RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 05/09/2024 Ricardo Quiterio Sartori Análises de diversidade e estrutura genética para a conservação de tamanduás-bandeiras (Myrmecophaga tridactyla) no estado de São Paulo, Brasil São José do Rio Preto 2022 Campus de São José do Rio Preto Ricardo Quiterio Sartori Análises de diversidade e estrutura genética para a conservação de tamanduás-bandeiras (Myrmecophaga tridactyla) no estado de São Paulo, Brasil Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biociências, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biociências, Área de Concentração – Genética e Biologia Evolutiva, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES – Código 001 FAPESP – Proc. 2016/13023-7 FAPESP – Proc. 2020/12796-8 Orientadora: Profª. Drª. Lilian Castiglioni São José do Rio Preto 2022 Sartori, Ricardo Quiterio. Análises de diversidade e estrutura genética para a conservação de tamanduás-bandeiras (Myrmecophaga tridactyla) no estado de São Paulo, Brasil / Ricardo Quiterio Sartori. -- São José do Rio Preto, 2022 128 f. Orientador: Lilian Castiglioni Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Genética animal. 2. Tamanduá-bandeira. 3. DNA. 4. Diversidade. 5. Animais – População. 6. Ecologia. I. Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho". Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. II. Título. CDU – 591.15 Ricardo Quiterio Sartori Análises de diversidade e estrutura genética para a conservação de tamanduás-bandeiras (Myrmecophaga tridactyla) no estado de São Paulo, Brasil Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biociências, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biociências, Área de Concentração – Genética e Biologia Evolutiva, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES – Código 001 FAPESP – Proc. 2016/13023-7 FAPESP – Proc. 2020/12796-8 Comissão Examinadora Profª. Drª Lilian Castiglioni UNESP / IBILCE – Universidade Estadual Paulista Orientadora Profª. Drª. Lilian Madi Ravazzi UNESP / IBILCE – Universidade Estadual Paulista Prof. Dr. Kaio César Chaboli Alevi UNESP / IBB – Universidade Estadual Paulista Prof. Dr. Luís Gustavo da Conceição Galego UFTM - Universidade Federal do Triângulo Mineiro Prof. Dr. Tiago Lucena da Silva UFAC - Universidade Federal do Acre São José do Rio Preto 2022 “Tudo o que você toca. Você muda. Tudo o que você muda. Muda você. A única verdade perene. É a mudança” Octavia E. Butler (2018, p. 6) AGRADECIMENTOS Agradeço à Deus e a todos que contribuíram de alguma forma para que eu chegasse até aqui. Principalmente à minha orientadora Profa. Dra. Lilian Castiglioni, minha sincera gratidão por tudo, foi muito mais que apenas uma orientadora. Obrigado pela orientação, pelas oportunidades, pela paciência e confiança. Agradeço ao meu pai Luiz e minha mãe Eliana pelo presente da Vida. À minha querida mulher Carolina que sempre me apoiou e esteve ao meu lado ao longo dessa jornada. Agradeço também à toda minha família, minha avó Tarcília, tias, tios, irmão e irmãs. Aos meus amigos, muito obrigado pelos momentos compartilhados! Muito obrigado a todos os amigos e colegas do laboratório de Imunogenética da FAMERP, ao Prof. Dr. Luiz Carlos de Mattos e à Profa. Dra. Cinara de Cássia Brandão, pelo acolhimento e suporte. Foram bons momentos e anos gratificantes na minha vida ao lado de vocês. Agradeço a todos do Hospital Veterinário da UNIRP, do SACCAS e do Zoológico Municipal de Rio Preto. Agradeço às professoras Dra. Adriana Coletto Morales e Dra. Rita de Cassia Bianchi da FCAV/UNESP, pela troca de amostras e pela parceria. Meus agradecimentos também ao pessoal da Universidade Federal de Pernambuco e em especial à Dra. Heidi Lacerda da Cruz pela gentileza, auxílio técnico e todo suporte necessário com as amostras. Ao Ibilce, agradeço a todos os professores, funcionários, amigos e colegas do Programa de Pós-Graduação em Biociências e da Seção de Pós-Graduação. Aos amigos e amigas do laboratório de Biologia Evolutiva de Insetos e do laboratório de Citogenética de Insetos, obrigado por contribuírem de alguma forma nessa jornada. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001, à qual agradeço, pelas bolsas de mestrado e doutorado e auxílios. Agradeço à FAPESP pela concessão do auxílio regular à pesquisa sob o processo nº 2016/13023-7 e pelo auxílio publicação sob o processo nº 2020/12796-8, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). RESUMO O tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) tem ampla distribuição na região Neotropical e é encontrado em todos os biomas brasileiros, no entanto, é classificado como vulnerável pela IUCN em nível global, nacional e estadual. As ameaças à espécie são relacionadas à forte pressão antrópica e os efeitos da fragmentação ou perda de habitat podem ser avaliados a partir da diversidade genética e características da paisagem. O objetivo do trabalho foi avaliar a diversidade genética e a estrutura populacional da espécie no estado de São Paulo, utilizando os marcadores moleculares SRY, 16S, RAG2 e DRB, em conjunto com microssatélites (SSR). As amostras foram obtidas a partir de resgate e atendimentos em Hospital Veterinário, além de amostras cedidas de campanhas de capturas em Estação Ecológica, totalizando 41 indivíduos amostrados, por meio do Esquema de Amostragem Individual (ISS). Após a amplificação, genotipagem e sequenciamento de DNA, diferentes análises estatísticas foram realizadas em programas específicos. A análise do gene SRY permitiu a identificação precisa do sexo dos indivíduos, o 16S não apresentou polimorfismos, sendo altamente conservado na espécie. O RAG2 foi utilizado para inferir eventos históricos, apresentou quatro haplótipos e revelou baixa diversidade genética (diversidade nucleotídica=0,0039 e diversidade haplotípica=0,273). Por outro lado, o gene DRB foi utilizado para inferir eventos recentes devido à alta taxa de mutação, assim como os SSR. Os resultados do gene DRB indicaram alta diversidade genética, mesmo para um gene adaptativo, revelando a presença de 21 alelos SSCP distintos em 41 amostras. Os índices de diferenciação genética indicaram de baixa a moderada diferenciação genética entre todos os indivíduos do estado de São Paulo (Fst=0,0322) e alta diferenciação ao comparar apenas as duas populações geográficas em Estações Ecológicas (áreas protegidas), além de correlação entre a as distâncias genéticas e geográficas. Não há evidências de Isolamento por Distância e existem evidências de Isolamento por Barreira, tanto em relação ao Índice de Agregação Alélica (Rjave = 0,467216994; p= 0,026000000), e aos métodos de detecção de barreiras, que identificaram duas barreiras ao fluxo gênico na paisagem. Outros resultados de análise Bayesiana indicaram isolamento populacional e a presença de dois agrupamentos (clusters), corroborando os resultados dos SSR. Portanto, a abordagem genética combinada, utilizando marcadores de genes com diferentes taxas de mutação permitiu inferir a diversidade, dinâmica e as características históricas e recentes da população. A análise integrada permitiu inferir que as barreiras detectadas são recentes, causadas provavelmente pelas ações antrópicas. As populações são prioritárias para a conservação e as áreas protegidas servem de reduto para a espécie, mesmo em ambientes altamente antropizados. A proteção dessas populações pode ajudar na conservação de outras espécies e de seu habitat. Além disso, o modelo de estudo apresentado pode servir para ecologistas e conservacionistas como uma abordagem genética viável para auxiliar na conservação e pode ser aplicada a outras espécies e populações, especialmente em áreas fragmentadas. Estratégias de conservação para o tamanduá- bandeira que beneficiem outras espécies devem ser adotadas e os dados científicos, incluindo as informações genéticas, devem ser implementados em políticas públicas, em planos de manejo e para ações de conservação. Palavras-chave: Genética da Conservação. Xenarthra. Ecótonos. São Paulo. ABSTRACT The giant anteater (Myrmecophaga tridactyla) has a wide distribution in the Neotropical region and is found in all Brazilian biomes, however, it is classified as vulnerable by the IUCN at a global, national, and state level. The threats to the species are related to strong anthropic pressure and the effects of fragmentation or habitat loss can be evaluated from the genetic diversity and landscape characteristics. The objective of this work was to evaluate the genetic diversity and population structure of the species in the state of São Paulo, using the molecular markers SRY, 16S, RAG2, and DRB, in conjunction with microsatellites (SSR). The samples were obtained from rescue and consultations at a Veterinary Hospital, in addition to samples provided from capture campaigns at Ecological Station, totaling 41 individuals sampled, through the Individual Sampling Scheme (ISS). After amplification, genotyping, and DNA sequencing, different statistical analyzes were performed in specific programs. The analysis of the SRY gene allowed the precise identification of the sex of the individuals, the 16S did not present polymorphisms, being highly conserved in the species. The RAG2 was used to infer historical events, presented four haplotypes and revealed low genetic diversity (nucleotide diversity=0.0039 and haplotypic diversity=0.273). In contrast, the DRB gene was used to infer recent events due to the high mutation rate, as well as the SSR. The DRB gene results indicated high genetic diversity, even for an adaptive gene, revealing the presence of 21 distinct SSCP alleles in 41 samples. The genetic differentiation indices indicated low to moderate genetic differentiation among all individuals in the state of São Paulo (Fst=0.0322) and high differentiation when comparing only the two geographic populations in Ecological Stations (protected areas), in addition to the correlation between genetic and geographic distances. There is no evidence of Isolation by Distance and there is evidence of Isolation by Barrier, both in relation to the Allelic Aggregation Index (Rjave = 0.467216994; p= 0.026000000) and to the barrier detection methods, which identified two barriers to the gene flow in the landscape. Other Bayesian analysis results indicated population isolation and the presence of two clusters, corroborating the SSR results. Therefore, the combined genetic approach, using markers of genes with different mutation rates, allowed us to infer the diversity, dynamics and the characteristics of historical and recent patterns of the population. The integrated analysis allowed us to infer that the detected barriers are recent, probably caused by anthropic actions. The populations are a priority for conservation and the protected areas serve as a refuge for the species, even in highly anthropic environments. The protection of these populations may help the conservation of other species and their habitat. In addition, the study model presented can serve ecologists and conservationists as a viable genetic approach to aid conservation and can be applied to other species and populations, especially in fragmented areas. Strategies for conservation of the giant anteater that benefit other species must be adopted and scientific data, including genetic information, must be implemented in public policies, management plans, and for conservation actions. Keywords: Conservation Genetics. Xenarthra. Ecotones. São Paulo. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1. Espécies de vertebrados, registradas como extintas ou extintas na natureza pela IUCN. Fonte: CEBALLOS et al., 2015..........................14 Figura 2. Mapa indicando os principais hotspots de biodiversidade. Fonte: MYERS et al., 2000..................................................................................16 Figura 3. Mapa de projeção dos níveis de ameaça nos principais hotsposts de biodiversidade. Fonte: HABEL et al., 2019..........................................18 Figura 4. Mapa do estado de São Paulo com locais de amostragem e indicação das Estações Ecológicas. Fonte: SARTORI et al., 2021..........19 Figura 5. Ilustração comparativa entre a Genética da Paisagem e a Filogeografia. Fonte: RISSLER, 2016.......................................................27 Figura 6. Proporção de estudos que utilizam diferentes tipos de marcadores moleculares para avaliar os efeitos ambientais e da paisagem no fluxo gênico. Fonte: MONTEIRO et al., 2019......................................29 Figura 7. Mapa da distribuição geográfica da espécie Myrmecophaga tridactyla e locais de possíveis extinções. Fonte: ALBERICI et al., 2020, MIRANDA et al., 2014..............................................................................33 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AFLP: Polimosfismo de Comprimento de Fragmento Amplificado CAPES: Coordenação de Aprimoramento de Pessoal de Nível Superior cpDNA: DNA cloroplastidial DNA: Ácido desoxirribonucleico EENP: Estação Ecológica do Noroeste Paulista EESB: Estação Ecológica de Santa Bárbara FAMERP: Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto FAPESP: Fundação de Amparao à Pesquisa do estado de São Paulo FCAV: Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias FENP: Floresta Estadual Noroeste Paulista Fst: Índice de fixação GABI: Grande Intercâmbio Biótico das Américas IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IBILCE: Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas IF: Instituto Florestal ISS: Esquema de Amostragem Individual IUCN: União Internacional para a Conservação da Natureza Km: Kilômetros MHC: Complexo de Histocompatibilidade Principal mtDNA: DNA mitocondrial NGS: Sequenciamento de Próxima Geração NP: Noroeste Paulista Rjave: Distribuição espacial geral de todos alelos e loci SACCAS: Setor de Atendimento Clínico Cirúrgico de Animais Selvagens scnDNA: DNA nuclear de cópia única SMAURB: Secretaria do Meio Ambiente e Urbanismo de São José do Rio Preto SNPs: Polimosfirmos de Nucleotídeo Único SP: São Paulo SSR: Microssatélites / Repetições de Sequência Simples UNESP: Universidade Estadual Paulista UNIRP: Centro Universitário de Rio Preto SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO............................................................................................................ 1.1 Biologia da Conservação: biodiversidade e ameaças à vida terrestre............... 1.2 Genética da Paisagem e Filogeografia: escalas temporais, espaciais e diferentes marcadores moleculares........................................................................... 1.3 Myrmecophaga tridactyla, uma espécie ameaçada: extinções locais e estratégias de conservação........................................................................................ 2 OBJETIVOS................................................................................................................ 12 12 21 30 38 2.1 Objetivo geral.......................................................................................................... 38 2.2 Objetivos específicos............................................................................................ 38 2 3 MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................................... 39 3 4 RESULTADOS........................................................................................................... 4.1 Capítulo I - Genetic diversity and molecular sexing of giant anteater: efforts for conservation and effects on other species........................................................... 39 40 4.2 Capítulo II - Adaptive molecular polymorphism in giant anteater using a viable low-cost method……………………………………….……………………………. 63 4 5.CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................................ 5 REFERÊNCIAS......................................................................................................... 6 APÊNDICE A............................................................................................................. ANEXO A................................................................................................................... ANEXO B................................................................................................................... ANEXO C................................................................................................................... 94 95 107 108 125 127 12 1. INTRODUÇÃO 1.1 Biologia da Conservação: biodiversidade e ameaças à vida terrestre A destruição e a fragmentação do habitat são os principais fatores de declínio e extinção de espécies, uma vez que podem aumentar a vulnerabilidade das populações de vida selvagem, reduzindo o espaço e os recursos disponíveis para elas e aumentando a probabilidade de conflito com os seres humanos. Além disso, criam habitats menores que suportam populações menores, que são mais propensas a serem extintas (FRANKHAM; 2005; FRANKHAM et al., 2019). Desde a metade do último século, foi amplamente reconhecido que a taxa de extinção de espécies estava aumentando e que muitas espécies estavam em perigo iminente de extinção. Os principais fatores relacionados a essas extinções e declínios foram o desmatamento, caça, pesca e outras matanças; perda, degradação e fragmentação do habitat; e introdução de espécies não nativas, patógenos, predadores e competidores (DIAMOND, 1989; HEDRICK; HURT, 2012). Um número crescente de ecossistemas contendo espécies ameaçadas está desaparecendo e estima-se que, devido às atividades humanas, as taxas atuais de extinção de espécies são cerca de 1.000 vezes maiores do que sem influência antrópica (PIMM et al., 2014). Mais de 27.000 espécies estão em risco de extinção, que incluem 25% são mamíferos, 14% são pássaros e 40% são anfíbios e estima-se que 1 milhão de espécies em todo o mundo podem enfrentar a extinção (DIAZ et al., 2019; IUCN, 2021). Para medir as taxas e riscos de extinção em espécies, diversos fatores são avaliados. Os biólogos da conservação medem e aplicam medidas estatísticas de registros, taxas de perda de habitat e várias outras variáveis como perda de biodiversidade, características genéticas, entre outros aspectos para tentar compreender os padrões de extinções em diferentes escalas (REGAN et al., 2001; MACKENZIE et al., 2003). A criação de ferramentas como a Lista Vermelha de Espécies Ameaçadas da União Internacional para a Conservação da Natureza (IUCN), é essencial para a conservação, pois é a fonte de informação mais abrangente do mundo sobre o status de risco de extinção global de espécies de animais, fungos e plantas. Além disso, é importante criar métodos para otimizar possíveis problemas 13 relacionados às ferramentas de categorização de espécies ameaçadas (BALMFORD; GREEN; JENKINS, 2003; GARNER; HOBAN; LUIKART, 2020). A Teoria da Biogeografia de Ilhas é possivelmente uma das contribuições mais significativas para a compreensão científica do processo e das taxas de extinção em espécies, envolvendo fatores que afetam a riqueza de espécies e comunidades, como o equilíbrio dinâmico entre as taxas de imigração e extinção, competição, colonização e equilíbrio, a partir da qual se pode determinar o número de espécies em equilíbrio em uma ilha (MACARTHUR; WILSON, 2001). As estimativas das taxas de extinção reais podem ser calculadas em ordens de magnitude mais altas e por isso, algumas estimativas de taxas de extinção foram criticadas por usar suposições que podem superestimar a gravidade da crise de extinção. Para isso diversas metodologias foram desenvolvidas a fim de evitar a superestimação das taxas de extinção que utilizam suposições extremamente conservadoras (HOFFMANN et al., 2010; CEBALLOS et al., 2015). Vale ressaltar que mesmo em análises extremamente conservadoras, os atuais esforços de conservação permanecem insuficientes para compensar os principais fatores de perda de biodiversidade. Assim, questionamentos surgiram a cerca de uma provável extinção do Holoceno, também conhecida como a sexta extinção em massa ou extinção do Antropoceno, um evento de extinção de espécies em curso que está intimamente ligado ao resultado da atividade humana (DIRZO et al., 2014). Com a degradação generalizada de habitats altamente biodiversos, como recifes de corais e florestas tropicais, bem como outras áreas, acredita-se que a maioria dessas extinções não seja documentada, além disso a taxa atual de extinção de espécies é estimada como sendo 100 a 1.000 vezes maior do que as taxas de extinção naturais de fundo, sem os efeitos antrópicos (PIMM et al., 1995; DE VOS et al., 2015) A atividade humana tornou o período a partir de meados do século 20 diferente o suficiente do resto do Holoceno para considerar o Antropoceno uma nova época geológica (SYVITSKY et al., 2020). Portanto, o Antropoceno fornece uma medida independente da escala e do ritmo das mudanças causadas pelo homem e o Antropoceno é um lembrete de que o Holoceno, durante o qual sociedades humanas complexas se desenvolveram, foi um ambiente estável (STEFFEN et al., 2011). Além disso, a baixa diversidade atual, principalmente de grandes mamíferos em áreas continentais é um fenômeno antropogênico, não natural, com importantes implicações para o manejo da natureza (SANDOM et al., 2014) 14 Desta maneira, à medida que avançamos no Antropoceno, corremos o risco de conduzir o Sistema Terrestre em uma trajetória rumo à extirpação de várias espécies em todo o globo (STEFFEN et al., 2011). Muitas publicações baseadas em métodos independentes demonstram a realidade da crise na biodiversidade. A sexta extinção em massa pode já estar acontecendo ou pode não ter ocorrido ainda, mas taxas elevadas de extinção e diversos declínios populacionais já ocorreram a uma taxa maior do que na ausência de influências antropogênicas (Figura 1). Isto é um fato e a hipótese de que a sexta extinção em massa tenha começado em terra e em água doce é cada vez mais provável (COWIE; BOUCHET; FONTAINE, 2022). Figura 1. Espécies de vertebrados, registradas como extintas ou extintas na natureza pela IUCN, 2012. Os gráficos mostram a porcentagem do número de espécies avaliadas. A curva preta tracejada representa o número de extinções esperadas. (A) Estimativa altamente conservadora. (B) Estimativa conservadora. Fonte: CEBALLOS et al., 2015. Independente das teorias sobre a sexta extinção em massa, o fato é que a extinção de espécies ocorre em níveis alarmantes e não só estamos perdendo espécies em uma taxa maior do que o normal, como também é evidente que os processos de evolução e especiação não conseguem acompanhar essa perda (CEBALLOS; EHRLICH, 2018). Devido à essa constante perda da biodiversidade e altas taxas de extinção de espécies, tentativas de estabelecer a conservação da Biodiversidade foram e são cada vez mais necessárias. Assim, a partir de 1970, a Biologia da Conservação surgiu como um novo campo do conhecimento. Uma área interdisciplinar baseada na gestão 15 de recursos naturais a partir da combinação entre a teoria em ecologia e a genética evolutiva, por um lado, e da política e prática de conservação, por outro (DASHMAN, 1968; EHRENFELD, 1970; SOULÉ, 1985; GERBER, 2010). A base multidisciplinar inerente para a biologia da conservação levou a novas subdisciplinas, incluindo a ciência social da conservação, o comportamento da conservação, a fisiologia da conservação e a genética da conservação (FRANKHAM, 2005; COOKE et al., 2013; BENNETT et al., 2017). Além disso, a disciplina de Biologia da Conservação está intimamente ligada à ecologia populacional, envolvendo a dispersão, migração, demografia, tamanho efetivo da população, depressão endogâmica e viabilidade populacional mínima, principalmente de espécies raras ou ameaçadas de extinção. Os estudos na área permitem a compreensão dos fenômenos que afetam a manutenção, perda e restauração da biodiversidade e a entender processos evolutivos que geram diversidade genética, populacional, de espécies e de ecossistemas (SAHNEY, BENTON, FERRY, 2010). Portanto, a Biologia da Conservação é o estudo da conservação da natureza e da biodiversidade da Terra com o objetivo de proteger as espécies, seus habitats e ecossistemas de taxas excessivas de extinção entre outras preocupações (MEINE; SOULÉ; NOSS, 2006). Apesar da perda da biodiversidade mundial e dos esforços realizados, os conservacionistas estão longe de ajudar todas as espécies ameaçadas e estimativas sugerem que até 50% de todas as espécies do planeta desaparecerão nos próximos 50 anos, levando à crise na biodiversidade global e demonstrando a importância de esforços para a conservação de espécies e dos ecossistemas (KOH et al., 2004). Assim, estratégias que visam a conservação de espécies são de extrema importância e uma das estratégias desenvolvidas baseia-se na identificação de “hotspots de biodiversidade” (Figura 2), na qual concentrações de espécies endêmicas sofrem grande perda de habitat. Uma vez que até 44% de todas as espécies de plantas vasculares e 35% de todas as espécies em quatro grupos de vertebrados estão confinados aos hotspots que compreendem em torno de apenas 2% da superfície terrestre da Terra, esta pode ser uma estratégia viável para conservação de diversas espécies (MYERS et al., 2000). Vale ressaltar que há uma controvérsia considerável sobre quais métricas usar para delinear os hotspots de biodiversidade e as consequências da aplicação de 16 diferentes métricas para evitar incongruência entre os locais definidos usando diferentes métricas e diminuir a preocupação com a noção de que os locais de riqueza de espécies devem se sobrepor àqueles identificados usando outras métricas de diversidade (POSSINGHAM; WILSON, 2005). Porém, embora existam controvérsias, os hotspots de biodiversidade são alvos promissores de conservação para mitigar as perdas e continuam sendo prioridades como estratégia para a conservação da biodiversidade em todas as regiões biogeográficas (NOSS et al., 2015; CARTWRIGHT, 2019). Figura 2. Mapa indicando os principais hotspots de biodiversidade. Fonte: MYERS et al., 2000 Em relação às regiões biogeográficas, uma das regiões de maior biodiversidade e que apresenta ecossistemas amplamente diversos é a região Neotropical, o qual compreende a América Central, incluindo a parte sul do México e da península da Baixa California, o sul da Flórida, as ilhas do Caribe e a América do Sul (MORRONE, 2014; ANTONELLI, 2021). As hipóteses para explicar a alta diversidade e endemismo na região Neotropical estão frequentemente relacionadas à heterogeneidade climática, geralmente associada à expectativa de que espécies tropicais tenham tolerâncias fisiológicas restritas. Essa heterogeneidade climática, tanto histórica quanto contemporânea afetaria diretamente a distribuição das linhagens por meio de 17 restrições fisiológicas espécie-específicas e indiretamente por meio da aptidão a parasitas, patógenos, predadores e competidores (CARNAVAL et al., 2014). A região Neotropical é uma das mais importantes reservas de biodiversidade da Terra e isso demonstra a importância de estudos para preservação de recursos naturais tanto em áreas protegidas e não protegidas, além da conservação de espécies e seus habitats (MAGIOLI et al., 2021; BURBANO- GIRÒN et al., 2022). Dentre os hotspots de biodiversidade na região Neotropical, mais especificamente na América do Sul podemos destacar a biodiversidade encontrada no território brasileiro, uma região mega diversa devido ao seu grande número de espécies e endemismos. O Brasil é considerado o país com a maior biodiversidade de qualquer país do planeta e é o segundo país do mundo com as espécies mais endêmicas (COSTA et al., 2005) Essa alta diversidade de fauna pode ser explicada em parte pelo tamanho do Brasil e pela grande variação em ecossistemas como Floresta Amazônica, Mata Atlântica e Cerrado, os quais encontram-se altamente ameaçados por ações antrópicas. Devido à ascensão econômica e demográfica do país no último século, a capacidade do Brasil de proteger seus habitats ambientais está cada vez mais ameaçada (BOLZANI, 2016). Portanto, proporcionalmente à enorme biodiversidade são os impactos ambientais causados pelo desenvolvimento econômico, visíveis principalmente no Sudeste Brasileiro (Figura 3), onde inúmeras espécies estão sob ameaça de extinção (CUBAS, 2006). 18 Figura 3. Mapa de projeção dos níveis de ameaça nos principais hotsposts de biodiversidade, ilustrando como a mudança climática e a pressão agro econômica afetam a região do Estado de São Paulo (áreas vermelhas indicam maior pressão antrópica). Fonte: HABEL et al., 2019. Diante do panorama e devido à importância dos fragmentos remanescentes para a manutenção da biodiversidade e de espécies ameaçadas, é necessária a investigação da situação das populações silvestres remanescentes. No presente trabalho, a amostragem experimental permitiu a avaliação em áreas protegidas e não protegidas de ecótonos entre Cerrado e Mata Atlântica no estado de São Paulo. Assim, duas Estações Ecológicas inseridas na zona de contato Cerrado/Mata Atlântica compõem a área de amostragem (Figura 4). É importante esclarecer que essas Estações Ecológicas sofreram diferentes impactos antrópicos com a fragmentação de habitat ao longo dos anos (IF, 2011; IF, 2014; IF, 2019). Além da avaliação de populações em áreas protegidas e entorno, a avaliação das populações em áreas não protegidas e da paisagem também é fundamental e devem ter a mesma importância de conservação que áreas protegidas (LI et al., 2021). Particularmente no Brasil, as áreas não protegidas compõem um importante cenário, principalmente em ambientes altamente fragmentados. Assim, conservar a vegetação nativa em terras privadas e não protegidas pode ser um dos mecanismos mais importantes para proteger a biodiversidade em biomas brasileiros, em especial na conservação de mamíferos terrestres (BERTASSONI; BIANCHI; DESBIEZ, 2021). Além disso, estudos indicam que diversos mamíferos, incluindo os tamanduás- 19 bandeiras usam as áreas protegidas e plantações em zonas de amortecimento, além de estradas não pavimentadas (PAOLINO et al., 2016; VERSIANI et al., 2021). Figura 4. Mapa do estado de São Paulo com locais de amostragem (pontos vermelhos) e indicação das Estações Ecológicas (círculos verdes). Estação Ecológica do Noroeste Paulista (região noroeste) e Estação Ecológica de Santa Bárbara (região centro-sul). Fonte: SARTORI et al., 2021. Estação Ecológica do Noroeste Paulista e entorno A Estação Ecológica do Noroeste Paulista (EENP), situada entre as coordenadas 220º49´ S a 47º23´ W, possui uma área de 500 hectares em conjunto com a Floresta Estadual Noroeste Paulista (FENP) e seu entorno é composto pelas áreas com alta influência antrópica pertencentes aos municípios de São José do Rio Preto e Mirassol. Devido ao histórico de degradação do local, não restam fragmentos de floresta madura, especialmente da Estacional e do Cerradão e hoje se encontra altamente fragmentada e em contato com áreas muito urbanizadas (IF, 2014). Vale ressaltar que a urbanização e a expansão imobiliária ameaçam seriamente a área e apesar de a região de estudo ser muito pobre de fragmentos florestais preservados e não haver muitos estudos sobre a fauna que restou, os dados mostram que a região ainda pode abrigar uma rica diversidade, mesmo sendo uma área cercada por pastagens, plantações e bairros urbanos. Além disso, é um dos poucos fragmentos 20 protegidos que representa este bioma na região noroeste paulista (PEREIRA; BRASILEIRO, 2015). Estação Ecológica de Santa Bárbara e entorno A Estação Ecológica de Santa Bárbara (EESB) conta com 2.712 hectares (ha) entre as coordenadas geográficas 22°46’ a 22°41’ S e 49°16’ a 49°10’ W e a maior parte da área da Estação Ecológica de Santa Bárbara é ocupada por vegetação nativa, com poucas evidências de perturbação antrópica e faz contato, na maior parte de suas divisas, com pastagens e reflorestamentos (IF, 2011) A EESB está entre as maiores áreas protegidas em São Paulo, e é uma das poucas a contemplar um mosaico dos diferentes tipos de vegetação de Cerrado. Diversas espécies registradas na Estação Ecológica encontram-se regionalmente ameaçadas de extinção, sendo que cinco são ameaçadas globalmente e as formações campestres destacam-se pelo número de espécies ameaçadas (LUCINDO et al., 2015). Portanto a proteção e preservação da área é de extrema importância, uma vez que esta área é um dos últimos remanescentes de Cerrado aberto no estado de São Paulo. Áreas não protegidas no Noroeste Paulista Além das áreas protegidas, foram avaliadas as populações e indivíduos em áreas não protegidas ao longo do Noroeste Paulista (NP), por uma amostragem de conveniência, a partir de atendimentos realizados pelo Hospital Veterinário “Dr. Halim Atique” e pelo Zoológico Municipal de São José do Rio Preto para tentativa de reabilitação de indivíduos atropelados, queimados, atacados por cães ou perdidos em áreas urbanas. Dessa maneira, avaliar animais em áreas não protegidas pode ser de grande relevância, pois os processos populacionais da vida selvagem que ocorrem fora das áreas protegidas podem afetar a conservação das espécies dentro das áreas protegidas. Além das áreas protegidas serem eficazes para a manutenção de populações reprodutoras, áreas não protegidas também apresentam resultados positivos para algumas populações de espécies silvestres (LEÓN-ORTEGA, 2017). Estudos sugerem que áreas não protegidas devem ter a mesma importância de conservação que as áreas protegidas, principalmente em relação aos mamíferos, no que diz respeito ao planejamento de conservação baseado na paisagem. Para alcançar os objetivos de conservação em longo prazo é cada vez mais reconhecido que as áreas não protegidas devem ser incorporadas às estratégias de conservação (LI et al., 2021; THAPA et al., 2021). 21 O Brasil, em sua legislação, obriga os proprietários de terras a separarem áreas de preservação. Assim, uma parte dos remanescentes de vegetação nativa devem ser protegidos em vez de convertidos para outros usos da terra em áreas de antigas fronteiras econômicas e esses remanescentes podem ser os pilares de sistemas de conservação regionais eficazes principalmente em áreas altamente antropizadas (DA SILVA; PINTO; SCARANO, 2021). Portanto, o estudo de espécies ameaçadas em áreas protegidas e não protegidas é essencial para entender as respostas de organismos e populações frente às alterações antrópicas (VERSIANI et al., 2021). Ainda, a utilização de abordagens interdisciplinares incluindo abordagens genéticas pode contribuir para avaliar como a destruição e a fragmentação de habitat recente atua estruturando as populações de uma determinada espécie. 94 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS -A combinação dos resultados de altas taxas de mutação e genes mais conservados revelou que a fragmentação recente do habitat influencia diretamente na estrutura genética das populações da espécie no estado de São Paulo. -As populações de tamanduás-bandeira no estado de São Paulo são prioritárias para a conservação e recuperação da diversidade genética da espécie, principalmente devido aos resultados a partir de genes com altas taxas de mutação. -A baixa diversidade e haplótipos únicos identificados a partir do gene RAG2 (e de mtDNA) em conjunto com dados ecológicos, indicam que a espécie deve continuar na lista de espécies ameaçadas. -A seleção, além da deriva genética, é um dos fatores evolutivos principais que atua na diferenciação genética das populações, inferida com base nas análises realizadas a partir do gene DRB. -Migrações em curtas distâncias ocorrem e mantém o fluxo gênico local e alta diversidade genética intrapopulacional. Entretanto, não há evidências de migração em longas distâncias entre as populações de tamanduá-bandeira, o que em conjunto com a intensa ação antrópica leva à diminuição de populações. -A conservação e proteção das populações de tamanduá-bandeira, baseada na prioridade genética, pode contribuir para a realização de ações que contribuam para a conservação de outras espécies e seus habitats. -Estudos interdisciplinares e a integração com tomadores de decisão em políticas de conservação são necessários para a efetiva contribuição de dados científicos e genéticos visando a implementação em ações de conservação. 95 REFERÊNCIAS ALBERICI, V. et al. Survival Blueprint for the conservation of the giant anteater, Myrmecophaga tridactyla, in the Brazilian Cerrado. An output from the Anteaters & Highways Project, Brazil, and EDGE of Existence fellowship. Zoological Society of London, London, UK, 2020. ALI, T. A Conceptual Framework for Designing Phylogeography and Landscape Genetic Studies. 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