Ana Letícia Guerra Análise molecular do subcomplexo Brasiliensis (Hemiptera, Triatominae) São José do Rio Preto 2016 Campus de São José do Rio Preto Ana Letícia Guerra Análise molecular do subcomplexo Brasiliensis (Hemiptera, Triatominae) Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor (a) em Genética, junto ao Programa de Pós-Graduação em Genética, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Orientador: Profª. Drª. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira São José do Rio Preto 2016 I Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE UNESP - Câmpus de São José do Rio Preto Guerra, Ana Letícia. Análise molecular do subcomplexo Brasiliensis (Hemiptera, Triatominae) / Ana Letícia Guerra. -- São José do Rio Preto, 2016 88 f. : il., tabs. Orientador: Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Biologia molecular. 2. Biologia - Classificação. 3. Hemiptera – Aspectos moleculares. 4. Triatoma – Brasil. 5. Citogenética animal. I. Azeredo-Oliveira, Maria Tercília Vilela de. II. Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho". Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título. CDU – 577.23 Ana Letícia Guerra Análise molecular do subcomplexo Brasiliensis (Hemiptera, Triatominae) Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor (a) em Genética, junto ao Programa de Pós-Graduação em Genética, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Comissão Examinadora Profª. Drª. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira UNESP – São José do Rio Preto Orientadora Profª. Drª. Hermione Elly Melara de Campos Bicudo UNESP – São José do Rio Preto Prof. Dr. Carlos Roberto Ceron UNESP – São José do Rio Preto Prof. Dr. Luiz Carlos de Mattos FAMERP - São José do Rio Preto Profª. Drª. Aline Rimoldi Ribeiro UNICAMP - Campinas São José do Rio Preto 2016 II Este trabalho foi realizado no laboratório de Biologia Celular, do Departamento de Biologia, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto – IBILCE - UNESP. Apoio financeiro na forma de bolsa de estudos financiada pela CAPES III AGRADECIMENTOS À minha orientadora, Profª. Drª. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira, por ser um exemplo de pessoa, educadora e pesquisadora a ser seguido. Agradeço pelos valiosos ensinamentos transmitidos durante esses anos e principalmente por ter confiado que eu seria capaz; Agradeço á Profª. Drª. Claudia Carareto e a Profª. Drª. Lílian Madi Ravazzi pelo espaço cedido e por me acolher em seus respectivos laboratórios e pelas grandiosas sugestões e colaborações valiosas a este trabalho; Ao Prof. Dr. João Aristeu da Rosa, da UNESP de Araraquara pela doação das espécies utilizadas nesse trabalho e por sua colaboração sempre, estendo meus agradecimentos ao doutorando Jader pela atenção e envio do material entomológico; À Profª. Drª. Lilian Castiglione, pela orientação no Mestrado, além de muito ter me ensinado e ter participado da minha formação; Aos professores e funcionários do Departamento de Biologia, da sessão de Pós-graduação, da Vice Direção e da Direção especialmente a Betinha e a Magda pelo carinho, atenção e disposição em ajudar sempre; A CAPES pela bolsa de Doutorado concedida e ao CNPQ pela bolsa produtividade concedida; Aos membros da banca examinadora, pela disponibilidade e atenção; Aos amigos e colegas que ainda estão ou já passaram pelo Laboratório de Biologia Celular: Lucilene, Maysa, Fernanda, Amanda, Giovana, Carlos, Kelly, João, Yago, pela convivência, amizade, apoio e incentivo em especial ao Kaio pela paciência e colaboração que sem dúvida foi de enorme importância para a realização e conclusão deste trabalho; a Nathália, amiga querida obrigada pelo companheirismo, pelos almoços animados e por estar presente em tantos VI momentos e a Priscila que tanto me ensinou, sempre acreditou e confiou em mim, me incentivou e que além de tudo sempre será uma grande amiga; Aos queridos amigos do Laboratório de Citogenética de Insetos e do Laboratório de Evolução Molecular de Insetos pela convivência agradável, trocas de ideias e ajuda; especialmente á Elaine, Adriana e a técnica Joice pela ajuda constante, por sempre terem me acolhido e por compartilharem seus conhecimentos; A querida amiga Leliane, que mesmo distante, sempre esteve disponível para me ajudar, me incentivar e contribuir com seus ensinamentos; A todos os amigos que fiz durante a infância que me proporcionaram momentos felizes e sempre torceram por mim, Marcella, Natália, Thaysa, Alessandra, Débora, Elisa; Aos novos amigos que esta etapa me proporcionou e que se tornaram muito importantes, Isabela, Marina, Vanessa Urbinatti, Vanessa Cardoso, Iris que alegraram meus finais de semanas, por todo apoio e companheirismo. Em especial a querida amiga Cecília por toda sua amizade, paciência, pela convivência, que sempre me ajudou, obrigada apoio incondicional nos bons e maus momentos do meu trabalho e da minha vida pessoal; Agradeço a meus familiares (tios/as, primos e avó), que apesar de nem sempre estarem presentes, sempre me incentivaram, apoiaram e torceram por mim; Ao meu querido irmão Antonio, por todo o apoio, carinho e compreensão; Aos meus pais, Izilda e Antonio meus maiores exemplos de vida, obrigada pelo apoio sempre em todos os momentos da minha vida pessoal e profissional, pela força, pelo amor incondicional e por todo esforço que sempre fizeram (e fazem) para eu chegar até aqui; A todos que aqueles que nos mais diversos momentos me ajudaram direta ou indiretamente na realização e conclusão desse trabalho; V Agradeço a Deus pela vida e por ter colocado pessoas tão especiais como vocês no meu caminho, sem vocês tudo teria sido mais difícil... A todos, muito obrigada!!! VI Nossa maior fraqueza está em desistir. O caminho mais certo de vencer é tentar mais uma vez. Thomas Edison VII SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT I. Introdução .................................................................................................................... 1 II. Objetivo Geral .......................................................................................................... 10 III. Objetivo Específico ................................................................................................. 10 IV. Material e Métodos ................................................................................................. 11 1. Obtenção das amostras ................................................................................................ 11 2. Extração de DNA ........................................................................................................ 11 3. Reações em cadeia da polomerase (PCR) ................................................................... 11 3.1. Domínio D2 (gene nuclear DNAr28S) ............................................................. 11 3.2. Gene mitocondrial ND1 .................................................................................... 12 4. Eletroforese ................................................................................................................. 13 5. Purificação dos fragmentos amplificados ................................................................... 13 6. Análise do sequenciamento dos genes D2 e ND1 ....................................................... 13 V. Resultados ................................................................................................................. 15 Capítulo 1 ....................................................................................................................... 16 Capítulo 2 ....................................................................................................................... 26 Capítulo 3 ....................................................................................................................... 41 VI. Discussão Geral ....................................................................................................... 56 VII. Conclusões .............................................................................................................. 62 VIII. Referências Bibliográficas .................................................................................. 63 VIII RESUMO Os triatomíneos pertencem à ordem Heteroptera, família Reduviidae e subfamília Triatominae. Atualmente, são admitidas 150 espécies, agrupadas em seis tribos e 18 gêneros. O subcomplexo Brasiliensis foi proposto, inicialmente por Lucena, em, 1970, contendo nove espécies, a saber: Triatoma brasiliensis; T. juazeirensis; T. melânica; T melanocephala; T. petrochiae; T. lenti; T. sherlocki; T. tibiamaculata e T. vitticeps. A partir de dados citotaxonômicos, foi proposta a exclusão das espécies T. melanocephala, T. vitticeps e T. tibiamaculata por apresentarem fragmentação do cromossomo sexual X e, com isso, serem proximamente relacionados aos triatomíneos da América do Norte. Com base em dados moleculares, foi sugerido, portanto, que esse subcomplexo compreende as seguintes espécies: T. brasiliensis, T. juazeirensis, T. melanica, T. sherlocki e a subespécie T. b. macromelasoma. No entanto, os estudos não incluíram T. lenti e T. petrochiae. Com base em análises citogenéticas, foi proposto que T. lenti seja um membro do subcomplexo Brasiliensis. Visando esclarecer as dúvidas relacionadas à posição das espécies T. lenti e T. petrochiae dentro desse subcomplexo, o presente trabalho teve como objetivo analisar, por meio do Domínio D2 (região 28S DNAr) e do gene mitocondrial ND1 a relação filogenética dos táxons que compõem o subcomplexo Brasiliensis. A partir das análises geradas com o domínio nuclear D2, concluímos que não foi possível confirmar a relação filogenética entre os membros do subcomplexo Brasiliensis, visto que, as sequencias obtidas apresentaram apenas dois sítios polimórficos em 567 pb, demonstrando que esse domínio não é um marcador molecular adequado para essas espécies, devido ao seu alto grau de conservação. Todavia, os resultados obtidos para o gene mitocondrial ND1 corroboraram os dados citotaxonômicos que consideram a espécie T. lenti como membro do subcomplexo Brasiliensis, comprovado pelo alto suporte nos ramos gerados pela filogenia (89% de bootstrap). Na topologia também foi verificado que T. petrochiae é grupo irmão das demais espécies do subcomplexo (100% de bootstrap), além de corroborar seu status específico. As observações encontradas na matriz de distância genética suportaram o fenômeno de hibridação homoploidal para a subespécie T. b. macromelasoma, contribuindo assim para o conhecimento filogenético das espécies desse subcomplexo. Os dados encontrados são significativos, pois, o conhecimento da taxonomia desses insetos e sua correta classificação permitem que os triatomíneos que atuam como vetores sejam foco específico dos programas de controle da doença de Chagas no Brasil e na América Latina. Palavras-chave: taxonomia molecular; gene nuclear (D2); gene mitocondrial (ND1); Triatoma lenti; Triatoma petrochiae. IX Abstract Triatomines belong to the order Heteroptera, family Reduviidae and subfamily Triatominae. Currently, they admitted 150 species, grouped into two tribes and 18 genera. Brasiliensis subcomplex was proposed initially by Lucena, in 1970, containing nine species: Triatoma brasiliensis; T. juazeirensis; T. melânica; T melanocephala; T. petrochiae; T. lenti; T. sherlocki; T. tibiamaculata and T. vitticeps. From data citotaxonomicals, it was proposed the exclusion of species T. melanocephala, T. vitticeps and T. tibiamaculata by present fragmentation of sex chromosome X and, therefore, are closely related to triatomines North America. Based on molecular data, it was suggested therefore that comprises the subcomplex species: T. brasiliensis, T. juazeirensis, T. melanica, T. sherlocki and subspecie T. b. macromelasoma. However, the studies didn’t include T. lenti and T. petrochiae. Based on cytogenetic analysis, it was proposed that T. lenti be a member of Brasiliensis subcomplex. Aiming to answer questions related to the position of the species T. lenti and T. petrochiae within this subcomplex, this study aimed to analyze, through the Domain D2 (region 28S RNAr) and mitochondrial gene ND1 the phylogenetic relationship of the taxa that comprise the subcomplex Brasiliensis. From the analysis generated with domain D2, we concluded that it was not possible to confirm the phylogenetic relationship among the members of Brasiliensis subcomplex, since the obtained sequences showed only two polymorphic sites in 567 bp, indicating that this domain is not a marker molecular suitable for these species, due to its high degree of conservation. However, the results obtained from the mitochondrial gene ND1 corroborate cytotaxonomic data that consider the species T. lenti as Brasiliensis subcomplex member, evidenced by the high support in the branches generated by phylogeny (89% bootstrap). In the topology it was also observed that T. petrochiae be the brother group of the other species of the subcomplex (100% bootstrap), and corroborate their specific status. The observations found in the genetic distance matrix support the homoploide hybridization phenomenon for the subspecies T. b. macromelasoma, thus contributing to the phylogenetic knowledge of the species of this subcomplex. Our data are significant because, the taxonomy of these insects and their correct classification allow triatomine that act as vectors are specific focus of Chagas disease control programs in Brazil and Latin America. Keywords: molecular taxonomy; nuclear gene (D2); mitochondrial gene (ND1); Triatoma lenti; Triatoma petrochiae. X 1 I. Introdução Os triatomíneos são insetos hematófagos que pertencem à ordem Hemiptera, subordem Heteroptera, família Reduviidae e subfamília Triatominae (LENT e WYGODZINSKY, 1979). Esses organismos possuem grande importância para a parasitologia humana, pois todas as espécies da subfamília Triatominae são potenciais vetores do protozoário Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 (Kinetoplastida; Trypanosomatidae) agente etiológico da doença de Chagas. A infecção ocorre por meio da alimentação com sangue de mamífero infectado (homens, marsupiais e alguns roedores), sendo que, todos os estádios ninfais (N1, N2, N3, N4 e N5) podem ser contaminados com o parasito, uma vez que, após a eclosão, a hematofagia é obrigatória em todas as fases de vida dos triatomíneos. Já a transmissão do protozoário para os mamíferos ocorre por meio das fezes desses insetos, que tem o hábito de defecar durante o repasto (NOIREAU et al, 2009). Os animais infectados com T. cruzi são sempre mamíferos, uma vez que o parasito não se desenvolve no sangue de aves, répteis ou anfíbios, embora esses animais possam servir de fonte alimentar para esses (GALVÃO et al, 2015). A doença de Chagas apresenta uma fase aguda, de curta duração, que na maioria dos casos progride para uma fase cronica. A fase aguda é geralmente assintomática, entretanto em 10% dos casos os sinais clínicos comecam 6 a 10 dias após a infecção e se caracterizam por um quadro febril e inespecífico, linfadenopatia, esplenomegalia e, mais raramente, uma intensa miocardite (RASSI et al, 2000). Essa fase se resolve espontaneamente em quatro a oito semanas. Entretanto, alguns pacientes, principalmente crianças ou indivíduos imunodeficientes, podem apresentar quadros meníngeos graves e insuficiência cardíaca que podem levar ao óbito (SILVA et al, 2006). Atualmente, são admitidas 150 espécies na subfamília Triatominae, agrupadas em 18 gêneros e seis tribos (ABAD-FRANCH et al, 2013; ALEVI et al, 2013; JURBERG et al, 2013; POINAR, 2013). No Brasil existem, aproximadamente, 66 espécies de triatomíneos distribuídas em 26 Estados (JURBERG et al, 2013; GARDIM et al, 2014). É conhecida a ação antrópica sobre os ambientes naturais, o que gera uma crescente devastação do meio ambiente. Isso ocorre, principalmente, para exploração de recursos naturais e aumento das áreas habitáveis e de cultivo, o que reflete em um 2 crescimento descontrolado dos municípios em várias regiões do país, onde se implantam habitações precárias, e há falta de recursos, de educação e de saneamento básico. Dessa forma, o contato do ser humano com o ambiente silvestre é cada vez maior o que gera diminuição do habitat original de muitos animais, inclusive dos triatomíneos. Todas essas ações favorecem o fenômeno de domiciliação dos insetos vetores, que se refugiam próximos aos domicílios (intra e peridomicílio), em busca de abrigo e alimento. Assim, é incessante a transmissão de várias doenças ao homem (antropozoonoses), e dentre essas, a doença de Chagas (FORATTINI, 1980; DIOTAIUTI, 2000; VINHAES; DIAS, 2000; PEÑARANDA-CARRILLO et al, 2002; TARTAROTTI et al, 2004; OLIVEIRA; SILVA, 2007). A identificação específica e a sistemática dos triatomíneos têm se pautado, fundamentalmente, em observações morfológicas, principalmente por meio de microscopia de luz (LENT; WYGODZINSKY, 1979; SHERLOCK, SERAFIM, 1967; LUCENA, 1970) utilizando como parâmetro morfológico a genitália feminina e masculina, metodologia largamente utilizada para a validação de novas espécies de triatomíneos (LENT; JURBERG, 1967, 1968, 1969, 1975; JURBERG et al, 1997; ROSA et al, 2014), bem como em outros grupos de insetos Heteropteras (WEIRAUCH; SCHUH, 2011), Coleopteras (MILLER, 2001). A partir da década de 1960, as análises morfológicas foram auxiliadas pela Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), que possibilitou uma melhor visualização dos parâmetros morfológicos com imagens mais detalhadas. Essa metodologia também auxiliou no esclarecimento do status de algumas espécies de Triatominae (ROSA et al, 1992; 1999). No entanto, apenas a análise de parâmetros morfológicos nem sempre conseguem esclarecer todas as questões taxonômicas, como é o caso de alguns complexos de espécies crípticas, como as espécies do subcomplexo Brasiliensis e espécies do gênero Rhodnius (COSTA et al, 1997; MONTEIRO et al, 2001; JURBERG, 2003). Nesses casos, a fim resolver essas questões, são necessárias ferramentas mais sensíveis, para a distinção dessas espécies, como o uso de técnicas moleculares e sequenciamento por exemplo, no sentido de não utilizar apenas caracteres morfológicos para a identificação de espécies de Triatominae (ACTIS et al, 1964). As espécies do subcomplexo Brasiliensis, que apresentam seu centro de dispersão no Nordeste do Brasil (FORATTINI, 1980) apresentam quatro padrões de coloração no pronoto, pernas e asas, cada um com distribuição em áreas distintas (COSTA et al, 1997, 1998, 2002; MONTEIRO et al, 2004; BORGES et al, 2005). 3 Devido a evidências morfológicas e genotípicas, o táxon T. brasiliensis (Neiva, 1911) sofreu várias revisões taxonômicas, pois as espécies desse grupo apresentam muitas semelhanças morfológicas, o que as torna um grupo de difícil classificação apresentando algumas espécies com o status taxonômico questionado (GARCIA et al, 1998). Schofield e Galvão (2009) agruparam os triatomíneos em complexos e subcomplexos específicos, utilizando como critérios características morfológicas e distribuição geográfica, a saber: complexo Phyllosoma, dividido nos subcomplexos Dimidiata e Phylosoma; complexo Flavida; complexo Rubrofasciata; complexo Protracta; complexo Lecticularia; complexo Dispar; complexo Infestans, que é subdivido nos subcomplexos Brasiliensis, Infestans, Maculata, Matogrosensis, Rubrovaria e Sordida e, por fim, o complexo Spinolai. Entre esses subcomplexos, vamos destacar o subcomplexo Brasiliensis que foi proposto, pela primeira vez, por Lucena, em 1970, como um arranjo sistemático denominado complexo Brasiliensis, composto, principalmente, por espécies encontradas na região Nordeste do Brasil. Esse complexo foi descrito, inicialmente, incluindo as espécies Triatoma brasiliensis Neiva, 1911, T. petrochii Pinto e Barreto, 1925, T. pessoai Sherlock e Serafim, 1967, T. lenti Sherlock e Serafim, 1967 e T. bahiensis Sherlock e Serafim, 1967 e pelas subespécies T. b. melanica Neiva e Lent, 1941 e T. b. macromelasoma Galvão, 1955. A espécie T. brasiliensis é uma das principais espécies vetoras da região Nordeste do Brasil, pois está diretamente relacionada com o clima semi-árido dessa região (LUCENA, 1970). Essa espécie habita seis Estados brasileiros: Maranhão; Paraíba; Pernambuco; Piauí; Rio Grande do Norte e Tocantins (GURGUEL-GONÇALVES et al, 2012). A espécie T. petrochii foi descrita por Pinto e Barreto, em 1925, baseada em apenas um exemplar proveniente do Rio Grande do Norte. Os autores nomearam a espécie homenageando a Dra. Juana Petrochi e a descreveram como idêntica a T. brasiliensis, diferenciando apenas por não ter manchas claras nos fêmures. Carcavallo e Martínez (1985) corrigiram o nome científico de T. petrochii para T. petrochiae, por homenagear uma mulher. Lent e Wygodzinsky (1979) confirmaram a similaridade existente entre as duas espécies, contudo ressaltaram que apresentam algumas diferenças morfológicas, tais como: ausência de fosseta esponjosa nas tíbias dos machos de T. petrochiae, rostro praticamente glabro e primeiro segmento antenal mais curto. Espínola (1971), por meio de cruzamento experimental e Monteiro et al (1998), por meio de parâmetros genéticos, confirmaram o status específico de T. petrochiae. 4 As espécies T. lenti, T. pessoai e T. bahiensis foram descritas, em 1967, como formas melânicas de T. brasiliensis (SHERLOCK; SERAFIM, 1967). As principais diferenças descritas, pelos autores, para separar as três espécies foram: em relação ao conexivo a espécie T. pessoai apresentava manchas grandes e de cor vermelha; T. lenti com manchas pequenas e amarelas e T. bahiensis com manchas de tamanho intermediário, além disso, T. bahiensis apresenta duas manchas no cório. Devido a essas semelhanças morfológicas, Lent e Wygodzinsky, em 1979, sinonimizaram T. pessoai e T. bahiensis com T. lenti. A subespécie T. b. melanica, por meio de parâmetros morfológicos, biológicos, ecológicos, enzimáticos, moleculares e cruzamentos experimentais teve seu status elevado para o nível de espécie (COSTA et al, 2006). Os autores ressaltam que T. melanica é a forma evolutiva mais diferenciada dentro do complexo, uma vez que apresenta incompatibilidade genética e produção de híbridos inviáveis em cruzamentos com os outros membros do subcomplexo Brasiliensis. Já a subespécie T. b. macromelasoma, descrita com base em formas melânicas de T. brasiliensis encontradas em domicílio (GALVÃO, 1955), foi recentemente redescrita e revalidada por Costa et al (2013). Costa e colaboradores, por meio de análises isoenzimáticas (COSTA et al, 1997a), morfológicas (estruturas das genitálias) (COSTA et al, 1997b), da superfície exocorial do ovo (COSTA et al, 1997b), biológicas (COSTA et al, 1998a), ecológicas (COSTA et al., 1998b), genéticas (MONTEIRO et al, 1999), citogenéticas (PANZERA et al, 2000), biogeográficas (COSTA et al, 2002), de cruzamentos experimentais (COSTA et al, 2003), moleculares (MONTEIRO et al, 2004) e da morfometria dos testículos (FREITAS et al, 2008) propuseram que o complexo T. brasiliensis deveria ser formado pelas espécies T. brasiliensis, T. b. macromelasoma, T. melanica e uma população de T. brasiliensis de Juazeiro/Bahia. Em 2007, Costa e Felix descreveram essa população de juazeiro como uma nova espécie, T. juazeirensis. Em 2009, Mendonça e colaboradores, por meio de reconstrução filogenética com dois genes mitocrondriais (cytb e 16S), sugeriram que T. sherlocki deveria fazer parte do complexo T. brasiliensis proposto por Costa e colaboradores. Assim, Costa et al (2013) propuseram que o subcomplexo Brasiliensis deveria ser constituído por quatro espécies (T. brasiliensis, T. melanica, T. juazeirensis e T. sherlocki) e uma subespécie (T.b. macromelasoma). T. petrochiae não foi considerado como membro do complexo pelos autores. Argola et al (2008) ressaltaram que esse inseto pode ser diferenciado dos demais agrupados no complexo pelas seguintes características: primeiro segmento antenal 5 incomumente curto, atingindo pouco mais da metade da distância entre a base e o ápice da cabeça e fosseta esponjosa ausente em machos e fêmeas. Os triatomíneos classificados no complexo T. brasiliensis por Costa et al. (2013) foram agrupados por Schofield e Galvão (2009) no complexo Infestans e subcomplexo Brasiliensis: T. brasiliensis, T. juazeirensis, T. lenti, T.melanica, T.melanocephala, T.petrochiae, T.sherlocki, T. tibiamaculata, T. vitticeps em uma tentativa de reunir a maioria das classificações propostas, por meio de dados moleculares, morfológicos e geográficos. Entretanto, Alevi et al (2012), por meio da descrição do cariótipo, propuseram que as espécies T. melanocephala, T. vitticeps e T. tibiamaculata deveriam ser excluídas do subcomplexo Brasiliensis, uma vez que diferem do número de cromossomos observado nas espécies do subcomplexo (2n= 20 autossomos + XY) por apresentarem fragmentação do cromossomo sexual X. A espécie T. vitticeps possui um sistema de determinação do sexo do tipo X1X2X3Y (SCHREIBER; PELLEGRINO, 1950; SEVERI-AGUIAR et al, 2006; ALEVI et al, 2012) e T. tibiamaculata apresenta o sistema X1X2Y (PANZERA et al., 1996), aproximando-se, dessa forma, das espécies de triatomíneos da América do Norte. Os autores também apontaram que os dados moleculares dessas três espécies não apresentaram evidências de proximidade com os outros membros desse subcomplexo. Recentemente, Gardim et al (2014), utilizando análises moleculares com os genes mitocondriais citocromo b (cytb), citocromo oxidadase subunidade I (COI) e 16S rDNA, corroboraram a exclusão dessas espécies do subcomplexo. Mendonça et al (2009) e Gardim et al (2014), por meio de reconstrução filogenética, sugeriram que o subcomplexo Brasiliensis deve ser formado pelas espécies T. brasiliensis, T. b. macromelasoma, T. juazeirensis, T. melanica e T. sherlocki. No entanto, os autores não incluíram T. lenti e T. petrochiae nos estudos moleculares. Com base em análises citogenéticas, Alevi et al (2012, 2013, 2014) sugeriram que T. lenti seja um membro do subcomplexo Brasiliensis. No entanto, os autores sugerem que análises moleculares e filogenéticas deveriam ser realizadas para confirmar a posição dessa espécie como membro efetivo do subcomplexo. Mesquita e colaboradores (2015) sequenciaram o genoma da espécie R. prolixus abrangendo 95% do genoma (~702 Mb). Com relação à sistemática dos triatomíneos, faz-se necessário o desenvolvimento de outros e novos parâmetros para a avaliação de espécies próximas. 6 Os precursores na avaliação de aspectos moleculares estudaram os padrões isoenzimáticos desses insetos (ACTIS et al, 1964; JURBERG et al, 1998; NOIREAU et al, 2002), e nos últimos anos, vários estudos visaram esclarecer dúvidas relacionadas á filogenia desse grupo (GARCIA et al, 2001; HYPSA et al, 2002; MENDONÇA et al, 2009). Novas análises têm auxiliado a elucidar questões filogenéticas sobre esses vetores usando marcadores moleculares baseados no DNA mitocondrial (mtDNA) e nuclear (nDNA). Os marcadores mais utilizados do DNA mitocondrial têm sido os fragmentos 12S, 16S, citocromo oxidase I (COI) e citocromo b (cytb) e do nDNA, ITS1, ITS2, 18S e a porção D2 do fragmento 28S (BARGUES et al, 2000; HYPSA et al, 2002; TARTAROTTI ; CERON, 2005; MARTINEZ et al, 2006). Com a disseminação da teoria filogenética e os avanços das técnicas moleculares surgiu a filogenia molecular, que estuda as relações evolutivas entre os organismos embasada em dados moleculares, como sequências de DNA, RNA e proteínas. Os dados obtidos a partir de estudos utilizando estas sequências são muitos, visto que, cada par de bases em uma sequência de nucleotídeos ou cada aminoácido de uma proteína são considerados um caráter separado (ARRIEL et al, 2006). As relações filogenéticas e a formação de complexos específicos da subfamília Triatominae ainda são muito discutidos, e, até o momento, nem todas as espécies foram avaliadas com base em marcadores moleculares, o que pode gerar enganos e controversias (LENT; WYGODZINSKY, 1979; CARCAVALLO et al, 1999; HYPSA et al, 2002; SCHOFIELD; GALVÃO, 2009). A subfamília Triatominae tem atraído atenção considerável, sendo que os primeiros estudos com foco no relacionamento evolutivo dentro das tribos que contêm os mais importantes vetores da doença Chagas (a saber, Rhodniini e Triatomini) realizados por Monteiro et al (2000) e Garcia et al (2001). Estudos subsequentes investigaram a monofilia da subfamília baseada em pequenas amostras de Triatomini, Rhodniini e não triatomíneos reduvídeos como outgroups (HYPSA, et al, 2002; SCHOFIELD e GALVÃO, 2009; DE PAULA, et al, 2005). A maioria destas análises baseou-se numa quantidade limitada de sequências nível molecular. Weirauch e Munro (2009) analisaram cinco espécies de triatomíneos representando as tribos Triatomini e Rhodniini da subfamília Reduviidae. Essa análise envolveu 89 táxons e cinco outgroups para aproximadamente 3.300 pb, utilizando os genes 16S, 28S e 18S rDNA e ,com isto, recuperou a idéia de monofilia para subfamília Triatominae. Nenhuma 7 análise incluiu representantes das outras três tribos da subfamília Triatominae, não permitindo, assim, corroborar dados morfológicos e moleculares. O gene 28S é considerado o mais longo (com até 4000 pb) e evolui um pouco mais rápido do que a região 18S, por exemplo, principalmente devido à presença de segmentos de expansão diferentes ou os chamados domínios (D1, D2, D3, etc), o que explica o seu comprimento variável de acordo com o grupo de organismos (BARGUES, et al, 2009). Em geral, regiões conservadas dentro dos genes produzem informações filogenéticas úteis para altos níveis taxonômicos, considerando que a rápida evolução de sequências dentro de espaçadores e também dentro de genes (como os domínios variáveis do gene 28S) permite que as mesmas sejam aplicadas para baixos níveis taxonômicos (BARGUES; MAS-COMA, 1997). A região nuclear variável do gene 28S (D2) é, frequentemente, usada em estudos filogenéticos na tribo Rhodniini. Dessa forma, os resultados corroboraram a hipótese de parafilia de R. robustus com a presença de uma derivada na posição 360, compartilhada com R. prolixus (MONTEIRO et al, 2000; MONTEIRO et al, 2003; MONTEIRO et al, 2014). O genoma mitocondrial, diferente do nuclear, possui algumas características particulares, tais como: o fato de ser citoplasmática, não seguindo os padrões mendelianos de segregação e não sofrendo recombinação; apresentar herança materna; possuir uma taxa de mutação relativamente rápida, o que pode ser resultado da ausência de mecanismos de reparo durante a replicação; apresentar conteúdo gênico conservado (apenas 37 genes); apresentar estrutura gênica simples (não possui DNA repetitivo, transposons, íntrons ou pseudogenes) e, ainda, apresentar alta taxa de evolução por mutação de cinco a dez vezes superiores a um gene de cópia única nuclear (BROWN, 1985; MORITZ et al, 1987; HARRISON, 1989; CORNELI; WARD, 2000; WILSON et al, 2000; DINIZ, 2005; LIU et al, 2007; BAKER et al, 2008; WEI-BING, 2009; VERGAMINI; PILEGGI; MANTELATTO, 2011). Este por possuir uma valiosa informação genética, é amplamente utilizado em estudos que abordam relações filogenéticas entre espécies, genética de populações e caracterização da variabilidade genética intra e interespecíficas (AVISE, 1994; AVISE, 2000; CHANDRA et al, 2006; COOK et al, 2008; QING-YI; QI-QUN; WEI-BING, 2009; VERGAMINI; PILEGGI; MANTELATTO, 2011). Os estudos filogenéticos em triatomíneos com genes mitocondriais tiveram início, em 1998 (GARCIA e POWELL, 1998). Em 2002, Hypsa e colaboradores 8 publicaram os resultados da amostra mais representativa de dados moleculares já descritos na literatura. Os autores utilizaram 57 espécies e fizeram inferências sobre a filogenia de três tribos da subfamília Triatominae, a partir dos genes mitocondriais ribossomais 12S e 16S. O genoma mitocondrial possui genes codificadores para duas subunidades ribossômicas (12S e 16S), 22 RNA transpotadores, três subunidades da enzima citocromo c oxidase (COI, COII e COIII), citocromo B (Cytb), subunidades 6 e 8 da ATP F0 sintase (ATP6 e ATP8) e sete subunidades da NADH desidrogenase (ND1- ND6 e ND4L). O tamanho dessa região exibe grande variação entre os organismos (BROWN, 1985; MORITZ et al, 1987). Análises do gene mitocondrial ND1, em Triatominae, demonstraram que tanto as sequências de nucleotídeos como a sequência de aminoácidos não variam homogeneamente ao longo do gene completo. Além disso, sítios polimórficos de diferentes partes do gene não parecem seguir uma taxa evolutiva uniforme dentro das diferentes linhagens de triatomíneos. Hotspot (pontos quentes mutacionais onde mutações são geradas mais frequentemente nesses sítios devido à ausência de reparo) ou regiões intragênicas conservadas aparecem em uma linhagem, mas tornam-se ausentes em outras (BARGUES; MAS-COMA, 2009). Os fragmentos do genoma nuclear, geralmente, são mais conservados que genes dos fragmentos do gene mitocondrial, portanto evoluem em taxas distintas. Regiões mais conservadas são utilizadas para análise de diversidade, relação das espécies e comparação entre táxons mais distantes. Já as regiões que evoluem rapidamente são mais adequadas para o estudo de organismos muito próximos (ABAD-FRANCH; MONTEIRO, 2005). A utilização de genes nucleares e mitocondriais demonstra ser o método que fornece informação mais valiosa a respeito da sistemática de triatomíneos, pois ambos incluem marcadores cuja utilidade já foi enfatizada em vetores da doença de Chagas (MONTEIRO et al, 2000; BARGUES et al, 2002). O sequenciamento de determinados genes permite avaliar, de forma direta, polimorfismos de DNA, fornecendo informações para inferência filogenética bem como para avaliação das relações entre organismos e populações. No entanto, como referido anteriormente, há ainda uma grande dificuldade na identificação de espécies da subfamilia Triatominae. Nesse contexto, novas análises moleculares, utilizando genes distintos, podem auxiliar no esclarecimento das questões 9 filogenéticas nesses insetos, visando contribuir para o desenvilvimento da profilaxia da doença de Chagas, visto que esta pode ser otimizada quando associada a dados biológicos dos vetores. 10 II. Objetivo Geral Com base nas informações mencionadas acima, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a relação filogenética das espécies do subcomplexo Brasiliensis (T. brasiliensis, T. b. macromelasoma, T. juazeirensis, T. melanica, T. petrochiae, T. lenti e T. sherlocki), com o sequenciamento da região do domínio D2 do gene nuclear 28S e do gene mitocondrial ND1. Estes resultados, em conjunto com as informações já disponíveis na literatura, mostraram ser de extrema importância para avaliar a relação filogenética de T. lenti e T. petrochiae com as espécies subcomplexo Brasiliensis. III. Objetivo Específico - Avaliar a relação filogenética das espécies T. lenti e T. petrochiae com os membros do subcomplexo Brasiliensis, por meio da comparação das sequencias de dois novos genes: nuclear D2 (domíneo do 28S) e mitocondrial ND1, visando fornecer subsídios para as interpretações taxonômicas e filogenéticas das espécies analisadas. 11 IV. Material e Métodos 1. Obtenção das amostras As espécies estudadas foram cedidas pelo “Insetário de Triatominae”, instalado na Faculdade de Ciências Farmacêuticas do Câmpus de Araraquara, que se encontra sob a coordenação do Prof. Dr. João Aristeu da Rosa. Para a obtenção da amostra de DNA genômico, o material genético foi extraído das pernas de exemplares adultos de cada espécie do subcomplexo Brasiliensis para ambos os genes. Os órgãos foram depositados em microtubos com etanol absoluto e armazenados no freezer, a -20°C. Como outgroup, foram utilizados indivíduos adultos da espécie Triatoma infestans, pois esta já se mostrou eficiente para estudos filogenéticos no subcomplexo Brasiliensis (GARDIM et al, 2014; MENDONÇA et al, 2009). 2. Extração de DNA Genômico O DNA genômico foi extraído utilizando o kit DNeasy Blood and Tissue kit (QIAGEN), de acordo com as instruções do fabricante. Após a extração, o DNA foi quantificado no espectrofotômetro ND-1000 NanoDrop (Uniscience) para determinação de sua concentração. Em seguida, 2µL de cada amostra de DNA genômico foram aplicadas em um gel de agarose a 1% para verificar a integridade desse material. 3. Reações em Cadeia da Polimerase (PCR) 3.1. Domínio D2 (gene nuclear DNAr28S) Os oligonucleotídeos utilizados para a amplificação dos fragmentos do domínio D2, região do gene 28S (DNAr) foram descritos por Porter e Collins (1996).  Forward: 5´- GCGAGTCGTGTTGCTTGATAGTGCAG - 3´  Reverse: 5´- TTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG - 3´ As condições para amplificação do gene nuclear D2 estão descritas na Tabela 1. 12 Tabela 1. Condições para amplificação do gene nuclear D2. Passo Etapa do Processo Temperatura Duração 1 Desnaturação inicial 95ºC 2 minutos 2 Desnaturação 95ºC 30 segundos 3 Anelamento 68ºC 30 segundos 4 Extensão 72ºC 1 minuto 5 Volta para o passo 2 - 40 vezes 6 Extensão Final 72ºC 5 minutos 3.2. Gene mitocondrial ND1 Os oligonucleotídeos do gene mitocondrial ND1 foram construídos com base da sequência correspondente de T. dimidiata (Genbank acesso AF301594, Dotson e Beard 2001), utilizando os programas Primer 3 v. 0.4.0 e Oligo Analyser 3.1, para construção e verificação da sua qualidade e integridade. O oligonocleotídeo reverse foi degenerado a fim de abranger um número maior de espécies.  Forward: 5´- TCTGATTCACCCTCAGCAAA - 3´  Reverse: 5´- GGAGCGTARGGTKTTRRGTTAT - 3´ As condições para amplificação do gene mitocondrial ND1 foram efetuadas e estão descritas na Tabela 2. 13 Tabela 2. Condições para amplificação gene mitocondrial ND1. Passo Etapa do Processo Temperatura Duração 1 Desnaturação inicial 95ºC 2 minutos 2 Desnaturação 95ºC 30 segundos 3 Anelamento 61ºC 30 segundos 4 Extensão 72ºC 1,5 minuto 5 Volta para o passo 2 - 40 vezes 6 Extensão Final 72ºC 5 minutos 4. Eletroforese Após a amplificação, os fragmentos de ambos os genes foram separados por eletroforese em gel de agarose a 1%, a uma voltagem de 90V, por aproximadamente 1:30 horas. O gel foi corado com brometo de etídio, visualizado em um transluminador UV e digitalizado. O marcador de peso molecular utilizado foi o DNA Ladder 1Kb (GE Healthcare and Life Technology). 5. Purificação dos fragmentos amplificados Logo após a eletroforese, o produto da PCR foi purificado utilizando o kit GFX PCR DNA & Gel Band (GE Healthcare and Life Technology), de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos da PCR purificados foram submetidos ao sequenciamento direto (sem a necessidade de clonagem), enviados ao Centro de Pesquisas sobre o Genoma Humano e Células-Tronco, Setor de Sequenciamento de DNA, USP – SP. 6. Análise do sequenciamento dos genes D2 e ND1 A validade das sequências obtidas de ambos os genes foi verificada a partir dos seguintes critérios: a) submetendo-as ao Nucleotide-nucleotide Blast (NCBI); b) sequenciando as fitas forward e reverse, para confirmação da região gênica. Para a avaliação das regiões, o alinhamento das sequencias foi realizado utilizando o programa “ClustalW Multiple Alignment” do “BioEdit Sequence Alignment Editor V. 7.0.9.0” (Hall, 1999) e corrigido manualmente quando necessário. Uma sequência consenso foi obtida para cada segmento de DNA de cada um dos indivíduos. 14 A análise das distâncias genéticas entre as espécies, construção de árvores filogenéticas, elaboração de matrizes de distância e observação de sítios polimórficos foram estimadas usando o programa MEGA 6.0 (TAMURA et al, 2007). A construção da rede de haplótipos Network foi gerada, por meio do programa TCS 1.21 (CLEMENTE et al, 2000). 15 V. Resultados - Os resultados do presente trabalho serão apresentados em forma de Capítulos. 16 Capítulo 1 – Artigo científico aceito para publicação na revista Genetics and Molecular Research Insights into a hotspot in the Brasiliensis subcomplex (Hemiptera, Triatominae) by analysis of the D2 domain of the gene 28S RNA A.L. Guerra 1 , K.C.C. Alevi 1 , C.A. Banho 2 , J. Oliveira 3 , J.A. Rosa 3 and M.T.V. Azeredo-Oliveira 1 1 Laboratório de Biologia Celular, Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, UNESP/IBILCE, São José do Rio Preto, SP, Brasil 2 Laboratório de Citogenética e Molecular de Insetos, Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, UNESP/IBILCE, São José do Rio Preto, SP, Brasil 3 Laboratório de Parasitologia, Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Araraquara, SP, Brasil Running title: Hotspot in the Brasiliensis subcomplex 17 ABSTRACT. The Brasiliensis subcomplex is a monophyletic group formed by the species Triatoma brasiliensis brasiliensis, T. b. macromelasoma, T. juazeirensis, T. melanica, and T. sherlocki. However, using cytogenetic data and experimental hybrid crosses, T. lenti and T. petrochiae were also grouped into this subcomplex. Monteiro and collaborators, in 2004, found independent mutations on the same locations of the cytochrome b gene, which are high frequency homoplasic sites termed hotspots. This study aimed to analyze the properties of hotspot in the nuclear gene D2 (variable region of the 28S RNA) in all species of the Brasiliensis subcomplex as well as T. lenti and T. petrochiae. These species show two transversions at position 385 (G↔C and T↔G). We suggest that this mutation in haplotype 4 may be an initial molecular tool that supports the relationship of these species with the subcomplex. In addition to the transversion at haplotype 4, these species, aside from T. melanica, also possess a transversion at position 385 (G↔T) in haplotype 1. Thus, we describe the hotspot mutations of the D2 gene for species in Brasiliensis subcomplex as follows: three transversions are present at position 385 of haplotypes 1 and 4, which are shared by members of the subcomplex as well as T. lenti and T. petrochiae. These transversions may be considered a synapomorphy between these species. However, we emphasize that new phylogenetic studies should be conducted to evaluate whether T. lenti and T. petrochiae are truly members of the Brasiliensis subcomplex. Keywords: Triatoma lenti; Triatoma petrochiae; Hotspot 18 INTRODUCTION The Triatominae subfamily consists of 150 species that are divided into18 genera (Alevi et al., 2015). These species can also be grouped into complexes and specific subcomplexes (Lent and Wygodzinsky, 1979; Carcavallo et al., 2000; Schofield and Galvão, 2009). Although complexes and subcomplexes are not valid according to the International Code of Zoological Nomenclature (Carcavallo et al., 2000) they should be considered monophyletic groups (Justi et al., 2014). Schofield and Galvão (2009) mainly used morphological characteristics and geographical distribution to group nine species in the Brasiliensis subcomplex: Triatoma brasiliensis Neiva, 1911; T. juazeirensis Costa & Felix, 2007; T. melanica Costa, Argolo & Felix, 2006; T. melanocephala Neiva & Pinto, 1923; T. petrochiae Pinto & Barreto, 1925; T. lenti Sherlock & Serafim, 1967; T. sherlocki Papa, Jurberg, Carcavallo, Cerqueira & Barata, 2002; T. tibiamaculata Pinto, 1926; and T. vitticeps Stal, 1859. However, T. melanocephala, T. tibiamaculata and T. vitticeps were excluded from this subcomplex based on cytogenetic (Alevi et al., 2012a, 2013a, 2014a, b) and molecular analyses (Gardim et al., 2014). All phylogenetic reconstructions of the Brasiliensis subcomplex were conducted with mitochondrial genes (Cyt b, 16S, COI and COII) and nuclear (18S and D2). Brasiliensis subcomplex is a monophyletic group formed by the species T. brasiliensis, , T. juazeirensis, T. melanica, T. sherlocki and subspecie T. b. macromelasoma (Monteiro et al., 2004; Mendonça et al., 2009; Gardim et al., 2014; Justi et al., 2014). However, we emphasize that T. lenti and T. petrochiae were not used in any of the phylogenetic analyses described above (perhaps due to difficulties in sample collection).Cytogenetic data (Alevi et al., 2012b; 2013b, 2014a) and experimental hybrid crosses (Mendonça et al., 2014) suggest that T. lenti can be considered as a member of this subcomplex. Monteiro et al. (2004) found independent mutations on the same sites of the Cyt b gene during phylogenetic reconstruction. These sites are high frequency homoplasic sites known as hotspots. Mutation hotspots often reflect a specific mechanism of generating mutations at a particular site and/or unusual properties of a phenotypic selection (Rogozin and Pavlov, 2003). Thus, this study aimed to analyze hotspots in the domain D2 (region of the 28S RNA), in all species of the Brasiliensis subcomplex (T. b. brasiliensis, T. juazeirensis, T. melanica, T. sherlocki and subspecie T. b. macromelasoma), as well as T. lenti and T. petrochiae. 19 MATERIAL and METHODS Seven adult specimens of each species belonging to the Brasiliensis subcomplex (except for T. melanica, where only two specimens could be collected due to difficulties with sample collection) and T. infestans (as an outgroup) were obtained from the “Insectary of Triatominae” the Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCFAR/UNESP), Campus of Araraquara, São Paulo, Brazil. These triatomines were dissected, and the legs were used for extraction of genetic material using the DNeasy Blood and Tissue Kit (QIAGEN) according to the manufacturer instructions. Amplification of variable region D2 in the 28S gene (rDNA) was performed via PCR as previously described by Porter and Collins (1996). The primers used were as follows: forward sequence: 5´GCGAGTCGTGTTGCTTGATAGTGCAG-3´ and reverse sequence: 5´- TTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3´. The cycling parameters are as follows: an initial cycle at 95°C for 2 min; 40 cycles of denaturation (95°C, 30 s), annealing (68°C, 30 s), and extension (72°C, 1 min); and one cycle at 72° C for 5 min. Following electrophoresis, the amplified fragments were purified using the GFX PCR DNA & Gel Band kit (GE Healthcare and Life Technology) according to the manufacturer instructions. Purified PCR products were subjected to direct sequencing. Samples were sent to the Research Center on the Human Genome and Stem Cells, USP/São Paulo, Brazil. Sequences of all individuals were analyzed by the BioEdit software 7.0.5, and a consensus sequence was obtained for each DNA segment. The sequences were aligned using ClustalW editor. We constructed a haplotype network using the software TCS 1.21 (Clement et al., 2000) based on the statistical parsimony method (Templeton et al., 1992). Reticulations were resolved according to common theoretical predictions about network structures (Crandall and Templeton, 1993; Posada and Crandal, 2001). RESULTS All species analyzed, except for T. infestans, presented hotspot mutations in haplotype 4, which were characterized as two transversions at position 385 (G↔C and T↔G) (Figure 1). With the exception of T. melanica, all species showed transversion at position 385 (G↔T) of haplotype 1. In addition to the mutations described above, T. 20 brasiliensis showed a transition in haplotype 2, and a transition at position 495 (C↔T) was found in the T. infestans outgroup (Figure 1). DISCUSSION The nuclear D2 variable region of the 28S RNA gene (D2) is frequently used in phylogenetic studies in the Rhodniini tribe (Monteiro et al., 2000, 2003; Díaz et al., 2014). In the Rhodniini tribe, this gene is more conserved as compared with other genes, containing only 9% variable sites (Monteiro et al., 2000). Díaz et al. (2014) observed that the D2 gene contained only 12 variable sites in the pallescens group. Monteiro et al. (2003) by means of D2 gene corroborates the paraphilia of R. robustus because R. prolixus and R. robustus from the Orinoco region share a derived C in position 360. For a long time, the species of the Brasiliensis subcomplex were considered to be chromatic variants of T. brasiliensis (Costa et al., 1998). Costa et al. (2006) elevated the specific status of T. b. melanica to T. melanica. Costa et al. (2007) described T. juazeirensis based on the T. brasiliensis population in Juazeiro/Bahia. Mendonça et al. (2009) grouped T. sherlocki into the Brasiliensis subcomplex based on phylogenetic analyses with mitochondrial genes (16S and CytB). Costa et al. (2013) revalidated and re-described the subspecies T. b. macromelanosoma based on melanin forms of T. brasiliensis encountered at housing (Galvão, 1955). All species of the Brasiliensis subcomplex have cytogenetic synapomorphies: 20 autosomes plus two sex chromosomes (XY in males and XX in females), C-blocks in one or both chromosomal ends in all autosomal pairs,a large chromocenter made up of both sex chromosomes plus two autosomal pairs, and multiple C-dots spread inthe nucleus during early meiotic prophase (Panzera et al., 2000; Alevi et al., 2013a, 2014a). T. vitticeps, T. melanocephala, and T. tibiamaculata, which were excluded from this subcomplex, have been found to have multiple sex systems and different C- heterochromatin patterns (Panzera et al., 2010; Alevi et al.,2012a, 2013a, 2014b). Hotspot analyses showed that all species belonging to the Brasiliensis subcomplex as well as T. lenti and T. petrochiae have two transversions at position 385 (G↔C and T↔G). Considering that T. lenti and T. petrochiae have the same cytogenetic characteristics described for theBrasiliensis subcomplex (Panzera et al., 2000;Alevi et al, 2012b, 2013b, 2014a), it is possible that this mutation in haplotype 4 may be an initial molecular tool that supports inclusion of these species within the subcomplex. 21 In addition to transversion in haplotype 4, all species except for T. melanica also demonstrated transversion at position 385 (G↔T) in haplotype 1. Since T. melanica is the most evolutionarily differentiated species within the subcomplex, it may have genetic incompatibility and provide unviable hybrids with other members of the Brasiliensis subcomplex (Costa et al., 2006).It is possible that this hotspot can also be a defining feature of the species within this subcomplex. In this study, we have illustrated hotspot mutations in the D2 gene for species in the Brasiliensis subcomplex, and suggest that three transversions at position 385 of haplotypes 1 and 4 are shared by members of the subcomplex as well as T. lenti and T. petrochiae. However, we emphasize that new phylogenetic studies should be conducted to evaluate whether T. lenti and T. petrochiae truly are members of the Brasiliensis subcomplex. Conflicts of interest The authors declare no conflicts of interest. ACKNOWLEDGMENTS We thank Dr. Carlos Eduardo Almeida for the assistance in constructing a haplotype network and the useful comments. We especially thank Dr. Claudia Carareto for support in the molecular analyses. The research was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). REFERENCES Alevi KC, Mendonça PP, Pereira NP, Rosa JA, et al. (2012a). 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Acta Trop. 110: 88-100. 25 Figure 1.Parsimony haplotype network showing hotspot mutations in species of the subcomplex Brasiliensis, with T. infestans as the outgroup. 26 Capítulo 2 – Artigo científico submetido para publicação na revista The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene SHORT REPORT Running title: D2 domain is conserved in South American triatomines D2 region of the 28S RNA gene: a too conserved fragment for inferences on phylogeny of South American triatomines Ana Letícia Guerra 1 , Kaio Cesar Chaboli Alevi 1* , Cecília Artico Banho 1 , Jader de Oliveira 2 , João Aristeu da Rosa 2 , Maria Tercília Vilela de Azeredo-Oliveira 1 1 Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista - São José do Rio Preto, Rua Cristovão Colombo 2265, 15054-000, São José do Rio Preto, SP, Brasil 2 Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista - Araraquara, Rod. Araraquara-Jaú km 1, 14801-902, Araraquara, SP, Brasil 27 Abstract The brasiliensis complex is composed of five triatomine species and different approaches suggest that Triatoma lenti and T. petrochiae may be the new members. Therefore, this study sought to analyze the phylogenetic relationships within this complex by means of the D2 region of the 28S RNA gene and to analyze the degree of polymorphism and phylogenetic significance of this gene for South American triatomines. Phylogenetic analysis by using sequence fragments of D2 domain did not allow performing phylogenetic inferences on species within the brasiliensis complex, because the gene alignment composed of a matrix with 37 specimens exhibited only two variable sites along the 567 bp used. Furthermore, if all South American species are included, only four variable sites were detected, reflecting the high degree of gene conservation. Therefore, we do not recommend the use of this gene for phylogenetic reconstruction for this group of Chagas disease vectors. Keywords: molecular taxonomy; nuclear gene; brasiliensis complex; infestans complex 28 Short Report Triatomines are bloodsucking insects of great importance to public health because they transmit the protozoan Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. Since 1966, triatomines have been grouped into complexes and specific subcomplexes. 1,2 Although the use of complexes and subcomplexes do not follow the International Code of Zoological Nomenclature, there is a consensus that these groupings should reflect the phylogeny. 3 Using mainly morphological characteristics and geographical distribution, Schofield and Galvão 2 grouped most of South American triatomine species within the infestans complex. This complex comprises the brasiliensis, infestans, maculata, matogrossensis, rubrovaria and sordida subcomplexes. With the exception of Triatoma melanocephala, T. vitticeps, and T. tibiamaculata, which exhibit fragmentation of the sex chromosome X, all infestans complex species have 22 chromosomes. 4,5,6,7 Using mitochondrial genes (16S, COI, COII and Cytb) and nuclear genes (18S and 28S), Justi et al. 3 analyzed the phylogenetic relationships of 64 species within the Triatominae subfamily and suggested that infestans and rubrovaria subcomplexes are monophyletic. The non-monophyly of brasiliensis subcomplex was then evidenced because T. melanocephala, T. vitticeps, and T. tibiamaculata were clustered separately, and they were then excluded via cytogenetic analysis. 5,6 With these exclusions, the brasiliensis complex is indeed a monophyletic group composed of T. brasiliensis, T. juazeirensis, T. melanica, and T. sherlocki, and subspecies T. b. macromelasoma. 8,9,10 However, it is important to note that T. lenti and T. petrochiae were not used in the phylogenetic analyses mentioned previously, possibly due their rarity. Cytogenetic data, 6,11 experimental lab-crossings, 12 morphological analysis, 2 and geographic information 2 have also suggested that T. lenti 29 may be a member of the complex. T. petrochiae has cytogenetic characteristics similar to those of brasiliensis complex. 6 The nuclear D2 region of the 28S RNA gene is frequently used in phylogenetic studies in the tribe Rhodniini 13,14,15 and was recently analyzed in the brasiliensis complex. 3 This gene consists of core segments that are highly conserved, and other useful for taxonomic purposes due to some variable regions, which are described as divergent D domains or expansion segments. 16 The authors 16 emphasized that the coexistence of variability and conserved regions along the 28S gene make this region suitable for estimating phylogenetic relationships among species, since sequence variation provides phylogenetic information while the conserved structure makes it easier to identify homology. Therefore, this study aimed to analyze the phylogenetic relationships that T. lenti and T. petrochiae share with other members of the brasiliensis complex using the nuclear D2 region of the 28S RNA gene. In addition, a comparative analysis including other species of the subcomplexes grouped within the infestans complex was conducted to address the degree of polymorphism and the phylogenetic significance of this gene among South American triatomines. Six adult specimens of each species in the brasiliensis complex were used (with the exception of T. melanica, with only 2 samples) and six adult T. infestans specimens (the outgroup) were used in the study, comprising a matrix with 37 sequences. The specimens were provided by the Triatomine Insectarium of the College of Pharmaceutical Sciences of São Paulo State University (UNESP), Araraquara Campus, in Brazil. The triatomines were dissected, genetic material was extracted from the legs using the DNeasy Blood and Tissue Kit (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions. PCR reactions were performed for amplification of the nuclear D2 variable 30 region of the 28S RNA gene according to Porter and Collins, 17 with the forward sequence: 5´-GCGAGTCGTGTTGCTTGATAGTGCAG-3´ and the reverse sequence: 5´-TTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3´. The conditions for the amplification reactions of this gene were as follows: an initial cycle at 95° C for 2 minutes, followed by 40 cycles comprising denaturation (95° C, 30 seconds), annealing (68° C, 30 seconds) and extension (72° C, 1 minute), and a final single cycle at 72° C for 5 minutes. After electrophoresis, the amplified fragments were purified using the GFX PCR DNA & Gel Band kit (GE Healthcare and Life Technology) according to the manufacturer's instructions. Direct sequencing was applied to the purified PCR products. The samples were sent to the Human Genome and Stem Cell Research Center, of the University of São Paulo (USP), Brazil. Sequences generated were analyzed using the BioEdit software, version 7.0.5, and a consensus sequence was obtained for each DNA segment. The sequences were aligned using the ClustalW. Subsequently, the MEGA 6.0 program for phylogenetic analysis was employed using the maximum likelihood method as a distance criterion. The bootstrapping resampling method was applied to assess support for the individual nodes (1,000 pseudoreplications). The Jukes–Cantor model was used to calculate genetic distances pairwise within each member of the complexes (Table 1) in the MEGA 6.0 software. In addition, the nuclear D2 variable region of the 28S RNA gene sequences deposited in GenBank for species from the infestans, maculata, matogrossensis, rubrovaria, sordida and brasiliensis subcomplexes were used (Table supplement 1). The nuclear D2 variable region of the 28S RNA gene did not allow to perform inferences on phylogenetic relationships among species within the brasiliensis complex due to the highly conserved nature of the fragments, with only two variable sites of 567 31 base pairs sequenced (Table 2, Figure Supplementary Material 1). Furthermore, when aligned with the species of the infestans complex, the gene also proved to be extremely conserved, with only four variable sites (Table 3). Phylogenetic analyses of the tribe Rhodniini showed that this gene had 9% of variable sites. 13 For species within the brasiliensis complex, however, the gene had only 0.35% of variable sites, and for the species in the infestans complex, the gene had 0.70% of variable sites. It is natural for the nuclear genes that are less polymorphic than mitochondrial, which have a rate of evolution by mutating five to ten times higher than a single copy nuclear gene. 18 However, the ITS2 nuclear intergenic region was found to have 22% of variable sites between T. infestans and the phyllosoma complex and 21.2% of variable sites between T. infestans and Dipetalogaster maxima. 19 This region was also found to have many polymorphic sites compared the tribes Triatomini and Rhodniini (85.8% variable sites). 19 Recently, Justi et al. 3 stated that DNA barcoding (COI) relies on a gene that does not separate the triatomine from South America, as observed by at least one intraespecific distance greater than the interspecific distances for species in the infestans complex. Initially, four T. brasiliensis populations were separated based on genetic distance. 20 Later, these populations were defined as T. melanica, T. juazeirensis, T. b. brasiliensis, and T. b. macromelasoma. The analysis of the distance matrix for the infestans complex species is in agreement with this study, 20 because the nuclear D2 region of the 28S RNA gene exhibited low variation (Table 1). This finding once again reflects the high degree of conservation of the gene. Our analysis confirms that the nuclear D2 region of the 28S RNA gene is not a good molecular marker for triatomine species from South America. 32 Thus, the nuclear D2 region of the 28S RNA gene did not allow for the confirmation of the phylogenetic relationships of T. lenti and T. petrochiae in comparison with the species from the brasiliensis complex. This domain proved to be extremely conserved in the South American triatomine species, thus demonstrating the fact that it is not a good molecular marker for phylogenetic studies on these vectors. Acknowledgments We thank Dr. Carlos Eduardo Almeida, Universidade Federal da Paraiba, Brazil, for the assistance in the construction of the phylogenetic tree and the useful comments and Dr. Claudia M. A. Carareto for lending the lab to perform the practical part of this work. Research supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). References 1. Usinger, RL, Wygodzinsky, P, Ryckman, RE 1966. The biosystematics of Triatominae. Annu. Rev. Entomol 11: 309-330. 2. Schofield CJ, Galvão C 2009. Classification, evolution, and species groups within the Triatominae. Acta Trop 110: 88-100. 3. Justi SA, Russo CAM, Mallet JRS, Obara MT, Galvão C 2014. Molecular phylogeny of Triatomini (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae). Paras. Vect 7: 149. 33 4. Panzera F, Pérez R, Panzera Y, Ferrandis I, Ferreiro MJ, Calleros L 2010. 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Mendonça VJ, Alevi KCC, Medeiros LMO, Nascimento JD, Azeredo-Oliveira MTV, Rosa JA 2014. Cytogenetic and morphologic approaches of hybrids from experimental crosses between Triatoma lenti Sherlock & Serafim, 1967 and T. sherlocki Papa et al., 2002 (Hemiptera: Reduviidae). Infect. Gen. Evol 26: 123-131. 13. Monteiro FA, Wesson DM, Dotson EM, Schofield CJ, Beard CB 2000. Phylogeny and molecular taxonomy of the Rhodniini derived from mitochondrial and nuclear DNA sequences. Am. J. Trop. Med. Hyg 62: 460-465. 14. Monteiro FA, Barrett TV, Fitzpatrick S, Cordon-Rosales C, Feliciangeli D, Neard CB 2003. Molecular phylogeography of the Amazonian Chagas disease vectors Rhodnius prolixus and R. robustus. Mol. Ecol 12: 997-1006. 35 15. Díaz S, Panzera F, Jaramillo-O N, Pérez R, Fernández R, Vallejo G, Saldanã A, Calzada JE, Triana O, Gómez-Palacio A 2014. Genetic, Cytogenetic and Morphological Trends in the Evolution of the Rhodnius (Triatominae: Rhodniini) Trans-Andean Group. 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JC-distance between species of the Infestans complex studied. Species 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 (1) Triatoma infestans 1 (2) T. platensis 0,000 (3) T. infestans 0,002 0,002 (4) T. wygodzinskyi 0,004 0,004 0,006 (5) T. sórdida 0,004 0,004 0,006 0,000 (6) T. guasayana 0,004 0,004 0,006 0,000 0,000 (7) T. costalimai 0,004 0,004 0,006 0,000 0,000 0,000 (8) T. circummaculata 0,004 0,004 0,006 0,000 0,000 0,000 0,000 (9) T. baratai 0,004 0,004 0,006 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 (10) T. brasiliensis 0,006 0,006 0,007 0,004 0,004 0,004 0,004 0,004 0,004 (11) T. brasiliensis 2 0,004 0,004 0,006 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 (12) T. lenti 1 0,004 0,004 0,006 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,000 (13) T. b. macromelasoma1 0,004 0,004 0,006 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,000 0,000 (14) T. juazeirensis 1 0,004 0,004 0,006 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,000 0,000 0,000 (15) T. petrochiae 1 0,004 0,004 0,006 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,004 0,002 0,002 0,002 0,002 (16) T. sherlocki 1 0,004 0,004 0,006 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,000 0,000 0,000 0,000 0,002 (17) T. melanica 1 0,004 0,004 0,006 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,004 0,002 0,002 0,002 0,002 0,000 0,002 0,000 37 Table 2. Polymorphic sites determinants of the members Brasiliensis subcomplex. Referring the fragment of 567 bp of the D2 gene. 38 Table 3. Polymorphic sites determinants of the members Infestans complex. Referring the fragment of 567 bp of the D2 gene. 39 Table supplement 1. Accession codes from Genbank sequences of Triatoma and species used in this study. Subcomplex Species D2 (28S rDNA) Infestans T. infestans 1 In this study* T. platensis GQ853400 T. infestans GQ853397 Maculata T. wygodzinskyi KC249222 Sordida T. sórdida KC249209 Matogrossensis T. guasayana KC249163 T. costalimai KC249149 T. baratai KC249143 Rubrovaria T. circummaculata KC249147 T. brasiliensis CQ853395 Brasiliensis T. brasiliensis 2 In this study* T. lenti 1 In this study* T. b. macromelasoma 1 In this study* T. juazeirensis 1 In this study* T. petrochiae 1 In this study* T. sherlocki 1 In this study* T. melanica 1 In this study* *Sequences in this study will be deposited in Genbank. 40 Triatoma petrochiae 7 Triatoma sherlocki 1 Triatoma juazeirensis 7 Triatoma juazeirensis 5 Triatoma juazeirensis 4 Triatoma juazeirensis 1 Triatoma b. macromelasoma 3 Triatoma b. macromolasoma 2 Triatoma b. macromelasoma 1 Triatoma lenti 7 Triatoma lenti 5 Triatoma lenti 4 Triatoma lenti 3 Triatoma lenti 2 Triatoma lenti 1 Triatoma brasiliensis 1 Triatoma brasiliensis 5 Triatoma brasiliensis 4 Triatoma brasiliensis 2 Triatoma sherlocki 2 Triatoma sherlocki 3 Triatoma sherlocki 4 Triatoma sherlocki 5 Triatoma brasiliensis 6 Triatoma brasiliensis 7 Triatoma b. macromelasoma 5 Triatoma b. macromelasoma 6 Triatoma b. macromelasoma 7 Triatoma juazeirensis 3 Triatoma juazeirensis 6 Triatoma petrochiae 1 Triatoma petrochiae 3 Triatoma petrochiae 4 Triatoma petrochiae 5 Triatoma petrochiae 6 Triatoma sherlocki 7 Triatoma melanica 1 Triatoma melanica 2 Triatoma infestans 1 Triatoma infestans 2 Triatoma infestans 3 Triatoma infestans 4 Triatoma infestans 5 Triatoma infestans 6 Figure supplement 1. Neighbor-joining tree based on Jukes-Cantor distances among members of Brasiliensis complex, with D2 gene. The numbers at nodes represent the bootstrap values. 41 Capítulo 3 – Artigo científico a ser submetido para publicação na revista Infection, Genetics and Evolution Phylogenetic analysis of Brasiliensis subcomplex (Hemiptera, Triatominae), by means of the ND1 mitochondrial gene Ana Letícia Guerra 1 , Kaio Cesar Chaboli Alevi 1 , Cecília Artico Banho 1 , Jader de Oliveira 2 , João Aristeu da Rosa 2 , Maria Tercília Vilela de Azeredo-Oliveira 1 1 Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista - São José do Rio Preto, Rua Cristovão Colombo 2265, 15054-000, São José do Rio Preto, SP, Brasil 2 Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista - Araraquara, Rod. Araraquara-Jaú km 1, 14801-902, Araraquara, SP, Brasil 42 ABSTRACT The Brasiliensis subcomplex was proposed initially by geographical disposal, consisting of the species Triatoma brasiliensis, T. petrochiae, T. pessoai, T. lenti and T. bahiensis and the subspecies T. b. melanica and T. b. macromelasoma. Recently, through data on phylogenetic analyzes, the subcomplex composition was changed, including the species T. brasiliensis, T. b. macromelasoma, T. melanica, T. juazeirensis, T. sherlocki, T. lenti and T. bahiensis. However, it was suggested that other phylogenetic studies with new sequences might be used to assess the position of T. lenti and T. petrochiae regarding the species of the subcomplex. Thus, this study aimed to analyze the phylogenetic relationships of species from Brasiliensis subcomplex on the bases of a new molecular marker: ND1. Phylogenetic reconstruction confirmed the monophyletic relationship of T. lenti with members of the Brasiliensis subcomplex, rescued T. petrochiae as sister group of the subcomplex, corroborated to recognize the species status of T. petrochiae regarding T. brasiliensis and supported the idea of homoploid hybridization phenomenon to T. b. macromelasoma, contributing thus to the phylogenetic knowledge included in the species of Brasiliensis subcomplex. KEYWORDS: Triatoma lenti, Triatoma petrochiae, homoploid hybridization SHORT COMMUNICATION Since 1966 the triatomines were grouped in complexes and specific subcomplexes, based mainly on morphology and geographical distribution (Usinger et al., 1966; Lucena, 1970; Lent and Wygodzinsky, 1979; Carcavallo et al., 2000; Schofield and Galvão, 2009). The Brasiliensis subcomplex was first proposed by Lucena (1970) as a systematic arrangement called Brasiliensis complex, composed of the species Triatoma brasiliensis (Neiva, 1911), T. petrochiae (Pinto and Barreto, 43 1925), T. pessoai (Sherlock and Serafim, 1967), T. lenti (Sherlock and Serafim, 1967) and T. bahiensis (Sherlock and Serafim, 1967) and the subspecies T. b. melanica (Neiva and Lent, 1941), T. b. macromelanosoma (Galvão, 1955). Lent e Wygodzinsky (1979) synonymized the species T. pessoai and T. bahiensis with T. lenti. Costa et al. (2006), by means of morphological, biological, ecological, experimental, enzymatic and molecular analyses crossings raised specific status of T. b. melanica for T. melanica. Furthermore, the subspecie T. b. macromelasoma was redescribed and revalidated by Costa et al. (2013). Through phylogenetic analysis using the mitochondrial gene Cytb, Monteiro et al. (2004) suggested that the Brasiliensis complex is a monophyletic group formed by species T. brasiliensis, T. melanica, T. b. macromelasoma and a population of T. brasiliensis from Juazeiro of which was later described as T. juazeirensis (Costa e Felix, 2007). In 2009, Mendonça et al. (2009), through mitochondrial genes Cytb and 16S, suggested that T. sherlocki was the fifth member of that complex. Schofield and Galvão (2009), mainly based on morphological characters and geographical distribution, grouped the triatomines of the South America in the Infestans complex. This complex is divided into six subcomplexes of species. In addition to the species T. brasiliensis, T. juazeirensis, T. melanica and T. sherlocki, the authors grouped, in the Brasiliensis subcomplex, the species T. lenti, T. petrochiae, as originally suggested by Lucena (1970), and the species T. melanocephala, T. vitticeps and T. tibiamaculata. Alevi et al. (2012, 2014a, 2014b), by cytogenetic analyzes excluded T. melanocephala, T. vitticeps and T. tibiamaculata of Brasiliensis subcomplex. Gardim et al (2014), by means of the mitochondrial genes Cytb, COI and 16S, presented supporte for excluding of these species from the subcomplex. 44 Mendonça et al. (2015) through several different analyses including morphology, cytogenetics, molecular and experimental hybrid crosses, revalidated the specie T. bahiensis. Moreover, the authors, utilizing the gene Cytb, have suggested that T. bahiensis is the sixth member of the Brasiliensis complex and T. lenti is the seventh member of the complex, as initially suggested by Lucena (1970), by geographical disposal, Alevi et al. (2012, 2013, 2014a), by cytogenetic analysis and Mendonça et al. (2014), by means of experimental hybrid crossing. Newly, Oliveira et al. (unpublished data) analyzed the phylogenetic relationship of T. petrochiae with the species included in the Brasiliensis subcomplex. On the bases of data on mitochondrial genes cytb, 12S, 16S, COI and intergenic regions ITS, the authors suggested that T. petrochiae is a sister group of the species included in the Brasiliensis subcomplex and also suggested that the inclusion of this species in subcomplex should be considered with caution. The authors proposed that other phylogenetic studies with new sequences to had be made to evaluate the position of T. lenti and T. petrochiae in relation to the species of the subcomplex. The ND1 mitochondrial gene belongs to family of NADH dehydrogenase 1, having an important role in oxidative phosphorylation. Analyses of the mitochondrial gene ND1, in the Triatominae subfamily, demonstrated that both the nucleotide sequences and amino acid sequences as don´t change homogeneously along the whole gene. Furthermore, polymorphic sites from different parts of the gene don’t appear to follow an uniform evolution rate within the different insect strains because hotspot or conserved intragenic regions are present in some strains but are absent in others (Bargues and Mas-Coma, 2009). Thus, this study aimed to analyze the phylogenetic relationship of species of Brasiliensis subcomplex by means of a new molecular marker: ND1. 45 We used seventeen adult specimens of each species of Brasiliensis subcomplex (except for T. melanica that due to the difficulty to obtain specimens, had only two analyzed individuals) and T. infestans (used as outgroup), previously proved to be effective in phylogenetic studies of this subcomplex (Gardim et al., 2014; Mendonca et al., 2009). All of than came from the “Insectary of Triatominae” of the Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCFAR/UNESP), Campus of Araraquara, São Paulo, Brazil were used. The triatomines were dissected and the legs used for extraction of the genetic material with the DNeasy Blood and Tissue Kit (QIAGEN), according to the manufacturer's instructions. The primers foward and reverse for the mitochondrial ND1 gene were constructed based on the sequence of the complete mitochondrial genome T. dimidiata (Genbank acess AF301594, Dotson and Beard 2001). They were constructed with the assistance of Bioedit 7.0.5 software, used to perform the alignments of sequences and Primer 3, and ITD softwares were used in the construction and verification of the quality and integrity of the generated primers. The reverse primer was degenerate to encompass a greater number of species. The desired sequence was amplified using the following primers: Forward: 5´- TCTGATTCACCCTCAGCAAA - 3´ and Reverse: 5´- GGAGCGTARGGTKTTRRGTTAT - 3´. The conditions for the amplification reactions of this gene were as follows: an initial cycle at 95° C for 2 minutes, followed by 40 cycles comprising denaturation (95° C, 30 seconds), annealing (61° C, 30 seconds) and extension (72° C, 1,5 minute) finishing with one cycle at 72° C for 5 minutes. After electrophoresis, the amplified fragments were purified using the GFX PCR DNA & Gel Band kit (GE Healthcare and Life Technology) according to the manufacturer's instructions. 46 The products of purified PCR were subjected to direct sequencing, the samples were sent to the Research Center on the Human Genome and Stem Cells, USP/São Paulo, Brazil. The sequences of all individuals were analyzed by BioEdit software 7.0.5 and a consensus sequence was obtained for each DNA segment. The sequences were aligned using the ClustalW editor. Subsequently, we used the MEGA 6.0 program for constructing a phylogenetic tree using the maximum likelihood method as a distance criterion and the model HKY+G (Hasegawa-Kishino-Yano + Gamma 0,006). The resampling by bootstrap was applied to assess support for the individual nodes (1000 repetitions). The genetic distance matrix was also constructed through the software MEGA 6.0 using the model Tamura-Nei for estimates of evolutionary divergence between sequences. As suggested by Mendonça et al. (2015), phylogenetic reconstruction with the gene confirmed the monophyletic relationship of T. lenti with members of the Brasiliensis subcomplex with 89% boodstrap (Figure 1). Oliveira et al. (unpublished data) also suggested that T. petrochiae was rescued as a sister group of species subcomplex (Figura 1). Triatoma petrochiae has been regarded for long as identical to T. brasiliensis, being differentiated only by the absence of clear spots on the femur (Pinto and Barreto, 1925). Lent and Wygodzinsky (1979) confirmed the similarity between the two species, but emphasized that they present some morphological differences. Espínola (1971), through experimental crossing and Monteiro et al. (1998), through genetic parameters confirmed the specific status T. petrochiae. Our results corroborate the specific status the T. petrochiae with 0,085 genetic distance (Tabela 1). The species T. brasiliensis, T. juazeirensis and T. b. macromelasoma showed extremely low genetic distances (Tabela 1). These low genetic distances observed for 47 these species corroborate the homoploid hybridization phenomenon described by Costa et al. (2009). The authors suggested that T. b. macromelasoma resulted from the hybrid cross between T. brasiliensis and T. juazeirensis. These data that were supported by morphological, morphometric, environmental and geographical analysis are now also supported by the present molecular data. Considering the geographical occurrence of T. b. macromelasoma (Pernambuco), which is situated between the areas of distribution of T. b. brasiliensis (north) and T. juazeirensis (south), it is suggested that the location of T. b. macromelasoma may support the natural hybridization of these species (hybrid zone). These data are reinforced by experimental crosses between T. b. brasiliensis and T. juazeirensis producing hybrids fertile, morphologically identical to T. b. macromelasoma (Costa et al, 2009; Costa, et al, 1997). The understanding of homoploide hybrid speciation has advanced substantially since this species formation mechanism has been coded for 50 years. Homoploidal hybrid speciation is defined as a hybridization process with no change in the number of chromosomes - it considered very rare (Mavarez et al, 2006). Therefore, this study corroborates the phylogenetic relationship of the species T. brasiliensis, T. b. macromelasoma, T. juazeirensis, T. melanica, T. sherlocki and T. lenti included in the Brasiliensis subcomplex, confirms that T. petrochiae is a sister group of the subcomplex, corroborating for specific status of the species, and supports, by molecular data, the homoploid hybridization phenomenon for T. b. macromelasoma. ACKNOWLEDGMENTS We thank Carlos Eduardo Almeida for constructing the phlylogenetic tree and for useful comments. Research supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado 48 de São Paulo (FAPESP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). ETHICAL STANDARDS The experiments comply with the current laws of the country in which they were performed. CONFLICT OF INTEREST The authors declare that they have no conflict of interest. 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