UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Química LUIS PAULO DE SOUSA COSTA Bioprospecção de fungos endofíticos da alga vermelha Pyropia spiralis Luis Paulo de Sousa Costa Departamento de Química Orgânica Araraquara 2016 LUIS PAULO DE SOUSA COSTA Bioprospecção de fungos endofíticos da alga vermelha Pyropia spiralis Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção doTítulo de Mestre em Química. Orientadora: Profª. Drª. Dulce Helena Siqueira Silva Araraquara 2016 FICHA CATALOGRÁFICA Elaboração: Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação Biblioteca do Instituto de Química, Unesp, câmpus de Araraquara Costa, Luis Paulo de Sousa C837b Bioprospecção de fungos endofíticos da alga vermelha Pyropia spiralis / Luis Paulo de Sousa Costa. – Araraquara : [s.n.], 2016 107 f. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Dulce Helena Siqueira Silva 1. Fungos endofíticos. 2. Alga marinha. 3. Metabólitos. 4. Fungos marinhos. 5. Microorganismos. I. Título. DADOS CURRICULARES Dados pessoais Nome: Luis Paulo de Sousa Costa Filiação: João Barroso Costa e Raimunda Sotero de Sousa Costa Nascimento: 25/08/1991 – Teresina-PI-Brasil Endereço profissional NuBBE “Núcleo de Bioensaio, Biossíntese e Ecofisilogia de Produtos Naturais” Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química de Araraquara - Universidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho”- UNESP, Araraquara - SP. Endereço eletrônico: luispaulo604@hotmail.com Formação acadêmica 2009-2014 Graduação: Licenciatura Plena em Química Instituição: Universidade Federal do Piauí – UFPI – Teresina- PI 2014-2016 Mestrado: Química, Área de Concentração - Química Orgânica Instituição: Universidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho”- UNESP- Instituto de Química de Araraquara- SP. Dissertação: Bioprospecção de fungos endofíticos da alga vermelha Pyropia spiralis Orientadora: Profª. Drª. Dulce Helena Siquiera Silva Bolsa: CAPES Produção bibliográfica Trabalhos publicados em anais de eventos A) New macrolides from marine red algae Pyropia spiralis endophytic fungus. In: 5th Brazilian Conference on Natural Products and the XXXI Meeting on Micromolecular, Evolution, Systematic and Ecology (RESEM) (26 a 29 de outubro de 2015 - Atibaia - SP) Participação em eventos científicos a) 5th Brazilian Conference on Natural Products and the XXXI Meeting on Micromolecular, Evolution, Systematic and Ecology (RESEM) (26 a 29 de outubro de 2015 - Atibaia - SP). AGRADECIMENTOS A UNESP e ao Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química- Araraquara, pela possibilidade do desenvolvimento deste trabalho. A prof. Dra. Dulce Helena S. Silva pela orientação, dedicação, compreensão, , muito obrigada pela confiança, sabedoria e apoio. Aos alunos do nosso grupo: Erika, Rebeca, Alana, Leonardo e aos ex- alunos; Camila, Teresinha, Neirilson e Airton. A prof. Dra. Angela Regina e ao prof. Dr. Alberto Cavalheiro que participaram do examede qualificação, e contribuíram para a finalização deste trabalho. Aos professores membros da banca prof. Dra. Angela Regina e prof. Edson Rodrigues, que gentilmente aceitaram o convite para avaliação desta dissertação. Aos professores do departamento de Química Orgânica em especial ao NuBBE por seus ensinamentos A todos os funcionários do IQ da Unesp. Ao querido Nivaldo Boralle pela realização dos espectros de RMN, por estar sempre disposto a compartilhar os seus conhecimentos. Ao técnico Marquinhos, por ser tão prestativo. Aos técnicos João e Juliana que sempre nos ajuda. A prof. Dr. Maria Cláudia M. Young, Profª. Drª. Carmen Lúcia Cardoso e ao prof. Dr. Paulo Michel P. Ferreira pela realização dos ensaios biológicos. Á CAPES pela bolsa concedida e ao Instituto de Química pelo apoio e estrutura. DEDICATORIA A DEUS por me conceder essa grande vitória, por sua presença e benção em minha vida. A minha Mãezinha Raimunda Sotero, que hoje está no céu Pois sei que seus ensinamentos, amor incondicional e carinho irão se perpetuar por toda minha vida e por ser meu maior exemplo e espelho na minha vida. A Meu Pai João Barroso, que tanto luta e batalha para dar o seu melhor por ser um homem integro. A Minha Irmã Ana Beatriz, por todo seu amor, carinho, atenção e apoio. Aos Meus Irmãos, João Henrique e Well Fernandes por todo incentivo, apoio e amor A toda Minha Família por acreditarem e me ajudaram a realizar esse tão querido sonho. As Minhas Avós Maria Sotero e Teresinha Barroso, por sempre me ajudarem, por suas doces palavras e abraços. Aos Meus Amigos de Teresina, por toda amizade e confiança Aos Meus Amigos do Piauí (nossa colônia) que estiveram junto durante esse tempo longe de nossa queria terra, amigos que certos momentos eram também minha família pelo total apoio em todos os momentos. Aos Amigos que aqui em Araraquara conquistei, do laboratório e UNESP pelos momentos que compartilhamos das reuniões com muita animação e alegria. em especial aos que convivi na Rep. Lira Vitor, João e Thulio. Enfim, a todos que contribuíram de forma direta ou indireta para a concretização deste trabalho. MUITO OBRIGADO !!! RESUMO Este trabalho consistiu no estudo dos micro-organismos Sarocladium strictum (Ps- 02) e Coniothyrium sp. (Ps-03) associados à macroalga vermelha Pyropia spiralis, coletada no litoral paulista. Os extratos foram obtidos em diferentes meios de cultivos: arroz, malte e Czapek, e induziram produção metabólica diversificada, conforme apontado pelas análises por CLAE-DAD e RMN de 1H, evidenciando que o perfil metabólico é dependente do meio de cultivo para estas linhagens. Os extratos e frações de Sarocladium strictum e Coniothyrium sp. foram avaliados em ensaios para atividade antifúngica, anticolinesterásica e citotóxica e apresentaram uma ou mais potenciais atividades. A fração Ps-03 A-ACN de Coniothyrium sp. apresentou atividade antifúngica e citotóxica, e foi selecionada para fracionamento por cromatografia em coluna sob pressão em modo reverso (C18) com eluição em gradiente H2O:MeOH. A purificação das frações por CLAE-DAD ou cromatografia flash em modo normal levou ao isolamento de uma dicetopiperazina, policetídeos e esteroides, que tiveram suas estruturas determinadas por análises na região do UV, RMN 1D e 2D, e por espectrometria de massas. Os policetídeos isolados neste estudo incluem três macrolídeos aromáticos (1 – 3): a (3R,5R)-sonnerlactona e dois análogos à sonnerlactona, sendo um inédito na literatura e outro, inédito como produto natural; o butenolídeo aromático gymnoascolídeo A (4), e a tetralona antiviral10-norparvulenona (7). Foram também obtidos os esteroides ergosterol-5,8- endoperóxido-∆6,22 (5) e 22E-ergosta-7,22-dieno-3β,5,6-triol (6), estruturalmente relacionados, provavelmente por rearranjo que inclui a abertura do anel endoperóxido e deslocamento da ligação dupla. A substância 8 uma dicetopiperazina: formada por unidades do aminoácido fenilalanina, e outra, do aminoácido treonina. Estes resultados confirmam a expressiva quimiodiversidade de fungos endofíticos de origem marinha, e seu potencial de bioatividade relevante, abrindo perspectivas atrativas para estudos de bioprospecção neste nicho ecológico Palavras-chave: fungo endofítico. Alga marinha. Metabólitos. Fungos marinhos. Micro-organismo ABSTRACT This work dealt with the study of fungal strains Sarocladium strictum (Ps-02) e Coniothyrium sp. (Ps-03) associated to the red macroalga Pyropia spiralis, collected at SP State shore. Their extracts were obtained in different culture media: rice, malt and Czapek, which induced diversified metabolic production, as shown by HPLC- DAD and NMR analyses and evidenced that the metabolic profile depends on culture media for these strains. Extracts and fractions from Sarocladium strictum and Coniothyrium sp. were evaluated in antifungal, anticholinesterasic and cytotoxic assays and presented one or more potential bioactivities. Fraction Ps-03 A-ACN from Coniothyrium sp. showed antifungal and cytotoxic activities, and was selected for reversed phase column chromatography under positive pressure and gradient elution with H2O:MeOH. Fractions purification by HPLC-DAD or normal phase column chromatography led to the isolation of one diketopiperazine, polyketides and steroids, which had their structural elucidation by UV, 1D and 2D NMR, and MS analyses. The polyketides isolated in this study include three aromatic macrolides (1 – 3): (3R,5R)- sonnerlactone and two sonnerlactone analogues: one novel compound and one novel as a natural product; the aromatic butenolide gymnoascolide A (4), and the antiviral tetralone 10-norparvulenone (7). Two steroids: ergosterol-5,8-endoperóxido- ∆6,22 (5) and 22E-ergosta-7,22-dieno-3β,5,6-triol (6) were also isolated. They are structurally related, probably due to rearrangement, which includes opening of the endoperoxide ring and double bond shift. Compound 8 is a diketopiperazine, that results from one unit phenylalanine and one of threonine. Such results confirm the strong chemodiversity of marine-derived endophytic fungi and their relevant bioactivity potential, which represents an open and attractive path towards deeper bioprospection studies on such ecological niche. Keywords endophytic fungi, marine alga, metabolites, marine fungi, microorganisms LISTA DE FLUXOGRAMAS Fluxograma 0.1- Cultivo das linhagens Ps-02 e Ps-03, e obtenção dos extratos brutos em diferentes meios líquidos. .................................................................................. 33 Fluxograma 0.2- Cultivo das linhagens Ps-02 e Ps-03, e obtenção dos extratos brutos em meio sólido. .......................................................................................................... 34 LISTA DE ESQUEMA Esquema 1. Catálise da acetiltiocolina e reação de Ellman .......................................... 42 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Cromatograma da F-5 por CLAE usando coluna RP18 e gradiente H2O:MeOH (95:05) por 40 min e detecção em 254 nm .................................................. 37 Figura 2. Cromatograma da análise de F-3 por CLAE usando coluna RP18 e gradiente H2O:ACN 28-65% em 40 min e detecção em 254 nm. .................................. 38 Figura 3. Cromatograma da F-2 por CLAE usando coluna RP18 e gradiente H2O:MeOH (95:05) por 40 min e detecção em 254 nm. ................................................. 39 Figura 4. Cromatograma ilustrando o decrescimento da atividade enzimática do ICER-AChEee na presença de inibidor padrão a 200 µmol L-1 . .................................... 43 Figura 5. Cromatogramas via CLAE usando coluna RP18 em gradiente exploratório dos extratos brutos e frações em diferentes meios de cultivo (a) Ps-02 Malte; (b) Ps- 02 A-ACN; (c) Ps-02 Czapek; (d) Ps-02 A-Aq. ................................................................. 46 Figura 6. Cromatogramas via CLAE usando coluna RP18 em gradiente exploratório dos extratos brutos e frações em diferentes meios de cultivo (a) P3-02 Malte; (b) Ps- 03 Czapek; (c) Ps-03 A-CN; (d) Ps-03 -Aq ........................................................................ 46 Figura 7. Espectros de RMN de ¹H de Ps-02 A-Hex (CDCl3, 300 MHz) e Ps-02- A- Aq e Acn, Ps-02 Malte e Czp (DMSO-d6, 300 MHz). ...................................................... 48 Figura 8. Espectros de RMN de ¹H de Ps-03 A-Hex (CDCl3, 300 MHz) e Ps-03- A- Aq e Acn, Ps-03 Malte e Czp (DMSO- d6, 300 MHz). ..................................................... 49 Figura 9. Espectro no Ultravioleta da Substância 1 ........................................................ 52 Figura 10. Espectro de RMN 1H da Substância 1 (CD3OD, 600 MHz) ....................... 53 Figura 11. Espectro de RMN 13C da Substância 1 (CD3OD, 150 MHz). ..................... 54 Figura 12. Espectro de RMN DEPT-135º da Substância 1 (CD3OD, 150 MHz). ....... 55 Figura 13. Mapa de correlações de COSY 1H-1H da Substância 1 (CD3OD, 600 MHz). ....................................................................................................................................... 56 Figura 14. Mapa de correlações de HMBC 1H-13C da Substância 1 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa) ...................................................................................... 58 Figura 15. Estrutura da Substância 1 ................................................................................ 59 Figura 16. Espectro no Ultravioleta da Substância 2 ...................................................... 61 Figura 17. Espectros de RMN de 1H das substâncias 1 e 2 (CD3OD, 600 MHz). ..... 62 Figura 18. Espectro DEPT-135º da substância 2 (CD3OD, 150 MHz) ......................... 63 Figura 19. Estrutura da Substância 2. ............................................................................... 65 Figura 20. Espectro de RMN de 1H da Substância 3 (CD3OD, 600 MHz). ................. 67 Figura 21. Espectro de RMN de DEPT-135º da substância 3 (CD3OD, 150 MHz). .. 68 Figura 22. Espectro de RMN de 13C da substância 3 (CD3OD, 150 MHz). ................. 69 Figura 23. Principais correlações de HMBC 1H-13C da Substância 3 .......................... 70 Figura 24. Estrutura da Substância 3 ................................................................................ 71 Figura 25. Espectro no Ultravioleta da Substância 04 .................................................... 72 Figura 26. Espectro de RMN de 1H da Substância 4 (CD3OD, 600 MHz). ................. 73 Figura 27. Espectro de RMN de 13C da Substância 4 (CD3OD, 150 MHz). ................ 74 Figura 28. Principais correlações de HMBC 1H-13C da Substância 4. ......................... 75 Figura 29. Estrutura da Substância 4. ............................................................................... 76 Figura 30. Espectro de RMN de 1H da Substância 5 (CD3OD, 600 MHz). ................. 80 Figura 31. Espectro de RMN de 13C da Substância 5 (CD3OD, 150 MHz) ................. 81 Figura 32. Espectro de RMN de 1H da Substância 6 (CDCl3, 600 MHz). .................... 84 Figura 33. Espectro de RMN de 13C da Substância 6 (CDCl3, 150 MHz). .................. 85 Figura 34. Espectro na região do UV da substância 07. ................................................ 87 Figura 35. Espectro de RMN de 1H da Substância 7 (CD3OD, 600 MHz). ................. 90 Figura 36. Espectro de RMN de 1H da Substância 8 (CD3OD, 600 MHz). ................. 93 Figura 37. Espectro de RMN de 13C da Substância 8 (CD3OD, 150 MHz). ................ 94 Figura 38. Mapa de correlações de HSQC 1H-13C da Substância 8 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa) ............................................................................................ 96 Figura 39. Mapa de correlações de COSY 1H-1H da Substância 8 (600 MHz, CD3ODa) .................................................................................................................................. 97 Figura 40. Mapa de correlações de HMBC 1H-13C da Substância 8 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa). ...................................................................................... 98 Figura 41. Substâncias isoladas de Coniothyrium sp ................................................... 103 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Compostos aprovados pela FDA para tratamento clínico ............................ 18 Tabela 2. Massa (mg) dos extratos brutos e frações em diferentes meios de cultivos para as linhagens de fungos Ps-02 e Ps-03 em escala reduzida .................................. 34 Tabela 3. Sistemas de eluentes otimizados para os ensaios biológicos em CCD dos extratos brutos e frações em diferentes meios de cultivos para os fungos Ps-02 e Ps- 03 em escala reduzida. ......................................................................................................... 35 Tabela 4. Atividade antifúngica e anticolinesterásica dos extratos brutos e frações dos fungos endofíticos e seus Rf. ....................................................................................... 50 Tabela 5. Atividade citotóxica dos extratos brutos e frações ......................................... 51 Tabela 6. Dados de RMN de 1H e 13C da Substância 1 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa) ................................................................................................................ 60 Tabela 7. Dados de RMN de 1H e 13C da Substância 2 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa) ................................................................................................................ 64 Tabela 8. Dados de RMN de 1H e 13C de substância 3 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa) ................................................................................................................ 71 Tabela 9. Dados de RMN de 1H e 13C da Substância 4 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa) ................................................................................................................ 77 Tabela 10. Dados de RMN de 1H e 13C da Substância 5 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa) ....................................................................................................... 79 Tabela 11. Dados de RMN de 1H e 13C da Substância 6 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, (CD3ODa) ...................................................................................................... 86 Tabela 12. Dados de RMN de 1H e 13C da Substância 7 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa) ........................................................................................................ 89 Tabela 13. Dados de RMN de 1H e 13C da Substância 8 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa) ........................................................................................................ 92 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 16 1.1 Organismos marinhos ....................................................................................................... 16 1.2 Fungos marinhos e sua quimiodiversidade ...................................................................... 19 1.3 Gênero Coniothyrium ....................................................................................................... 23 2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 28 3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 29 3.1 Materiais ........................................................................................................................... 29 3.1.1 Macroalga e micro-organismos associados ............................................................. 29 3.1.2 Solventes e equipamentos gerais ............................................................................. 29 3.1.3 Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ............................................................ 29 3.1.4 Cromatografia em coluna ........................................................................................ 30 3.1.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de Arranjo de Diodos (CLAE-DAD) ................................................................................................................... 30 3.1.6 Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio ...................................................... 30 3.1.7 Espectrometria de Massas ....................................................................................... 31 3.1.8 Cultivo dos fungos endofíticos: ............................................................................... 31 3.2 Métodos ..................................................................................................................... 31 3.2.1 Obtenção das cepas fúngicas .............................................................................. 31 3.2.2 Obtenção dos extratos ......................................................................................... 32 3.2.3 Fracionamento da Fração Acetonitrila de Ps-03 A-ACN (escala reduzida) ....... 35 3.2.4 Avaliação das atividades biológicas dos extratos brutos e frações. .................... 39 3.2.5 Identificação das cepas fúngicas.......................................................................... 44 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 45 4.1 Avaliação do perfil químico dos extratos brutos e frações obtidos em diferentes meios de cultivos (escala reduzida) dos fungos Ps-02 e Ps-03 ............................................................ 45 4.2 Perfil Cromatográfico dos extratos brutos e frações (escala reduzida) em CLAE-DAD 45 4.3 Perfil químico dos extratos brutos e frações (peq. escala) em RMN de 1 H. .................... 47 4.4 Avaliação das atividades antifúngica e anticolinesterásica .............................................. 50 4.5 Atividade citotóxica ......................................................................................................... 51 4.6 Identificação e Elucidação estrutural das substâncias produzidas pelo endófito (Ps-03) Conithyrium sp. .................................................................................................................... 51 4.6.1 Determinação estrutural da substância 1 ............................................................ 51 4.6.2 Determinação estrutural da substância 2 ............................................................ 60 4.6.3 Determinação estrutural da substância 3 ............................................................ 65 4.6.4 Determinação estrutural da substância 4. ............................................................ 72 4.6.5 Determinação estrutural da substância 5. ............................................................ 77 4.6.6 Determinação estrutural da substância 6. ............................................................ 82 4.6.7 Determinação estrutural da substância 7 ............................................................. 87 4.6.8 Determinação estrutural da substância 8 ............................................................. 91 5. CONCLUSÕES .............................................................................................................. 100 16 1 INTRODUÇÃO 1.1 Organismos marinhos Os oceanos ocupam cerca de 3/4 da superfície da Terra, são habitados por espécies de animais, plantas, esponjas, octocorais, ascídeas e briozoários, além de enorme quantidade de micro-organismos. As pesquisas com produtos naturais marinhos tiveram impulso acentuado na década de 50 com advento de grande investimento da indústria farmacêutica, além da popularização e desenvolvimento de técnicas de mergulho em maiores profundidades. Entretanto, estudos com micro e organismos marinhos vêm se desenvolvendo de maneira crescente a partir da década de 90, já que podem viver em condições adversas em ecossistemas extremos como em regiões polares e profundezas dos oceanos suportando altas pressões, em que a evolução e sobrevivência dessas espécies estimulam a compreensão do rico habitat marinho (PINTO et al., 2002; SCOPEL, 2012). Com o isolamento dos nucleosídeos antivirais espongouridina (I) e espongotimida (II) da esponja Cryptotethya cryptacom foi possível, somente após 15 anos, obter seus derivados sintéticos: citarabina (III) (Ara-C), utilizado no tratamento câncer e vidarabina (IV) (Ara-A), um antiviral. Outros exemplos de substâncias que foram aprovadas para uso clínico pela FDA (Food and Drug Administration) incluem o ziconotídeo, derivado do peptídeo ϖ–conotoxina (V), que foi isolado do molusco Conus magnus e é constituído por 25 aminoácidos, para uso no tratamento de dores crônicas, e que confirma ser viável e muito atrativo o uso de substâncias oriundas de organismos marinhos no desenvolvimento de novos fármacos. Foram relatados 2600 novos compostos oriundos de fontes marinhas entre os anos de 1963 e 2014 (BLUNT et al., 2015; BLUNT et al., 2016), sendo que só no ano de 2014 foram descritos 1378 compostos (BLUNT et al., 2016), o que mostra o intenso crescimento no interesse em compostos de origem marinha, em especial nos últimos 5 anos Este cenário é decorrente de importantes descobertas relacionadas com o estabelecimento do potencial de bioatividade de produtos naturais de fontes marinhas que resultaram no desenvolvimento de agentes terapêuticos, além dos já citados, como o mesilato de eribulina, obtido a partir do macrolídeo citostático halicondrina B, isolado a partir da esponja marinha Halinchodria okadai. O mesilato de eribulina, Halaven® foi aprovado pelo FDA em 2010 para tratamento de 17 pacientes com câncer de mama metastático (DYBDAL-HARGREAVES et al., 2015; COSTA-LOTUFO et al., 2009) Outro agente terapêutico, a trabectedina, é um alcaloide tetraidroisoquinolínico, isolado do tunicato marinho Ecteinascidia turbinata, encontrado nos mares das Caraíbas. Atualmente encontra-se aprovado pela Comissão Européia para tratamento de sarcomas de tecidos moles. A trabectedina é obtida por síntese química a partir da cianosafracina B, oriunda da cultura da bactéria Pseudomonas fluorescencs (COSTA-LOTUFO et al., 2009; BEESOO et al., 2014). Merece destaque também, o Brentuximab vendotin, um derivado sintético da dolastatina 10, um peptídeo citostático natural, que contém em sua estrutura várias unidades de aminoácidos, e foi isolado a partir do molusco marinho Dolabella auricularia. A dolastatina 10 foi relatada pela primeira vez em 1987 por Pettit et al., (1987) e estudos posteriores evidenciaram que a dolastatina é produzida pela cianobacteria Symploca sp., que são consumidas pelo molusco como alimento (PETTIT et al., 2001). Além destes, estudos recentes demonstram a importância de ácidos ômega-3 na dieta, como forma de proteção ao sistema nervoso central, bem como por suas propriedades, que auxiliam no combate de patologias como o câncer, asma, diabetes, hipertensão arterial, distúrbios neurológicos e doenças cardiovasculares. Estas descobertas contribuíram para a aprovação do éster etílico de ácidos ômegas- 3 como agente terapêutico para tratamento de hipertrigliceridemia (VAZ et al., 2014) Atualmente existem 07 compostos de origem marinha aprovados pela FDA (Tabela 01) com atividade antitumoral, anti-inflamatória, antiviral ou anti- hipertrigliceridemia, utilizados no tratamento clínico. 18 . Tabela 1. Compostos aprovados pela FDA para tratamento clínico Ano de aprovação Composto Organismo marinho Uso 1969 Citarabina (Ara-c) Esponja Câncer: Leucemia 1976 Vidarabina (Ara-A) Esponja Antiviral 2004 Ziconotídeo Caracol (molusco) Dor crônica 2010 Mesilato de Eribulina Esponja Câncer de mama 2004 Omega-3-ácido-etil ésteres Peixe Hipertrigliceridemia 2015 Trabectedina (ET-743) Tunicato Câncer de ovário e sarcoma 2011 Brentuximab vedotina (SGN-35) Molusco Câncer linfomas Fonte: NH2-CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC-CONH2 N NH O O R O OH H HOH H OH H N N NH2 O O OH H HOH H OH H N O OH H HOH H OH H N N N NH2 I - R = H II - R = CH 3 III IV V 19 1.2 Fungos marinhos e sua quimiodiversidade Fungos marinhos podem ser classificados em dois grupos: obrigatórios e facultativos. Fungos marinhos obrigatórios são aqueles que crescem e esporulam exclusivamente em ambiente marinho ou estuário, enquanto os facultativos podem viver em água doce ou ambiente terrestre e são capazes de crescer e esporular no ambiente marinho (KOHLMEYER & KOHLMEYER, 1979). Até 2010 foram listadas 530 espécies de fungos obtidos do ambiente marinho distribuídos em 03 filos e 321 gêneros, grande parte pertencente ao filo Ascomycota, com 424 espécies (pertencentes a 251 gêneros), 94 espécies anamórficas (pertencentes a 61 gêneros) e apenas 12 espécies inseridas em Basidiomycota (distribuídas em 09 gêneros) (EBEL e RATEB, 2011). Estes podem estar presentes de forma independente ou associados a diversos nichos como plantas marinhas, incluindo algas, ervas marinhas e plantas de mangue, bem como em invertebrados marinhos, principalmente em esponjas, corais, acídias e crustáceos, e ainda, em vertebrados (peixes) ou, matéria inorgânica (solos e sedimentos) (WIESE et al., 2011). Os micro-organismos marinhos são capazes de produzir uma grande diversidade metabólica em função das condições de crescimento incluindo diversos parâmetros como fonte de nutrientes, temperatura e tempo de cultivo, tipo de água (mar e ultrapura), dentre outros, produzindo grande variedade de produtos naturais como policetídeos, terpenoides, alcaloides, peptídeos, além de metabólitos de biossíntese mista. Muitos destes têm mostrado também enorme diversidade de substâncias bioativas, sendo muitas pertencentes a classes químicas novas e sendo ainda não encontradas em fontes terrestres. A importância destes micro-organismos, produtores de substâncias bioativas, é evidenciada pelo grande número de novos compostos isolados. De acordo com Blunt e colaboradores (2016), 540 novos compostos de micro-organismos de origem marinha foram relatados entre 2013 e 2014, sendo que a fonte predominante de diversidade de fungos são as algas, seguidas por esponjas e espécies do habitat de mangues (EBEL e RATEB, 2011). Desde o primeiro metabólito bioativo isolado do fungo Cephalosporium sp. obtido de água do mar, o antibiótico cefalosporina C (VI), em 1951 (BURTON e ABRAHAM, 1951), os fungos marinhos têm se revelado uma fonte atrativa para a descoberta de novas substâncias e agente antivirais, antibacterianos, antiplasmódicos, anti-inflamatórios e anticancerígenos (DUARTE et al., 2012). 20 Sendo as algas detentoras da maior diversidade de micro-organismos, muitos estudos têm focalizado em algas de diferentes filos (Rhodophyta, Chlorophyta, Phaeophyta) na busca por linhagens fúngicas associadas para investigação químico-biológica. O estudo do fungo Aspergillus sp., isolado da alga verde Halimeda copiosa, levou ao isolamento da dicetopiperazina halimida (VII), que apresentou potente atividade citotóxica contra células de carcinoma de ovário e cólon. Para a obtenção de análogos visando à otimização da bioatividade, foram planejadas modificações estruturais que forneceram a plinabulina (VIII), atualmente em fase III de testes clínicos para o desenvolvimento de agente terapêutico antitumoral (Clinical Trials, 2015). Outros exemplos da diversidade estrutural dos metabólitos produzidos por fungos são apresentados no estudo realizado por Vita-Marques e colaboradores (2008), que investigaram o fungo Beauveria felina associado à alga Caulerpa sp. Este estudo levou ao isolamento de dois novos derivados do ciclodepsipeptídeo destruxina, que apresentou potencial inseticida e também foram isoladas do fungo de solo Metarhizium anisopliae. Estes derivados, a pseudodestruxina C (IX) e destruxina E β-Me-Pro chlorohydrin (X) apresentaram potencial acaricida (MORAIS- URANO et al., 2012). S N COOH CH2OAc O NH O HOOC HNH2 H VI NH NH O O N NH NH NH O O N NH VII VIII 21 Zhang e colaboradores (2014) isolaram do fungo Paecilomyces variotii da alga vermelha Grateloupia turuturui um novo alcaloide, varioxepine A (XI), com atividade contra fungo patogênico Fusarium graminearum. Da cultura do fungo Penicillium steckii isolado da alga do gênero Sargassum identificou-se o (S)-8-metoxi-3,5- dimetilisochroman-6-ol (XII) com atividade antimicrobiana (KOSSUGA et al., 2011). Os endófitos isolados de algas vermelhas (Rodofíceas) apresentam em geral substâncias com estruturas químicas interessantes e potencial biológico. Dentre estas, destacam-se os macrolídeos XIII e XIV, do tipo curvularina, isolados de Curvularia sp., que apresentaram atividade antifúngica e antibacteriana, bem como um novo derivado indoloditerpênico (XV) isolado do fungo Aspergillus oryzae , que foi obtido da alga vermelha Heterosiphonia japonica. Outros exemplos incluem policetídeos como o 2-carboxi-8-metoxi-naftalenol (XVI), que apresentou atividade N O O N H N O N H O O O N O N O O N H N O N H O O O N O OH Cl IX X O N N NH O O OO XI O OOH XII 22 citotóxica e contra o fitopatógeno Cladosporium cucumerinum e foi obtido da cultura do fungo associado à alga vermelha Kappaphycus alvarezii, e ainda, o acremonisol A (XVII), um policetídeo aromático isolado do fungo Acremonium sp. associado à alga Plocamium sp. (DAI et al, 2010; QUIAO et al, 2010; PONTIUS et al, 2008; TARMAN et al, 2011), que evidenciam a quimiodiversidade marcante apresentada por fungos associados a algas vermelhas. OH O O O O O OH OH O OCH3O O XIII XIV N OH O O H H H H OCH3 OH COOH Cl COOH OCH3 H3CO XV XVI XVII 23 A partir da cultura do fungo Cladosporium sp., associado a alga Pyropia yezoensis, Ding et al. (2008) isolaram o ácido fenil-acético (XVIII), L-β-fenil-lático (XIX) e o tirosol (XX), que apresentaram forte atividade antimicrobiana. O desenvolvimento de estudos com fungos endofíticos apresentam diversas vantagens em relação outros organismos, por exemplo, por apresentarem crescimento mais rápido, demandarem menor espaço para cultivo, além de representarem uma fonte renovável de material para as pesquisas e aplicações. Além disso, modificações no tipo de meio de cultivo (fonte de carbono) e/ou condições como temperatura, pH, aeração, dentre outras, podem controlar ou direcionar os processos de produção metabólica de interesse (GLOER, 2007). Estas considerações permitem prever uma ampla gama de investigações visando aplicações biotecnológicas para produtos oriundos ou derivados de fungos endofíticos, com destaque para aqueles associados a organismos marinhos. 1.3 Gênero Coniothyrium O gênero Coniothyrium pertence ao filo Ascomycota e família Leptosphaeriaceae, possuindo algumas espécies relatadas em ambiente marinho, segundo a base de dados acessada em www.marinespecies.org. Algumas espécies são relatadas como fitopatogênicas, como Coniothyrium diplodiella, associado à podridão branca de uvas (ZHANG et al., 2013). OH O OH OH O OH OH XVIII XIV XX 24 O estudo com o fungo Coniothyrium cereale, isolado da alga Enteromorpha sp. levou ao isolamento de uma série de derivados de fenalenonas (XXI) (ELSEBAI et al., 2011), policetídeos (XXII) e alcaloides (XXIII) com atividades antimicrobiana, citotóxica (ELSEBAI et al,. 2011a, 2011b). Diversos estudos relatam o isolamento de substâncias bioativas a partir de espécies de Coniothyrium obtidas de plantas terrestres. Krohn e colaboradores (2008) estudaram o fungo Coniothyrium sp., isolado da Sideritis chamaedryfoliai, isolando nitronaftalenos (XXIV e XXV) com atividade antibacteriana e antifúngica, e inibição do crescimento de algas. De Carpobrotys edulis, espécie ornamental conhecida como ‘chorao-da-praia’, foi isolado o fungo Coniothyrium sp., cujos extratos revelaram a presença de massarilactona (XXVI), massarigenina E (XXVII) e coniothyrenol (XXVIII), espirolactonas com potencial antimicrobiano e herbicida (KOCK et al., 2007). Uma nova classe de antibióticos, as palmarumycinas C2, C3 e C5, apresentou atividades antibacteriana, antifúngica e herbicida, e foi isolada de cultura de Coniothyrium sp., obtido de alga marinha. A determinação estrutural da palmarumycinas XXIX, XXX e XXXI foram realizados por análise de raios-X (KROHN et al, 1994). Estudos com linhagens de Coniothyrium sp. isoladas de solo revelaram a presença da coniothyriomycina (XXXII), uma imida de cadeia aberta, de estrutura relativamente simples, com forte potencial antifúngico. Posteriormente Krohn et al., (1992) realizaram estudos de estrutura e atividade de seus análogos sintéticos. 25 OO O OH OH OH OOH OH O O O H O NH OOH OH CHO XXI XXII XXIII OH OCH3NO 2 O2N OCH3 OCH3NO2 NO2 O O OH O OH OH XXIV XXV XXVI OH OH OH O O OH OH H OH H OH OH H XXVII XXVIII 26 A espécie Coniothyrium minitans é considerada um micoparasita (antagonista) que realiza o controle biológico de fitopatógenos como as espécies Sclerotinia sclerotiorum e Sclerotinia cepivorum, responsáveis por causar o mofo branco em plantas. A cultura de Coniothyrium minitans em meio líquido de Czapek forneceu como metabólito majoritário o macrosphelídeo A (XXXIII) (McQUILKEN et al, 2003). A investigação de linhagem de Coniothyrium sp., realizada por HUSSAIN et al., (2014), levou ao isolamento de um novo éter fenoxi-fenílico (XXXIV) e outros compostos já conhecidos, como o coniol (XXXV) e (+)-epoxydon (XXXVI) que apresentaram atividade antibacteriana contra Bacilus megaterium e inibidora do crescimento da alga Chlorella fusca. O OH O OO O OH O OO OH O O O OO O XXIX XXX XXXI Cl OH O NH O O OCH3 XXXII O O OH O O O O OH XXXIII 27 Para este estudo foram selecionados fungos endofiticos isolados da alga marinha vermelha Pyropia spiralis, visando contribuir para o conhecimento da quimiodiversidade de fungos de origem marinha e explorar as potencialidades biológicas e biotecnológicas de organismos oriundos da costa brasileira como fonte de metabólitos biologicamente ativos. O ambiente marinho é ainda subexplorado no Brasil e os esforços direcionados a um maior conhecimento de suas características podem também contribuir para ações que visem à protecao dos frágeis ecossistemas num contexto que privilegie o desenvolvimento sustentável. OH O OH OH O OH O O OH OH XXXIV XXXV XXXVI 28 2. OBJETIVOS Objetivo geral: estudar quimicamente as linhagens de fungos isolados da alga vermelha marinha Pyropia spiralis e avaliar seu potencial de bioatividade Objetivos específicos: - Classificar os fungos isolados (Ps-02 e Ps-03) obtidos da alga Pyropia spiralis. - Fracionar os extratos e purificar as substâncias presentes nos extratos dos fungos que se mostrarem mais promissores do ponto de vista químico e de bioatividade. - Avaliar o potencial dos extratos, frações e substâncias puras frente aos diferentes ensaios biológicos; antifúngico, anticolinesterásico e citotóxico. - Identificar ou elucidar as estruturas químicas das substâncias isoladas através da combinação de métodos espectroscópicos (RMN de 1H e de 13C, uni e bidimensionais, UV, IV) e espectrométricos (EM, CLAE-EM e CG-EM), conforme suas características estruturais. 29 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Materiais 3.1.1 Macroalga e micro-organismos associados A macroalga Pyropia spiralis (Ps) foi coletada no Litoral do Estado de SP, na praia da Fortaleza, próxima a Ubatuba, para isolamento dos micro-organismos associados. Uma excicata da alga foi identificada pela Dra. Nair Yokoya e depositada no Herbario do Instituto de Botânica (SMA/SP). As linhagens fúngicas isoladas foram identificadas como Sarocladium strictum (Ps-02) e Coniothyrium sp. (Ps-03) pela empresa Genotyping (Botucatu/SP). 3.1.2 Solventes e equipamentos gerais Foram utilizados solventes padrões analíticos (PA) das marcas Synth, Dinâmica, Vetec, Merck, Ecibra: Diclorometano (DCM), clorofórmio, metanol (MeOH), acetato de etila, n-hexano, acetonitrila (MeCN). Estes solventes foram usados para extração, fracionamento e obtenção de perfil por cromatografia em camada delgada (CCD). Os solventes Deuterados: CDCl3, DMSO-d6 e CD3OD (CIL, Acros ou Sigma- Aldrich) foram utilizados para análises de RMN. Os extratos e frações foram concentrados em evaporador rotatório da Buchi R- 114, sob pressão reduzida com auxílio de bombas de vácuo FABBE; Banho termostático Marconi BTC-9090. Foram ainda utilizados: Autoclave vertical Phoenix Luferco; Câmara de Fluxo laminar vertical da marca Pachane; Balanças Mettler Toledo AG245 e AG204 (analíticas) e Marconi BG2000 (semi-analítica). 3.1.3 Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Para as análises por CCD foram utilizadas placas comerciais (marca Whatman) de sílica gel 60 com indicador de fluorescência (UV254), 0,20 mm de espessura. 30 3.1.4 Cromatografia em coluna As cromatografias em coluna (CC) foram realizadas em colunas de vidro, empregando como fase estacionária sílica modo reverso do tipo octadesil silano (C18), da marca Sorbent Technologies, com porosidade de 60 Å e tamanho de partículas de 40-75 µm (200-400 mesh), sílica para cromatografia flash, fase normal (40-60 µm) (Acros Organics), e ainda Sephadex LH–20 para cromatografia por exclusao. As dimensões das colunas variaram de acordo com a quantidade de material a ser aplicado. 3.1.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de Arranjo de Diodos (CLAE-DAD) As análises por CLAE-DAD foram realizadas em dois equipamentos Shimadzu com detector ultravioleta em arranjo de diodos (DAD): - Analítico: duas bombas LC-20AT, degaseificador DGU-20A3, comunicadora CBM- 20A, injetor automático SIL-20A, detector de arranjo de diodos SPD-M20A, - Analítico e Semireparativo: duas bombas LC-6AD, comunicadora CBM-20A, injetor automático (modo analítico) SIL-10AF, detector de arranjos de diodos SPD-M20A. O tratamento dos dados foi realizado utilizando o software Shimadzu LC solution (versão 1.23 SP1). Foram utilizadas colunas C-18 Phenomenex Gemini e Luna (250 x 4.60 mm; 5 µm; 110Å) no modo analítico e coluna C-18 Phenomenex Luna (250 x 10 mm; 5 µm; 110Å) no modo semipreparativo. 3.1.6 Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio Os espectros de RMN uni e bidimensionais foram realizados em dois espectrômetros, Bruker Fourier 300 com campo magnético de 7,0 T e Bruker Ascend III 600 com campo magnético de 14,1 T. Além dos solventes deuterados especificados acima, TMS foi utilizado como referência interna. 31 3.1.7 Espectrometria de Massas Os espectros de massas de alta resolução foram obtidos em um espectrômetro de massas modelo UltrOTOFQ (ESI-TOF Mass Spectrometer, Bruker Daltonics), operando no modo positivo ou negativo. Condições do Experimento: Bomba de infusão. Fluxo 250μL/h. Fase móvel para a solubilização: CH3OH 100% ou CHCl3 100%. Modo de detecção: positivo e negativo para as amostras. 3.1.8 Cultivo dos fungos endofíticos:  Meios de cultivo: - BDA (Acumedia): Batata Dextrose Ágar: 39 g L-1 de água; - Czapek: Sacarose (30 g.L-1), NaNO3 (3,0 g.L-1), Na2(PO4)3 (1,0 g.L-1), MgSO4 (0,5 g.L-1), KCl (0,5 g.L-1) e FeSO4 (0,01 g.L-1); - Malte (extrato de malte) de concentração de 20 g.L-1; - Arroz comercial. Os meios líquidos de cultura foram submetidos à esterilização em autoclave (Quimis) a 121°C por 20 minutos e o meio sólido foi esterilizado três vezes a cada 24 horas, a 121°C por 20 minutos. 3.2 Métodos 3.2.1 Obtenção das cepas fúngicas Em junho de 2013 foi realizada a coleta, no costão direito da praia da Fortaleza, Ubatuba - SP, de pequenas quantidades da alga Pyropia spiralis (PS) para o isolamento dos fungos endofíticos. Foram escolhidos espécimes saudáveis, que foram lavados cuidadosamente em água do mar e armazenados em frascos contendo água do mar coletada no mesmo local e esterilizada por autoclavagem, e o antibiótico cloranfenicol (200 mg L-1), visando a inibicao de proliferacao bacteriana. 32 Estes frascos foram acondicionados em caixas térmicas e transportados ao Instituto de Química de Araraquara-UNESP. Já no laboratório, a alga foi esterilizada superficialmente por imersão em solução de NaOCl 1% por 5 segundos seguida de lavagem com água do mar estéril por 10 minutos. O procedimento de esterilizacao foi otimizado com base em análises prévias, em que foram testadas variacoes na concentracao de NaOCl e no tempo de imersao. As condicoes adotadas foram suficientes para a esterilizacao sem danificar os tecidos da alga ou fungos endofíticos, o que foi confirmado pelo sucesso na obtencao das linhagens fúngicas a partir da alga. Após o processo de esterilização, a alga foi fragmentada com uso de pinça e bisturis cirúrgicos estéreis e transferida para placas de Petri contendo meio de cultivo de batata-dextrose-ágar (BDA), água do mar ou água MilliQ esterilizadas e o antibiótico cloranfenicol (200 mg L-1). Em cada placa foram colocados 4 fragmentos da alga e para cada método foram usadas 2 placas preparadas com água MilliQ e duas placas com água do mar. Para controle da eficácia do método de esterilização, uma alíquota de água de lavagem foi inoculada em BDA/água MiliQ e BDA/água do mar. O crescimento dos fungos foi monitorado e repiques sucessivos foram realizados até a obtenção das linhagens puras, preservadas em “slants” (frascos contendo água do mar ou água MiliQ estéril e o fungo em meio sólido MDA), que foram lacrados e mantidos em temperatura ambiente. A partir da alga PS foram isoladas 3 linhagens (PS-01 – PS-03). Vale ressaltar que a linhagem fúngica PS-01 foi isolada em placas de Petri contendo meio de cultivo preparado com água MilliQ, enquanto as linhagens PS-02 e PS-03 em água do mar. 3.2.2 Obtenção dos extratos As linhagens fúngicas isoladas denominadas Ps-02 e Ps-03 foram preservadas em “slants” e repicadas em placas de Petri contendo BDA (Batata Dextrose Agar). Após o crescimento (10 dias) fúngico, aproximadamente um terço de micélio de cada placa de Petri foi inoculado em meio líquido de Malte e Czapek, (Fluxograma 01) ou em meio sólido de Arroz (Fluxograma 02) para obtenção dos extratos em escala reduzida. Paralelamente foi realizado o branco (controle negativo) em todos os meios seguindo a mesma metodologia sem a inoculação dos fungos endofíticos. 33 Os solventes orgânicos foram eliminados utilizando evaporador rotatório a pressão reduzida, fornecendo os respectivos extratos brutos (Tabela 02). Os solventes recuperados foram adequadamente descartados em frascos previamente rotulados e encaminhados à recuperação ou descarte conforme as Normas Gerais de Gerenciamento de Resíduos Químicos no IQ/UNESP presente no site: www.iq.unesp.br/APOIO-TECNICO/normasresiduos.pdf. Fluxograma 0.1- Cultivo das linhagens Ps-02 e Ps-03, e obtenção dos extratos brutos em diferentes meios líquidos. Crescimento: 600 mL (Malte e Czapek) 3 Erlenmeyrs de boca larga http://www.iq.unesp.br/APOIO-TECNICO/normasresiduos.pdf 34 Fluxograma 0.2- Cultivo das linhagens Ps-02 e Ps-03, e obtenção dos extratos brutos em meio sólido. . Tabela 2. Massa (mg) dos extratos brutos e frações em diferentes meios de cultivos para as linhagens de fungos Ps-02 e Ps-03 em escala reduzida Extratos Ps-02 Ps-03 Czapek 20 110 Malte 71 58 Fração Hexânica 1,233 960 Fração Acetonitrila 570 760 Fração Aquosa 290 631 Os extratos brutos obtidos em meios líquidos e frações no meio sólido em pequena escala foram submetidos aos ensaios biológicos para orientar a escolha das amostras para prosseguimento do estudo. Além disso, foram realizadas análises por RMN de 1H e CLAE-DAD em gradiente exploratório, a fim de estabelecer o perfil químico das amostras, o que também contribuiu para a seleção daquelas mais promissoras para prosseguimento do estudo, bem como para traçar estratégias de separação por técnicas cromatográficas, incluindo CLAE. Crescimento 21 dias - Solub. AcOEt(minimo) - 3x ½ H2O - Evap. solvente - Solub. ACN (minimo) - 3x ½ Hexano - Evap. solvente -6x200 mL de AcOEt a cada 12 hs -Filtração à vacuo - Evap. solvente Crescimento: 90,0 g de Arroz e 75 mL e água do mar em 3 Erlenmeyrs de boca larga 35 Antes das análises por CLAE-DAD em modo analítico, cada amostra (3,5 mg) foi solubilizada em 1 mL de solução MeOH (95 %) e submetida a procedimento de limpeza utilizando cartucho de sílica C-18 acoplados a membrana Millipore® (0,2 µm). Após este procedimento, as amostras (3,5 mg mL-1) foram armazenadas em frascos para injeção. O sistema utilizado para análise em CLAE-DAD foi coluna analítica Phenomenex Gemini (250 x 4.60 mm; 5 µm; 110Å) tipo octadesil silano (C- 18), com injeção de 20,0 μL e eluição em gradiente exploratório H2O:MeOH (95:05 v/v) à (0:100 v/v) por 40 min., com detecção de λ = 200 nm até 800 nm. Nas análises por CCD foram testados vários sistemas de eluição (Tabela 03) com diferentes solventes, a fim de obter melhor perfil para os extratos. Foram utilizadas placas comerciais (marca Whatman) de sílica gel 60 com indicador de fluorescência (UV 254 nm) e 0,20 mm de espessura. . Tabela 3. Sistemas de eluentes otimizados para os ensaios biológicos em CCD dos extratos brutos e frações em diferentes meios de cultivos para os fungos Ps-02 e Ps-03 em escala reduzida. Extratos Ps-02 Ps-03 Czapek CHCl3:MeOH: H2O 65:30:05 CHCl3:MeOH 88:12 Malte CHCl3:MeOH 8:2 CHCl3:MeOH: H2O 65:30:05 Fração Hexânica CHCl3:MeOH 9:1 CHCl3:MeOH 9:1 Fração Acetonitrila CHCl3:MeOH 8:2 CHCl3:MeOH 88:12 Fração Aquosa CHCl3:MeOH: H2O 65:30:05 CHCl3:MeOH: H2O 65:30:05 3.2.3 Fracionamento da Fração Acetonitrila de Ps-03 A-ACN (escala reduzida) A análise do cromatograma em CLAE-DAD de Ps-03 A-ACN, permitiu realizar um fracionamento por cromatografia em coluna (13 cm de altura e 3,5 cm de diâmetro) sob pressão, utilizando como fase estacionária sílica modo reverso (C18, 65 g) e como fase móvel o sistema de eluentes em gradiente H2O:MeOH (Fluxograma 03), resultando em 7 frações (60,0 mL cada). 36 . Fluxograma 0.3- Fracionamento da amostra Ps-03 A-ACN de Coniothyrium sp. CC,C-18 (13 X 3,5 cm ) H2O:MeOH 37 As frações obtidas foram submetidas a análise por CLAE-DAD nas mesmas condições descritas no item 3.3. Após esta análise, a fração 5 (Figura 1) foi submetida à separação por CLAE-DAD semipreparativa, na qual a amostra foi solubilizada e submetida a etapa de limpeza utilizando cartuchos de sílica C-18. Posteriormente, a amostra foi seca e diluída em solução de H2O:MeOH de mesma polaridade do início da corrida, e com volume necessário para as amostras apresentarem concentração de 20 mg.mL-1. Antes da injeção as amostras foram devidamente filtradas em membranas PTFE (0,22 µm). A coluna utilizada foi C-18 Phenomenex Luna (250 x 10 mm; 5 µm; 110Å) e a eluição em gradiente 65-100% MeOH ocorreu em 30 min com vazão de 3,5 mL.min-1. Este procedimento levou ao isolamento das substâncias 1 (14,0 mg), 2 (3,0 mg) e 4 (4,0 mg). Figura 1. Cromatograma da F-5 por CLAE usando coluna RP18 (analítica) e gradiente H2O:MeOH (95:05) por 40 min e detecção em 254 nm A fração 3 (Figura 2) também foi submetida a separação por CLAE-DAD semipreparativa, coluna C-18 Phenomenex Luna (250 x 10 mm; 5 µm; 110Å) com eluição em gradiente H2O:ACN 28-65% em 40 min e vazão de 3,5 mL.min-1, que resultou no isolamento da substância 3 (6,4 mg). 01 02 04 38 Figura 2. Cromatograma da análise de F-3 por CLAE usando coluna RP18 (analítica) e gradiente H2O:ACN 28-65% em 40 min e detecção em 254 nm. Para substância 8, foi coletado um sinal cromatográfico em 20,50 minutos (Figura 2), denominado F3-6 (15,0 mg). Em seguida foi realizado o fracionamento cromatográfico em coluna (30 cm x 2 cm) de sephadex LH-20, utilizando como fase móvel metanol e diclorometano em proporção 1:1. Após análises por CCDC utilizando como eluentes Hex : AcOEt 6:4 após revelar uma mancha amarela, sugerindo pureza suficiente para sua identificação por análise espectrométrica. A análise dos espectros de RMN 1H e 13C permitiu a identificação da substância 8 (10,0 mg). A fração 7 (0,230 g) foi submetida a fracionamento cromatográfico flash em coluna (19cm x 2 cm) de gel de sílica (34,0 g) sobre pressão, utilizando hexano, acetato de etila e metanol em diferentes proporções como fase móvel para eluição em gradiente crescente de polaridade. Após remoção do solvente e análises por CCDC, as frações foram reunidas por similaridade dos fatores de retenção (Rf) e manchas na placa após revelação. Os grupos denominados F7-16 e F7-32, após análises por CCDC utilizando como eluentes Hex:AcOEt 6:4 e AcOEt:MeOH 75:25, respectivamente, revelou a presença de apenas uma mancha para cada fração, sugerindo pureza suficiente para sua identificação por análise espectrométrica. A análise dos espectros de RMN 1H e 13C permitiram a identificação das substâncias 5 (6,0 mg) e 6 (5,0 mg). 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 min -250 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 mAU 254nm,4nm (1.00) 03 08 39 A fração 2 (Figura 3) também foi submetida a separação por CLAE-DAD semipreparativa, coluna C-18 Phenomenex Luna (250 x 10 mm; 5 µm; 110Å) com vazão de 4,0 mL.min-1, em gradiente 30-60% H2O:MeOH em 30 min, que resultou no isolamento da substância 7 (4,0 mg). Figura 3. Cromatograma da F-2 por CLAE usando coluna RP18 (analítica) e gradiente H2O:MeOH (95:05) por 40 min e detecção em 254 nm. 3.2.4 Avaliação das atividades biológicas dos extratos brutos e frações. 3.2.4.1 Avaliação da atividade anticolinesterásica A atividade anticolinesterásica foi detectada por teste em CCD a partir da eluição dos extratos brutos e frações em concentração de 200 µg.mL-1, utilizando as fases móveis descritas acima (tabela 02). As cromatoplacas foram nebulizadas com uma solução da enzima acetilcolinesterase, e incubadas em câmara úmida fechada a 37ºC por 20 minutos. Após este período foi borrifada uma solução C (contendo 10 mL da solução A e 40 mL da solução B, sendo: Solução A: 250 mg de acetato de 1- naftila em 100 mL de etanol. Solução B: 400 mg do sal Fast Blue B em 160 mL de água destilada). Como padrão positivo foi utilizado o composto fisostigmina (0,05 µg 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5 min -50 -25 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 mAU 280nm,4nm (1.00) 07 40 mL-1) (MARSTON, 2002). Este ensaio foi realizado sob a supervisão da Drª. Maria Claudia Marx Young (Instituto de Botânica, SMA/SP). 3.2.4.2 Avaliação da atividade antifúngica . Os extratos brutos e frações em concentrações de 400 µg mL-1 foram eluídos em CCDC, utilizando fase móvel de acordo com a tabela 02. As cromatoplacas foram nebulizadas com solução de esporos dos fungos fitopatogênicos Cladosporium sphaerospermum e C. cladosporioides (concentração de 5x107 esporos.mL-1, em solução de glicose e sais) (HOMANS e FUCHS, 1970; RAHALISON, 1994). As placas foram incubadas a 25º C por 48 horas, na ausência de luz. O padrão positivo utilizado para comparação foi a nistatina (1 µg mL-1). Este ensaio foi realizado também sob a supervisão da Drª. Maria Claudia Marx Young (Instituto de Botânica, SMA/SP). 3.2.4.3 Avaliação do potencial citotóxico. As análises foram realizadas no Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia Marinha (LaBBMar, Universidade Federal do Ceará). O ensaio se baseia na medida da absorbância do formazan formado após a metabolização do sal de MTT pelas células tumorais viáveis (MOSMANN, 1983). Células tumorais de adenocarcinoma de cólon (HCT-116) e mama (MCF-7) cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino foram aplicadas em placas de 96 poços e expostas às amostras por 72 horas. Três horas antes do término do tempo de incubação, o sal de MTT (0,5 mg.mL-1) foi adicionado e a absorbância mensurada a 595 nm. A triagem inicial foi realizada utilizando 2 concentrações das amostras para avaliar a porcentagem de inibição do crescimento da célula tumoral (%GI). Para amostras que demonstraram inibição maior que 75%, o valor de CI50 é calculado por regressão não linear utilizando o GraphPad Prism 4.0 (Intuitive Software for Science). 41 3.2.4.3 Avaliação da atividade antimicrobiana. Foram selecionadas a fração Ps-03 Acn e subfrações F-3, F-5 e F-7 frente aos patógenos humanos Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853); Escherichia coli (UBC 8161); Staphylococcus aureus resistente a meticilina - MRSA (ATCC33591); Bacillus subtilis (H344) e Candida albicans (ATCC 90028). Foram adicionados inicialmente 5 mL de meio líquido Muller Hinton (MHB - Muller Hinton Broth) em um tubo Falcon de 15 mL juntamente com um repique da placa de ágar Muller Hinton (MHA - Muller Hinton Agar) de cada patógeno. Estes foram incubados a 37ºC (ou 30ºC para B. subtilis) por 18 a 24 horas. Após o período de incubação, a suspensão celular de cada patógeno foi diluída (usando MHB) para uma concentração final de 1 x105 células/mL e 2,8 x105 células/mL para C. albicans. Para verificar a concentração final foi feita a medida de densidade óptica (DO) a 600 nm de cada suspensão, sendo que um valor de DO de 0,0001 equivale a 1 x105 células/mL. Em seguida, 5 a 7 mL da suspensão celular de cada patógeno foram distribuídos na superfície de placa de MHA seca, sendo que ao final o excesso de suspensão foi retirado. As amostras foram diluídas com metanol a uma concentração de 2 mg/mL e 20 µL de cada amostra foram colocados em um disco estéril (e poço da placa de 96 poços), tendo ao final uma concentração de 40 µg/disco. Após a completa secagem das amostras nos discos, 20 µL de DMSO foi adicionado em cada disco contendo as amostras, bem como em um disco limpo, como controle negativo. Como controle positivo foram utilizados os antibióticos polimixina B (30 ug/disco) para P. aeruginosa, E. coli e B. subtilis, rifamicina (10 ug/disco) para MRSA, e o antifúngico anfotericina B (20 ug/disco) para C. albicans. Os discos contendo amostras, DMSO, antibióticos e/ou antifúngico foram colocados na superfície da placa de cada patógeno, em seguida, as mesmas foram lacradas e incubadas a 37ºC (ou 30ºC para B. subtilis) durante 18 a 24 horas. Após o período de incubação das placas, foi feita a medida do diâmetro (em mm) das zonas de inibição ao redor das amostras e/ou controles positivos e negativos. Este ensaio foi realizado sob a supervisão do Prof. Dr. Raymond Andersen da University of Bristish Columbia, Vancouver, Canadá com colaboração da Dra. Rebeca Priviate. 42 3.2.4.4 Avaliação da atividade anticolinesterásica por cromatografia de bioafinidade Este ensaio foi realizado frente às enzimas acetilcolinesterase humana e de enguia elétrica (AChE-hu e AChE-ee) imobilizadas em biorreatores (SILVA et al., 2013). Utilizando o método modificado de Ellmann (ELLMAN et al., 1961), que se baseia na medida da velocidade de produção da tiocolina formada através da hidrólise do análogo do substrato da AChE, a acetiltiocolina. A tiocolina formada reage com o chamado Reagente de Ellman (ácido 5,5-ditiobis[2-nitrobenzóico]) formando uma mistura de dissulfetos e um ânion amarelo com intensa absorção em 412 nm (Esquema 1). Esquema 1. Catálise da acetiltiocolina e reação de Ellman Os biorreatores denominados ICERs de 30 cm x 0,01 mm em capilar de sílica fundida serão preparados pela imobilização de 2 enzimas acetilcolinesterase diferentes resultando em:  ICER-AChE-ee – com a enzima Acetilcolinesterase de Electrophorus electricus (enguia elétrica);  ICER-AChE-hu – com a enzima Acetilcolinesterase de eritrócitos humanos; Os ICERs serão utilizados como colunas conectadas ao equipamento de CLAE. O monitoramento do produto da reação enzimática pela observação da banda cromatográfica correspondente à formação do produto da reação enzimática foi realizado nas seguintes condições: 43  Fase móvel (Tampão de trabalho): Tampão Tris 0,1M pH 8,0 e reagente de Ellman (DTNB - ácido 5,5-ditiobis[2-nitrobenzóico]) 0,126 mM;  Amostra injetada:10 µL da solução contendo 1mM de Acetiltiocolina (ATChI) para AChE-ee e 2 mM para AChE-hue 200 µg mL-1de amostra a ser testada;  Vazão: 0,05 mL/min;  Detector DAD-UV: 412nm;  Inibidor padrão utilizado: Tacrina. A Figura 4 mostra um cromatograma representando a diminuição da banda cromatográfica referente ao produto na presença e ausência do inibidor padrão. Figura 4. Cromatograma ilustrando o decrescimento da atividade enzimática do ICER-AChEee na presença de inibidor padrão a 200 µmol L-1 . . Os percentuais de inibição serão obtidos comparando-se a área da atividade da enzima na presença do inibidor (Ai) com a área da atividade da enzima na ausência de inibidor (A0), de acordo com a equação abaixo: 0 2 4 6 8 10 0 4x10 5 8x10 5 1x10 6 A b so rb â n ci a ( a 4 1 2 n m ) Tempo (minutos) Presença de inibidor Ausência de inibidor 44 As amostras foram diluídas em metanol em concentrações de 1,5 mg mL-1 para extratos e frações semi-puras e 1,0 mg mL-1 para frações puras. A partir dessas soluções estoque serão preparadas soluções de 200 µg mL-1 contendo: 60 µL da solução de tampão trabalho, 20 µL da solução do extrato ou fração e 20 µL da solução de ATChI. O volume final será de 100 µL. As soluções foram preparadas em duplicatas e alíquotas de 10 µL serão injetadas no ICER. Antes de cada amostra ser injetada apenas o substrato da enzima (60 µL da solução de tampão trabalho, 20 µL da solução de ATChI e 20 µL de metanol) foi injetado para a avaliação da atividade enzimática. Também foi injetado um branco de cada amostra (60 µL da solução de tampão trabalho, 20 µL da solução do extrato e 20 µL de metanol). Este ensaio foi realizado sob a supervisão da Profª. Drª. Carmen Lúcia Cardoso, da Faculdade de Ciências e Letras da USP-Ribeirão Preto. 3.2.5 Identificação das cepas fúngicas As linhagens de endófitos Ps-02 e Ps-03 foram identificadas pela empresa Genotyping Biotecnologia (Divisão Micro-organismos, Laboratório Central, Botucatu/SP). O Sequenciamento automático foi feito por eletroforese capilar no equipamento ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) e de acordo com a comparação do alinhamento das sequências de nucleotídeos produzidas com as sequências de referência depositadas no GenBank. Os microrganismos Ps-02 e Ps- 03 apresentam 99% de indentidade com o fungo da espécie Sarocladium strictum e o fungo do gênero Coniothyrium sp., respectivamente. Ambas linhagens estão depositadas na micoteca do Departamento de Química Orgânica/IQAr – SP. 45 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Avaliação do perfil químico dos extratos brutos e frações obtidos em diferentes meios de cultivos (escala reduzida) dos fungos Ps-02 e Ps-03 Com o intuito de avaliar a produção metabólica das linhagens dos fungos Ps-02 e Ps-03 em diferentes meios de cultivo, foram selecionados dois meios líquidos (Czapek e Malte) e um meio sólido (arroz) a fim de determinar a melhor condição de crescimento para os endófitos. 4.2 Perfil Cromatográfico dos extratos brutos e frações (escala reduzida) em CLAE-DAD Os cromatogramas dos extratos Ps-02 Czapek (20 mg), Ps-02 Malte (71 mg), e das frações Ps-02 A-ACN (570 mg) e Ps-02 A-aq (290 mg) utilizando gradiente exploratório e detecção em λ 254 nm (CLAE-DAD) apresentaram vários picos associados a substâncias com polaridades variando de média a alta, com boa resolução cromatográfica e diferentes absorbâncias, indicando a produção de diferentes classes de metabólitos. Entretanto não foi possível observar grande produção metabólica e rendimento em massa (Tabela 2) para Ps-02 Czapek quando comparado (Figura 5) com os outros extratos. Isso pode se dever a este ser considerado um meio de cultivo pobre em nutrientes e rico em sais minerais. 46 Figura 5. Cromatogramas via CLAE usando coluna RP18 em gradiente exploratório dos extratos brutos e frações em diferentes meios de cultivo (a) Ps-02 Malte; (b) Ps- 02 A-ACN; (c) Ps-02 Czapek; (d) Ps-02 A-Aq. . Figura 6. Cromatogramas via CLAE usando coluna RP18 em gradiente exploratório dos extratos brutos e frações em diferentes meios de cultivo (a) P3-02 Malte; (b) Ps- 03 Czapek; (c) Ps-03 A-CN; (d) Ps-03 -Aq 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 min -0.50 -0.25 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 uV(x10,000) 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 min -0.25 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 uV(x10,000) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 min 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 uV(x1,000,000) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 min 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 uV(x100,000) Ps-02 Czapek Ps-02 Malte Ps-02 Acn Ps-02 Aq 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 min 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 uV(x10,000) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 min -0.50 -0.25 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 uV(x10,000) Ps-03 Czapek Ps-03 Malte 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 min 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 uV(x100,000) Ps-03 Aq 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 min 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 uV(x100,000) Ps-03 Acn 47 Para os extratos produzidos pelo fungo Ps-03, foi usado gradiente exploratório com detecção em λ 254 nm (CLAE-DAD). Para os extratos Ps-03 Czapek (110 mg) Ps-03 Malte (58 mg) e frações Ps-03 A-ACN (760 mg) e Ps-03 A-Aq (631 mg), foi possível observar uma grande produção metabólica pela comparação dos picos (Figura 6) ao longo do cromatograma nas regiões de baixa a alta polaridade, com boa resolução cromatográfica. Merecem destaque o extrato Ps-03 Czapek e fração Ps-03 A-ACN que apresentaram picos distribuídos nas regiões de baixa a média polaridade com absorbâncias e tempos de retenção distintos nos cromatogramas. 4.3 Perfil químico dos extratos brutos e frações (peq. escala) em RMN de 1H. Os espectros de RMN de 1H para os extratos e frações das linhagens dos fungos Ps-02 (Figura 7) e Ps-03 (Figura 8) corroboram a alta quimiodiversidade evidenciada pelos dados obtidos na análise por CLAE-DAD, com sinais em δH 0,8 até aproximadamente δH 9,5 característicos de hidrogênios olefínicos, carbinólicos, aldeídicos, metílicos, metilênicos e metínicos. Observou-se também uma região complexa associada a hidrogênios aromáticos para as amostras Ps-02 A-Aq, Ps-03 Czp, Ps-03 A-ACN e Ps-03 Malte, sugerindo a presença de constituintes de várias classes e evidenciando a diversidade metabólica destes extratos e frações. A variação de meios de cultivos contribuiu também para uma produção metabólica diferenciada. 48 Figura 7. Espectros de RMN de ¹H de Ps-02 A-Hex (CDCl3, 300 MHz) e Ps-02- A-Aq e Acn, Ps-02 Malte e Czp (DMSO-d6, 300 MHz). 49 Figura 8. Espectros de RMN de ¹H de Ps-03 A-Hex (CDCl3, 300 MHz) e Ps-03- A-Aq e Acn, Ps-03 Malte e Czp (DMSO- d6, 300 MHz). 50 4.4 Avaliação das atividades antifúngica e anticolinesterásica A Tabela 4 mostra os resultados obtidos para a atividade antifúngica e anticolinesterásica dos extratos brutos e frações dos fungos Ps-02 e Ps-03. Podemos observar que apenas as frações Ps-02 A-Acn, Ps-02 A-Aq e Ps-03 A-Aq apresentaram atividade fraca ou moderada para os ensaios empregados. Os demais extratos e frações apresentaram forte atividade para ambos ensaios. Nota-se pelo sistema de eluição adotado (Tabela 03) para cada extrato e fração, que as substâncias associadas aos Rf (fator de retenção) com atividade inibitória são diferentes, mostrando que o potencial de atividade pode ser atribuído a diferentes classes de metabólitos. Como exemplo, a fração Ps-03 Czp, que mostra forte atividade para os ensaios realizados, apresenta também substâncias ativas com diferentes Rf para cada ensaio. Tabela 4. Atividade antifúngica e anticolinesterásica dos extratos brutos e frações dos fungos endofíticos e seus Rf. Amostra C. cladosporioides C. sphaerospermum Anticoli- nesterásico Ps -02 Malte 0,41 a 0,46**; 0,53 - 0,59*** 0,66-0,81** 0,65-071*** Ps-02 A-Hex - - 0,51-0,62*** Ps-02 A-Acn 0,41-0,46** 0,43-0,49,* - Ps-02 A-Aq 0,49-0,55* - - Ps-03 Czp 0,26-0,84*** 0,40-0,86*** 0,65-071*** Ps-03 Malte 0,68 a 0,94*** 0,82-0,95* - Ps-03 A-Hex 0,65* - 0,53-0,62*** Ps-03 A-Acn 0,66-0,82*** 0,58-0,63; 0,71- 0,84*** - Ps-03 A-Aq 0,81 - 0,95* - - Padrão nistatina*** origem*** fisostigmina*** *atividade fraca/**atividade moderada/***atividade forte 51 4.5 Atividade citotóxica Os ensaios foram realizados com duas linhagens de células tumorais de adenocarcinoma de cólon (HCT-116) e mama (MCF-7). De acordo com os resultados (Tabela 5), as frações e extratos não mostraram inibição relevante da proliferação celular tumoral nas linhagens testadas, consideradas, portanto não ativas, com exceção do extrato Ps-03 Czp, e fração Ps-03 A-ACN com CI50 variando de 3.9 a 16.7 ug/mL. Tabela 5. Atividade citotóxica dos extratos brutos e frações Amostra CI50 (µg/mL) HCT-116 MCF-7 Ps-02 A-ACN 50 >50 Ps-03 A-ACN 9.9 10.3 Ps-03 Czp 3.9 16.7 Doxorubicina* - - *Padrão Os resultados de bioatividade orientaram a escolha da fracão Ps-03 A-ACN para estudo detalhado, conforme apresentado abaixo. 4.6 Identificação e Elucidação estrutural das substâncias produzidas pelo endófito (Ps-03) Conithyrium sp. 4.6.1 Determinação estrutural da substância 1 A substância 1 (14,0 mg) foi isolada da fração 5 de Ps-03 A-Acn e apresentou no espectro de UV (Figura 9) absorções com λmax em 264 nm e 299 nm. Sua determinação estrutural se deu por meio das análises dos espectros de RMN de 1H, 13C e DEPT 135°, mapas de contorno COSY 1H -1H, HSQC e HMBC 1H - 13C, além dos dados de espectrometria de massas em alta resolução e por comparação com dados da literatura. 52 . Figura 9. Espectro no Ultravioleta da Substância 1 . O espectro de RMN de 1H (Figura 10) mostrou um sinal para grupo metila (δH 1.37; d, J 6.4 Hz), um sinal em δH 5.25 (m) característico de hidrogênio desprotegido, sugerindo a presença em sua vizinhança de elemento eletronegativo e foi atribuído a H-3, e ainda, sinais na região de hidrogênios aromáticos: dois dupletos em δH 6.15 (H-11) e δH 6.20 (H-9) ambos com J 2,4 Hz, atribuídos aos hidrogênios em posição meta do anel aromático tetra-substituído. Este espectro também apresentou sinais característicos de hidrogênios alifáticos entre δH 1.37 – 3.27. O espectro de RMN de 13C (Figura 11) mostrou sinais para quatorze carbonos, incluindo um sinal para grupo carbonila de éster em δC 171.9 (C-1) e outro para carbono oxigenado em δC 73.0 (C-3). A análise do espectro DEPT 135º (Figura 12), em conjunto com o experimento HSQC e comparação com os dados de RMN de 13C, evidenciou a presença de um sinal para carbono metílico, cinco metilênicos, dois metínicos, um oximetínico (C-3) e ainda cinco sinais para carbonos não hidrogenados, sendo quatro aromáticos e um carboxílico (Tabela 6). O espectro de RMN de 13C mostrou ainda que, dentre os carbonos aromáticos, os sinais em δ 163.4 e δ 164.5, característicos de carbonos aromáticos oxigenados, puderam ser atribuídos a C-10 e C-12, respectivamente, e evidenciaram a presença de hidroxilas fenólicas para substância 1. 53 Figura 10. Espectro de RMN 1H da Substância 1 (CD3OD, 600 MHz) 54 Figura 11. Espectro de RMN 13C da Substância 1 (CD3OD, 150 MHz). 55 Figura 12. Espectro de RMN DEPT-135º da Substância 1 (CD3OD, 150 MHz). 56 Figura 13. Mapa de correlações de COSY 1H-1H da Substância 1 (CD3OD, 600 MHz). . 57 A sub-estrutura do sistema alifático foi confirmada pelas correlações indicadas no mapa de contorno COSY 1H -1H (Figura 13) abrangendo os sinais para o grupo metila em C3, além de H-3, H-4, H-5, H-6, H-7 e H-8. Esta análise mostrou também um sistema isolado para os hidrogênios aromáticos. Estes dados, associados aos observados nos espectros de RMN de 1H e 13C, permitiram definir duas sub- estruturas parciais A e B para substância 1, bem como confirmar a atribuição dos sinais para carbonos metilênicos (C-4, C-5, C-6, C-7 e C-8), metínicos (C-9 e C-11), hidroximetínico (C-3) e quaternários (C-1, C-8a, C-10, C-12 e C-12a), e ainda para o grupo metila. A B A junção entre as estruturas parciais A e B foi definida com base nas correlações observadas no mapa de contorno HMBC (Figura 14). Esta análise exibiu a correlação entre H-3 (δ 5.24) e C-1 (δ 172.9), em que H-3 é oximetínico e C- 3 está ligado ao átomo de O da unidade éster. As correlações entre H-8 e C-7/C-8, e entre H-9 e C-8 demonstraram que C-8 está ligado ao grupo fenila através de C-8a, enquanto as correlacoes de H-9 com C-1, C-8, C-10, C-11 e C-12a e ainda, de H-11 com C-1, C-9, C-10, C-12 e C-12a foram importantes para definir as conectividades de cada subestrutura, bem como as ligações entre as mesmas, e definir a atribuição dos sinais a cada posição no anel aromático. . O O CH3H H 3 8 8a 1 9 12 12a H H O O CH3 58 Figura 14. Mapa de correlações de HMBC 1H-13C da Substância 1 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa) 59 A análise da subst. 1 por espectrometria de massas de alta resolução, evidenciou os sinais em ESI(+) com m/z 273.1100 [M + Na]+, e m/z 251.1279 [M+H]+, que sugeriram a fórmula molecular C14H18O4 . Os dados de RMN de 13C, evidenciaram a presença de hidroxilas fenólicas, dentre outros sinais, que confirmaram os dados obtidos pelas análises de espectrometria de massas de alta resolução, e permitiram sugerir a formula molecular C14H18O4 (Figura 15) para substância 1. Figura 15. Estrutura da Substância 1 .. O levantamento bibliográfico realizado nas bases de dados Web of Science e Scinfinder indicou que este policetídeo macrolídeo de 10 membros foi descrito por Yoshihara e colaboradores (2001) como produto intermediário na síntese de derivados do ácido β-resorcílico, embora se trate de uma substância inédita oriunda de fontes naturais. A substância 1 apresenta a mesma constante de acoplamento (6,4 Hz) para o sinal dos hidrogênios do grupo metila em C-3 quando comparada com os dados descritos na literatura por Yoshihara e col. (2001). Como C-3 é o único centro de assimetria desta molécula, este dado sugere que ambas apresentam a mesma configuração (R) para C3, por se tratar de um síntese estereosseletiva. De acordo com Liu e colaboradores (2015), diversos macrolídeos marinhos foram isolados de esponjas, algas, dinoflagelados, bem como de outros invertebrados e micro-organismos. Estas subtâncias demonstraram diversas propriedades biólogicas, tais como citotóxica, antimicrobiana, antiviral e atividades moluscicidas. 60 Tabela 6. Dados de RMN de 1H e 13C da Substância 1 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa) Posição 1H δ 13C δ HMBC 1 - 172.9; C - 3 5.24 m 73.0; CH C-1,C-4 e CH3 4 1.71 m 33.7; CH2 C-3, C-6 e CH3 1.79 m 5 1.66 m 20.6; CH2 C-3, C-4 e C-6 1.90 m 6 1.45 m 29.0; CH2 C-4, C-7 e C-8 1.53 m 7 1.42 m 30.2; CH2 C-6 e C-11 1.77 m 8 2.30, ddd (12,6; 9,1; 7,6) 35.5; CH2 C-6, C-7, C-8a, C-9 3.27, t (9,9) 8ª - 150.1; C - 9 6.20, d (2,4) 112.0; CH C-1, C-8,C-10, C-11, C-12a, 10 - 163.7; C - 11 6.15, d (2,4) 101.6; CH C-1,C-9, C-10, C-11, C- 12a, 12 - 164.5; C - 12ª - 106.0; C - 3-CH3 1.37, d (6,4) 20.1; CH3 C-3, C-4 adeslocamentos químicos relativos ao TMS como referência interna, (δ) em ppm, constante de acoplamento entre parênteses e em Hz. 4.6.2 Determinação estrutural da substância 2 A substância 2 (3,0 mg) foi isolada da fração 5 de Ps-03 A-Acn e apresentou espectro de UV (Figura 16) com absorções com λmax em 274 nm e 307 nm. Foi identificada por meio das análises dos espectros de RMN de 1H, 13C e DEPT 135°, mapas de contorno COSY 1H -1H, HSQC e HMBC 1H - 13C, além de espectrometria de massas em alta resolução e por comparação com os dados da substância 1 e da literatura. 61 Figura 16. Espectro no Ultravioleta da Substância 2 Os espectros de RMN das substâncias 1 e 2 (Figura 17) e seus espectros de UV indicaram que pertecem à mesma classe de metabólitos, ou seja, macrolídeos de 10-membros. A comparação com os sinais do espectro de RMN 1H da substância 01 na região de hidrogênios aromáticos, que apresentou dois dupletos em δH 6.15 (H-11) e δH 6.20 (H-09), mostrou uma diferença importante, já que o espectro de RMN de 1H da substância 2 apresentou apenas um sinal em δ 6.24, integrando para um hidrogênio (H-9). Este dado indicou a presença de outro substituinte na posição 11 da substância 2, caracterizando assim um anel aromático pentassubstituído. Adicionalmente, o experimento HSQC evidenciou a presença de somente um carbono aromático metínico (C-9), confirmando a proposta estrutural para subst. 2. O espectro de DEPT 135º (Figura 18), com auxílio do experimento de HSQC, mostrou a presença de um sinal de carbono metílico (CH3), cinco metilênicos (C-4, C-5, C-6, C-7 e C-8), um metínico (C-9), um carbinólico (C-3 ) e seis sinais de carbonos não hidrogenados (C-1, C-8a, C-10, C-11, C-12 e C-12a), sugerindo que a substância 2 possui o mesmo esqueleto da substância 1 (Tabela 7). 62 Figura 17. Espectros de RMN de 1H das substâncias 1 e 2 (CD3OD, 600 MHz). Substância 1 Substância 2 63 Figura 18. Espectro DEPT-135º da substância 2 (CD3OD, 150 MHz) 64 Tabela 7. Dados de RMN de 1H e 13C da Substância 2 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa) Posição 1H δ 13C δ HMBC 1 - 172.2; C - 3 5.27, m 72.8; CH C-1,C-4 e CH3 4 1.74, m 33.7; CH2 C-3, C-6 e CH3 1.80, m 5 1.66, m 20.4; CH2 C-3, C-4 e C-6 1.91, m 6 1.44, m 28.6; CH2 C-4, C-7 e C-8 1.53, m 7 1.41, m 30.3; CH2 C-6 e C-11 1.79, m 8 2.25, ddd (12,8; 9,0; 7,7) 34.7; CH2 C-6, C-7, C-8a, C-9 3.22, t (9,9) 8a - 139.4; C - 9 6.24, s 109.9; CH C-1, C-8,C-10, C-11, C-12a, 10 - 153.2; C - 11 - 131.7; C - 12 - 150.7; C - 12a - 106.0; C - 3-CH3 1.37, d (6,4) 19.8; CH3 C-3, C-4 adeslocamentos químicos relativos ao TMS como referência interna, (δ) em ppm, constante de acoplamento (J) entre parênteses e em Hz. OH OH O O CH3 H R 65 Esta substância foi também analisada por espectrometria de massas de alta resolução, evidenciando os picos por ESI(+) com m/z 289,1041 [M + Na]+ e m/z 267,1231 [M+H]+ . A comparação com os dados de EM da substância 1 mostra que a diferença entre as massas e dados de RMN 13C da substância 2 (Figura 19) deve- se ao substituinte hidroxila em C-11e. e permitiu propor a fórmula molecular C14H18O5 para a substância 2. O levantamento bibliográfico realizado nas bases de dados Web of Science e Scifinder indicou tratar-se de uma substância inédita. Os dados de RMN de 1H obtidos para substância 1 sugerem que a substância 2 deve ter a mesma configuração (R) em C-3 por apresentarem constantes de acoplamento (J = 6,4 Hz) idênticas. Figura 19. Estrutura da Substância 2. 4.6.3 Determinação estrutural da substância 3 A substância 3 (6,4 mg) foi isolada da fração 3 de Ps-03 A-Acn e identificada por meio das análises dos espectros de RMN de 1H, 13C e DEPT 135°, mapas de contorno do tipo; COSY 1H -1H, HSQC e HMBC 1H - 13C, espectrometria de massas de alta resolução e por comparação com dados da literatura e aqueles obtidos para as substâncias 1 e 2. OH H OH OH O O CH3 1 3 5 8 8a 12a 9 11 66 Figura 19. Espectro no Ultravioleta da substância 3 Os espectros da substância 3 apresentaram sinais característicos semelhantes aos mostrados nos espectros de RMN e UV (Figura 20) da substância 01, incluindo absorções com λmax em 260 nm e 295 nm e sugerindo tratar-se da mesma classe de compostos. O esqueleto carbônico de substância 3 foi confirmado pelos sinais característicos em δ 170.7 (C-1), 107.1 (C-12a) e 147.5 (C-8a), observados no espectro de RMN de 13C, bem como os sinais em δ 6.16 (d, H-9), 6.18 (d, H-11), 4.98 (m, H-3) e 1.44 (d, 3-CH3), observados no espectro de RMN de 1H (Figura 21) (Tabela 08). O espectro DEPT 135º (Figura 22), com auxílio do experimento HMBC e em comparação com o espectro de RMN de 13C (Figura 23), mostrou a presença de sinais para dois carbonos oximetínicos em δ 71.0 (C-5) e 72.0 (C-3). Estes espectros permitiram ainda destacar a principal diferença entre 1 e 3, associada à presença de uma hidroxila adicional em C-5. As atribuições dos sinais de C e H foram determinadas através do experimento HMBC pelas correlações (Figura 24) de H-3 com C-1, C-4, C-5 e 3-CH3, e de H-6 com C-4, C-5 e C-7, e ainda, confirmadas pelas correlações observadas no mapa de contorno COSY 1H-1H, com destaque para aquelas abrangendo os sinais do sistema alifático que inclui 3-CH3, H-3, H-4, H-5, H-6, H-7 e H-8. 67 Figura 20. Espectro de RMN de 1H da Substância 3 (CD3OD, 600 MHz). 68 Figura 21. Espectro de RMN de DEPT-135º da substância 3 (CD3OD, 150 MHz). 69 Figura 22. Espectro de RMN de 13C da substância 3 (CD3OD, 150 MHz). . 70 A substância 3 foi analisada por espectrometria de massas de alta resolução , que mostrou picos em ESI (+) com m/z 289.1043 [M + Na]+, e m/z 267.1223 [M+H]+. A comparação com os dados da literatura (LI et al, 2010) e com aqueles obtidos para as substâncias 1 e 2, além dos dados de EM e de RMN 13C, sugeriu a presença de grupo hidroxila em C-5 (δ 71.0) e formula molecular C14H18O5. Estes dados permitiram identificar substância 3 com um macrolídeo já conhecido, isolado anteriormente do fungo endofítico (Zh6-B1), obtido das cascas de Sonneratia apetala, que ocorre no mangue na costa sul do Mar da China. Li e colaboradores (2010) isolaram dois macrolídeos diastereoméricos de 10-membros, a (3R,5R)-sonnerlactona e (3R,5S)-sonnerlactona, cuja avaliação de citotoxicidade mostrou que ambas atuam como inibidores de células de carcinoma multi- resistentes. Figura 23. Principais correlações de HMBC 1H-13C da Substância 3 Para proposta da estereoquímica foram analisados os dados de RMN 1H e 13C, (tabela 8), em especial, aqueles dos centros assimétricos C-3 e C-5 da substância 03 (Figura 24) e dos macrolídeos diastereoméricos (3R,5R)-sonnerlactona e (3R,5S)-sonnerlactona. O sinal para o H-3 e sua constante de acoplamento (J) com o grupo metila em C-3 (δ 4.99; 6,4 Hz) mostraram-se idênticos aos relatados para a (3R,5R)-sonnerlactona, enquanto diferiram substancialmente daqueles observados para seu diastereômero, a (3R,5S)- sonnerlactona (δ 4.99; 6,8 Hz). Além disso, os sinais de H-5 (δ 3.81) e de C-5 (δ 71.0) mostraram semelhança acentuada com os dados do macrolídeo (3R,5R)-sonnerlactona, que apresentou os sinais de H-5 em δ 3.85 e C-5 em δ 72.0. Por outro lado, os dados obtidos para substância 3 diferem do macrolídeo (3R,5S)-sonnerlactona, cujos sinais para H-5 e C-5 foram observados H H OH OH O O CH3 OH 71 em δ 4.23 e δ 67.9, respectivamente. A análise conjunta dos dados acima sugere a estrutura do macrolídeo (3R,5R)-sonnerlactona para substância 3. Tabela 8. Dados de RMN de 1H e 13C de subst.03 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa) Posição 1H δ 13C δ HMBC 1 - 170.7; C - 3 4.99, dqd (12,4; 6,4; 2,0) 72.0; CH C-1,C-4 e CH3 4 1.75, dd (14,1;11,9) 44.5; CH2 C-3, C-6 e CH3 2.05, m 5 3. 81, m 71.0; CH2 - 6 1.55, m 35.6; CH2 C-4, C-5, C-7 e C-8 1.76, m 7 1.40, m 26.1; CH2 C-5, C-6 e C-8ª 2.09, m 8 2.53, dd (13,1; 8,0; 6,2) 34.7; CH2 C-6, C-7, C-8a, C-9 e C- 12ª 3.12, dt (12,9; 6,6) 8ª - 147.5; C - 9 6.16, d (2,4) 110.2; CH C-1, C-8,C-10, C-11, C-12a, 10 - 162.1; C - 11 6.18, d (2,4) 100.3; CH C-1,C-9, C-10, C-11, C- 12a, 12 - 163.0; C - 12ª - 106.1; C - 3-CH3 1.37, d (6,4) 20.0; CH3 C-3, C-4 adeslocamentos químicos relativos ao TMS como referência interna, (δ) em ppm, constante de acoplamento entre parênteses e em Hz. Figura 24. Estrutura da Substância 3 OH OH O O CH3 OH 1 3 5 8 8a 9 12a 12 72 4.6.4 Determinação estrutural da substância 4. A substância 4 (6,0 mg) foi isolada da fração 5 de Ps-03 A-Acn e apresentou no espectro de UV (Figura 25) absorções com λmax em 247 nm. Sua identificação se deu por meio das análises dos espectros de RMN de 1H e 13C e mapas de contorno COSY 1H -1H, HSQC e HMBC 1H-13C, além de espectrometria de massas de alta resolução e por comparação com dados da literatura. Figura 25. Espectro no Ultravioleta da Substância 04 . O espectros de RMN de 1H (Figura 26) e 13C (Figura 27) da substância 04 apresentaram sinais para dois sistemas característicos de anéis aromáticos monossubstituídos, além de um sinal para carbonila de éster/lactona em δ 174.3 (C- 2), e sinais para dois carbonos metilênicos isolados: C-5 (δC 71.47; δH 4.78, s) e C-6 (δC 33.15; δH 3.99, s). Estes espectros mostraram ainda sinais para dois carbonos sp2 em δ 126.6 e δ 162.1, atribuídos a C-3 e C-4, respectivamente, caracterizando uma ligacao dupla conjugada à carbonila do éster de um sistema carbonílico α,β– insaturado (Tabela 09). 73 Figura 26. Espectro de RMN de 1H da Substância 4 (CD3OD, 600 MHz). 74 Figura 27. Espectro de RMN de 13C da Substância 4 (CD3OD, 150 MHz). 75 Através do experimento HMBC, foi possivel verificar as correlações entre H-5 e C-2, C-3 e C-4, capazes de definir o anel γ-lactona α,β–insaturado que caracterizam um butenolídeo. Adicionalmente, as correlações entre H-6 e C-1’’, C-3, C-4 e C-5 indicaram um grupo benzila ligado ao anel lactônico através dos carbonos C-6 e C-4. As correlações entre H-2’’/H-6’’ e C-6, bem como entre H-3’’/H-5’’ e C-1’’ reforçaram as conectividades internamente ao grupo benzila. As demais correlações observadas entre H-2’/H-6’ e C-1’, e entre H-3’/H-5’ e C-3 permitiram confirmar a presença de um grupo fenila, conectado ao anel lactônico através da ligação entre os carbonos C-1’ e C-3 (Figura 28), caracterizando um butenolídeo -dissubstituído por um grupo fenila e um benzila, respectivamente. Figura 28. Principais correlações de HMBC 1H-13C da Substância 4. A substância 4 foi analisada por espectrometria de massas de alta resolução que mostrou os picos por (ESI (+) em m/z 273.0884 [M + Na]+, e m/z 251.1063 [M+H]+. A comparação com os dados da literatura, além dos dados de EM e de RMN OO R 2R 1 1 3 5 O O 1 3 5 6 1'' 2'' 6'' 1' 2' 76 13C, permitiu identificar a substância 4 como um butenolídeo aromático de fórmula molecular C17H14O2, já relatado na literatura como gymnoascolídeo A (Figura 29) e anteriormente isolado do ascomiceto Gymnoascus reessii, obtido do solo australiano (BRINGMANN et al, 2005). Figura 29. Estrutura da Substância 4. . Os butenolídeos correspondem a -lactonas insaturadas (BARBOSA et al, 2010) e suas atividades biológicas são frequentemente relacionadas à presença da insaturação do anel, além da natureza e posições dos diferentes substituintes do mesmo (BASSETIIi, M.; D’ANNIBALE, A. 2013). Os gymnoascolídeos possuem uma rara estrutura, formada por uma unidade de butenolídeo e anéis aromáticos que são encontrados a partir de fontes microbianas. O O 1 3 5 6 1'' 2'' 6'' 1' 2' 6' 5' 4' 3' 3'' 4'' 5'' 77 Tabela 9. Dados de RMN de 1H e 13C da Substância 4 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa) Posição 1H δ 13C δ HMBC 2 - 174.3; C - 3 - 126.5; C - 4 - 162.1; C - 5 4.78, s 71.4; C 1’, 1’’, 2, 3, 4, 6 6 3.99, s 33.1; CH2 2, 3, 4, 5, 1’’ 1’ - 129.8; CH2 - 2’/6’ 7.50 128.7 CH 3, 1’, 3’/5’ 3’/5’ 7.47 128.3; CH 2’/6’ 4’ 7.42 128.2; CH 2’/6’, 3’/5’ 1” - 136.5; C - 2’’/6’’ 7.19 128.3; CH 6, 4’’ 3’’/5’’ 7.32 128.6; CH 1’’, 3’’/5’’ 4’’ 7.25 126.8; CH 2’’/6’’, 3’’/5’’ adeslocamentos químicos relativos ao TMS como referência interna, (δ) em ppm, constante de acoplamento entre parênteses e em Hz. . R1 4.6.5 Determinação estrutural da substância 5. HO O O H H 3 1 5 8 19 18 22 23 2821 17 26 27 11 78 A análise dos espectros de RMN 1H e 13C da fração F7-16 permitiu a identificação da substância 5, pertencente à classe dos esteroides. O espectro de RMN 1H (Figura 30) apresentou dois simpletos em δ 0.81 e 0.89 correspondentes aos hidrogênios metílicos em carbono não hidrogenado (H-18 e H- 19); um mutipleto em δ 3.77 (1H, m) atribuído ao hidrogênio hidroximetínico H-3, além de sinais em δ 5.20 (1H, dd, J= 15.2, 8.3 Hz), e 5.23 (1H, dd, J= 15.2, 8.3 Hz) correspondentes aos hidrogênios olefínicos H-22 e H-23 na cadeia lateral e sinais em δ 6.50 (1H, d, 8.5 Hz) e 6.27 (1H, d, 8.5 Hz) associados aos hidrogênios da dupla ligação endocíclica entre C-6 e C-7, respectivamente (Tabela 10). O espectro de RMN 13C (Figura 31) mostrou sinais para 28 carbonos, sendo quatro olefínicos, em δ 136.8, 133.5, 131.7 e 136.8, seis metilas em δ 13.2, 18.6, 21.3, 20.0, 20.4 e 18.1, além do carbono carbinólico em δ 67.0 atribuído a C-3 e dois carbonos quaternários oxigenados adjacentes do grupo peróxido em δ 83.5 e 80.7, atribuídos a C-5 e C-8. As correlações no mapa de contorno HMBC de H-4 com C-3 e C-5 e de H-14 com C-8 confirmaram a presença o grupo peroxido conectando C-5 e C-8. A comparação destes dados de RMN 1H e 13C com os relatados na literatura (KWON et al, 2002) permitiu propor a estrutura do esteroide ergosterol-5,8-endoperóxido ∆6,22 para substância 5. A análise por espectrometria de massas de alta resolução mostrou os picos em (ESI (+) com m/z 451.3185 [M + Na]+ e m/z 429.3368 [M+H]+ , associados à fórmula molecular C28H44O3, que confirmou a estrutura de 5. Ergosterol endoperóxido, já foi descrito na literatura em linhagens de Aspergillus versicolor isolado da alga parda Sargarssum thunbergii, bem como em fungos terrestres, incluindo linhagens obtidas no deserto do Atacama, e corais e possui atividade antibacteriana e citotóxica (MIAO et al, 2012; YAOITA et al, 1998; YU et al, 2006; GONÇALVES et al, 2016). 79 Tabela 10. Dados de RMN de 1H e 13C da Substância 5 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, CD3ODa) Posição 1H δ 13C δ HMBC 1 Ha= 1.70; Hb= 1.90 35.9 2, 3, 10 2 Ha= 1,78; Hb= 1.51 30.8 1, 3 3 3.77 m 66.9 4 1.96 37.7 3, 5, 6 5 - 83.9 6 6.50 d (8.5) 131.7 5, 7, 8 7 6.27 d (8.5) 136.8 5, 6, 8 8 - 80.7 9 1.45 52.7 8, 10 10 - 37.7 11 Ha= 1.25; Hb= 1.55 24.3 12 1.95 38.1 13 - 45.7 14 1.53 53.1 15 1.50 21.5 16 1.76 29.8 17 1.24 57.5 18 0.84 s 13.2 13 19 0.90 s 18.6 10 20 1.99 40.6 21 1.02 d (6.6) 21.3 22 5.20 dd (15.2, 8.3) 136.8 17, 20, 21, 23, 24 23 5.23 dd (15.2, 8.3) 133.4 17, 20, 22, 24, 24 2.06 41.1 25 1.47 34.3 26 0.85 d 20.0 23, 24, 25, 27 27 0.85 d 20.4 23, 24, 25, 26 28 0.93 d (6.8) 18.1 23, 24, 25 adeslocamentos químicos relativos ao TMS como referência interna, (δ) em ppm, constante de acoplamento entre parênteses em Hz. 80 Figura 30. Espectro de RMN de 1H da Substância 5 (CD3OD, 600 MHz). 81 Figura 31. Espectro de RMN de 13C da Substância 5 (CD3OD, 150 MHz) 82 4.6.6 Determinação estrutural da substância 06. Os espectros de RMN das substâncias 5 e 6 mostraram similaridades, indicando que ambas pertecem à mesma classe de metabólitos, os esteroides. Ambas mostraram sinais de RMN 1H na região de hidrogênios olefínicos em δ 5.23 e 5.16, referentes a H-22 e H-23, respectivamente, da cadeia lateral acíclica do esteroide. O espectro de RMN de 1H (Figura 32) apresentou dois simpletos em δ 0.59 e 1.08 correspondentes aos hidrogênios metílicos sobre carbono quaternário (H-18 e H-19); dois sinais para hidrogênios hidroximetínicos em δ 4.08 (1H, m) e em δ 3.62 (1H, d, 4.6 Hz), atribuídos a H-3 e H-6, além de sinais para dois hidrogênios olefínicos em δ 5.16 (1H, dd, J= 15.3, 8.3 Hz) e 5.23 (1H, dd, J= 15.3, 8.3 Hz), que foram atribuídos a H-22 e H-23, por mostrarem correlacao no experimento HSQC com os sinais em δ 132.3 e 135.5, associados aos cabornos sp2 C-22 e C-23, respectivamente, da cadeia lateral. A comparação com dados de RMN de 1H da substância 5 indicou a diferença marcante associada à posicao da ligacao dupla endocíclica, já que para a substâncai 6 foi observado sinal para apenas mais um hidrogênio olefínico, em contraste com os dois sinais adicionais observados para 5 nesta região. Este espectro permitiu assim, a atribuição do sinal em δ 5.35 a H-7, pela sua correlação com C-7 (δ 117.7), observada no mapa de contorno HSQC, bem como aquelas de H-7 com C-5, C-9 e C-14, observadas no experimento HMBC. Este experimento evidenciou também a correlação entre H-9 e o sinal para carbono sp2 não hidrogenado em δ 144.2, que foi então atribuído ao C-8, bem como a posiçao da dupla ligação entre C-7 e C-8. HO H H OH OH 3 1 5 8 19 18 22 23 2821 17 26 27 11 7 83 Análise adicional dos dados de RMN 13C (Figura 33) confirmou esta proposta, em especial pela análise de sinais diagnósticos como aqueles de carbonos sp2 e oxigenados. Este espectro mostrou 28 sinais, sendo quatros sinais de carbonos olefínicos em δ 132.3, 135.5, 117.6 e 144.1, além de sinais para carbonos hidroximetínicos em δ 67.0 e em δ 73.8, atribuídos a C-3 e C-6, e para carbono quaternário oxigenado em δ 76.1, atribuído a C-5. A análise destes dados e sua comparação com dados de RMN de 13C da substância 5, confirmaram a diferença associada à posicao da ligação dupla endocíclica, já que os sinais para carbonos oxigenados da substância 6, em conjunto com os dados de RMN 2D, sugeriram a posição da dupla ligação endocíclica entre C-7 e C-8 e ausência do grupo peróxido (Tabela 11). Correlações adicionais no mapa de contorno HMBC entre H-19 e C-5, e entre H-7 e C-5, bem como seu descolamento químico em δ 76.1, confirmaram que C-5 esteja ligado ao substituinte OH, caracterizando um álcool terciário. Durante o processo de purificação destes esteroides, verificou-se a maior polaridade da substância 6 quando comparada à 5, contribuindo para o respaldo da proposta estrutural com dois grupos hidroxila adicionais para 6. As análises descritas acima, bem como a comparação dos dados de RMN 1H e 13C com os dados da literatura (KAWAGISHI et al, 1988 e ZHAO et al, 2014) permitiram confirmar a estrutura proposta com fórmula molecular C28H46O3 e identificar a substância 6 com o esteroide 22E-ergosta-7,22-dieno-3β,5,6-triol. 84 Figura 32. Espectro de RMN de 1H da Substância 6 (CDCl3, 600 MHz). 85 Figura 33. Espectro de RMN de 13C da Substância 6 (CDCl3, 150 MHz). 86 Tabela 11. Dados de RMN de 1H e 13C da Substância 6 (600 MHz para 1H e 150 MHz para 13C, (CD3ODa) Posição 1H δ 13C δ HMBC 1 Ha= 1.53; Hb= 1.60 33.2 2, 3, 10 2 1,86 30.9 1, 3, 4 3 4.08 m 67.8 4 Ha= 1.77; Hb= 2.14 39.5 2, 3, 5 5 - 76.1 6 3.62 d (8.5) 73.7 5, 6, 7, 8 7 5.35 d (8.5) 117.6 5, 6, 8 8 - 144.1 9 1.95 t 43.6 8, 10 10 - 37.2 11 1.45 23.0 12 Ha= 1.31; Hb= 2.05 39.3 13 - 43.9 14 1.91 54.8 15 1.57 22.1 16 1.73 28.0 17 1.29 m 56.1 18 0.59 s 12.4 13, 17 19 1.08 s 19.0 5, 9, 10 20 2.02 40.5 21 1.02 d (6.6) 21.3 17, 20, 22 22 5.23 dd (15.3, 8.3) 132.3 20, 21, 23, 24 23 5.16 dd (15.3, 8.3) 135.5 20, 22, 24. 25 24 1.84 42.9 25 1.46 33.1 26 0.82 d 19.7 24, 25, 27 27 0.83 d 20.1 24, 25, 26 28 0.91 d (6.8) 17.3 23, 24, 25 adeslocamentos químicos relativos ao TMS como referência interna, (δ) em ppm, constante de acoplamento entre parênteses em Hz. 87 4.6.7 Determinação estrutural da substância 7 A substância 7 (4,0 mg) isolada da fração 2 de Ps-03 A-Acn apresentou no espectro de UV (Figura 34) absorções com λmax em 223 e 286 nm. Sua identificação se deu por meio das análises dos espectros de RMN de 1H e 13C e mapas de contorno COSY 1H -1H, HSQC e HMBC, além de espectrometria de massas de alta resolução e por comparação com dados da lite