UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Avaliação da eficácia e da citotoxicidade in vitro do ácido ursólico e sua incorporação em emulsão cosmética Fernanda Cardoso Colombo Araraquara - SP 2018 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Avaliação da eficácia e da citotoxicidade in vitro do ácido ursólico e sua incorporação em emulsão cosmética Fernanda Cardoso Colombo Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Marcos Antonio Corrêa Araraquara - SP 2018 Colombo, Fernanda Cardoso C718a Avaliação da eficácia e da citotoxicidade in vitro do ácido ursólico e sua incorporação em emulsão cosmética / Fernanda Cardoso Colombo. – Araraquara, 2018. 123 f. : il. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas. Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos. Orientador: Marcos Antonio Corrêa. 1. Ácido ursólico (AU). 2. Antioxidante. 3. Despigmentante. 4. Antimicrobiana. 5. Citotóxico. 6. CLAE. I. Corrêa, Marcos Antonio, orient. II. Título. Ficha Catalográfica Elaborada por Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara CAPES: 40300005 FernandaCardosoColombo SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 16 2. REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 20 3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 40 3.1. Objetivo geral ............................................................................................... 40 3.2. Objetivos específicos ................................................................................... 40 4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 41 4.1. MATERIAL ................................................................................................... 41 4.2. MÉTODOS ................................................................................................... 43 4.2.1. Caracterização de MPAU ...................................................................... 44 4.2.2. Avaliação da eficácia e da citotoxicidade “in vitro” do AU ...................... 45 4.2.3. Preparo das emulsões ........................................................................... 55 4.2.4. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica para quantificação de AU em emulsão ............................................................................................. 56 4.2.5. Avaliação da estabilidade das emulsões ............................................... 63 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 65 5.1. Caracterização de MPAU ............................................................................. 65 5.1.1. Identificação qualitativa do AU por espectroscopia na região IV ........... 65 5.1.2. Avaliação da solubilidade do AU ........................................................... 67 5.2. Avaliação da eficácia e da citotoxicidade “in vitro” do AU ............................ 68 5.2.1. Avaliação da atividade antioxidante ....................................................... 68 5.2.2. Avaliação da atividade despigmentante ................................................ 72 5.2.3. Avaliação da atividade antimicrobiana ................................................... 75 5.2.4. Avaliação do potencial citotóxico ........................................................... 79 5.3. Preparo das emulsões ................................................................................. 81 FernandaCardosoColombo 5.4. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica para quantificação de AU em emulsão ..................................................................................................... 85 5.4.1. Desenvolvimento de metodologia analítica por CLAE ........................... 85 5.4.2. Validação da metodologia desenvolvida ................................................ 90 5.5. Avaliação da estabilidade das emulsões .................................................... 100 5.5.1. Teste de centrifugação ........................................................................ 101 5.5.2. Aspecto, cor e odor .............................................................................. 102 5.5.3. Determinação de pH ............................................................................ 105 5.5.4. Determinação da viscosidade .............................................................. 106 5.5.5. Determinação do teor de AU ............................................................... 108 6. CONCLUSÕES ................................................................................................ 110 7. REFERÊNCIAS ................................................................................................ 112 FernandaCardosoColombo RESUMO O aumento da preocupação com a estética e saúde corporal vem elevando a demanda por produtos cosméticos contendo ativos que previnam o envelhecimento e outras alterações cutâneas. O ácido ursólico (AU), ativo natural extraído de plantas como o alecrim e o manjericão, tem se demonstrado interessante para incorporação em cosméticos por possuir potencial antioxidante, despigmentante, propriedade antimicrobiana, entre outras. Este trabalho teve como objetivo avaliar a possibilidade da utilização do AU como um ativo cosmético multifuncional através da avaliação da eficácia e citotoxicidade in vitro do AU, bem como o preparo e avaliação de uma emulsão contendo o ativo. O potencial antioxidante do AU foi avaliado por meio de métodos de inibição de radicais como o 1,1-difenil-2-picrilhidrazila (DPPH•) e o 2,2 - azino bis-(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid (ABTS•+), tendo demonstrado atividade antioxidante, com IC50 de 235,61 µg/mL para técnica com DPPH• e 107,17 µg/mL para técnica com ABTS•+. A atividade despigmentante foi verificada através da inibição da enzima tirosinase, utilizando 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) como substrato, e apresentando como resultado um IC50 de 338,00 µg/mL. Para a avaliação da atividade antimicrobiana diversas cepas foram testadas a partir da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) pela técnica de diluição em microplacas, e da concentração bactericida mínima (CBM) pela replicação em placa de Petri, seguindo suplemento M100-S16 do CLSI. O AU demonstrou atividade antimicrobiana frente a cepa S.aureus com CIM de 25 μg/mL e CMB de 50 μg/mL; para S. epidermides com CIM de 25 μg/mL e CBM de 50 μg/mL; para E.coli, com CIM de 50 μg/mL e CBM de 50 μg/mL; a cepa P. aeruginosa revelou uma CIM de 25 μg/mL e CBM= 0. O potencial citotóxico in vitro foi avaliado através de técnica utilizando o corante 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)- (MTT) e queratinócitos humanos metabolicamente incompetentes, não tendo demonstrado citotoxicidade às células em uma concentração máxima de 50 µg/mL. Para incorporação em cosmético foi escolhida uma emulsão de alta estabilidade e como técnica de controle de qualidade do AU nessa emulsão foi desenvolvida e validada uma metodologia analítica por CLAE, utilizando os preceitos de química verde. Um estudo de estabilidade preliminar da emulsão preparada foi conduzido a fim de se avaliar a estabilidade do AU em uma emulsão estável frente a condições extremas, como temperaturas de 25, 40 e 5 ºC, luz indireta e ciclos de congelamento/ descongelamento. A emulsão preparada com AU demonstrou estabilidade para as características de pH e viscosidade, e com relação ao teor, foi mais estável a temperatura de 25 e 5 ºC. O AU, através dos ensaios in vitro realizados demonstrou caráter antioxidante, despigmentante e antimicrobiano, não sendo observada citotoxicidade às células utilizadas na faixa de concentração testada, além de ter demonstrado certa estabilidade na emulsão de escolha. Como pôde ser observado, este composto multifuncional demonstrou características in vitro de grande interesse para ser utilizado como ativo cosmético de uso tópico e possivelmente como um agente antimicrobiano, sendo assim necessário estudos mais aprofundados que possam garantir sua completa segurança e eficácia de uso. Palavras-chave: ácido ursólico (AU); antioxidante; despigmentante; antimicrobiana; citotóxico; CLAE. FernandaCardosoColombo ABSTRACT Increased concern with body esthetics and health has raised the demand for skin cosmetics containing actives that prevent aging and other skin changes. Ursolic acid (UA), a natural active extracted from plants as rosemary and basil, has shown an interesting compound for cosmetic incorporation, to possess antioxidant activity, depigmenting, antimicrobial property, among others. This study aimed to evaluate the possibility of using UA as a multifunctional cosmetic compound through the UA efficacy and cytotoxicity in vitro, and to prepare and evaluate an emulsion containing the substance. Antioxidant potential was tested using inhibition methods of radical 1,1- diphenyl-2-picrilhidrazila (DPPH•) and radical 2,2 -azinobis-(3-ethylbenzothiazoline)-6- sulfonic acid (ABTS•+) showing antioxidant activity, with IC50= 235,61 µg/mL for DPPH• technique and 107,17 µg/mL to ABTS•+ method. The depigmenting activity was given by inhibition of the enzyme tyrosinase with3,4- dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) substrate and show IC50 de 338,00 µg/mL. For evaluation of antimicrobial activity, many strains were tested from the minimum inhibitory concentration (MIC) determined by dilution method on microplates, and minimum bactericidal concentration (MBC) by Petri dish replication, following M100-S16 supplement CLSI. The UA demonstrated antimicrobial activity, with a MIC to S. aureus strain of 25 μg/mL and MBC of 50 μg/mL; to S. epidermides a MIC of 25 μg/mL and MBC of 50 μg/mL; to E. coli a MIC of 50 μg/mL and MBC of 50 μg/mL; the P. aeruginosa strain revealed a MIC of 25 μg/mL and MBC= 0. The cytotoxicity in vitro was determined for metabolically incompetent human keratinocytes ability reduce 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H- tetrazolium bromide (MTT) and as result the UA didn’t present cellular cytotoxicity in a maximum concentration of 50 µg/mL. To cosmetic incorporation, a high stability emulsion was choice and as quality control technique of UA in this emulsion, an analytical methodology for HPLC was developed and validated, using green chemistry precepts. To evaluate the emulsion, a preliminary stability study was conducted, for the purpose evaluate the stability of UA in a stable emulsion, front of extreme conditions as 25, 40 e 5 ºC temperatures, indirect light and freezing/ thawing cycles. The emulsion containing UA demonstrated stability for the pH and viscosity characteristics, and about content, was more stable with 25 and 5 ºC. The UA, through in vitro assays performed demonstrated antioxidant, depigmenting and antimicrobial character, no cytotoxicity was observed in the used cells in the concentration range tested, besides showing some stability in the emulsion of choice. As noted, this multifunctional compound demonstrated in vitro characteristics of great interest for use as topical cosmetic active and possibly as an antimicrobial agent, thus further studies are needed to ensure its complete safety and efficacy of use. Keywords: ursolic acid (UA), antioxidant, tyrosinase, antimicrobial, cytotoxic, HPLC. FernandaCardosoColombo LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura do AU e do AO. .......................................................................... 26 Figura 2. Radical DPPH• e sua forma reduzida. ....................................................... 30 Figura 3. Cascata de reações na produção dos pigmentos melânicos .................... 32 Figura 4. Espectrofotômetro de absorção na região IV Vertex 70- Bruker ............... 44 Figura 5. Esquema do preparo das microplacas para determinação da CIM ........... 51 Figura 6. Preparo das amostras finais do ensaio com MTT. .................................... 53 Figura 7. Esquema da montagem das placas para o ensaio com MTT .................... 54 Figura 8. Cromatógrafo Líquido Perkin Elmer Flexar ............................................... 57 Figura 9. Espectro de absorção IV de PDAU ........................................................... 65 Figura 10. Espectro de absorção IV de MPAU ......................................................... 66 Figura 11. Sobreposição dos espectros IV de PDAU e MPAU ................................. 67 Figura 12. Tubos reacionais do AU frente ao DPPH• ............................................... 69 Figura 13. Curva analítica do AU para a porcentagem de inibição de DPPH• .......... 69 Figura 14. Curva analítica do AA para a porcentagem de inibição de DPPH• .......... 70 Figura 15. Tubos reacionais do AU frente ao ABTS•+ ............................................... 71 Figura 16. Curva analítica do AU para porcentagem de inibição do ABTS•+ ............ 71 Figura 17. Curva analítica do AA para porcentagem de inibição do ABTS•+ ............ 72 Figura 18.Placa reacional do ensaio com tirosinase e AU ....................................... 73 Figura 19. Curva analítica do AU para porcentagem de inibição da tirosinase ........ 74 Figura 20. Curva analítica do AA para porcentagem de inibição da tirosinase ........ 74 Figura 21. Ensaio de CIM em microplaca (a) e CBM em placa de Petri (b) do AU frente à cepa S. aureus. ...................................................................................................... 77 Figura 22. Ensaio de CIM em microplaca (a) e CBM em placa de Petri (b) do AU frente à cepa S. epidermides. .............................................................................................. 77 Figura 23. Ensaio de CIM em microplaca (a) e CBM em placa de Petri (b) do AU frente à cepa E. coli. ............................................................................................................ 77 Figura 24. Ensaio de CIM em microplaca (a) e CBM em placa de Petri (b) do AU frente a cepa P. aeruginosa. ............................................................................................... 78 Figura 25. Placa reacional do ensaio de citotoxicidade com MTT ............................ 80 Figura 26. Emulsões preparadas sem AU (EM-BS) e com AU (EM-AU) .................. 83 FernandaCardosoColombo Figura 27. Características microscópicas de EM-BS (a) e EM-AU (b). .................... 84 Figura 28. Estrutura química do Poliacrilato de Sódio. ............................................. 84 Figura 29. Espectro UV de MPAU. ........................................................................... 86 Figura 30. Espectro UV de PDAU. ........................................................................... 86 Figura 31. Teste de concentrações .......................................................................... 87 Figura 32. Comparação dos cromatogramas das amostras de PDAU e MPAU ....... 88 Figura 33. Cromatograma final de MPAU 600 µg/mL ............................................... 89 Figura 34. Curva analítica final de linearidade.......................................................... 91 Figura 35. Gráfico de dispersão de resíduos ............................................................ 92 Figura 36. Cromatogramas sobrepostos das SPcb, SPd e SAm .............................. 95 Figura 37. Cromatogramas da solução de MPAU frente à solução de HCl .............. 96 Figura 38. Cromatogramass da solução de MPAU frente à solução de NaOH ........ 96 Figura 39. Cromatogramas da solução de MPAU frente à solução de H2O2 ............ 97 Figura 40. Cromatogramas da solução de MPAU frente à solução de H2O a 80 ºC . 97 Figura 41. Cromatogramas da solução de MPAU frente à solução de luz UV ......... 98 Figura 42. Emulsões submetidas à centrifugação a 3000 rpm. .............................. 101 Figura 43. Comparativo de aspecto e cor de EM-BS e EM-AU em T3 e T15 a 25 ºC ................................................................................................................................ 102 Figura 44. Comparativo de aspecto e cor de EM-BS e EM-AU em T3 e T15 a 40 ºC ................................................................................................................................ 103 Figura 45. Comparativo de aspecto e cor de EM-BS e EM-AU em T3 e T15 em luz indireta .................................................................................................................... 103 Figura 46. Comparativo de aspecto e cor de EM-BS e EM-AU em T3 e T15 em 5 ºC ................................................................................................................................ 104 Figura 47. Aspecto e cor de EM-BS e EM-AU em T12 no ciclo de congelamento/descongelamento ............................................................................. 104 Figura 48. Valores de pH da EM-BS obtidos na estabilidade preliminar ................ 105 Figura 49. Valores de pH da EM-AU obtidos na estabilidade preliminar ................ 106 Figura 50. Valores de viscosidade da EM-BS obtidos na estabilidade preliminar .. 107 Figura 51. Valores de viscosidade da EM-AU obtidos na estabilidade preliminar .. 107 Figura 52. Valores de teor de EM-AU ao longo dos 15 dias de experimento ......... 108 FernandaCardosoColombo LISTA DE TABELAS Tabela 1. Composição dos tubos reacionais para ensaio com o radical DPPH• ....... 46 Tabela 2. Composição dos tubos reacionais para ensaio com ABTS•+ .................... 47 Tabela 3. Composição dos poços reacionais do ensaio com tirosinase. .................. 49 Tabela 4. Fórmula da emulsão utilizada ................................................................... 55 Tabela 5. Preparo das soluções diluídas para análise da exatidão. ......................... 62 Tabela 6. Concentração de AU nos poços reacionais do ensaio antimicrobiano...... 76 Tabela 7. Concentração de AU nos poços reacionais do ensaio com MTT ............. 80 Tabela 8. Resultados obtidos para conformidade do sistema................................... 90 Tabela 9. Análise de variância dos valores obtidos na linearidade ........................... 92 Tabela 10. Teste t homocedástico para análise da precisão entre analistas ............ 94 Tabela 11. Resultado final para exatidão .................................................................. 99 Tabela 12. Resultados obtidos no parâmetro de robustez ...................................... 100 Tabela 13. Média e desvio padrão das concentrações (µg/mL) de AU na EM-AU no início, meio e fim do estudo de estabilidade preliminar, frente às condições submetidas ................................................................................................................................ 109 FernandaCardosoColombo LISTA DE QUADROS Quadro 1. Exemplos de estudos em diversas áreas utilizando AU. ......................... 28 Quadro 2. Estudos envolvendo metodologias por CLAE para AU. ........................... 38 Quadro 3. Significado dos termos descritivos de solubilidade .................................. 45 Quadro 4. Solubilidade do AU frente a solventes diversos ....................................... 67 Quadro 5. Análise detalhada da emulsão utilizada ................................................... 82 Quadro 6. Características físico-químicas das emulsões obtidas ............................ 83 FernandaCardosoColombo LISTA DE ABREVIATURAS AA- Ácido ascórbico ABTS•+- 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) AC- Ácido Cafeico ANVISA- Agência Nacional de Vigilância Sanitária AO- Ácido oleanólico AU- Ácido Ursólico BPF- Boas práticas de fabricação CG- Cromatografia gasosa CIM- Concentração Inibitória Mínima CLAE- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CBM- Concentração Bactericida Mínima DMSO- dimetilsulfóxido DMEM- Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DPPH•- 2,2-difenil-1-picrilhidrazil DPR- Desvio padrão relativo EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético EM-AU- Emulsão contendo ácido ursólico EM-BS- Emulsão base F calc. - Valor calculado do teste estatístico F tab. - Valor tabelado do teste estatístico IC50- Concentração inibitória de 50% IV- Infravermelho HaCat- Queratinócitos humanos metabolicamente incompetentes LD- Limite de detecção L- Dopa - 3,4- Dihydroxy-L-phenylalanine LQ- Limite de quantificação MPAU- Matéria-prima ácido ursólico MTT- 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide O/A- Óleo/água FernandaCardosoColombo OMS- Organização Mundial da Saúde PBS- Phosphate Buffer Saline PDAU- Padrão ácido ursólico RMN- Ressonância Magnética Nuclear SAm- Solução amostra SPcb- Solução placebo SPd- Solução padrão TSA- Triptona de Soja TSB- Tripticaseína Soja UV-VIS- Ultravioleta visível FernandaCardosoColombo Dedicatória Dedico este trabalho a todas as pessoas que de alguma forma estiveram envolvidas para que fosse possível seu desenvolvimento e conclusão. Assim, esta dedicatória vai para Deus, para toda minha família e amigos. Sem a amizade, tantos ensinamentos, carinho e força de vocês, eu não teria conseguido. Portanto, vocês são completamente merecedores desta dedicatória. Muito obrigada por estarem ao meu lado e fazerem parte dessa curta, porém grandiosa experiência da minha vida. FernandaCardosoColombo Agradecimentos Ao meu orientador, professor Doutor Marcos Antonio Corrêa, por ter confiado a mim o desenvolvimento de um de seus projetos e me aceitado como sua primeira orientanda de mestrado, por sempre ter me incentivado, se mostrado solicito e compreensivo, pela paciência, amizade e por ter me mostrado caminhos mais leves e tranquilos, tanto profissionais quanto pessoais, enfim por todos os enormes ensinamentos da pessoa grandiosa que é. À colaboradora e amiga Ms. Caroline Magnani Spagnol, por sempre ter estado disposta a me auxiliar em todo o desenvolvimento deste trabalho de forma integral e dedicada, pela amizade nos momentos de alegria e nos momentos de dificuldades, pela paciência e compreensão. À professora Dra. Vera Lucia Borges Isaac, ao professor Dr. André Gonzaga dos Santos e à professora Dra. Hérida Regina Nunes Salgado por todo o auxílio dado em partes importantes do desenvolvimento deste trabalho. Aos professores: Prof. Dr. Jean Leandro dos Santos, Prof.ª Dra. Regina Cicarelli e Prof.ª Dra. Juliana Álvares Duarte Bonini Campos por compartilharem seus conhecimentos e equipamentos no decorrer deste trabalho. Aos amigos que fiz na universidade durante todo o meu tempo de mestrado, e que sempre me auxiliaram de alguma forma, seja com conhecimento, troca de experiências, auxílio nos experimentos, conversas amigas nos momentos difíceis, e que além de tudo dividiram comigo os momentos de felicidade, conquistas e anseios: Bia Leone, Carol Kogawa, Dani Marcato, Alessandra Custódio, Gabi Prado, Gabi Almeida, Wagner, Isa Freitas, Ana Carolina, Ilza, Claudia, Jussara, Mari, Mateus, Caio, Vinícius, Fátima, Bia, entre outros. À minha família, por ter me dado todo suporte, apoio e incentivo, mesmo sem entender meus desejos e objetivos, e em especial à minha mãe Célia e meu pai Sérgio, que sempre acreditaram e investiram parte de seus sonhos em mim, estiveram FernandaCardosoColombo ao meu lado e me deram toda e a melhor base e educação para que eu me tornasse quem sou hoje, motivo pelo o qual se tornou possível o desenvolvimento e conclusão deste trabalho. Agradeço imensamente à Deus por ter permitido vocês como minha família. Ao meu companheiro de vida, Carlos, por toda dedicação, amor e carinho, paciência, os mais sábios conselhos, apoio incondicional em todos os momentos e por estar sempre ao meu lado nos momentos difíceis de ansiedade e angústia e nos momentos de felicidade e conquista, me mostrando todo o lado mais leve e mais simples das coisas. Sou eternamente grata a você por tudo e à Deus por ter colocado você em meu caminho. Sem você não teria sido possível chegar até aqui. À família que a vida me deu, meus queridos amigos que sempre estiveram ao meu lado tornando meus dias mais felizes e minha jornada mais leve, em especial aos amigos da Casa de Fraternidade Chico Xavier sempre presentes e dispostos a me trazerem a paz e a alegria que eu precisava para me manter firme do início ao fim, à minha sogra Neusa por todo o auxílio e apoio, e aos meus queridos amigos de longa data que sempre fizeram questão de tornar meu caminho mais alegre e divertido, além de me ensinarem a ser alguém melhor a cada dia. Aos funcionários da Faculdade de Ciências Farmacêuticas que sempre se mostraram solícitos em ajudar no que fosse necessário. À secretaria de pós-graduação, em especial Cláudia, Aniele, Daniela e Christiane. Ao Curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara da UNESP. À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal Nível Superior) pelo apoio financeiro concedido. FernandaCardosoColombo “Nascestes no lar que precisavas, vestistes o corpo físico que merecias, moras onde melhor Deus te proporcionou, de acordo com o teu adiantamento. Possuis os recursos financeiros coerentes com as tuas necessidades, nem mais, nem menos, mas o justo para as tuas lutas terrenas. Teu ambiente de trabalho é o que elegeste espontaneamente para a tua realização. Teus parentes, teus amigos são almas que atraístes, com a tua própria afinidade. Portanto, teu destino está constantemente sob teu controle. Tu escolhes, recolhes, eleges, atrais, buscas, expulsas, modificas tudo aquilo que te rodeia a existência. Teus pensamentos e vontades são a chave de teus atos e atitudes. São as fontes de atração e repulsão na tua jornada e vivência. Não reclames nem te faças de vítima. Antes de tudo, analisa e observa. A mudança está nas tuas mãos. Reprograma a tua meta, busca o bem e viverás melhor. Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim”. Francisco Cândido Xavier 16 FernandaCardosoColombo 1. INTRODUÇÃO O aumento da expectativa de vida começou a ganhar força em meados de 1950 e vem aumentando em todo o mundo, principalmente graças aos avanços na área da saúde. No entanto, para garantia da qualidade de vida, uma série de fatores deve ser levada em consideração, como o bem-estar físico, a boa saúde mental e a interação social do indivíduo. Para isso, é necessário considerar necessidades individuais, tais como autonomia, novos significados de vida e autoestima (KALACHE et al., 1987; CAMARANO et al., 2004; VERAS, 2009). Assim, a fim de garantir um corpo saudável e autossatisfação, uma crescente preocupação com a saúde e com a estética corporal tem aumentado a demanda por produtos cosméticos capazes de prevenir o envelhecimento cutâneo e o aparecimento de patologias, uma vez que, com o aumento de idade, fatores genéticos e hormonais podem reduzir a atividade plena do sistema imunológico, causando inúmeras alterações no tecido cutâneo, podendo resultar em uma pele fina e ressecada, com manchas, rugas e possíveis carcinomas. Dentre estes produtos, tem recebido considerável atenção e interesse pelo mercado, seja por forte apelo de “marketing” ou não, os que possuem ativos de origem vegetal e que, de certa forma, reforçam a crescente preocupação atual com a sustentabilidade. Por esse motivo, a pesquisa de novos ativos para incorporação em produtos de administração tópica torna-se de grande relevância (RESENDE, 2013). Além dos fatores intrínsecos do indivíduo, fatores externos como a radiação solar também podem acelerar o envelhecimento, ocasionando uma das mais pronunciadas alterações à pele, denominadas de fotoenvelhecimento, que ocorre principalmente pela ação dos raios UV, a partir da produção de espécies químicas altamente reativas e instáveis (formadas por um não-emparelhamento de elétrons), chamadas de radicais livres, que são capazes de ligar-se a diferentes classes de moléculas, como o DNA, promovendo assim danos a vários tipos celulares do organismo, inclusive os produtores de colágeno e elastina. Nesse contexto, os antioxidantes, que podem ser naturais, adquiridos na dieta, ou sintéticos, atuam combatendo essas espécies altamente reativas, auxiliando na prevenção de danos celulares (FERREIRA et al., 1997; BARREIROS et al., 2006; MONTAGNER et al., 2009). 17 FernandaCardosoColombo Outro composto importante na proteção da pele é a melanina, um pigmento produzido por células especializadas do corpo humano, os melanócitos, que confere fotoproteção contra danos causados pela radiação UV. Sua produção ocorre a partir de organelas específicas geradas pelo retículo endoplasmático dos melanócitos, os melanossomos, em cujo interior produz- se o pigmento. Tal produção é mediada pela tirosinase, uma enzima chave responsável por iniciar a cascata de processos na produção da melanina, uma vez que transforma tirosina em L-DOPA que dará continuidade ao restante da cascata. Porém, a produção exacerbada deste pigmento pode causar certos inconvenientes, como o aparecimento de manchas na pele (ANTELO et al., 2008; SPAGNOL, 2014). Alguns ativos naturais ainda pouco explorados comercialmente, têm sido estudados por apresentarem potencial atividade preventiva contra danos causados ao tecido cutâneo, destacando-se as atividades antioxidante, despigmentante, antineoplásica e anti-inflamatória. O AU, um composto triterpenóide pentacíclico é um deles, e pode ser encontrado em uma grande variedade de espécies vegetais, muitas delas de origem brasileira que possuem grande importância na medicina fitoterápica. Além de todas as atividades anteriormente citadas, também é reportado ao AU atividade antimicrobiana, tornando- o um ativo multifuncional de grande interesse para incorporação em produtos de administração tópica, uma vez que pode contribuir para a prevenção de danos diversos causados à pele e atuar, ao mesmo tempo, como um conservante antimicrobiano (LIU, 1995; FRIGHETTO et al., 2005; SILVA et al., 2008; ELOY et al., 2012). Os produtos cosméticos, segundo a RDC Nº 7 da ANVISA de 2015, podem ser classificados em produtos de grau 1 e grau 2, sendo considerados os produtos de grau 2 como “produtos de higiene pessoal, cosméticos e perfumes (...) que possuem indicações específicas, cujas características exigem comprovação de segurança e/ou eficácia, bem como informações e cuidados, modo e restrições de uso”, ou seja, produtos cosméticos que apresentam substâncias ativas em suas formulações, e, por esse motivo, seu desenvolvimento e produção requerem altos padrões de qualidade para garantir eficácia e segurança ao consumidor. De um modo geral, um dos aspectos inerentes à segurança do consumidor, diz respeito à presença de um adequado sistema conservante (incluindo conservantes antimicrobianos), já que as 18 FernandaCardosoColombo matérias primas utilizadas podem oferecer um ambiente adequado à proliferação de microrganismos que podem prejudicar a qualidade do produto, podendo ser responsáveis por sua deterioração, baixa eficácia e possíveis danos à saúde do consumidor. A atividade antimicrobiana do AU foi avaliada em alguns estudos que comprovaram um potencial antimicótico e um amplo espectro contra bactérias, principalmente as gram-positivas, podendo dessa forma, sugerir estudos mais aprofundados do AU como um possível conservante antimicrobiano (AMARAL, 2010; BRASIL, 2015; JESUS et al., 2015). A fim de avaliar a segurança de um novo ativo em estudo, também devem ser realizados ensaios de toxicidade. O potencial citotóxico de um composto pode ser traduzido como a capacidade de gerar apoptose em uma célula. No caso do AU consiste na indução da apoptose de células tumorais sem afetar as células normais, além de prevenir a transformação de células normais em cancerígenas. O mecanismo dessa citotoxicidade ainda não foi completamente esclarecido, mas sabe-se que pode estar relacionado com a habilidade do AU em inibir a replicação do DNA, à medida que inibe suas enzimas metabólicas (DALLA VECHIA et al., 2009; RESENDE, 2013). Para a escolha da veiculação de ativos no desenvolvimento de novos produtos cosméticos grau 2, existem atualmente no mercado os mais variados tipos de cosméticos para a pele, sendo que as emulsões são uma das formas mais antigas e utilizadas graças às vantagens que possui, como facilidade de aplicação e preparo, possibilidade de utilização de categorias diversas de matérias-primas e obtenção de produtos de baixo custo. Estes sistemas emulsionados são definidos como sistemas dispersos formados pela junção de dois líquidos imiscíveis, em que um se apresenta como disperso e outro como dispersante e, devido às suas grandes vantagens citadas e a possibilidade de veiculação de compostos ativos em suas fórmulas, são amplamente escolhidas para o desenvolvimento de novos produtos, principalmente aqueles com maior estabilidade (CORRÊA et al., 2012). Uma questão importante no que diz respeito à garantia da qualidade de produtos é o emprego de técnicas analíticas qualitativas e quantitativas. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é um dos métodos mais utilizados, e consiste em uma técnica de separação analítica que permite a realização de testes qualitativos e quantitativos de amostras de diversas naturezas. O desenvolvimento e 19 FernandaCardosoColombo a validação de novas metodologias (para essa e outras técnicas) exigem diversas etapas, e uma delas é a escolha dos materiais a serem utilizados, mediante as condições adotadas. Como nos últimos tempos, as mudanças climáticas ocorridas têm gerado preocupação no mundo todo, uma mudança de postura e de pensamento neste quesito tem trazido alterações significantes, principalmente para a indústria. Assim, os conceitos de sustentabilidade e química verde vêm ganhando bastante força no desenvolvimento de novos produtos e novas metodologias analíticas, uma vez que esses conceitos incluem redução da emissão de poluentes para o meio ambiente, maior segurança ao operador e menor custo (RIBANI et al., 2004; ALVES et al., 2010; ÇELIK et al., 2017; HAO et al., 2017). Ainda que o AU seja um composto natural e que apresente propriedades muito interessantes para incorporação em cosmético, é um ativo pouco explorado neste sentido no mercado e há poucos estudos que mostram a eficácia desse ácido incorporado a uma preparação com característica e apelo cosmético. Deste modo, este trabalho procurou avaliar a possibilidade da utilização do AU como um ativo cosmético multifuncional, explorando as possíveis atividades antioxidante, despigmentante e antimicrobiana. Além disso, propôs-se avaliar seu comportamento em relação à um dos quesitos de segurança, a partir do modelo de citotoxicidade in vitro realizado com cultura de células, e a avaliação de seu comportamento frente a incorporação em uma emulsão. 20 FernandaCardosoColombo 2. REVISÃO DA LITERATURA Bem-estar e saúde Introduzido na sociedade em 1948 juntamente com a fundação da Organização Mundial da Saúde (OMS), o conceito de saúde humana foi definido como sendo “o estado completo de bem-estar físico, mental e social, e não somente a ausência de enfermidade ou invalidez”, em que era considerado que para ter um completo estado de saúde ou bem- estar, todas as necessidades do indivíduo deveriam ser perfeitamente atendidas. Além disso, cada componente (físico, mental e social) era considerado isoladamente, não existindo uma conexão entre eles. Ao longo dos anos, a interpretação deste conceito foi passando por diversas modificações, e atualmente sabe-se que ideia de saúde é bem mais complexa, e pode ser considerada como um parâmetro não estático da vida (uma vez atingida), já que sofre diversas alterações com o passar do tempo, e depende de fatores que variam de indivíduo para indivíduo, como fatores biológicos (sexo, idade, genética), socioeconômicos e ambientais (condições de moradia, alimentação e geografia), sendo assim considerado como um conceito subjetivo. Uma das possíveis interpretações, mais dinâmicas deste conceito, não considera mais cada componente separadamente, mas sim a existência de uma grande interação entre eles, capaz de gerar um estado de bem-estar individual, de acordo com as condições de vida de cada um (FERRAZ, 1997; SÁ JUNIOR, 2004; PORTAL MEC, 2017). O bem-estar tornou-se sinônimo de saúde e em termos gerais significa a satisfação das necessidades, sentir-se bem e a ausência de queixas e sofrimento. A satisfação das necessidades inclui necessidades psicológicas, sociais e físicas, que estão profundamente ligadas umas às outras. Em resumo, se uma não vai bem, provavelmente irá afetar a qualidade da outra. Claro que a satisfação das necessidades não será plena, uma vez que o ser humano sempre cria necessidades, porém conseguindo contemplar os pontos principais de cada uma, já será possível gerar um estado de bem-estar e saúde (SÁ JUNIOR, 2004; PORTAL MEC, 2017). O bem-estar psicológico está envolvido com a ausência de distúrbios mentais como estresse, depressão, ansiedade, insônia, crises de pânico, entre outros; e com a presença de fatores que proporcionem prazer, felicidade e relaxamento ao indivíduo. 21 FernandaCardosoColombo Assim, a garantia desse bem-estar pode estar intimamente ligada ao bem-estar social, que inclui fatores socioeconômicos e relacionamento interpessoal, e também com o bem-estar físico que inclui a ausência de disfunções fisiológicas do corpo, que pode consequentemente conferir uma boa aparência física (ANTIENÈ et al., 2017; VUJCIC et al., 2017; PORTAL MEC). A boa estética, além de poder ser um indicativo de como se encontra a saúde física, é também o resultado de como o indivíduo cuida do seu corpo, podendo ter impacto na forma como ele se enxerga. A forma de se enxergar inclui aspectos da avaliação corporal como a percepção do próprio visual, percepção de massa corpórea, e de como outros nos enxergam, podendo ter forte influência emocional. Em resumo, a boa aparência que está atrelada a aspectos físicos e sociais pode ser um dos fatores de impacto na garantia do bem-estar emocional, sendo que esse bem- estar consequentemente poderá atuar na prevenção de doenças e até mesmo no auxílio a tratamentos de doenças já existentes. Assim, para atuar nos cuidados com o corpo físico, atualmente é possível o acesso a inúmeras estratégias, como a prática de diversas modalidades de exercícios físicos, alimentação saudável, os mais variados tipos de tratamentos estéticos, além do uso de uma gama de produtos cosméticos especializados na prevenção de muitas alterações indesejadas que podem ocorrer no corpo humano (HAMERMESH et al., 2013; LIPOWSKA et al., 2016; ANTIENÈ et al., 2017; MCCOLL-KENNEDY et al., 2017). Envelhecimento humano O envelhecimento é um processo de deterioração natural que ocorre com todos os organismos vivos em resposta ao tempo e à exposição a fatores ambientais, e causa uma série de alterações celulares, moleculares e sistêmicas, podendo gerar danos ao organismo e até mesmo a morte. Para os seres humanos esse fenômeno, também chamado de velhice, ocorre não somente fisicamente, mas também em termos mentais e sociais, e, portanto, requer cuidados específicos para garantir bem- estar, qualidade de vida e prazer ao idoso, tornando-se dessa forma um processo a ser encarado positivamente (MONTAGNER et al., 2009; SILVA et al., 2010). 22 FernandaCardosoColombo O envelhecimento populacional, conquista social que leva a um aumento da expectativa de vida, começou a ganhar força por volta da década de 1950 e vem aumentando em todo o mundo, podendo ser observado tanto em países desenvolvidos, como em países subdesenvolvidos. É um processo que ocorre graças aos avanços tecnológicos em diversas áreas, principalmente na área de pesquisa e de saúde, e que possibilita novos programas e melhoria da qualidade de vida. Dessa forma, viver por mais tempo tem se tornado um novo desejo do ser humano, acessível a todos. No entanto, uma série de fatores devem ser levados em consideração para garantia de um envelhecimento tranquilo, prazeroso e com qualidade, como o bem- estar físico, boa saúde mental e social do indivíduo, que podem ser garantidos através de políticas de saúde e de atendimento às necessidades individuais, como autonomia, participação, novos significados de vida e autoestima (KALACHE et al., 1987; VERAS, 2009; SILVA et al., 2010). A fim de garantir uma boa integridade física e autossatisfação, observa-se uma crescente preocupação com a saúde e com a estética corporal, não somente na população mais jovem, mas também na população mais velha, o que tem aumentado a demanda por alimentação mais saudável, exercícios físicos e também por produtos capazes de conter alterações indesejáveis que ocorrem no corpo por conta de envelhecimento (reações de oxidação), ação do ambiente (luz UV e agentes infecciosos) e também por fatores intrínsecos. No tecido cutâneo, inúmeras alterações podem ser listadas, devido a uma degradação do sistema imunológico por fatores genéticos e hormonais e por ação de fatores externos, que podem resultar em uma pele fina e ressecada, com manchas, rugas e possíveis carcinomas (MONTAGNER et al., 2009). A Pele A pele no ser humano, o maior órgão existente e responsável por 5 % do peso corpóreo, apresenta alta complexidade estrutural e é constituída por três partes, dispostas em diferentes níveis de profundidade, chamadas de camadas (epiderme, derme e tecido subcutâneo), que se relacionam para desempenhar inúmeras funções 23 FernandaCardosoColombo extremamente importantes ligadas ao funcionamento do corpo e a adaptações a estímulos, auxiliados por uma série de anexos (CORRÊA et al., 2012). São inúmeras as funções que podem ser listadas para a pele, como proteção mecânica ao exterior, reparação contra danos, recepção de informação sensorial, manutenção de homeostase, estética, entre outras. A função estética é responsável por caracterizar o perfil do ser humano conferindo-lhe aparência que pode se relacionar com vários aspectos da saúde humana. Em resumo, a pele humana é responsável por realizar barreira química, elétrica, microbiológica, térmica e contra a luz UV (KUMAR e PHILIP, 2007). A epiderme, camada mais externa da pele, é composta por subcamadas de células epiteliais, anexos epidérmicos e outras células importantes. A subcamada mais profunda da epiderme é a camada basal, e é responsável por gerar as outras subcamadas epiteliais, a partir da diferenciação celular. Nessa camada também estão presentes os melanócitos, células dendríticas responsáveis pela produção da melanina a ser distribuída aos queratinócitos vizinhos. A melanina é um pigmento endógeno transportado por partículas citoplasmáticas, denominadas melanossomos, dos melanócitos basais para as subcamadas mais superiores da epiderme, onde se espalham, e ao liberarem o pigmento melanina de seu interior resultam na pigmentação da pele. Dessa forma, a melanina é a responsável pela cor que a pele apresenta em cada etnia. Após a camada basal encontra-se uma subcamada intermediária, a camada espinhosa responsável por nutrir as células presentes e possui como característica mais importante a presença de desmossomos, células conectoras que realizam a ligação com células vizinhas, além de conter as células de Langerhans, responsáveis pela barreira imunológica da pele por conter linfócitos, células T epidérmicas, e as células de Merkel, células relacionadas com a recepção dos impulsos elétricos na pele. Outra subcamada intermediária da epiderme é a camada granulosa onde encontram-se presentes os precursores de queratina. Por fim, a subcamada mais externa e que consiste na primeira barreira de proteção da pele é denominada de camada córnea, e por ser uma camada mais espessa composta por células desidratadas e queratinizadas confere impermeabilidade e resistência à pele. Porém, por possuir tais características, essa camada objetiva dificultar a permeação de produtos químicos e, desta forma, pode dificultar a via tópica para a 24 FernandaCardosoColombo passagem de ativos cosméticos. Existem estratégias que buscam contornar tal situação, como por exemplo, a utilização de substâncias que alteram a permeabilidade cutânea, à medida que promovem a remoção reversível desta barreira, como os promotores de permeação, tensoativos, esfoliantes, métodos elétricos, entre outros (MARTINS e VEIGA, 2002; ANTELO et al., 2008; CORRÊA et al., 2012). Na epiderme também podem ser encontrados anexos epidérmicos, que são estruturas de origem epitelial que se invaginam para camadas mais profundas da pele diferenciando-se, como as glândulas sudoríparas e sebáceas, os pelos e as unhas, responsáveis por uma série de funções protetoras (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). Após a epiderme, é possível encontrar a derme, camada intermediária da pele, composta por tecido conjuntivo formado por fibroblastos, mastócitos, histiócitos, células endoteliais e fibras de diversas naturezas (colágena e elástica). Nessa camada é possível observar a presença de terminações nervosas, vasos e glândulas. E por fim, a última camada da pele e a mais profunda é a chamada tecido subcutâneo, camada caracterizada por apresentar uma estrutura mais complexa com a presença de células de gordura. É responsável pela proteção contra impactos mais fortes e profundos e calor, além de ser a camada responsável pela formação de rugas (CORRÊA et al., 2012). Envelhecimento cutâneo O envelhecimento cutâneo é um processo que pode ser ocasionado por dois fatores principais, que estão intimamente interligados: o envelhecimento intrínseco (genético) programado em todos os organismos, e o envelhecimento extrínseco que pode ser um fator acelerador do primeiro. No primeiro ocorrem processos genéticos como replicações menos eficientes de DNA e proliferações celulares diminuídas, o que gera como consequência perda de funções exercidas por proteínas da pele, como o colágeno, fibras elásticas e outras proteínas importantes, fazendo com que a pele tenha menos elasticidade, menor capacidade de retenção de água, entre outras alterações. Esses fatores podem mudar a estrutura das membranas, gerando flacidez à pele. Já o envelhecimento extrínseco pode ser causado por raios ultravioleta, estresse oxidativo e radicais livres, que podem causar a morte de células por oxidação 25 FernandaCardosoColombo de ácidos graxos importantes às camadas lipídicas da pele e também por causar danos ao DNA (HIRATA et al., 2004, TOBIN, 2017). Em suma, fatores intrínsecos associados a diversos fatores extrínsecos, em conjunto, apresentam forte potencial para o desenvolvimento de mecanismos de alteração celular que podem resultar em fragilização do tecido cutâneo trazendo alterações como o aparecimento de rugas (diminuição da tensão da pele com perda de firmeza e elasticidade), cicatrização menos eficiente, desordens pigmentares, diminuição da barreira de defesa e uma pele mais fina e ressecada (TOBIN, 2017). Embora a pele possua mecanismos de defesa contra fatores externos, suas atividades tornam-se reduzidas com o aumento de idade, e, na tentativa de contornar essa redução de atividade, torna-se importante buscar externamente ao organismo um possível incremento na manutenção das atividades normais da pele, pelo emprego de compostos que possam desempenhar o papel de proteção. Existem atualmente no mercado produtos cosméticos para a pele capazes de auxiliar contra alterações indesejáveis causadas tanto por fatores extrínsecos quanto intrínsecos. Tais preparações propõem veicularem substâncias ativas em suas formulações, e objetivam desempenhar um papel preventivo através da proteção desta pele. Assim, os ativos de origem vegetal têm sido cada vez mais procurados com este objetivo, por possibilitarem um tratamento cutâneo, ao mesmo tempo que podem contribuir com o desenvolvimento sustentável. Sendo assim, a pesquisa de novos produtos para administração tópica, que possam prevenir e tratar alterações causadas na pele, se tornam de grande interesse (HIRATA et al., 2004; RESENDE, 2013). Ácido ursólico O AU, um composto triterpenóide, pentacíclico, mono- hidroxilado é um ativo natural presente em várias espécies vegetais, muitas delas encontradas no Brasil, como espécies da classe Ocimum (manjericão), tais como O. basilicum, O. micranthum, O. tenuiflorum, O. gratissimum L e espécies da classe Rosmarinus, como a R. officinalis, popularmente conhecida como alecrim, além das espécies Vaccinium spp. (blueberry), V. macrocarpon (cranberry) e também em cascas de maçãs. Essas espécies são de grande importância na medicina fitoterápica e na culinária e podem 26 FernandaCardosoColombo ser facilmente encontradas. Derivado do ácido oleanólico (AO), o ácido ursólico é um isômero estrutural, que difere apenas na posição de um radical metil, como pode ser observado na Figura 1. Esses triterpernóides podem se apresentar como ácidos livres ou como agliconas (saponinas) (LIU, 1995; SILVA et al., 2008; KIM et al., 2017). Figura 1. Estrutura do AU e do AO. Fonte: autor As características do AU ainda não estão totalmente relatadas, e são poucas as informações encontradas em compêndios oficiais. Os aspectos gerais do AU encontrados foram coletados no Merk Index, e são eles: ➢ Nome genérico: Ursolic acid; ➢ Nome químico: 3β- hidroxi- urs-12-en-28-óico; ➢ Outros nomes: urson, prunol, micromerol, malol; ➢ Fórmula molecular: C30H48O3; ➢ Peso molecular: 456.71 g/mol; ➢ Composição percentual: C 78%, H10,59%, O10,51%; ➢ Solubilidade a 25º: uma parte em 88 de metanol; 178 de etanol, 140 de éter; 388 de clorofórmio; 1675 de dissulfeto de carbono. Moderadamente solúvel em acetona. Solúvel em ácido acético glacial quente e em 2% de solução alcoólica de NaOH. Insolúvel em água. O AU começou a ser estudado há algum tempo, e atualmente estudos em diversas áreas, principalmente da saúde vem sendo conduzidos a fim de explorar as 27 FernandaCardosoColombo características deste composto que tem se mostrado bastante promissor na melhoria da qualidade de vida, como pode ser observado no Quadro 1. No Brasil, seu uso vem sendo associado e prescrito em farmácias magistrais como um suplemento alimentar para ganho de massa magra. Muitas atividades podem ser atribuídas ao AU, como efeito antioxidante, atividade despigmentante (inibição da enzima tirosinase), atividade antimicrobiana, atividade citotóxica anti-neoplásica, atividade anti-inflamatória, atividade anti- chagásica, entre outras. Muitas delas estão sendo estudadas e testadas, com a intenção de utilizar este ativo em associação com diversas classes de produtos promovendo assim o desenvolvimento de novos produtos promissores na área da saúde e a melhoria das características de produtos já existentes. Não somente o AU, mas outros compostos têm despertado interesse para novas pesquisas, por apresentarem muitas dessas características também, como é o caso do ácido cafeico e do ácido ferúlico. Diante de tantas características importantes para a área cosmética farmacêutica, o AU revela- se um ativo multifuncional extremamente atrativo para a incorporação em produtos para aplicação tópica (LIU,1995; SPAGNOL, 2014). 28 FernandaCardosoColombo Quadro 1. Exemplos de estudos em diversas áreas utilizando AU. Título do trabalho Tema analisado Referência “Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid” Revisão AU- onde é encontrado, estudos e atividades relacionadas. LIU, 1995 “Variation of ursolic acid content in eigth Ocinum Species from Northeastern Brazil” Avaliação da quantidade de AU em diferentes espécies de plantas SILVA et al., 2008 “Bases moleculares da ação anti- inflamatória dos ácidos oleanólico e ursólico sobre as isoformas da ciclo- oxigenase por docking e dinâmica molecular” Investigação das ligações moleculares ocorridas entre o AU e o AO com mediadores de inflamação MAGALHÃES et al., 2012 “Aplicação de cromatografia centrífuga de contra corrente na purificação de ácido ursólico das folhas de Egenia brasiliensis Lam.” Metodologia cromatográfica utilizando AU FRIGHETTO et al., 2005 “Development and evaluation of a nanoemulsion containing ursolic acid: a promising trypanocidal agent” Avalia atividade tripanocida de uma nanoemulsão desenvolvida com ácido ursólico, bem como sua citotoxicidade OLIVEIRA et al., 2017 “Influence of oxidative stress on the antibacterial activity of botulin, betulinic acid and ursolic acid” Atividade antimicrobiana de 3 compostos, incluindo o AU OLOYEDE, et al., 2017 “Interference of ursolic acid treatment with glioma growth: an in vitro and in vivo study” Ação citotóxica do AU frente a células tumorais cerebrais BERGAMIN et al., 2017 “Cardiovascular, anthyperlipidemic and antioxidant effects of oleanolic and ursolic acids in experimental hypertension Ensaios citotóxicos, hemodinâmicos e diuréticos do AU e AO SOMOVA et al., 2003 Fonte: autor 29 FernandaCardosoColombo Radicais livres e antioxidantes Radicais livres são espécies químicas formadas ou ocasionadas por reações de óxido redução. Quando envolvidas no metabolismo de oxigênio e nitrogênio, formam espécies altamente reativas e instáveis, compostas por número ímpar de elétrons devido a um não emparelhamento dos mesmos. No corpo humano, podem ser formadas naturalmente ou por disfunções, nas reações que ocorrem a todo momento no metabolismo, principalmente para produção de energia, síntese de substâncias biológicas, fagocitose etc. Porém, a produção excessiva dessas espécies reativas pode provocar danos a tecidos e membranas, a partir da ligação a diferentes tipos de biomoléculas, causando patologias ou agravando as já existentes. Sendo assim, para auxiliar na defesa e regeneração do organismo, é necessário o combate a essas espécies químicas em excesso e/ou sua prevenção, que podem ser realizados através dos antioxidantes, substâncias capazes de bloquear a oxidação de substâncias oxidáveis ou de regenerá-las. Os antioxidantes podem ser naturais, adquiridos na dieta ou sintéticos (FERREIRA et al., 1997; HALLIWELL, 2000; BARREIROS et al., 2006). Na literatura existem alguns métodos para avaliação da atividade antioxidante de compostos, como o método do ácido tiobarbitúrico para espécies reativas utilizado por MORAIS et al. (2006), método por redução férrica, método de absorbância pelo radical oxigênio, e os métodos utilizando os radicais 1,1-difenil-2-picrilhidrazila (DPPH•) e o 2,2 -azinobis-(3-ethylbenzothiazoline) -6-sulfonic acid (ABTS•+). Dois métodos muito utilizados são os de inibição dos radicais DPPH• e ABTS•+, por se tratarem de métodos simples e de baixo custo. Esses métodos, ambos colorimétricos, consistem na redução dos radicais através de substâncias oxidáveis (doadoras de átomo de hidrogênio), com alteração de cor. Ambos os métodos podem ser lidos na região do ultravioleta visível (UV-VIS), que compreende comprimentos de onda que vão de 400 a 800 nm. No caso do DPPH• o radical apresenta-se na coloração violeta em sua forma oxidada e amarelo residual em sua forma reduzida. Já o ABTS•+ apresenta-se com uma coloração verde em sua forma oxidada e transparente quando é reduzido. A Equação 1 representa de forma simplificada a transformação que ocorre com os radicais (EREL, 2004; MOLYNEUX, 2004; MORAIS et al., 2006; PAVIA et al., 2010; ALMEIDA et al., 2013). 30 FernandaCardosoColombo 𝑅∎ + 𝑆𝐻 = 𝑅𝐻 + 𝑆∎ (1) Em que: R• = radical SH = substância oxidável S• = radical livre gerado A estrutura molecular do radical DPPH• e sua forma reduzida estão representados na Figura 2. Figura 2. Radical DPPH• e sua forma reduzida. Fonte: autor Hiperpigmentação A melanina, pigmento natural da pele, é um biopolímero responsável por, além de conferir fotoproteção, fornecer a cor da pele juntamente com outros fatores intrínsecos do organismo. Esse composto é produzido nos melanócitos através da malânogenese, em que ocorre uma série de reações catalisadas pela enzima tirosinase. A primeira reação que ocorre é a transformação de tirosina em L-dopa, seguida da transformação de L-dopa em dopaquinona. Em ambas as reações há a participação da tirosinase e, sendo assim, essa enzima pode ser considerada uma enzima chave na produção da melanina no corpo humano. No final do processo, são produzidos tipos diferentes de melanina, cada uma com um tipo de pigmento diferente. 31 FernandaCardosoColombo Um esquema representativo da produção da melanina pode ser observado na Figura 3 (GONCHOROSKI et al., 2005; VIEIRA et al., 2015). O sistema pigmentar, porém, pode sofrer algumas desordens de coloração, as discromias, que podem ser classificadas como acromias (falta de pigmentação), hipocromias (pouca pigmentação) e hipercromias (excesso de pigmentação). As hiperpigmentações acometem um número elevado de indivíduos e podem causar vários transtornos que afetam o bem-estar, uma vez que muitas dessas manchas aparecem na face. Ela pode ocorrer através da hiperestimulação dos melanócitos por fatores como: hormônios, radiação solar, radicais livres, inflamações, entre outros, que levam a um acúmulo de pigmentos na epiderme que se apresentam como manchas acastanhadas. Essas machas podem se manifestar de diversas formas, como cloasmas, melasmas, hiperpigmentação periorbital, lentigens, entre outras (NICOLETTI et al., 2002; GONCHOROSKI et al., 2005; SATO et al., 2007). 32 FernandaCardosoColombo Figura 3. Cascata de reações na produção dos pigmentos melânicos Fonte: SPAGNOL, 2014, adaptado de PROTA, 1980; ALMEIDA, 2013 Sendo assim, o desenvolvimento de novos tratamentos preventivos para as hipercromias, é de extrema importância na manutenção do bem-estar físico, principalmente para a população idosa que têm aumentado nos últimos anos (NICOLETTI et al, 2002). A inibição da atividade da tirosinase tem se demonstrado uma técnica bastante interessante em terapias para tratamento dermatológico de manchas causadas pela hiperprodução dos melanócitos, por diminuir a produção de melanina e consequentemente clarear a pele. A principal substância, muito utilizada no Brasil para esse tipo de terapia, é a hidroquinona, porém apresenta uma série de efeitos adversos indesejados como demartite de contato, irritação local, acromias secundárias, 33 FernandaCardosoColombo catarata, entre outras, e que inclusive indicaram sua proibição de uso em alguns países. Tal situação sugere, em termos globais, a busca por alternativas eficazes e seguras para suprir ou atender a necessidade de ativos que contemplem a terapia pigmentar (COSTA et al., 2010). Antimicrobianos Atualmente o mercado de produtos e serviços encontra-se em um contexto em que a qualidade se tornou um item indispensável e extremamente criterioso para garantia de aceitação do produto ou serviço pelos consumidores. A segurança de um produto é um item indispensável à sua qualidade, principalmente quando se refere à sua segurança microbiológica. Tem se tornado crescente a busca por produtos naturais para utilização e substituição de antimicrobianos clássicos (sintéticos), optando-se por materiais que sejam eficazes e menos agressivos tanto para o homem quanto para a natureza. Compostos naturais que apresentam atividade antimicrobiana tem se demonstrado bastante interessantes para a substituição ou redução de conservantes sintéticos, e como novas alternativas terapêuticas eficazes no tratamento de patologias causadas por bactérias (ANTUNES et al., 2006; PACKER et al., 2007; SOUZA et al., 2007). Como representantes da classe de produtos naturais podemos citar os flavonoides, taninos, triterpenóides, entre outros. Os triterpenóides podem ser considerados como a subclasse que apresenta o maior número de representantes da classe. O AU, pertencente aos triterpenóides, é um composto apresentado na literatura como detentor de atividade antimicrobiana (KOZAI et al., 1987; JESUS et al., 2015; OLOYEDE et al., 2017). Ensaios de toxicidade Para a garantia de segurança e eficácia de um novo produto cosmético em desenvolvimento, principalmente aqueles que levam substâncias ativas em suas fórmulas devem ser realizados ensaios de toxicidade e irritabilidade, de acordo com a aplicabilidade do produto, a fim de prever os possíveis efeitos tóxicos no consumidor final. Atualmente, a utilização de animais para esses tipos de ensaios tem sido alvo 34 FernandaCardosoColombo de muitas críticas e rigoroso controle, sendo necessário a utilização de métodos alternativos em substituição aos modelos animais. Diante deste fato, os testes in vitro tem se demonstrado muito promissores na detecção de toxicidade para seres humanos. Como exemplo destes testes in vitro, é possível citar os ensaios com artemia salina, atividade hemolítica e ensaios com cultura de células, amplamente utilizados por conta das vantagens que oferecem de serem reprodutíveis, sensíveis e rápidos. Entre os ensaios de citotoxicidade é possível citar o modelo de difusão em ágar, método do corante vermelho neutro e o método utilizando o corante 3-(4,5- dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), que possuem como princípio avaliar a viabilidade e morte celular (ROGERO et al., 2003; BEDNARCZUK et al., 2010). O potencial citotóxico de um composto pode ser traduzido como a capacidade de gerar apoptose em uma célula. No caso do AU consiste na indução da apoptose de células tumorais sem afetar as células normais, além de prevenir a transformação de células normais em cancerígenas. O mecanismo dessa citotoxicidade ainda não foi completamente esclarecido, mas sabe-se que pode estar relacionado com a habilidade do AU em inibir a replicação do DNA, à medida que inibe suas enzimas metabólicas (DALLA VECHIA et al., 2009; RESENDE, 2013). Desenvolvimento e validação de metodologias analíticas e os preceitos de química verde Para que a qualidade de um produto cosmético possa ser assegurada, a indústria se utiliza de inúmeras estratégias e ferramentas da qualidade a fim de garantir a padronização e confiabilidade do mesmo. O controle de qualidade, bem como as Boas Práticas de Fabricação (BPF) e a garantia da qualidade, estão inseridas dentro do gerenciamento farmacêutico, compondo assim um sistema eficiente, capaz de conferir qualidade ao produto final (BRASIL, 2010). O setor de controle de qualidade é responsável por realizar uma série de procedimentos e ensaios tanto em produtos acabados como em matérias primas, garantindo assim sua qualidade e padronização. Para isso, diversos métodos de identificação, caracterização e quantificação de compostos podem ser empregados, 35 FernandaCardosoColombo como titulações de natureza diversa, análise de solubilidade, pH, densidade, reologia, espectroscopias variadas (região do ultravioleta (UV), região do infravermelho (IV), ressonância magnética nuclear (RMN), espectroscopia de absorção atômica, de massas), entre outras. Acopladas a algumas dessas técnicas encontram-se técnicas de separação de compostos, como a cromatografia e a eletroforese, constituindo assim sistemas eficientes para identificação e quantificação de amostras diversas, como farmacêuticas, biológicas e de alimentos (RIBANI et al., 2004; BRASIL, 2010; DE MARIA e MOREIRA, 2007; SPAGNOL, 2014). A cromatografia é uma técnica de separação de compostos que tem como princípio a interação de moléculas através de suas polaridades, e que permite o reconhecimento de uma substância pela comparação com padrões de referência, bem como a separação de compostos de interesse presentes em amostras compostas (misturas). Existem vários tipos de cromatografias, como a cromatografia gasosa (CG), cromatografia em camada delgada e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A CLAE é amplamente utilizada em laboratórios de controle de qualidade pelas vantagens de fornecer dados qualitativos e quantitativos de amostras quando associada a outras técnicas; por ser possível utilizar amostras de diferentes naturezas e pela possibilidade de analisar mais de um composto por ensaio (DE MARIA e MOREIRA, 2007; ELOY et al., 2012). Diversas metodologias utilizando CLAE e outras técnicas são empregadas para a análise de compostos, porém para se fazer o uso de uma já existente que não esteja presente em compêndios oficiais, ou para o desenvolvimento de uma nova é necessário cumprir certas exigências e critérios, geralmente determinados por órgãos responsáveis, para que os dados gerados pela metodologia em questão sejam seguros e confiáveis. A essas exigências e critérios é dado o nome de validação, e, no Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) é a responsável por definir e fiscalizar (RIBANI et al., 2004). Segundo a RDC 166 de 24 de julho de 2017, que “dispõe da validação de métodos analíticos para insumos farmacêuticos, medicamentos e produtos biológicos, a validação deve demonstrar que o método analítico produz resultados confiáveis e adequados à finalidade a que se destina”. Dessa forma, tal legislação define alguns 36 FernandaCardosoColombo parâmetros para a validação de metodologias, como exatidão, precisão, seletividade, limite de detecção e quantificação, linearidade e robustez (BRASIL, 2017). ✓ Exatidão: avalia o grau de recuperação de um método, a partir da concordância entre os resultados individuais de cada concentração escolhida (alta, média e baixa), sempre contemplando o intervalo linear do método. ✓ Precisão: a precisão irá avaliar a proximidade de resultados obtidos quando a amostra for submetida a diferentes condições, como por exemplo diferentes analistas, ou através de ensaios repetidos. Pode ser avaliada através da repetibilidade (intradia) precisão intermediária (entre analistas) e reprodutibilidade. ✓ Seletividade: Analisa a capacidade de componentes de matriz e/ou impurezas interferirem no sinal do analito em questão. Deve ser testada submetendo o analito a soluções estresse e frente a matriz da amostra. ✓ Limite de detecção e quantificação: demonstram as menores quantidades detectáveis do analito, e a menor quantidade quantificável de forma precisa e exata. ✓ Linearidade: demonstra o quanto um método é linear, ou seja, se a respostas analítica é proporcional à concentração analisada do composto. ✓ Robustez: por fim a robustez de um método irá avaliar se pequenas mudanças inseridas no método são ainda capazes de produzir resultados com baixo desvio. Durante centenas de anos o homem explorou os recursos da Terra de forma excessiva e irresponsável, sem que existisse uma preocupação do que essa ação poderia gerar a longo prazo. Provavelmente acreditava-se que os recursos da natureza eram inesgotáveis e poderiam ser utilizados sem moderação. Com o avanço intelectual e tecnológico o ser humano começou a perceber o desequilíbrio físico- químico que a Terra estava iniciando, graças à irresponsabilidade com a utilização dos recursos naturais. Foi assim que se iniciou uma conscientização em relação aos assuntos ambientais, e em 1972 ocorreu a primeira conferência de discussão 37 FernandaCardosoColombo ambiental, a Conferência de Estocolmo. Desde então, o ser humano vem se preocupando cada vez mais em se desenvolver de forma sustentável, pesquisando e investindo em tecnologias que possam auxiliar neste desenvolvimento, de forma a gerar menos resíduos, substituir recursos esgotáveis e preservar a natureza (SILVA et al., 2005). Assim, no início dos anos 90 um novo conceito surgiu, o da Química Verde, tendo como proposta principal a redução e eliminação de resíduos tóxicos, a partir do desenvolvimento de produtos, processos e metodologias analíticas sustentáveis. Esse novo preceito baseia-se em doze princípios, e alguns deles são: prevenção da geração de resíduos, substituição para substâncias menos tóxicas, redução do uso de solventes, reutilização (reciclagem) de compostos, processos mais eficientes energeticamente, minimização de acidentes, entre outros. Uma sugestão para a substituição de solventes tóxicos seria a utilização de água como solvente. Outras substâncias também poderiam ser utilizadas na metodologia por serem menos poluentes, como o etanol e o ácido acético (PRADO et al., 2003; SILVA et al., 2005; ÇELIK e YIDIZ, 2017). Atualmente não existem métodos analíticos descritos nos compêndios oficiais para identificação e quantificação de AU em formulações. No entanto, é possível encontrar na literatura estudos de desenvolvimento e validação de metodologias analíticas para o AU envolvendo CLAE, como pode ser observado no Quadro 2. 38 FernandaCardosoColombo Quadro 2. Estudos envolvendo metodologias por CLAE para AU. Comprimento de onda (nm) Fase móvel Tempo de retenção (min) Vazão (mL/min) Tipo de coluna Referência 203 Acetonitrila: água (88:12) 11 1,0 C18- 250 mm Eloy et al., 2012 210 Metanol: tampão fosfato (88:12) - 1,0 C18- 250 mm Zhou et al., 2007 215 Metanol: água (95:5) 21,57 0,4 C18- 250 mm Xu et al., 2012 210 Acetonitrila: água (85:15) - 1,0 C18- 250 mm Alvarado et al., 2015 210 Acetonitrila: metanol (80:20) 12,36 0,5 C18- 250 mm Taralkar e Chattopadhyay, 2012 Fonte: autor Como é possível observar, as metodologias encontradas em literatura para o AU não apresentam preceitos de química verde, demonstrando assim a importância relevante para o desenvolvimento de metodologias menos poluentes, mais seguras e mais baratas para análise qualitativa e quantitativa de AU em formulações. Emulsões e produtos cosméticos As emulsões podem ser definidas como sistemas bifásicos dispersos, termodinamicamente instáveis, formados pela união de dois líquidos imiscíveis, em que um se apresenta como disperso (fase descontínua/ interna) e outro como dispersante (fase contínua/ externa), através da estabilização por agentes emulsificantes na interface óleo/água. Esses sistemas emulsionados podem ser classificados de acordo com a natureza da fase dispersa (lipo ou hidrossolúvel), como óleo/água (O/A), isto é, quando a fase dispersa é a fase oleosa, ou água/ óleo (A/O), quando a fase dispersa é do tipo aquosa, sendo que as emulsões do tipo O/A são as 39 FernandaCardosoColombo mais utilizadas; e também podem ser classificadas quanto à consistência, segundo sua aplicabilidade, natureza química ou quanto às propriedades/finalidades (FRANGE e GARCIA, 2009; CORRÊA, 2012; FRANZOL e REZENDE, 2015). A aplicabilidade das emulsões é possível ser observada em várias áreas, como na alimentícia, agroquímica, de revestimentos, cosmética e farmacêutica, sendo que as duas últimas são consideradas como as mais complexas, devido a possibilidade de utilização de matérias-primas das mais variadas categorias e natureza química, bem como a veiculação de uma gama de compostos ativos em suas fórmulas. Na área cosmética, as emulsões são amplamente escolhidas para o desenvolvimento de novos produtos, principalmente para administração tópica, por se tratarem de uma das formas mais antigas utilizadas que apresentam como outras vantagens a facilidade de aplicação, preparo e a obtenção de produtos de baixo custo (PIANOVSKI, 2008; CORRÊA, 2012; FRANZOL e REZENDE, 2015). Os produtos cosméticos, segundo a RDC Nº 7 da ANVISA, podem ser classificados em produtos de grau 1 e grau 2, sendo considerados os produtos de grau 2 como “produtos de higiene pessoal, cosméticos e perfumes (...) que possuem indicações específicas, cujas características exigem comprovação de segurança e/ou eficácia, bem como informações e cuidados, modo e restrições de uso”. Assim, são encontrados diversos produtos cosméticos que carregam em suas fórmulas substâncias ativas, principalmente produtos para a pele. Atualmente, a demanda por esses produtos, cujo desenvolvimento e produção requerem altos padrões de qualidade para garantir eficácia e segurança ao consumidor, vem aumentado graças ao aumento da expectativa de vida associada ao bem-estar, uma vez que são capazes de tratar e prevenir alterações indesejadas na pele. Sendo assim, a pesquisa por novos ativos para incorporação em cosmético, principalmente os de caráter multifuncional demonstram-se muito atrativos para o mercado (AMARAL, 2010; RESENDE, 2013; BRASIL, 2015). 40 FernandaCardosoColombo 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo geral Este trabalho teve como objetivo a investigação da eficácia do ácido ursólico através de avaliação in vitro de seu potencial antioxidante, despigmentante e antimicrobiano, a fim de explorá-lo como um ativo cosmético multifuncional que pudesse ser utilizado na prevenção de efeitos indesejáveis na pele, e que ao mesmo tempo pudesse atuar como um conservante antimicrobiano; a avaliação de seu potencial citotóxico in vitro; e o estudo de uma emulsão contendo o ativo. 3.2. Objetivos específicos Caracterização de matéria-prima (MP) contendo AU ➢ Identificação qualitativa do AU por espectroscopia na região de infravermelho (IV); ➢ Avaliação da solubilidade do AU frente a solventes variados; Avaliação da eficácia e da citotoxicidade “in vitro” do AU ➢ Avaliação da atividade antioxidante; ➢ Avaliação da atividade despigmentante; ➢ Avaliação da atividade antimicrobiana; ➢ Avaliação do potencial citotóxico. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica para quantificação de AU em emulsão ➢ Desenvolvimento de metodologia analítica por CLAE; ➢ Validação da metodologia analítica desenvolvida. Incorporação do AU em emulsão ➢ Preparo e avaliação de características físico-químicas das emulsões preparadas; ➢ Avaliação da estabilidade das emulsões preparadas. 41 FernandaCardosoColombo 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. MATERIAL Equipamentos ✓ Espectrofotômetro Spectrostar Nano, BMG LABTECH, com leitor de microplaca; ✓ Ultrassom Ultrasonic Cleaner, Unique®; ✓ Cromatógrafo líquido PDA analítico- Perkin Elmer Flexar, com desgaseificador, sistema quaternário de bombeamento, injetor manual de 6 vias Rheodyne, forno de coluna, detector PDA com cela analítica (190-700 nm) e detector UV- VIS com cela preparativa ✓ Coluna cromatográfica RP18 Waters® (XDB, 4,6 x 250 mm, 5 μm) ✓ Coluna cromatográfica Phenomenex® C18 (4,6 x 250 mm, 5 μm; 110A) ✓ Espectrofotômetro de absorção na região de infravermelho médio com transformada de Fourier-BRUKER, modelo VERTEX 70, com detector DLaTGS, faixa de leitura 400 a 4000 cm -1 ✓ Estufa para cultura bacteriológica ECB 1.2 digital Odontobrás ✓ Balança analítica Shimadzu modelo AY220 ✓ Micropipetadores Eppendorf de 5000 (500 a 5000), 1000 (100 a 1000) e 100 (10 a 100) µL ✓ Cromatógrafo líquido Perkin Elmer Flexar, com desgaseificador, sistema de bombeamento, injetor manual e detector UV-VIS ✓ Estufa de CO2 para crescimento celular- Shel Lab ✓ Centrífuga BOECO modelo U-32 R ✓ pHmetro digital- Gehaka PG 1800 ✓ Viscosímetro digital programável- Brookfield modelo RV-III ✓ Centrífuga Centribio. 42 FernandaCardosoColombo Reagentes, soluções e outros materiais ✓ Rosemary Extract 90% (AU) - Sabinsa Corporation; ✓ Ursolic Acid 99,2%- Sigma Aldrich®; ✓ Água destilada ✓ Água ultrapura obtida pelo sistema Mili-Q® ✓ Dimetilsulfóxido (DMSO) grau analítico- Synth ✓ Metanol grau analítico- Synth ✓ Etanol grau analítico- Dinâmica ✓ Tirosinase (80 unidades/mL) Sigma Aldrich® ✓ Radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazila (DPPH•)- Sigma Aldrich® ✓ Radical 2,2 -azinobis-(3-ethylbenzothiazoline) -6-sulfonic acid (ABTS•+)- Sigma Aldrich® ✓ Ácido ascórbico- Sigma Aldrich® ✓ Persulfato de potássio- Synth ✓ Tampão fosfato pH 6,8 ✓ 3,4- Dihydroxy-L-phenylalanine (L- Dopa)- Sigma Aldrich® ✓ Placas de 96 poços- Falcom® ✓ Cepas: Staphylococcus aureus ATCC 6538; Staphylococcus epidermides ATCC 12228; Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. ✓ Caldo tripticaseína de soja (TSB)- Prolab ✓ Placa de Petri 9 cm de diâmetro- Pyrex ✓ Meio de cultura ágar triptona de soja (TSA)- Prolab ✓ Antibióticos: cefazolina sódica e aztreonam- ABL ✓ Revelador 7-hidroxi-3H-phonoxazin-3-ona10-óxido (resazurina)- Sigma Aldrich® ✓ Cetearyl Alcohol ✓ Ceteareth-20 ✓ Ethylhexyl Stearate ✓ Glyceryl Stearate ✓ Propylene Glycol ✓ Disodium EDTA 43 FernandaCardosoColombo ✓ Methylparaben ✓ Propylparaben ✓ Sodium Polyacrylate (RapithixTM A-100) ✓ Filtro hidrofóbico de PTFE 0,22 µm ✓ Água ultrapura Mili- Q® ✓ HCl - Qhemis ✓ NaOH - Qhemis ✓ Solução de peróxido de hidrogênio 10 volumes- Impex ✓ Ácido acético glacial grau HPLC- J.T.Baker ✓ Etanol grau HPLC- Applichem® ✓ Etanol grau HPLC- J.T Baker® ✓ Frascos para crescimento celular de 25 e 75 cm2 de área de crescimento- TPP ✓ Meio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) alta glicose- Cultilab ✓ Soro fetal bovino- Cultilab ✓ Solução antibiótica e antimicótica (100x- penicilina- 10000 U/mL, streptomicina- 10 mg/mL e anfotericina B- 25 µg/mL - SLBB2618) - Sigma Aldrich® ✓ Phosphate Buffer Saline (PBS) ✓ Tripsina estéril 10x (Gamma Irradiated)- SAFC Biosciences TM ✓ Tubos Falcon de 15 e 50 mL ✓ Filtro de seringa de 0,22 µm- KASV ✓ 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide MTT- Sigma Aldrich® 4.2. MÉTODOS A fim de simplificar a terminologia, a matéria prima utilizada nos experimentos fornecida pela Sabinsa Corporatio® (Rosemary Extract- AU 90%) foi denominada por matéria-prima ácido ursólico (MPAU), e o padrão utilizado, comprado da Sigma Aldrich® foi denominado por padrão ácido ursólico (PDAU). 44 FernandaCardosoColombo 4.2.1. Caracterização de MPAU 4.2.1.1. Identificação qualitativa do AU por espectroscopia na região de IV A identificação qualitativa do AU por espectroscopia de absorção na região de infravermelho foi realizada em espectrofotômetro de absorção na região de infravermelho médio com transformada de Fourier, na faixa de leitura de 400 a 4000 cm -1. O equipamento utilizado está representado na Figura 4. Pequenas quantidades de amostra em pó de PDAU e de MPAU foram colocadas sobre o cristal de diamante presente no centro do equipamento, e dessa forma as amostras foram lidas diretamente com auxílio do software Opus 7,5 (LABORATÓRIO I MULTIUSUÁRIOS DE ANÁLISES QUÍMICAS). Figura 4. Espectrofotômetro de absorção na região IV Vertex 70- Bruker Fonte: Laboratório I Multiusuário de Análises Químicas 4.2.1.2. Avaliação da solubilidade do AU Os termos descritivos de solubilidade utilizados nas farmacopeias são expressos como “partes”, definidas pela dissolução de 1g da substancia em mililitros (partes) do solvente, sendo que cada termo tem um significado específico para os solventes, como pode ser observado no Quadro 3 (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010). A avaliação da solubilidade do AU foi realizada utilizando tubos de ensaio de vidro, com 25 mm de diâmetro x 150 mm de altura, adicionando-se a 10 mg de MPAU alíquotas crescentes de diferentes solventes (de 10 em 10 µL), com o auxílio de 45 FernandaCardosoColombo micropipetas, até total solubilização. Para otimização da solubilização, foi utilizado agitador de tubos Phoenix modelo AT 56, em velocidade média. Os solventes utilizados foram: água purificada, etanol, metanol, dimetilsulfóxido (DMSO), acetato de etila, clorofórmio e acetonitrila, todos com grau analítico. Quadro 3. Significado dos termos descritivos de solubilidade Solvente Termo descritivo Muito solúvel Menos de 1 parte Facilmente solúvel De 1 a 10 partes Solúvel De 10 a 30 partes Ligeiramente solúvel De 30 a 100 partes Pouco solúvel De 100 a 1000 partes Muito pouco solúvel De 1000 a 10.000 partes Praticamente insolúvel ou insolúvel Mais de 10.000 partes Fonte: Farmacopeia Brasileira 4.2.2. Avaliação da eficácia e da citotoxicidade “in vitro” do AU 4.2.2.1. Avaliação da atividade antioxidante A atividade antioxidante do AU foi avaliada através de dois métodos amplamente utilizados em diferentes estudos da atividade antioxidante de ativos: método de inibição do radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazila (DPPH•) e método de inibição do radical 2,2’-azinobis-(3-ethylbensothiazoline) -6-sulfonic acid (ABTS•+). 4.2.2.1.1. Método de inibição do radical DPPH• O potencial de inibição do radical DPPH• pelo AU foi analisado segundo metodologias propostas por Mensor et al. (2001) e Chiari et al. (2012), com adaptações. Para realização do ensaio, previamente foram preparados 50 mL de uma solução estoque de MPAU com concentração de 1,75 mg/mL em metanol (concentração escolhida a partir de ensaios prévios para definição de faixa máxima e mínima da curva analítica). Alíquotas da solução estoque foram adicionadas a 10 46 FernandaCardosoColombo tubos de ensaio contendo 2,5 mL de solução metanólica de DPPH• a 0,004%, e volumes decrescentes de água destilada, obtendo um volume final de 3,5 mL para cada tubo, como pode ser observado na Tabela 1. Os tubos foram então mantidos ao abrigo da luz, e 30 minutos após o preparo, as absorbâncias das soluções finais foram determinadas em espectrofotômetro a 515 nm por espectroscopia na região UV. O experimento foi realizado em triplicata. Tabela 1. Composição dos tubos reacionais para ensaio com o radical DPPH• TUBO 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 [AU] (µg/mL) 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 VAU (µL) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Vágua (µL) 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Obs.: tubo 0 = controle/ Fonte: autor Para o cálculo da porcentagem de inibição do radical DPPH• pelo AU, foi utilizado a Equação 2 (MOLINEUX, 2004). % 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 𝑑𝑜 𝑟𝑎𝑑𝑖𝑐𝑎𝑙 𝐷𝑃𝑃𝐻 = 𝐴𝑏𝑠𝑚á𝑥 − 𝐴𝑏𝑠 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐴𝑏𝑠 𝑚á𝑥 𝑥 100 (2) Em que: Abs máx. = absorbância do DPPH• a 515 nm (controle); Abs amostra = absorbância da amostra a 515 nm. A fim de realizar estudo comparativo, o ensaio também foi realizado com um padrão de referência, no caso o ácido ascórbico (em faixa de concentração adequada a este ativo), potente antioxidante natural de baixo custo muito utilizado em preparações cosméticas (SCOTTI et al., 2007). A análise dos resultados foi realizada utilizando as concentrações inibitórias de 50% do radical (IC50) de cada ativo, obtidas através das curvas analíticas construídas, de % de inibição versus concentração do ativo. 4.2.2.1.2. Método de inibição do radical ABTS•+ 47 FernandaCardosoColombo A inibição do radical ABTS•+ pelo AU foi verificada segundo metodologia proposta por Almeida et al. (2013), com adaptações. Foi preparada previamente uma solução estoque de ABTS•+ com concentração de 7 mM (192 mg em 50 mL de água destilada), e uma solução estoque de persulfato de potássio com concentração de 140 mM (378,4 mg em 10 mL de água destilada), uma vez que a formação do radical é dependente da presença do persulfato. Assim, 5 mL da solução estoque de ABTS•+ foram misturados com 88 µL da solução estoque de persulfato de potássio, e a solução resultante foi mantida em repouso por aproximadamente 16 h, ao abrigo da luz. A fim de se obter uma absorbância de 0,7± 0,05, a 734 nm, uma alíquota dessa solução final foi diluída em etanol. Também foi preparada uma solução estoque de MPAU em etanol com concentração de 523,63 µg/mL (concentração escolhida a partir de ensaios prévios para definição de faixa máxima e mínima da curva analítica). Para a realização do teste, alíquotas da solução estoque de MPAU foram adicionadas a 10 tubos de ensaio contendo 2,0 mL da solução final de radical ABTS•+, e volumes decrescentes de etanol, obtendo-se um volume final de 3,03 mL para cada tubo, como pode ser observado na Tabela 2. Tabela 2. Composição dos tubos reacionais para ensaio com ABTS•+ TUBO 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 [AU] (µg/mL) 0 22,47 39,75 57,03 74,31 91,59 108,87 126,16 143,44 160,72 178 VAU (µL) 0 130 230 330 430 530 630 730 830 930 1030 Vetanol (µL) 1030 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Obs.: tubo 0 = controle/ Fonte: autor Em seguida as absorbâncias das soluções amostras dos tubos foram determinadas em espectrofotômetro a 734 nm, e a porcentagem de inibição do radical foi calculada através da Equação 3 (MOLYNEUX, 2004). 48 FernandaCardosoColombo % 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 𝑑𝑜 𝑟𝑎𝑑𝑖𝑐𝑎𝑙 𝐴𝐵𝑇𝑆 = 𝐴𝑏𝑠𝑚á𝑥 − 𝐴𝑏𝑠 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐴𝑏𝑠 𝑚á𝑥 𝑥 100 (3) Em que: Abs máx = absorbância do ABTS•+ a 734 nm (controle); Abs amostra = absorbância da amostra a 734 nm. O ensaio também foi realizado com um padrão de referência, o ácido ascórbico, para estudo comparativo, em faixa de concentração adequada a este ativo. A análise dos resultados foi realizada utilizando as IC50 do radical, de cada ativo, obtidas através das curvas analíticas construídas, de % de inibição versus concentração do ativo. 4.2.2.2. Avaliação da atividade despigmentante A atividade despigmentante do AU foi determinada através da atividade inibidora de tirosinase, em placa de 96 poços, segundo metodologia proposta por Khazaeli et al. (2009), com adaptações. Foram preparadas previamente solução de tampão fosfato pH 6,8, solução de L-dopa a 4,5 mM em tampão, solução de tirosinase a 80 unidades/mL em tampão, e solução estoque de MPAU a 1000 µg/mL em DMSO (concentração escolhida a partir de ensaios prévios para definição de faixa máxima e mínima da curva analítica). Para montagem das placas de 96 poços foram adicionados, a cada poço, volumes constantes de solução de L- dopa (45 µL) e de solução de tirosinase (25 µL), volumes decrescentes de solução tampão e alíquotas da solução estoque de AU, obtendo-se um volume final de 150 µL, como pode ser observado na Tabela 3. Cada poço foi preparado em triplicata na mesma placa. A placa foi mantida em repouso por aproximadamente 10 minutos, e após esse tempo foi realizada leitura das absorbâncias a 490 nm em espectrofotômetro com leitor de placas. Para o cálculo da porcentagem de inibição da tirosinase foi utilizada a Equação 4. 49 FernandaCardosoColombo %𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 = (1 − 𝐴𝑏𝑠 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐴𝑏𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 ) 𝑥 100 (4) Em que: % Inibição = porcentagem de inibição da tirosinase; Abs amostra = absorbância da amostra; Abs controle = absorbância na ausência de amostra (controle). Tabela 3. Composição dos poços reacionais do ensaio com tirosinase. Poço Vtampão (µL) VAU (µL) [AU] µg/mL A1-3 80 0 0 B1-3 75 5 33,00 C1-3 70 10 66,00 D1-3 65 15 100,00 E1-3 60 20 133,00 F1-3 55 25 166,00 G1-3 50 30 200,00 H1-3 45 35 233,00 A4-6 40 40 266,00 B4-6 35 45 300,00 C4-6 30 50 333,00 D4-6 25 55 366,00 E4-6 20 60 400,00 F4-6 15 65 433,00 G4-6 10 70 466,00 H4-6 5 75 500,00 A7-9 0 80 533,00 Obs.: poços A1-3= controle/ Fonte: autor Também foi realizado experimento com o padrão de referência ácido ascórbico para estudo comparativo (em faixa de concentração adequada a este ativo), por se tratar de um ativo natural de baixo custo que apresenta alto poder despigmentante (efeito clássico). A análise dos resultados foi realizada utilizando as IC50 de tirosinase, de cada ativo, obtidas através das curvas analíticas construídas, de % de inibição versus concentração do ativo. 50 FernandaCardosoColombo 4.2.2.3. Avaliação da atividade antimicrobiana A avaliação da atividade antimicrobiana do AU foi realizada seguindo suplemento M100-S16 do CLSI (2006b), com adaptações. As cepas utilizadas no experimento foram: Staphylococcus aureus ATCC 6538; Staphylococcus epidermides ATCC 12228; Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. O ensaio foi dividido em duas etapas: determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e determinação da concentração bactericida mínima (CBM). Preparo dos inóculos O inóculo para realização dos ensaios foi feito em caldo tripticaseína de soja (TSB), preparado a partir da dissolução em água, sob aquecimento e posteriormente esterilizado em autoclave (121 ºC, 1 atm) durante 15 minutos. O repique das culturas foi realizado com alça de platina, e após esse procedimento, as culturas foram mantidas por 24 horas em estufa de cultura bacteriológica (35ºC ± 2ºC) para crescimento. O inóculo foi então padronizado em espectrofotômetro a 580 nm, com uma concentração de aproximadamente 1,0 x 108 UFC/mL (transmitância de 25% ± 2%). A suspensão foi então novamente diluída em TSB (1:100), obtendo-se uma suspensão final de 1,0 x 106 UFC/mL, utilizada no experimento (CLSI, 2006b). Preparo das amostras contendo MPAU Foram preparados 5 ml de uma solução metanólica de MPAU a 400 µg/ml, solubilizando-se o ativo em metanol com auxílio do ultrassom durante aproximadamente 5 minutos. Determinação da CIM A determinação da CIM foi realizada através de diluição em microplacas de 96 poços de acordo com a metodologia descrita para bactérias aeróbicas da norma M7- A6 do Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006a). As microplacas foram preparadas adicionando- se a todos os poços 100 µL de água destilada estéril. Nos poços designados por A foi realizado controle de meio (água), e os designados por B foi realizado controle de crescimento bacteriano (controle negativo), e, portanto, nesses poços foram adicionados 100 µL de caldo TSB. Nos 51 FernandaCardosoColombo poços determinados pela letra C foram adicionados 100 µL de solvente (controle de solvente). Nos designados por D, foram adicionados 100 µL de solução de antibiótico (400 µg/ml- controle positivo): cefazolina para S. aureus e S. epidermides e aztreonam para E. coli e P. aeruginosa. Nos poços determinados pelas letras E, F, G e H foram adicionados 100 µL da solução estoque de AU. Assim, todos os poços passaram por diluições sucessivas seguidas da adição de 100 µL de inóculo, com exceção dos poços designados por A. As microplacas foram incubadas em estufa bacteriológica a 35ºC ± 2ºC por 24 horas. O ensaio foi realizado em triplicata para cada cepa. O esquema do preparo das microplacas pode ser observado na Figura 5. Figura 5. Esquema do preparo das microplacas para determinação da CIM Fonte: autor Para avaliação dos resultados, em todos os poços foram adicionados 30 µL de solução de resazurina (100 µg/ml), revelador colorimétrico amplamente utilizado em ensaios antimicrobianos. Em aproximadamente 2 horas as placas foram sendo reveladas, exibindo coloração azul onde houve inibição de crescimento bacteriano e coloração rosa onde houve crescimento bacteriano (PALOMINO et al., 2002). Determinação da CBM A CBM foi determinada através do crescimento bacteriano em meio ágar TSA em placa de Petri. O conteúdo dos poços das linhas contendo solução amostra (em 52 FernandaCardosoColombo diferentes concentrações) das microplacas foram replicadas em placas de Petri contendo ágar TSA, com auxílio de hastes de madeira estéreis. As placas de Petri foram então incubadas a 35ºC por 24 horas, para verificação ou não de crescimento bacteriano. Os resultados de morte bacteriana foram então confirmados através da análise conjunta com as placas de 96 poços. 4.2.2.4. Avaliação do potencial citotóxico O potencial citotóxico do AU foi avaliado através do método colorimétrico com o 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), proposto por Mosmann (1983) e por Chiari et al. (2014), com adaptações, utilizando queratinócitos humanos metabolicamente incompetentes (Hacat). Cultivo celular O cultivo das células foi realizado em frascos para crescimento celular de 25 e 75 cm2 com meio DMEM estéril enriquecido com soro fetal bovino a 10% e antibiótico (meio completo), por aproximadamente quatro semanas. A cada troca de meio as garrafas foram lavadas com solução de Phosphate Buffer Saline (PBS) 1x. As garrafas contendo as células foram mantidas em estufa apropriada para crescimento celular a 37°C em atmosfera de 5% de CO2. Ensaio com MTT Para o plaqueamento em microplacas de 96 poços, as células com confluência entre 80-90% foram previamente lavadas com PBS, tripsinizadas e centrifugadas com meio de cultura DMEM completo a 1300 rpm durante 3 minutos. A seguir, foi realizada uma diluição e suspensão das células em meio completo, seguida de uma contagem em câmara de Neubauer com padronização (concentração requerida de 5x105 células/mL). Dessa forma, 100 µL desta suspensão padronizada foram pipetados em cada poço da microplaca, que foi incubada em estufa por 24 horas para adesão das células. As amostras contendo MPAU foram preparadas em tubo Falcon a partir de uma solução estoque de MPAU a 100 µg/mL (em DMSO), em que uma alíquota foi diluída em 3 mL de meio de cultura sem soro fetal bovino, resultando em uma solução a 2% de DMSO e concentração de 50 µg/mL de MPAU. Para o controle de solvente foram 53 FernandaCardosoColombo preparadas amostras contendo somente DMSO a 2% em meio de cultura sem soro fetal. As amostras foram então filtradas com filtro de seringa de 0,22 µm em tubos estéreis. As amostras finais, a serem adicionadas nas placas de 96 poços (somente metade da placa foi utilizada) foram preparadas em tubos de 2 mL através de diluição seriada, como é possível observar na Figura 6. 100 µL de cada solução diluída foram então adicionados em triplicata nas linhas que vão de B a G (1 a 3 para AU e 4 a 6 para controle de solvente), do menos concentrado para o mais concentrado. Na linha A foi realizado o controle negativo (somente meio), e na linha H foi realizado o controle positivo (meio a 10% de DMSO). O esquema de montagem das placas pode ser observado na Figura 7. As placas foram então tampadas e levadas para estufa por 24 horas. Figura 6. Preparo das amostras finais do ensaio com MTT. Fonte: autor 54 FernandaCardosoColombo Figura 7. Esquema da montagem das placas para o ensaio com MTT Fonte: autor Após 24 horas o tratamento foi então removido da placa, que foi lavada com PBS (100 µL em cada poço). 100 µL de solução de MTT (1 mg/mL) foram adicionados a todos os poços, e a placa foi incubada em estufa por 3 horas. O MTT foi então removido da placa e foram adicionados 100 µL de álcool isopropílico em cada poço para solubilização dos cristais de formazana. O conteúdo dos poços da placa foi então lido em espectrofotômetro em 595 nm, e os valores de absorbâncias obtidos foram utilizados para o cálculo da % de células vivas, através das Equações 5 e 6 (ZHANG et al., 2004). % 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑚𝑜𝑟𝑡𝑎𝑠 = (𝐴𝑏𝑠𝐶𝑛−𝐴𝑏𝑠𝐴𝑚) 𝐴𝑏𝑠𝐶𝑛 × 100 (5) % 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑣𝑎𝑠 = 100 − % 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑚𝑜𝑟𝑡𝑎𝑠 (6) Em que: Abs Cn = absorbância do controle negativo Abs Am = absorbância da amostra Para análise dos resultados foi então construída uma curva de analítica, em que foi possível a obtenção do IC50, a partir da equação da reta. 55 FernandaCardosoColombo Foram realizados 3 ensaios independentes. 4.2.3. Preparo das emulsões A preparação de escolha para o estudo foi uma emulsão do tipo O/A utilizada por Spagnol (2014), cuja fórmula encontra-se descrita na Tabela 4. Para o preparo, em escala laboratorial, os constituintes tanto da fase oleosa quanto da fase aquosa foram pesados em balança semianalítica, em béqueres distintos. A fase aquosa foi então submetida à agitação mecânica manual para dispersão dos