UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA TRANSMISSÃO GALACTOGÊNICA DE Toxoplasma gondii NA INFECÇÃO EXPERIMENTAL DE RATAS WISTAR VERUSKA MAIA DA COSTA BOTUCATU – SP 2008 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA TRANSMISSÃO GALACTOGÊNICA DE Toxoplasma gondii NA INFECÇÃO EXPERIMENTAL DE RATAS WISTAR VERUSKA MAIA DA COSTA Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Mestre. Orientador: Prof. Titular Helio Langoni Co-orientadora: Profa. Dra. Simone B. Lucheis Comissão examinadora iii V.M.COSTA 2008 Veruska Maia da Costa. Transmissão galactogênica de Toxoplasma gondii na infecção experimental de ratas Wistar. Defesa: 28/05/2008 Local: FMVZ/UNESP - Campus de Botucatu/SP COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Titular Helio Langoni Presidente e Orientador Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ - UNESP - Botucatu/SP Prof. Associado Dr. Italmar Teodorico Navarro Membro Titular Departamento de Medicina Veterinária Preventiva Centro de Ciências Agrárias UEL - Londrina/PR Profa. Assistente Dra. Katia Denise Saraiva Bresciani Membro Titular Departamento de Apoio Produção e Saúde Animal Faculdade de Odontologia - UNESP - Araçatuba/SP _____________________________________________________________ Profa. Titular Lisiane Almeida Martins Membro Suplente Departamento Medicina Veterinária UNIPAR - Umuarama/PR Prof. Assistente Dr. Márcio Garcia Ribeiro Membro Suplente Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ - UNESP - Botucatu/SP Prof. Assistente Dr. Paulo Francisco Domingues Membro Suplente Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ - UNESP - Botucatu/SP Dedicatória iv V.M.COSTA 2008 DEDICATÓRIA “Dedico este trabalho aos meus queridos pais, Antônio Costa e Vilany Costa, por serem exemplos de dignidade e fortaleza, pessoas vencedoras cujo apoio foi de fundamental importância para o meu crescimento pessoal e profissional sempre me mostrando a ver os fatos e a vida como realmente são e nunca me deixando desistir. O meu obrigada é muito pequeno diante da grandeza do que fizeram por mim” Amo Vocês! Agradecimentos v V.M.COSTA 2008 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por me amparar e dar força e perseverança em todos os meus dias, e por colocar em meu caminho pessoas tão especiais; Aos meus pais, Antônio Costa e Vilany Costa, pessoas mais queridas e especiais que possuo em vida, sempre estiveram ao meu lado, mesmo a distância durante o período da pós-graduação, permitiram que eu pudesse chegar até aqui, acreditando em mim e acima de tudo, pelo amor, paciência, apoio, carinho, atenção e dedicação incansável e principalmente pelos sacrifícios feitos; Aos meus irmãos Jefferson Costa e Jonatas Costa mesmo pelas diferenças comuns entre irmãos, sempre me apoiaram e incentivaram, amo vocês; Ao Jonas Brant por todas as vezes que mesmo sem dominar muito bem o assunto, ficava me olhando, ouvindo, dando conselhos, sugestões, colaborando assim, para a realização deste trabalho; pelo grande amor que nos une e que é à base de toda minha força, te agradeço, pela compreensão, pela paciência, pela amizade, e tranqüilidade nos momentos difíceis; Em especial, e com grande carinho e consideração, ao Professor Helio Langoni, pelos ensinamentos transmitidos nesses anos de convivência, principalmente por acreditar no meu potencial e pela confiança que depositou em mim, desde a Residência dando-me oportunidade de trabalhar, contribuindo assim tanto para o meu crescimento profissional como pessoal; A Cidinha e ao Guilherme, pessoas ótimas, obrigada pela convivência, pelos momentos de alegria e descontração; A família que ganhei, “Família Beira Serra”, Cris, Dr. Brant, Vó Coraly, Lucas, Filhão, Luciene, Ana, Gonzalo, Tomaz, Walderi, Maria, Ademir, Eduardo e Ricardo, que me acolheram, obrigada pelo imenso carinho; Agradecimentos vi V.M.COSTA 2008 À Walkíria Prado, companheira, amiga, muito obrigada por sua amizade e espero que continue assim, sólida e sincera; À Nair Lira, amiga que “ganhei” nesta etapa final da dissertação, agradeço por sua amizade e pelos valiosos conselhos; Aos grandes amigos que fiz em Botucatu, André Peres, Priscila Barbante e Rodrigo Costa, pelos auxílios na pesquisa, grande troca de conhecimentos científicos, convivência alegre e saudável, em especial ao Fábio Shimabukuro pelo apoio direto na realização dessa pesquisa; Aos amigos Adriana Oliveira e Rodrigo Alfani, pelas conversas e momentos alegres de descontração e incentivo nas horas certas; Aos colegas de pós-graduação, Ana Carolina Ramalho, Tatiana Salermo, Amanda Siqueira, Simone Mangia, Acácia Elias, Deolinda Carneiro, Claudia Mello, Juliana Giantomassi, Luciana Costa e Patrícia Faccioli, pela ótima convivência, ajuda e troca de conhecimentos; Aos residentes, Leila Ullmann, Lucilene Camossi, Marta Fernandes, pela ajuda prestada; Aos bolsistas de Iniciação Cientifica do CNPq Felipe Gazza e Taticia Ykeda, pelo auxilio na realização da parte experimental; Aos professores, Simone Baldini Lucheis, Paulo Francisco Domingues, Marcio Ribeiro Garcia, Jane Megid, Luiz Carlos Souza, José Rafael Modolo, Germano Biondi, Antonio Carlos e Antonio Carlos Paes, pela experiência compartilhada durante a pós-graduação; Ao Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ/UNESP, em especial a Profa. Noeme Souza, pela ajuda no diagnóstico citológico; Aos funcionários do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública, Benedito Menozzi, Marcos Vinicius, Joseane Crespilho, Wanderley Forlin, Sergio Fávero, Rodrigo Carrera, Adilson Pardal, Adriana Pavan, Tânia Martins, pela solicitude e boa vontade sempre que precisei; Agradecimentos vii V.M.COSTA 2008 Aos funcionários da seção de pós-graduação, Denise Garcia, Maria Manuel e José Roberto pelo ótimo atendimento, gentileza, atenção, compreensão e esclarecimentos sempre quando solicitado; Ao Prof. Doutor Aristeu da Silva, pela imprescindível assistência estatística; Aos funcionários da biblioteca da Universidade “Júlio de Mesquita Filho”, campus de Botucatu/SP, pela colaboração na adequação das referências bibliográficas as normas da ABNT desta dissertação; À FAPESP pela concessão de bolsa e auxílio pesquisa, fundamental para o referido projeto de pesquisa sob o número 2005/03017-5 e 2006/02860-3 respectivamente; Ao CNPq pela concessão de auxílio pesquisa, permitindo a concretização deste trabalho, sob o número 471.914/2006-1. Enfim, a todas as pessoas que anonimamente, fizeram e fazem parte da minha caminhada, que contribuíram ou contribuem para o meu crescimento pessoal, profissional, intelectual e espiritual, e que de uma forma ou de outra, foram importantes para realização deste trabalho. Muito obrigada. viii V.M.COSTA 2008 “Diante de qualquer desafio, o importante é assumirmos a direção de nossas vidas, seguindo a nossa intuição e o nosso coração. Devemos aceitar os desafios como algo positivo, que sempre nos trará crescimento a qualquer tempo. Encare os desafios de frente, abrace as oportunidades, pois a estagnação empobrece o espírito”. Salmos – Espelho da Alma Salmos, por Nívea Mallia Cittadino Lista de quadros ix V.M.COSTA 2008 LISTA DE QUADROS Quadro 1. Seqüências dos oligonucleotídeos utilizados na detecção (TOX4 e TOX5) de Toxoplasma gondii, em amostras de leite materno e tecidual. .........................................................................................46 Quadro 2. Etapas da amplificação das regiões codificadoras dos oligonucleotídeos utilizados na detecção (TOX4 e TOX5) de Toxoplasma gondii. ........................................................................47 Quadro 3. Referência para os reagentes utilizados na PCR para uma amostra. ........................................................................................................112 Lista de figuras x V.M.COSTA 2008 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Reação de aglutinação em amostras de soro. 1) Controle sabidamente positivo, 2) Amostra testada e positiva, 3) Controle sabidamente negativo. Botucatu, 2008. ........................................ 39 Figura 2. Inoculação de taquizoítos via intraperitoneal em camundongos Swiss albinos de 30 dias de idade para produção de antígeno, utilizado na inoculação experimental. Botucatu, 2008. ................. 39 Figura 3. Cisto de T. gondii obtido pelo método de separação de cistos pelo Percoll 25% em tecido cerebral de camundongo infectado com a cepa BTU4. Aumento de 1000x. Botucatu, 2008. ......................... 41 Figura 4. Demonstração da coleta de leite. 1) Preparação do animal anestesiado para coleta de leite; 2) massagem da glândula mamária após a aplicação de ocitocina; 3) pipeta pasteur estéril e descartável para coletar a amostra; 4) leite coletado e armazenado em microtubo. Botucatu, 2008. ..................................................... 44 Figura 5. Dinâmica dos títulos de anticorpos séricos anti-T. gondii, detectados pela RIFI, nas ratas do G1 e G2 infectadas experimentalmente com 104 bradizoítos pela via oral com a cepa BTU4. Botucatu, 2008................................................................... 52 Figura 6. Dinâmica dos títulos de anticorpos séricos anti-Toxoplasma gondii, detectados pelo método de aglutinação direta, nas ratas do G1 e G2 infectadas experimentalmente com 104 bradizoítos pela via oral com a cepa BTU4. Botucatu, 2008. .............................................. 52 Figura 7. Dinâmica dos títulos de anticorpos séricos anti-T. gondii, detectados pela RIFI e pelo MAD do G1 e G2 infectadas experimentalmente com 104 bradizoítos pela via oral com a cepa BTU4. Botucatu, 2008................................................................... 53 Lista de figuras xi V.M.COSTA 2008 Figura 8. Formas sugestivas de taquizoítos em esfregaço de amostra de leite. Coloração pelo método de Giemsa. Aumento 40x. Botucatu, 2008. ............................................................................................. 56 Figura 9. Proporção de detecção de formas sugestivas de T. gondii no leite das ratas G1 x G2 (esquerda), G1 x G3 (centro), G2 x G3 (direita) infectadas experimentalmente com 104 bradizoítos pela via oral com a cepa BTU4. Botucatu, 2008. .............................................. 58 Figura 10 Visualização de banda de 529pb, em gel de agarose a 2%. Limiar de detecção da PCR para o gene repetitivo amplificado de segmento de DNA de T. gondii para amostras puras e de leite em diferentes concentrações. Amostras de exsudato peritoneal diluídas. (A) Amostras de leite contaminadas por exsudato peritoneal com taquizoítos (B). 1) Padrão de peso molecular 100 bp DNA-Ladder Invitrogen®; 2) 1,5 x 104 taquizoítos/mL; 3) 1,5 x 103 taquizoítos/mL 4) 1,5 x 102 taquizoítos/mL; 5) 1,5 x 101 taquizoítos/mL; 6) 1,5 x 100 taquizoítos/mL.. Botucatu, 2008. ...... 63 Figura 11 Visualização de banda de 529pb, em gel de agarose a 2%. Limiar de detecção da PCR para o gene repetitivo amplificado de segmento de DNA de T. gondii para amostras puras de exsudato peritoneal rico em taquizoíto e de leite em diferentes concentrações. Amostras de exsudato peritoneal diluídas (A); cérebro (B); pulmão (C) e língua (D). 1) Padrão de peso molecular 100 bp DNA-Ladder Invitrogen®; 2) 1,5 x 104 taquizoítos/mL; 3)1,5 x 103 taquizoítos/mL 4) 1,5 x 102 taquizoítos/mL; 5) 1,5 x 101 taquizoítos/mL; 6) 1,5 x 100 taquizoítos/mL.. Botucatu, 2008. ...... 64 Figura 12. Visualização de banda de 529pb, em gel de agarose a 2%. Limiar de detecção da PCR para o gene repetitivo amplificado de segmento de DNA de T. gondii para amostras puras de exsudato peritoneal de rico em taquizoíto e de leite em diferentes concentrações. (A); coração (B); tecido mamário (C) e musculatura esquelética estriada (D). 1) Padrão de peso molecular 100 bp DNA- Lista de figuras xii V.M.COSTA 2008 Ladder Invitrogen®; 2) 1,5 x 104 taquizoítos/mL; 3)1,5 x 103 taquizoítos/mL. Amostra de tecido hepático Botucatu, 2008. ....... 64 Lista de tabelas xiii V.M.COSTA 2008 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Resultado do exame sorológico pela RIFI a MAD para a detecção de anticorpos da classe IgG, anti-T.gondii, nas fêmeas inoculadas. Botucatu, 2008. ............................................................................. 51 Tabela 2. Resultado do exame sorológico para a detecção de anticorpos da classe IgG, anti-T.gondii, em soros dos filhotes do G1 comparando RIFI x MAD. Botucatu, 2008.......................................................... 54 Tabela 3. Resultado do exame sorológico para a detecção de anticorpos da classe IgG, anti-T.gondii, em soros dos filhotes do G3 comparando RIFI x MAD. Botucatu, 2008.......................................................... 54 Tabela 4. Resultado do exame sorológico pela RIFI para a detecção de anticorpos da classe IgG, anti-T.gondii, em soros dos filhotes do G1 x G3. Botucatu, 2008. ................................................................... 55 Tabela 5. Resultado do exame sorológico pela MAD para a detecção de anticorpos da classe IgG, anti-T. gondii, em soros dos filhotes G1 x G3. Botucatu, 2008. ...................................................................... 55 Tabela 6. Detecção de formas sugestivas de T. gondii em esfregaços de secreção láctea coletada durante os 15 primeiros dias de lactação. Botucatu, 2008. ............................................................................. 57 Tabela 7. Resultados referentes à sorologia dos camundongos inoculados com pool de tecidos dos animais do G1 e das respectivas ninhadas. Botucatu, 2008. ............................................................ 60 Tabela 8. Resultados referentes à sorologia dos camundongos inoculados com pool de tecidos dos animais do G2. Botucatu, 2008. ............ 61 Tabela 9. Resultados referentes à sorologia dos camundongos inoculados com pool de tecidos dos animais do G3 e das respectivas ninhadas. Botucatu, 2008. ............................................................ 62 Lista de tabelas xiv V.M.COSTA 2008 Tabela 10. Resultado da PCR nas seis amostras de leite coletadas durante os primeiros 15 dias de lactação, nas seis fêmeas de cada grupo. Botucatu, 2008. ............................................................................. 66 Tabela 11. . Resultado da PCR nas oito amostras teciduais coletadas após 21 dias de lactação, nas fêmeas de cada grupo. Botucatu, 2008...... 67 Tabela 12. Resultado da PCR nas sete amostras teciduais coletadas após 21 dias de vida, nos seis filhotes de cada fêmea do G1. Botucatu, 2008. ............................................................................................. 68 Tabela 13. Resultado do exame sorológico pela RIFI a MAD para a detecção de anticorpos da classe IgG, anti-T.gondii, dos animais pertencentes ao G1, fêmeas inoculadas via oral com 104 bradizoítos da cepa BTU4, cronificadas. Botucatu, 2008............ 100 Tabela 14. Resultado do exame sorológico pela RIFI e MAD para a detecção de anticorpos da classe IgG, anti-T.gondii, dos animais pertencentes ao G2, fêmeas inoculadas via oral com 104 bradizoítos da cepa BTU4 cronificadas e imunossuprimidas após o parto Botucatu, 2008.................................................................. 101 Tabela 15. Resultado do exame sorológico pela RIFI e MAD para a detecção de anticorpos da classe IgG, anti-T.gondii, dos animais pertencentes ao G3, fêmeas inoculadas via oral com 104 bradizoítos da cepa BTU4 após o parto. Botucatu, 2008............ 102 Tabela 16. Resultado do exame sorológico pela RIFI e MAD para a detecção de anticorpos da classe IgG, anti-T.gondii, em soros dos filhotes das ratas do G1, com 21 dias de idade. Botucatu, 2008............. 103 Tabela 17. Resultado do exame sorológico pela RIFI e MAD para a detecção de anticorpos da classe IgG, anti-T.gondii, em soros dos filhotes com 21 dias de vida das ratas do G3. Botucatu, 2008................ 104 Lista de abreviaturas e símbolos xv V.M.COSTA 2008 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS PCR Reação em cadeia pela Polimerase RIFI Reação de Imunofluorescência Indireta MAD Método de Aglutinação Direta dpi Dias pós-inoculação HIV Vírus da Imunodeficiência adquirida aids Síndrome da Imunodeficiência Adquirida DNA Ácido desoxirribonucléico SSTF Solução Salina Tamponada de Fosfatos g Gramas mg/kg/dia Miligramas por kilograma de peso vivo por dia mL Mililitro µL Microlitro x g Vezes a gravidade 2ME 2- Mercaptoetanol M Molar ºC Grau Celsius mmol Milimol µM Micromolar Sumário xvi V.M.COSTA 2008 SUMÁRIO SUMÁRIO ............................................................................................................................. xvi 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 22 2. REVISÃO DA LITERATURA ....................................................................................... 24 3. OBJETIVOS ................................................................................................................. 33 4. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................. 34 4.1. Animais experimentais .......................................................................................... 34 4.2. Delineamento experimental .................................................................................. 34 4.3. Cepas de T. gondii ................................................................................................. 35 4.3.1. Produção de antígeno para RIFI ......................................................................... 35 4.3.2. Preparação de lâminas para RIFI........................................................................ 36 4.3.3. Diluição dos soros ............................................................................................... 36 4.3.4. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI).................................................... 36 4.3.5. Produção de antígeno para o método de aglutinação direta modificada (MAD) ........................................................................................................................... 37 4.3.6. Método de Aglutinação Direta (MAD).................................................................. 37 4.3.7. Inoculação dos animais ....................................................................................... 38 4.4. Infecção experimental ........................................................................................... 41 4.5. Acasalamento......................................................................................................... 41 4.6. Anestesia e eutanásia dos animais experimentais............................................. 42 4.7. Redução da ninhada .............................................................................................. 42 4.8. Coleta das amostras .............................................................................................. 42 4.8.1. Sangue ................................................................................................................ 42 Sumário xvii V.M.COSTA 2008 4.8.2. Leite..................................................................................................................... 43 4.8.3. Amostras teciduais .............................................................................................. 44 4.9. Exames realizados ................................................................................................. 45 4.9.1. Sorológico............................................................................................................ 45 4.9.2. Citologia............................................................................................................... 45 4.9.3. Inoculação em camundongos - Bioprova ............................................................ 45 4.9.4. Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) ........................................................ 45 4.9.4.1. Extração e purificação de DNA.................................................................... 46 4.9.4.2. Amplificação de DNA................................................................................... 46 4.9.4.3. Eletroforese em gel de agarose para visualização dos produtos amplificados na PCR .................................................................................................... 47 4.9.4.4. Limiar de detecção de T. gondii para amostras de leite e tecidos............... 47 4.9.4.5. Controles...................................................................................................... 48 4.10. Análise estatística.................................................................................................. 48 5. RESULTADOS ............................................................................................................. 49 5.1. Animais experimentais .......................................................................................... 49 5.2. Exames sorológicos .............................................................................................. 50 5.3. Citologia.................................................................................................................. 56 5.4. Inoculação em camundongos - Bioprova............................................................ 59 5.5. PCR.......................................................................................................................... 63 5.5.1. Limiar de detecção de T. gondii para amostras de leite e tecidos ...................... 63 5.5.2. Detecção de DNA de Toxoplasma gondii em amostras de leite e teciduais ....... 65 6. Discussão.................................................................................................................... 69 Sumário xviii V.M.COSTA 2008 6.1. Animais experimentais .......................................................................................... 69 6.2. Exames Realizados................................................................................................ 72 6.2.1. Provas Sorológicas.............................................................................................. 72 6.2.2. Citologia............................................................................................................... 77 6.2.3. Inoculação em camundongos - Bioprova ............................................................ 78 6.2.4. PCR..................................................................................................................... 80 7. CONCLUSÃO............................................................................................................... 83 8. REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 84 9. ANEXOS....................................................................................................................... 99 9.1. Anexo A – Parecer de aprovação pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal ........................................................................................ 99 9.2. Anexo B - Tabelas e Figuras ............................................................................... 100 9.3. Anexo C - Fórmulas e solucões.......................................................................... 105 9.3.1. Para reação de imunofluorescência indireta ..................................................... 105 9.3.2. Para o método de aglutinação direta modificada (MAD)................................... 105 9.3.3. Para infecção experimental ............................................................................... 106 9.3.4. Para inoculação em camundongos (Bioprova).................................................. 107 9.3.5. Para citologia por imprints ................................................................................. 107 9.3.6. PCR................................................................................................................... 108 9.4. Anexo D - Protocolo de extração e purificação pelo GFX Genomic Blood DNA Purification Kit (GE Healthcare/Life Sciences) - método direto, segundo manual do fabricante, com modificações.......................................... 110 9.5. Anexo E - Protocolo de extração e purificação pelo Illustra Blood genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare/Life Sciences), segundo manual do fabricante. .......................................................................................... 111 Sumário xix V.M.COSTA 2008 9.6. Anexo F - Quadro 3. Referência para os reagentes utilizados da PCR para uma amostra. ............................................................................................... 112 9.7. Anexo G - Materiais utilizados ............................................................................ 113 10. Artigo Científico............................................................................................................ 1 Resumo xx V.M.COSTA 2008 COSTA, V.M. Transmissão galactogênica de Toxoplasma gondii na infecção experimental de ratas Wistar. Botucatu, 2008. 98p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Botucatu, São Paulo. RESUMO A toxoplasmose é similar em humanos e em ratos, sendo estes, o modelo experimental, mais utilizado para o estudo da doença. Há poucos relatos da transmissão desta enfermidade pelo leite materno, e desta forma o objetivo do presente estudo foi pesquisar a presença de Toxoplasma gondii no leite de ratas experimentalmente infectadas e a transmissão galactogênica. Utilizaram- se ratas Wistar (Rattus norvegicus), divididas em três grupos: G1, G2 e G3, contendo seis fêmeas cada um. Foram inoculadas via oral com 104 bradizoítos da cepa BTU4, genótipo I, isolada de cão com cinomose. As ratas do G1 e G2 foram infectadas 60 dias antes do acasalamento e as do G3 logo após o parto. Os animais do G2 foram submetidos à imunossupressão pós-parição. Para a detecção do parasito no leite utilizou-se a reação em cadeia pela polimerase (PCR) e para verificar a transmissão para os filhotes pesquisou-se nestes anticorpos anti-T. gondii pela imunofluorescência indireta (RIFI) e método de aglutinação direta (MAD), e a bioprova pela inoculação de camundongos com pool de tecidos (cerebral, pulmonar, hepático, cardíaco, muscular esquelético, língua e diafragma) de cada ninhada, bem como pela PCR nestes tecidos individualmente. A PCR foi positiva em três amostras de leite, duas provenientes da rata 1 do G1, e uma da rata 3 do G3. Os filhotes de todas as ratas do G1 soroconverteram, mas foram negativos na bioprova. Filhotes das ratas 1 e 3 do G3 soroconverteram, e a bioprova foi positiva. Amostras de fígado, musculatura esquelética e pulmão de filhotes do G1 foram positivas na PCR. Desta forma conclui-se que ocorreu a transmissão do T. gondii pelo leite, sugerindo-se novos estudos em lactentes, considerando-se a magnitude da doença em crianças e recém-nascidos. Palavras-chave: Infecção experimental, PCR, Ratas, Toxoplasma gondii, Transmissão galactogênica Abstract xxi V.M.COSTA 2008 COSTA, V.M. Lactational transmission of Toxoplasma gondii in experimentally infected wistar female rats. Botucatu, 2008. 98p. Dissertation (Master) - Faculty of Veterinary Medicine and Animal Husbandry, Campus of Botucatu, São Paulo State University “Júlio de Mesquita Filho”. Botucatu, São Paulo. ABSTRACT Toxoplasmosis is similar in humans and rats, and the latter constitute the most used experimental model to study this disease. Few reports on toxoplasmosis transmission through maternal milk are available in literature; thus, the aim of the present study was to investigate whether Toxoplasma gondii is present in and transmitted through the milk of experimentally infected rats. Wistar (Rattus norvegicus) female rats were divided into three groups: G1, G2 and G3, with six animals each. They were orally inoculated with 104 bradyzoites of BTU4 strain, genotype I, isolated from a dog with distemper. G1 and G2 rats were infected 60 days before mating and those of G3, soon after the parturition. G2 animals were subjected immunosuppression just after parturition. Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the parasite in the milk. To verify the parasite transmission to the offspring, these anti-T. gondii antibodies were investigated through indirect immunofluorescence assay (IFA) and direct agglutination test (DAT). Bioassay consisted of inoculating mice with a pool of tissues (brain, lungs, liver, heart, skeletal muscle, tongue and diaphragm) from each litter, as well as PCR in these tissues individually. PCR was positive in three milk samples, two from rat 1 (G1) and one from rat 3 (G3). The pups of all G1 rats seroconverted but were negative in the bioassay. The pups of rats 1 and 3 (G3) seroconverted and their bioassay was positive. Liver, skeletal muscle and lung samples were PCR-positive in G1 pups. Thus, we can conclude that T. gondii was transmitted through milk, suggesting the need of new studies in breast- feeding mothers as this disease is highly severe in children and newborns. Keywords: Experimental infection; PCR; Rats; Toxopasma gondii; Lactational transmission Introdução 22 V.M.COSTA 2008 1. INTRODUÇÃO A toxoplasmose é causada pelo Toxoplasma gondii, protozoário intracelular obrigatório, de distribuição cosmopolita, constituindo-se em uma importante zoonose (ACHA e SZYFRES, 2003), que infecta uma ampla variedade de animais suscetíveis. O gato é o hospedeiro definitivo, enquanto que o homem, outros mamíferos e as aves são os hospedeiros intermediários. Apresenta considerável relevância quanto aos aspectos de produção animal, já que pode causar aborto em diferentes espécies animais de interesse zootécnico (TENTER, 1998), bem como para a saúde pública, pois trata-se de uma enfermidade oportunista em pacientes HIV positivos ou que apresentem imunodeficiência severa, e é ainda, causa importante de abortos ou de enfermidade congênita na primoinfecção materna durante a gravidez (DEROUIN et al., 1995). Normalmente o T. gondii parasita o hospedeiro sem pródromos, mas leva à formação de cistos teciduais que podem persistir durante toda a sua vida. Os maiores problemas clínicos da toxoplasmose referem-se à primoinfecção durante a gestação, podendo causar abortamento e mortalidade neonatal em ovinos, caprinos e suínos resultando em grandes perdas econômicas. Outro aspecto importante é a reativação de infecções latentes em imunossuprimidos, com o desenvolvimento de quadros severos, às vezes fatais (DUBEY e BEATTIE, 1988). A infecção se dá pelo consumo de carne crua ou mal cozida contendo a forma cística do parasito e de hortifrutigranjeiros contaminados com oocistos, além do contato com o mesmo a partir do meio ambiente. Outra forma possível de infecção é a ingestão de leite in natura, a partir do leite de cabras infectadas (CHIARI e NEVES, 1984). Há, entretanto, poucos estudos que confirmem a infectividade pelo leite materno para o filho. Introdução 23 V.M.COSTA 2008 Entre 15 e 85% da população humana adulta é cronicamente infectada pelo T.gondii, dependendo da localização geográfica (DUBEY e BEATTIE, 1988). Estima-se que mundialmente, 1 a 2 bilhões de pessoas estejam infectadas pelo T.gondii, variando entre 20 a 83% da população (KAWAZOE, 2000), e segundo Sawadogo et al. (2005), 60% dos casos são assintomáticos. Para saúde pública a enfermidade apresenta grande importância por causar abortos na transmissão congênita, infecção fetal grave, comprometimento neurológicos e oculares em crianças, como retardo mental e cegueira, além de acometer gravemente pacientes imunocomprometidos, principalmente os HIV positivos (TENTER et al., 2000). Considerando a importância da infecção toxoplásmica na população humana, a qual além de acarretar prejuízos e morte, gera altos custos com serviços médicos, hospitalização de recém-nascidos ou de crianças, exames laboratoriais, medicamentos, custos com educação especial desde a infância, até o individuo adulto. O objetivo do presente estudo foi avaliar a infecção materno-neonatal na infecção toxoplásmica pela pesquisa do agente no leite de ratas infectadas experimentalmente, observando-se a possibilidade da transmissão galactogênica à ninhada procurando-se estabelecer aspectos da biologia do parasito e da epidemiologia da enfermidade, como nos casos de reativação da infecção crônica frente à imunossupressão, bem como da primoinfecção. Revisão da Literatura 24 V.M.COSTA 2008 2. REVISÃO DA LITERATURA A toxoplasmose tem como agente etiológico o Toxoplasma gondii, parasito intracelular obrigatório, pertencente ao Filo Apicomplexa, Classe Sporozoasida, Subclasse Coccidia, Ordem Eucoccidiorida e Família Sarcocystidae, sendo a única espécie do gênero Toxoplasma (DUBEY, 1994). As primeiras descrições do Toxoplasma gondii ocorreram quase que simultaneamente em diferentes partes do mundo em 1908. No Brasil, Splendore (1908) descreveu o parasito em coelhos e Nicolle e Manceaux (1908), emTunis na África do Norte, descreveram o parasito em tecidos de um roedor africano, o Ctenodactylus gondi. A denominação do gênero deriva do grego ”toxon”, que significa arco e “plasma”, que significa forma, e refere-se a um estágio do ciclo evolutivo do parasito A primeira descrição da doença humana foi descrita por Jankü (1923), caracterizada pela presença do parasito da retina de uma criança falecida aos 11 meses de idade com hidrocefalia e cegueira. A doença congênita foi descrita por Wolf e Cowen (1937), onde relataram o óbito de um lactente com encefalite granulomatosa. Os mesmos pesquisadores realizaram a primeira transmissão experimental da toxoplasmose humana para animais, demonstrando que o agente infeccioso produzia doença intra-uterina. A descoberta do T. gondii como causa de doença adquirida no adulto é creditada a Pinkerton e Weinman (1940), que descreveram um caso de doença generalizada fatal, em um jovem. Entretanto, a freqüência da infecção humana somente foi reconhecida a partir de 1948, com Sabin e Feldman a partir da introdução do teste do corante desenvolvido por eles, permitindo a realização de inúmeros estudos, que evidenciaram os aspectos clínicos e epidemiológicos da toxoplasmose e demonstraram a alta prevalência da enfermidade (SABIN e FELDMAN, 1948). Hutchinson et al. (1968), foi o primeiro a relatar o ciclo evolutivo do parasito no gato. Frenkel (1973), descreveram a fase sexuada do T. gondii no intestino delgado do gato Revisão da Literatura 25 V.M.COSTA 2008 doméstico, produzindo oocistos típicos dos coccídeos nas fezes, esclarecendo a natureza desse protozoário O parasito apresenta três estágios em seu ciclo evolutivo: os taquizoítos; os bradizoítos presentes em cistos teciduais e esporozoítos presentes em oocistos esporulados. Estas formas são infectantes para hospedeiros intermediários e definitivos, que podem adquirir a infecção pela ingestão de oocistos em alimentos contaminados por fezes de felídeos, ou de cistos teciduais presentes na carne crua ou mal cozida de hospedeiros intermediários, verticalmente pela transmissão transplacentária (TENTER, 1998), ou ainda, pela ingestão de taquizoítos que podem estar presentes em leite não pasteurizado de caprinos infectados (TENTER, 1999) e nos casos de transplante de órgãos e transfusões sangüíneas (FRENKEL, 2000). A enfermidade pode ser dividida em duas fases: a aguda, onde o parasito se dissemina pelos tecidos do hospedeiro, e a fase crônica que se caracteriza pela presença de cistos no cérebro e na musculatura (FRENKEL, 1988). O taquizoíto é encontrado durante a fase aguda da infecção, possui capacidade de multiplicação rápida dentro de células do sistema fagocítico mononuclear bem como células hepáticas, pulmonares, nervosas, submucosa e musculares. Na fase crônica, têm-se os bradizoítos, forma de multiplicação lenta do parasito, encontrados dentro de cistos, localizados predominantemente no sistema nervoso central (SNC), globo ocular, bem como nos músculos esquelético e cardíaco (DUBEY, 1994). Segundo Sparkes (1998), os felídeos são o ponto-chave na epidemiologia da toxoplasmose, por serem os hospedeiros da forma sexuada do parasito e, portanto, denominados definitivos. Eliminam os oocistos de T.gondii pelas fezes, que são vias de transmissão para os outros animais que desempenham o papel de hospedeiros intermediários. Nestes animais, mantêm apenas a fase assexuada, com proliferação de formas císticas nos órgãos. Revisão da Literatura 26 V.M.COSTA 2008 Com o advento da resposta imune, desenvolvem-se os cistos teciduais, como forma de defesa do agente contra os anticorpos. Estes permanecem viáveis e são infectantes para os gatos, bem como para outros hospedeiros intermediários onívoros (DUBEY, 1994). Quando o sistema imune não controla a infecção, os taquizoítos podem causar toxoplasmose generalizada, que é fatal (FRENKEL, 1988). Desta maneira, o desenvolvimento da resposta imune celular e a resistência aos taquizoítos determinam a sobrevivência do hospedeiro e do próprio parasito, que sob a pressão do sistema imunológico modula-se em bradizoítos e pode persistir encistado durante longo período, principalmente na musculatura e tecido nervoso (DENKERS e GAZZINELLI, 1998). Arias et al. (1994) descreveram que formas viáveis do T. gondii são isoladas de uma grande variedade de carnes, e estudos sorológicos têm evidenciado uma ampla distribuição da infecção, entre os animais de interesse zootécnico. É uma das infecções oportunistas mais freqüentes em pessoas imunodeficientes. No geral 3-20% das pessoas infectadas pelo vírus HIV, morrem devido à toxoplasmose (DUBEY, 1994). O T. gondii é responsável por uma variedade de síndromes clínicas, sendo a mais comum, à encefalite (KASPER e BUZONI-GATEL, 1998), que resulta da reativação de infecção crônica ou de infecções primárias que também ocorrem nestes indivíduos (FERREIRA, 2000). No estado de São Paulo, em 1998, a aids foi à causa de 4619 mortes, sendo que a toxoplasmose estava associada em 12,2%, sendo a sexta causa de óbitos nestes pacientes (SANTO et al., 2000). O primeiro relato de surto de toxoplasmose no Brasil foi feito por Magaldi et al. (1967), onde de 81 indivíduos que viviam em um seminário em Bragança Paulista-SP, 30 apresentaram a doença. Em virtude do pouco conhecimento sobre a sua epidemiologia naquela época, os autores chegaram ao fim da investigação sem comprovações e conclusões a respeito das fontes de infecção ou das vias de transmissão. O maior surto de toxoplasmose do mundo ocorreu no município de Santa Isabel do Ivaí-PR, Brasil, entre novembro de 2001 e janeiro de 2002, onde 462 indivíduos apresentaram-se sororreagentes para toxoplasmose Revisão da Literatura 27 V.M.COSTA 2008 (anticorpos IgM positivo). Em estudo epidemiológico com 156 indivíduos que apresentavam sintomas da doença, como cefaléia, febre, cansaço, fraqueza, mialgia, adenomegalia e outros. Sete eram gestantes e seis delas tiveram seus filhos infectados, ocorrendo um caso de anomalia congênita grave e um de aborto espontâneo. A investigação concluiu que a fonte de contaminação foi um dos reservatórios de água da cidade contaminado por fezes de gato contendo oocistos de T.gondii (MOURA et al., 2006). A infecção pelo T. gondii atinge todas as regiões do país, principalmente a região Sul, onde há relatos de alta incidência, na forma ocular, com relatos inclusive de casos entre irmãos. Provavelmente a toxoplasmose no Sul está associada a uma população de origem alemã e italiana que possui o hábito de ingerir carne suína mal cozida (FRENKEL, 2000). Recentemente, estudos realizados nesta região, registraram prevalências variando de 60 a 74,5% em Porto Alegre-RS no ano de 2003 e de 83,0% na zona rural do estado do Paraná-PR em 1999 (KAWAZOE, 2000). Diversos inquéritos sorológicos demonstram que a soroprevalência da toxoplasmose varia de 50 a 80% na população adulta saudável (GUIMARÃES et al., 1993). Rey e Ramalho (1999), realizaram inquérito sorológico em grupos populacionais de Fortaleza, pelo teste imunoenzimático, e encontraram anticorpos IgG anti-T.gondii em 529 (53,1%) de um total de 997 indivíduos, e em 133 (71,5%) das 185 gestantes avaliadas. No período de 1996 a 1998 em Londrina-PR, Reiche et al. (2000), analisaram 1559 amostras de soros pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI), e encontraram 1044 (67%) gestantes com IgG anti-Toxoplasma gondii. Neste mesmo período, Cantos et al. (2000) detectaram anticorpos anti-Toxoplasma pela RIFI em 1255 (41,91%) dos pacientes atendidos na Universidade Federal de Santa Catarina, de um total de 2994, sendo que 26 (0,87%) apresentavam IgM, demonstrando que a prevalência da toxoplasmose é alta. A toxoplasmose congênita é considerada uma importante causa mundial de mortalidade e morbidade infantil. Nos EUA, estima-se que a cada ano nasçam cerca de 3.000 crianças com toxoplasmose congênita, e o custo anual associado aos cuidados delas são de US$ 31 a 40 milhões Revisão da Literatura 28 V.M.COSTA 2008 (DUBEY, 1994). No Brasil, anualmente nascem cerca de 60000 crianças com a doença, sendo, portanto, de alta magnitude, podendo resultar em abortos, partos prematuros, natimortos e casos de malformação. A gravidade é inversamente proporcional à idade gestacional, e à facilidade de transmissão (MACÊDO, 1994). A transmissão ao feto, se dá principalmente durante a fase inicial da infecção, ou raramente, como resultado de recrudescência da infecção crônica materna, durante a gravidez (DESMONTS et al., 1990). A incidência e a prevalência da infecção pré-natal por T. gondii variam em diferentes países, sendo difícil comparar estes dados na infecção congênita entre populações distintas, devido aos variados métodos sorológicos utilizados, bem como, diferenças de exposição às fontes de infecção (DESMONTS et al., 1990; TENTER et al., 2000). Estimativas recentes, baseadas em estudos sorológicos, sugerem incidências de infecção materna primária, durante a gestação, em diferentes populações na Europa, Ásia, Austrália e América, variando de um a 310 por 10000 gestações (TENTER, et al., 2000). O risco de se adquirir a toxoplasmose durante a gestação, correlaciona-se com a sua prevalência na comunidade, com o número de fontes de infecção e com o número de mulheres grávidas na comunidade com sorologia negativa para essa zoonose (FRENKEL, 2000). A cidade de São Paulo apresenta 67% de gestantes sororeagentes e uma incidência da infecção congênita de 16 neonatos por 1000 nascidos vivos (GUIMARÃES et al., 1993). Quanto à infecção materno-fetal, um estudo prospectivo realizado por Camargo Neto et al. (2000), demonstrou que das 140914 amostras de soro provenientes de todas as regiões do Brasil, 47 eram de casos de toxoplasmose congênita, ou seja, uma prevalência de um caso em cada 3000 nascimentos. Já no município de Campos dos Goytacases-RJ, a incidência de toxoplasmose congênita foi de cinco casos entre os 2550 bebês avaliados (PETERSEN et al., 2001). Admite-se que raramente uma infecção materna adquirida antes da gravidez possa ser transmitida ao feto, a não ser que a placenta seja colonizada em função de uma recorrência parasitêmica e a imunidade materna seja insuficiente para reprimir a proliferação do parasito (DESMONTS et al., Revisão da Literatura 29 V.M.COSTA 2008 1990). Os riscos de infecção intra-uterina, da manifestação da toxoplasmose congênita e a gravidade da doença dependem do período de gestação no qual a infecção ocorre, assim como, da competência imunológica da mãe durante a parasitemia, da carga parasitária e virulência dos parasitos transmitidos ao feto (TENTER et al., 2000). Em relação à infecção materno-neonatal há poucos estudos, embora alguns trabalhos revelem a presença de taquizoítos no leite de várias espécies como ovino, caprino, bovino e de camundongos experimentalmente infectados (PETTERSEN, 1984; TENTER et al., 2000). O leite é considerado importante veículo na transmissão da toxoplasmose ao homem (SAARI e RAISANEN, 1974; SOGANDARES- BERNAL et al., 1975). Trabalhos experimentais demonstram que o leite de animais infectados contém taquizoítos, possibilitando a transmissão para a prole (SANGER e COLE, 1955). Riemann et al. (1975) relatou um caso de infecção pelo T. gondii em crianças, onde suspeitou-se do contágio pela ingestão de leite de cabras não pasteurizado, embora argumente-se que o suco gástrico inative rapidamente os taquizoítos. Dubey (1998a) discorda do argumento, pois demonstrou a infecção em camundongos e gatos infectados pela via oral com taquizoítos, supondo assim que ocorra a infecção pela ingestão de leite contendo a forma parasitária. Bonametti et al. (1997) descreveram a transmissão do T. gondii em uma mãe que adquiriu a primoinfecção, pela ingestão de carne ovina crua contaminada por cistos, e possivelmente transmitiu o parasito ao recém- nascidos pela amamentação. Os trabalhos com isolamento de parasitos viáveis de tecidos comestíveis, bem como do leite caprino (CHIARI e NEVES, 1984) revelam a importância da toxoplasmose animal, decorrente do fato dos animais infectados servirem como fontes direta ou indireta, de infecção para o homem. A demonstração da ocorrência da toxoplasmose em humanos, associada à ingestão de leite de cabras in natura, comprovadamente infectadas, torna esses animais importante fonte de infecção, principalmente Revisão da Literatura 30 V.M.COSTA 2008 pelo fato dos caprinos não serem submetidos normalmente a controle sanitário da toxoplasmose (CHIARI et al., 1987; SKINNER et al., 1990). Há trabalhos experimentais relatando que camundongas lactantes infectadas, eliminam o T. gondii no leite (PETTERSEN, 1984). Vários aspectos dos mecanismos responsáveis pela infecção toxoplásmica são elucidados a partir de modelos experimentais (HUTCHISON et al., 1982, SIMS et al., 1988) e o rato é o animal mais empregado nestes estudos (GAZZINELLI et al., 1992). De acordo com Dubey e Beattie (1988), a similaridade da suscetibilidade e patogenia em humanos e animais, sugere que a enfermidade pode ser comparável em muitos aspectos. O rato é uma das espécies mais resistentes ao T. gondii, sendo a infecção nestes animais similar à nos humanos adultos (DUBEY, 1998). Dentre os modelos animais, a rata é que mais se assemelha a mulher, particularmente em relação ao sistema endócrino e a morfologia de ductos e alvéolos mamários (SOUZA, 1970; RUSSO e RUSSO 1987). A lactação é indispensável para o crescimento e desenvolvimento dos recém-nascidos (SILVA e VASCONCELLOS, 1988), que começam a mamar depois de 15 a 29 minutos do nascimento. Também em relação à placenta é muito semelhante histologicamente a da mulher, sendo ambas do tipo hemocorial, com menor número de camadas de tecido interpostas entre a circulação fetal e a materna (LOKE, 1982). O T.gondii possui três linhagens clonais predominantes, designadas como tipo I, II e III, ocorrendo globalmente nos animais e no homem (DARDÉ et al., 1992). As linhagens são correlacionadas com a virulência em camundongos. As cepas de T. gondii se dividem em cepas avirulentas e virulentas para estes animais. As cepas virulentas se multiplicam rapidamente no hospedeiro e causam a infecção aguda, enquanto as avirulentas formam cistos levando a uma infecção crônica (JOHNSON, 1997). A freqüência dos diferentes genótipos em animais pode ser considerada conflitante. Segundo o estudo de Howe e Sibley (1995), a freqüência das cepas tipo III é maior em animais do que em casos humanos, Revisão da Literatura 31 V.M.COSTA 2008 devendo-se considerar que, em geral, as amostras de T.gondii provenientes de humanos causam doença clínica, enquanto a maioria daquelas provenientes de animais representam infecções crônicas e subclínicas. As cepas tipo II levam a infecção crônica e produção de cistos teciduais em camundongos, enquanto as cepas do tipo I são extremamente virulentas para camundongos, causando níveis significativos de parasitemia, que pode aumentar o risco da transmissão transplacentária ou severidade de infecção nos fetos em desenvolvimento. Apesar da dificuldade de se comparar estudos de grupos de pesquisas distintos, pelo uso de diferentes cepas do parasito, linhagens e protocolos de infecção, os experimentos consistem no desafio da mãe não infectada durante a prenhez, e avaliação da transmissão aos fetos (INNES, 1997). Em animais experimentais infectados a presença de T. gondii pode ser estudada também pela reação em cadeia pela polimerase (PCR). A técnica de PCR para a detecção de T.gondii foi desenvolvida por Burg et al. (1989). Desde então diversos autores a utilizam para a detecção de DNA toxoplásmico em vários espécimes biológicos, tais como humor aquoso, coração, cérebro, placenta, fígado, liquido cerebroespinhal, fluido broncoalveolar, líquido amniótico e sangue (PAUGAM et al., 1995; MORGAN, 2000). A maioria dos estudos utilizam a amplificação dos genes B1 (PCR-B1) e SAG-1 (PCR-SAG-1) do T. gondii (DA SILVA e LANGONI, 2001). As técnicas de PCR baseadas na detecção dos genes SAG-1, que codifica a principal proteína de membrana de taquizoítos e B1, de função desconhecida, têm sensibilidade limitada pelo baixo número de cópias das seqüências alvo, já que o gene B1 repete-se 35 vezes e o SAG-1 uma vez. A PCR de DNA ribosssomal tem sido investigada, pois esta seqüência repete-se aproximadamente 110 vezes no parasito (ELLIS, 1998), bem como, uma seqüência com 200 a 300 cópias no genoma nuclear do T. gondii, descrita por Homan et al. (2000). Revisão da Literatura 32 V.M.COSTA 2008 A literatura mostra que estudos sobre a infecção congênita empregam principalmente a PCR-B1 em amostras de líquido amniótico, sangue fetal ou placenta e que esta técnica apresenta maior sensibilidade que outros métodos de diagnóstico, variando de 61 a 90% (PELLOUX et al., 1996; JENUM et al., 1998). A detecção do parasito pela PCR em animais experimentalmente infectados, visando avaliar a parasitemia foi efetuada por alguns autores, entretanto sua detecção depende também da cepa de T. gondii, via de inoculação, estágio de desenvolvimento e carga parasitária inoculada, bem como do hospedeiro (HAFID, 2001). Objetivos 33 V.M.COSTA 2008 3. OBJETIVOS Objetivo Geral: Verificar presença de T.gondii no leite e a transmissão galactogênica a partir da infecção experimental em ratas Wistar. Objetivos Específicos: 1. Avaliar a soroconversão para T. gondii pesquisando IgG nas ratas Wistar experimentalmente infetadas, e de seus respectivos filhotes; 2. Avaliar a infecção toxoplásmica em ratas cronificadas, cronificadas e imunodeprimidas pós-parto, e primoinfectadas pós-parto, e nas respectivas crias; 3. Utilizar protocolo de imunossupressão em ratas Wistar infectadas cronicamente pelo T.gondii no período de lactação para avaliar a recrudescência da enfermidade e infecção nos respectivos filhotes; 4. Verificar a presença do parasito nas ratas experimentalmente infectadas e, em seus respectivos filhotes a partir de amostras de tecidos cerebral, hepático, pulmonar, cardíaco, muscular esquelético, língua, diafragma e tecido mamário apenas nas ratas mães. Material e Métodos 34 V.M.COSTA 2008 4. MATERIAL E MÉTODOS Os trabalhos experimentais foram realizados no laboratório do Núcleo de Pesquisa em Zoonoses (NUPEZO), Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” (DHVSP/FMVZ/UNESP), campus de Botucatu/SP. 4.1. Animais experimentais Para o experimento foram utilizados ratos (Rattus norvegicus) da linhagem Wistar albinos, machos e fêmeas, com idade de 30 dias com aproximadamente 60g. E para a obtenção de cistos teciduais de T. gondii, utilizou-se camundongos Swiss, albinos, de 30 dias de idade, com aproximadamente 20g, ambos gentilmente cedidos pelo Biotério Central, UNESP, campus de Botucatu/SP, e mantidos no Infectório do Laboratório de Diagnóstico de Zoonoses, NUPEZO, DHVSP/FMVZ/UNESP, campus de Botucatu/SP. 4.2. Delineamento experimental Foram utilizados três grupos experimentais, G1, G2 e G3 com seis ratas fêmeas em cada grupo. As fêmeas foram inoculadas via oral com auxilio de gavagem com 104 bradizoítos da cepa BTU4. As ratas do G1 e G2 foram infectadas 60 dias antes do acasalamento e as ratas do G3 logo após o parto. Os animais do G2 foram submetidos à imunossupressão logo após- parição utilizando dexametasona na dose de 2,5mg/Kg/dia, durante 15 dias, segundo o protocolo de Djurkovic-Djakovic e Milenkovic (2001) com adaptações para via subcutânea. Material e Métodos 35 V.M.COSTA 2008 Durante o experimento, os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno 41 x 34 x 16 cm, piso coberto com maravalha autoclavada, com ração comercial e água filtrada por osmose reserva (Quimis®) ad libitum. Previamente à inoculação, todos os animais ficaram em observação por um período de adaptação mínimo de 15 dias no infectório do NUPEZO, e submetidos à sorologia para toxoplasmose, utilizando-se a técnica de reação de imunofluorescência indireta (RIFI), segundo Camargo (1964), e também o método de aglutinação direta (MAD) de acordo com Desmonts e Remington (1980), tendo ambas como ponto de corte o título 16. Frente ao resultado negativo, as ratas do G1 e G2 foram inoculadas e mantidas em observação durante 60 dias, a partir da infecção, efetuando-se a coleta quinzenal de sangue, para a obtenção de soro para realização da RIFI e da MAD. Ao final do período de observação foram acasaladas juntamente com o G3. Foi colhido o leite das mães durante os primeiros 15 dias de lactação para posterior análise das amostras pelo Giemsa e PCR. Após 21 dias, todos os animais foram eutanasiados, ratas fêmeas e filhotes, coletando- se os órgãos para avaliação da presença do parasito e da infecção galactogênica, pela inoculação de camundongos (bioprova) e PCR. 4.3. Cepas de T. gondii 4.3.1. Produção de antígeno para RIFI Utilizou-se a cepa RH de T. gondii, isolada por Sabin em 1939 de uma criança nos Estados Unidos (SABIN, 1941), pertencente ao genótipo I e mantida por inoculação intraperitoneal semanalmente de camundongos Swiss albinos de 30 dias com 1mL de exsudato peritoneal proveniente de camundongos previamente infectados pela via intraperitoneal por T. gondii. Após o período de incubação, os camundongos foram eutanasiados em câmara de saturação de vapor de isofluorano, obtendo-se o exsudato peritoneal. Este exsudato, rico em taquizoítos, foi homogeneizado volume/volume em solução de formalina a 2%, obtendo-se uma suspensão a 1%, e incubada a 37�C por 30 minutos, agitando-se suavemente por inversão Material e Métodos 36 V.M.COSTA 2008 dos tubos, a cada 10 minutos, com posterior centrifugação a 1600 x g por 5 minutos. Após, desprezar-se o sobrenadante, ressuspendeu-se o sedimento em 2mL de solução salina tamponada de fosfatos (SSTF) pH 7.2, centrifugando-se, como anteriormente. Este procedimento foi repetido por duas a três vezes até a obtenção de 20 a 30 parasitos/campo, utilizando-se microscópio com aumento de 40 vezes para a leitura, para examinar 50μL da suspensão final, entre lâmina e lamínula. 4.3.2. Preparação de lâminas para RIFI Para fixação do antígeno em lâminas utilizadas na prova sorológica, pipetou-se 10μL da suspensão antigênica nas delimitações de lâminas adequadas para esta finalidade. Removeu-se o excesso, restando apenas uma fina película, que posteriormente foi secada à temperatura ambiente. As lâminas assim preparadas foram mantidas em caixas apropriadas, em freezer a -20ºC, até o momento de sua utilização. 4.3.3. Diluição dos soros Em microplacas distribuiu-se 150μL de SSTF pH 7.2 em cavidades de acordo com o número de amostras a serem testadas. Adicionou- se 10μL do soro a ser testado na primeira cavidade na proporção de 1:16. Transferiu-se 50μL do soro diluído da primeira cavidade para a segunda, homogeneizando-se, repetindo-se esta operação até a quinta cavidade, desprezando-se 50μL da última cavidade (diluições 1:64, 1:256, 1:1024, 1:4096). O mesmo procedimento foi realizado para uma amostra de soro sabidamente positiva (controle positivo) e outra sabidamente negativa (controle negativo). 4.3.4. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) Na lâmina fixada com o antígeno, distribuiu-se 10�L de cada diluição do soro nos orifícios de acordo com protocolo previamente determinado. Incubaram-se as lâminas à 37�C em câmara úmida por 30 minutos, em seguida foram lavadas duas vezes com SSTF pH 7.2, deixando-as em imersão por 10 minutos cada lavagem. A seguir foram secadas e coradas. Material e Métodos 37 V.M.COSTA 2008 Procedeu-se a diluição do conjugado anti-IgG rat-FITC (Bethyl®), em solução de azul de Evans a 20mg% diluída em SSTF pH 7.2 na proporção 1:5. Esta solução preparada com o conjugado diluído em solução de azul de Evans foi distribuída em todos os orifícios da lâmina tratada com o soro, colocando 10�L da solução. Novamente a lâmina foi incubada e lavada, como descrito anteriormente. Depois de seca, colocou-se duas gotas de glicerina, cobrindo-se com lamínula 24 x 60 x 0,18 mm, examinando em microscópio de fluorescência (Zeiss SH250, Zeiss�) com objetiva de aumento de 40 vezes e ocular de aumento de 10 vezes. 4.3.5. Produção de antígeno para o método de aglutinação direta modificada (MAD) Para detecção de anticorpos anti-Toxoplasma gondii, utilizou- se como antígeno o fluido peritoneal de camundongos previamente infectados com T. gondii, cepa RH, preparado a partir do homogeneizado com igual volume de células de sarcoma TG180, obtidas por passagens sucessivas em camundongos albinos Swiss com idade de 30 a 40 dias previamente inoculados pela via intraperitoneal com 0,2mL, a cada 12 dias. A suspensão de sarcoma e taquizoítos foi inoculada via intraperitoneal em camundongos, e após 48 horas, procedeu-se o lavado peritoneal com 10mL de SSTF pH 7.2. Os fluidos peritoneais ricos em células parasitadas foram tratados com solução de tripsina a 0,05% para rompimento das células e liberação dos parasitos. A suspensão de taquizoítos foi fixada em solução de formalina a 6% por 24 horas a temperatura ambiente. Posteriormente a formalina foi removida por meio de centrifugações sucessivas a 1200 x g por 10 minutos, sendo o antígeno ressuspendido em tampão borato pH 8.7 (DESMONTS e REMINGTON, 1980). A diluição de uso do antígeno foi determinada pelo teste de várias diluições frente a soros controle positivos e negativos. 4.3.6. Método de Aglutinação Direta (MAD) Os soros foram diluídos em SSTF pH 7.2 na diluição 1:16 semelhante a RIFI, sendo transferidos 25μL de cada diluição para microplaca com fundo em V, adicionando-se então 25μL de 2-mercaptoetanol 0,1M e 50μL Material e Métodos 38 V.M.COSTA 2008 de antígeno por cavidade da microplaca. As placas foram incubadas a temperatura 37�C por seis a 12 horas, sendo consideradas positivas aquelas diluições dos soros em que se formava uma película que cobria pelo menos 50% da cavidade, e negativas quando se formava botão ou anel no fundo da cavidade (Figura 1). 4.3.7. Inoculação dos animais Para inoculação das ratas utilizou-se a cepa BTU4 isolada de cérebro de um cão, com sintomatologia nervosa atendido no ambulatório de Enfermidades Infecciosas dos Animais do Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, campus de Botucatu-SP. Esta cepa pertence ao genótipo I, e é mantida por inoculação intraperitoneal semanal (Figura 2), em camundongos Swiss albinos de 30 dias, com 1mL de exsudato peritoneal obtido de camundongos previamente infectados. Esta cepa apresenta comportamento patogênico para camundongos albinos e formação de cistos teciduais cerebrais em ratos. Para a inoculação das ratas o tecido cerebral dos camundongos infectados foi submetido à separação dos cistos teciduais de T. gondii para obtenção de bradizoítos por meio da pepsinização, de acordo com Dubey (1998a), descrita originalmente para ratos. Material e Métodos 39 V.M.COSTA 2008 1 2 3 1 2 3 Figura 1. Reação de aglutinação em amostras de soro. 1) Controle sabidamente positivo, 2) Amostra testada e positiva, 3) Controle sabidamente negativo. Botucatu, 2008. Figura 2. Inoculação de taquizoítos via intraperitoneal em camundongos Swiss albinos de 30 dias de idade para produção de antígeno, utilizado na inoculação experimental. Botucatu, 2008. Material e Métodos 40 V.M.COSTA 2008 Os camundongos inoculados com a cepa BTU4 foram tratados com sulfadiazina (400mg sulfadiazina e 10g de bicarbonato de sódio/L de água), na água de bebida, do 3o ao 20o dia pós-inoculação (dpi), de acordo com o protocolo de Villard et al. (1997). Com a infecção prévia de 60 dias os animais soropositivos para RIFI e MAD, foram eutanasiados em câmara saturada de isofluorano. Os cérebros foram removidos assepticamente e lavados com 5mL de solução salina 0,9%/cérebro para remover as hemácias aderidas. Foram incubados a temperatura de 40C por 12 horas em 4mL de solução salina 0,9%/cérebro e posteriormente homozeneizados por meio de passagens sucessivas em seringa com agulha 30 x 7. O material foi transferido para tubo de centrifuga e adicionado Percoll a 25% e centrifugado a 2000 x g por 30 minutos, em posição “brake off”. O tecido cerebral foi removido cuidadosamente da superfície do tubo, deixando apenas 0,5mL no tubo. Resuspendeu-se o sedimento com 10mL de solução salina 0,9%, centrifugou-se novamente a 1200 x g por 10 minutos, em posição “brake off”. Descartou-se o sobrenadante, resuspendendo-se em 1mL de solução salina 0,9%, procedendo-se a contagem de cistos em microscópio óptico, em alíquota de 8�L da suspensão entre lâmina e lamínula 22 x 22 (Figura 3). O material foi submetido à técnica de digestão em solução ácida de pepsina segundo Dubey (1998a), para liberação dos bradizoítos do interior dos cistos. Completou-se o volume da suspensão de cistos com 10 mL de solução salina 0,9%, adicionando-se 10mL de solução ácida de pepsina previamente aquecida a 37�C por 5minutos, sob agitação constante. Em seguida a suspensão foi neutralizada com solução de bicarbonato de sódio 1,2% e centrifugada a 1200 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e ressuspendido com solução salina 0,9% para 1mL. Os bradizoítos foram contados em câmara de Newbauer. A concentração do número de bradizoítos foi ajustada para 104 bradizoítos em 100�L de suspensão, para utilização como inoculo para as ratas do experimento. Material e Métodos 41 V.M.COSTA 2008 Figura 3. Cisto de T. gondii obtido pelo método de separação de cistos pelo Percoll 25% em tecido cerebral de camundongo infectado com a cepa BTU4. Aumento de 1000x. Botucatu, 2008. 4.4. Infecção experimental As fêmeas inoculadas com a cepa BTU4 receberam 104 bradizoítos em 100μL de suspensão pela via oral, por gavagem. As ratas do G1 e G2 foram infectadas 60 dias antes do acasalamento e as ratas do G3 após o parto. 4.5. Acasalamento Machos e fêmeas inicialmente foram avaliados de acordo com a idade entre 100 a 120 dias, e com peso entre 250 a 300g, para posterior acasalamento, assegurando assim a maturidade sexual dos animais. Os três grupos foram submetidos ao acasalamento na proporção de um macho para cada três fêmeas, mantidas em caixas de polipropileno 41 x 34 x 16 cm, piso coberto com maravalha autoclavada, acondicionadas em estante ventilada, oferecendo-se ração comercial e água filtrada por osmose reversa (Quimis®) ad Material e Métodos 42 V.M.COSTA 2008 libitum em estante ventilada Alesco®, permanecendo no infectório do NUPEZO. As fêmeas foram inspecionadas diariamente para observação do tampão vaginal mucoso, sendo designado “dia 0” o dia desta observação, considerando-se como início da prenhez (ROBERTS e ALEXANDER, 1992), já que esta característica evidência a ocorrência da cópula durante as 24 horas anteriores (HARKNESS e WAGNER, 1993). Depois de constatada a presença desta secreção, permaneceram nas caixas apenas as fêmeas. A partir do 18o dia de prenhez, foram separadas em caixas individuais e acompanhadas diariamente até o momento do parto. 4.6. Anestesia e eutanásia dos animais experimentais Utilizou-se 25mg/Kg de cloridrato de cetamina via intramuscular para anestesia dos grupos experimentais, para coleta de leite e sangue. Para eutanásia utilizou-se câmara saturada de vapor de isoflurano (BRASIL, 2005). 4.7. Redução da ninhada Devido ao elevado número de nascidos/mãe e a incapacidade fisiológica da sobrevivência de todos os filhotes, procedeu-se a redução dos mesmos. Desta forma, optou-se por deixar a ninhada com o número de seis filhotes por rata. 4.8. Coleta das amostras 4.8.1. Sangue As amostras sanguíneas foram coletadas pela punção do plexo retro-orbital dos animais com auxílio de tubos capilares, em microtubos de plástico de 1,5mL. Foram dessoradas após retração do coágulo e centrifugadas a 2500 x g por 10 minutos, acondicionando-se os soros em novos microtubos Material e Métodos 43 V.M.COSTA 2008 de plástico de 1,5mL, identificados e mantidos em freezer a –20ºC até o momento da realização das provas sorológicas. 4.8.2. Leite Para auxiliar na coleta da secreção láctea utilizou-se 1 mL (5 UI) de ocitocina via intraperitoneal (LEITE et al., 2002), procedendo a ordenha manual das mamas utilizando-se pipeta pasteur descartável estéril, realizando anti-sepsia prévia, com álcool iodado (Figura 4). Convencionou-se o volume de 300�L de amostra de leite e seis coletas intercalando os dias de coleta até a 3ª coleta, e a partir da 4ª coleta, estabeleceu-se o intervalo de dois dias até o 15o dia de lactação, já que após 18 dias de parição, a rata começa a rejeitar os filhotes nas suas tentativas de mamar e, gradualmente, os desmamam (BROWN, 1998). Há decréscimo nos níveis de hormônios lactogênicos e estase de leite nos alvéolos, ocorrendo à involução da glândula mamária (QUARRIE et al.,1996). Para o G1 e G2 a primeira coleta foi no segundo dia após a parição e para G3 a coleta iniciou-se no 1o dpi. As amostras foram armazenadas individualmente em microtubos de 1,5mL estéreis, identificados e mantidos sob congelamento a -80�C para realização da PCR. Confeccionou-se esfregaço da secreção láctea, em lâminas para microscopia que foram fixadas em metanol e coradas pelo método de Giemsa. Material e Métodos 44 V.M.COSTA 2008 Figura 4. Demonstração da coleta de leite. 1) Preparação do animal anestesiado para coleta de leite; 2) massagem da glândula mamária após a aplicação de ocitocina; 3) pipeta pasteur estéril e descartável para coletar a amostra; 4) leite coletado e armazenado em microtubo. Botucatu, 2008. 4.8.3. Amostras teciduais Coletou-se com auxílio de tesouras e pinças estéreis, sob capela de fluxo laminar os cérebros, fígados, pulmões, musculatura estriada esquelética, cardíaca, diafragma, língua tanto das ratas e filhotes e tecido glandular mamário somente nas ratas mães, separando-os em duas alíquotas, uma individual e a outra em pool. Confeccionaram-se lâminas com imprints de tecido glandular mamário que foram fixadas em metanol e coradas pelo método de Giemsa. As amostras individuais foram colocadas, em cadinhos de porcelana estéreis e maceradas em gral com pistilo, e resuspendidas em água ultra-pura, na proporção aproximada de 1:2 para cérebro, fígado, pulmão, coração, língua, diagrama, e 1:3 para musculatura estriada esquelética e tecido glandular mamário, sendo acondicionadas em microtubos de 1,5mL e congeladas a -80�C até o momento do processamento. Já as amostras em pool dos tecidos foram trituradas em homogeneizador vertical Black & Decker®. Material e Métodos 45 V.M.COSTA 2008 4.9. Exames realizados 4.9.1. Sorológico Todas as amostras de soro coletadas durante o experimento foram submetidas às provas sorológicas RIFI e MAD, para pesquisa de anticorpos das classes IgG, com descrito anteriormente. 4.9.2. Citologia O tecido mamário das mães e a secreção láctea foram examinados utilizando-se o método de Giemsa, para pesquisa de taquizoítos e cistos, em microscópia óptica por imersão (aumento de 1000 vezes). 4.9.3. Inoculação em camundongos - Bioprova O pool de órgãos das ninhadas e respectivas mães foram divididos em duas partes, a primeira parte foi submetida à técnica de digestão em solução ácida de pepsina segundo Dubey (1998a), e outra parte processada in natura. Ambas as amostras (digeridas e in natura), foram inoculadas pela via subcutânea, em três camundongos Swiss de 30 dias, sendo observados por um período de 60 dias. Os animais que desenvolveram sinais clínicos foram eutanasiados, e dos que vieram a óbito, examinou-se o exsudato peritoneal, para a pesquisa de taquizoítos de T.gondii. Dos assintomáticos, coletou-se sangue para a obtenção de soro, e realização da RIFI e MAD. Foram consideradas positivas as amostras que revelaram taquizoítos no exsudato peritoneal, ou aquelas reagentes para RIFI e para MAD, com título mínimo de 16 para ambas as provas sorológicas. 4.9.4. Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) A reação em cadeia pela polimerase para a detecção de DNA de T. gondii no leite e nos tecidos foi realizada utilizando-se os oligonucleotídeos TOX4 e TOX5 (Quadro 1), segundo descrito por Homan et al. (2000), amplificando uma região de 529 pares de base (pb). Material e Métodos 46 V.M.COSTA 2008 Quadro 1. Seqüências dos oligonucleotídeos utilizados na detecção (TOX4 e TOX5) de Toxoplasma gondii, em amostras de leite materno e tecidual. Oligonucleotídeos Seqüência de bases TOX4 5’CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG3’ TOX5 5’CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT3’ 4.9.4.1. Extração e purificação de DNA Para extração e purificação de DNA das amostras de leite e tecidos utilizou-se o kit de extração, GFX Genomic Blood DNA Purification Kit (GE Healthcare/Life Sciences), pelo método proporcional (scalable method) com algumas alterações (Anexo D), e o Blood genomicPre Mini Spin Purification Kit (GE Healthcare/Life Sciences), respectivamente conforme instrução do fabricante (Anexo E). 4.9.4.2. Amplificação de DNA Cada tubo de reação de 0,2mL recebeu 2,5μL de tampão de PCR (50mmol KCl, 10mmol Tris-HCl), 0,75μL de MgCl (1,5mmol), 0,25μL da solução de deoxinucleotídeos (1,25 mmol), 0,15U/�L de taq-polimerase (Invitrogen), 5μL de cada oligonucleotídeos TOX4 e TOX5 (10μM/μL - dialab), 10μL de amostra obtida no final da extração e 17,35μL de água ultra-pura. A amplificação foi realizada em termociclador MJ Research®, em 35 ciclos onde consistiu na desnaturação, anelamento e extensão e um ciclo final para completar a extensão dos amplicons (Quadro 2). Material e Métodos 47 V.M.COSTA 2008 Quadro 2. Etapas da amplificação das regiões codificadoras dos oligonucleotídeos utilizados na detecção (TOX4 e TOX5) de Toxoplasma gondii. Etapas � de ciclos Período (minutos) Temperatura (ºC) Desnaturação 1 7 94 Anelamento 35 1 72 Extensão dos amplicons 1 10 72 4.9.4.3. Eletroforese em gel de agarose para visualização dos produtos amplificados na PCR Para cada amostra de 10μL submetida à amplificação adicionou-se 2μL de uma solução de azul de bromofenol (0,15g Tris- hidroximetil-aminometano-Tris + 1mg azul de bromofenol + 4g sacarose + 10mL água deionizada). Após homogeneização, esta solução foi submetida à eletroforese horizontal em gel de agarose 2,0% com tampão tris-borato-EDTA 0,5x (54g Tris-hidroximetil-aminometano-Tris + 27,5g ácido bórico + 20mL solução estoque de EDTA 0,5M + 980mL água deionizada). A corrida foi realizada a 100 voltz por aproximadamente 60 minutos. Após a corrida, o gel foi submerso em solução de brometo de etídeo (5μL brometo de etídeo + 20mL tampão tris-borato-EDTA 5x + 80mL água deionizada), por aproximadamente 40 minutos e a visualização das bandas, indicativas da presença de T. gondii, realizada em transiluminador ultravioleta, com filtro de 300nm. Os géis foram fotografados utilizando-se sistema fotográfico Polaroid®. 4.9.4.4. Limiar de detecção de T. gondii para amostras de leite e tecidos As técnicas de extração, purificação, PCR e eletroforese foram testadas em amostras de leite de ratas e em diferentes amostras de tecidos sabidamente negativas para T gondii, que foram contaminadas experimentalmente com uma suspensão de 1,5 x 106 taquizoítos por mL de T. Material e Métodos 48 V.M.COSTA 2008 gondii, cepa BTU4, contados em câmara de Neubauer, diluída com SSTF pH 7.2 estéril nas concentrações aproximadas de 1,5x100, 1,5x101, 1,5x102, 1,5x103 e 1,5x104 por mL de suspensão de cada amostra de leite e tecido. 4.9.4.5. Controles Para cada seqüência de extração e PCR de leite e tecidos foram utilizados controles positivo e negativo. Para o leite utilizou-se como controle positivo amostras de leite de ratas contaminadas com T.gondii, na concentração de 2,0 x 102 taquizoítos/mL. Para os tecidos utilizou-se as concentrações de 2,0 x 102 taquizoítos/mL, para as amostras de suspensão de cérebro, pulmão e língua e de 2,0 x 103 taquizoítos/mL para amostras de musculatura cardíaca e esquelética, fígado, diagrama e tecido mamário. Como controle negativo utilizou-se água ultra-pura para todas as amostras a serem testadas. 4.10. Análise estatística* Os resultados obtidos foram analisados pelos testes estatísticos não paraméricos de Wilcoxon, Mann-Whitney, McNemar e Exato de Fisher para as sorologias e o teste de Log-Rank para análise do leite quando utilizou-se a coloração de Giemsa e PCR. Os demais resultados foram analisados descritivamente. Para todas as análises foi considerado um nível de significância � =0,05. * Consultoria Técnica na análise de dados: Prof. Dr. Aristeu Vieira Silva. Mestrado em Ciência Animal, Universidade Paranaense/UNIPAR - Umuarama/PR. Resultados 49 V.M.COSTA 2008 5. RESULTADOS 5.1. Animais experimentais Durante o experimento, os animais do G1 e G3 tanto ratas mães como filhotes não apresentaram sinais clínicos pertinentes à infecção toxoplásmica. No G2, ocorreu óbito de três ratas e das ninhadas de todas as ratas deste grupo. Verificaram-se principalmente alterações clínicas, como prostração, queda de pêlos e perda de peso. O exsudato peritoneal desde animais, não revelou formas taquizoíticas do parasito. Para os animais deste mesmo grupo calculou-se a mediana de dias de sobrevivência, que foi de 13 dias nas ratas e nove dias nos neonatos. Ainda dos animais do G2 que morreram os imprints de fígado revelaram formação de granulomas de dimensões variáveis, constituídos por células pleomórficas apresentando citoplasma alongado e levemente acidofílico, e contendo núcleo central com um único nucléolo e predomínio de neutrófilos degenerados. No pulmão observou-se necrose e descamação do epitélio bronquiolar com infiltrados inflamatórios compostos por células mononucleares no parênquima pulmonar. Resultados 50 V.M.COSTA 2008 5.2. Exames sorológicos Os resultados dos exames sorológicos pela RIFI e MAD para detecção de IgG são apresentados na tabela 1, indicando a mediana dos títulos de cada grupo experimental das ratas infectadas nos diferentes momentos de coleta de amostras. A comparação entre os testes sorológicos dos animais do mesmo grupo em um mesmo momento, e também, a comparação entre grupos para o mesmo teste e momento, observando uma maior sensibilidade da MAD. As figuras 6 a 8 demonstram graficamente os mesmos dados indicando a média em log dos títulos de cada grupo experimental nos diferentes momentos de coleta das amostras. Ainda, nestas figuras observa-se um aumento considerável de título de anticorpos anti-T. gondii com 30 dias pós infecção (dpi) tanto na RIFI com na MAD para os animais do G1 e G2, elevando-se até 45dpi, momento em que se estabilizou. No momento 21 colheu-se amostra somente para os animais do G3, grupo com infecção aguda, analisando-se ambas as provas sorológicas. Os resultados evidenciaram que todos os animais dos grupos G1 e G2, soroconverteram após 30 dias de infecção, ao contrário dos animais do G3. Todos os títulos individuais de cada grupo são apresentados nas tabelas 14, a 16 no anexo B. O resultado da sorologia dos filhotes, estão apresentados nas tabelas 2 e 3 onde pode-se comparar os resultados dos testes sorológicos entre os filhotes do mesmo grupo, G1 e G3 respectivamente. Apenas os filhotes de G1 apresentaram diferença estatística significativa entre os testes. Quando comparados os teste RIFI x MAD entre os filhotes de G1 x G3, observa-se diferença significativa para ambos os testes (Tabelas 4 e 5). Com a morte dos filhotes do G2, não foi possível a pesquisa de anticorpos anti-T. gondii. A mediana de dias de sobrevivência dos neonatos deste grupo foi de nove dias, variando de 6 a 16 dias. Resultados 51 V.M.COSTA 2008 Tabela 1. Resultado do exame sorológico pela RIFI a MAD para a detecção de anticorpos da classe IgG, anti-T.gondii, nas fêmeas inoculadas. Botucatu, 2008. Momento Grupo Método Estatística 15 21 30 45 60 75 90 Mediana 8Aa - 256Ab 640Aa 640Aa 640Aa 256Aa P25 0 - 256 256 256 256 256RIFI P75 52 - 256 1024 1024 1024 832 Mediana 64Ba - 1024Aa 1024Ba 1024Ba 1024Ba 1024Ba P25 64 - 1024 1024 1024 1024 1024 G1 MAD P75 64 - 3328 3328 3328 3328 3328 Mediana 8Aa - 64Aa 256Aa 256Aa 256Aa 256Aa P25 0 - 64 256 256 256 256RIFI P75 16 - 64 256 256 256 256 Mediana 64Aa - 640Aa 640Aa 1024Aa 1024Ba 1024Ba P25 16 - 256 256 1024 1024 1024 G2 MAD P75 64 - 1024 1024 1024 1024 1024 Mediana 16Aa 16A P25 4 16 RIFI P75 16 16 Mediana 64Ba 64B P25 28 28 G3 MAD P75 64 64 Estatística: Para um mesmo grupo e momento, valores de mediana seguidos de letras maiúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre os testes de detecção de anticorpos, pelo teste de Wilcoxon, para um �=0,05. Para um mesmo teste e momento, valores de mediana seguidos de letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre os grupos, pelo teste de Kruskall-Wallis (momento 15) ou pelo teste de Mann-Whitney (outros momentos), para um �=0,05. Resultados 52 V.M.COSTA 2008 Figura 5. Dinâmica dos títulos de anticorpos séricos anti-T. gondii, detectados pela RIFI, nas ratas do G1 e G2 infectadas experimentalmente com 104 bradizoítos pela via oral com a cepa BTU4. Botucatu, 2008. Figura 6. Dinâmica dos títulos de anticorpos séricos anti-Toxoplasma gondii, detectados pelo método de aglutinação direta, nas ratas do G1 e G2 infectadas experimentalmente com 104 bradizoítos pela via oral com a cepa BTU4. Botucatu, 2008. Resultados 53 V.M.COSTA 2008 Figura 7. Dinâmica dos títulos de anticorpos séricos anti-T. gondii, detectados pela RIFI e pelo MAD do G1 e G2 infectadas experimentalmente com 104 bradizoítos pela via oral com a cepa BTU4. Botucatu, 2008. Resultados 54 V.M.COSTA 2008 Tabela 2. Resultado do exame sorológico para a detecção de anticorpos da classe IgG, anti-T.gondii, em soros dos filhotes do G1 comparando RIFI x MAD. Botucatu, 2008. MAD Positivo Negativo Total Positivos 29 0 29 RIFI Negativos 7 0 7 Total 36 0 36 Estatística: p=0,0233, ou seja, houve diferença entre os grupos, pelo teste de McNemar, com uma concordância de 89,23% ± 4,05% (IC95%: 81,30-97,16) entre os testes. Tabela 3. Resultado do exame sorológico para a detecção de anticorpos da classe IgG, anti-T.gondii, em soros dos filhotes do G3 comparando RIFI x MAD. Botucatu, 2008. MAD Positivo Negativo Total Positivos 29 0 29 RIFI Negativos 7 0 7 Total 36 0 36 Estatística: p=1,0000, ou seja, não houve diferença entre os grupos, pelo teste de McNemar, com uma concordância de 97,22% ± 2,74% (IC95%: 85,47-99,93) entre os testes. Resultados 55 V.M.COSTA 2008 Tabela 4. Resultado do exame sorológico pela RIFI para a detecção de anticorpos da classe IgG, anti-T.gondii, em soros dos filhotes do G1 x G3. Botucatu, 2008. Grupo G1 G3 Total Positivos 29 3 32 RIFI Negativos 7 33 40 Total 36 36 72 Estatística: p<0,0001, ou seja, houve diferença entre os grupos, com um risco relativo de positivos em G1 de 5,18 (IC95%: 2,62-10,24) em relação a G3, pelo teste Exato de Fischer. Tabela 5. Resultado do exame sorológico pela MAD para a detecção de anticorpos da classe IgG, anti-T. gondii, em soros dos filhotes G1 x G3. Botucatu, 2008. Grupo G1 G3 Total Positivos 36 4 40 MAD Negativos 0 32 32 Total 36 36 72 Estatística: p<0,0001, ou seja, houve diferença entre os grupos, pelo teste Exato de Fischer. Resultados 56 V.M.COSTA 2008 5.3. Citologia Na figura 6, observam-se formas sugestivas de taquizoítos de T. gondii. Os imprints dos tecidos mamários mostraram-se negativos. Figura 8. Formas sugestivas de taquizoítos em esfregaço de amostra de leite. Coloração pelo método de Giemsa. Aumento 40x. Botucatu, 2008. Na tabela 6 podem ser observados os resultados dos exames citológicos da secreção láctea que apresentaram formas sugestivas de T.gondii. Realizou-se a comparação nos achados das formas sugestivas do parasito nos imprints de leite, observando somente diferença estatística significativa entre os animais do G1 x G2. Resultados 57 V.M.COSTA 2008 Tabela 6. Detecção de formas sugestivas de T. gondii em esfregaços de secreção láctea coletada durante os 15 primeiros dias de lactação. Botucatu, 2008. Coletas 1a 2a 3a 4a 5a 6a Fêmeas G1 G2 G3 G1 G2 G3 G1 G2 G3 G1 G2 G3 G1 G2 G3 G1 G2 G3 1 FS FS FS FS N S/A N FS N N FS N N N N N N N 2 FS FS FS FS N FS N N FS N N N N N N N N N 3 FS FS FS FS N FS N FS N N N N N N N N N N 4 FS FS FS N FS N N N FS N O N N O N N O N 5 FS FS FS N FS N FS N N N S/A N N N N N S/A N 6 FS FS FS N FS FS N FS N N S/A N N S/A N N S/A N Total FS 6/6 6/6 6/6 3/6 3/6 3/5 1/6 3/6 3/6 0/6 1/3 0/6 0/6 0/4 0/6 0/6 0/3 0/6 Total N 0/6 0/6 0/6 3/6 3/6 2/5 5/6 3/6 3/6 0/6 2/3 6/6 6/6 4/4 6/6 6/6 3/3 6/6 FS: formas sugestivas de taquizoítos; N: negativos; S/A: sem amostras; O: óbito. Estatística: G1 � G2 (p=0,0117); G1 = G3 (p=0,6527); G2 = G3 (p=0,0543) pelo teste de Log- Rank com dados censurados, considerando-se �=0,05. Re su lta do s 58 V .M .C OS TA 2 00 8 Fi gu ra 9 . P ro po rç ão d e de te cç ão d e fo rm as s ug es tiv as d e T. g on di i n o le ite d as ra ta s G 1 x G 2 (e sq ue rd a) , G 1 x G 3 (c en tro ), G 2 x G 3 (d ire ita ) in fe ct ad as e xp er im en ta lm en te c om 1 04 b ra di zo íto s pe la v ia o ra l c om a c ep a B TU 4. B ot uc at u, 20 08 . Resultados 59 V.M.COSTA 2008 5.4. Inoculação em camundongos - Bioprova A maioria dos camundongos inoculados com o pool de tecidos tanto das amostras digeridas como in natura, não morreram e não apresentaram alterações clínicas, sendo eutanasiados após 60 dias de observação, para realização da sorologia. Dos que morreram o exsudato peritoneal, não apresentou formas taquizoíticas para confirmação do diagnóstico. As tabelas 7 a 9 mostram os resultados incluindo-se a sorologia pela RIFI e MAD dos camundongos inoculados com pool de tecidos das ratas e filhotes de cada grupo. No G2, foi possível realizar apenas a inoculação em camundongos com amostras provenientes das fêmeas do grupo, pois suas respectivas ninhadas morreram. Observou-se sorologia positiva nos camundongos somente na MAD. Resultados 60 V.M.COSTA 2008 Tabela 7. Resultados referentes à sorologia dos camundongos inoculados com pool de tecidos dos animais do G1 e das respectivas ninhadas. Botucatu, 2008. Camundongos MAD (DIG) RIFI (DIG) Camundongos MAD (CRU) RIFI (CRU) M1.1 N N M1.1 64 N M1.2 N N M1.2 16 N M1.3 N N M1.3 M* M* F1.1 N N F1.1 N N F1.2 N N F1.2 N N F1.3 N N F1.3 N N M2.1 M* M* M2.1 M* M* M2.2 M* M* M2.2 N N M2.3 N N M2.3 N N F2.1 N N F2.1 N N F2.2 N N F2.2 N N F2.3 N N F2.3 N N M3.1 N N M3.1 N N M3.2 N N M3.2 N N M3.3 N N M3.3 N N F3.1 N N F3.1 N N F3.2 N N F3.2 N N F3.3 N N F3.3 N N M4.1 N N M4.1 N N M4.2 N N M4.2 N N M4.3 N N M4.3 N N F4.1 N N F4.1 N N F4.2 N N F4.2 N N F4.3 N N F4.3 N N M5.1 N N M5.1 N N M5.2 N N M5.2 N N M5.3 N N M5.3 N N F5.1 N N F5.1 N N F5.2 N N F5.2 N N F5.3 N N F5.3 N N M6.1 N N M6.1 M* M* M6.2 N N M6.2 M* M* M6.3 N N M6.3 N N F6.1 N N F6.1 M* M* F6.2 N N F6.2 M* M* F6.3 N N F6.3 N N Mx.y = camundongo inoculado com pool de tecidos da rata x, sendo y o número de camundongos inoculados (para cada amostra foram inoculados três camundongos). Fx.y = camundongo inoculado com pool de tecidos dos filhotes da ninhada da rata x, sendo y o número de camundongos inoculados (para cada amostra foram inoculados três camundongos). DIG = Amostra inoculada a partir de tecido digerido pela pepsina; CRU = Amostra inoculada a partir de tecido in natura; N= Negativo; M* = Animal veio a óbito e coletado exsudato peritoneal, mas não encontrou-se formas taquizoiticas do T. gondii. Resultados 61 V.M.COSTA 2008 Tabela 8. Resultados referentes à sorologia dos camundongos inoculados com pool de tecidos dos animais do G2. Botucatu, 2008. Camundongos MAD (DIG) RIFI(DIG) Camundongos MAD (CRU) RIFI (CRU) M1.1 N N M1.1 N N M1.2 N N M1.2 N N M1.3 N N M1.3 N N M2.1 N N M2.1 N N M2.2 N N M2.2 N N M2.3 N N M2.3 N N M3.1 N N M3.1 N N M3.2 N N M3.2 N N M3.3 N N M3.3 N N M4.1 M* M* M4.1 M* M* M4.2 M* M* M4.2 M* M* M4.3 M* M* M4.3 M* M* M5.1 N N M5.1 N N M5.2 N N M5.2 N N M5.3 N N M5.3 N N M6.1 N N M6.1 N N M6.2 N N M6.2 N N M6.3 N N M6.3 N N Mx.y = camundongo inoculado com pool de tecidos da rata x, sendo y o número de camundongos inoculados (para cada amostra foram inoculados três camundongos) DIG = Amostra inoculada a partir de tecido digerido em pepsina; CRU = Amostra inoculada a partir de tecido in natura; N= Negativo; M* = Animal veio a óbito e coletado exsudato peritoneal, mas não encontrou-se formas taquizoiticas do T. gondii. Resultados 62 V.M.COSTA 2008 Tabela 9. Resultados referentes à sorologia dos camundongos inoculados com pool de tecidos dos animais do G3 e das respectivas ninhadas. Botucatu, 2008. Camundongos MAD (DIG) RIFI (DIG) Camundongos MAD (CRU) RIFI (CRU) M1.1 16 N M1.1 N N M1.2 N N M1.2 N N M1.3 N N M1.3 N N F1.1 N N F1.1 N N F1.2 N N F1.2 N N F1.3 N N F1.3 N N M2.1 N N M2.1 N N M2.2 N N M2.2 N N M2.3 N N M2.3 N N F2.1 N N F2.1 N N F2.2 N N F2.2 N N F2.3 N N F2.3 N N M3.1 N N M3.1 N N M3.2 N N M3.2 N N M3.3 N N M3.3 N N F3.1 16 N F3.1 16 N F3.2 16 N F3.2 16 N F3.3 N N F3.3 N N M4.1 N N M4.1 N N M4.2 N N M4.2 N N M4.3 N N M4.3 N N F4.1 N N F4.1 N N F4.2 N N F4.2 N N F4.3 N N F4.3 16 N M5.1 N N M5.1 N N M5.2 N N M5.2 N N M5.3 N N M5.3 N N F5.1 N N F5.1 N N F5.2 N N F5.2 N N F5.3 N N F5.3 N N M6.1 N N M6.1 N N M6.2 N N M6.2 N N M6.3 N N M6.3 N N F6.1 N N F6.1 N N F6.2 N N F6.2 N N F6.3 N N F6.3 N N Mx.y = camundongo inoculado com pool de tecidos da rata x, sendo y o número de camundongos inoculados. F x.y = camundongo inoculado com pool de tecidos dos filhotes da rata x, sendo y o número de camundongos inoculados (para cada amostra foram inoculados três camundongos) DIG = Amostra inoculada a partir de tecido digerido; CRU = Amostra inoculada a partir de tecido in natura; N= Negativo; M* = Animal veio a óbito e coletado exsudato peritoneal, mas não encontrou-se formas taquizoiticas do T. gondii. Resultados 63 V.M.COSTA 2008 5.5. PCR 5.5.1. Limiar de detecção de T. gondii para amostras de leite e tecidos A reação em cadeia pela polimerase detectou concentrações variáveis de taquizoítos de T. gondii, de acordo com as amostras de leite e de tecidos examinados. A extração e purificação pelo kit GFXTM Genomic Blood DNA Purification Kit (GE Healthcare/Life Sciences®), detectou até 1,5 x 101 e 1,5 x 102 taquizoítos/mL para suspensão pura do exsudato peritoneal e para as amostras de leite contaminadas com exsudato rico em taquizoítos respectivamente (Figura 11). Já para os tecidos utilizando o kit Blood Genomic Pre-Mini Spin Purification Kit (GE Healthcare/Life Sciences®) detectou-se até 1,5x101 para a amostra pura de exsudato rico em taquizoíto e amostras de suspensão cerebral, e 1,5x102 para amostras de pulmão, língua, diagrama, e 1,5x103 taquizoítos/mL, para as amostras de tecido hepático, cardíaco, musculatura estriada esquelética e glândula mamária (Figuras 12 e 13). Figura 10 Visualização de banda de 529pb, em gel de agarose a 2%. Limiar de detecção da PCR para o gene repetitivo amplificado de segmento de DNA de T. gondii para amostras puras e de leite em diferentes concentrações. Amostras de exsudato peritoneal diluídas. (A) Amostras de leite contaminadas por exsudato peritoneal com taquizoítos (B). 1) Padrão de peso molecular 100 bp DNA-Ladder Invitrogen®; 2) 1,5 x 104 taquizoítos/mL; 3) 1,5 x 103 taquizoítos/mL 4) 1,5 x 102 taquizoítos/mL; 5) 1,5 x 101 taquizoítos/mL; 6) 1,5 x 100 taquizoítos/mL.. Botucatu, 2008. Resultados 64 V.M.COSTA 2008 Figura 11 Visualização de banda de 529pb, em gel de agarose a 2%. Limiar de detecção da PCR para o gene repetitivo amplificado de segmento de DNA de T. gondii para amostras puras de exsudato peritoneal rico em taquizoíto e de leite em diferentes concentrações. Amostras de exsudato peritoneal diluídas (A); cérebro (B); pulmão (C) e língua (D). 1) Padrão de peso molecular 100 bp DNA-Ladder Invitrogen®; 2) 1,5 x 104 taquizoítos/mL; 3)1,5 x 103 taquizoítos/mL 4) 1,5 x 102 taquizoítos/mL; 5) 1,5 x 101 taquizoítos/mL; 6) 1,5 x 100 taquizoítos/mL.. Botucatu, 2008. A 2 3 4 2 3 4 2 3 4 2 3 4 C DB 1 A 2 3 4 2 3 4 2 3 4 2 3 4 C DB 1 Figura 12. Visualização de banda de 529pb, em gel de agarose a 2%. Limiar de detecção da PCR para o gene repetitivo amplificado de segmento de DNA de T. gondii para amostras puras de exsudato peritoneal de rico em taquizoíto e de leite em diferentes concentrações. (A); coração (B); tecido mamário (C) e musculatura esquelética estriada (D). 1) Padrão de peso molecular 100 bp DNA-Ladder Invitrogen®; 2) 1,5 x 104 taquizoítos/mL; 3)1,5 x 103 taquizoítos/mL. Amostra de tecido hepático Botucatu, 2008. Resultados 65 V.M.COSTA 2008 5.5.2. Detecção de DNA de Toxoplasma gondii em amostras de leite e teciduais Os resultados da PCR das amostras de leite são apresentados na tabela 10, mostrando a comparação entre os grupos. A tabela 11 apresenta os resultados da PCR das amostras teciduais para os animais dos G1, G2 e G3. Para os tecidos provenientes dos filhotes, a PCR foi positiva nas amostras de fígado e musculatura esquelética de um filhote, e apenas na amostra de fígado de outro filhote da fêmea 3 do G1. Foi positiva ainda, a amostra de pulmão de um filhote da fêmea 4 pertencente a este mesmo grupo (Tabela 12). Os filhotes do G1 não apresentaram DNA do parasito em suas amostras teciduais pesquisadas e, os filhotes de G2 morreram, não sendo assim possível a realização do prova. Resultados 66 V.M.COSTA 2008 Tabela 10. Resultado da PCR nas seis amostras de leite coletadas durante os primeiros 15 dias de lactação, nas seis fêmeas de cada grupo. Botucatu, 2008. Coletas Coletas 1a 2a 3a 4a 5a 6a Fêmeas G1 G2 G3 G1 G2 G3 G1 G2 G3 G1 G2 G3 G1 G2 G3 G1 G2 G3 1 P N N N N S/A N N N N N N P N N N N N 2 N N N N N N N N N N N N N N N N N N 3 N N P N N N N N N N N N N N N N N N 4 N N N N N N N N N N O N N O N N O N 5 N N N N N N N N N N S/A N N N N N S/A N 6 N N N N N N N N N N S/A N N S/A N N S/A N Total P 1/6 0/6 1/6 0/6 0/6 0/5 0/6 0/6 0/6 0/6 0/3 0/6 1/6 0/4 0/6 0/6 0/3 0/6 Total N 5/6 6/6 5/6 6/6 6/6 5/5 6/6 6/6 6/6 6/6 3/3 6/6 5/6 4/4 6/6 6/6 3/3 6/6 P: positivos; N: negativos; S/A: sem amostras; O: óbito. Estatística: G1 � G2 (p=0,0466); G1 = G3 (p>0,05); G2 = G3 (p=0,5040) pelo teste de Log- Rank com dados censurados, considerando-se �=0,05. Resultados 67 V.M.COSTA 2008 Tabela 11. . Resultado da PCR nas oito amostras teciduais coletadas após 21 dias de lactação, nas fêmeas de cada grupo. Botucatu, 2008 GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 Animais 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 Fêmea 1 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N Fêmea 2 N N N N N N P N N N N N N N P N N N N N N N N N Fêmea 3 N N N N N N N N N N N N N N P N N N N N N N N N Fêmea 4 N N N N N N P N N N N N N N N N N N N N N N N N Fêmea 5 N N N N N N P N N N N N N N N N N N N N N N N N Fêmea 6 N N N N N N P N N N N N N N N N N N N N N N N N 1 = Cérebro /2 = Pulmão/ 3 = Fígado/ 4 = Coração/ 5 = Diafragma/ 6 = Língua/ 7 = Musculatura Esquelética/ 8 = Tecido mamário/ N = Amostras negativas/ P = Amostras positivas Resultados 68 V.M.COSTA 2008 Tabela 12. Resultado da PCR nas sete amostras teciduais coletadas após 21 dias de vida, nos seis filhotes de cada fêmea do G1. Botucatu, 2008. 1 = Cérebro; 2 = Pulmão; 3 = Fígado; 4 = Coração; 5 = Diafragma; 6 = Língua; 7 = Musculatura esquelética; N = Amostras negativas; P = Amostras positivas Filhote 1 Filhote 2 Filhote 3 Filhote 4 Filhote 5 Filhote 6 Fêmea 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 N N N N N N N N N N N N N N N N P N N N P N N N N N N N N N P N N N N N N N N N N N 2 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N P N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 3 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 4 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 5 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 6 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N Discussão 69 V.M.COSTA 2008 6. Discussão 6.1. Animais experimentais Em pesquisas experimentais com Toxoplasma gondii, os ratos (Rattus novergicus) são considerados bons modelos biológicos, por serem mais resistentes ao desenvolvimento da enfermidade clínica (DUBEY e FRENKEL, 1998), entretanto, esta espécie não é resistente à infecção, podendo desenvolver a doença clinica e morrer pelas lesões parasitárias, dependendo principalmente do estado imunológico do animal. Não foram observadas alterações clínicas dignas de nota, tanto nas mães inoculadas como em suas respectivas crias nos G1 e G3, corroborando com Mandakhalikar et al. (1994), que também não registraram nenhuma alteração clínica, apesar do encontro de cistos cerebrais, necrose hepática, renal, esplênica e congestão pulmonar. Diferentemente do G2, grupo submetido à imunossupressão, observaram-se principalmente alterações clínicas compatíveis com a toxoplasmose, embora o exsudato peritoneal destes animais, tenha sido negativo. A PCR positiva em amostras de musculatura esquelética, em ratas sobreviventes do G2 caracterizou assim a forma crônica da doença, e possivelmente a não recrudescência da enfermidade. O imprint do fígado e pulmão de três ratas que morreram deste grupo, revelaram achados compatíveis a um processo inflamatório, que pode ter aparecido a partir da queda de imunidade devido a uma infecção oportunista secundária. Chinchilla et al. (1981), sugerem como dose letal para toxoplasmose em ratos 108 parasitos, independe da idade do animal. No entanto, De Champs et al. (1998) verificando o efeito da idade e da dose infectante na sobrevivência de ratos Wistar e Fischer inoculados com a cepa RH, observaram que a resistência ao T. gondii conferida aos ratos, esta relacionada à idade do animal, sendo que os neonatos são mais susceptíveis, e os desmamados resistentes. Discussão 70 V.M.COSTA 2008 Dubey (1996a) inoculou ratas Sprague-Dawley de 44 dias de idade com doses variando entre 100 a 107 oocistos da cepa VEG, considerada de baixa virulência para camundongos e classificada como genótipo III. Os animais inoculados com 105 a 106 oocistos, adoeceram apresentando diarréia e depressão. Três de cinco ratas inoculadas com106 oocistos morreram no 8º dpi, enquanto todos os outros animais permaneceram sadios. Os animais doentes apresentaram lesões e taquizoítos em intestino, linfonodos mesentéricos, fígado, baço, coração, adrenais, linfonodos renais, língua, musculatura e cérebro. Em geral, as infecções com oocistos são mais severas nos hospedeiros intermediários do que aquelas induzidas com cistos (DUBEY e BEATTIE, 1988). Portanto, a infecção dos ratos pelo T. gondii, e as taxas de mortalidade, estão relacionadas à quantidade de parasitos inoculados, bem como estágio infectante. No presente trabalho, utilizou-se somente uma única dose, 104 bradizoítos, estando abaixo das consideradas letais na literatura. Cabe ressaltar, que a resposta dos ratos não é homogênea, com grande influência da constituição genética dos animais à resposta ao T. gondii (FUJII et al. 1983 e KEMPF et al., 1999). Outro trabalho que aponta esta diferença genética é de Paulino e Vitor (1999), onde em infecção experimental a ocorrência da enfermidade congênita foi maior nas fêmeas Wistar do que nas Holtzman. O modelo experimental mais utilizado