UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CENTRO DE AQÜICULTURA CÂMPUS DE JABOTICABAL EFEITOS DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR E DA REALIMENTAÇÃO NO CRESCIMENTO E METABOLISMO ENERGÉTICO DE JUVENIS DE PACU (Piaractus mesopotamicus HOLMBERG, 1887) Valéria Leão Souza Orientadora: Profa Dra. Elisabeth Criscuolo Urbinati Tese apresentada ao Centro de Aqüicultura da UNESP – Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Aqüicultura (Área de Concentração em Aqüicultura). JABOTICABAL Estado de São Paulo - Brasil AGOSTO - 1998 ii Souza, Valéria Leão S719e Efeitos da restrição alimentar e da realimentação no crescimento e metabolismo energético de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) / Valéria Leão Souza. – Jaboticabal, 1998 XII, 118 p. : il. ; 28 cm Tese (Doutor)-Universidade Estadual Paulista, Centro de Aqüicultura, 1998 Orientador: Elisabeth Criscuolo Urbinati Banca examinadora: Elisabete Maria Macedo Viegas, Dalton José Carneiro, Laurelúcia Orives Lunardi, José Alberto Mello de Oliveira Bibliografia 1. Pacu-restrição alimentar-realimentação. 2. Pacu-crescimento- metabolismo energético. I. Título. II. Jaboticabal-Centro de Aqüicultura. CDU 639.3 : 636.085 Ficha Catalográfica elaborada pelo SATI-SBD iii ii lll CCOOMMOO UUMM RRIIOO SSeerr ccaappaazz,, ccoommoo uumm rriioo qquuee lleevvaa ssoozziinnhhoo aa ccaannooaa qquuee ssee ccaannssaa,, ddee sseerrvviirr ddee ccaammiinnhhoo ppaarraa aa eessppeerraannççaa.. EE ddee llaavvaarr ddoo llíímmppiiddoo aa mmáággooaa ddaa mmaanncchhaa,, ccoommoo oo rriioo qquuee lleevvaa,, ee llaavvaa.. CCrreesscceerr ppaarraa eennttrreeggaarr nnaa ddiissttâânncciiaa ccaallaaddaa uumm ppooddeerr ddee ccaannççããoo,, ccoommoo oo rriioo ddeecciiffrraa oo sseeggrreeddoo ddoo cchhããoo.. SSee tteemmppoo éé ddee ccrreesscceerr,, rreetteerr oo ddoomm ddaa ffoorrççaa sseemm ddeeiixxaarr ddee sseegguuiirr.. EE aattéé mmeessmmoo ddee ssuummiirr ppaarraa,, ssuubbtteerrrrâânneeoo,, aapprreennddeerr aa vvoollttaarr ee ccuummpprriirr,, nnoo sseeuu ccuurrssoo,, oo ooffíícciioo ddee aammaarr.. CCoommoo uumm rriioo,, aacceeiittaarr eessssaass ssúúbbiittaass oonnddaass ffeeiittaass ddee áágguuaass iimmppuurraass qquuee aafflloorraamm aa eessccoonnddiiddaa vveerrddaaddee nnaass ffuunndduurraass.. CCoommoo uumm rriioo,, qquuee nnaassccee ddee oouuttrrooss,, ssaabbeerr sseegguuiirr jjuunnttoo ccoomm oouuttrrooss sseennddoo ee nnoouuttrrooss ssee pprroolloonnggaannddoo ee ccoonnssttrruuiirr oo eennccoonnttrroo ccoomm áágguuaass ggrraannddeess ddoo oocceeaannoo sseemm ffiimm.. MMuuddaarr eemm mmoovviimmeennttoo,, mmaass sseemm ddeeiixxaarr ddee sseerr oo mmeessmmoo sseerr qquuee mmuuddaa.. CCoommoo uumm rriioo.. TThh aaggoo ddee MMee loo iv Aos meus avós, Oscar Valeriano Leão e Wanda Arantes Leão, exemplos de vida, que me ensinaram a amar e a respeitar a natureza; Aos meus tios, João Antônio (in memorian), Vânia, Irma, Oscar e Honorina, que sempre estiveram presentes e unidos em todos os momentos de minha vida, OFEREÇO À minha mãe, Zelma Arantes Leão, pelo seu apoio, confiança e oportunidade a mim concedida para que pudesse voar em busca de sonhos, mesmo tendo que abandonar o ninho; À minha irmã, Raquel Leão Souza, que junto comigo cresceu e hoje segue a sua busca por novos horizontes, DEDICO v Existem pessoas especiais neste mundo de meu Deus! Pessoas alegres e cheias de vida, que sofrem, que choram como qualquer outro ser. Mas que são graciosas em seus movimentos, sabem admirar o sol em dias chuvosos, semeiam flores em tempo de seca e colhem frutos maravilhosos! Pessoas assim, guiadas pelas estrelas, são únicas em cada existência e brilham naturalmente, sem o menor esforço. Felizes aqueles que conviveram e acompanharam alguns de seus passos, assimilando os ensinamentos e espalhando o seu canto. Beth, continue sendo sempre essa pessoa iluminada. Que Deus a abençôe! vi Ah! O tempo passa... Mas as pessoas deixam suas marcas. Aos amigos, Lúcia Helena Vasques, Elenise Gonçalves Oliveira, Coléte Fonseca, Sérgio Fonseca Zaiden, Marcos Antonio Vasques e Waldir José Machado, pessoas queridas que participaram desse meu caminhar ajudando- me a crescer como pessoa e profissionalmente, deixo-lhes o meu carinho. “Não se pode fechar os olhos Não se pode olhar pra trás Sem se aprender alguma coisa” Renato Russo vii AGRADECIMENTOS - À Profa Dra. Elisabeth Criscuolo Urbinati, pela amizade e orientação segura e carinhosa com que conduziu os meus passos ao longo desses anos. - À Profa Dra. Laurelúcia Orives Lunardi, pessoa admirável pelo seu carisma e profissionalismo, que sempre esteve aberta para me receber e ajudar. - Ao Prof. Dr. José Alberto Mello de Oliveira, pela maneira carinhosa de me receber e transmitir, pacientemente, seus valiosos conhecimentos. - Aos Profs. Drs. Dalton José Carneiro e Elisabete Maria Macedo Viegas, pela amizade e sugestões apresentadas para melhoria do presente trabalho. - Ao Prof. Ruberval Armado Lopes (FORP/USP), por permitir a utilização do fotomicroscópio. - À Profa Dra. Laura Satiko Okada Nakaghi, pela amizade e ajuda prestada durante a execução deste trabalho. - Ao Centro de Aqüicultura da UNESP – Câmpus de Jaboticabal, pelo aprimoramento científico, e seu quadro funcionários, pelo apoio técnico. - Aos queridos companheiros de trabalho, Damares, Euclides, Coelho, Orandi (Depto. de Morf. e Fisiol. Animal – FCAV/UNESP), Neusa, Maria Antonieta (Depto. de Bioquímica – FMRP/USP), Lia (Depto. de Patologia – FAVJ/UNESP) e Maria Paula (Depto. de Patologia – FMRP/USP), pelo apoio técnico nas análises laboratoriais. - A todos os funcionários do Depto. de Morfologia e Fisiologia Animal, pelo carinho e convívio durante essa minha jornada. - A todos os meus colegas de curso, pela convivência. - À FAPESP, pelo auxílio concedido na forma de bolsa de estudo. - E a todos aqueles que contribuíram, direta ou indiretamente, na execução deste trabalho. viii ÍNDICE Página LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... x LISTA DE TABELAS ........................................................................................................ xii 1. RESUMO ....................................................................................................................... 1 2. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 3 3. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 6 3.1. O metabolismo dos peixes e a privação alimentar ................................................ 6 3.2. A realimentação ................................................................................................... 20 3.3. A influência da temperatura no metabolismo e desenvolvimento do peixe ......... 22 4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 24 4.1. Animais e alimentação ......................................................................................... 24 4.2. Instalações ........................................................................................................... 25 4.3. Delineamento estatístico ...................................................................................... 26 4.4. Amostragens ........................................................................................................ 26 4.5. Métodos utilizados para obtenção dos dados ...................................................... 27 4.5.1. Glicose sangüínea ...................................................................................... 27 4.5.2. Glicogênio hepático .................................................................................... 28 4.5.3. Ácidos graxos livres plasmáticos ............................................................... 29 ix 4.5.4. Lipídios totais do fígado ............................................................................. 29 4.5.5. Proteína total plasmática ............................................................................ 30 4.5.6. Triiodotironina (T3) e Tiroxina (T4) .............................................................. 30 4.5.7. Índice hepato-somático (IHS) ..................................................................... 30 4.5.8. Índice gordura-viscero-somático (IGVS) .................................................... 30 4.5.9. Morfologia e morfometria dos hepatócitos ................................................. 31 4.5.10. Ultraestrutura do glicogênio ..................................................................... 31 4.5.11. Histoquímica do glicogênio ...................................................................... 32 4.5.12. Histoenzimologia do metabolismo intermediário........................................33 4.5.13.1. Leitura das reações histoenzimológicas .................................... 35 4.5.13. Composição corporal ............................................................................... 36 5. RESULTADOS ............................................................................................................. 39 5.1. Condições climáticas locais e temperatura da água dos tanques ....................... 39 5.2. Desenvolvimento dos peixes ............................................................................... 43 5.3. Composição corporal ........................................................................................... 44 5.4. Variáveis metabólicas .......................................................................................... 47 5.5. Morfologia e Morfometria dos hepatócitos .......................................................... 50 5.6. Ultraestrutura do glicogênio ................................................................................. 55 5.7. Histoquímica do glicogênio .................................................................................. 59 5.8. Histoenzimologia do metabolismo intermediário ...................................................61 6. DISCUSSÃO ................................................................................................................ 73 7. CONCLUSÕES .............................................................................................................87 8. ABSTRACT ...................................................................................................................88 9. LITERATURA CITADA ................................................................................................ 90 10. APÊNDICE .............................................................................................................. 105 x LISTA DE FIGURAS Página 1. Valores diários obtidos para temperatura ambiente e umidade relativa do ar no período experimental .................................................................................................................... 40 2. Valores diários obtidos para precipitação pluviométrica e insolação no período experimental .................................................................................................................... 41 3. Valores diários obtidos para temperatura da água do tanque 1 (controle) e do tanque 2 (experimental) no período de estudo ............................................................................... 42 4. Fotografia de um exemplar de pacu (Piaractus mesopotamicus) juvenil .................... 43 5. Fotografia fígado do pacu (Piaractus mesopotamicus) juvenil .................................... 51 6. Fotomicrografias de hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) ...... 52 7. Fotoeletronmicrografias de hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus). Utilização do processo rotineiro para microscopia eletrônica e da técnica de ósmio redução na marcação do glicogênio .............................................................................................. 56 8. Fotoeletronmicrografias de hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus), processados pela técnica de ósmio redução, no dia zero, 2 dias de restrição alimentar e 7 dias de restrição alimentar ............................................................................................... 57 9. Fotoeletronmicrografias de hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus), processados pela técnica de ósmio redução, aos 30 dias de restrição alimentar, 60 dias de restrição alimentar, 7 dias de realimentação e 30 dias de realimentação ....................... 58 xi 10. Fotomicrografia da histoquímica do glicogênio (PAS) nos hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) ..............................................................................................60 11. Fotomicrografia da histoquímica da fosfofrutoquinase (PFK) nos hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) ......................................................................................64 12. Fotomicrografia da histoquímica da fosfoglucomutase (PGM) nos hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) .................................................................................65 13. Fotomicrografia da histoquímica da glicose-6-fosfatase (G6P-A) nos hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) ....................................................................66 14. Fotomicrografia da histoquímica da glicose-6-fosfato desidrogenase (G6P-D) nos hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) ............................................67 15. Fotomicrografia da histoquímica da 6-fosfogluconato desidrogenase (6PG-D) nos hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) ............................................68 16. Fotomicrografia da histoquímica da lactato desidrogenase (L-D) nos hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) ....................................................................69 17. Fotomicrografia da histoquímica da nicotinamida adenina dinucleotídeo – tetrazólio redutase (NADH2-TR) nos hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) .70 18. Fotomicrografia da histoquímica da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato – tetrazólio redutase (NADPH2-TR) nos hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) 71 19. Fotomicrografia da histoquímica da succinato desidrogenase (L-D) nos hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) ....................................................................72 xii LISTA DE TABELAS Página 1. Análise de variância obtida para o desenvolvimento dos peixes ................................. 44 2. Valores médios de peso corporal, comprimento padrão, índice hepato-somático (IHS) e índice gordura-víscero-somático (IGVS) dos peixes, no estudo da interação entre os fatores estudados (n = 7) ............................................................................................................. 44 3. Análise de variância obtida para a composição corporal dos peixes .......................... 46 4. Valores médios dos teores de umidade, proteína bruta, extrato etéreo e cinzas na carcaça dos peixes, no estudo da interação entre os fatores estudados (n = 7) .......................... 46 5. Análise de variância obtida para variáveis metabólicas dos peixes ............................ 47 6. Valores médios dos níveis de glicogênio hepático, glicose sangüínea, proteína total plasmática, lipídio total do fígado, ácidos graxos livres plasmáticos e triiodotironina (T3) dos peixes, no estudo dos fatores estudados (n = 7).............................................................. 48 7. Análise de variância obtida para a morfometria dos hepatócitos dos peixes .............. 53 8. Valores médios da área do citoplasma, área do núcleo, volume do citoplasma e volume do núcleo dos hepatócitos dos peixes, no estudo da interação entre os fatores estudados (n = 7) ...................................................................................................................................... 54 9. Intensidade da reação de PAS em hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) (n = 4) ................................................................................................... 59 10. Atividade enzimática em hepatócitos de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus)61 1 1. RESUMO O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da restrição alimentar e da realimentação sobre o crescimento e o metabolismo energético de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus), criados em cativeiro durante época de temperaturas ambientais altas, através de avaliações bioquímicas, histoenzimológicas e estruturais. O experimento foi conduzido no Centro de Aqüicultura da UNESP, Câmpus de Jaboticabal, no período de 17/10/95 a 16/01/96. Foram utilizados 98 peixes, com peso entre 200 e 300 g, divididos em dois grupos: controle e experimental. Os animais do grupo experimental foram amostrados aos 0, 2, 7, 30 e 60 dias de restrição alimentar e aos 7 e 30 dias de realimentação. Os do grupo controle foram alimentados diariamente e amostrados nos mesmos períodos que os do experimental. Para análise de variância foi utilizado o Delineamento Inteiramente Casualizado no esquema fatorial 2x7 (Alimentação x Períodos), com 7 repetições, sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey. Os resultados demonstraram que o peso corporal e comprimento padrão dos peixes foram inferiores durante o período de restrição alimentar, mas se recuperaram após a realimentação, apesar de não alcançarem os valores dos controles. O IHS (índice hepato-somático) e o IGVS (índice gordura-víscero-somático) 2 apresentaram diminuição na restrição alimentar e a recuperação, após a realimentação, levou a valores semelhantes aos dos controles. A restrição alimentar provocou diminuição de matéria seca e extrato etéreo da carcaça dos animais, com aumento na porcentagem de água sem, contudo, afetar os teores de proteína bruta e cinzas. Após a realimentação, os valores foram semelhantes aqueles dos controles. Os níveis de glicose sangüínea diminuíram em ambos os grupos, controle e experimental, ao longo do tempo, embora no experimental tenham sido registrados picos durante a restrição alimentar. Ocorreu, também, diminuição nos valores de glicogênio hepático em ambos os grupos, mas foi mais pronunciada no experimental. Os níveis de proteína total plasmática, lipídio total do fígado e T3 (triiodotironina) foram menores nos animais experimentais em relação aos controles. Os níveis de ácidos graxos livres plasmáticos aumentaram gradativamente durante a restrição alimentar e restabeleceram seus valores após a realimentação. A área do citoplasma e núcleo, volume do citoplasma e núcleo dos hepatócitos diminuíram durante a restrição alimentar e foram recuperados após a realimentação, equiparando-se aos controles. A desorganização estrutural do tecido hepático observada durante a restrição alimentar recuperou-se com a realimentação. As respostas obtidas através da microscopia eletrônica de transmissão e da avaliação histoquímica de enzimas envolvidas no metabolismo energético corroboraram as alterações encontradas na análise bioquímica, referentes à dinâmica dos metabólitos, durante a restrição alimentar e realimentação. 3 2. INTRODUÇÃO Enquanto os animais endotérmicos não podem sobreviver mais do que poucos dias ou semanas sem alimento, os ectotérmicos são capazes de se manter vivos por longos períodos de tempo sob esta condição (ABRAHAM et al., 1984; SHERIDAN & MOMMSEN, 1991). Assim, muitas espécies de peixes estão bem adaptadas a mobilizar constituintes do corpo e sobreviver a longos períodos naturais de jejum, como por exemplo durante o inverno, nas flutuações sazonais do suprimento alimentar ou no processo migratório da reprodução (MACHADO et al., 1989; SUMPTER et al., 1991; MEHNER & WIESER, 1994). O jejum envolve uma complexidade de alterações para promover o ajuste biológico do animal e suas conseqüências finais são altamente dependentes da espécie considerada, da idade do peixe e das condições experimentais, tais como temperatura da água, fotoperíodo, dieta pré-jejum, etc (LOVE, 1980; WEATHERLEY & GILL, 1987; BLASCO et al., 1991). Nos peixes, uma importante fonte de energia é o carboidrato estocado no fígado na forma de glicogênio. Diante da solicitação energética, é degradado e distribuído ao corpo pela corrente sangüínea, como glicose, cuja concentração é normalmente mantida constante, em 4 muitas espécies submetidas a longos períodos de jejum, às expensas do glicogênio hepático (RANZANI-PAIVA & GODINHO, 1988). Mas, a fonte energética utilizada pelos peixes durante a restrição alimentar pode variar entre as espécies, pois algumas se utilizam principalmente do glicogênio, outras de lípidios e outras, ainda, de proteínas (SHERIDAN & MOMMSEN, 1991). Vários fatores alteram o metabolismo dos peixes, mas o principal fator que afeta os processos fisiológicos e bioquímicos, entre os quais taxa de crescimento e desenvolvimento do animal, é a temperatura da água. Geralmente, os peixes são mais susceptíveis às alterações ocorridas no jejum em temperaturas altas (MOON et al., 1985; ANGELINI et al., 1992). Muitos autores sugerem que os ajustes metabólicos ocorrem devido a alterações na quantidade e/ou qualidade das taxas limitantes de enzimas. Entretanto, formas independentes e diferentes de alterações enzimáticas são encontradas em diversos tecidos de peixes e, conseqüentemente, o controle da atividade metabólica difere de um órgão para outro. No músculo, o grau de adaptação da atividade enzimática e metabolismo oxidativo geralmente corresponde a uma compensação do metabolismo total do animal. Já no fígado, a forma de adaptação não se reflete necessariamente no metabolismo total, indicando que o metabolismo hepático não é controlado exclusivamente pela demanda da produção de energia (JANKOWSKY et al., 1984). Segundo MOON (1983), o combustível e o mecanismo de equilíbrio metabólico em um tecido pode ser estimado medindo o nível de atividade enzimática. A histoquímica permite a interpretação de fenômenos biológicos em termos que transcendem os limites da morfologia, sem abandonar seus princípios básicos e, neste campo, a histoenzimologia contribui com um rico acervo de técnicas para o estudo do metabolismo celular. Desta forma, os métodos histoenzimológicos possibilitam o estudo da 5 identificação, localização e a maior ou menor atividade de determinada enzima a nível de tecidos, células e organelas (MELLO DE OLIVEIRA, 1986). Como o pacu (Piaractus mesopotamicus) é uma espécie de águas essencialmente tropicais, de hábito alimentar onívoro e que tem sido sistematicamente cultivada e testada em experimentação piscícola, viu-se a necessidade de estudar a estratégia metabólica utilizada por este peixe quando submetido a períodos de restrição alimentar. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da restrição alimentar e da realimentação sobre o crescimento e o metabolismo energético de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus), criados em cativeiro durante época de temperaturas ambientais altas, através de avaliações bioquímicas, histoenzimológicas e estruturais. 6 3. REVISÃO DE LITERATURA 3.1. O METABOLISMO DOS PEIXES E A PRIVAÇÃO ALIMENTAR A homeostase dos carboidratos em vertebrados superiores é realizada através da ação de alguns hormônios, incluindo os peptídeos pancreáticos, insulina e glucagon. Em mamíferos bem alimentados, os níveis de glicose e insulina no sangue são altos. A glicose é, então estocada como glicogênio no fígado e músculo. Quando os estoques de glicogênio estão repletos, o restante da glicose é transformado, através da glicólise, em lactato e ácidos graxos (BAANANTE et al., 1991). Mamíferos submetidos a curtos períodos de jejum (poucos dias) apresentam níveis de glucagon elevados, enquanto os de insulina permanecem inalterados ou diminuem (Gilfant & Sherwin, 1983 citados por MOON et al., 1989). Assim, o aumento na proporção de glucagon/insulina e o conseqüente aumento da produção de glicose hepática e glicemia, pela ativação da glicogenólise e gliconeogênese, ocorrem, principalmente, pela elevação nos níveis de glucagon (Cherrington & Vranic, 1986, citados por MOON et al., 1989). Um jejum prolongado (semanas) resulta em uma leve queda nos 7 níveis de glucagon e promove uma diminuição ou relativa estabilidade nos níveis de insulina (RUDERMAN, 1975). Essas variações nos hormônios alteram significativamente o fluxo metabólico, especialmente no fígado e também o fornecimento de outros metabólitos para o mesmo, promovendo em todo o corpo a homeostase de carboidrato. A glicose é um importante combustível metabólico nos vertebrados e vários mecanismos atuam para assegurar um constante suprimento para os tecidos glicose- dependentes, tais como células vermelhas do sangue, testículos, porção medular do rim, sistema nervoso, entre outros (Newsholme & Start, 1973 citados por SUAREZ & MOMMSEN, 1987). Ela pode originar-se do intestino durante a digestão e absorção de carboidratos ingeridos além de ser produzida pelo fígado e rins por glicogenólise, ou através da gliconeogênese a partir de lactato, aminoácidos e glicerol. Entretanto, nos animais que estão se alimentando normalmente a gliconeogênese é poupada, sendo ativada apenas durante o jejum, especialmente quando há diminuição nos estoques de glicogênio no fígado (SUAREZ & MOMMSEN, 1987). A visão geral estabelecida para o metabolismo dos peixes é que a glicose é necessária para manter a produção basal de insulina, mas a sua função no metabolismo de carboidrato é mais direcionada para oxidação de glicose do que para ser estocada como glicogênio (CHRISTIANSEN & KLUNGSOYR, 1988). Em peixes bem alimentados, a insulina também estimula processos metabólicos, aumentando a glicólise e diminuindo a glicogenólise no fígado (OTTOLENGHI et al., 1985). O glucagon aumenta a glicogenólise e a gliconeogênese nos hepatócitos de teleósteos (MOMMSEN & SUAREZ, 1984). Apesar da semelhança com mamíferos na ação dos hormônios, os processos ocorridos durante o jejum são muito diferentes (BAANANTE et al., 1991). Alguns trabalhos têm demonstrado que o metabolismo em peixes apresenta peculiaridades que tornam o animal apto a suportar, por exemplo, prolongados períodos de 8 jejum; sejam decorrentes da indisponibilidade de alimentos ou por ocasião da época reprodutiva. Essa habilidade do peixe tem sido atribuída à baixa taxa metabólica ou à ativação do fluxo gliconeogênico (MOON, 1988). Segundo NAGAI & IKEDA (1971), as alterações que ocorrem nos estoques de carboidrato, como o glicogênio, durante o jejum em peixes, são pequenas, contrastando com mamíferos. Geralmente, o glicogênio hepático e muscular é utilizado como fonte de energia em situações de estresse (MORATA et al., 1982b; VIJAYAN & MOON, 1992). Durante a privação alimentar, os principais combustíveis utilizados são as reservas de lipídio (MOON & JOHNSTON, 1980; VIJAYAN et al., 1993), mas o jejum prolongado pode aumentar a proteólise no músculo e fígado (MOMMSEN et al., 1980). Entretanto, as respostas metabólicas decorrentes desta situação variam consideravelmente entre os teleósteos (WEATHERLEY & GILL, 1987; BASTROP et al., 1991). Sabe-se que não ocorre severa hipoglicemia como resultado de jejum prolongado. Algumas espécies de peixe, como Carassius auratus (CHAVIN & YOUNG, 1970), Anguilla rostrata (LEWIS & EPPLE, 1984), Oncorhynchus kisutch (SHERIDAM & MOMMSEN, 1991), Cyprinus carpio (SHIMENO et al., 1990; BLASCO et al., 1992), Salmo trutta fario (NAVARRO et al., 1992) e Piaractus mesopotamicus (SOUZA, 1994) mantêm as concentrações de glicose no sangue próximas às de animais alimentados, depois de semanas ou meses de jejum. Entretanto, alguns autores (LARSSON & LEWANDER, 1973; FLETCHER, 1984; MACHADO et al. 1988, 1989; FOSTER & MOON, 1991; SHIKATA et al., 1993; SOENGAS et al., 1996) encontraram valores mais baixos deste metabólito em peixes privados de alimento. A utilização dos estoques de glicogênio também apresenta diferentes respostas diante desta situação. Resultados de pesquisas (MACHADO et al., 1988; SHIMENO et al.; 1990; PASTOUREAUD (1991); FOSTER & MOON, 1991; BLASCO et al., 1992, NAVARRO et al., 1992; SOUZA, 1994; COLLINS & ANDERSON, 1995; SOENGAS et al. 1996) revelaram 9 que há mobilização do glicogênio hepático para suprir o déficit energético no organismo do animal. O glicogênio muscular também pode ser mobilizado, embora em menor magnitude (BLACK & LOVE, 1986; FOSTER & MOON, 1991 e NAVARRO et al., 1992). Entretanto, algumas espécies de peixe, como Anguilla anguilla (DAVE et al., 1975) e Oncorhynchus kisutch (SHERIDAN & MOMMSEN, 1991) conservam total ou parcialmente o glicogênio hepático utilizando, principalmente, os estoques de lipídio como fonte energética. Os lipídios exercem várias funções nos vertebrados, dentre elas, a de ser fonte energética e componente principal das membranas celulares. Nos peixes, os principais sítios de estoque de lipídio são o fígado, tecido adiposo e músculo esquelético. Mas o principal órgão utilizado varia muito entre os teleósteos (McCLELLAND et al., 1995). Segundo Sheridan (1988), citado por McCLELLAND et al. (1995), as diferenças nos sítios de estoque de lipídio podem ser atribuídas ao estilo de vida, ou seja, peixes sedentários tendem a estocar lipídio no fígado e/ou tecido adiposo, enquanto os mais ativos utilizam o músculo. Os estudos biológicos dos lipídios como combustível energético no metabolismo dos peixes têm revelado sua importância durante períodos de estresse, especialmente no jejum. As respostas metabólicas obtidas diante desta situação mostraram que, para algumas espécies de peixe, tais como Clarias lazera (YANNI, 1962), Salmo gairdneri (JEZIERSKA et al., 1982), Gadus morhua (BLACK & LOVE, 1986), Rhamdia hilarii (MACHADO et al., 1988), Salmo trutta fario (NAVARRO et al., 1992), Cyprinus carpio (SHIMENO et al., 1990; BLASCO et al., 1992), Piaractus mesopotamicus (SOUZA, 1994) e Ictalurus punctatus (WEBSTER et al., 1994), a quantidade de lipídio, tanto no fígado quanto em outros tecidos diminue, revelando que este metabólito tem contribuição substancial para o fornecimento de energia durante o jejum. Entretanto, para outras espécies, como Carassius auratus (STIMPSON, 1965) e Anguilla rostrata (LARSSON & LEWANDER, 1973), a proteína muscular é a principal fonte energética. 10 Como o transporte dos lipídios dos depósitos de gordura para os sítios de utilização é realizado pelos ácidos graxos livres plasmáticos, mobilizados em conseqüência da quebra de triglicerídeos, estes parecem ser a fração metabolicamente mais ativa de lipídios no plasma. A mobilização de ácidos graxos durante o jejum é muito importante para o controle do nível glicêmico. O aumento dos ácidos graxos livres plasmáticos inibe a utilização de glicose pelo tecido periférico e a liberação de glicose pelo fígado. Por outro lado, o aumento da captação de ácidos graxos livres plasmáticos pelo fígado favorece mais o metabolismo de gordura do que o de carboidratos (PLISETSKAYA, 1980). LEWIS & EPPLE (1984), ZUIM et al. (1984), MACHADO et al. (1988, 1989), SHIMENO et al. (1990); SHERIDAN & MOMMSEN (1991) e SOUZA (1994) demonstraram que os níveis de ácidos graxos livres plasmáticos de peixes aumentaram quando submetidos a períodos de jejum. Diferentemente, INCE & THORPE (1976) e FARBRIDGE et al. (1992) não encontraram alterações nos níveis deste metabólito em Esox lucius e Oncorhynchus mykiss, respectivamente. O metabolismo de proteína ocorre em muitos órgãos, mas os mais importantes são o fígado e os músculos. Contudo, muitas vias catabólicas de aminoácidos estão localizadas no fígado, o que o torna o maior sítio catabólico do corpo. Da mesma forma, o controle dos níveis de proteína plasmática também ocorre no fígado e estes podem definir padrões característicos de funcionamento deste órgão em peixes (JANKOWSKY et al., 1984; HEPHER, 1988). Estudos realizados com Gadus morhua (KAMRA, 1966), Salmo trutta (Carbery , 1970 citado por LOVE, 1980) e Cyprinus carpio (SHIMENO et al., 1990) revelaram que os níveis de proteína total plasmática diminuem durante o jejum. Entretanto, segundo outros pesquisadores (LARSSON & LEWANDER, 1973; DAVE et al., 1975; INCE & THORPE, 1976; 11 BLACK & LOVE, 1986; SOUZA, 1994), os valores obtidos para este parâmetro permaneceram inalterados durante o jejum. Assim, definir a estratégia metabólica utilizada por uma determinada espécie de peixe durante o jejum não é fácil. Segundo NEWSHOLME et al. (1978) e MOON (1983), o combustível e o mecanismo de equilíbrio metabólico em um tecido pode ser estimado medindo o nível de atividade enzimática. A glicólise é a principal via de utilização da glicose e ocorre em todos os tecidos. É uma via singular, podendo utilizar o oxigênio (aeróbica), quando disponível, ou funcionar na ausência dele (anaeróbica). Em peixes, todas as enzimas da glicólise tem sido encontradas. Estas enzimas são similares em peixes e mamíferos, quanto ao substrato específico e mecanismo de regulação. Em mamíferos, a glicólise é regulada pela quantidade de energia, estado nutricional e modulação hormonal. Entretanto, os conhecimentos a respeito das funções destes mecanismos regulatórios em peixes ainda são limitados (CHRISTIANSEN & KLUNGSOYR, 1988). Como muitas espécies de peixe passam por períodos naturais de escassez de alimento, vários estudos tem tentado definir as respostas metabólicas dessas espécies sujeitas a este tipo de estresse (FOSTER & MOON, 1991). Durante o jejum, a atividade das enzimas hexoquinase, fosfofrutoquinase e piruvatoquinase no fígado de peixes encontra-se diminuída (FIDEU et al., 1983; FOSTER & MOON, 1991). MOON & JOHNSTON (1980) notaram uma diminuição significativa na atividade dessas três enzimas no músculo branco de Pleuronectes platessa submetido a 4 meses de jejum. Diminuições similares, mas menores, das mesmas enzimas foram observadas também, no músculo vermelho e fígado. Segundo MOON (1983), a atividade da hexoquinase no fígado, músculo vermelho e branco, durante o jejum, é variável mas 12 geralmente baixa, fato que pode limitar a utilização de glicose por estes tecidos. A hexoquinase, fosfofrutoquinase e piruvatoquinase tiveram atividades semelhantes e qualquer uma pode limitar o fluxo glicolítico. Das três enzimas, somente a fosfofrutoquinase tem demonstrado características regulatórias no fígado dos peixes. SHIKATA et al. (1993) não encontraram alterações na atividade da piruvatoquinase em Cyprinus carpio. As respostas obtidas por SOENGAS et al. (1996) revelaram uma diminuição na atividade da fosfofrutoquinase no fígado de Salmo salar num período superior a 7 dias de jejum. Algumas informações sobre a influência de diferentes dietas na atividade das enzimas glicolíticas são disponíveis. A atividade da hexoquinase aumenta na truta arco-íris (Salmo gairdneri) submetida à dietas ricas em carboidrato, enquanto que dietas ricas em proteína diminuem a atividade da hexoquinase e fosfofrutoquinase (CHRISTIANSEN & KLUNGSOYR, 1988). As diferentes fontes de carboidratos testadas por LIN & SHIAU (1995), em tilápias (Oreochromis niloticus x Oreochromis aureus), não afetaram as enzimas hexoquinase e fosfofrutoquinase, da via glicolítica. A gliconeogênese é uma via biossintética responsável pela síntese de novo de glicose (a síntese de glicogênio geralmente está incluída) a partir de precursores incluindo lactato, aminoácido, glicerol e frutose. Várias das reações da via gliconeogênica são possíveis através da ação de enzimas que são facilmente reversíveis, comumente tidas como glicolíticas. Estas enzimas são: fosfoglicoisomerase, aldolase, triose fosfato-isomerase, gliceraldeído fosfato desidrogenase, fosfogliceratoquinase, fosfogliceratomutase e enolase. Entretanto, três enzimas da glicólise (hexoquinase, fosfofrutoquinase e piruvatoquinase) são essencialmente irreversíveis e devem ser “superadas” para que ocorra fluxo gliconeogênico em sentido contrário. Para isto, os tecidos gliconeogênicos possuem enzimas específicas que catalizam reações no sentido gliconeogênico. Estas enzimas são: glicose-6-fosfatase, frutose 1,6 difosfatase, piruvato carboxilase e fosfoenolpiruvato carboxiquinase. A atividade dessas 13 enzimas está relacionada com a produção de glicose (SUAREZ & MOMMSEN, 1987; MOON, 1988). Diferente da glicólise, que ocorre em todos os tecidos, em vertebrados a gliconeogênese é restrita a certos tecidos, incluindo o fígado e os rins, (Cahill, 1986 citado por MOON, 1988). O músculo esquelético pode produzir glicogênio, a partir do lactado, durante o exercício, mas não há evidências de que este processo contribui para o “pool” de glicose (Connett, 1979 e McLane & Holloszy, 1979 citados por MOON, 1988). A gliconeogênese é afetada pela composição da dieta e pelo estado nutricional do peixe. COWEY et al. (1977) observaram aumento na atividade das enzimas gliconeogênicas em truta arco-íris (Salmo gairdneri) alimentada com dietas ricas em proteína, comparativamente às dietas ricas em carboidrato. Uma diminuição na incorporação do C14 da alanina à glicose foi observada em peixes alimentados com dietas ricas em carboidrato. Estes efeitos também foram encontrados por HIGUERA & CARDENAS (1985), indicando uma certa capacidade da truta arco-íris (Salmo gairdneri) em regular a gliconeogênese de acordo com as alterações da dieta. LIN & SHIAU (1995) observaram que a glicose-6- fosfatase não foi afetada por diferentes fontes de carboidrato, em tilápias (Oreochromis niloticus x Oreochromis aureus). O jejum geralmente aumenta o fluxo gliconeogênico em peixes como ocorre em mamíferos (MOON, 1988), mas para que se possa observar alguma alteração na atividade das enzimas gliconeogênicas é necessário um jejum prolongado (CHRISTIANSEN & KLUNGSOYR, 1988). MORATA et al. (1982a) observaram um aumento na atividade da frutose difosfatase e fosfoenolpiruvato carboxiquinase na truta arco-íris (Salmo gairdneri), depois de 2 meses de jejum. MOON & JOHNSTON (1980) notaram um grande aumento na atividade da fosfoenolpiruvato carboxiquinase no Pleuronectes platessa, depois de 4 meses de jejum, embora não tenham encontrado alterações na atividade da piruvato carboxilase e 14 frutose difosfatase. A atividade da glicose-6-fosfatase foi aumentada durante o jejum, em Salmo gairdneri (NAGAYAMA et al., 1972), Leuciscus idus melanotus (SEGNER & BRAUNBECK, 1988) e Cyprinus carpio (SHIMENO et al., 1990). FOSTER & MOON (1991) encontraram aumento na atividade da fosfoenolpiruvato carboxiquinase em Perca flavescens, depois de 7 meses de jejum. Em mamíferos, a atividade da glicose-6-fosfatase aumenta durante o jejum acentuando a gliconeogênese, como também foi observado em Salmo gairdneri por SCHÄR et al. (1985). Entretanto, Macha et al. (1982), citados pelos autores anteriores, encontraram diminuições na atividade desta enzima em outros teleósteos. O glicogênio é a principal forma de armazenamento de carboidrato nos animais e ocorre principalmente no fígado e músculos. No músculo, ele atua como fonte de unidades de hexose para a glicólise. Já o glicogênio hepático está grandemente relacionado com a exportação de unidades de hexose para a manutenção da glicose sangüínea. Os mecanismos de regulação intracelular envolvem tanto a síntese como a degradação da molécula do glicogênio. A reação de síntese é catalisada pela enzima uridina difosfo-glicose glicogênio transferase. Esta enzima existe sob duas formas, sendo que uma delas, a uridina difosfo-glicose glicogênio transferase (D), depende da concentração de glicose-6-fosfato do citosol. O aumento da concentração de glicose-6-fosfato ativa a enzima e acelera a síntese do glicogênio, enquanto a redução na sua concentração inibe a enzima e reduz o processo de síntese. A forma I é mais ativa que a D para catalisar a síntese de glicogênio (MELLO DE OLIVEIRA, 1986). Em peixes, a glicogênio sintetase foi primeiramente encontrada na truta arco-íris, Salmo gairdneri (INGRAM, 1970), sendo que sua atividade no fígado e músculo vermelho foi idêntica e 15 vezes maior do que no músculo branco. O salmão do Pacífico (CHANG & IDLER, 1960) não mobilizou os estoques de glicogênio do fígado durante a migração para a 15 desova. Esta mesma inércia dos estoques de glicogênio no fígado foi vista em outros peixes, sendo a carpa o exemplo mais extremo. A carpa (Cyprinus carpio) pode permanecer em jejum por mais de 100 dias sem esgotar o glicogênio hepático (NAGAI & IKEDA, 1971). Na truta arco-íris (Salmo gairdneri), MORATA et al. (1982a) encontraram uma redução de 80% no glicogênio do fígado, após 20 dias de jejum. Prolongando o jejum, não houve redução no conteúdo do mesmo. Pelo contrário, o glicogênio aumentou até certo ponto e permaneceu constante durante o período de jejum (60 dias). Em truta arco-íris (Salmo gairdneri) submetida ao estresse físico, MORATA et al. (1982b) observaram uma diminuição rápida no glicogênio hepático, com uma redução máxima de 40%, após 30 minutos. Depois disso, a síntese de novo recuperou os níveis de glicogênio aos seus valores originais em 45 minutos, permanecendo assim até o final do período experimental. No músculo, a quebra de glicogênio durante o estresse foi mais rápida e a síntese não foi observada nos 60 minutos do período experimental. Isto indica que o glicogênio hepático é um estoque de emergência e é mobilizado somente durante os primeiros minutos de uma situação crítica. Entretanto, o glicogênio muscular está mais prontamente disponível e especialmente no músculo branco, o glicogênio é rapidamente quebrado a lactato quando este músculo é requerido para trabalho de alta intensidade (Stevens & Black, 1966 citados por CHRISTIANSEN & KLUNGSOYR, 1988) como, por exemplo, na captura de presa ou fuga de predadores. O desdobramento do glicogênio inicia-se pela ação da fosforilase, que é uma enzima específica para o rompimento fosforolítico dos laços 1,4 do glicogênio, para dar glicose-1- fosfato. No fígado, a fosforilase existe nas formas a (ativa) e b (inativa) (CHRISTIANSEN & KLUNGSOYR, 1988). MORATA et al. (1982b) encontraram somente a forma a na truta arco- íris (Salmo gairdneri). Durante o jejum, a atividade da enzima glicogênio fosforilase, assim como a fosfofrutoquinase e piruvatoquinase, diminui (FOSTER & MOON, 1991). Os resultados 16 obtidos por SUNDBY et al. (1991), com salmão do Atlântico (Salmo salar) e bacalhau (Gadus morhua), demonstraram que a atividade da hexoquinase estava aumentada no fígado do salmão e diminuída no bacalhau. Encontraram, ainda, que a atividade da glicogênio fosforilase e fosfofrutoquinase estava aumentada no salmão. Entretanto, no bacalhau, o jejum provocou diminuição ou não alterou a atividade da fosforilase. SOENGAS et al. (1996) não encontraram alterações significativas na atividade da glicogênio fosforilase total no fígado do salmão do Atlântico (Salmo salar), em fase inicial de jejum (7 dias), mas a partir da segunda semana a atividade desta enzima aumentou significativamente em relação aos peixes controles. Quanto à atividade da glicogênio fosforilase a, houve um aumento aos 7 e 14 dias de jejum. A combinação do jejum com o nado contínuo, em Oncorhynchus kisutch, não alterou a atividade das enzimas envolvidas no metabolismo do glicogênio hepático (glicogênio fosforilase, glicogênio sintetase, piruvatoquinase, ou seus estados fosforilados, e lactato desidrogenase) quando comparado com peixes em repouso e alimentados (VIJAYAN et al., 1993). Outras enzimas da via da pentose fosfato, glicose-6-fosfato desidrogenase e 6- fosfogluconato desidrogenase, enzimas envolvidas na síntese de lipídio, diminuem no fígado de peixes durante o jejum, indicando uma redução na formação de lipídio (LOVE, 1980). Yamauchi et al. (1975) citados por CHRISTIANSEN & KLUNGSOYR (1988) também encontraram diminuição na atividade dessas enzimas, no fígado de Salvelinus fontinalus, após uma semana de jejum. Em Leuciscus idus melanotus, a atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase foi diminuída durante o jejum (SEGNER & BRAUNBECK, 1988). A lactato desidrogenase é uma enzima glicolítica que catalisa a reação final, ou seja, a conversão de piruvato a lactato sob condições anaeróbicas (Maekawa, 1988 citado por 17 JAVED et al., 1995). No salmão do Atlântico, Salmo salar, a atividade desta enzima foi maior durante o jejum quando comparada com a dos peixes alimentados (SOENGAS et al., 1996). A mobilização das reservas dos tecidos, durante o jejum prolongado, também resulta em alterações pronunciadas na sua estrutura. Nos hepatócitos, o efeito do jejum pode ser notado através da diminuição da área e volume celular, aparecimento de uma cadeia de fibras colágenas, acúmulo de partículas contendo ferro, mudanças no posicionamento e forma do núcleo, espaços intercelulares reduzidos e desaparecimento da organização celular. Além disso, o citoplasma apresenta baixa afinidade tintorial, o núcleo mostra uma coloração mais escura e há diminuição nos estoques de glicogênio e lipídio. Essas e outras alterações foram observadas por THEILACKER (1978), LOVE (1980), STORCH et al. (1983), STORCH & JUARIO (1983), WATANABE (1985), SOUZA et al. (1995) e BISBAL & BENGTSON (1995). O jejum afeta a atividade metabólica e durante esse período os processos essenciais são mantidos através das reservas energéticas endógenas, resultando em perda de peso (WEATHERLEY & GILL, 1987). Este efeito aparece claramente em vários órgãos, especialmente no fígado, o qual desempenha um papel central no metabolismo intermediário, visto que nele se realizam importantes vias metabólicas, como é o caso da síntese de glicogênio, gliconeogênese, lipogênese, β oxidação e outras essenciais à sobrevivência do organismo. Quando o animal é submetido a algum estresse crônico, como é o caso do jejum prolongado, a atividade de muitas enzimas diminui, como resultado de uma diminuição do potencial total do fígado (FOSTER & MOON, 1991). Estudos têm demonstrado que o jejum provoca perda de peso corporal em Cyprinus carpio (BASTROP et al., 1991), Chanos chanos (TZENG & YU, 1992), Piaractus mesopotamicus (SOUZA, 1994), Perca fluviatilis (MEHNER & WIESER, 1994), Clarias gariepinus (ZAMAL & OLLEVIER, 1995), Anguilla anguilla (OLIVEREAU & OLIVEREAU, 18 1997), Acipenser transmontanus (HUNG et al., 1997), como também do fígado (JEZIERSKA et al., 1982; MOON, 1983; MOON et al., 1989; SHIMENO et al., 1990; FOSTER & MOON, 1991; SOUZA, 1994; ZAMAL & OLLEVIER, 1995; SOENGAS et al., 1996 HUNG et al., 1997). No peixe, a depleção de energia que ocorre durante o jejum indica que os vários constituintes do corpo podem ser mobilizados em diferentes taxas e que, estes substratos, apesar de semelhantes, podem ser utilizados de formas diferentes nos diversos tecidos do corpo. A tendência geral é conservar a proteína corporal, utilizando-se dos estoques de lipídio e glicogênio (WEATHERLEY & GILL, 1987). A utilização dos constituintes do corpo leva à hidratação o tecido, isto é, aumenta o conteúdo de água. A diferença na perda de peso entre os peixes, durante o jejum, pode ser em parte, devido as alterações no conteúdo de água. Segundo LOVE (1970, 1980), num jejum moderado, o peso corporal é mantido pela água para compensar a perda de matéria orgânica. Entre os “peixes gordurosos”, há uma relação dinâmica inversa entre o conteúdo de lipídio e água no músculo, enquanto as espécies “não gordurosas” apresentam uma relação semelhante entre a proteína e a água. A análise da composição corporal de algumas espécies de peixe revelou aumento no conteúdo de água e cinzas, sendo que os teores de lipídios e proteína diminuíram (STIRLING, 1976; REINITZ, 1983; ALLIOT et al., 1984; UMINO et al., 1991; ZAMAL & OLLEVIER, 1995). Os resultados obtidos por SOUZA (1994) foram semelhantes aos encontrados por estes pesquisadores, diferindo somente quanto à porcentagem de proteína na carcaça, a qual aumentou durante o jejum em Piaractus mesopotamicus. Esse aumento na porcentagem de proteína e cinzas foi provavelmente, decorrente da diminuição na concentração do lipídio e não de um aumento real desses componentes. Os processos anabólicos, por meio dos quais os nutrientes absorvidos são convertidos nos tecidos durante o metabolismo, são regulados por hormônios os quais estão 19 entre os principais fatores que ajudam a promover o crescimento, associados a fatores genéticos e nutricionais (WEATHERLEY & GILL, 1987). Segundo esses autores, os hormônios tireoideanos podem influenciar no crescimento. Entretanto, ainda não está claro se o seu efeito promotor de crescimento é uma conseqüência de sua ação direta ou se eles potencializam a atividade anabólica de outros hormônios, especialmente o hormônio de crescimento (agindo sinergicamente ou com efeito permissivo), ou exercem alguma influência mais generalizada no metabolismo. Segundo EALES & MacLATCHY (1989), a produção de T3 é aumentada em estado anabólico (balanço energético positivo ou condições favoráveis ao crescimento somático; ingestão de alimento ou tratamento com andrógenos ou hormônio de crescimento) e é diminuída em estado catabólico (balanço energético negativo ou condições desfavoráveis ao crescimento somático; jejum, estresse ou altos níveis de estradiol associados com vitelogênese). Assim, em peixes, como em mamíferos, o estado tireoidal pode estar perfeitamente relacionado ao balanço energético e a produção completa de T3 regula os processos de demanda de energia, que nos peixes incluem o crescimento somático, desenvolvimento e primeira maturação gonadal. O jejum inibe a atividade da tireóide e as concentrações de T3 existentes são afetadas primeiro do que as de T4 (SUMPTER, 1992). Diminuições nos níveis de T3 e T4 foram mencionadas por FARBRIDGE et al. (1992), SCOTT-THOMAS et al. (1992) e YOUSON et al. (1994), em peixes privados de alimento. Todas essas alterações sofridas pelo organismo do peixe durante o jejum e, conseqüentemente, a tolerância à fome, ocorre devido a uma reorganização metabólica, isto é, por adaptações bioquímicas reguladas pelo sistema endócrino e neural, no qual os hormônios pancreáticos e tireoideanos desempenham um importante papel (BASTROP et al., 1991). 20 3.2. A REALIMENTAÇÃO Quando o fornecimento de alimento é restabelecido, após um período de jejum, todos os processos passam a ser revertidos. Assim, os peixes utilizam primeiramente o alimento para suprir as necessidades energéticas na manutenção dos processos vitais e repor o catabolismo do tecido e, somente depois, o restante passa a ser usado para o crescimento (HEPHER, 1988). Segundo LOVE (1980), a utilização de uma ração completa e de boa qualidade favorece a recuperação dos tecidos corporais e conseqüentemente, dos seus metabólitos, apresentando respostas satisfatórias para a realimentação dos peixes. É interessante notar que as alterações nos metabólitos sangüíneos e tecidos são reversíveis e não patológicas como tem sido demonstrado em outros estudos durante a recuperação do crescimento na realimentação (WEATHERLEY & GILL, 1987). Muitos estudos têm demonstrado que a realimentação resulta em uma recuperação do glicogênio hepático e muscular, glicose sangüínea, aminoácidos, lipídio do fígado, ácidos graxos livres plasmáticos, proteína total plasmática, como também, da composição corporal, aos níveis normais (KAMRA, 1966; INCE & THORPE, 1976; LOVE, 1980; BLACK & LOVE, 1986; SHIMENO et al., 1990; BLASCO et al., 1991; SOUZA, 1994; BÖHM et al., 1994; COLLINS & ANDERSON, 1995; HUNG et al., 1997). As concentrações de T3 no plasma de peixes realimentados são rapidamente aumentadas (Higgs et al., 1982, citados por SUMPTER, 1992), assim como os níveis de T4 (HIMICK et al., 1991), os quais são recuperados dentro de poucas horas. Várias alterações na estrutura e ultraestrutura dos hepatócitos são também atribuídas às diferenças nas condições nutricionais. Entretanto, essas modificações em suas estruturas 21 resultantes do jejum podem ser revertidas após a realimentação (LOVE, 1980; STORCH & JUARIO, 1983). Há evidências de que as enzimas da via glicolítica e gliconeogênica também retornem aos níveis originais após a realimentação (SEGNER & BRAUBECK, 1988; SHIMENO et al., 1990; GARCÍA DE FRUTOS et al., 1991; BAANANTE et al., 1991). Segundo Créac’h (1972) citado por LOVE (1980), as condições fisiológicas dos peixes em jejum parecem ser totalmente restabelecidas após dois meses de realimentação, e esses peixes podem ser diferenciados dos controles (alimentados) somente por suas elevadas concentrações de hemoglobina e seus fígados volumosos, os quais são muito ricos em glicogênio e potássio. O retorno às condições alimentares adequadas seguidas de um período de privação alimentar ou má nutrição pode resultar num desenvolvimento rápido de crescimento denominado crescimento compensatório (DOBSON & HOLMES, 1984; JOBLING et al., 1993). Em algumas espécies de peixes, tais como: Salmo gairdneri (WEATHERLEI & GILL, 1981; DOBSON & HOLMES, 1984), Phoxinus phoxinus (RUSSELL & WOOTTON, 1992), Leuciscus cephalus, Chalcalburnus chalcoidesmento, Scardinius ergthrophtalmus (WIESER et al., 1992), Salmo salar (MORTENSEN & DAMSGÅRD, 1993), Salvelinus alpinus (MORTENSEN & DAMSGÅRD, 1993; JOBLING et al., 1993), Piaractus mesopotamicus (SOUZA, 1994), e Ictalurus punctatus (KIM & LOVELL, 1995b) esse fenômeno foi observado. Trabalhos realizados com animais domésticos têm evidenciado que as respostas quanto ao crescimento compensatório podem ser influenciadas por vários fatores, como a severidade da restrição alimentar imposta, a idade, sexo e estado de maturidade sexual do animal, temperatura e composição nutriente da dieta a ser fornecida durante a fase de realimentação. Entretanto, os possíveis efeitos desses fatores em peixes são quase desconhecidos (JOBLING et al. 1993). 22 3.3. A INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA NO METABOLISMO E DESENVOLVIMENTO DO PEIXE A temperatura da água é um dos fatores mais importantes para o desenvolvimento e sobrevivência dos peixes. Durante a aclimatação térmica, muitos processos fisiológicos e bioquímicos são fundamentalmente reorganizados e esses incluem alterações na taxa metabólica, tolerância térmica, preferência de temperatura, função digestiva, eficiência de conversão alimentar, crescimento e desenvolvimento (WOO, 1990). Muitos estudos têm documentado os efeitos da temperatura no metabolismo dos peixes, mas é difícil estabelecer um padrão de resposta, tendo em vista que as espécies respondem diferentemente ao estresse, seja ele nutricional ou térmico. Para algumas espécies de peixes, tais como Barbus holubi, Cyprinus carpio, Labeo umbratus, Labeo capensis (Van VUREN & HATTINGH, 1978), Sarotherodon mossambicus, Cyprinus carpio (SMIT et al., 1981) e Chrysophrus major (WOO, 1990), os níveis de proteína plasmática diminuíram em temperaturas mais baixas. Entretanto, em Salmo gairdneri (SMIT et al., 1981) o mesmo não ocorreu. Já os níveis de glicose apresentaram respostas diferentes, podendo-se observar que para Cyprinus carpio, Chrysophrus major e Salmo gairdneri os valores foram maiores, enquanto que em Sarotherodon mossambicus isso ocorreu em uma temperatura intermediária (20oC). A adaptação ao frio também resulta em uma imensa variedade de alterações no fígado. Por exemplo: reorganização metabólica que inclui diminuição na taxa de consumo de oxigênio (Moerland & Sidell, 1981 citados por MOON et al., 1985), marcante hipertrofia do fígado, troca do lipídio pelo carboidrato como fonte de combustível e diminuição na atividade de algumas enzimas (WOO, 1990). Alguns mecanismos podem ser responsáveis pelas alterações na taxa desses processos metabólicos. A concentração e ativação de enzimas existentes pode ser variada, a síntese de novas formas de proteína pode ser induzida ou a 23 existência de enzimas micro-ambientais (pH citosólico, fluidez de lipídio da membrana) pode ser modificada (Hochachka & Somero, 1984, citados por MOON et al. 1985). Desta forma, o efeito da temperatura auxilia as espécies de peixe de clima temperado a suportar a falta de alimento, que geralmente ocorre no inverno (WEATHERLEY & GILL, 1987). Como se sabe, os peixes têm um limite, alto e baixo, de tolerância térmica e “percebem” quando a temperatura é ótima para o crescimento, reprodução, conversão alimentar ótima e resistência à doenças. A maioria dos peixes de águas tropicais pára de se alimentar quando a temperatura atinge 17 a 18oC e atinge a taxa máxima em 28 e 30oC (BORGHETTI & CANZI, 1993). Desta forma, muitas espécies apresentam uma taxa de crescimento maior com o aumento da temperatura (CUI & WOOTON, 1988). A temperatura também desempenha um papel crucial durante o jejum influenciando nas alterações dos componentes corporais (WEATHERLEY & GILL, 1987). Durante o verão foram observadas diminuições mais acentuadas nos níveis de glicose (OTTOLENGHI et al., 1995), glicogênio hepático (MEHNER & WIESSER, 1994), peso do fígado (WALSH et al., 1983; MEHNER & WIESER, 1994) e peso corporal (KIM & LOVELL, 1995a). Entretanto, a aclimatação térmica, a baixas temperaturas, resultou em aumento na atividade de algumas enzimas durante o jejum (WALSH et al., 1983). Como pode-se notar, os efeitos do jejum, no verão, são mais severos do que no inverno, por ser a taxa metabólica mais alta (maior demanda energética) nesse período (WEATHERLEY & GILL, 1987). 24 4. MATERIAL E MÉTODOS O presente experimento foi conduzido no Centro de Aqüicultura da UNESP e no Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - Câmpus de Jaboticabal (localizado a 21o15’22” de latitude sul, 48o18’58” de longitude oeste e a 595m de altitude, a 2 Km do perímetro urbano). A fase experimental de campo realizou-se no período de 17 de outubro de 1995 a 16 de janeiro de 1996. 4.1. ANIMAIS E ALIMENTAÇÃO Foram utilizados 98 juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus), sem distinção de sexo, com peso inicial entre 200 e 300 g, procedentes do Centro de Aqüicultura. Estes animais foram divididos em dois grupos: controle (alimentado - A1) e experimental (restrição alimentar e realimentação - A2). 25 Os animais foram submetidos a um período de adaptação de sete dias nos tanques, antes de iniciar o período experimental. A ração foi fornecida diariamente aos dois grupos durante o período de adaptação e, posteriormente, apenas um dos grupos (controle) continuou sendo alimentado diariamente. Foi utilizada ração comercial estrusada para crescimento e engorda Fri-Peixe no 2, fabricada pela Rações Fri-Ribe S.A., contendo: 12% de umidade, 24% de proteína bruta, 3% de extrato etéreo, 8% de fibra bruta, 11% de matéria mineral, 1,8% de cálcio e 0,6% de fósforo, cuja composição básica consistia de: milho integral moído, farelo de trigo, farelo de soja, farinha de vísceras, farinha de peixe, sal comum (NaCl), calcário calcítico e premix mineral vitamínico. A quantidade de ração fornecida variou 3 a 5% do peso corporal, de acordo com as oscilações da temperatura da água, conforme as indicações do fabricante. O arraçoamento foi feito diariamente, no período da manhã, em torno de 09:00 horas. A temperatura da água dos tanques foi medida diariamente na sub-superfície, às 09:00 e 16:00 horas, utilizando-se um termômetro Incoterm, e os dados de temperatura ambiente, umidade relativa do ar, precipitação pluviométrica e insolação foram obtidos através da Estação Agroclimatológica, do Departamento de Ciências Exatas da FCAV/UNESP. 4.2. INSTALAÇÕES Os animais do grupo controle (A1) e experimental (A2) foram mantidos em dois tanques distintos, cada um contendo inicialmente 49 animais, com área de 39,1 m2 , profundidade média de 1,10 m, vazão mínima de 5,4 l/min., abastecidos com água procedente de mina. 26 4.3. DELINEAMENTO ESTATÍSTICO Após a fase de adaptação, o grupo experimental foi amostrado aos 0 (P0), 2 (P1), 7 (P2), 30 (P3) e 60 (P4) dias de restrição alimentar e aos 7 (P5) e 30 (P6) dias de realimentação. O grupo controle foi alimentado diariamente e amostrado nos mesmos períodos que o grupo experimental. Para a análise de variância foi utilizado o Delineamento Inteiramente Casualizado (DIC) no esquema Fatorial 2x7 (Alimentação x Períodos), com 7 repetições, sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey (STEEL & TORRIE, 1980): CAUSAS DE VARIAÇÃO G.L. Alimentação (A) 1 Períodos (P) 6 Interação (A x P) 6 (Tratamentos) (13) Resíduo 84 TOTAL 97 As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa ESTAT, desenvolvido na FCAV/UNESP. 4.4. AMOSTRAGENS Sempre no dia anterior a cada período de amostragem, sete animais de cada grupo (controle e experimental) foram capturados, dos respectivos tanques, com rede arrasto e transferidos para aquários de alvenaria do Laboratório Didático do Centro de Aqüicultura. 27 Na amostragem, os animais foram retirados individual e cuidadosamente dos aquários, com auxílio de um puçá, anestesiados com benzocaína (1g/15L), pesados e medidos em balança de precisão e ictiômetro, respectivamente. Em seguida, foram coletadas amostras de sangue, por punção da veia caudal, com seringas heparinizadas, para as determinações bioquímicas. Posteriormente, tiveram a cavidade abdominal aberta para a retirada do fígado, que foi pesado, dividido em porções, embalado em papel alumínio, congelado em gelo seco e mantido em freezer a -20oC para posterior dosagem de glicogênio e lípidio. Fragmentos de aproximadamente 5 mm3 foram congelados e mantidos em nitrogênio líquido a -190oC para histoquímica e outros, fixados em Bouin a 4oC para análises histológicas. Alguns fragmentos foram fixados em solução de Karnowsky (KII), a 4oC, para microscopia eletrônica de transmissão. A carcaça de todos os animais utilizados neste experimento foi congelada em freezer a -20oC para posterior análise de sua composição. Os peixes foram moídos inteiros (com vísceras, mas com o trato digestivo limpo de conteúdo e gordura), lavando-se a máquina a após moagem de cada indivíduo. Posteriormente, foram coletadas amostras da massa homogeneizada, liofilizadas a -40oC por 24 horas e utilizadas para determinação de matéria seca, umidade, proteína bruta, cinzas e extrato etéreo, realizadas no Laboratório de Nutrição Animal, do Departamento de Nutrição Animal e Pastagens da FCAV/UNESP. 4.5. MÉTODOS UTILIZADOS PARA OBTENÇÃO DOS DADOS 4.5.1. Glicose Sangüínea Para a determinação da glicose sangüínea foi utilizado o método colorimétrico de KING & GARNER (1947), que consistiu, primeiramente, em misturar a 1,8 ml de solução 28 isotônica (sulfato de sódio e sulfato de cobre), 0,1 ml de sangue e 0,1 ml de solução de tungstato de sódio a 10%. Centrifugado por 10 minutos a 2.000 rpm, o sobrenadante foi retirado e mantido congelado a -20oC, em freezer, até a realização da análise, quando foi adicionado 1 ml de reagente cúprico e 3 ml de arsenomolibídico. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro a 540 nm. 4.5.2. Glicogênio Hepático O teor de glicogênio hepático foi dosado pelo método de antrona, de acordo com CARROL et al. (1956). Amostras de 500 mg de tecido foram colocadas em tubos de centrífuga contendo 2 ml de KOH a 30% e depois hidrolizadas em banho-maria a 100oC por 1 hora. Em seguida foram adicionadas 5 gotas de Na2SO4 saturado e 4,5 ml de álcool etílico a 95%. Essa mistura foi agitada com bastão de vidro e aquecida até a fervura em banho-maria. O bastão foi retirado e os tubos centrifugados a 2.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado, ressuspenso com 2 ml de água destilada aquecida e adicionado 4,5 ml de álcool etílico 95%. Após quatro lavagens, o precipitado foi ressuspenso com 2 ml de água destilada aquecida e completado para 10 ml com água destilada. 0,1 ml desse volume foi transferido para um tubo, completado para 2 ml de água destilada, colocado em água com gelo, adicionando-se lentamente 4 ml do reagente de antrona dissolvido em H2SO4 a 95%. As leituras das amostras, em absorbância, foram realizadas em espetrofotômetro a 620 nm. 29 4.5.3. Ácidos Graxos Livres Plasmáticos A dosagem de ácidos graxos livres plasmáticos foi realizada utilizando o método proposto por DOLE & MEINERTZ (1960). Foi utilizado 0,2 ml de plasma para o processo de extração com heptana. Na titulação foi acrescentada uma solução indicadora, preparada com timol azul a 0,1% e o ponto de viragem (aparecimento da cor mostarda) foi obtido adicionando-se NaOH a 0,5 N em presença de nitrogênio. 4.5.4. Lipídios Totais do Fígado A extração dos lipídios totais do fígado foi feita através da técnica de BLIGH & DYER (1959). Utilizou-se 500 mg de tecido homogeneizado em 5 ml da mistura de extração com solvente orgânico (clorofórmio - metanol 2:1). Após a filtragem do homogenado foi acrescentada água destilada na proporção de 5:1, agitado e centrifugado por 5 minutos a 1.500 rpm para obtenção de camadas distintas, sendo uma contendo a fração lipídica (clorofórmio) e outra não lipídica (metanol). Através do isolamento da camada que continha o lipídio, cada amostra foi colocada em placas de Petri previamente pesadas e em seguida levadas a estufa à 100oC por 1 hora para evaporação. A diferença entre os pesos inicial e final das placas permitiu a realização dos cálculos para obtenção da porcentagem de lipídio em cada amostra. 30 4.5.5. Proteína Total Plasmática A proteína total plasmática foi dosada pelo método de macrobiureto, de acordo com GORNALL et al. (1949), utilizando-se 0,1 ml de plasma e adicionando 0,9 ml de água destilada. Em seguida, adicionou-se 4 ml do reagente de biureto. Após 30 minutos, foi realizada a leitura das amostras em espectrofotômetro Hitachi U-2000, a 540 nm. 4.5.6. Triiodotironina (T3) A determinação dos níveis de T3 no plasma foi realizada por radioimunoensaio (RIA), com kits Coat-A-Count T3 Total da DPC. O limite mínimo de detecção para este hormônio foi de 0,18 ng/ml. 4.5.7 Índice Hepato-somático (IHS) Foi estimado através da relação porcentual entre o peso do fígado (g) e o peso corporal (g). IHS= peso do fígado x 100 peso corporal 4.5.8. Índice Gordura Víscero-somático (IGVS) Foi estimado através da relação porcentual entre o peso da gordura visceral (g) e o peso corporal (g). IGVS= peso da gordura visceral x 100 peso corporal 31 4.5.9. Morfologia e Morfometria dos Hepatócitos Para descrição estrutural dos hepatócitos foi utilizada a técnica de coloração de hematoxilina de Harris (HE), descrita por BEHMER et al. (1976). As amostras de fígado, após coletadas e fixadas em Bouin a 4oC, foram incluídas em parafina, microtomizadas com 5 µm de espessura e coradas por HE. Os cortes histológicos foram analisados por microscópio de luz, com objetiva de 40x, acoplado ao sistema analisador de imagem Kontron Elektronik (Videoplan) para análise morfométrica dos hepatócitos (área e volume do citoplasma e núcleo). De cada lâmina observada, procedeu-se a leitura de 30 hepatócitos e, posteriormente, calculou-se a média dos valores obtidos para cada parâmetro analisado. Os cortes foram fotomicrografados no Fotomicroscópio Nikon Alphaphot-2 YS2. 4.5.10. Ultraestrutura do Glicogênio Para a observação da distribuição de glicogênio nos hepatócitos, fragmentos de 1 mm3 de fígado foram fixados em solução de Karnowsky (2% paraformaldeído, 2% glutaraldeído, 0,25% CaCl2, pH 7,4), pós-fixados em tetróxido de ósmio a 1% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,4 por 2 horas a 4oC. Em seguida, os fragmentos foram lavados no mesmo tampão e desidratados com passagens em soluções crescentes de acetona, nas seguintes concentrações: acetona 30% x 10 min., acetona 50% x 10 min., acetona 70% x 10 min., acetona 90% x 10 min., acetona 95% x 10 min. e acetona 100% 3 x de 20 min. cada. O procedimento seguinte foi a infiltração, iniciada com a imersão das amostras em uma mistura de araldite e acetona pura (1:1), por 2 horas, e depois colocadas em uma mistura de araldite e acetona (2:1), por 24 horas à temperatura ambiente. A inclusão foi feita em mistura plena de araldite na seguinte proporção: araldite 6005 resina 20 ml, 32 BDMA (acelerador) 1 ml, DDSA (endurecedor) 16 ml, dibutilfitato (plastificador) 0,4 ml. O material incluído foi colocado na estufa de 60oC por 72 horas, para que se efetuasse a polimerização. Para uma melhor visualização de glicogênio, as amostras, após a fixação, foram pós- fixadas em solução de ósmio a 1% + ferrocianeto de potássio a 1,5% em temperatura ambiente por 2 horas (técnica de ósmio redução - NOVIKOFF, 1971). Após essa etapa, o material foi transferido diretamente para acetona 30%, sem pré-lavagem. Em seguida, as amostras foram processadas rotineiramente para microscopia eletrônica de transmissão. Os cortes foram fotoeletronmicrografados no microscópio eletrônico de transmissão JEOL-100C. 4.5.11. Histoquímica do Glicogênio Para a demonstração histoquímica do glicogênio na célula hepática foi utilizada a coloração pelo PAS (Ácido Periódico – Reativo de Schiff) associada com a coloração de cortes vizinhos previamente submetidos à digestão por α amilase (WEGMANN & VERNE, 1958). Foram utilizados fragmentos de fígado congelados e mantidos em nitrogênio líquido, os quais foram criotomizados a -14oC, com 5 µm de espessura. Os cortes foram montados em xarope de Apathy, observados em microscópio e fotomicrografados no Fotomicroscópio Nikon Alphaphot-2 YS2. Para a leitura das lâminas foi utilizada uma avaliação qualitativa da intensidade da reação, cuja graduação variou de ( - ), quando negativas, a ( ++++ ), quando positivas. A designação para cada tipo de reação, quando positiva, foi a seguinte: fraca ( + ), moderada ( ++ ), forte ( +++ ) e intensa ( ++++ ). 33 4.5.12. Histoenzimologia do Metabolismo Intermediário Foram utilizados fragmentos de fígado congelados e mantidos em nitrogênio líquido, os quais foram criotomizados a -14oC, com 5 µm de espessura, para análise da atividade de enzimas indicadoras das vias de utilização do combustível energético a nível celular, através de técnicas histoenzimológicas, tais como: a) Fosfofrutoquinase (PFK, EC 2.7.1.11): segundo BONILLA & SCHOTLAND (1970). Os cortes foram pré-fixados em acetona por 20 min. em temperatura ambiente, secos ao ar por 2 horas, incubados por 2 horas com solução mãe (tampão arseniato 0,02 M pH 7,0 = 5,0 ml; NAD - Sigma N-7004 = 6,6 mg; adenosina 5’ trifosfato - Sigma A-3377 = 5,5 mg; sulfato de magnésio = 1,2 mg; água destilada deionizada = 5,0 ml) = 5,0 ml e frutose-6-fosfato de sódio - Sigma F-3627 = 3,0 mg, fixados em formol a 10% por 5 min. e lavados em água destilada deionizada. b) Fosfoglucomutase (PGM, EC 2.7.5.1): segundo MELLO DE OLIVEIRA (1977). Os cortes foram incubados a 37oC por 30 min. com solução estoque (glicose-1,6-fosfato - Sigma G- 7000 = 0,75 mg; cloreto de magnésio 0,1 M = 0,4 ml; NADP - Sigma N-0505 = 2,5 mg; NBT - Sigma N-6876 = 1,0 mg; tampão tris HCl 0,2 M pH 7,4 = 2,5 ml; água destilada deionizada = 4,6 ml) = 4,0 ml e glicose-1-fosfato - Sigma G-5875 = 1,2 mg, fixados em formol neutro 10% por 5 min. e lavados em água destilada deionizada. c) Glicose-6-fosfatase (G6P-A, EC 3.1.3.9): segundo CHIQUOINE (1953). Os cortes foram incubados no seguinte meio: - Solução I (acetato de sódio 0,2 M = 1,0 ml; glicose-6-fosfato - Sigma G-7250 = 1,5 mg) = 1,0 ml; - Solução II (acetato de chumbo 2% = 0,30 ml; água 34 destilada = 1,70 ml) = 1,0 ml, por 30 min. a 37oC, lavados em água destilada deionizada, passados em sulfeto de amônio 1% (filtrado) por 1 min. e lavados em água corrente. d) Glicose-6-fosfato desidrogenase / 6-fosfogluconato desidrogenase (G6P-D, EC 1.1.1.49 / 6PG-D, EC 1.1.1.44): segundo WEGMANN & GERZELI (1961). Os corte foram incubados nos seguintes meios: - G6P-D [solução estoque (tampão tris HCl 0,2 M pH 7,4 = 5,0 ml; cloreto de magnésio 0,1 M = 0,8 ml; NADP - Sigma N-0505 = 5,0 mg; NBT - Sigma N- 6876 = 2,0 mg; água destilada deionizada = 9,2 ml) = 5,0 ml e glicose-6-fosfato - Sigma G- 7250 = 1,52 mg]; - 6PG-D (solução estoque = 5,0 ml e 6-fosfogluconato - Sigma P-7877 = 2,86 mg), a 37oC por 30 min., lavados em água destilada deionizada, fixados em formol neutro 10% por 5 min. e lavados em água destilada deionizada novamente. e) Lactato desidrogenase (L-D, EC 1.1.1.27): segundo WEGMANN & SOTELO (1962). Os cortes foram incubados em solução lactato de sódio 0,2 M (ácido lático = 1,45 ml; água destilada deionizada = 100,0 ml; hidróxido de sódio 1 N = 5,0 ml) = 0,3 ml; NBT = 0,15 mg; NAD (forma oxidada) - Sigma N-7004 = 0,9 mg, tampão fosfato 0,1 M pH 7,4 = 0,3 ml e água destilada deionizada = 0,6 ml, a 37oC por 30 min., lavados em água destilada deionizada, fixados em formol neutro 10% (filtrado) por 5 min. e lavados em água destilada deionizada novamente. f) Nicotinamida adenina dinucleotídeo - tetrazólio redutase / Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato - tetrazólio redutase (NADH2-TR, EC 1.6.99.3 / NADPH2-TR, EC 1.6.99.1): segundo SCARPELLI et al. (1958). Os cortes foram incubados nas soluções: - NADH2-TR (NADH2 - Sigma N-8129 = 3,0 mg; NBT - Sigma N-6878 = 1,0 mg; tampão tris 0,2 M pH 7,4 = 4,0 ml; água destilada deionizada = 1,0 ml); - NADPH2-TR (NADPH2 - Sigma N- 1630 = 3,0 mg; NBT - Sigma N-6878 = 1,0 mg; tampão tris 0,2 M pH 7,4 = 4,0 ml; água destilada deionizada = 1,0 ml), por 20 min. a 37oC, lavados em água destilada deionizada, 35 passados em formol neutro a 10% (filtrado) por 5 min. e lavados novamente em água destilada deionizada. g) Succinato desidrogenase (S-D, EC 1.3.99.1): segundo WEGMANN & TORDET- CARIDROIT (1960). Os cortes foram incubados em succinato de sódio = 67,5 mg, NBT - Sigma N-6878 = 0,5 mg, tampão fosfato 0,1 M pH 7,4 = 2,0 ml e água destilada deionizada = 2,0 ml, por 30 min. a 37oC, lavados em água destilada deionizada, fixados em formol neutro 10% por 5 min. e lavados em água destilada deionizada novamente. Antes da utilização do material experimental propriamente dito, foram realizados vários testes destinados à padronização dessas enzimas para o fígado de pacu, utilizando fígado e músculo de rato e peixe, tendo em vista que as mesmas são aplicadas em tecido de mamífero, rotineiramente no Laboratório de Patologia do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP. Para cada reação realizada no meio contendo o substrato, outro corte foi incubado, em paralelo, num meio de composição idêntica, porém sem o substrato (Testemunha). Os cortes foram montados em xarope de Apathy, observados em microscópio e fotomicrografados no Fotomicroscópio Nikon Alphaphot-2 YS2. Para a classificação das enzimas em estudo, foi seguida a nomenclatura adotada pela União Internacional de Bioquímica (I.U.B., 1978). 4.5.11.1. Leitura das Reações Histoenzimológicas Para a leitura da atividade enzimática foi utilizada uma avaliação qualitativa da intensidade das reações, cuja graduação variou de ( - ), quando negativas, a ( ++++ ), quando positivas, em função do acúmulo do “produto final da reação” (PFR) no citoplasma 36 celular. Quando positivas, as designações para cada tipo de intensidade de reação foram as seguintes: fraca ( + ), moderada ( ++ ), forte ( +++ ) e intensa ( ++++ ). 4.5.13. Composição Corporal a) Matéria Seca (MS) e Umidade O teor de umidade na amostra original foi determinado pesando-se aproximadamente 10 g de amostra, sendo esta acondicionada em vidros previamente tarados, os quais foram, então, transferidos para o liofilizador. Após 24 horas, o material foi novamente pesado, obtendo-se a 1a MS, da seguinte forma: 1a MS (%) = PS1 x 100 PU1 onde: PS1 = peso seco para obtenção da 1a MS PU1 = peso úmido da amostra original Para determinar a 2a MS, foi pesado 1 g da amostra liofilizada, colocando-a em cadinho de porcelana previamente tarado, o qual foi levado à estufa a 105oC, por 12 horas, sendo então, pesado novamente. Após a segunda pesagem, foi aplicada a seguinte fórmula: 2a MS (%) = PS2 x 100 PU2 onde: PS2 = peso seco para obtenção da 2a MS PU2 = peso úmido da amostra liofilizada A matéria seca original (MSO) foi obtida, utilizando-se a seguinte fórmula: MSO (%) = 1a MS x 2a MS 100 37 O teor de umidade contido na carcaça foi obtido através da fórmula: Umidade (%) = 100 - MSO onde: MSO = matéria seca original b) Proteína Bruta (PB) Para a determinação da proteína bruta, foi utilizado o método de Kjedhal (A.O.A.C., 1984), o qual avalia o teor de nitrogênio total contido na amostra. Para tanto, o nitrogênio presente nos aminoácidos transforma-se em N amoniacal, através de processos de digestão e destilação, sendo em seguida titulado com ácido clorídrico. A porcentagem de proteína bruta foi calculada da seguinte forma: PB (%) = ml x N x 14 x 6,25 x 100 PA onde: ml = quantidade de HCl gasto na titulação N = normalidade do HCl (0,1 N) 14 = peso atômico do nitrogênio 6,25 = fator de transformação para cálculo da proteína PA = peso da amostra (100 mg) c) Cinzas ou Matéria Mineral (MM) A determinação da cinza ou matéria mineral (MM) foi realizada pelo método de Weende (A.O.A.C., 1984), que consiste em colocar 1 g da amostra em cadinho de porcelana previamente tarado, sendo este levado à mufla a 600oC, por 3 horas, para que a amostra seja incinerada. 38 Cálculo: MM (%) = TC - T x 100 PA onde: TC = tara do cadinho + cinza T = tara do cadinho PA = peso da amostra d) Extrato Etéreo (EE) Este método utiliza o Extrator de Sohxlet (método de Weende - A.O.A.C., 1984), para isolar o lipídio contido na amostra e consiste em colocar 1 g do material na garrafa de Sohxlet, fazendo passar éter de petróleo pela amostra, por 5 horas. O lipídio foi recolhido em um balão volumétrico previamente tarado. Cálculo: EE (%) = BG - B x 100 PA onde: BG = peso do balão + gordura B = tara do balão PA = peso da amostra 39 5. RESULTADOS 5.1. CONDIÇÕES CLIMÁTICAS LOCAIS E TEMPERATURA DA ÁGUA DOS TANQUES Segundo os dados fornecidos pela Estação Agroclimatológica do Departamento de Ciências Exatas da FCAV/UNESP, o clima do município de Jaboticabal é definido como sendo do tipo Cwa, ou seja, sub-tropical, relativamente seco, caracterizado por chuvas de verão. Os dados diários da temperatura ambiente (máxima, mínima e média), umidade relativa do ar, precipitação pluviométrica e insolação observados durante a fase experimental encontram-se nas Figuras 1 e 2. Durante o período experimental, ocorreram grandes oscilações na temperatura ambiente. Registros de temperatura máxima mais baixos seguidos por aumentos na umidade relativa do ar e precipitação pluviométrica, com diminuições nas horas de insolação, foram decorrentes de dias chuvosos ou nublados acompanhados por frentes frias, situação esta geralmente atípica para essa época do ano. Entretanto, foram registrados também, dias 40 chuvosos quando a umidade relativa do ar apresentou valores elevados, coincidindo com aumentos na temperatura máxima, situação esta característica da região. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 17 /o ut 21 /o ut 25 /o ut 29 /o ut 02 /n ov 06 /n ov 10 /n ov 14 /n ov 18 /n ov 22 /n ov 26 /n ov 30 /n ov 04 /d ez 08 /d ez 12 /d ez 16 /d ez 20 /d ez 24 /d ez 28 /d ez 01 /ja n 05 /ja n 09 /ja n 13 /ja n DIAS TE M P E R A TU R A (° C ) Média Máxima Mínima A 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 17 /o ut 21 /o ut 25 /o ut 29 /o ut 02 /n ov 06 /n ov 10 /n ov 14 /n ov 18 /n ov 22 /n ov 26 /n ov 30 /n ov 04 /d ez 08 /d ez 12 /d ez 16 /d ez 20 /d ez 24 /d ez 28 /d ez 01 /ja n 05 /ja n 09 /ja n 13 /ja n DIAS U R (% ) B FIGURA 1 - Valores diários obtidos para temperatura ambiente (A) e umidade relativa do ar (B) no período experimental. 41 0 10 20 30 40 50 17 /o ut 21 /o ut 25 /o ut 29 /o ut 02 /n ov 06 /n ov 10 /n ov 14 /n ov 18 /n ov 22 /n ov 26 /n ov 30 /n ov 04 /d ez 08 /d ez 12 /d ez 16 /d ez 20 /d ez 24 /d ez 28 /d ez 01 /ja n 05 /ja n 09 /ja n 13 /ja n DIAS P R E C IP IT A Ç Ã O (m m ) A 0 3 6 9 12 15 17 /o ut 21 /o ut 25 /o ut 29 /o ut 02 /n ov 06 /n ov 10 /n ov 14 /n ov 18 /n ov 22 /n ov 26 /n ov 30 /n ov 04 /d ez 08 /d ez 12 /d ez 16 /d ez 20 /d ez 24 /d ez 28 /d ez 01 /ja n 05 /ja n 09 /ja n 13 /ja n DIAS IN S O LA Ç Ã O (h ) B FIGURA 2 - Valores diários obtidos para precipitação pluviométrica (A) e insolação (B) no período experimental. Quanto à temperatura da água dos tanques (Figuras 3 e 4), ocorreram variações entre os períodos da manhã e tarde, exceto nos dias nublados ou chuvosos. Pequenas diferenças 42 foram observadas entre os dois tanques, com valores pouco mais altos no tanque 2. Isto, provavelmente, foi decorrente do sombreamento sobre o tanque 1. As oscilações na temperatura da água praticamente acompanharam as encontradas na temperatura ambiente, com valores mais altos no período da tarde. 20 22 24 26 28 30 32 17 /o ut 21 /o ut 25 /o ut 29 /o ut 02 /n ov 06 /n ov 10 /n ov 14 /n ov 18 /n ov 22 /n ov 26 /n ov 30 /n ov 04 /d ez 08 /d ez 12 /d ez 16 /d ez 20 /d ez 24 /d ez 28 /d ez 01 /ja n 05 /ja n 09 /ja n 13 /ja n DIAS TE M P E R A TU R A (° C ) 9:00 16:00 Tanque 1 20 22 24 26 28 30 32 17 /o ut 21 /o ut 25 /o ut 29 /o ut 02 /n ov 06 /n ov 10 /n ov 14 /n ov 18 /n ov 22 /n ov 26 /n ov 30 /n ov 04 /d ez 08 /d ez 12 /d ez 16 /d ez 20 /d ez 24 /d ez 28 /d ez 01 /ja n 05 /ja n 09 /ja n 13 /ja n DIAS TE M P E R A TU R A (° C ) 9:00 16:00 Tanque 2 FIGURA 3 - Valores diários obtidos para temperatura da água do tanque 1 (controle) e do tanque 2 (experimental) no período de estudo. 43 5.2. DESENVOLVIMENTO DOS PEIXES A análise estatística dos dados e as respostas obtidas para o desenvolvimento do pacu (Figura 4), durante o período experimental, encontram-se a seguir. FIGURA 4 – Fotografia de um exemplar de pacu (Piaractus mesopotamicus) juvenil. A análise de variância pelo teste F (Tabela 1) revelou que os dois fatores estudados (alimentação x períodos) tiveram efeitos significativos sobre as variáveis analisadas. O estudo da interação para comparação das médias pelo teste de Tukey (Tabela 2) demonstrou que houve um crescimento maior dos animais do grupo controle ao longo dos períodos de amostragem. Este fato pôde ser estatisticamente comprovado quando analisados o peso corporal e comprimento padrão, onde os mesmos foram progressivamente maiores com o decorrer do tempo e os maiores valores (428,57 g e 44 22,60 cm, respectivamente) foram significativos (P<0,05) em relação aos demais períodos. Quanto aos animais experimentais, tanto o peso corporal quanto o comprimento padrão mantiveram-se praticamente estáveis durante toda a fase de restrição alimentar (com uma tendência de diminuição aos 60 dias - P4) e início da realimentação. Entretanto, aos 30 dias de realimentação (P6) houve um aumento significativo (P<0,05) no crescimento, onde os animais alcançaram uma média de 353,57 g no peso corporal e 21,21 cm no comprimento padrão. As diferenças estatísticas (P<0,05) entre os grupos estudados foram evidenciadas nos períodos P4, P5 e P6, para ambas as medidas. TABELA 1 - Análise de variância para o desenvolvimento dos peixes. Valores de F para as variáveis analisadas Fontes de Variação G.L. Peso Corporal Comprimen to Padrão IHS IGVS Efeito da Alimentação (A) 1 58,12** 41,06** 57,63** 19,85** Efeito dos Períodos (P) 6 36,41** 26,97** 15,32** 3,28** Interação A x P 6 10,67** 7,77** 20,00** 4,46** Coeficiente de Variação (%) 12,98 4,22 13,89 18,20 ** P<0,01 TABELA 2 – Valores médios de peso corporal, comprimento padrão, índice hepato-somático (IHS) e índice gordura víscero-somático (IGVS) dos peixes, no estudo da interação entre os fatores estudados (n = 7). Restrição Alimentar (dias) Realimentação (dias) Variáveis Grupos 0 2 7 30 60 7 30 Peso Cor- Controle 246,43 Ac 219,29 Ac 247,86 Ac 258,14 Ac 349,00 Ab 355,71 Ab 428,57 Aa poral (g) Experimental 243,00 Ab 229,29 Ab 228,57 Ab 233,57 Ab 195,00 Bb 239,29 Bb 353,57 Ba Comp. Pa- Controle 19,00 Ac(1) 18,49 Ac 19,14 Ac 19,33 Ac 21,66 Aab 21,26 Ab 22,60 Aa drão (cm) Experimental 18,89 Ab 18,44 Ab 19,07 Ab 18,89 Ab 18,61 Bb 18,83 Bb 21,21Ba IHS Controle 1,25 Aabc 1,43 Aa 1,27 Aabc 1,41 Aa 1,36 Aab 1,07 Ac 1,11 Bbc (%) Experimental 1,29 Aa 1,38 Aa 0,87 Bb 0,69 Bb 0,68 Bb 0,84 Bb 1,43 Aa IGVS Controle 3,51 Aa 3,40 Aa 3,25 Aa 3,85 Aa 3,98 Aa 3,63 Aa 4,11 Aa (%) Experimental 3,11 Aabc 3,29 Aab 3,63 Aa 3,78 Aa 2,59 Abc 2,16 Bc 3,27 Bab (1) Médias seguidas de letras iguais minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05). 45 O índice hepato-somático (IHS) dos animais controles (Tabela 2) foi maior em P1 (1,43%), que diferiu significativamente (P<0,05) de P5 e P6. Entretanto, nos animais experimentais, os maiores índices foram obtidos em P0, P1 e P6, diferindo significativamente (P<0,05) dos demais períodos. Somente não se encontrou diferença (P>0,05) entre os grupos controle e experimental nos períodos P0 e P1. Os valores obtidos para o índice gordura víscero-somático (IGVS) dos animais controles (Tabela 2) não apresentaram diferenças significativas (P>0,05) ao longo dos períodos de amostragem. Nos experimentais, os menores índices foram encontrados aos 60 dias de restrição alimentar (P4) e início da realimentação (P5). Diferenças significativas (P<0,05) entre os grupos controle e experimental foram notadas somente nos períodos P5 e P6. 5.3. COMPOSIÇÃO CORPORAL A análise de variância pelo teste F (Tabela 3) revelou que os dois fatores estudados (alimentação x períodos) tiveram efeitos significativos sobre quase todas as variáveis analisadas. Exceções a esse comportamento foram observadas quanto às porcentagens de proteína bruta e cinzas ou matéria mineral, contidas na carcaça dos peixes. O estudo da interação para comparação das médias pelo teste de Tukey (Tabela 4) demonstrou que o teor de umidade na carcaça dos animais controles foi mais alta em P1 (69,05%) diferindo significativamente (P<0,05) das encontradas em P5 e P6 (65,40 e 65,02%, respectivamente). Nos animais experimentais, o prolongamento do período de restrição alimentar resultou em aumento na porcentagem de água na carcaça. Aos 7 dias de 46 realimentação (P5), houve uma tendência de diminuição e, aos 30 dias (P6) seus valores foram restabelecidos. As diferenças entre os grupos ocorreram nos períodos P4, P5 e P6. TABELA 3 - Análise de variância para a composição corporal dos peixes. Valores de F para as variáveis analisadas Fontes de Variação G.L. Umida- De Proteína Bruta Extrato Etéreo Cinzas Efeito da Alimentação (A) 1 31,38** 0,95NS 26,81** 0,58NS Efeito dos Períodos (P) 6 3,43** 1,18NS 3,24** 1,61NS Interação A x P 6 7,94** 1,36NS 7,49** 1,28NS Coeficiente de Variação (%) 2,99 7,68 13,07 14,50 ** P<0,01; NS Não significativo (P>0,05). Para a porcentagem de lipídio ou extrato etéreo da carcaça dos animais controles (Tabela 4), não foram encontradas diferenças estatísticas (P>0,05) ao longo dos períodos de amostragem. Entretanto, nos experimentais, seus valores foram significativamente menores (P<0,05) aos 60 dias de restrição alimentar (P4). Diferenças significativas (P<0,05) entre os grupos controle e experimental foram observadas nos períodos P4, P5 e P6. TABELA 4 – Valores médios dos teores de umidade, proteína bruta, extrato etéreo e cinzas da carcaça dos peixes, no estudo da interação entre os fatores estudados (n = 7). Restrição Alimentar (dias) Realimentação (dias) Variáveis Grupos 0 2 7 30 60 7 30 Umidade Controle 67,77 Aab 69,05 Aa 67,88 Aab 68,07 Aab 65,77 Bab 65,40 Bb 65,02 Bb (%) Experimental 67,60 Ac 67,86 Ac 68,25 Abc 70,01 Aabc 72,66 Aa 71,36 Aab 67,37 Ac Extrato Controle 16,50 Aa(1) 15,14 Aa 15,83 Aa 14,95 Aa 17,91 Aa 17,41 Aa 18,18 Aa Etéreo (%) Experimental 15,73 Aa 16,06 Aa 16,21 Aa 14,07 Aab 10,77 Bc 12,36 Bbc 15,89 Ba Proteína Controle 14,22 14,29 14,61 15,48 14,71 15,32 15,18 Bruta (%) Experimental 15,03 14,35 13,96 14,23 14,96 14,53 15,20 Cinzas Controle 1,50 1,51 1,68 1,49 1,60 1,86 1,61 (% ) Experimental 1,63 1,73 1,57 1,68 1,61 1,74 1,54 (1)Médias seguidas de letras iguais minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05). *Os dados obtidos para extrato etéreo, proteína bruta e cinzas foram calculados na base úmida. 47 Os resultados obtidos para as porcentagens de proteína bruta e cinzas (Tabela 4) tiveram um perfil semelhante, ou seja, não foram significativamente (P>0,05) afetados por qualquer efeito estudado (alimentação, períodos e interação). 5.4. VARIÁVEIS METABÓLICAS A análise de variância pelo teste F (Tabela 5) revelou que os dois fatores estudados (alimentação x períodos) tiveram efeitos significativos sobre quase todos as variáveis metabólicas analisadas. Exceções, a esse comportamento, foram os efeitos da alimentação no glicogênio hepático e da interação na porcentagem de lipídio total do fígado e níveis de T3 (triiodotironina). TABELA 5 - Análise de variância para variáveis metabólicas dos peixes. Valores de F para as variáveis analisadas Fontes de Variação G.L. Glicogênio Hepático Glicose Sangüínea Proteína Plasmática Lipídio Total do Fígado Ácidos Gra Xos Livres T3 Efeito da Alimentação (A) 1 1,59NS 5,41* 66,43** 17,36** 7,62** 38,19** Efeito dos Períodos (P) 6 28,47** 6,25** 9,38** 2,74* 5,81** 29,85** Interação A x P 6 15,19** 3,42** 5,67** 1,24NS 3,39** 0,64NS Coeficiente de Variação (%) 24,68 18,84 11,34 23,96 16,66 27,68 ** P<0,01; * P<0,05; NS Não significativo (P>0,05). O estudo da interação para comparação das médias pelo teste de Tukey (Tabela 6) demonstrou que os valores de glicogênio hepático nos animais controles foram mais altos em P2 e significativamente diferente (P < 0,05) dos obtidos em P0, P3, P4 e P6. Entretanto, nos animais experimentais, os valores foram mais altos em P0 e P1 (5,90 e 7,01%, respectivamente), os quais diferiram significativamente (P<0,05) dos demais períodos. 48 Quando analisadas as médias dentro de cada período, entre os grupos estudados, observa- se que não foram encontradas diferenças significativas (P>0,05) em P3, P4 e P6, para este metabólito. TABELA 6 – Valores médios dos níveis de glicogênio hepático, glicose sangüínea, proteína total plasmática, lipídio total do fígado, ácidos graxos livres plasmáticos e triiodotironina (T3) dos peixes, no estudo dos fatores estudados (n = 7). Restrição Alimentar (dias) Realimentação (dias) Variáveis Grupos 0 2 7 30 60 7 30 Média Glicogênio Controle 4,18 Bb(1) 4,25 Bab 5,71 Aa 3,14 Abc 3,45 Ab 4,23 Aab 1,83 Ac Hepático (%) Experimental 5,90 Aa 7,01 Aa 2,75 Bb 2,72 Ab 2,75 Ab 2,36 Bb 1,60 Ab Glicose Sangüí- Controle 80,55 Aab 89,78 Aa 78,53 Aab 68,90 Bab 63,84 Ab 63,16 Ab 65,42 Ab nea (mg/100 ml) Experimental 66,65 Aabc 76,06 Aab 58,84 Bbc 84,82 Aa 71,79 Aabc 53,05 Ac 55,72 Abc Lipídio Total Controle 6,59 5,23 5,50 5,39 5,31 4,19 5,80 5,43 A do Fígado Experimental 4,38 5,11 4,94 4,45 3,81 3,70 4,65 4,43 B (%) Média 5,48 a 5,17 ab 5,22 ab 4,92 ab 4,56 ab 3,95 b 5,23 ab Ácidos Graxos Controle 0,46 Aa 0,56 Aa 0,46 Ba 0,52 Ba 0,54 Ba 0,59 Aa 0,53 Aa Livres (µmol/ml) Experimental 0,43 Ac 0,50 Abc 0,58 Aabc 0,64 Aab 0,72 Aa 0,60 Aab 0,55 Abc Proteína Plasmá Controle 4,18 Ab 4,65 Ab 4,23 Ab 6,17 Aa 4,29 Ab 4,77 Ab 4,35 Ab tica (mg/ml) Experimental 3,73 Aa 3,90 Ba 3,74 Aa 4,01 Ba 3,84 Aa 4,01 Ba 3,85 Aa T3 Controle 1,11 1,49 1,81 1,34 2,36 1,86 3,17 1,87 A (ng/ml) Experimental 0,74 0,77 1,12 0,86 1,54 1,56 2,55 1,31 B Média 0,93 d 1,13 cd 1,47 bc 1,10 cd 1,95 b 1,71 b 2,86 a (5) Médias seguidas de letras iguais minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P>0,05). Os níveis de glicose sangüínea (Tabela 6) nos animais controles foram maiores nos quatro primeiros períodos, mas as diferenças significativas (P<0,05) ocorreram quando os valores obtidos em P1 foram comparados aos de P4, P5 e P6. Nos animais experimentais, o nível mais alto foi detectado em P3, o qual diferiu significativamente (P<0,05) dos encontrados em P2, P5 e P6. As diferenças entre os grupos ocorreram (P<0,05) somente nos períodos P2 e P3. 49 Para a proteína total plasmática (Tabela 6), o maior valor para os animais controles foi obtido em P3 (6,17 mg/ml), o qual diferiu significativamente (P<0,05) dos demais períodos. Entretanto, nos animais experimentais não foram notadas diferenças significativas (P>0,05) ao longo dos períodos de amostragem, apesar dos valores tenderem a aumentar em P3 e P5. Diferenças significativas (P<0,05) entre os grupos foram observadas nos períodos P1, P3 e P5. Como a interação entre os efeitos da alimentação e dos períodos (Tabela 5) foi não significativa (P>0,05) para a porcentagem de lipídio total do fígado, os resultados mostraram que houve diferença significativa (P<0,05) entre os grupos estudados (Tabela 6), sendo os menores valores encontrados nos animais experimentais (4,43%). Os períodos de amostragem também afetaram significativamente (P<0,05) a porcentagem de lipídio e o maior valor foi obtido em P0 (5,48%), o qual diferiu significativamente (P<0,05) somente de P5 (3,95%). Nos animais controles, os níveis de ácidos graxos livres plasmáticos (Tabela 6) não apresentaram diferenças significativas (P>0,05) ao longo dos períodos de amostragem. Nos experimentais, seus valores foram mais altos em P4 (0,72 µmol/ml), os quais diferiram significativamente (P<0,05) de P0, P1 e P6. Entre os grupos estudados foram observadas diferenças estatísticas (P<0,05) somente nos períodos P2, P3 e P4. Pode-se observar, pela Tabela 5, que não houve efeito significativo (P>0,05) da interação entre os fatores alimentação e períodos para os níveis de triiodotironina (T3). Entretanto, seus valores foram significativamente diferentes (P<0,05) entre os grupos controle e experimental (1,87 e 1,31 ng/ml, respectivamente), conforme apresentado na Tabela 6. Houve também, efeito significativo (P<0,05) dos períodos de amostragem sobre os níveis desse hormônio, sendo os valores mais altos encontrados em P6 (2,86 ng/ml), os quais diferiram estatisticamente dos demais períodos. 50 5.5. MORFOLOGIA E MORFOMETRIA DOS HEPATÓCITOS Através da análise morfológica do fígado do pacu (Figura 5 A) foi observada a presença de três lobos, revestidos por uma camada delgada de tecido conjuntivo. Os hepatócitos estavam dispostos em cordões intercalados por capilares sinusóides, que convergiam para uma veia hepática terminal; não formavam lóbulos; eram poligonais, com um ou dois núcleos centrais, nucléolo evidente e apresentavam ductos biliares. Além disso, foi encontrado um tecido pancreático exócrino (pâncreas intra-hepático) (Figura 5 B), envolvido por uma camada de tecido conjuntivo, separado das células hepáticas por sinusóides, contendo vasos sangüíneos, tanto no interior quanto periferia. Foi, também, evidenciada quantidade considerável de pigmentos de cor castanho (Figura 5 C) e de glicogênio. Após 30 dias de restrição alimentar verificou-se uma atrofia do fígado, com diminuição da área e volume do citoplasma e núcleo dos hepatócitos, uma desorganização dos cordões de células hepáticas, estreitamento dos capilares sinusóides e acúmulo de pigmentos castanhos. Após a realimentação, as alterações estruturais provocadas pela restrição alimentar foram revertidas. 51 FIGURA 5 – A – Fotografia do fígado do pacu (Piaractus mesopotamicus) juvenil. B – Fotomicrografia do fígado do pacu (Piaractus mesopotamicus), mostrando o pâncreas intra-hepático (p). Colora