UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU EFEITO DE DIFERENTES FONTES DE COBRE E ZINCO SOBRE O DESEMPENHO, SAÚDE, QUALIDADE DE CARNE E ÓSSEA DE FRANGOS DE CORTE CASSIO YUTTO OURA Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia como parte dos requisitos para obtenção do titulo de Mestre. Botucatu – SP Dezembro – 2020 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU EFEITO DE DIFERENTES FONTES DE COBRE E ZINCO SOBRE O DESEMPENHO, SAÚDE, QUALIDADE DE CARNE E ÓSSEA DE FRANGOS DE CORTE CASSIO YUTTO OURA Orientador: Prof. Dr. José Roberto Sartori Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia como parte dos requisitos para obtenção do titulo de Mestre. Botucatu – SP Dezembro – 2020 Palavras-chave: Avicultura; Hidroxicloretos; Hidroximinerais; Microminerais. Oura, Cassio Yutto. Efeito de diferentes fontes de cobre e zinco sobre o desempenho, saúde, qualidade de carne e óssea de frangos de corte / Cassio Yutto Oura. - Botucatu, 2020 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: José Roberto Sartori Capes: 50403001 1. Aves domésticas. 2. Frango de corte. 3. Carne - Qualidade. 4. Cobre - Efeito fisiológico. 5. Zinco - Efeito fisiológico. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. ii “Mera mudança não é crescimento. Crescimento é a síntese de mudança e continuidade, e onde não há continuidade não há crescimento.” C.S. Lewis iii DEDICATÓRIA Aos meus pais, Mary Akemi Doi Oura e Francisco Mistuo Oura Por todo apoio e confiança depositados, incentivando-me a ser melhor e ir além. AGRADECIMENTO ESPECIAL Ao meu orientador, Prof. Dr. José Roberto Sartori pela oportunidade de orientação, conhecimentos repassados e pela amizade gerada durante o tempo no qual trabalhamos juntos. Ao meu orientador da graduação, Prof. Dr. Carlo Rossi Del Carratore, por todo conhecimento, incentivo e amizade. Aos amigos e membros da equipe de trabalho: Priscila G.M Urayama, Tatiane S. dos Santos, Jéssica M. Cruvinel, Fernanda K.L. Krenchinski, Julianna S. Batistioli, Robert G. A. Cardoso, Connie Gallardo Vela, Érica S. Mello e todos os membros LABAVES a qual tive o privilégio temporário de conhecer. Agradeço imensamente por todo companheirismo e amizade, por sempre disporem a me ajudar. A todos os meus familiares e amigos, em especial minha namorada Bruna Lindolfo da Silva, pelo companheirismo e partilha nessa jornada que traçamos juntos, com amor e carinho. A todos, os meus mais sinceros agradecimentos. iv AGRADECIMENTOS Ao Programa de Pós-Graduação em Zootecnia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP/Botucatu, pela oportunidade e suporte para a obtenção do título de mestre. A empresa Trouw Nutrition pela parceria e financiamento do projeto. Aos professores do programa de pós-graduação José Roberto Sartori, Margarida Maria Barros, Antônio Celso Pezzato, Luíz Edivaldo Pezzato, Ricardo de Oliveira Orsi, Pedro Magalhães Padilha e Carlos Roberto Padovani pelo conhecimento passado e auxilio durante meu mestrado. Aos professores e funcionários do Departamento de Melhoramento e Nutrição Animal da FMVZ/UNESP/Botucatu pelo acolhimento e ajuda oferecida. Ao professor Dr. Pedro de Magalhães Padilha e ao pós - doutorando José C. S. Vieira, pela colaboração neste projeto. Aos estagiarios Gustavo de Martino Barbosa, Laura Granero, Mariana Poletto, Vitor Coiado Fittipaldi, por toda colaboração e amizade. Aos pesquisadores do laboratório de qualidade de carne Evelyn P. Brito, Iasmin M. S. C. Farias, Caroline T. Santos, por toda a ajuda e amizade. Aos pesquisadores do laboratório AQUANUTRI – Pedro P. F Carvalho, Igor S. T. Vicente, William S. Xavier, Matheus G. Guimarães e Edgar J. D. Rodrigues, por toda ajuda e amizade. Aos Funcionários da Supervisão de Fazendas de Ensino, Pesquisa e Produção da FMVZ/UNESP/Botucatu e da Fábrica de Rações pela amizade e serviços prestados. Aos Funcionários da Seção de Pós-Graduação da FMVZ/UNESP/Botucatu. Ao grupo LABAVES, meus irmãos de vida, pela união em cada caminhada nesses dois anos de mestrado. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Muito obrigado! v BIOGRAFIA Cassio Yutto Oura nasceu na cidade de Lucélia, Estado de São Paulo, no dia 25 de março de 1996. Ingressou na Universidade de Marília (UNIMAR) graduando-se em Medicina Veterinária em junho de 2018. Em agosto do mesmo ano, ingressou no Programa de Pós- Graduação em Zootecnia – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ – UNESP Botucatu/SP) no curso de Mestrado Acadêmico, área de Nutrição e Produção Animal, com foco em Nutrição de Frangos de Corte, atuando nos seguintes temas: nutrição mineral de frangos de corte, nutrição de poedeiras, qualidade de ovos e de carne de frangos de corte. vi LISTA DE TABELAS TABELA 1. Ingredientes (%) e composição nutricional das dietas basais. ................... 19 TABELA 2. Composição dos tratamentos experimentais. ............................................ 19 TABELA 3. Níveis analisados de Cu e Zn nas dietas experimentais. ........................... 20 TABELA 4. Desempenho de frangos de corte de 1 a 21 dias de idade. ........................ 26 TABELA 5. Desempenho de frangos de corte de 1 a 35 dias de idade. ........................ 27 TABELA 6. Desempenho de frangos de corte de 1 a 42 dias de idade. ........................ 28 Tabela 7. Rendimento de carcaça, rendimento de partes e peso de órgãos de frangos de corte aos 42 dias de idade. ........................................................................................... 29 TABELA 8. Histomorfometria intestinal de frangos aos 42 dias de idade. ................... 30 TABELA 9. Diferencial de leucócitos em frangos de corte aos 21 e 42 dias de idade... 32 TABELA 10. Qualidade óssea da tíbia de frangos aos 42 dias de idade. ...................... 33 TABELA 11. Resistência de pele antes e após o processo de escaldagem. ................... 34 TABELA 12. Scores de lesões de coxim plantar, jarrete e qualidade de cama de frangos em diferentes idades. ................................................................................................... 35 TABELA 13. Qualidade de carne de frangos aos 42 dias de idade. .............................. 37 TABELA 14. Concentração de Cu e Zn no fígado de frangos aos 42 dias de idade. ..... 38 TABELA 15. Concentração de Cu e Zn no plasma de frangos aos 21 e 42 dias de idade. .................................................................................................................................... 39 TABELA 16. Concentração de Cu e Zn na tíbia de frangos de corte aos 42 dias. ......... 41 vii Sumário CAPÍTULO I ...............................................................................................................2 CONSIDERAÇÕES INICIAIS ...................................................................................2 1. Introdução ..........................................................................................................2 2. Fontes de suplementação mineral ........................................................................3 3. Cobre: absorção e funções ..................................................................................4 4. Zinco: absorção e funções ...................................................................................6 5. Interação entre os minerais..................................................................................7 6. Justificativa e objetivo ........................................................................................8 7. Referências .........................................................................................................9 CAPÍTULO II ........................................................................................................... 13 Efeito de diferentes fontes de cobre e zinco sobre o desempenho, saúde e deposição mineral em tecidos de frangos de corte..................................................................... 15 Effect of different sources of copper and zinc on the performance, health and tissues mineral deposition of broiler chickens ...................................................................... 16 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 17 2. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 18 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 26 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 43 5. IMPLICAÇÕES ............................................................................................ 49 CAPÍTULO I CONSIDERAÇÕES INICIAIS 2 1. Introdução A busca pelo aumento da produção de alimentos principalmente aliada a melhorias em ganhos de produtividade de forma sustentável, é uma realidade do setor agropecuário mundial, levando-se em conta a estimativa de 9,8 bilhões de habitantes no mundo no ano de 2050 (FAO, 2017). A avicultura nacional possui grande importância no cenário mundial, visto que grandes quantidades de grãos são utilizados na alimentação das aves, o Brasil ocupa hoje a posição de maior exportador e terceiro maior produtor de carne de frango mundial (ABPA, 2020). Para atingir tais níveis de produção, a avicultura nacional e mundial tem se modificado constantemente para se adaptar e atender a maior demanda de alimentos. A evolução da avicultura industrial gerou mudanças nas composições nutricionais das aves, principalmente pelo contínuo avanço genético (PETROVIK et al., 2010) e fatores de criação que desafiam o desenvolvimento e saúde das mesmas (PETEK et al., 2010). A busca por minerais com maior biodisponibilidade incentivou a pesquisa por novas fontes que propiciem melhor aporte para atender a expressão genética das linhagens e causar menor impacto ambiental. Os microminerais possuem grande influência na manutenção do crescimento e saúde das aves. Como exemplos da atual pesquisa, o cobre (Cu) possui grande participação no sistema enzimático, sendo essencial para o bom funcionamento da fisiologia animal (DAVIS; MERTZ, 1987); e o zinco (Zn), é componente de mais de 200 metaloenzimas (PRASAD, 1984). Além dos sistemas enzimáticos, estes minerais também estão envolvidos no metabolismo hormonal e atividade imunológica das aves (DIECK et al., 2003). De acordo com as mudanças de mercado, diminuição ou proibição ao uso de antibióticos promotores de crescimento, exige a necessidade de alternativas seguras para a substituição dos mesmos (OWENS et al., 2008). Isto, juntamente com as características benéficas dos minerais, faz com que os nutricionistas utilizem valores de microminerais acima do recomendado para atender as necessidades fisiológicas e melhorar o desempenho das aves. Porém, as fontes convencionais utilizadas possuem baixa biodisponibilidade e alta capacidade de interações adversas com nutrientes da dieta, aumentando assim sua excreção para o ambiente (LEESON, 2008). Dentre as fontes alternativas estão os minerais orgânicos que têm sido estudados frente à estas implicações técnicas, apresentando resultados pertinentes, porém com variações quanto a sua composição e qualidade de seus ligantes, que podem proporcionar 3 interferências na absorção e resposta destes elementos (RUTZ; MURPHY, 2009). Os hidroxicloretos consistem em nova alternativa de suplementação de minerais- traços; sendo descobertos em 1990, possuem características de interesse dos nutricionistas, tais como a alta biodisponibilidade e consequente menor excreção ao ambiente (AGAPITO; SEYBOTH, 2017). Propriedades estas expressas por sua estrutura tridimensional cristalina que possui grande estabilidade no trato gastrointestinal, principalmente pela maior força de ligação química (COHEN; STEWARD, 2012). Desse modo, os hidroxicloretos consistem em alternativa promissora para a suplementação de microminerais, em especial Cu e Zn, porém é necessário uma avaliação mais aprofundada para se determinar a melhor combinação quantitativa entre os minerais e avaliar os efeitos dos mesmos, frente a um desafio entérico e sua possível ação em altas doses como melhorador de desempenho. 2. Fontes de suplementação mineral A suplementação mineral ocorre tradicionalmente através do uso de fontes inorgânicas, tais como sulfatos, cloretos, carbonatos e óxidos. Estes, são quebrados no trato digestivo formando os íons livres de alto poder de interação, que podem formar complexos com nutrientes da dieta, dificultando ou inativando a absorção dos mesmos (CLOSE; LYONS; JACQUES, 1998). Interações negativas entre minerais e componentes da dieta sempre foram motivo de preocupação, sendo relatada a complexação entre o ácido fítico dos alimentos e os minerais traços, tais como o cobre (Cu) e zinco (Zn), resultando em redução da biodisponibilidade destes elementos para os animais (AGAPITO; SEYBOTH, 2017). Os minerais orgânicos possuem maior biodisponibilidade por possuírem fortes ligações químicas com agentes quelantes, geralmente aminoácidos, que lhes conferem maior estabilidade e menor interação com nutrientes da dieta (RICHARDS; DIBNER, 2005). Estudos relataram maior biodisponibilidade de Cu e Zn orgânicos quando comparados às fontes convencionais, proporcionando menor excreção, melhor desempenho e maiores concentrações destes nos tecidos das aves (DOZIER et al., 2003). Os hidroxicloretos são sais neutros inertes e insolúveis em água, apresentam superioridade aos minerais tradicionais (sulfatos) por não promoverem a oxidação de rações e por conferirem maior estabilidade mineral por suas ligações equivalentes aos minerais orgânicos, podendo serem empregados em altos níveis, exercendo papel de 4 promotores de crescimento em dietas animais (AGAPITO; SEYBOTH, 2017). Essas ligações covalentes com o metal são fortes o suficiente para limitar as interações indesejadas, mas fracas o suficiente para liberar prontamente o metal para os receptores de membrana do organismo, melhorando sua absorção (COHEN e STEWARD, 2012). 3. Cobre: absorção e funções A absorção do cobre (Cu) ocorre predominantemente no duodeno das aves, podendo acontecer no proventrículo. O Cu pode ser absorvido por dois mecanismos conforme sua concentração: difusão simples (altas concentrações) e transporte ativo (baixas concentrações) (MASSUQUETTO; MARIORKA; MACARI, 2017). O transporte do Cu para dentro dos enterócitos pode ocorrer a partir uma ou mais proteínas transportadoras, à especifica cooper transporter1 (CTR1) e a divalent metal transporter 1 (DMT-1) cujo o mineral possui menor afinidade, devido sua principal função ser a absorção do ferro (KIM et al., 2008). A regulação da absorção do Cu parece ser regulada pela metalotioneina, sugerindo a existência de um sítio intestinal de interação entre os minerais Cu e Zn (MASSUQUETTO; MARIORKA; MACARI, 2017). O Cu é liberado das células intestinais por transporte ativo mediado por ATPases ou por CTR1 na membrana basolateral, indo para a circulação portal onde é transportado até o fígado ligado principalmente à albumina e a transcuprina (NEDERBRAGT et al., 1984). No hepatócito o mineral é transportado para o aparelho de Golgi onde é incorporado a ceruloplasmina (ROSA; MATTIOLI, 2002). A ceruloplasmina é responsável por carrear o Cu no sistema circulatório e sua composição baseia-se em uma globulina capaz de ligar até seis moléculas de Cu; esta contém cerca de 90% deste mineral presente no sistema circulatório animal (UNDERWOOD; SUTTLE, 1999). Sendo essa uma proteína de fase aguda que protege as células contra lesões induzidas pelo estresse oxidativo (ACETOZE et al., 2016). O Cu é considerado um mineral essencial para o metabolismo adequado do ferro e a hematopoiese (MCDOWELL, 2003), o crescimento e maturação óssea, dentre outras funções fisiológicas importantes (POND et al., 1995), atuando na produção de melanina e queratina, no sistema imune e na redução da gravidade dos processos inflamatórios (OGNIK et al., 2017). Sendo considerado um antioxidante, o Cu está envolvido na atividade do ferro e 5 da superóxido dismutase (SOD), enzima dependente de Cu e Zn (UNDERWOOD; SUTTLE, 1999) e exerce papel nas cobre-toxinas intracelulares, enzimas da defesa antioxidante (MCDOWELL, 2003). O Cu também desempenha papel fundamental na enzima lisil-oxidase (LO), sendo essa uma amina oxidase cobre dependente. A LO atua na formação de matrizes de tecido conjuntivo, por ligações cruzadas de colágeno e elastina (SMITH-MUNGO; KAGAN, 1998). A resistência da pele é altamente correlacionada com o colágeno presente em sua composição, sendo o Cu um nutriente que pode influenciar a suscetibilidade de lesões do órgão, visto que, deficiências deste mineral acarretaram em menores concentrações de colágeno (LEESON; SUMMERS, 2005). O Cu é cofator da enzima citocromo-C oxidase (SUTTLE, 2010; YANG et al., 2017), uma enzima importante no processo respiratório celular, responsável por gerar energia a todos os tecidos animais pela transferência de elétrons (SUTTLE, 2010). O requerimento segundo NRC (1994) de Cu para frangos de corte é de 8 ppm. Já Rostagno et al. (2017) citaram concentrações que variam de 11,68 a 6,08 pmm de acordo com as fases de criação. Na cadeia de produção avícola, 125 a 250 ppm de Cu de sulfato penta-hidrato são normalmente utilizados como promotores de crescimento (PESTI; BAKALLI, 1996). O Cu foi tradicionalmente empregado como antimicrobiano promotor de crescimento por anos (ALDINGER, 1967). Dentre os mecanismos que explicam o efeito antimicrobiano do Cu, foi proposto que os íons liberados pelo mineral induzem danos às membranas bacterianas gerando a perda do potencial de membrana e do conteúdo citoplasmático (PARRA et al., 2018), de modo a ocorrer o influxo de íons de Cu no interior da célula com posterior dano oxidativo aos constituintes celulares e degradação do DNA (LUO et al., 2017). Visto as funções do Cu e seus mecanismos de ação, atualmente o mineral se tornou alternativa interessante aos antibióticos promotores de crescimento (APC). Kim et al. (2011) encontraram resultados promissores, uma vez que suplementaram 100 ppm de Cu orgânico e obtiveram melhorias de desempenho equivalentes a suplementação de Avilamicina, destacando o Cu como possível substituto aos APC e relatando a melhoria na qualidade microbiológica do trato de frangos suplementados com o mineral. Outros autores ainda concluíram que frangos suplementados com hidroxicloreto de Cu e Zn obtiveram maior desempenho e designaram o resultado encontrado à possível maior biodisponibilidade da fonte (MILES et al., 1998; BATAL et al., 2001). Do mesmo modo, 6 a suplementação de Cu ao nível de 125 ppm, proporcionou melhor desempenho e CA das aves (BAKER et al., 1991; PAIK, 2001). Porém, há relatos de que altas dosagens de Cu acima de 250 ppm na dieta, geralmente deprimem o desempenho das aves (JENSEN; MAURICE, 1979; CHRISTMAS; HARMS, 1984; ZHAO et al., 2016), podendo provocar lesões de moela (FISHER et al. 1973), efeitos que são tradicionalmente atribuídos a toxicidade do mineral (LEDOUX et al., 1986). Altas inclusões de Cu também podem interferir na fermentação normal do ceco das aves (JENSEN; MAURICE, 1979). 4. Zinco: absorção e funções O processo de absorção do zinco (Zn) ocorre predominantemente no intestino delgado, sendo sua transferência para as células da mucosa auxiliada pela metalotioneína, proteína produzida no fígado com síntese influenciada por níveis dietéticos e plasmáticos do mineral (MCDOWELL, 1992). As dietas vegetais possuem alta quantidade de fitato e este possui efeito inibitório sobre o metabolismo do Zn em frangos de corte (BAFUNDO et al., 1984). Esta inibição é comumente observada em dietas que utilizam minerais com fracas ligações, pela exacerbada formação de quelatos com o fitato. Após absorção o Zn é depositado principalmente nos tecidos muscular e ósseo, sendo armazenado e liberado em possíveis situações de deficiência do mineral (UNDERWOOD; SUTTLE, 1999). Liao et al. (2013), relataram que as concentrações de Zn no osso da tíbia, consistem em um sensível indicador para a exigência do mineral em frangos de corte. O fígado compõe-se como principal órgão do metabolismo de nutrientes, sendo que a deposição de Zn no fígado aumenta concomitantemente com o aumento do mineral na dieta (MIN et al., 2019). O Zn é considerado um oligoelemento essencial para aves, sendo cofator de mais de 200 metaloenzimas (PRASAD, 1984). O mineral faz parte da síntese de proteínas, do metabolismo de carboidratos, do metabolismo energético e de outras reações bioquímicas. Atua na síntese de DNA e RNA, crescimento e reparo de tecidos, mineralização óssea e coagulação sanguínea (SALIM et al., 2008). Sendo considerado importante na recuperação de danos causados por doenças entéricas (MACDONALD, 2000). Este mineral também participa como cofator constituinte das enzimas superóxido- 7 dismutase (SOD) e anidrase carbônica (AC), sendo a última encontrada na mucosa intestinal, eritrócitos, túbulos renais e epitélio glandular (SILVA; PASQUAL, 2014). Min et al. (2019) concluíram que o aumento de Zn melhorou a atividade da AC, promovendo maior deposição de carbonato de cálcio e consequente, melhor qualidade da tíbia. De acordo com Iqbal et al. (2002), ocorreu a superprodução de peróxido de hidrogênio em pulmões de frangos de corte acometidos com hipertensão pulmonar, com consequente maior atividade da glutationa peroxidase. Indicando a maior necessidade da enzima SOD, responsável por converter radicais de oxigênio em peróxido de hidrogênio, molécula menos tóxica ao organismo, que é posteriormente convertida em água pela ação da glutationa peroxidase (RICHARDS et al., 2010). O colágeno e a queratina são proteínas estruturais fundamentais, sendo o Zn essencial para a síntese das mesmas (UNDERWOOD; SUTTLE, 1999). A deficiência deste mineral reflete em diminuição da síntese de colágeno e queratina, que pode ocasionar baixa resistência tecidual, dermatites e anormalidades ósseas (LEESON; SUMMERS, 2001). O Zn possui funções importantes na atuação do sistema imunológico e sua deficiência pode ocasionar a redução da função de células T, menores títulos de anticorpos e consequente diminuição da função imunológica dos animais (RICHARDS et al., 2010). A exigência de Zn de frangos segundo o National Research Council é acima de 40 ppm para dietas compostas de milho e farelo de soja (NRC, 1994). Rostagno et al. (2017) citaram exigências que variam de 76,15 a 39,67 ppm de acordo com as fases de criações. 5. Interação entre os minerais O estudo dos minerais em animais possui grande complexidade, visto que os mesmos possuem inúmeras interações, podendo estas serem sinérgicas ou antagônicas (Georgievskii, 1982). Vários fatores podem influenciar a absorção dos minerais no sistema gastrointestinal, podendo esta ser interferida pela reação dos minerais com compostos da dieta ou pela competição de sitios de absorção gerando interações antagonicas entre os mesmos (HERRICK, 1993). Sabe-se da interação e possível antagonismo entre os microminerais bivalentes cobre (Cu) e zinco (Zn) (MASSUQUETTO; MARIORKA; MACARI, 2017). De forma que, minerais quais 8 possuem caracteristicas semelhantes além de interagirem no lumen intestinal podem possuir interações dentro das celulas na absorção ou transporte aos tecidos (COZZOLINO et al., 1997). Logo na absorção podemos observar que o Cu e o Zn compartilham os mesmos transportadores de membrana DMSB+APC e CTR1, sendo a absorção destes regulada pela metalotioneína (MASSUQUETTO; MARIORKA; MACARI, 2017). Já no sistema antioxidante, o Cu e o Zn atuam em conjunto na enzima superóxido dismutase, onde o Cu facilita a dismutação do radical livre superóxido e o Zn estabiliza a molécula (Suttle, 2010). 6. Justificativa e objetivo A avicultura industrial passa por mudanças constantes, sendo os nutricionistas responsáveis por modular a dieta para que os animais possam expressar o seu potencial genético, frente aos desafios de produção. Sabe-se da ocorrência da suplementação de microminerais em níveis acima do recomendado, principalmente em forma de sulfato. Porém, essa estratégia acaba onerando os custos de produção e estes minerais são lixiviados ao solo junto às fezes, devido à baixa biodisponibilidade da fonte tradicional. Além da poluição ambiental ocasionada por altos níveis de excreção, estes microminerais são provenientes de fontes finitas e por isso há a necessidade do estudo de fontes alternativas. Os hidroximinerais constituem-se em nova fonte inorgânica de suplementação de minerais traços, em especial cobre (Cu) e zinco (Zn). Sabe-se da maior biodisponibilidade desta fonte perante as tradicionais, característica esta provinda das fortes ligações covalentes que os hidroximinerais possuem. Contudo, por ser uma fonte recente, há carência de informações referentes aos níveis dietéticos e ação destes minerais nos frangos em sistemas de criações atuais. Em função do exposto, o presente estudo tem como objetivo avaliar os hidroxicloretos de Cu e Zn em substituição às fontes convencionais sulfatos e ao antibiótico promotor de crescimento, observando seus efeitos no desempenho zootécnico, características de carcaça, parâmetros imunológicos, qualidade de carne, óssea e de pele, incidência de pododermatites, qualidade de cama e deposição dos minerais em tecidos. O Capítulo II, denominado “Efeito de diferentes fontes de cobre e zinco sobre o desempenho, saúde e deposição mineral em tecidos de frangos de corte”, apresenta- se de acordo com as normas para publicação na Poultry Science. 9 7. Referências ABPA (Associação Brasileira de Proteína Animal). Mercado Mundial de Carne de Frango. Relatório Anual, 2020. Disponível em: Acesso em: 25 de maio de 2020. ACETOZE, G.; KURZBARD, R.; FLASING, K.C.; RAMSEY, J.J.; ROSSOW, H.A. 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CAPÍTULO II 15 Efeito de diferentes fontes de cobre e zinco sobre o desempenho, saúde e deposição mineral em tecidos de frangos de corte Resumo: O estudo foi realizado com o objetivo de avaliar a fonte mineral hidroxicloreto de cobre (Cu) e zinco (Zn) em comparação a fonte tradicional sulfato e sua possível ação como substituto ao antibiótico promotor de crescimento (APC) para frangos de corte. Foram analisados parâmetros de desempenho, saúde e deposição dos minerais em tecidos, além de qualidade de carne, pele, óssea e de cama das aves. Para o experimento foram alojados 2.100 pintos de corte machos da linhagem Cobb®500 com um dia de idade, distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado, constituído de 5 tratamentos com 14 repetições cada. As dietas foram formuladas à base de milho e farelo de soja, de acordo com a recomendação de cada fase (pré-inicial, inicial, crescimento e final). Os tratamentos consistiram em variações de concentração e fonte Cu e níveis fixos de Zn, alterando apenas a fonte. Dois tratamentos Cu e Zn sulfatos, um de baixa concentração de Cu (SB) com adição de antibiótico promotor de crescimento (APC) e outro com alta concentração de Cu (SA). Somados a três tratamentos com Cu e Zn hidroxicloreto, sendo um com inclusão de Cu idêntica ao sulfato alta dose (HCA) e outros dois tratamentos com maiores inclusões, considerados superdose (HCS) e hiperdose (HCH), que variavam de acordo com a fase do animal. Os dados foram submetidos ao teste normalidade e homogeneidade, seguido da análise de variância pelo Minitab® 2018, sendo as médias significativas (P<0,05) comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. A fonte hidroxicloreto se mostrou superior à fonte convencional sulfato, atuando como possível substituto do APC, sendo os níveis de 125 ppm de Cu e 80 ppm de Zn os mais indicados. Estas concentrações proporcionaram uma melhor saúde aos animais, auxiliando os mesmos a superarem o desafio empregado e alcançarem o desempenho equivalente ao tratamento com adicção de APC, não prejudicando os parâmetros de qualidade avaliados no experimento. Palavras-chaves: hidroximinerais, hidroxicloretos, microminerais, avicultura. 16 Effect of different sources of copper and zinc on the performance, health and tissues mineral deposition of broiler chickens Abstract: The study was carried out to evaluate the mineral source hydroxychloride of copper (Cu) and zinc (Zn) in comparison to the traditional source of sulfate and its possible action as a substitute for antibiotic growth promoter (APC) for broilers. Parameters of performance, health, and deposition of minerals in tissues were analyzed, as well as the quality of meat, skin, bone, and poultry litter. For the experiment, 2,100 male day-old Cobb®500 broiler chicks were housed, distributed in a completely randomized design, consisting of 5 treatments with 14 repetitions each. The diets were formulated based on corn and soybean meal, according to the recommendation of each phase (pre-initial, initial, growth, and final). The treatments consisted of variations in concentration and source Cu and fixed levels of Zn, changing only the source. Two treatments Cu and Zn sulfates, one with a low concentration of Cu (SB) with the addition of antibiotic growth promoter (APC) and the other with a high concentration of Cu (SA). Added to three treatments with Cu and Zn hydroxychloride, one with the inclusion of Cu identical to high dose sulfate (HCA) and two other treatments with greater inclusions, considered overdose (HCS) and hyperdose (HCH), which varied according to the phase of the animal. The data were subjected to the normality and homogeneity test, followed by the analysis of variance by Minitab® 2018, with significant means (P<0.05) compared by the Tukey test at 5% probability. The hydroxychloride source proved to be superior to the conventional sulfate source, acting as a possible substitute for APC, with the levels of 125 ppm Cu and 80 ppm Zn being the most suitable. These concentrations provided better health to the animals, helping them to overcome the challenge employed and achieve the performance equivalent to the treatment with the addition of APC, without harming the quality parameters evaluated in the experiment. Keywords: hydroximinerals, hydroxychlorides, micro minerals, poultry. 17 1. INTRODUÇÃO A avicultura industrial evolui constantemente, sendo os nutricionistas responsáveis por modular a dieta para que os animais possam expressar o seu máximo potencial genético, frente aos desafios de produção (Penz Junior, 2019). Dentre os nutrientes que compõem a dieta de frangos de corte, estão os microminerais cujos níveis e fontes utilizados nas dietas possuem grande influência na manutenção da saúde e crescimento das aves. O zinco (Zn) é componente de mais de 200 metaloenzimas (Prassad, 1984) e o cobre (Cu) possui grande participação no sistema enzimático, sendo essencial para o bom funcionamento da fisiologia animal (Davis e Mertz, 1987). Além dos sistemas enzimáticos, estes minerais também estão envolvidos no metabolismo hormonal e atividade imunológica (Dieck et al., 2003). De acordo com as mudanças de mercado e diminuição ou proibição ao uso de antibióticos promotores de crescimento, existe a necessidade de alternativas seguras para a substituição dos mesmos (Owens et al., 2008). Visto isso, nutricionistas utilizam valores de microminerais acima do recomendado para atender as necessidades fisiológicas e melhorar o desempenho dos animais. Porém, as fontes convencionais utilizadas são de baixa biodisponibilidade e alta capacidade de interações adversas com outros nutrientes da dieta, aumentando assim sua excreção para o ambiente (Leeson, 2008). Os hidroxicloretos descobertos em 1990, consistem em nova fonte para a suplementação de microminerais, sendo que possuem como característica a alta biodisponibilidade e consequente menor excreção ao ambiente (Agapito e Seyboth, 2017). Propriedades expressas por sua estrutura tridimensional cristalina formada por ligações covalentes que garantem a maior estabilidade no trato gastrointestinal (Cohen e Steward, 2014). Desse modo, os hidroxicloretos consistem em alternativa promissora para a suplementação de microminerais, em especial Cu e Zn, sendo necessários estudos para elucidar os efeitos da utilização quantitativa desses elementos na nutrição, saúde e desempenho de frangos de corte. 18 2. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi conduzido na Universidade Estadual Paulista (UNESP), Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, no Laboratório de Nutrição de Aves (LabAves). Os procedimentos experimentais foram submetidos e aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Campus de Botucatu (0252/2018 – CEUA), estando de acordo com os princípios éticos na experimentação animal adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). Ensaio Foram alojados 2.100 pintainhos machos de um dia de idade da linhagem Cobb 500® provenientes de um lote padrão de matrizes, vacinados no incubatório contra as doenças de Marek e Gumboro. As aves foram distribuídas em um delineamento inteiramente casualizado (DIC) com 5 tratamentos e 14 repetições, de 30 aves por unidade experimental. Cada unidade experimental com 2,0 m2, dotadas de cama de maravalha com 10 cm de espessura, um comedouro tubular e bebedouros tipo niple. As dietas (Tabela 1) foram formuladas de acordo com as exigências de cada fase: pré-inicial (PI: 1-7 dias), inicial (I: 8-21 dias), crescimento (C: 22-35 dias) e final (F: 36- 42 dias), à base de milho e farelo de soja de acordo com a recomendações de Rostagno et al. (2011). Os fornecimentos de água e ração ocorreram de forma ad libitum. Os tratamentos consistiram em variações de concentração e fonte Cu e níveis fixos de Zn, alterando apenas a fonte. Sendo dois tratamentos Cu e Zn sulfatos, um de baixa concentração de Cu (SB) seguindo a recomendação de Rostagno et al. (2011) com a adição de antibiótico promotor de crescimento (APC) para mimetizar dietas comerciais, e outro com alta concentração de Cu (SA) buscando o efeito melhorador de desempenho com a fonte sulfato. E outros três tratamentos com Cu e Zn hidroxicloreto para comparar com as fontes convencionais e avaliar a sua possivel utilização como substituto ao APC, sendo um tratamento com inclusão de Cu idêntica ao sulfato alta dose (HCA) e outros dois tratamentos com maiores inclusões, considerados superdose (HCS) e hiperdose (HCH), que variavam de acordo com a fase do animal (Tabela 2). 19 TABELA 1. Ingredientes (%) e composição nutricional das dietas basais. Ingredientes (%) Pré-inicial Inicial Crescimento Final Milho, grão, 8% 59,01 61,54 64,40 68,75 Soja, farelo, 46% 36,64 33,81 30,31 26,48 Soja, óleo bruto 0,50 1,32 2,31 2,21 Fosfato bicálcico 1,22 0,87 0,64 0,41 Calcário calcítico* 0,96 0,99 0,95 0,88 Sal comum 0,52 0,48 0,46 0,44 DL-Metionina, 99% 0,340 0,290 0,270 0,250 L-Lisina, 99% 0,320 0,270 0,270 0,300 Suplemento vitamínico e mineral¹ 0,200 0,180 0,160 0,120 L-Treonina, 98,5% 0,120 0,090 0,080 0,080 Cloreto de Colina, 60% 0,070 0,060 0,060 0,040 Fitase 500 FTU 0,005 0,005 0,005 0,005 Composição Nutricional Energia metabolizável, kcal/kg 2.964 3.050 3.149 3.199 Proteína bruta, % 22,40 21,20 19,80 18,40 Cálcio, % 0,92 0,84 0,76 0,66 Fósforo total, % 0,71 0,63 0,57 0,52 Fósforo disponível, % 0,47 0,40 0,35 0,31 Lisina, % 1,32 1,21 1,13 1,06 Metionina, % 0,66 0,60 0,56 0,53 Metionina+cistina, % 0,95 0,88 0,83 0,77 Treonina, % 0,86 0,79 0,73 0,69 ¹Pré-mistura vitaminico mineral suplementados por kg de dieta: vitamina A, 13.500 UI; vitamina D3, 3.750 UI; vitamina E, 30 UI; vitamina K3, 3,75 mg; vitamina B1, 3 mg; vitamina B2, 9 mg; ácido pantotênico, 18 mg; vitamina B6, 4,5 mg; vitamina, B12 22,5 μg; niacina, 52,5 mg; ácido fólico, 2,25 mg; Biotina, 0,15 mg; Se, 0,375 mg; Fe, 50 mg; Co, 1 mg; I, 1 mg, ² Energia metabolizável aparente. *Os níveis e fontes de suplementação de Cu e Zn foram incluídos na dieta basal por meio da substituição do calcário e adição de inerte. TABELA 2. Composição dos tratamentos experimentais. TRAT¹ APC² Cu Sulfato Zn Sulfato Cu Hidroxicloreto Zn Hidroxicloreto (ppm) SB+APC + 10 80 SA - 125 80 HCA - 125 80 HCS - 200-150-125-125 80 HCH - 250-200-125-125 80 ¹Tratamentos: SB+APC = 10 ppm de sulfato (SF) de Cu + 80 ppm de SF de Zn + avilamicina em todas as etapas da criação; SA = 125 ppm de SF de Cu + 80 ppm de SF de Zn em todas as etapas da criação; HCA = 125 ppm Cu hidroxicloreto (HC) + 80 ppm Zn HC em todas as etapas da criação; HCS = 200, 150, 125 e 125ppm Cu HC nas fases de criação pré-inicial (PI), inicial (I), crescimento (C) e final (F), respectivamente, + 80 ppm de Zn HC em todas as fases da criação ; HCH = 250, 200, 125 e 125ppm Cu HC nas fases PI, I, C, F, respectivamente + 80 ppm Zn HC todas as fases de criação.²APC: 50 ppm de antibiotico promotor de crescimento Avilamicina. 20 Os valores analisados da quantificação mineral na dieta são representados na Tabela 3. TABELA 3. Níveis analisados de Cu e Zn nas dietas experimentais. TRAT¹ APC Cu Sulfato Zn Sulfato Cu Hidroxicloreto Zn Hidroxicloreto (ppm) SB+APC + 22 85 SA - 109 87 HCA - 125 98 HCS - 193-156-126-127 108 HCH - 247-186-143-117 98 ¹Tratamentos: SB+APC = 10 ppm de sulfato (SF) de Cu + 80 ppm de SF de Zn + avilamicina em todas as etapas da criação; SA = 125 ppm de SF de Cu + 80 ppm de SF de Zn em todas as etapas da criação; HCA = 125 ppm Cu hidroxicloreto (HC) + 80 ppm Zn HC em todas as etapas da criação; HCS = 200, 150, 125 e 125ppm Cu HC nas fases de criação pré-inicial (PI), inicial (I), crescimento (C) e final (F), respectivamente, + 80 ppm de Zn HC em todas as fases da criação ; HCH = 250, 200, 125 e 125ppm Cu HC nas fases PI, I, C, F, respectivamente + 80 ppm Zn HC todas as fases de criação. Ao alojamento foi administrada a vacina de coccidiose em dose dez vezes maior que a dose comercial para todas as aves do experimento, visando um desafio à saúde intestinal. Desempenho Para obtenção do peso corporal todas as aves de cada unidade experimental foram pesadas aos dias 1, 21, 35 e 42 dias. O ganho de peso foi calculado em períodos acumulados, por meio da diferença entre o peso das aves no início e final de cada período. O consumo de ração foi determinado através da diferença entre a quantidade de ração fornecida ao início e as sobras existentes no final de cada período e o resultado obtido foi dividido pelo número médio de aves de cada unidade experimental no período, ou seja, corrigido pela mortalidade das aves. Conversão alimentar: a conversão alimentar foi calculada dividindo-se o peso total da ração consumida pelas aves da unidade experimental, expressa em quilogramas, pelo peso total das aves no mesmo período também expresso em quilogramas, corrigido pelo peso das aves mortas no período. Viabilidade: as mortalidades, bem como o peso das aves mortas, foram registradas diariamente, e a partir desses dados foi calculada a viabilidade (percentual de aves vivas ao final de cada período em relação ao número inicial de aves alojadas). Índice de eficiência produtiva (IEP): Para a obtenção do IEP foi utilizado a seguinte fórmula aos 42 dias de idade: 21 𝐼𝐸𝑃 = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑣𝑖𝑣𝑜 (𝑘𝑔)𝑥 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 (%) (𝐼𝑑𝑎𝑑𝑒 (𝑑𝑖𝑎𝑠)𝑥 𝐶𝑜𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠ã𝑜 𝑎𝑙𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑟) 𝑥 100 Análises de sangue e tecidos Foram utilizadas duas aves de cada unidade experimental selecionadas aleatoriamente para a análises de sangue aos 21 e 42 dias de idade. Foram coletados 4 mL de sangue via punção da veia jugular direita de cada ave, com seringas estéreis e auxílio de tubo contendo o anticoagulante ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA). Separou- se um mL de sangue in natura para a análise de contagem diferencial de leucócitos. Posteriormente os tubos foram centrifugados para a obtenção do plasma sanguíneo e congelados a -20 C° para a análise de concentração plasmática de Cu e Zn. Uma ave de cada unidade experimental aos 42 dias foi eutanasiada por deslocamento cervical para a coleta de pernas, as quais foram previamente descarnadas e identificadas, sendo armazenadas a -20°C para posteriores análises de índice de Seedor, resistência óssea, teor de cinzas e concentração mineral. Dessas aves foram coletadas amostras de pele (5cm²) da sobrecoxa esquerda, para futura avaliação da resistência e elasticidade de pele. Os fígados foram coletados concomitantemente, sendo que os lóbulos esquerdos foram armazenados em tubos falcon de 50 mL identificados e congelados a -20°C até seu uso na análise de concentração mineral. Ainda, dessas mesmas aves eutanasiadas, foram coletados segmentos de 2,0 cm do duodeno e jejuno, destinados às análises histomorfométricas. Rendimento de carcaça partes e peso de órgãos Aos 42 dias de idade, três aves de cada boxe foram retiradas aleatoriamente e submetidas a jejum alimentar durante 8 horas, sendo posteriormente transportadas ao Abatedouro Experimental da FMVZ, UNESP, Campus de Botucatu, onde foram pesadas e insensibilizadas por eletronarcose, abatidas, depenadas e evisceradas. O rendimento de carcaça foi calculado pela relação percentual do peso da carcaça, após a retirada das penas, sangue, cabeça, pés, vísceras, pescoço, gordura abdominal, e o peso vivo obtido momentos antes do abate das aves. Para a obtenção do rendimento de partes foi calculada a relação percentual entre o peso das partes individuais (dorso, peito, asas, coxas e sobrecoxas) e o peso da carcaça. Os órgãos pâncreas, baço, fígado e coração, foram coletados e submetidos a pesagem para a obtenção dos seus respectivos pesos em relação ao peso vivo das aves. 22 Neste período também foram coletados fragmentos (5cm2) de pele da sobrecoxa de uma ave por unidade experimental após as mesmas passarem por escaldagem, para posterior análise de resistência e elasticidade de pele. Histomorfometria intestinal Os segmentos do duodeno e jejuno coletados foram fixados em formaldeído 10% por 24 horas e em seguida armazenadas em álcool 70%. Para a confecção das lâminas histológicas, as amostras foram desidratadas em série crescente de álcool (álcool 70%; 80%; 90%; 100%; 100%; 100%). Posteriormente foram diafanizadas em solução álcool: xilol (1:1), imersas em parafina em estufa a 55° e, incluídas em parafina para formação dos blocos. Em seguida, as amostras foram submetidas à microtomia obtendo-se os cortes histológicos que foram colocados em lâminas e corados com hematoxilina-eosina. A determinação de altura dos vilos e profundidade das criptas de cada segmento intestinal, foi realizada por imagens capturadas em microscópio óptico com objetiva de 10x, com o auxílio de câmera digital. Em seguida as imagens foram transferidas ao programa analisador de imagem, para realização de 10 leituras de altura de vilos e profundidade de criptas por segmento intestinal. A partir dos dados analisados foi-se obtido a relação vilo-cripta, dividindo-se a altura do vilo pela profundidade da cripta. Contagem diferencial de leucócitos Os esfregaços foram realizados com o sangue in natura e, após a realização da extensão sanguínea, as lâminas foram submetidas a solução corante de Rosenfeld para a posterior determinação de leucócitos totais (LT), contagem diferencial de leucócitos e relação heterófilo:linfócito (H:L) de 21 e 42 dias de idade. As análises foram realizadas com o auxílio de um microscópio, utilizando-se a objetiva de 100x. Para determinação de LT foram contadas todas as células de 10 campos de visão e multiplicando o total por 1000 e a contagem diferencial de leucócitos foi realizada contando 100 células por lâmina, diferenciando-se os tipos celulares e então obtida a relação H:L e as porcentagens das diferentes células (Noriega, 2000). Qualidade óssea O índice de Seedor foi obtido através da divisão do peso do osso em (mg), pelo valor do comprimento em (mm) de cada tíbia, sendo que esses os valores foram determinados com o auxílio de um paquímetro com capacidade de 0 a 150 mm e precisão de 0,01 mm e uma balança semi-analítica digital de precisão de ± 0,01g (Seedor, 1995). 23 A análise de resistência óssea foi realizada com os ossos in natura com o auxílio do aparelho EMIC DL 300kN, calibrado para permitir que o vão livre da diáfise seja de 3,0 cm (Almeida Paz et al., 2006). Para o valor de cinzas os ossos foram quebrados e desengordurados em éter etílico com o auxílio do extrator Soxhlet por aproximadamente 8 horas. Posteriormente, as tíbias foram para mufla a 600°C e os valores foram obtidos conforme a metodologia de Silva e Queiroz (2004). Resistência de pele A resistência e elasticidade da pele antes e após a escaldagem foi obtida com o auxílio do aparelho texturômetro (Modelo TA-XSAi, Stable Mycro Systems LTDA., Goldalming, UK), equipado com dispositivo de fixação para teste de perfuração. As amostras foram submetidas ao ensaio de flexão a taxa de deformação constante para material viscoelástico. Foi utilizado 10g de força de disparo, tensão de 15mm, com velocidade de 1mm/s, para a mensuração da força de ruptura em quilograma (kg) e elasticidade da pele (mm), que corresponde à distância que a ponta de prova percorre antes de atingir o pico (Ribeiro, 2016). Scores de qualidade de pata e cama Para a qualidade de pata foram determinadas os scores totais de dermatites dos coxins plantares (SCP) e de jarrete (SJ), sendo ambas avaliadas em scores (0, 1, 2 e 3), em 5 frangos por boxe aos 42 dias de idade. As dermatites de coxins plantares foram classificadas em uma escala de 4 pontos: escore 0, sem lesões nos pés; escore 1, pequena lesão do epitélio do coxim plantar (<1 cm); score 2, lesão maior (> 1 cm); e score 3, edema dorsal visível (McWard et al., 2000). A prevalência de dermatites jarrete foram classificadas como: ausência de dermatite atribuição da pontuação 0; alterações de cor ou lesões menores pontuação 1; lesões maiores pontuação 2; ou pontuação 3 para lesões graves. Ambos os scores foram calculados utilizando a seguinte fórmula (Olukosi, et al., 2018): 𝑆𝐶𝑃 𝑜𝑢 𝑆𝐽 = (1 𝑥 𝑛) + (2 𝑥 𝑛) + (3 𝑥 𝑛) 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑛𝑖𝑚𝑎𝑖𝑠 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑠𝑎𝑑𝑜𝑠 Onde os números de 1 a 3 indicam a pontuação atribuída a cada ave e n indica o número de aves que receberam a pontuação específica em cada boxe. Pontuações baixas estão associadas a uma melhor qualidade de patas. A condição da cama de maravalha de cada boxe foi avaliada no final das fases 24 crescimento (21 dias de idade) e final (42 dias de idade) em um score de 1 a 5 pontos com base no protocolo de avaliação da qualidade do bem-estar para avicultura (Botreal et al., 2009). A pontuação total da cama (STC) foi calculado da seguinte forma (Olukosi, et al., 2018): 𝑆𝑇𝐶 = (1 𝑥 %) + (2 𝑥 %) + (3 𝑥 %) + (4 𝑥 %) + (5 𝑥 %) 100 Onde os números de 1 a 5 eram os scores conforme descrito anteriormente e a porcentagem (%) da área total do boxe correspondente a cada pontuação. Uma pontuação mais baixa está associada a melhor qualidade de cama. Qualidade de carne As análises da qualidade da carne foram realizadas no Laboratório de Qualidade de Carne da Faculdade de Ciências Agronômicas, UNESP, Câmpus de Botucatu, sendo realizadas após 24 horas post-mortem no músculo peitoral maior (Pectoralis major) de 28 aves por tratamento, totalizando 140 peitos. A coloração da carne foi avaliada com a utilização do colorímetro CR 400 (Konica Minolta Sensing, New Jersey, EUA) por meio das medições de três pontos distintos na superfície ventral do peito desossado. Os valores foram obtidos pela reflectância de luz em três dimensões: L* (luminosidade – nível de escuro a claro), a* (teor de vermelho/verde) e b* (teor de amarelo/azul) expressas no sistema de cor CIELAB. Os valores de pH foram determinados pela inserção do eletrodo (peagâmetro portátil Homis, HI8314, São Paulo, Brasil) no músculo do peitoral direito, que posteriormente foi utilizado para medir a capacidade de retenção de água (CRA). Para determinação da CRA foi utilizado o método de perda de água por exsudação (drip loss), de acordo com a metodologia proposta por Honikel (1998) adaptada, em duplicata, onde foram utilizadas amostras de 100g de carne de peito suspensas em tubos coletores, que permanecerão em câmara fria (1 a 4°C) por 48 horas. A porcentagem de perda de água por gotejamento, foi determinada por meio da diferença entre o peso inicial e o peso final da amostra, dividido pelo peso inicial e multiplicado por 100. As análises de perda de peso por cocção (PPC) e força de cisalhamento (FC) foram realizadas utilizando o filé do músculo peitoral esquerdo. A PPC foi realizada submetendo-se os filés crus a pesagem individual em balança analítica, sendo embalados em sacos plásticos e identificados para o posterior cozimento em banho-maria a 85°C. O processo perdurou até que se constatasse a temperatura interna 25 do filé de 80°C, com o auxílio de um termômetro digital. Após as amostras foram submetidas ao resfriamento em temperatura ambiente e posterior pesagem, para obtenção da diferença entre o peso inicial e final da amostra (Honikel, 1998). Para a mensuração da FC, as amostras foram analisadas em um equipamento texturômetro TAXT-Plus (Stable Micro Systems, Surrey, UK) equipado com dispositivo Warner-Bratzler, calibrado com faixa de peso normal de 5 kg, avaliando a energia (N/mm) e a força de cisalhamento (N). As amostras constituíram em retângulos (1,0 x 1,0 x 2,0 cm) da superfície cranial dos peitos que foram anteriormente submetidos à análise de PPC, sendo posicionadas no texturômetro em sentido perpendicular à lâmina Razor Blade, de acordo com Cavitt et al. (2004). Análises químicas Para determinação do teor de Cu e Zn no plasma, utilizou-se 250 µl de plasma digerido em 1000 µl de ácido nítrico (65% PA) e 300 µl de peróxido de hidrogênio (35% PA), utilizando tubos fechados de fluoropolímero (PFA) em forno micro-ondas da marca Speedwave modelo SW-4. O valor de Cu e Zn na tíbia foi obtido a partir de 100 mg de cinzas previamente pesadas, colocadas para digestão com 1000 µl de ácido clorídrico (30 %) e 400 µl de peróxido de hidrogênio (35% PA). A concentração de cobre e zinco no fígado, foi determinada a partir de 100 mg do órgão in natura, adicionado para digestão com 3 ml de ácido nítrico (65% PA) e 2 ml de peróxido de hidrogênio (35% PA), utilizando tubos fechados de fluoropolímero (PFA) em forno micro-ondas da marca Speedwave modelo SW-4. Após digeridas as amostras foram volumadas e analisadas pelo método de espectrofotometria de absorção atômica com equipamento SHIMADZU AA- 6800 de acordo com Neves et al. (2009). Análise estatística Para a realização das análises estatisticas dos resultados de deferencial de leucócitos, os dados foram transformados para Log10 e posteriormente retransformados. Posteriormente, todos os dados foram submetidos ao teste normalidade e homogeneidade, seguido da análise de variância pelo Minitab® 2018, sendo as médias significativas (P <0,05) comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. 26 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Desempenho Analisando os dados de desempenho pode-se observar diferença em todos os períodos analisados, de modo que todos os parâmetros exceto a viabilidade e o índice de eficiência produtiva foram afetados. Na fase inicial de 1 a 21 dias de idade (Tabela 4), o tratamento hidroxicloreto hiperdose (HCH) foi o único que diferiu, apresentando menor resultado para ganho de peso (GP) (P <0,0001), e pior conversão alimentar (CA) (P <0,0001). Sabe-se que concentrações de Cu acima de 250 ppm na dieta, geralmente deprimem o desempenho das aves (Jensen e Maurice, 1979; Christmas e Harmas, 1984; Zhao et al., 2016). Efeitos tradicionalmente atribuídos a toxicidade do mineral (Ledoux et al., 1986), podendo o efeito ter sido exacerbado pela combinação das altas concentrações de Cu e o desafio realizado neste experimento. De acordo com Southern e Baker (1982), a absorção e toxicidade são exacerbadas em aves suplementadas com 250 ppm de Cu e desafiadas com coccidiose, o que não ocorreu em aves alimentadas com 18 a 100 ppm do mineral. TABELA 4. Desempenho de frangos de corte de 1 a 21 dias de idade. TRAT¹ GP, g CR, g CA VB, % SB+APC 778a 1208 1,570a 97,62 SA 773a 1205 1,579a 96,90 HCA 757a 1187 1,571a 98,57 HCS 761a 1176 1,582a 98,33 HCH 719b 1193 1,668b 98,81 CV (%) 5,25 3,98 4,60 2,92 P-valor <0,0001 0,407 <0,0001 0,395 ¹Tratamentos: SB+APC = 10 ppm de sulfato (SF) de Cu + 80 ppm de SF de Zn + avilamicina em todas as etapas da criação; SA = 125 ppm de SF de Cu + 80 ppm de SF de Zn em todas as etapas da criação; HCA = 125 ppm Cu hidroxicloreto (HC) + 80 ppm Zn HC em todas as etapas da criação; HCS = 200, 150, 125 e 125ppm Cu HC nas fases de criação pré-inicial (PI), inicial (I), crescimento (C) e final (F), respectivamente, + 80 ppm de Zn HC em todas as fases da criação ; HCH = 250, 200, 125 e 125ppm Cu HC nas fases PI, I, C, F, respectivamente + 80 ppm Zn HC todas as fases de criação. GP, ganho de peso; CR, consumo de ração; CA, conversão alimentar; VB, viabilidade; CV, coeficiente de variação. a, b = As médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna são estatisticamente diferentes (P <0,05) pelo teste de Tukey. A fase de crescimento de 1 a 35 dias de idade (Tabela 5), evidencia o melhor desempenho dos frangos do tratamento sulfato baixa dose com adição de antibiotico promotor de crescimento (SB+APC) para GP (P <0,0001), sendo que, os demais tratamentos não diferiram entre si. A CA também apresentou diferença (P <0,008), de forma que o SB+APC foi responsável pelo melhor resultado, seguido do tratamento 27 hidroxicloreto alta dose (HCA) que se igualou ao mesmo e não se diferiu dos demais tratamentos. Para o consumo de ração (CR) (P <0,015) o SB+APC apresentou o maior resultado, sendo o HCH responsável pelo menor consumo, os demais tratamentos apresentaram comportamento padrão. Os melhores resultados do SB+APC podem ser explicados pela possível ação do antibiótico promotor de crescimento (APC) presente nesse tratamento. O APC possui inúmeros benefícios, dentre eles, proporcionar elevado PF, GP, melhor CA e maior resistência dos frangos aos patógenos (Ferket, 2004). De forma que, os melhores índices de PF e CA em frangos de corte suplementados com APC são atribuídos principalmente a melhor qualidade intestinal (Miles et al., 2006; Pedroso et al., 2006). O menor resultado de CR pode ser atribuído aos altos níveis de Cu, em conformidade com Lendoux (1986), que verificou que concentrações acima de 250 ppm de Cu geralmente ocasiona depressão da ingestão de alimentos em frangos. TABELA 5. Desempenho de frangos de corte de 1 a 35 dias de idade. TRAT¹ GP, g CR, g CA VB, % SB+APC 2096a 3373a 1,635a 96,19 SA 2001b 3295ab 1,680b 95,95 HCA 1995b 3290ab 1,666ab 96,43 HCS 1993b 3310ab 1,681b 96,19 HCH 1944b 3225b 1,688b 96,19 CV (%) 4,49 3,50 2,60 3,70 P-valor <0,0001 0,015 0,008 0,998 ¹Tratamentos: SB+APC = 10 ppm de sulfato (SF) de Cu + 80 ppm de SF de Zn + avilamicina em todas as etapas da criação; SA = 125 ppm de SF de Cu + 80 ppm de SF de Zn em todas as etapas da criação; HCA = 125 ppm Cu hidroxicloreto (HC) + 80 ppm Zn HC em todas as etapas da criação; HCS = 200, 150, 125 e 125ppm Cu HC nas fases de criação pré-inicial (PI), inicial (I), crescimento (C) e final (F), respectivamente, + 80 ppm de Zn HC em todas as fases da criação ; HCH = 250, 200, 125 e 125ppm Cu HC nas fases PI, I, C, F, respectivamente + 80 ppm Zn HC todas as fases de criação. GP, ganho de peso; CR, consumo de ração; CA, conversão alimentar; VB, viabilidade; CV, coeficiente de variação. a, b = As médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna são estatisticamente diferentes (P <0,05) pelo teste de Tukey. No período de 1 a 42 dias de idade (Tabela 6), para GP (P <0,005) e CA (P <0,007), os frangos do SB+APC continuaram se mostrando mais eficientes, sendo que, apenas os frangos do HCA se igualaram ao mesmo em todos os índices de desempenho estudados. Os demais tratamentos não se diferiram entre si nas variáveis analisadas. Frangos do tratamento sulfato alta dose (SA) mesmo recebendo nível identico de Cu do HCA variando apenas a fonte, não obtiveram os mesmos resultados. Kim et al. (2011) encontraram resultado semelhante, uma vez que suplementaram 100 ppm de Cu orgânico e obtiveram melhorias de desempenho comparáveis a suplementação de APC Avilamicina, destacando o Cu como possível substituto aos antibióticos. Da mesma forma 28 que, a suplementação de Cu ao nível de 125 ppm proporcionou melhor desempenho e CA das aves (Baker et al., 1991; Paik, 2001), resultados que foram corroborados pelos encontrados nessa pesquisa. De acordo com Swiatkiewicz et al. (2014), fontes inorgânicas convencionais se complexam com facilidade aos nutrientes da dieta, gerando menor absorção mineral e consequente maior excreção para o ambiente. Características que podem ter influenciado o resultado do SA a não equiparar ao HCA. Outros autores também concluíram que frangos suplementados com HC de Cu e Zn obtiveram maior desempenho, e designaram o resultado encontrado à possível maior biodisponibilidade da fonte (Miles et al., 1998; Batal et al., 2001). TABELA 6. Desempenho de frangos de corte de 1 a 42 dias de idade. TRAT¹ GP, g CR, g CA VB, % IEP SB+APC 2705a 4712 1,773a 94,26 337,17 SA 2573b 4618 1,835b 93,81 312,88 HCA 2593ab 4613 1,808ab 95,00 324,72 HCS 2577b 4634 1,831b 94,29 316,10 HCH 2540b 4541 1,826b 94,52 313,75 CV (%) 4,9 3,68 2,86 4,72 7,83 P-valor 0,005 0,123 0,007 0,973 0,059 ¹Tratamentos: SB+APC = 10 ppm de sulfato (SF) de Cu + 80 ppm de SF de Zn + avilamicina em todas as etapas da criação; SA = 125 ppm de SF de Cu + 80 ppm de SF de Zn em todas as etapas da criação; HCA = 125 ppm Cu hidroxicloreto (HC) + 80 ppm Zn HC em todas as etapas da criação; HCS = 200, 150, 125 e 125ppm Cu HC nas fases de criação pré-inicial (PI), inicial (I), crescimento (C) e final (F), respectivamente, + 80 ppm de Zn HC em todas as fases da criação ; HCH = 250, 200, 125 e 125ppm Cu HC nas fases PI, I, C, F, respectivamente + 80 ppm Zn HC todas as fases de criação. GP, ganho de peso; CR, consumo de ração; CA, conversão alimentar; VB, viabilidade; IEP, índice de eficiencia produtiva; CV, coeficiente de variação. a, b = As médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna são estatisticamente diferentes (P <0,05) pelo teste de Tukey. Rendimento de carcaça e peso de órgãos Analisando a Tabela 7, pode-se observar que não houve diferença estatística para rendimento de carcaça (RC), rendimento de partes (RP) e peso relativo dos órgãos (PO). A genética consiste em principal fator capaz de influenciar o RC e RP de aves de corte (Moreira et al., 2003). Por tanto, outros fatores possuem maior dificuldade para modificar as características citadas. De forma que, Olukosi et al. (2019) não encontraram diferença para RC e RP em aves suplementadas com Cu e Zn das fontes sulfato e hidroxicloreto na concentração de 15 e 80 ppm, respectivamente. Togashi et al. (2008) do mesmo modo, não observaram variação para os mesmos parametros e peso relativo de figado em aves suplementadas com 125 e 250 ppm de Cu. Medeiros (2017) não observou diferença no peso de fígado, baço e pâncreas de aves suplementadas com Cu e Zn de fontes 29 convencionais, em comparação a substituição de 50% por minerais orgânicos. M’Sadeq et al. (2018) também afirmaram não terem encontrado diferença no peso relativo do baço de aves suplementadas com hidroxicloreto de Cu e Zn aos 11 dias de idade. Resultados semelhantes aos obtidos nesta pesquisa. O peso de baço e coração são ótimos indicadores para mensurar a resposta fisiológica a deficiência de oxigênio (Silversides et al., 1997). Na falta deste em órgãos vitais, o coração aumenta de tamanho proporcionalmente, sendo essa a primeira reação da ave frente ao desafio da hipóxia (Rosário et al., 2004). Por mais que os minerais Cu e Zn possuam participação na resposta fisiológica e síntese de órgãos, no presente estudo os animais não apresentaram diferença no PO citados anteriormente. Resultado que pode ser explicado devido a suplementação a partir de níveis recomendados de Cu e Zn, que foram capazes de suprir as necessidades das aves. Fatores externos como ambiente e manejos possuem grande influência no PO, podendo atribuir a este fato a dispersão das respostas encontradas na literatura. TABELA 7. Rendimento de carcaça, rendimento de partes e peso de órgãos de frangos de corte aos 42 dias de idade. TRAT¹ RC,% RP, % PO, % GD PT C+SB D A P C B F SB+APC 73,43 1,31 38,79 30,68 18,88 11,92 0,17 0,46 0,08 2,02 SA 72,84 1,23 38,28 31,29 18,73 11,93 0,16 0,49 0,09 2,07 HCA 73,00 1,21 38,68 30,28 18,87 12,13 0,17 0,54 0,08 1,91 HCS 73,03 1,16 38,49 30,63 18,77 12,15 0,17 0,51 0,09 2,03 HCH 72,93 1,11 38,62 30,76 18,70 12,11 0,17 0,52 0,07 1,94 CV (%) 1,35 18,31 3,61 3,27 4,48 3,32 16,82 16,57 28,05 11,52 P-valor 0,58 0,15 0,90 0,12 0,97 0,35 0,91 0,14 0,48 0,30 ¹Tratamentos: SB+APC = 10 ppm de sulfato (SF) de Cu + 80 ppm de SF de Zn + avilamicina em todas as etapas da criação; SA = 125 ppm de SF de Cu + 80 ppm de SF de Zn em todas as etapas da criação; HCA = 125 ppm Cu hidroxicloreto (HC) + 80 ppm Zn HC em todas as etapas da criação; HCS = 200, 150, 125 e 125ppm Cu HC nas fases de criação pré-inicial (PI), inicial (I), crescimento (C) e final (F), respectivamente, + 80 ppm de Zn HC em todas as fases da criação ; HCH = 250, 200, 125 e 125ppm Cu HC nas fases PI, I, C, F, respectivamente + 80 ppm Zn HC todas as fases de criação. RC, rendimento de carcaça; RP, rendimento de partes; PO, peso de órgãos; GD, gordura abdominal; PT, peito; C+SB, coxa e sobrecoxa; D, dorso; A, asas; P, pâncreas; C, coração; B, baço; F, fígado; CV, coeficiente de variação. Histomorfometria Intestinal Os resultados de tamanho de vilo e profundidade de cripta de ambos os segmentos intestinais não apresentaram diferença estatística entre os tratamentos analisados (Tabela 8). A relação vilo cripta (V/C) do duodeno também não apresentou diferença estatística, porém a relação V/C do jejuno se diferenciou. Sendo os tratamentos SA e HCA os que 30 apresentaram maior relação V/C e o HCS o que apresentou o menor valor, os demais tratamentos não se diferenciaram dos mesmos. A altura do vilo está relacionada a absorção intestinal, maiores vilos tendem a promover absorção superior, enquanto a profundidade da cripta está relacionada a renovação celular (Parsaie et al., 2007). A relação V/C consiste em um indicador da capacidade digestiva do intestino delgado. Sendo maiores relações V/C correlacionadas a melhores equilíbrios entre o turnover celular e a altura das vilosidades (Parsaie et al., 2007). Menores valores de V/C estão relacionados a vilos danificados e atividade proliferativa aumentada nas criptas, objetivando a restauração do epitélio (Luquetti 2005). Há a carência de estudos onde há a utilização de Cu e Zn em conjunto sobre a morfologia intestinal. Echeverry et al. (2016) encontraram uma maior relação V/C quando suplementaram frangos com minerais de maior biodisponibilidade perante grupo controle. Já no presente estudo, quando comparados os tratamentos com 125 ppm de Cu e 80 ppm de Zn variando apenas a fonte os mesmos não se diferenciaram entre si, porém tais níveis aparentam ter contribuído para uma melhor qualidade intestinal. Resultado que corrobora com Bortoluzzi et al. (2020) qual cita que, diversos estudos apontam a suplementação de oligoelementos em níveis superiores das recomendações como possíveis alternativas de neutralizar os efeitos negativos de doenças entéricas na saúde intestinal de frangos de corte. TABELA 8. Histomorfometria intestinal de frangos aos 42 dias de idade. TRAT¹ Duodeno Jejuno Vilo, µm Cripta, µm V/C Vilo, µm Cripta, µm V/C SB+APC 1460,2 164,1 9,43 942,0 114,16 10,09ab SA HCA 1274,0 1442,6 165,8 184,1 8,13 8,73 1024,2 1046,7 113,43 114,55 11,06a 11,21a HCS 1358,2 173,6 8,67 981,2 111,54 9,49b HCH 1339,7 153,8 9,39 991,3 112,10 10,69ab CV (%) 3,90 6,11 17,93 2,34 6,60 12,43 P-valor 0,556 0,580 0,052 0,658 0,671 0,001 ¹Tratamentos: SB+APC = 10 ppm de sulfato (SF) de Cu + 80 ppm de SF de Zn + avilamicina em todas as etapas da criação; SA = 125 ppm de SF de Cu + 80 ppm de SF de Zn em todas as etapas da criação; HCA = 125 ppm Cu hidroxicloreto (HC) + 80 ppm Zn HC em todas as etapas da criação; HCS = 200, 150, 125 e 125ppm Cu HC nas fases de criação pré-inicial (PI), inicial (I), crescimento (C) e final (F), respectivamente, + 80 ppm de Zn HC em todas as fases da criação ; HCH = 250, 200, 125 e 125ppm Cu HC nas fases PI, I, C, F, respectivamente + 80 ppm Zn HC todas as fases de criação. V/C, relação vilo cripta; CV, coeficiente de variação. a, b = As médias seguidas de letras diferentes na mesma linha são estatisticamente diferentes (P <0,05) pelo teste de Tukey. 31 Diferencial de Leucócitos Aos 21 dias nenhum dos parâmetros analisados foram alterados, porém aos 42 dias foram observadas diferenças para porcentagem de linfócitos (P <0,05) (Tabela 9). De modo que, os frangos do SB+APC apresentaram a maior contagem de linfócitos e os do HCH apresentaram o menor resultado; frangos dos demais tratamentos não se diferenciaram entre si. Níveis adequados de minerais são cruciais para se obter respostas imunológicas eficientes e superar os desafios encontrados no ambiente (Maggini et al., 2007). O total de leucócitos encontrados nesta pesquisa está de acordo com os valores de 12.000 a 30.000 leucócitos/µL, exceto o tratamento HCH aos 21 dias, que apresentou resultado inferior ao minimo citado na literatura para frangos de corte (Bounous e Stedman, 2000), sendo que as diferentes inclusões e fontes de minerais não foram capazes de alterar o número total de leucócitos, porcentagem de heterófilos, monócitos e a relação heterófilo/ linfócito. As informações sobre as funções dos eosinófilos em aves ainda são limitadas, podendo ser interpretadas livremente como resposta ao parasitismo e exposição a antígenos estranhos (Campbell, 2015). De forma que, os níveis de 125 ppm de Cu e 80 ppm de Zn hidroxicloreto parecem ter contribuído para uma resposta mais efetiva contra o desafio empregado no experimento, uma vez que o tratamento apresentou o maior número de eosinófilos e maior desempenho dos animais, que se igualou ao SB+ APC. O tratamento com adição de 50 ppm de APC parece ter sido eficaz, já que os frangos deste apresentaram os maiores números de linfócitos e menores números de eosinófilos e basófilos, comprovando a baixa necessidade do sistema imune inato. Como podemos observar, frangos do HCH apresentaram maior quantidade de basófilos, resultado que pode ser explicado devido a possível toxicidade apresentada pela maior inclusão de Cu, uma vez que os basófilos se associam a situações de estresse prolongado e a processos tóxicos e septicêmicos (Charles Noriega, 2000). 32 TABELA 9. Diferencial de leucócitos em frangos de corte aos 21 e 42 dias de idade. TRAT¹ SB+APC SA HCA HCS HCH CV (%) P-valor 21 dias Heterófilo 28,86 35,71 31,58 29,17 38,79 10,29 0,069 Linfócito 57,21 49,29 53,69 59,42 48,31 5,59 0,051 Eosinófilo 4,21 3,43 3,55 4,85 3,07 62,05 0,430 Monócito 6,50 7,50 8,57 6,69 7,00 36,94 0,341 Basófilo 3,21 4,07 4,85 4,54 4,36 55,09 0,720 LT 13.570 14.790 14.070 13.380 11.420 9,90 0,080 H/L 0,57 0,73 0,53 0,47 0,76 50,71 0,090 42 dias Heterófilo 45,57 42,07 41,00 41,57 46,64 5,53 0,298 Linfócito 40,00a 36,62ab 37,14ab 35,14ab 30,86b 6,71 0,033 Eosinófilo 3,78b 4,50ab 6,29a 3,75b 5,07ab 47,60 0,010 Monócito 8,14 9,64 10,86 12,43 8,57 24,74 0,395 Basófilo 2,21b 3,14ab 3,92ab 4,50ab 6,57a 54,78 0,012 LT 17.000 19.360 18.430 20.710 21.140 9,35 0,366 H/L 1,17 1,25 1,18 1,27 1,45 35,53 0,560 ¹Tratamentos: SB+APC = 10 ppm de sulfato (SF) de Cu + 80 ppm de SF de Zn + avilamicina em todas as etapas da criação; SA = 125 ppm de SF de Cu + 80 ppm de SF de Zn em todas as etapas da criação; HCA = 125 ppm Cu hidroxicloreto (HC) + 80 ppm Zn HC em todas as etapas da criação; HCS = 200, 150, 125 e 125ppm Cu HC nas fases de criação pré-inicial (PI), inicial (I), crescimento (C) e final (F), respectivamente, + 80 ppm de Zn HC em todas as fases da criação ; HCH = 250, 200, 125 e 125ppm Cu HC nas fases PI, I, C, F, respectivamente + 80 ppm Zn HC todas as fases de criação. LT, leucócitos totais por µL; H/L, relação heterofilo linfócito; CV, coeficiente de variação. a, b = As médias seguidas de letras diferentes na mesma linha são estatisticamente diferentes (P <0,05) pelo teste de Tukey. Qualidade Óssea Os parâmetros de qualidade óssea: índice de seedor (IS), porcentagem de cinzas (PC) e força a quebra (FQ), representados na Tabela 10, não apresentaram diferença entre os tratamentos avaliados. O IS consiste em uma variável obtida através da divisão do peso do osso pelo respectivo comprimento, onde maiores valores representam maiores densidades ósseas, como proposto por Seedor (1993). El-Husseyny et al. (2012) comparando fontes orgânicas e inorgânicas de Cu e Zn observaram maiores IS e FQ quando se utilizou combinações entre as duas fontes, resultado que mostra a possível ação em parâmetros ósseos quando se utiliza fontes alternativas dos microminerais estudados. Porém, M’Sadeq et al. (2018) não obtiveram diferença no peso, comprimento, PC e FQ em tíbias de frangos suplementados com hidroxicloretos de Cu e Zn, comparados a outras três fontes minerais. Zhao et al. (2010) não obtiveram diferença estatística no parâmetro FQ da tíbia de frangos alimentados com Cu e Zn orgânicos e inorgânicos. Resultados que foram corroborados pelos encontrados no presente estudo, onde fontes de Cu e Zn e níveis de Cu não foram capazes de alterar as variáveis ósseas analisadas. 33 TABELA 10. Qualidade óssea da tíbia de frangos aos 42 dias de idade. TRAT¹ Índice de seedor FQ, kg Cinzas, % SB+APC 158,70 38,44 48,418 SA HCA 155,62 154,56 37,98 39,64 48,987 48,003 HCS 151,15 36,29 48,662 HCH 155,61 43,51 48,224 CV (%) 6,20 18,50 2,63 P-valor 0,376 0,094 0,318 ¹Tratamentos: SB+APC = 10 ppm de sulfato (SF) de Cu + 80 ppm de SF de Zn + avilamicina em todas as etapas da criação; SA = 125 ppm de SF de Cu + 80 ppm de SF de Zn em todas as etapas da criação; HCA = 125 ppm Cu hidroxicloreto (HC) + 80 ppm Zn HC em todas as etapas da criação; HCS = 200, 150, 125 e 125ppm Cu HC nas fases de criação pré-inicial (PI), inicial (I), crescimento (C) e final (F), respectivamente, + 80 ppm de Zn HC em todas as fases da criação ; HCH = 250, 200, 125 e 125ppm Cu HC nas fases PI, I, C, F, respectivamente + 80 ppm Zn HC todas as fases de criação. FQ, força a quebra; CV, coeficiente de variação. Resistência de Pele Os dados de resistência de pele aos 42 dias estão representados na Tabela 11. Quando analisada in natura antes da escaldagem não foi possível observar diferença entre os tratamentos. Ainda na mesma tabela, pode-se verificar diferença entre tratamentos quando a pele foi submetida ao processo de escaldagem (P <0,028). De forma que, os frangos do SB+APC apresentaram maior resistência da pele após a escaldagem e os do HCH obtiveram a menor resistência; os demais tratamentos não se diferiram dos mesmos. O Cu e Zn desempenham papéis fundamentais na síntese e manutenção do epitélio e estruturas conectivas do tecido, influenciando na incidência de lesões em frangos de corte (Manangi et al., 2012). Autores suplementando Zn em nível fixo, variando apenas os níveis (9 a 25 ppm) e fontes de Cu, obtiveram maior resistência tecidual em tratamentos com maiores concentrações de Cu provindos de fontes de maior biodisponibilidade, sendo a maior resistência deste tecido crucial para a saúde e processamento post mortem das aves (Richards et al., 2010). A lisil oxidase (LO) atua na formação de matrizes de tecido conjuntivo, por ligações cruzadas de colágeno e elastina (Smith-Mungo e Kagan, 1998). De forma que a maior atividade da LO (dependente de Cu), pode disponibilizar a maior resistência tecidual (Richards et al., 2010). A resistência da pele está altamente correlacionada com o colágeno presente em sua composição (Leeson e Summers, 2005), sendo o Zn necessário para síntese de duas importantes proteínas estruturais, colágeno e queratina (Underwood e Suttle, 1999), de forma que deficiência deste mineral reflete em diminuição da síntese de colágeno e queratina, que pode ocasionar baixa resistência tecidual (Leeson e Summers, 2001). Deste modo, justificam-se os resultados encontrados 34 nesta pesquisa, onde o processamento animal post mortem representou um desafio adicional à pele do frango, explicando a diferença estatística encontrada apenas após a escaldagem da mesma. Os dois minerais contribuem para a resistência de pele, porém uma ótima combinação entre eles é importante, pois segundo Bao et al. (2010), interações entre minerais consistem em principal causa de variações na absorção dos mesmos, o que justifica o maior resultado encontrado no SB+APC e o menor resultado encontrado no HCH, devido ao possível desbalanço na absorção dos minerais. TABELA 11. Resistência de pele antes e após o processo de escaldagem. TRAT¹ In natura, kgf Após a escaldagem, kgf SB+APC 5,793 5,494a SA 4,997 5,233ab HCA 5,209 4,735ab HCS 5,134 5,300ab HCH 4,950 4,214b CV (%) 30,08 23,98 P-valor 0,637 0,028 ¹Tratamentos: SB+APC = 10 ppm de sulfato (SF) de Cu + 80 ppm de SF de Zn + avilamicina em todas as etapas da criação; SA = 125 ppm de SF de Cu + 80 ppm de SF de Zn em todas as etapas da criação; HCA = 125 ppm Cu hidroxicloreto (HC) + 80 ppm Zn HC em todas as etapas da criação; HCS = 200, 150, 125 e 125ppm Cu HC nas fases de criação pré-inicial (PI), inicial (I), crescimento (C) e final (F), respectivamente, + 80 ppm de Zn HC em todas as fases da criação ; HCH = 250, 200, 125 e 125ppm Cu HC nas fases PI, I, C, F, respectivamente + 80 ppm Zn HC todas as fases de criação. CV, coeficiente de variação. a, b = As médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna são estatisticamente diferentes (P <0,05) pelo teste de Tukey. Scores de qualidade de pata e cama de frangos de corte Os scores de lesões de coxim plantar, jarrete e qualidade de cama de frangos de corte (Tabela 12) não apresentaram diferença entre os tratamentos analisados. As dermatites de pés são preocupantes por causarem condenação de patas de frangos que poderiam ser comercializadas e afetarem o bem-estar animal (Shepherd e Fairchild., 2010). Como citado anteriormente, tanto o Cu quanto o Zn são fundamentais para manter uma boa integridade de tecidos, podendo estes, melhorar a qualidade da pele. Zhao et al. (2010) sugerem que fontes minerais com maior biodisponibilidade são as preferíveis para melhor integridade e saúde dos pés de frango. Com o mesmo intuito, Olukosi et al. (2019) utilizaram hidroxicloretos de Cu e Zn em frangos de corte e não observaram diferença de escores de lesões de pata (ELP) em aves aos 28 dias de idade. Outros autores também não observaram diferença em ELP, quando submeteram as aves a dietas contendo quelatos de Cu, Zn e manganês (Mn) (Zhao et al., 2010; Chen et al., 2017). A qualidade de cama está altamente relacionada com a sua umidade, sendo considerada o principal fator 35 predisponente para o aparecimento de lesões em pés de frangos de corte (Nagaraj et al., 2007; Youssef et al., 2011). Além de induzir as lesões de patas e jarrete, esta pode afetar a qualidade do peito e deprimir o desempenho dos frangos de corte (Martland, 1985). A qualidade da cama pode ser afetada nutricionalmente por dietas que ocasionam distúrbios osmorregulatórios, agravamento da poliúria, comprometimento da recuperação da água e ou aparecimento de diarreia (Collet, 2012). Deste modo, pode-se observar que os minerais estudados não ocasionaram distúrbios capazes de alterar a qualidade de cama nos períodos analisados. TABELA 12. Scores de lesões de coxim plantar, jarrete e qualidade de cama de frangos em diferentes idades. TRAT¹ 21 dias 42 dias SQC² SQC² SCP³ SJ4 SB+APC 2,13 2,13 1,11 1,17 SA 2,1 2,08 1,01 1,07 HCA 2,06 2,02 1,17 1,00 HCS 2,05 1,79 1,09 1,20 HCH 2,01 1,82 1,16 0,99 CV (%) 12,64 21,53 26,19 39,99 P-valor 0,808 0,119 0,635 0,600 ¹Tratamentos: SB+APC = 10 ppm de sulfato (SF) de Cu + 80 ppm de SF de Zn + avilamicina em todas as etapas da criação; SA = 125 ppm de SF de Cu + 80 ppm de SF de Zn em todas as etapas da criação; HCA = 125 ppm Cu hidroxicloreto (HC) + 80 ppm Zn HC em todas as etapas da criação; HCS = 200, 150, 125 e 125ppm Cu HC nas fases de criação pré-inicial (PI), inicial (I), crescimento (C) e final (F), respectivamente, + 80 ppm de Zn HC em todas as fases da criação ; HCH = 250, 200, 125 e 125ppm Cu HC nas fases PI, I, C, F, respectivamente + 80 ppm Zn HC todas as fases de criação. CV, coeficiente de variação. ² Scores de qualidade de cama: 1 a 5 baseados no protocolo de avaliação da qualidade do bem-estar de aves (Botreau et al., 2009). ³ Score de lesão de coxins plantares: 0= sem lesões nas almofadas dos pés; score 1= pequena lesão do epitélio da almofada do pé (<1 cm); score 2= lesão maior (> 1 cm); e score 3= inchaço dorsal visível (pé inchado) (McWard et al., 2000). 4 Score de lesão de jarrete: 0= dermatite de jarrete ausente; score 1 = alterações de cor ou lesões menores; score 2 = lesões maiores; e score 3 = lesões graves. Qualidade de Carne Os parâmetros de qualidade de carne (coloração, pH, perda de peso por cozimento (PPC), perda de peso por gotejamento (PPG) e força de cisalhamento (FC)) estão representados na Tabela 13 e, destas apenas duas características apresentaram diferença entre tratamentos, sendo a coloração para a* teor de vermelho (P <0,014) e pH da carne (P <0,021). Para a coloração da carne, o SA proporcionou o maior teor de vermelho, sendo o HCA responsável pelo menor resultado, de forma que os demais tratamentos não diferiram entre si para variável analisada. Frangos do tratamento HCS apresentaram maior pH da carne e os do SA o menor resultado, sendo que os demais tratamentos não se diferiram entre si. A qualidade sensorial da carne de frango está correlacionada com as 36 características físico químicas das mesmas, como coloração, FC e capacidade de retenção de água (Yang et al., 2011). O valor do pH reflete na taxa de glicose da carne e está associado ao prazo de validade da mesma, carnes com baixo pH parecem acelerar o processo de oxidação (Yang e Chen, 1993). No presente estudo as fontes hidroxicloretos com alta inclusão apresentaram maiores pH quando comparadas a fonte sulfato com níveis elevados. Embora ocorra influência dos parâmetros cor e pH sobre a qualidade da carne, na produção de frangos isto não está tão bem estabelecido como em extremos de carnes pálidas, flácidas e exsudativas (PSE) e escuras, firmes e secas (DFD) observados em suínos (Quiao et al., 2001). Alguns autores relataram alteração nos parâmetros de qualidade de carne pela suplementação dos microminerais estudados, mesmo não sendo prática comum a avaliação destes parâmetros. Yang et al. (2011) estudando a inclusão de Cu, Zn, Fe e Mn encontraram maior capacidade de retenção de água para peitos provindos de aves suplementadas e citaram que esta característica se deve ao mineral Zn. Comparando niveis e fontes de Zn, Liu et al. (2011) relatam aumento do valor de b*, pH, FC e ainda, citaram uma tendência de maior valor de a* quando se utiliza níveis suplementares de Zn, comparados com a dieta controle. Aksu et al. (2011) avaliando a qualidade da carne de frango com a utilização de Cu, Zn e Mn orgânicos e inorgânicos encontraram menores níveis de a* e L* quando se utilizou fontes alternativas de minerais, não encontrando diferença para b*. As respostas do presente estudo se assemelham às encontradas nestes estudos, onde a suplementação da fonte hidroxicloreto apresentou menor valor de a* quando comparada a fonte sulfato, não alterando L* e b*. Os resultados que se diferem da atual pesquisa podem ser justificados devido a utilização de apenas um ou a combinação de mais minerais, além dos pesquisados neste estudo. 37 TABELA 13. Qualidade de carne de frangos aos 42 dias de idade. TRAT¹ pH L* a* b* PPC, % FC, Kgf PPG, % SB+APC 5,923ab 59,780 11,234ab 8,861 20,550 20,067 0,632 SA HCA 5,880b 5,949ab 59,492 59,228 11,759a 10,729b 8,789 8,426 21,890 21,530 20,021 18,516 0,581 0,765 HCS 5,988a 59,225 11,335ab 8,972 20,200 19,240 0,812 HCH 5,976ab 58,559 11,282ab 8,373 18,330 18,422 0,590 CV (%) 2,28 3,170 9,870 15,430 27,960 25,35 32,62 P-valor 0,021 0,0166 0,014 0,346 0,166 0,585 0,133 ¹Tratamentos: SB+APC = 10 ppm de sulfato (SF) de Cu + 80 ppm de SF de Zn + avilamicina em todas as etapas da criação; SA = 125 ppm de SF de Cu + 80 ppm de SF de Zn em todas as etapas da criação; HCA = 125 ppm Cu hidroxicloreto (HC) + 80 ppm Zn HC em todas as etapas da criação; HCS = 200, 150, 125 e 125ppm Cu HC nas fases de criação pré-inicial (PI), inicial (I), crescimento (C) e final (F), respectivamente, + 80 ppm de Zn HC em todas as fases da criação ; HCH = 250, 200, 125 e 125ppm Cu HC nas fases PI, I, C, F, respectivamente + 80 ppm Zn HC todas as fases de criação. pH, potencial hidrogeniônico; L*, luminosidade; a*, coloração de vermelho; b*, coloração de amarelo; PPC, perca de peso por cozimento; FC, força de cisalhamento; PPG, perda de peso por gotejamento; CV, coeficiente de variação. a, b = As médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna são estatisticamente diferentes (P <0,05) pelo teste de Tukey. Concentração mineral no Fígado, Plasma e Tíbia Para concentração de Cu no fígado (Tabela 14), o HCH apresentou o maior resultado (P <0,0001), seguido pelo HCS, os tratamentos SA e HCA não se diferiram e o SB+APC foi responsável pela menor concentração. A deposição de Zn no fígado não apresentou diferença entre os tratamentos. O fígado é o principal órgão de armazenamento do Cu (Southern e Baker, 1982; Suttle, 2010), de forma que a concentração deste mineral no órgão aumenta conforme sua inclusão na dieta (Ledoux et al., 1986). Os resultados do presente estudo estão de acordo com esta afirmação, uma vez que a concentração do Cu no fígado aumentou linearmente conforme sua inclusão na dieta. Olukosi et al. (2018) obtiveram maior deposição de Cu no fígado quando suplementaram Cu e Zn da fonte hidroxicloreto em comparação a fonte sulfato, justificando este fato a maior biodisponibilidade do mineral. Na atual pesquisa quando comparado os tratamentos com níveis idênticos de 125 ppm de Cu alterando apenas a fonte, apesar de ter sido numericamente maior para fonte hidroxicloreto o nível de Cu no fígado não se diferenciou estatisticamente. Southern e Baker (1982) citam que a absorção do Cu é quantitativamente aumentada em aves durante desafio coccidiano, onde animais suplementados com níveis acima de 250 ppm apresentam sinais de toxicidade exacerbados, enquanto aves suplementadas com até 100 ppm do mineral não apresentaram este distúrbio. Resultados semelhantes aos encontrados neste estudo, aves suplementadas com 250 ppm de Cu na fase pré-inicial apresentaram sinais de toxicidade, podendo o desafio empregado no experimento ter contribuído para exacerbação dos mesmos; e aves suplementadas com 125 ppm de Cu de ambas as fontes não apresentaram 38 tais problemas. Zhao et al. (2016) citam serem o primeiro relato de impacto de altas doses de Cu e diferentes fontes de Zn, de forma que ao avaliarem a concentração de Zn no fígado não encontraram diferença estatística para os dois fatores. As respostas encontradas na atual pesquisa corroboram com as citadas anteriormente, os níveis de deposição de Zn não se diferiram em todos os tratamentos analisados. TABELA 14. Concentração de Cu e Zn no fígado de frangos aos 42 dias de idade. TRAT¹ Cu, ppm Zn, ppm SB+APC 13,38d 74,59 SA 16,65c 71,27 HCA 17,79c 64,42 HCS 20,50b 61,64 HCH 22,56a 58,71 CV (%) 32,54 27,55 P-valor <0,0001 0,120 ¹Tratamentos: SB+APC = 10 ppm de sulfato (SF) de Cu + 80 ppm de SF de Zn + avilamicina em todas as etapas da criação; SA = 125 ppm de SF de Cu + 80 ppm de SF de Zn em todas as etapas da criação; HCA = 125 ppm Cu hidroxicloreto (HC) + 80 ppm Zn HC em todas as etapas da criação; HCS = 200, 150, 125 e 125ppm Cu HC nas fases de criação pré-inicial (PI), inicial (I), crescimento (C) e final (F), respectivamente, + 80 ppm de Zn HC em todas as fases da criação ; HCH = 250, 200, 125 e 125ppm Cu HC nas fases PI, I, C, F, respectivamente + 80 ppm Zn HC todas as fases de criação. Cu, concentração de cobre no fígado; Zn, concentração de zinco no fígado; CV, coeficiente de variação. a, b, c, d = As médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna são estatisticamente diferentes (P <0,05) pelo teste de Tukey. As concentrações dos minerais Cu e Zn no plasma das aves com 21 e 42 dias de idade estão representadas na Tabela 15. Houve diferença estatística entre tratamentos para todas as variáveis analisadas. Para concentração plasmática de Cu aos 21 dias de idade (P <0,0001) os tratamentos SB+APC, HCA e HCS foram responsáveis pelas maiores concentrações, e os tratamentos SA e HCH obtiveram os menores resultados. Para a concentração plasmática de Zn aos 21 dias de idade (P <0,01) o HCA obteve o maior resultado, sendo que o HCH apresentou a menor concentração e os demais tratamentos não diferiram entre si. Resultados que mostram a possível melhor qualidade intestinal do SB+APC aos 21 dias provinda do APC, pelo fato do mesmo representar o menor nível de Cu suplementado e apresentar uma das maiores concentrações do mineral no plasma na idade citada. Os tratamentos que obtiveram menores resultados no plasma aos 21 dias, encontraram tais respostas pela possível pior qualidade intestinal ocasionada pelo desafio e antagonismo do Cu junto ao Zn, uma vez que os mesmos apresentaram menores quantidades de Zn plasmático. A concentração plasmática de Cu aos 42 dias (P <0,015) apresentou os seguintes resultados: o HCS foi responsável pela maior concentração, sendo o SA responsável pela menor, os demais tratamentos não diferiram dos mesmos 39 para a variável analisada. Aos 42 dias a concentração plasmática de Zn (P <0,0001) apresentou maiores resultados para os tratamentos que utilizaram a fonte hidroxicloreto e menores resultados para os tratamentos da fonte convencional sulfato. De modo geral, a fonte hidroxicloreto mostrou possível maior biodisponibilidade e menor interação entre os minerais, principalmente quando se analisa a concentração plasmática dos minerais entre o HCA e SA que possuem os mesmos níveis de inclusões variando apenas a fonte. Olukosi et al. (2018) sabendo do necessário sinergismo entre minerais, estudaram a