do tempo de preparo da calda para uso na hidrólise da cana-de-açúcar, assim como o efeito da palha para a hidrólise. Segundo Oliveira (2010) vários fatores interferem na hidrólise, no entanto, não foram relatadas informações bibliográficas sobre a relação tanto do tempo do preparo da suspensão da calda quanto da influencia da palha na eficiência da hidrólise da cana-de-açúcar. Assim, torna-se oportuna a realização de estudos para entender a ação de tais fatores sobre a hidrólise da cana-de-açúcar. Este aspecto é importante, pois muitos produtores preparam a calda com antecedência para facilitar as operações relacionadas com a hidrólise e alguns utilizam picadeiras móveis (cana-de-açúcar integral picada). Todavia, os produtores rurais, principalmente produtores de leite, utilizam picadeiras fixas (normalmente despalham a cana-de- açúcar antes de picá-la). Portanto, é importante o conhecimento sobre até que ponto esses procedimentos podem interferir na hidrólise da cana-de-açúcar. 2.1.2.1 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) Além de análises em laboratório que quantificam os teores de fibras do volumoso, existe a técnica de microscopia eletrônica de varredura (MEV) que tem sido utilizada, segundo Lempp (2007), para estabelecer uma base entre a parede celular e a digestibilidade de forragens, pois proporciona profundidades de campo muito maiores, possibilitando a observação e registro de imagem tridimensional (SANTOS, 1995). A MEV permite esclarecer o processo de quebra das fibras, possibilitando a identificação e até mesmo a quantificação de substratos provenientes da degradação da forragem. Lempp (2007) em sua revisão sobre a MEV na avaliação de alimentos para ruminantes, estudou forragens tropicais, milho para ensilagem, tratamento de resíduos agrícolas (bagaço de cana-de-açúcar), leguminosas (alfafa), forragens com tanino e milho grão. Este tipo de estudo em forrageiras visa apurar o efeito da anatomia na digestibilidade e fornece informações sobre os fatores que interferem na qualidade das forragens. Lempp (1997) verificou, com a MEV, que a parede celular da 7 gramínea Paniccum maximum, cv. Vencedor apresentou-se mais rígida em relação à cv. Aruana, sem verificar diferenças na composição bromatológica entre estas cultivares. Jung e Casler (2006) estudaram a degradabilidade in vitro e a micrografia do resíduo da incubação in vitro (24 e 96h) do entrenó do milho em diferentes fases de desenvolvimento, e observaram que o aumento da parede celular no entrenó do milho foi associado ao espessamento da parede celular secundária na região do córtex e identificaram também as regiões não degradadas (córtex) e regiões parcialmente degradadas (medular) pelas imagens obtidas a partir da fotomicrografia. Ao observarem o efeito do tratamento com hidróxido de sódio (NaOH) e bicarbonato de amônia (NH4HCO3) no colmo de palha de arroz, Wang et al. (2006) perceberam que com o tratamento com NH4HCO3, houve aumento da ruptura da camada de cutícula, mas a epiderme permaneceu inalterada. Já com o NaOH, a camada da cutícula se dissolveu, resultando em degradação da epiderme. A avaliação com uso da microscopia é importante, pois nem sempre a análise química e a digestibilidade são capazes de elucidar todas as variações no consumo das forrageiras pelos ruminantes (LEMPP, 2007). Técnicas de microscopia eletrônica de varredura possibilita maiores esclarecimentos das relações de causa e efeito na degradabilidade das forragens, assim como sua escolha em relação ao potencial qualitativo (FERRARI, 2013). Há escassez de trabalhos com a técnica da MEV para melhor compreender a ação de agentes alcalinizantes na cana-de-açúcar, o que dificulta a discussão e interpretação das imagens (FERRARI, 2013). 2.2 Palha da cana-de-açúcar como forragem A nomenclatura do resíduo agrícola da cana-de-açúcar apresenta falta de padronização do que seria a palha, a palhada ou o palhiço (Ripoli e Gamero, 2007). O palhiço da cana-de-açúcar é o material remanescente no canavial após a colheita. É constituído de folha verde, folha seca, ponteiro e pedaços de colmo industrializáveis ou não (Ripoli e Gamero, 2007). A palha (folha seca) constitui de uma parte do palhiço. Do ponto de vista industrial, a palha é caracterizada como 8 toda a parte aérea da planta (ponteiro), constituído por folha verde e folha seca; porém, do ponto de vista de produção animal, a palha é caracterizada como sendo a folha seca. A palha da cana-de-açúcar é constituída principalmente de 40-44% de celulose, 30-32% de hemicelulose e 22-25% de lignina (Santos et al., 2012). A oferta de forragem para a produção animal sofre variações ao longo do ano. No inverno é o período de maior escassez de forragem devido à baixa temperatura e, principalmente, por caracterizar um período seco. Com isso, o custo de produção se eleva devido à necessidade de obtenção de concentrados e silagens de alto custo. Uma interessante alternativa para evitar, ou então minimizar estas variações de oferta de forragem é o uso de alimentos alternativos de baixo custo. O uso de resíduos agrícolas, como a palha, na alimentação de ruminantes deve ser levado em consideração. O animal ruminante é capaz de aproveitar o material fibroso presente em forragens devido à fermentação microbiana que ocorre no rúmen. O produto desta fermentação são os ácidos graxos voláteis (ácido acético, propiônico e butírico) que serão utilizados pelo animal como fonte de energia para produção. Apesar da escassez de trabalhos bibliográficos que abordam a palha da cana- de-açúcar na alimentação de ruminantes, Rodrigues e Souza (2005) descreveram bem este resíduo agrícola. É um volumoso de baixo valor nutricional, portanto, não pode ser fornecido como alimento único na dieta. Nas épocas de escassez de forragem, o uso da palha é interessante por diminuir o custo da dieta. A palha, que é um resíduo lignocelusósico, apresenta alto teor de parede celular (celulose, hemicelulose e lignina), baixo teor de proteína bruta e minerais, principalmente fósforo e enxofre. Para melhor aproveitamento das palhadas pelos ruminantes, pesquisadores sugerem, primeiramente, a correção nutricional da palhada antes de qualquer tipo de tratamento da forragem, seja ele biológico, químico ou físico. Para a correção nuticional da palha da cana-de-açúcar, deve-se levar em consideração o suprimento de energia e proteína na dieta de forma balanceada. O balanceamento entre energia e proteína é exigido pelos microrganismos do rúmen para a síntese de proteína microbiana. O tratamento do resíduo agrícola tem como principal objetivo aumentar a digestibilidade das fibras, além de aumentar o consumo de matéria seca. O baixo valor nutritivo da palha é devido ao incrustamento da 9 parede celular pela lignina (RODRIGUES e SOUZA, 2005). Tratamentos químicos da palha com uso de hidróxido de sódio, de cálcio, de potássio e de amônio, por serem produtos alcalinos, acabam hidrolisando a lignina, causando expansão das fibras. O resutaldo é aumento da digestibilidade da celulose e hemicelulose (RODRIGUES e SOUZA, 2005). Carvalho et al. (2010) ao estudarem a digestibilidade in vitro da fibra em detergente neutro (DIVFDN), encontraram 11,9% para digestibilidade dos colmos e 23,9% para digestibilidade das folhas. Entretanto, o teor de FDN do colmo foi de 38,2% e das folhas de 68,7%. Os valores de digestibilidade da palha não foi considerado, mas provavelmente, segundo Siqueira et al. (2012), possuía teores de FDN superiores aos da folha. Os ruminantes, com seu sistema digestivo compartimentado, são capazes de ulitizar as palhadas quando corretamente suplementados com fontes de nitrogênio e minerais. Souza e Cardoso (2003) afirmaram que a identificação de alternativas no uso da palhada no Brasil representa considerável desafio econômico, ambiental e, sobretudo, técnico-científico. 3. Objetivos gerais O objetivo do primeiro estudo foi avaliar a influência da palha e dos tempos de preparo da calda de hidróxido de cálcio antes da hidrólise da cana-de-açúcar na composição bromatológica e nos valores de pH e temperatura. O segundo estudo objetivou avaliar a digestibilidade dos nutrientes, o desempenho produtivo a composição do leite de vacas leiteiras alimentadas com os tratamentos obtidos a partir dos melhores resultados bromatológicos no primeiro estudo. Como estudo complementar, imagens de microscopia eletrônica de varredura foram feitas e avaliou-se a ação da digestão in vitro e do hidróxido de cálcio na cana-de-açúcar com ou sem palha. 10 4. Referências ALVES, A.C.N. Desempenho produtivo de vacas mestiças alimentadas com cana- de-açúcar hidrolisada e “in natura”. 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Doi: 0.1016/j.anifeedsci.2006.08.017. 13 CHAPTER 2 – Evaluating the influence of straw and the time of lime preparation before the hydrolysis of sugarcane ABSTRACT ABSTRACT – This study aimed to evaluate the influence of straw and the time of lime preparation before the hydrolysis of sugarcane on the chemical composition, pH and temperature of sugarcane. A completely randomized 2 x 5 factorial design with four replications for each of the ten combinations of the two factors (n=40) was used. Treatments were two ways of use chopped sugarcane (with or without straw), and five times of lime preparation before the hydrolysis of sugarcane (72h, 48h, 24h, 0.5h and no lime preparation for fresh sugarcane). Calcium hydroxide [Ca(OH)2] was the lime used. Chemical composition of sugarcane was analyzed nine hours after the hydrolysis process. Internal and external temperatures of the stacks of sugarcane as well as pH were measured 0.5h, 3h, 6h and 9h after hydrolysis. In general, the highest neutral detergent fiber ash-free values were obtained for sugarcane with straw treatments (450 g/kg) compared to sugarcane without straw (412 g/kg). Hence higher residual of Ca(OH)2 remained in the container used to prepare the suspension. Fresh sugarcane had lower ash (36.2 g/kg) due to non-use of additive Ca(OH)2 with mineral properties. The pH of hydrolyzed sugarcane decreased as time increased (0.5h, 3h, 6h and 9h), from 11.3 to 9.1 and fresh sugarcane was similar as time increased with average of 5.3. Sugarcane with straw did not have different pH values compared to sugarcane without straw. After 9 hours of hydrolysis, sugarcane with straw had higher internal (18.6oC) and external (21.1oC) temperatures than without straw (14.3 and 15.4oC). From the chemical composition point of view, fresh sugarcane without straw and hydrolyzed sugarcane with straw using the lime prepared 72 hours before the hydrolysis can be used to feed cows because, in general, provided lower neutral detergent fiber. Hydrolyzed sugarcane has some advantages such as the possiblility to store it, facilitating the labor. Additionally, it provides lower temperatures of the stacks of sugarcane and higher pH which is interesting for conservation. Keywords: chemical composition, pH, temperature 14 Influência da palha e do tempo de preparo da calda antes da hidrólise da cana- de-açúcar RESUMO RESUMO – O estudo teve como objetivo avaliar a influência da palha da cana-de-açúcar e do tempo de preparo da calda antes da hidrólise da cana-de- açúcar a fim de verificar seus efeitos na composição bromatológica, pH e temperatura da canad-de-açúcar. Foi utilizado um delineamento inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2 x 5, com quatro repetições para cada uma das 10 combinações dos dois fatores (n=40). Os tratamentos foram, duas formas de utilização da cana-de-açúcar picada (com e sem palha) e cinco tempos de preparo da calda antes da hidrólise (72h, 48h, 24h, 0,5h e sem preparo para cana-de-açúcar fresca). A cal utilizada foi o hidróxido de cálcio (Ca(OH)2). Após o processo de hidrólise da cana-de-açúcar, foram feitas as análises bromatológicas. Foram mensuradas as temperaturas interna e externa, e o pH dos amontoados de cana-de- açúcar durante os tempos 0,5h, 3h, 6h e 9h após a hidrólise. Em geral, os valores de fibra em detergente neutro livre de cinzas foram maiores para a cana-de-açúcar com palha (450 g/kg) em comparação à cana-de-açúcar sem palha (412 g/kg). Sendo assim, maior Ca(OH)2 residual permaneceu no recipiente utilizado para preparar a calda. A cana-de-açúcar fresca apresentou menor teor de cinzas (36,2 g/kg) devido à ausência do aditivo Ca(OH)2 com propriedades minerais. O valor de pH da cana- de-açúcar hidrolisada diminuiu de 11,3 para 9,1 com o passar das horas (0,5h, 3h, 6h e 9h) e para a cana-de-açúcar fresca isto não aconteceu, sendo o pH médio 5,3. A cana-de-açúcar com palha não teve seus valores de pH alterados em comparação com a cana-de-açúcar sem palha. Após 9 h de hidrólise, a cana-de-açúcar com palha teve maior temperatura interna (18,6oC) e externa (21,1oC) que a cana-de- açúcar sem palha (14,3 e 15,4oC). Do ponto de vista de composição bromatológica, a cana-de-açúcar fresca sem palha e a cana-de-açúcar hidrolisada com palha e a calda preparada 72 horas antes da hidrólise pode ser usada na alimentação de vacas, pois proporciona menor fibra em detergente neutro. A cana-de-açúcar tem alguma vantagem, como a possibilidade de estocá-la, o que facilita a mão-de-obra. Além disso, possibilita menor temperatura dos amontoados de cana e maior pH, que é interessante para sua conservação. Palavras-chave: composição química, pH, temperatura 15 1. Introduction Sugarcane is a tropical roughage widely used in cattle production feed in Brazil. It has up to 60% of total digestible nutrient on a dry matter basis, which is interesting from the animal nutritional point of view (OLIVEIRA, 2010). Another positive aspect of sugarcane is the high production per hectare, 74.8 ton fresh matter (FM)/ha (CONAB, 2014), especially when forage is scarce (winter season). It has, however, few drawbacks: low crude protein content (up to 4.0% in DM basis) that requires protein supplementation and a need for daily harvest due to the high concentration of soluble carbohydrates. Due to this high concentration of soluble carbohydrates, the environment becomes favorable for the development of microorganisms that deteriorate the chopped sugarcane. The amount of neutral detergent fiber (57% in DM basis) is not a problem, but because of its low digestibility of the fibers, it becomes a drawback (SIQUEIRA et al., 2012). Previous studies have evaluated the effect of some additives such as calcium oxide (CaO) and calcium hydroxide (Ca(OH)2) on sugarcane stability and its chemical composition (RIBEIRO et al., 2009; MOTA et al., 2010; OLIVEIRA, 2010). They observed an improvement on sugarcane stability and chemical composition after using additives, such as lower amount of neutral detergent fiber (NDF), acid detergent fiber (ADF) and hemicelluloses (HEM). Several factors affect the hydrolysis process, e.g. particle size of chopped sugarcane and the lime type used for hydrolysis (OLIVEIRA, 2010). However, the influence of straw and lime preparation time on the efficiency of sugarcane hydrolysis has not been reported. Lime is prepared (by mixing the Ca(OH)2 with water) every day by producers to hydrolyze the sugarcane. If a large amount of lime is prepared and no loss is observed, then this procedure can be interesting for producers to facilitate the labor. It is already known, that the amount of straw in the sugarcane fields is considerably high and for long time was considered useless. Most of times, the straw is burned to eliminate it and also to facilitate the harvesting. This practice is common for small and medium producers. Burning, however, is not safe for the environment, human and animal health. Burning plants residues causes emissions of greenhouse 16 gases (GHG) such as carbon dioxide (CaO2), nitrous oxide (N2O) and methane (CH4) (CANÇADO et al., 2006). According to Bordonal et al. (2013), preliminary burning (burned harvest) of sugarcane fields is performed when the harvest is done manually. Sugarcane straw biomass accounts for 1/3 of the gross energy potential of sugarcane (SANTOS et al., 2012). São Paulo State Law no 11.241/2002, aims to eliminate the burned harvest until 2021.The Green Ethanol Protocol (Protocolo Etanol Verde) was an initiative of São Paulo state to anticipate the pre harvest burning of sugarcane to 2014, but in March, 2015 Federal Supreme Tribunal considered this practice unconstitutional. Some studies evaluated the potential of straw from sugarcane for ethanol production, and also the use of residual straw in ruminant feed (RODRIGUES; SOUZA, 2005 and SANTOS et al., 2012). This study aimed to evaluate the influence of straw and the time of lime preparation before the hydrolysis of sugarcane on chemical composition, pH and temperature. 2. Material and methods The IAC 86-2480 was the variety of sugarcane used, harvested at 18 months of growing, used with or without straw, and chopped in particle size of 1.0 cm average. A completely randomized 2 x 5 factorial design with four replications for each of the ten combinations of the two factors (n=40) was used. Treatments consisted in two ways of use chopped sugarcane (with or without straw), and five times of lime preparation before the hydrolysis of sugarcane, i.e., different times of mixing the Ca(OH)2 with water before hydrolysis process (72h, 48h, 24h, 0.5h and no lime was used for fresh sugarcane). The final product obtained after this mixing was named Ca(OH)2 suspension. Fresh sugarcane with or without straw was evaluated as control. Sugarcane with straw was harvested and immediately chopped using a tractor with a chopper of knives coupled. Sugarcane without straw was harvested manually using a machete, and the straw was removed around the sugarcane’ stems before to chopping with a fixed chopper of knives. The entire plant (stem, leaves and dry leaves, i.e. straw) was defined as sugarcane with straw, and sugarcane without straw 17 was defined as just stem and leaves. Sugarcane was hydrolyzed using 0.5% of Ca(OH)2, as fresh basis, i.e., for each 100 kg of fresh sugarcane, 0.5 kg of Ca(OH)2 diluted in 2 liters of water was used (OLIVEIRA, 2010). Chemical composition of the hydrolyser additive consisted of 94.1% of Ca(OH)2 and 1.5% of magnesium oxide. After harvesting of sugarcane, all the material obtained was then stored in a shed. The hydrolyzed sugarcane was obtained by spreading it on a tarp, forming a stack. After that, Ca(OH)2 suspension was poured over the sugarcane and the stack was revolved for homogenization. Fresh sugarcane did not receive any type of hydrolyser additive. All the stacks were identified with tags and each one was constituted by 30 kg of sugarcane. According to Oliveira (2010), eight hours of hydrolysis is enough so that the fibers breaking occur and the intake is not affected by the high pH values of hydrolyzed sugarcane. On the times 0.5h, 3h, 6h and 9h after the hydrolysis process, measurements of pH, internal and external temperature (IT and ET) were obtained. Infrared thermometer and digital pH meter were used according to Silva and Queiroz (2002). Samples of sugarcane from all treatments were collected after 9 hours of hydrolysis and were pre-dried at 55ºC forced-ventilation during 72h and posteriorly milled with 1.0 mm grinding plates. The milled samples were used to determine the contents of dry matter (DM), organic matter (OM) and ash following AOAC (1990) methodologies. The content of neutral detergent fiber ash-free (NDFa) was determined according to Van Soest et al. (1991) whereas acid detergent fiber (ADF) was determined according to Silva and Queiroz (2002). Total carbohydrates (TC) values and non-fiber carbohydrates (NFC) were determined according to Mertens (1997), by TC = 100 – (%CP + %EE + %ash); NFC = 100 – (%CP + %EE + %ash + %NDFa). The statistical model was as follows: Model for the chemical composition, Yijk = µ + si + tj + si*tj + eij, where Yijk is the measured variable; µ is the overall mean; si is the effect of the straw of the ith condition (with or without straw); tj is the effect of the lime preparation before the hydrolysis of the jth time; si*tj is the interaction between straw and lime preparation before the hydrolysis; eij is the residual error. 18 Regression model for the pH and temperature along the time, Yijk = b0 + b1xi1 + b2xi2 + b3xi3 + b4xi4 +αj + eij, where Yij is the measured of dependent variable; b’s are the coefficients of the regression; xi is the independent variable; αj is the deviation of jth regression; eij is the residual error. Data were subjected to normality and homogeneity analysis and adjusted when necessary. For chemical analysis of sugarcane data were subjected to analysis of variance by PROC GLM using SAS (2001). When significant differences were detected, means were tested by Tukey HSD range test. For the pH and temperature, a polynomial regression analysis with split plots was performed. An additional study using scanning electron microscopy (SEM) was done. Samples from fresh and hydrolyzed sugarcane with and without straw were taken to be observed before and after in vitro digestion. The digestion from sugarcane samples was determined using a Fermenter machine (Rumen Ankom®, "Daisy Fermenter II"). Sugarcane was analyzed from 12 to 24 hours after the hydrolysis process. An amount of 0.5 g of sample for in vitro digestion was weighed in the bag F57® digestion. These were then sealed and placed in digestion jars (up to 25 bags per jar) containing the previously prepared solution. In each jar, 1600 mL of pre- warmed buffer (at 39°C) was added, consisting of the mixture in a 5:1 ratio of two solutions called, 'A' and 'B' respectively. The 'A' solution consisted of, 10g/L of KH2PO4; 0.5 g/L of MgSO4.7H2O; 0.5g/L of NaCl; 0.1g/L CaCl2, and 0.5g/L of reactive urea-grade. The 'B' solution consisted of, 15g/L Na2CO3, and 1.0g/L of Na2S.9H2O. After that, the rumen inoculums liquid was added into each jar (400 mL per jar). The inoculum of rumen fluid was obtained from a donor animal. The animal was subjected to a 20-day adaptation period to the diet. A diet consisting of 50:50% fresh and hydrolyzed sugarcane, concentrate, mineral mixture and ad libitum water was supplied. Samples were incubated during 48 hours. After that period, a second stage was carried out with the addition of 8 g of pepsin and 40mL of 6N HCl in each jar, keeping the system heated at 39oC for more 24 hours. After the incubation period, the bags with samples inside were dried at 55oC. 19 Samples were fixed on a metalic specimen holder of cylindrical shape using double-sided tape of conductive material (copper) (Figure 1). After fixed the samples, the metallization was made. Metallization is essential for the material to become electrically conductive and comprises in the deposition of a thin layer (about 35 nm) of palladium gold (JEOL JFC1100, Figure 2). Evaluations by observation in a SEM were made using the JEOL brand JSM5410 model machine (Figure 2). This analysis aimed to make possible the microscopic understanding of the role of calcium hydroxide on the sugarcane fibers before and after the in vitro digestion. Figure 1. Specimen holder with the double-sided copper tape and sugarcane samples (1.0 mm particle size) Figure 2. Machine (JEOL JFC 1100) on the left and scanning electron microscope on the right (JSM5410). 3. Results and discussion Evaluating the influence of supplying sugarcane with straw for the animals as well as the time of lime preparation before the hydrolysis of sugarcane and its chemical composition is important for the choice on how this roughage should be provided to the ruminants. Regarding the straw aspect (Figure 3), a higher NDFa (450 g/kg) and ADF (231 g/kg) were observed for sugarcane with straw than for sugarcane without straw 20 (NDFa, 412 g/kg and ADF 204 g/kg). Straw, according to Santos et al. (2012) is composed basically by 420 g/kg of cellulose, 315 g/kg of hemicellulose and 235 g/kg of lignin. It is possible to confirm the higher NDFa and ADF of sugarcane with straw. NDF is constituted by cellulose, hemicellulose and lignin, while ADF is composed by cellulose and lignin. Lower DM (218 g/kg) and NFC (461 g/kg) were observed for sugarcane with straw compared to sugarcane without straw (DM, 224 g/kg and 496 g/kg). Sugarcane has an important amount of NFC, mainly because sucrose is a main compound of this roughage. This can collaborate to increase DM of sugarcane. 910 461B 218B 450A 231A 50.6 412B 224A 204B 496A 907 53.3 0 200 400 600 800 1000 DM NDFa ADF NFC TC Ash with straw without straw g /k g Figure 3. Chemical composition of sugarcane with or without straw. Dry matter (DM), neutral detergent fiber ash-free (NDFa), acid detergent fiber (ADF), non-fiber carbohydrates (NFC), total carbohydrates (TC) and ash (g/kg in DM basis). Tukey test (p<0.05) Time of lime preparation interfered in the amount of NDFa (Figure 4a), NFC, TC and ash (Figure 4c), but did not interfere in the amount of DM and ADF (Figure 4a and 4b). Ca(OH)2 suspension prepared 48 hours before the hydrolysis of sugarcane provided higher NDFa (458 g/kg) compared to fresh sugarcane (402 g/kg). Other treatments did not differ (p>0.05). The obtained NFC values (Figure 2c) acted oppositely compared to those of NDFa, i.e. NFC of sugarcane hydrolyzed using Ca(OH)2 suspension prepared 24 hours (465 g/kg) and 48 hours (446 g/kg) before its application was lower than fresh sugarcane (522 g/kg). Value of TC for fresh sugarcane (924 g/kg) was higher compared to hydrolyzed sugarcane, regardless the time of lime preparation before the hydrolysis. Regarding the ash content, Ca(OH)2 suspension prepared 0.5 hour before the hydrolysis was lower (51.9 g/kg) compared to Ca(OH)2 suspension prepared 24 hours before (59.4 g/kg). 21 423AB458A438AB432AB 402B 0 100 200 300 400 500 Fresh HT0.5 HT24 HT48 TH72 DM NDFa g /k g (a) p < 0.05 p > 0.05 0 100 200 300 400 500 Fresh HT0.5 HT24 HT48 HT72 ADF g /k g p > 0.05 (b) 522A 477AB 465B 446B 480AB 903B904B909B924A 903B 36.2C 51.9B 59.4A 55.6AB 56.6AB 0 200 400 600 800 1000 Fresh HT0.5 HT24 HT48 HT72 NFC TC Ash (c) p < 0.001 p < 0.001 p < 0.001 Figure 4. Chemical composition of fresh sugarcane or hydrolyzed sugarcane (mean ± SEM) using the lime prepared 72h, 48h, 24h and 0.5h before the hydrolysis: (a) dry matter (DM) and neutral detergent fiber ash-free (NDFa), (b) acid detergent fiber (ADF), (c) non-fiber carbohydrates (NFC), total carbohydrates (TC) and ash (g/kg in DM basis) Oliveira (2010) recommendation of 0.5 kg of Ca(OH)2 diluted in 2 liters of water is not concerned to obtain a solution, but a facilitator vehicle to hydrolyze the sugarcane. Only 1.73 g of Ca(OH)2 can be dissolved per 1 liter of water (OMRI, 2002). That means, 0.5 kg of Ca(OH)2 diluted in 2 liters of water, only 3.46 g was dissolved. The rest should have remained in a suspension form and exactly 467 g was sinking to the bottom. Even though the Ca(OH)2 suspension was mixed by agitation before the hydrolysis process, time 0.5 hour of the lime preparation could have been not enough to saturate the 3.46 g of mixture. Hence higher residual of Ca(OH)2 remained in the container used to prepare the suspension. Fresh sugarcane had lower ash (36.2 g/kg), due to non-use of additive Ca(OH)2 with mineral properties. Mota et al. (2010) evaluated the hydrolysis of sugarcane using calcium oxide and calcium hydroxide, and found 250 g/kg of DM, 401 g/kg of NDF, 187 g/kg of ADF and 33.0 g/kg of ash. In the current study, it was found similar averages for 22 hydrolyzed sugarcane without straw 224 g/kg of DM, 412 g/kg of NDFa, 204 g/kg of ADF and 53 g/kg of ash. Interaction between straw and time of lime preparation was observed for NDFa (Table 1, Figure 5), NFC (Table 2, Figure 6), TC (Table 3, Figure 7) and ash (Table 4, Figure 8). In general, the highest NDFa values were obtained for sugarcane with straw treatments. It, however, did not affect the NDFa value when Ca(OH)2 suspension was prepared 0.5 and 24 hours before the sugarcane hydrolysis (Table 1, Figure 5). Table 1. Unfolding the interaction, straw and time of lime preparation of neutral detergent fiber ash-free (NDFa) of sugarcane (g/kg in DM basis) NDFa Straw Fresh HT0.5 HT24 HT48 HT72 P-value With 432Aab 442ab 424b 488Aa 461Aab 0.038* Without 371Bb 422ab 453a 428Bab 384Bb 0.003** P-value 0.007** 0.355ns 0.187ns 0.008** 0.001** Fresh sugarcane i.e. no lime used, HT0.5, HT24, HT48, HT72, i.e. hydrolyzed sugarcane and time 0.5, 24, 48 and 72 hours of lime preparation before the hydrolysis. Columns with different capital letters are significantly different, Tukey test. Line with different small letters are significantly different, Tukey test. *(p<0.05), **(p<0.01), ns = non- significant. 461Aab 488Aa 424b 442ab432Aab 384Bb 428Bab 453a 422ab 371Bb 250 300 350 400 450 500 550 Fresh HT0.5 HT24 HT48 HT72 with straw without straw N D F a ( g /k g ) Figure 5. Interaction of straw and time of lime preparation of neutral detergent fiber ash-free (NDFa) of sugarcane (g/kg in DM basis) (mean ± SEM). Treatments: Fresh sugarcane i.e. no lime used, HT0.5, HT24, HT48, HT72, i.e. hydrolyzed sugarcane and time 0.5, 24, 48 and 72 hours of lime preparation before the hydrolysis. Different capital letters are significantly different between straw. Different small letters are significantly different between the times of lime preparation before the hydrolysis, Tukey test The lowest values of NDFa were observed for fresh sugarcane without straw (371 g/kg) and hydrolyzed sugarcane without straw using Ca(OH)2 suspension 23 prepared 72 hours before the hydrolysis (HT72, 384 g/kg). This is a nutritionally important factor because it is related to intake regulation in ruminants (Berchielli et al., 2011). This is confirmed because the straw is basically composed of cellulose (444 g/kg), hemicellulose (307 g/kg) and lignin (198 g/kg) (Santos et al., 2014), which are three known components of NDF. For NFC (Table 2, Figure 6), the results were opposite to NDFa values, i.e. the lowest NFC values were obtained in sugarcane with straw treatments. It, however, did not affect (p>0.05) the NFC value when Ca(OH)2 suspension was prepared 0.5 and 24 hours before the hydrolysis of sugarcane. The lowest NFC values were observed for sugarcane with straw HT48 (419 g/kg). Table 2. Unfolding the interaction, straw and time of lime preparation of non-fiber carbohydrates (NFC) of sugarcane (g/kg in DM basis) NFC Straw Fresh HT0 HT24 HT48 HT72 P-value With 493Ba 468ab 486ab 419Bb 438Bab 0.014* Without 552Aa 486abc 444c 474Abc 523Aab <0.001** P-value 0.016* 0.442ns 0.084ns 0.023* 0.001** Fresh sugarcane i.e. no lime used, HT0.5, HT24, HT48, HT72, i.e. hydrolyzed sugarcane and time 0.5, 24, 48 and 72 hours of lime preparation before the hydrolysis. Columns with different capital letters are significantly different, Tukey test. Line with different small letters are significantly different, Tukey test. *(p<0.05), **(p<0.01), ns = non- significant. 493Ba 468ab 486ab 419Bb 438Bab 552Aa 486abc 444c 474Abc 523Aab 250 325 400 475 550 Fresh HT0.5 HT24 HT48 HT72 with straw without straw N F C ( g /k g ) Figure 6. Interaction of straw and time of lime preparation of non fiber-carbohydrates (NFC) of sugarcane (g/kg in DM basis) (mean ± SEM). Treatments: Fresh sugarcane i.e. no lime used, HT0.5, HT24, HT48, HT72, i.e. hydrolyzed sugarcane and time 0.5, 24, 48 and 72 hours of lime preparation before the hydrolysis. Different capital letters are significantly different between straw. Different small letters are significantly different between the times of lime preparation before the hydrolysis, Tukey test 24 Regardless of the presence or absence of straw in sugarcane, the TC was higher for fresh sugarcane (p<0.05) compared to hydrolyzed sugarcane mainly due to the presence of ash from Ca(OH)2 additive (Table 3, Figure 7). As it is known, TC is obtained by TC = 100 - (%CP + %EE + %ash) (Mertens, 1997). Hydrolyzed sugarcane with straw, using Ca(OH)2 suspension prepared 24 hours before the hydrolysis had higher TC value (910 g/kg) compared to hydrolyzed sugarcane without straw in the same time of lime preparation (897 g/kg). Table 3. Unfolding the interaction, straw and time of lime preparation of total carbohydrates (TC) of sugarcane (g/kg in DM basis) TC Straw Fresh HT0 HT24 HT48 HT72 P-value With 925a 910b 910Ab 907b 899b <0.001** Without 923a 908b 897Bb 902b 907b <0.001** P-value 0.734ns 0.682ns 0.005** 0.280ns 0.835ns Fresh sugarcane i.e. no lime used, HT0.5, HT24, HT48, HT72, i.e. hydrolyzed sugarcane and time 0.5, 24, 48 and 72 hours of lime preparation before the hydrolysis. Columns with different capital letters are significantly different, Tukey test. Line with different small letters are significantly different, Tukey test. *(p<0.05), **(p<0.01), ns = non- significant. 899b 907b910Ab910b 925a 907b 923a 908b 897Bb 902b 870 880 890 900 910 920 930 940 Fresh HT0.5 HT24 HT48 HT72 with straw without straw T C ( g /k g ) Figure 7. Interaction of straw and time of lime preparation of totan carbohydrates (TC) of sugarcane (g/kg in DM basis) (mean ± SEM). Treatments: Fresh sugarcane i.e. no lime used, HT0.5, HT24, HT48, HT72, i.e. hydrolyzed sugarcane and time 0.5, 24, 48 and 72 hours of lime preparation before the hydrolysis. Different capital letters are significantly different between straw. Different small letters are significantly different between the times of lime preparation before the hydrolysis, Tukey test Sugarcane with straw differed (p<0.05) in ash content, when the Ca(OH)2 suspension was prepared 24 and 48 hours before the hydrolysis of sugarcane (Table 4, Figure 8). Lower ash for hydrolyzed sugarcane with straw HT24 (5.5 g/kg) and HT48 (5.2 g/kg) compared to hydrolyzed sugarcane without straw (HT24: 6.3 g/kg 25 and HT48: 6.0 g/kg). Higher values (p<0.05) of ash were found for treatments with hydrolysis. This behavior was expected due to the presence of minerals such as calcium and magnesium on the additive used, Ca(OH)2. Table 4. Unfolding the interaction, straw and time of lime preparation of ash of sugarcane (g/kg in DM basis) Ash Straw Fresh T0 T24 T48 T72 P-value With 3.4b 5.2a 5.5Ba 5.2Ba 5.9a <0.001** Without 3.8c 5.1b 6.3Aa 6.0Aab 5.4b <0.001** P-value 0.242ns 0.754ns 0.017* 0.015* 1.107ns Fresh sugarcane i.e. no lime used, HT0.5, HT24, HT48, HT72, i.e. hydrolyzed sugarcane and time 0.5, 24, 48 and 72 hours of lime preparation before the hydrolysis. Columns with different capital letters are significantly different, Tukey test. Line with different small letters are significantly different, Tukey test. *(p<0.05), **(p<0.01), ns = non- significant. 5.9a 5.2Ba5.5Ba5.2a 3.4b 5.4b 6.0Aab6.3Aa 5.1b 3.8c 0 2 4 6 8 Fresh HT0.5 HT24 HT48 HT72 with straw without straw A s h ( g /k g ) Figure 8. Interaction of straw and time of lime preparation of ash of sugarcane (g/kg in DM basis) (mean ± SEM). Treatments: Fresh sugarcane i.e. no lime used, HT0.5, HT24, HT48, HT72, i.e. hydrolyzed sugarcane and time 0.5, 24, 48 and 72 hours of lime preparation before the hydrolysis. Different capital letters are significantly different between straw. Different small letters are significantly different between the times of lime preparation before the hydrolysis, Tukey test From the chemical composition of sugarcane point of view, lower NDFa was found for fresh sugarcane without straw and hydrolyzed sugarcane with straw using the lime prepared 72 hours before the hydrolysis. Higher NFC was found for fresh sugarcane without straw and hydrolyzed sugarcane without straw using the lime prepared 72 hours before the hydrolysis. Those were the criteria used to choose the treatments that were provided to the cows to analyze performance, milk composition and in vitro digestibility of nutrients (Chapter 3). 26 In general, pH of sugarcane stacks decreased (p<0.05) as time increased from 0.5 to 9 hours (Figure 9). Just on time 3 and 6 hours, pH was similar (p >0.05). Remarkable decrease of pH was observed during the first three hours and at the end of the hydrolysis process. Domingues et al. (2011) evaluated the aerobic stability of sugarcane hydrolyzed using CaO, and they found 9.8 of initial pH and 7.1 of final pH, after 24 hours of hydrolysis. 8.3C9.0B9.3B 10.1A 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 0.5 3 6 9 pH p H hours y = 10.131 - 0.486x + 0.0878x2 - 0.006x3 ; R2 = 0.100 Figure 9. pH values (mean ± SEM) according to the treatments over time Fresh sugarcane with or without straw had lower pH values compared to hydrolyzed sugarcane with or without straw. This fact demonstrates that the alkalizing action of the lime (Ca[OH]2) suspension on hydrolyzed sugarcane occurred (Figure 10). Additionally, straw did not affect the pH values of sugarcane among treatments. 10.4A10.0A10.2A9.7A 5.3B 10.0A10.5A10.3A10.1A 5.4B 0 2 4 6 8 10 12 Fresh HT0.5 HT24 HT48 HT72 with straw without straw p H v a lu e Figure 10. pH values (mean ± SEM) according to the treatments. Treatments: Fresh sugarcane i.e. no lime used, HT0.5, HT24, HT48, HT72, i.e. hydrolyzed sugarcane and time 0.5, 24, 48 and 72 hours of lime preparation before the hydrolysis 27 Fresh sugarcane with (Figure 11a) or without (Figure 11b) straw had constant behavior of pH, around 5.4. pH of hydrolyzed sugarcane decreased as time increased from 0.5 to 9 hours, showing quadratic and cubic behaviors. However, it seems that hydrolyzed sugarcane with straw using the lime prepared 24 and 48 hours before the hydrolysis causes an unstandardized pH decrease, i.e., cubic behavior. 5 7 9 11 0.5 3 6 9 hours p H v a lu e Fresh with HST0.5 HST24 HST48 HST72 (a) 5 7 9 11 0.5 3 6 9 hours p H v a lu e Fresh without HT0.5 HT24 HT48 HT72 (b) Figure 11. pH values of sugarcane (mean ± SEM) (a) with or (b) without straw, using the lime prepared 72h, 48h, 24h and 0.5h before the hydrolysis Lower pH for fresh sugarcane (5.3) was observed compared to hydrolyzed sugarcane (10.2), regardless of the presence or not of straw. Use of Ca(OH)2 naturally increases the pH of hydrolyzed material due to presence of alkaline property in their composition. The pH during the hydrolysis time (0.5, 3, 6 and 9 hours) is shown in Table 5. Immediately after the application of Ca(OH)2, i.e., Ca(OH)2 suspension prepared 0.5 hour before the hydrolysis, pH had an average of 11.3, and after 9 hours of hydrolysis, pH had an average of 9.1. There was a decrease in pH as time increased for treatments submitted to hydrolysis; but this decrease did not achieve the average pH obtained for fresh sugarcane (5.3). Oliveira (2010) evaluated sugarcane hydrolyzed using 0.5% Ca(OH)2, and found initial pH of 10.9, whereas after 6 hours of hydrolysis the pH was 9.7. 28 Table 5. Unfolding the interaction, time of lime preparation within treatment for pH. Sugarcane 0.5 hours 3 hours 6 hours 9 hours P-value Fresh, with straw 5.4 5.4 5.4 5.2 0.94ns Fresh, without straw 5.4 5.4 5.4 5.4 0.99ns HST0.5 11.0A 10.2AB 9.0BC 8.8C <0.0001** HT0.5 11.4 A 10.5 AB 9.8BC 8.7C <0.0001** HST24 11.3 A 9.4B 10.4AB 9.7B 0.0008** HT24 11.6 A 10.9 AB 9.7BC 8.9C <0.0001** HS48 11.2 A 9.4BC 10.6AB 9.0C <0.0001** HT48 11.5 A 10.9 AB 10.1BC 9.4C 0.0006** HST72 11.2 A 10.4 AB 10.6AB 9.3B 0.0038** HT72 11.3 A 10.4 AB 9.3BC 9.0C <0.0001** P-value ns ns ns ns SEM 0.075 0.325 0.284 0.580 HST0.5 and HT0.5 = with and without straw, time 0.5 hour of lime preparation before the hydrolysis. HST24 and HT24 = with and without straw, time 24 hours of lime preparation before the hydrolysis. HST48 and HT48 = with and without straw, time 48 hours of lime preparation before the hydrolysis. HST72 and HT72 = with and without straw, time 72 hours of lime preparation before the hydrolysis. Line with different letters are significantly different, Tukey test. ** (p<0.01), ns = non-significant. Internal temperature of sugarcane stacks had cubic behavior as time increased, but no temperature increase was observed (Figure 12). External temperature of sugarcane stacks had quadratic behavior as time increased, and temperature increase was observed just during the first three hours of hydrolysis (Figure 12). This behavior indicates that during the beginning of hydrolysis process there is an increase of temperature, probably due to chemical reactions that occurred with aerobic exposure. External temperature (17.5oC) was lower than internal temperature (18.9 oC) after 9 hours of hydrolysis. This is because the external area of the stacks was under wind action. Internal temperature: y=20.163+0.688x–0.248x2+0.018x3; R²=0.100 External temperature: y=20.216+0.516x–0.092x²; R²=0.996 19.1 B 20.5 A 18.9 B 20.2 A 17.5 C 19.9 B 21.1 A20.2 B 16 17 18 19 20 21 22 23 0.5 3 6 9 hours Te m pe ra tu re , º C Internal temperature External temperature Figure 12. Internal and external temperatures (mean ± SEM) according to the treatments over time 29 Hydrolyzed sugarcane without straw, had lower (p <0.05) internal (16.5 ºC) and external (15.6ºC) temperatures of stacks after 9 hours. Whereas, the temperatures of hydrolyzed sugarcane with straw were 21.2 and 19.1°C, respectively (Figure 13). 23.5A 21.2B 15 17 19 21 23 25 27 0.5 3 6 9 hours In te rn a l p e m p e ra tu re , o C Fresh with HST0.5 HST24 HST48 HST72 (a) 20.7A 19.1B 17 19 21 23 25 0.5 3 6 9hours E x te rn a l p e m p e ra tu re , o C Fresh with HST0.5 HST24 HST48 HST72 (c) 22.0A 16.5B 13 15 17 19 21 23 25 27 29 0.5 3 6 9hours In te rn a l t e m p e ra tu re , o C Fresh without HT0.5 HT24 HT48 HT72 (b) 19.3A 15.6B 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 0.5 3 6 9hours E x te rn a l t e m p e ra tu re , o C Fresh without HT0.5 HT24 HT48 HT72 (d) Figure 13. Internal temperature of sugarcane (mean ± SEM) with (a) or without (b) straw, using the lime prepared 72h, 48h, 24h and 0.5h before the hydrolysis. External temperature of sugarcane with (c) or without (d) straw, using the lime prepared 72h, 48h, 24h and 0.5h before the hydrolysis. Fresh sugarcane, temperatures ranged from 19.3ºC (without straw) and 23.5ºC (with straw). Oliveira et al. (2008) evaluated the internal and external temperature of hydrolyzed sugarcane stacks using 0.5% of Ca(OH)2 and found 23.0oC of internal and 24.6oC of external temperatures after 9 hours of hydrolysis. Straw of sugarcane consists of approximately 95% of DM, i.e. 5% water. It is known that water is a thermal insulator, therefore the highest temperature observed in 30 stacks of sugarcane with straw can be explained by the lower level of water acting as a thermal insulator. Internal and external temperatures of fresh sugarcane were lower compared to hydrolyzed sugarcane because the uses of high levels of lime reduces the water activity and the development of microorganisms (SANTOS et al., 2008). It is possible to observe the SEM images of sugarcane before and after the in vitro digestion in Figure 14. Small particles are observed in the images of sugarcane before the in vitro digestion (Figure 14 a, c and e). These small particles suffered the in vitro digestion (Figure 14 b, d and f). More particles remained undigested in hydrolyzed sugarcane without straw samples compared with fresh and hydrolyzed sugarcane with straw samples, after in vitro digestion. As shown in Figure 3, NDF content was higher for sugarcane with straw (450 g/kg) than sugarcane without straw (412 g/kg). Using the SEM images, it is possible to say that the straw suffered digestion. Higher digestion of hydrolyzed sugarcane with straw occurred probably because of the straw hydrolysis. 31 F ig u re 1 4 . F re s h s u g a rc a n e ( a ) a n d ( b ), h y d ro ly z e d s u g a rc a n e w it h s tr a w ( c ) a n d ( d ), h y d ro ly z e d s u g a rc a n e a a a a a a a ia iw it h o u t s tr a w ( e ) a n d ( f) . 32 4. Conclusions From the chemical composition point of view, fresh sugarcane without straw and hydrolyzed sugarcane with straw using the lime prepared 72 hours before the hydrolysis can be used to feed cows because, in general, provided lower neutral detergent fiber. Hydrolyzed sugarcane has some advantages such as the possiblility to store it, facilitating the labor. Additionally, it provides lower temperatures of the stacks of sugarcane and higher pH that is interesting for conservation. 5. Acknowledgments The Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Unesp/Jaboticabal, for the oportunity to develop the experiment work. To Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) for scholarship. To Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) process number 2011/01566-2. 6. References ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS (AOAC). Official methods of analysis. 15.ed. Washington, D.C., 1990. 1298p. BERCHIELLI, T.T. et al. Nutrição de ruminantes. 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Experiment 1 was arranged as a completely randomized design to evaluate the in vitro dry matter (IVDMD), neutral detergent fiber (IVNDFD) and acid detergent fiber (IVADFD) digestibilities of sugarcane. Experiment 2 was arranged as a Latin square 5 x 5 to evaluate the performance of the dairy cows fed sugarcane as roughage. Hydrolyzed sugarcane with straw had lower values of IVDMD (HST0, 57.3% and HST72, 55.2%) and higher values of IVNDFD (HST0, 45.5% and HST72, 47.0%) compared to sugarcane without straw (fresh or hydrolyzed). The highest IVADFD was obtained for HST72 (29.9%), followed by HST0 (26.1%), then HT72 (21.9%) and the lowest values were for sugarcane without straw for fresh (17.6%) and HT0 (18.3%). Regardless of the time of lime preparation, sugarcane with straw provided lower DM intake (HST0, 13.5 kg/d and HST72, 12,0 kg/d) compared to the fresh (15.4 kg/d) or hydrolyzed sugarcane without straw (HT0, 15.5 kg/d and HT71,16.0 kg/d). The lowest intake of OM, TC and TDN was observed for sugarcane with straw regardless of the time of lime preparation. For sugarcane hydrolyzed with the lime prepared 72 hours before the hydrolysis process, a lower intake of CP, NDF, ADF and ash compared with fresh or hydrolyzed sugarcane was found. Milk production was 12.6 kg/d, whereas composition was 3.6% of fat, 3.5% of protein, 4.9% of lactose, 8.9% of solids-non-fat and 12.9% of total solids. Milk production and composition were similar among the treatments. As the feed efficiency of dairy cows was been improved and the digestibility of fibers increased, sugarcane with straw can be used in animal nutrition. In addition, the Ca(OH)2 suspension may be prepared three days before the hydrolysis of sugarcane to facilitate the labor. Keywords: feed efficiency, intake, milk production, neutral detergent fiber 36 Influência da palha e do tempo de preparo da calda antes da hidrólise da cana- de-açúcar na digestibilidade dos nutrientes e no desempenho de vacas RESUMO RESUMO – Este estudo teve como objetivo avaliar a influência da palha e do tempo de preparo da suspensão de hidróxido de cálcio na produção e na composição do leite, na digestibilidade in vitro de nutrientes, e no consumo pelas vacas alimentadas com cana-de-açúcar hidrolisada. Cinco tratamentos foram utilizados: cana-de- açúcar fresca sem palha, HPT0,5 (cana-de-açúcar hidrolisada com palha e a calda preparada 0,5 hora antes da hidrólise), HPT72 (cana-de-açúcar hidrolisada com palha e a calda preparada 72 horas antes da hidrólise), HT0,5 e HT72 que foram a cana-de-açúcar hidrolisada sem palha submetidas aos mesmos procedimetos da cana-de-açúcar com palha. A cal utilizada foi o hidróxido de cálcio Ca(OH)2. O experimento 1 foi um delineamento inteiramente casualizado para avaliar a digestibilidade in vitro da matéria seca (DIVMS), fibra em detergente neutro (DIVFDN) e fibra em detergente ácido (DIVFDA).