Natália da Costa Luchiari Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para determinação de cafeína em águas residuárias a partir de ensaios colorimétricos e fluorimétricos Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química Orientador: Prof. Dr. Paulo Clairmont Feitosa de Lima Gomes Araraquara 2018 DADOS CURRICULARES IDENTIFICAÇÃO Nome: Natália da Costa Luchiari Nome em citações bibliográficas: LUCHIARI, N. C.; Natália Lucchiari; LUCCHIARI, N.; LUCHIARI, Natália da Costa. ENDEREÇO PROFISSIONAL Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Química de Araraquara. Rua Francisco Degni, 55. Jardim Quitandinha, 14800060 - Araraquara, SP–Brasil. FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO 2008 – 2015 Bacharela em Química Tecnológica, pela Universidade Federal de São Carlos – UFSCar. 2013 – 2014 Graduação sandwich na Budapest University of Technology and Economics, BUTE, Hungria. FORMAÇÃO COMPLEMENTAR 2018 Escola SENAI “Henrique Lupo” de Araraquara Curso de Formação Inicial e Continuada – Aperfeiçoamento Profissional – Microcontrolador Arduíno – 40h. 2017 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP. Estágio e Docência em Química Analítica Quantitativa (Teórica) – 60h. Estágio e Docência voluntário em Química Analítica Quantitativa (Experimental) – 60h. 2013 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP. Estágio para elaboração de trabalho de conclusão de curso (TCC) – 240h. 2009 Universiade Federal de São Carlos – UFSCar. Monitoria em Química Experimental Geral – 180h. ATUAÇÃO PROFISSIONAL 2018 Escola Técnica Estadual – ETEC 2018 Universidade Federal de Goiás – UFG Estágio Grupo de Métodos Eletroforéticos. 2016 – atualmente Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP. Mestrado em Química 2015 – 2016 Universiade Federal de São Carlos – UFSCar. Iniciação Científica voluntária: Grupo de Química Teórica em Mecânica Quântica não-linear – QuiTeo. 2015 – 2016 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP. Iniciação Científica (bolsista): Laboratório de Eletroquímica e Eletroanalítica – IQ. 2014 Budapest University of Technology and Economics – BUTE. Estágio (em “Bioorganic Chemistry Group” 2013 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP. Estágio voluntário: Laboratório de Eletroquímica e Eletroanalítica – IQ. 2009 – 2013 Universiade Federal de São Carlos – UFSCar. Iniciação Científica (bolsista CNPq): Laboratório de Bioquímica Micromolecular de Micro-organismos. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA MARTINS, G. S.; LUCHIARI, N. da C.; LAMARCA, R. S.; SILVA, B. F. da.; GOMES, P. C. F. L. Removal of sulfamethoxazol and trimethoprim using horizontal-flow anaerobic immobilized bioreactor. Scientia Chromatographica, v. 9, n. 4, p. 253-264, 2017. CARDOSO, J. C.; LUCCHIARI, N. da C.; ZANONI, M. V. B. Bubble annular photoeletrocatalytic reactor with TiO2 nanotubes arrays applied in the textile wastewater. Journal of Environmental Chemical Engineering, v. 3, p. 1177-1184, 2015. PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS 1. VII Workshop de Microfluídica, 2017 2. 35ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2012. 3. IX Semana da Química- UFSCar, 2012. 4. Workshop de Biocatálise e de Biotransformação, 2012. 5. XX Congresso de Iniciação Científica, 2012. 6. 18º Encontro da Sociedade Brasileira de Química Regional Interior Paulista, 2011. 7. 34ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2011. 8. 3rd Brazilian Conference on Natural Products, XXIX RESEM and VII SFL., 2011. 9. XIX Congresso de Iniciação Científica da UFSCar - 9a Jornada Científica e Tecnológica, 2011. 10. XVIII Congresso de Iniciação Científica da UFScar, 2011. 11. XVIICongresso de Iniciação Científica da UFSCar - 8ª Jornada Científica e Tecnológica, 2009. __________________________________________________________________ ________________________________ Dedicatória Dedico não só essa dissertação, mas toda a minha jornada acadêmica ainda em curso, aos meus pais Sueli e Claudemir por não medirem esforços para que esse caminho se tornasse mais leve e prazeroso através de constantes demonstrações de afeto e por sempre incentivarem meus sonhos. À minha irmã Isabela à quem tenho o prazer de ter como parceira de profissão e pra vida. Aos meus avós, Pedro e Iolanda (in memorian) que por circunstâncias da idade tem me ensinado diariamente o significado da palavra superação em todos os segmentos da vida. Ao arquiteto do Universo, aos que me regem, me guiam e protegem. ___________________________________________________________________ Agradecimentos Minha gratidão ao Prof. Dr. Paulo Clairmont, orientador exímio no exercer de sua profissão como professor e pesquisador. Agradeço aos valiosos ensinamentos, pela oportunidade de desenvolvermos esse trabalho e pela amizade. Aos amigos do nosso grupo de Pesquisa pela parceria, aprendizado e momentos compartilhados: Rafa, Gabi, Flavinha, Andressa, Mateus e Pietro. À Gabrielen e ao César pela preciosa colaboração e envolvimento direto nas etapas de desenvolvimento desse trabalho. À Dra. Bianca Ferreira da Silva por quem tenho profunda admiração pessoal e profissional, pelos preciosos ensinamentos transmitidos. Por ter sido a grande incentivadora para que esse título fosse alcançado me apresentando ao Prof. Paulo e sua inovadora linha de pesquisa. Ao Prof. Dr. Wendell Coltro pelo convite de conhecer seu grupo de pesquisa na Universidade Federal de Goiás, pioneiro em microfluidica e microfabricação de dispositivos. Acresço meus agradecimentos à todo o grupo de pesquisa pela receptividade, ensinamentos e à oportunidade de conhecer o admirável trabalho que desenvolvem na UFG. Ao corpo docente da Unesp, principalmente aos professores do Departamento de Química Analítica sempre muito receptivos à colaborações. Prof. Dr. Arnaldo Cardoso, Prof. Dra. Raquel Nogueira, Prof. Dr. Clóvis Augusto Ribeiro, por disporem seus laboratórios às nossas necessidades. Estendo os agradecimentos aos integrantes de seus respectivos grupos de pesquisa, colegas de trabalho com quem tenho tido o prazer de aprender diariamente. Aos amigos, Armando Sambataro pelas prazerosas discussões que contribuíram emocional e profissionalmente para a conclusão desse trabalho. Tímea Pálinkas pela amizade e incentivo a cada etapa desse trabalho. André Marcomini pela sólida amizade, pelos momentos de discussão profissional e principalmente pelas boas risadas. Marina Sá pela amizade e incentivo a minha jornada acadêmica. Às amigas Heloísa F. Pallini e Monize Pavan pela amizade que se estende desde a graduação e que se faz presente nessa etapa. Aos amigos do IQ-Unesp pelas valiosas discussões e por tornarem o dia-a-dia mais prazeroso (com café): Bi, ThailaMigaSuaLoka, JP, AC, Jef, Josiel, Kallyni, Alisson, Iovan, Chico. Ao João Carlos (River Black) pela amizade e parceria, pela prontidão em me auxiliar a cada dificuldade do presente trabalho. Ao Albertinho pelo apoio. À Bel pela amizade e auxílio nas etapas finais desse trabalho. Ao Prof. Dr. Clóvis Augusto Ribeiro e ao Prof. Dr. Arnaldo Sarti por terem aceitado o convite de serem banca do Exame de Qualificação e contribuírem com valiosa discussão. Aos funcionários do IQ pelo suporte e prontidão. À seção de pós-graduação, Wennia, Cíntia, Paula, Célia, Robson pelo auxílio dado em todos os momentos. Aos funcionários da Biblioteca, à Valéria pela atenção e discussões para normatização desse trabalho. Ao INCT-DATREM, à PROPE, CNPq, FAPESP e à CAPES pelo financiamento concedido para o desenvolvimento dessa pesquisa. ___________________________________________________________________ Lista de Figuras Figura 1 – Estrutura plana da molécula de cafeína. 24 Figura 2 – Estrutura plana da molécula de HPTS. 28 Figura 3 – Representação esquemática do dispositivo colorimétrico (DC) fabricado por impressão 3D. 34 Figura 4 – Representação esquemática da etapa de aquisição da imagem usando dispositivo colorimétrico (DC) acoplado ao celular e a posição de captura da imagem (spot) na placa de porcelana. 35 Figura 5 – Placa de porcelana com resíduo sólido avermelhado obtido após a reação entre cafeína (75 mg L-1) e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %) ocorrer. 41 Figura 6 – Cromatograma de íons totais (TIC): (a) referente ao padráao de cafeína (1,00 mg L-1) seguido do seu respectivo cromatograma de íon extraído (XIC) de m/z 195 e espectro de massas com tempo de retenção de 4,67 minutos da cafeína padrão e (b) TIC e XIC do produto avermelhado obtido pela reação entre a cafeína e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %). 43 Figura 7 – (a) cromatograma de íon extraído (XIC) de m/z 241 seguido do respectivo espectro de massas com tempo de retenção de 4,15 minutos e (b) XIC de m/z 324 e respectivo espectro de massas com tempo de retenção de 4,74 minutos. 44 Figura 8 – Espectros de massas dos íons fragmentos de m/z (a) 324, (b) 241 e (c) 481. 45 Figura 9 – Cromatograma de íons totais (TIC) para experimentos de monitoramento de reação selecionada (SRM) para padrão de cafeína, com varredura das transições de transições 195>138, 195>110 e 195>83. 46 Figura 10 – Cromatograma de íons totais (TIC) para experimentos de monitoramento de reação selecionada (SRM) para o produto avermelhado obtido pela reação entre a cafeína e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %). 47 Figura 11 – Curva analítica obtida para o produto 1 da reação entre a cafeína e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %), por LC-MS/MS. 47 Figura 12 – Curva analítica obtida para o produto 2 da reação entre a cafeína e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %), por LC-MS/MS. 49 Figura 13 – Representação esquemática da disposição dos spot-tests na placa de porcelana. 49 Figura 14 – Curva analítica da área da banda de cafeína em função da concentração de cafeína entre 3,33 e 333 mg L-1, por LC-MS/MS. 50 Figura 15 – Curva analítica da densidade óptica (D.O.) em função da concentração de cafeína entre 100 e 500 mg L-1, em água ultrapura, por celular. 52 Figura 16 – Cromatograma de íons totais (TIC) para experimentos de monitoramento de reação selecionada (SRM) para (a) amostra do branco de energético e (b) para amostra do produto avermelhado obtido pela reação entre a cafeína (contida na amostra de energético) e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %). 58 Figura 17 – Cromatograma de íons totais (TIC) para experimentos de monitoramento de reação selecionada (SRM) para (a) amostra do branco de medicamento 1 e (b) para amostra do produto avermelhado obtido pela reação entre a cafeína (contida na amostra de medicamento 1) e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %). 59 Figura 18 – Cromatograma de íons totais (TIC) para experimentos de monitoramento de reação selecionada (SRM) para (a) amostra do branco de medicamento 2 e (b) para amostra do produto avermelhado obtido pela reação entre a cafeína (contida na amostra de medicamento 2) e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %). 60 Figura 19 – Cromatograma de íons totais (TIC) para experimentos de monitoramento de reação selecionada (SRM) para (a) amostra do branco de esgoto e (b) para amostra do produto avermelhado obtido pela reação entre a cafeína (contida na amostra de esgoto) e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %). 62 Figura 20 – Curvas analíticas da D.O. em função da concentração de cafeína para método colorimétrico em amostras de (a) energético entre 100 a 500 mg L- 1, (b) esgoto entre 100 a 500 mg L-1, (c) medicamento 1 entre 100 a 300 mg L-1 e (d) medicamento 2 entre 100 a 500 mg L-1, por celular. 63 Figura 21 – Efeito de matriz avaliado pela relação entre os coeficientes angulares das curvas analíticas das amostras de energético, esgoto e medicamento 1 em comparação com a curva da água ultrapura. 66 Figura 22 – Representação esquemática do dispositivo fluorométrico (DF) e local para inserção do (a) insert contendo a amostra, (b) fibra óptica e (c) fonte luminosa LED azul. 74 Figura 23 – Componentes do sistema dispositivo fluorimétrico (DF): (a) insert, (b) fibra óptica e (c) LED. 75 Figura 24 – Representação esquemática do circuito do dispositivo fluorimétrico (DF) e seus componentes: (a) insert, (b) fibra óptica, (c) LED, (d) microcontrolador arduíno nano, (e) potenciômetro, (f) resistor, (g) cabo OTG e (h) celular. 76 Figura 25 – Representação esquemática do sistema de aquisição da imagem usando o dispositivo fluorimétrico (DF) acoplado ao celular. 77 Figura 26 – Espectro de emissão em 460 nm obtidos pelo espectrofluorímetro RF-1501 para (a) solução de cafeína em (a) água ultrapura e (b) em esgoto lab- made. 83 Figura 27 – Avaliação do tempo ideal de reação entre a cafeína (300 mg L -1) e a solução tampão de fosfato (0,100 mol L-1, pH 6,30 e 0,600 μmol L-1 de HPTS) a 25 °C, em espectrofluorímetro RF-1501. 84 Figura 28 – Curva analítica da razão de fluorescência (IF0/IF) em função da concentração da solução aquosa de cafeína entre 100 a 700 mg L-1, em espectrofluorímetro RF-1501. 85 Figura 29 – Curva analítica da razão de fluorescência (IF0/IF) em função da concentração da solução de cafeína em lab-made, entre 60 a 1300 mg L-1, em espectrofluorímetro RF-1501. 86 Figura 30 – Aquisição da imagem da reação fluorimétrica entre a solução aquosa de cafeína 100 mg L-1 e a solução tampão de fosfato (0,100 mol L-1, pH 6,30 e 100 μmol L-1 de HPTS) a 25 °C, adquirida pelo celular. 88 Figura 31 – Curva analítica da densidade óptica (D.O.) em função da concentração da solução aquosa de cafeína entre 100 a 600 mg L-1, por celular. 88 Figura 32 – Curva analítica da densidade óptica (D.O.) em função da concentração da solução l de cafeína em lab-made, entre 100 a 600 mg L-1, por celular. 89 Figura 33 – Curvas analíticas da razão de fluorescência (IF0/IF) em função da concentração de cafeína (100 a 600 mg L-1) em amostras de (a) energético e (b) esgoto, em espectrofluorímetro RF-1501. 94 Figura 34 – Curvas analíticas da D.O. em função da concentração de cafeína para método fluorimétrico em amostras de (a) energético entre 100 a 600 mg L -1, (b) esgoto entre 100 a 300 mg L-1, (c) medicamento 1 entre 100 a 600 mg L -1 e (d) medicamento 2 entre 100 a 600 mg L-1, por celular. 95 Figura 35 – Efeito de matriz avaliado pela relação entre os coeficientes angulares das curvas analíticas das amostras de energético, esgoto e medicamentos 1 e 2 em comparação com a curva da (a) água ultrapura e (b) do lab-made. 98 __________________________________________________________________________ Lista de Tabelas Tabela 1 – Parâmetros de ajuste do App OpenCamera definidos para aquisição de imagem do produto avermelhado gerado pela reação colorimétrica em placa de porcelana. 35 Tabela 2 – Massa molar, íon preceursor, íon fragmento, energia de colisão e potencial de saída de célula referentes à cafeína e os produtos 1 e 2 obtidos na reação colorimétrica para experimentos de monitoramento de reação selecionada (SRM). 38 Tabela 3 – Massa molar, íon precursor e íons fragmentos referentes à cafeína e aos produtos 1 e 2 obtidos na reação colorimétrica monitorados por LC-MS/ MS. 46 Tabela 4 – Figuras de mérito obtidas para a cafeína em água ultrapura, por LC-MS/MS. 51 Tabela 5 – Figuras de mérito obtidas para a cafeína em água ultrapura, pelo método desenvolvido em dispositivo colorimétrico (DC), por celular. 53 Tabela 6 – Figuras de mérito obtidas para a cafeína em água ultrapura pelos métodos desenvolvidos em LC-MS/MS e dispositivo colorimétrico (DC). 54 Tabela 7 – Comparação das vantagens e limitações das técnicas de análise por LC-MS/MS e o dispositivo colorimétrico (DC), segundo parâmetros de consumo de amostra, consumo de solvente orgânico, resíduos, efeito de matriz,preparo de amostra, tempo de análise, portabilidade e custo estimado do equipamento / dispositivo. 55 Tabela 8 – Figuras de mérito obtidas para cafeína em água ultrapura pelos métodos desenvolvidoes em LC-MS/MS e dispositivo colorimétrico (DC), das matrizes aquosas de energético, esgoto e medicamento 1. 64 Tabela 9 – Comparação entre as concentrações experimentais intradia e interdia em 300 mg L-1 de cafeína, obtidas a partir da fortificação das amostras de energético, esgoto e medicamento 1 e que utilizam suas respectivas curvas analíticas como modelo. 67 Tabela 10 – Comparação dos principais parâmetros analíticos de faixa linear, LOD, tipo de analito e suporte utilizado pelo presente estudo colorimétrico e trabalhos análogos encontrados na literatura. 68 Tabela 11 – Componentes do esgoto lab-made e suas respectivas concentrações. 73 Tabela 12 – Parâmetros analíticos do RF-1501 para análise das amostras da reação de resposta fluorimétrica entre a cafeína e a solução tampão de fosfato (0,100 mol L-1, pH 6,30 e 0,600 μmol L-1 de HPTS). 78 Tabela 13 – Figuras de mérito obtidas para a reação de resposta fluorimétrica entre a solução de cafeína (em água entre 100 a 700 mg L -1 e em lab-made entre 60 a 1300 mg L-1 ) e a solução tampão de fosfato (0,100 mol L-1, pH 6,30 e 0,600 μmol L-1 de HPTS), em espectrofluorímetro RF-1501. 87 Tabela 14 – Figuras de mérito obtidas para a reação de resposta fluorimétrica entre a solução de cafeína (em água e lab-made ambas entre 100 a 600 mg L- 1) e a solução tampão de fosfato (0,100 mol L-1, pH 6,30 e 100 μmol L-1 de HPTS), por celular. 90 Tabela 15 – Figuras de mérito obtidas para a cafeína em água ultrapura e esgoto lab-made, pelos métodos desenvolvidos em fluorímetro (F) e dispositivo fluorimétrico (DF). 91 Tabela 16 – Comparação das vantagens e limitações das técnicas de análise por espectrofluorímetro (F) e o dispositivo fluorimétrico (DF), segundo parâmetros de consumo de amostra, consumo de solvente orgânico, resíduos, efeito de matriz,preparo de amostra, tempo de análise, portabilidade e custo estimado do equipamento / dispositivo. 92 Tabela 17 – Figuras de mérito obtidas para cafeína em matrizes de energético (entre 100 a 600 mg L-1 para F e DF) e esgoto (entre 100 a 600 mg L-1 para F e entre 100 a 300 mg L-1 DF), pelos métodos desenvolvidoes em espectrofluorímetro (F) e dispositivo fluorimétrico (DF). 96 Tabela 18 – Efeito de matriz avaliado em valor percentual para amostras de energético (entre 100 a 600 mg L-1 de cafeína), esgoto (entre 100 a 300 mg L-1 de cafeína) e medicamentos 1 e 2 (entre 100 a 600 mg L-1 de cafeína) utilizando como modelo as curvas analíticas da água ultrapura e do esgoto lab-made. 97 Tabela 19 – Concentrações experimentais intradia obtidas a partir da fortificação das amostras de energético, esgoto e medicamentos 1 e 2 em 300 mg L-1 de cafeína, utilizando suas respectivas curvas analíticas, obtidas por dispositivo fluorimétrico (DF), como modelo analítico. 99 Tabela 20 – Concentrações experimentais intradia obtidas a partir da fortificação das amostras de energético, esgoto e medicamentos 1 e 2 em 300 mg L-1 de cafeína, utilizando suas respectivas curvas analíticas, obtidas pelo espectrofluorímetro RF-1501, como modelo analítico. 99 Tabela 21 – Comparação dos principais parâmetros analíticos de faixa linear, LOD, tipo de analito e suporte utilizado pelo presente estudo fluorimétrico e trabalhos análogos encontrados na literatura. 100 _________________________________________________________________ Lista de Equações Equação1 – Equação que descreve a curva analítica obtida para o produto 1 da reação entre a cafeína e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %), por LC-MS/MS. 48 Equação 2 – Equação que descreve a curva analítica obtida para o produto 2 da reação entre a cafeína e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %), por LC-MS/MS. 49 Equação 3 – Equação que descreve a curva analítica da reação colorimétrica obtida para a cefeína em água ultrapura, por LC-MS/MS. 50 Equação 4 – Relação logarítmica da densidade óptica (D.O.) 52 Equação 5 – Equação que descreve a curva analítica do dispositico colorimétrico (DC) obtida para a cefeína em água ultrapura, por celular. 52 Equação 6 – Equação para determinação do efeito de matriz 65 Equação 7 – Equação modelo da razão de fluorescência (Stern-Volmer) 81 Equação 8 – Equação que descreve a curva analítica da reação fluorimétrica obtida para a cefeína em água ultrapura, em espectrofluorímetro RF-1501. 85 Equação 9 – Equação que descreve a curva analítica da reação fluorimétrica obtida para a cefeína em esgoto lab-made, em espectrofluorímetro RF-1501. 86 Equação 10 – Equação que descreve a curva analítica do dispositivo fluorimétrico (DF) obtida para a cefeína em água ultrapura, por celular. 89 Equação 11 – Equação que descreve a curva analítica do dispositivo fluorimétrico (DF) obtida para a cefeína em lab-made, por celular. 89 Lista de Abreviaturas ACN – Acetonitrila ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária App – Aplicativo móvel CE – Collision energy CEP – Cell entrance potential CUR – Curtain gas CXP – Cell exit potential Da – Dalton DC – Dispositivo colorimétrico DF – Dispositivo fluorimétrico DMF – N-N-dimetilformamida D.O. – Densidade óptica DOQ-CGCRE – Definições de Termos Utilizados nos Documentos Relacionados à Acreditação de Laboratórios, Produtores de Materiais de Referência e Provedores de Ensaios de Proficiência. DP – Declustering potential DPR – Desvio padrão relativo EP – Entrance potential Energético – Red Bull® FDA – Food and Drug Administration GS – gas HPTS – 8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonate ICH – International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. Inmetro – Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia IS – íon spray KBrO3 – Bromato de potássio LC – Liquid chromatography LED – Light emitting diode LOC – lab-on-a-chip LOD – Limite de detecção LOQ – Limite de quantificação Medicamento 1 – Doril® Medicamento 2 – Melhoral® MeOH – Metanol MS/MS – Espectrômetro de massas sequencial PFP – Pentafluorophenyl PLA – Ácido polilático PMMA – Metacrilato de metilo PPCPs – Pharmaceuticals and Personal Care Products PS – Poliestireno PET – polietileno tereftalato PTZ – Pentilenotetrazol μPADs – Dispositivos microfluídicos a base de papel QTRAP – Quadrupole ion trap linear R2 – Coeficiente de determinação RGB – Red, Green e Blue ROI – Região de interesse óptico SRM – Selected reaction monitoring TEM – Temperatura TIQ – Cromatograma de íons totais UV-VIS – Região do espectro do ultravioleta e visível XIQ – Cromatograma de íon extraído _________________________________________________________________ RESUMO O elevado consumo de produtos que apresentam cafeína em suas composições tem contribuído significativamente para as alarmantes concentrações desse fármaco em esgoto em níveis de concentração que variam de µg L-1 a mg L-1. O desenvolvimento de dispositivos portáteis por prototipagem 3D que em conjunto à reações colorimétricas e fluorimétricas sejam capazes de determinar a presença de cafeína em amostras de águas residuárias é uma proposta inovadora e promissora para análises rápidas e de baixo custo. A técnica de aquisição de imagem usando celular utilizada visando a portabilidade e a acessibilidade do dispositivo miniaturizado, permitiu a digitalização da resposta analítica com auxílio do App OpenCamera. As imagens capturadas foram processadas no software ImageJ para obtenção da intensidade de sinal analítico. Os métodos propostos e de referência (LC-MS/MS e fluorímetro) foram validados segundo diretivas nacionais e internacionais de acreditação e aplicados em amostras de energético, esgoto e medicamentos. O método colorimétrico apresentou linearidade de 100 a 500 mg L-1 de cafeína com LOQ de 100 mg L-1 e LOD de 30,0 mg L-1 para valores de precisão entre 0,0800 e 0,760 %. O efeito de matriz foi avaliado para ambas amostras em água ultrapura e o método foi capaz de determinar cafeína em amostras de medicamentos com precisão. O método fluorimétrico apresentou valores de precisão intradia entre 0,890 e 2,05 % e interdia entre 0,830 e 1,98 % para faixa linear de 100 e 600 mg L-1 de cafeína com LOQ de 100 mg L-1 e LOD de 30,0 mg L-1 e R2 0,900. O efeito de matriz foi inferior a 100% para amostras de energético e esgoto, sendo aplicável a tais matrizes com precisão e exatidão. A faixa de trabalho obtida para ambos os métodos miniaturizados é relativamente ampla, sendo uma importante vantagem analítica para os dispositivos propostos comparados a outros métodos similares descritos na literatura científica. Os dispositivos propostos apresentaram características importantes como custo reduzido, volumes diminutos de reagentes e amostra, análises rápidas, possibilidade de total portabilidade e aplicabilidade em matrizes complexas. Palavras – chave: Cafeína. Colorimétrica. Fluorimétrica. Impressora 3D. Dispositivo. ___________________________________________________________________ ABSTRACT The high consumption of caffeine-containing products in their own compositions has contributed significantly to the alarming concentrations of this drug in wastewater at concentration levels ranging from μg L-1 to mg L-1. Portable 3D prototyping devices have worked together with colorimetric and fluorimetric reactions being able to determine the presence of caffeine in wastewater samples. It is an innovative and promising option for fast and low cost analyzes. The image acquisition technique has been used smartphones supporting the portability and accessibility in miniaturized devices. OpenCamera App was used to captur images that were processed in the ImageJ software to obtain the analytical signal strength. The proposed and reference methods (LC-MS / MS and fluorimeter) were validated according to the national and international accreditation directives and applied in samples of energy, domestic sewage and medicines. The colorimetric method showed linearity from 100 to 500 mg L-1 of caffeine with LOQ of 100 mg L-1 and LOD of 30.0 mg L-1 for precision values between 0.0800 and 0.760 %. The matrix effect was evaluated for both samples in ultrapure water and the method was able to accurately determine caffeine in drug samples. The fluorimetric method presented values of intraday precision between 0.890 and 2.05 % and between 0.830 and 1.98% for linear range of 100 and 600 mg L-1 of caffeine with LOQ of 100 mg L-1 and LOD of 30.0 mg L-1 and R2 0.900. The matrix effect was less than 100 % for energy and domestic sewage samples, applied to such matrices with precision and accuracy. The working range obtained for both miniaturized methods is relatively broad. It is an important analytical advantage for the proposed devices compared to other similar methods described in the scientific literature. The proposed devices presented important characteristics such as reduced cost, small volumes of reagents and samples, rapid analyzes, possibility of total portability and applicability in complex matrices. Keywords: Caffeine. Colorimetric. Fluorimetric. 3D printer. Device. ___________________________________________________________________ SUMÁRIO Capítulo 1 – Introdução Geral 1 INTRODUÇÃO 24 1.1 Cafeína: propriedades e resposta analítica 24 1.2 Contextualização da problemática ambiental 24 1.3 A ocorrência de cafeína no ambiente 26 1.4 Os efeitos da cafeína nos organismos 27 1.5 Reações colorimétrica e fluorimétrica 27 1.6 Microssitemas como uma alternativa analítica: Impressão 3D 28 1.7 Resposta analítica a partir do celular 29 1.8 Objetivo 30 Capítulo 2 – O dispositivo colorimétrico OBJETIVOS ESPECÍFICOS 32 2 MATERIAIS E MÉTODOS 32 2.1 Padrões e reagentes utilizados 32 2.2 Condições analíticas da reação 33 2.3 Instrumentação e condições analíticas 33 2.3.1 O dispositivo colorimétrico (DC) para captura de imagem 33 2.3.2 Aquisição da imagem 34 2.3.3 Processamento da imagem 36 2.3.4 Método referência: LC-MS/MS 37 2.4 Aplicação do método desenvolvido em amostras de energético, esgoto e medicamentos 38 2.4.1 Amostra de bebida energética 39 2.4.2 Amostra de medicamentos 39 2.4.3 Amostra de esgoto 40 2.5 Validação do método propostos em LC-MS/MS dispositivo colorimétrico (DC) 40 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 41 3.1 Considerações sobre a reação colorimétrica 41 3.2 Desenvolvimento do método referência – LC-MS/MS 42 3.2.1 Validação do método referência – LC-MS/MS 50 3.3 Desenvolvimento do método de estudo – Dispositivo colorimétrico (DC) 52 3.4 Comparação entre o método de LC-MS/MS e o dispositivo colorimétrico (DC) proposto. 53 3.5 Aplicação dos métodos desenvolvidos para reação colorimétrica em amostras de energético, esgoto e medicamentos. 57 3.5.1 Amostra de energético 57 3.5.2 Amostra de medicamentos 59 3.5.3 Amostra de esgoto 61 3.5.4 Comparação entre os resultados obtidos para amostras de energético, esgoto e medicamentos. 63 3.6 Comparação dos resultados obtidos no presente estudo colorimétrico com aqueles apresentados na literatura. 67 4. CONCLUSÃO 69 Capítulo 3 – O dispositivo fluorimétrico OBJETIVOS ESPECÍFICOS 71 2 MATERIAIS E MÉTODOS 71 2.1 Padrões e reagentes utilizados 71 2.2 Preparo das soluções 72 2.3 A reação entre a cafeína e o HPTS 73 2.4 Instrumentação e condições analíticas 74 2.4.1 O dispositivo fluorimétrico (DF) portátil proposto 74 2.4.2 Aquisição da imagem 77 2.4.3 Processamento da imagem 77 2.4.4 Método referência: Espectrofluorímetro 78 2.5 Aplicação do método desenvolvido em amostras de energético, esgoto e medicamentos. 78 2.5.1 Amostra de bebida energética 79 2.5.2 Amostra de medicamentos 80 2.5.3 Amostra de esgoto 80 2.6 Validação dos métodos propostos 80 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 81 3.1 Considerações sobre a reação fluorimétrica 81 3.2 Desenvolvimento do método referência – Shimadzu RF–1501 82 3.2.1 Avaliação da intensidade de fluorescência em água ultrapura e esgoto lab-made 82 3.2.2 Avaliação do tempo de reação 84 3.2.3 Validação do método de referência em água e lab-made 84 3.3 Desenvolvimento do método de estudo – Dispositivo fluorimétrico (DF) 87 3.4 Comparação entre o método espectrofluorimétrico (F) Shimadzu RF–1501 e o dispositivo fluorimétrico (DF) proposto. 90 3.5 Aplicação dos métodos desenvolvidos para reação fluorimétrica em amostras de energético, esgoto e medicamentos. 93 3.5.1 Amostra de energético 93 3.5.2 Amostra de medicamento 94 3.5.3 Amostra de esgoto 94 3.6 Comparação dos resultados obtidos no presente estudo fluorimétrico com aqueles apresentados na literatura. 100 4. CONCLUSÃO 101 Capítulo 4 - Conclusão Geral e Perspectivas Conclusão 104 Perspectivas 104 REFERÊNCIAS 106 ________________________________________ PREFÁCIO A presente dissertação aborda o uso de reações colorimétrica e fluorimétrica para determinação de cafeína em águas residuárias. A utilização de dispositivos miniaturizados e impressos a partir da técnica de prototipagem rápida foi uma alternativa inovadora aplicada ao método proposto, visando garantir a portabilidade dos dispositivos propostos nesse estudo. O Capítulo 1 apresenta uma revisão bibliográfica dos aspectos ambientais que motivaram a realização do presente estudo e o desenvolvimento de dispositivos de resposta analítica rápida, de baixo custo e portáteis para análises remotas . O Capítulo 2 apresenta o procedimento realizado e os resultados obtidos no estudo da resposta colorimétrica para cafeína em águas residuárias, bebida energética e medicamentos que contêm cafeína em sua composição. O Capítulo 3 descreve o procedimento experimental que envolve a reação fluorimétrica bem como a técnica de fabricação do dispositvo impresso com tecnologia 3D para suportar a reação. Os resultados obtidos a partir da reação fluorimétrica para detecção de cafeína em águas residuárias, bebida energética e medicamentos que contêm cafeína em sua composição também são apresentados. Por fim, o Capítulo 4 apresenta uma conclusão geral sobre o trabalho. ___________________________________________________________________ 23 ___________________________________________________________________ Capítulo 1 Introdução Geral 24 ___________________________________________________________________ Capítulo 1: Introdução Geral 1 INTRODUÇÃO 1.1 Cafeína: propriedades e resposta analítica A cafeína (C8H10N4O2) é um composto orgânico da família dos alcalóides, de função orgânica amida e que pertence à classe de compostos das metil-xantinas, conforme demonstrado na Figura 1. Figura 1 – Estrutura plana da molécula de cafeína. Fonte: autor, 2018 (ACD/Labs) Software versão 11.2 (© 1994 – 2018 ACD/Labs). Possui duplas conjugadas e grupos carbonila interagindo com a radiação na região do ultravioleta, que permite monitoramento desse analito por resposta colorimétrica perceptível ao olho humano e a equipamentos de captura de imagem sem elevada sensibilidae óptica. Técnicas espectrofotométricas e cromatográficas podem ser utilizadas para a determinação da cafeína em soluções, porém essas técnicas exigem a aquisição de equipamentos de alto valor monetário, encarecendo a análise desse elemento. 1.2 Contextualização da problemática ambiental As atividades industriais atreladas ao crescimento populacional e ao consumo exacerbado de produtos têm efeito direto sobre a dinâmica natural dos ecossistemas. O comprometimento da biota bem como a degradação do meio dada pela exploração de fontes naturais ou pelo lançamento de contaminantes orgânicos e inorgânicos podem atingir concentrações capazes de desequilibrar o meio 25 ambiente e comprometer a saúde humana1. Os dejetos humanos são a principal fonte de disseminação de compostos no ambiente por conter uma ampla variedade de compostos em sua constituição. A grande variedade de poluentes e a escassez de informações sobre os processos de transformação e de degradação desses compostos têm motivado o monitoramento desses emergentes nos ambientes aquático, terrestre, marinho e atmosférico visando fornecer importantes informações de como essas substâncias podem modificar o ecossistema estudado. 1.3 A ocorrência de cafeína no ambiente Nesse contexto, a cafeína é classificada como um contaminante emergente, isto é um composto com potencial toxicidade aos organismos vivos e com estudos de cinética dedegradação pouco explorados. Sua presença em ampla variedade de produtos culmina com a sua ocorrência em águas residuárias, comprometendo principalmente os ecossistemas aquáticos. A indústria alimentícia representa bem esse cenário com sua diversificada produção de consumíveis que apresentam cafeína em sua composição, como o chocolate (Theobroma cacao) que contém cafeína do cacau, matéria-prima de sua produção; na erva-mate (Ilex paraguariensis); em refrigerantes à base de cola (semente das árvores do gênero Cola sp.); no guaraná (Paullinia cupana) dentre outros2. O segmento farmacêutico de cosméticos igualmente oferece produtos que atendem desde ingeríveis, como supressores de apetite, energéticos, aspirina até cremes anticoagulante e anticelulite que contêm cafeína em sua composição3. As principais fontes de despejo de cafeína no ambiente são a excreção humana e a lavagem dos utensílios domésticos. Essa substância está presente no ambiente em concentrações com níveis que variam de µg L−1 a mg L−1, de acordo com as atividades antropogênicas e a região de coleta de amostra 4-6. No Brasil pode-se citar estudos recentes em que concentrações de contaminantes emergentes, dentre eles a cafeína, foram detectadas em águas residuárias. Segundo Sodré e colaboradores, estudos realizados na cidade de Campinas, localizada no Estado de São Paulo, indicaram a presença de cafeína com valores médios de 13,1 µg L–1, encontrada em cinco dos seis pontos amostrais na extensão da bacia do rio Atibaia7. Esse valor médio está em concordância com os níveis encontrados em matrizes similares em outras regiões do mundo, como com os teores determinados em amostras de esgoto bruto 26 de países mais desenvolvidos, tal como a Noruega8. Ambos os estudos apresentaram valores médios de cafeína dentro da faixa de µg L−1 a mg L−1 como esperado, porém em comparação com dados obtidos em estudos realizados em outras regiões do mundo, pode-se observar valores de detecção na ordem de mg L−1, como no caso de um estudo desenvolvido no Canadá9, em que a concentração de cafeína em esgoto sanitário apresentaram uma faixa de concentração de 20,0 a 300 mg L−1. Sua presença em água potável não é desejável, mas por ser comumente encontrada, ela vem sendo utilizada como um biomarcador que indica a presença de outras substâncias químicas nocivas à saúde humana. Assim, a cafeína enquadra-se na classificação de Pharmaceuticals and Personal Care Products (PPCPs), sendo um potencial indicador de contaminação antropogênica10. Na natureza, essa substância é encontrada em cerca de 60 espécies de plantas sendo as principais fontes de obtenção a semente do café (Coffea arabica) e a folha de chá-preto (Camellia sinensis). A cafeína tem sua funcionalidade na natureza como um praguicida natural, capaz de proteger as espécies de plantas que a produz de ataques de insetos, pois atua como inibidor de atividades enzimáticas do sistema nervoso do organismo e, por fim, causa a morte do mesmo11. Estudos realizados por Hollingsworth, Armstrong e Campbell avaliaram o potencial da cafeína como praguicida para lesmas e caracóis em culturas de alimentos, sendo uma alternativa natural como repelente12. A cafeína está presente em diferentes concentrações em produtos alimentícios, como bebidas energéticas, refrigerantes, chás e cafés. A concentração estimada de cafeína em um copo de leite com chocolate é de 21,2 mg L-1. Em refrigerantes como a Coca-Cola© clássica e a Coca-Cola© Cherry esses valores são de 96,0 mg L-1, segundo o fabricante. Os energéticos também apresentam valores expressivos de cafeína, porém similares dentre as marcas consideradas, como a bebida energética Monster e a Electric Monkey Wild com 33,8 mg L-1. A franquia de cafés StarbucksTM oferece café clássico com 35,9 mg L-1 e refrescos com 10,6 mg L-1 de cafeína13. A presença desse composto em produtos cosméticos também ocorre em ampla aplicabilidade, como por exemplo em cremes anticelulite disponíveis por variadas marcas no mercado. 27 1.4 Os efeitos da cafeína nos organismos Os efeitos biológicos da exposição de organismos a essa substância pode causar comprometimento do desenvolvimento de algumas espécies. Os organismos aquáticos tem se mostrado mais sensíveis a exposição de cafeína, porém já é relatado na literatura, o comprometimento da saúde humana pela ingestão excessiva dessa substância, tendo como principal consequência quadros de convulsão e epilepsia14. O modelo de organismo utilizado para esse amplo estudo tem sido o peixe-zebra, ou zebrafish (Danio rerio) que vem apresentando quadros de epilepsia recorrente de convulsões quando expostos a elevadas concentrações de cafeína. O uso do zebrafish como modelo animal é atribuído a fatores como manutenção de baixo custo, embriões altamente resistentes à manipulações experimentais que dispensam protocolos invasivos, boa capacidade de absorver compostos adicionados à água e ainda, uma estrutura embrionária transparente que permite a visualização dos processos do desenvolvimento nos seus diferentes estágios15. Com a finalidade de avaliar o impacto causado pelos elevados índices de concentração de cafeína em águas residuárias estão sendo desenvolvidos estudos em larvas de peixe zebra nas fases iniciais de seu desenvolvimento para caracterização comportamental. O estudo permite avaliar a capacidade locomotora do animal através de uma dada distância percorrida e sua velocidade média, uma vez que esse animal apresenta os sistemas sensitivo, motor e endócrino bastante desenvolvidos, de modo a apresentarem excelente resposta sensíveis as alterações ambientais e manipulações farmacológicas16. 1.5 Reações colorimétrica e fluorimétrica Reações colorimétrica e fluorimétrica são alternativas analíticas rápidas e de baixo custo para determinação de analitos e mostram-se promissoras para desenvolvimento de métodos eficazes de análise e portáteis. A reação considerada para o ensaio colorimétrico é descrita na literatura por Karawya, Diab e Swelem envolvendo cafeína, HCl 37 % e KBrO3, como uma alternativa para indicar e determinar a presença de cafeína, pois resulta em um composto provido de intensa coloração na região do visível17. Outra alternativa é o desenvolvimento de métodos 28 envolvendo reações fluorimétricas ou de decaimento de fluorescência que apresentam significante seletividade e sensibilidade. A interação eletrônica relatada por Taylor e colaboradores sugere que a cafeína e o fluoróforo HPTS formem um produto de transferência de cargas18. Esse produto formado a partir da interação entre a cafeína e um corante fluorescente também foi citado por Rochat e colaboradores19. O corante fluorescente 8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonate (HPTS), estrutura presente na Figura 2, ao reagir com a cafeína em solução tampão de fosfato (0,100 mol L-1, pH 6,30 e 50,0 μmol L-1 de HPTS) resulta em um composto entre o HTPS e a cafeína, com propriedades fluorescentes na região do ultravioleta visível (UV-VIS)19. Figura 2 – Estrutura plana da molécula de HPTS. Fonte: autor, 2018 (ACD/Labs) Software versão 11.2 (© 1994 – 2018 ACD/Labs). 1.6 Microssistemas como uma alternativa analítica: Impressão 3D O desenvolvimento de microssistemas impressos com tecnologia de impressão 3D são uma tendência às análises químicas devido a fácil implementação e ao aumento da frequência analítica que favorecem um método mais acessível e de fácil execução. A redução da quantidade de amostra, reagentes utilizados e do tempo de análise, bem como dos resíduos gerados, e suas respectivas toxicidades20,21. Estudos de microssistemas tiveram seu início na década de 90 com o desenvolvimento de microdispositivos analíticos capazes de realizar um maior número de análises concomitantes em um único sistema que disponha de uma quantidade reduzida de amostra, sem que haja comprometimento da sensibilidade, precisão, estabilidade e reprodutibilidade das análises22. Esse revolucionário segmento da instrumentação analítica é denominado lab-on-a-chip (LOC), e consiste na miniaturização e na integração de várias etapas analíticas laboratoriais usando um sistema miniaturizado como um microchip. A necessidade de uma técnica 29 simples para análise, que atenda aos princípios da Química Verde e que permita o desenvolvimento de métodos analíticos, motivou o uso de spot-tests miniaturizados. Embora o manuseio de volumes muito reduzidos – da ordem de 10-9 a 10-6 L – aumente a incidência de erro analítico durante a análise, a obtenção de uma resposta analítica dispondo de microvolumes de amostra é um ganho, principalmente quando a amostra apresenta volumes reduzidos. Além dessa vantagem, o descarte desses microssistemas é facilitado bem como o menor volume de resíduos químicos23. A possibilidade de realizar análises “in loco” a partir de dispositivos portáteis conferem inúmeras vantagens ao analista. Os dispositivos microfluídicos a base de papel (μPADs) juntamente aos dispositivos impressos por tecnologia 3D são uma tendência de acessível fabricação24,25. A técnica de impressão 3D tem sido amplamente utilizada para fabricação dos mais variados objetos e aplicabilidades. Trata-se de uma técnica de prototipagem rápida do tipo aditiva, isto é, a fabricação de objetos em escala real em um curto período de tempo a partir de um processo de adição de material por camadas26. A disponibilidade de filamentos poliméricos como uma alternativa ao vidro, até então amplamente utilizado para aplicações analíticas, caracteriza essa técnica como economicamente vantajosa. Os filamentos poliméricos estão disponíveis em uma gama de opções, e podem ser escolhidos para fabricação de um dispositivo miniaturizado segundo as propriedades químicas, mecânicas e elétricas27. O interesse por sistemas miniaturizados é uma tendência as mais variadas finalidades analíticas e estende-se a diversas aplicabilidades e análises ambientais. O uso de μPADs e dispositivos 3D para análises colorimétricas e de fluorescência com análise de imagens são ideais para análises rápidas, embora ainda hajam limitações e desafios. 1.7 Resposta analítica a partir do celular A colorimetria relaciona de forma direta a intensidade de cor obtida como resposta analítica em função da concentração do analito. O dispositivo é submetido a uma etapa de aquisição de imagem por uma câmera fotográfica ou scanner28. A necessidade de obter uma imagem de cada spot sem variação na posição de captura dessa garante uma resposta analítica confiável e confere precisão ao método, de modo que esse cuidado foi considerado na etapa de aquisição da imagem. Em uma etapa subsequente, o tratamento da imagem é feito com auxílio de 30 um software gráfico, ImageJ. Uma região de interesse (ROI) foi delimitada por um retângulo na região vertical do spot, garantindo que maior homogeneidade da imagem fosse considerada. A imagem capturada pelo celular é submetida a um modelo cromáticos de cores chamado RGB (Red, Green and Blue) que passa a expressar a imagem original em função das possibilidades de combinação das cores vermelho, verde e azul. A partir desses 3 canais de cores é possível observar em qual deles a variação de D.O. é mais acentuada para então utilizá-lo como canal de referência e obter os valores numéricos de sinal analítico. As reações fluorimétricas tem sua intensidade de cor medida de maneira análoga. Uma importante limitação da técnica miniaturizada é a possível contaminação do sinal analítico de fluorescência, pelo fenômeno de espalhamento de radiação e por fluorescência de fundo. A disposição da fonte luminosa incidente na amostra deve ser perpendicular ao equipamento (celular, câmera etc) utilizado para aquisição da imagem da resposta analítica ou mesmo usar filtros para barrar a radiação usada para excitar o analito presente na amostra29. Após a etapa de aquisição da imagem com as respectivas peculiaridades para cada tipo de reação, segue a etapa de processamento da imagem30. A utilização de equipamentos celulares tem se mostrado uma forte tendência para análises usando spot-tests para os mais variados tipos de reações químicas. A praticidade da aquisição da resposta analítica, e posterior, tratamento da imagem são uma excelente combinação aos fatores de custo e vantagens analíticas. 1.8 Objetivo O objetivo proposto é a determinação de cafeína em amostras de energético (Red Bull®), esgoto e medicamentos (Doril® e Melhoral®) bem como desenvolver dispositivos poliméricos portáteis e de baixo custo para análises quantitativas. 31 ___________________________________________________________________ Capítulo 2 Dispositivo Colorimétrico _________________________________________________________________ 32 ___________________________________________________________________ Capítulo 2: Dispositivo colorimétrico OBJETIVOS ESPECÍFICOS ✔ Otimizar as melhores condições experimentais da reação, como pH, volume e a concentração de reagentes/soluções, bem como o tempo que a reação precisa para ocorrer de maneira efetiva. ✔ Verificar os produtos gerados pela reação entre cafeína e bromato de potássio. ✔ Desenvolver um método comparativo para determinar cafeína usando cromatografia líquida acoplada à espectrômetro de massas sequencial (LC- MS/MS). ✔ Validar o método proposto e comparar os resultados obtidos com o método referência. ✔ Aplicar os métodos desenvolvidos em amostras que contêm cafeína em sua composição, sendo esgoto, medicamentos e bebida energética. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Padrões e reagentes utilizados As soluções estoque utilizadas no presente estudo foram preparadas a partir de padrões fornecidos pela Sigma-Aldrich®: cafeína (C8H10N4O2, massa molar (MM) de 194,19 g mol-1, CAS 58-08-2), bromato de potássio (KBrO3, MM de 167,0 g mol-1, CAS 7758-01-2), ácido clorídrico 37 % (HCl, MM de 36,46 g mol -1, CAS 7647-01-0) e N-N Dimetilformamida (HCON(CH3)2, MM de 73,09 g mol-1, CAS 68-12-2). Os solventes com grau de pureza HPLC utilizados para análises por LC-MS/MS foram fornecidos pela J. T. Baker Chemicals: metanol (MeOH), acetonitrila (ACN) e ácido fórmico. As soluções aquosas estoque de cafeína (1000 mg L-1) e KBrO3 (2000 mg L-1) foram semanalmente preparadas, armazenadas em frasco âmbar sob ambiente controlado a temperatura entre 6 e 10°C. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=7758-01-2&interface=CAS%20No.&lang=en®ion=US&focus=product 33 2.2 Condições analíticas da reação A partir do ensaio de viabilidade da reação colorimétrica para determinação de cafeína em matriz aquosa foi possível otimizar as condições experimentais de concentração e volume de soluções/reagentes, tempo de reação e temperatura de aquecimento. A reação mostrou-se viável à tais condições com formação de um resíduo marrom-avermelhado, com característica similar ao reportado por Karawya. O presente estudo bem como a citação bibliográfica nãoapresentou proposta de elucidação estrutural para os produtos de reação17. As reações foram realizadas em placas de toque em porcelana (Unilab, 6 spot-test com capacidade para 500 µL) e avaliada para diferentes concentrações de cafeína numa faixa de 3,00 a 1000 mg L-1 disposta em cada spot. A reação consiste na adição de 100 μL da solução aquosa de cafeína (já disposta no spot) e 100 μL de ácido HCl 37,0 %, acrescidos do mesmo volume de solução de KBrO3. A placa de porcelana é então disposta em uma mesa de aquecimento (Kasvi, K40-1820H) a 150°C até completa evaporação dos solventes. A placa é removida e aguarda-se seu resfriamento à temperatura ambiente. O solvente DMF (500 μL) é adicionado em cada spot e após 15,0 minutos em contato com o produto remanescente da evaporação inicial a placa é novamente submetida ao aquecimento (100°C) para a completa evaporação desse. 2.3 Instrumentação e condições analíticas 2.3.1 O dispositivo colorimétrico (DC) para captura de imagem A necessidade de controlar a luminosidade recebida pelo spot-test durante a etapa de aquisição da imagem usando celular bem como a captura da imagem de cada spot com mínima variação da posição foram importantes parâmetros considerados para desenvolvimento e fabricação do dispositivo colorimétrico. O processo de fabricação do dispositivo tem início pela etapa de modelagem e dimensionamento dos objetos com auxílio de um software modelador 3D, FreeCAD (versão 0.16). Em seguida, o software fatiador de imagem, Slic3r (versão 34 1.2.9), interpreta os arquivos de extensão .stl gerados na etapa prévia e permite o tratamento estrutural da constituição física do objeto. Na última etapa do processo de fabricação do objeto 3D, o arquivo em código G é então interpretado pelo software executor da impressora (3D Cloner ST printer, Ind. Schumacher Ltda., Brasil), e o objeto físico é obtido de acordo com as especificações previamente estabelecidas nas etapas de modelagem e de fatiamento em camadas. Os softwares utilizados nas etapas de modelagem, fatiamento e impressão dos dispositivos bem como os utilizados na aquisição e tratamento de imagem, são classificados como softwares de código aberto tendo seus respectivos código fonte disponibilizados e licenciados com base em direito autoral32. A escolha do tipo de material utilizado para fabricar os dispositivos foi avaliada de acordo com a finalidade de aplicação de cada seção. O filamento de ácido polilático (PLA, AcccreateTM) cinza foi introduzido no bico extrusor da impressora aquecido a 200°C para que o material atinja temperatura suficiente para ser extrudado. A mesa de aquecimento usou temperatura de 65°C garantindo aderência do material em sua superfície. Esses parâmetros são característicos a cada material e devem ser especificados pelo fabricante desses polímeros. O dispositivo consiste em uma capa retangular (15 x 7,7 x 1,1 cm) para acomodar o celular sempre na mesma posição. Um cilindro está acoplado à essa (2,4 cm de diâmetro e 4,0 cm de comprimento) responsável por permitir a captação da imagem digital e manter a distância focal entre a câmera - spot e a radiação da luz do LED sempre constantes. Esse dispositivo está ilustrado na Figura 3. Figura 3 – Representação esquemática do dispositivo colorimétrico (DC) fabricado por impressão 3D. Fonte: autor, 2018 (FreeCad) Software versão 0.16 (© 2016 – 2018 FreeCad). 35 2.3.2 Aquisição da imagem A etapa de aquisição da imagem foi realizada usando celular (Motorola Moto G5 Plus, câmera 12 MP). Para isso, a imagem da área superficial do spot-test da placa de toque foi fotografada pelo celularcelular acoplado ao dispositivo proposto, Figura 4. Figura 4 – Representação esquemática da etapa de aquisição da imagem usando dispositivo colorimétrico (DC) acoplado ao celular e a posição de captura da imagem (spot) na placa de porcelana. Fonte: autor, 2018 (FreeCad) Software versão 0.16 (© 2016 – 2018 FreeCad). As configurações de flash, filtros, ajustes de escala e, em especial, o modo de captura que definem a câmera do celular foram manualmente ajustadas. O aplicativo de celular OpenCamera (versão 1.40) é um aplicativo de código aberto desenvolvido para tablets e celulares com sistema Android que controla os principais parâmetros considerados nessa etapa e suas respectivas definições, Tabela 1. Tabela 1 – Parâmetros de ajuste do App OpenCamera definidos para aquisição de imagem do produto avermelhado gerado pela reação colorimétrica em placa de porcelana. Parâmetros Modo Flash Contínuo Foco Contínuo ISO 1600 Auto estabilização Desativado Balanço de branco Daylight Detecção de rosto Desativado Temporizador Desativado Modo de cena Hdr Efeito de cor Nenhum Interval de desparo Nenhum Exposição travada Ativada Fonte: autor, 2018. 36 Os parâmetros considerados são fundamentais à resposta analítica obtida a partir da imagem capturada pelo celular. O flash contínuo garante que a mesma intensidade luminosa está atingindo o spot garantindo homogeneidade na captura da imagem. A escolha da ISO 1600 dentre as opções possíveis garante maior sensibilidade do sensor da câmera a luz, assim, quanto maior o ISO, maior a sensibilidade do sensor a luz. O balanço de branco é uma ferramenta utilizada para compensar a cor da foto através de uma escala de temperatura de cores (quente - fria) na escala Kelvin. A opção Daylight encontra-se na região central da escala na interface de cores azul e amarela, em 5.000 K. O modo de cena alto alcance dinâmico (Hdr) permite que quantidades de luz com diferentes intensidades sejam gravadas pelas lentes da câmara ao capturar a imagem, sendo ideal para fotos com muita ou pouca luz, pois trabalha com sobreposição de imagens. 2.3.3 Processamento da imagem O software ImageJ (versão 1.50i, National Institutes of Health, USA) tem sido comumente usado para processamento de imagens científicas multidimensionais. A imagem capturada pelo App OpenCamera é agora convertida em um modelo de cores aditivas RGB (Red, Green e Blue), que combina as cores vermelho, verde e azul em um espectro cromático que varia em uma escala de 0 a 255 para cada cor. A mistura então varia em uma escala do preto (0, 0, 0) ao branco (255, 255, 255). A resposta referente a cor obtida (RGB) está diretamente relacionada a cor complementar capturada do objeto fotografado. Os canais fornecem valores numéricos do sinal analítico (Mean), referente a variação na escala cromática. Para garantir que a mesma região de cada spot seja analisada, uma região de interesse óptico (ROI) foi gerada a partir do primeiro spot e aplicada aos demais. Esta ferramenta garante que a região e a área a serem analisada apresentem valores fixos, e consequentemente, que a resposta analítica obtida tenha maior confiabilidade e repetibilidade. Uma região retangular com 4560 unidade de área foi utilizada para delimitar a área fixa de interesse em cada spot. 37 2.3.4 Método referência: LC-MS/MS Um método referência de análise foi desenvolvido em LC-MS/MS e os resultados foram comparados com aqueles obtidos pelo método de estudo miniaturizado. As curvas analíticas obtidas para cafeína em água ultrapura segundo procedimento da seção 2.2. Os resíduos sólidos, obtido após a reação ocorrer em cada spot para ambas condições, foram solubilizados em 300 µL de MeOH e transferido para um insert para análise. A partir dessa análise buscou-se elucidar o produto obtido na reação entre cafeína e brometo de potássio em meio ácido. A curva analítica da cafeína foi obtida para concentrações de 3,33 a 333 mg L-1. Um equipamento de LC da Agilent 1200 Series, composto por amostrador automático 1200 Series, bomba quaternária 1200 e forno para coluna 1200 Series foi utilizado. Para as análises do(s) possível produto(s) da reação colorimétrica e das demais amostras foram injetados 20,0 µL da solução metanólica em uma vazão de 1,00 mL min-1. A amostra foi separada em coluna Phenomenex PFP (150 x 4,60 mm x 5,00 µm), condicionada a 35°C. A fase móvel utilizada foi água ultrapura acidificada e acetonitrila (ACN) ambas contendo 0,100 % de ácido fórmico. A eluição foi feita em modo gradiente tendo a seguinte programação: 0,50 minutos (5,00 % ACN), de 0,50 a 8,00 minutos (5,00 a 100 % ACN), de 8,00 a 10,00 minutos (100 % ACN). As condições iniciais foram reestabelecidas por mais 4,00 minutos e o tempo de análise total foi de 14,0 minutos. As condições do espectrômetro de massas 3200 QTRAP (quadrupolo – íon trap linear) da AB Sciex (Foster City, CA, USA) contaram com ionização por electrospray (Turbo Ion Spray) no modo positivo. Os parâmetros de operação da fonte de ionização contaram com potencial de Ion Spray (IS): 5500 V, Curtain Gas (CUR): 20 psi, Temperatura (TEM): 650°C, Gas (GS 1)1: 50 psi, Gas 2 (GS 2): 50 psi, Interface heater: ON. Os demais parâmetros de ionização e fragmentação foram ajustados automaticamente através da infusão direta de 0,100 mg L-1 da cafeína (composto referência utilizados nas reações investigadas) com declustering potential (DP) de 51,0 V, entrance potential (EP) de 4,00 V e cell entrance potential (CEP) de 10,0 V. 38 Experimentos de varredura de íons de 120 a 920 Da foram realizados, inicialmente para verificar a presença de possíveis produtos da reação de oxidação da cafeína. Experimentos de íons fragmentos (MS/MS) para os íons precursores encontrados também foram realizados a fim de monitorá-los no modo selected reaction monitoring (SRM). A Tabela 2 ilustra as transições monitoradas para os dois produtos majoritários da reação e da própria cafeína afim de proporcionar maior seletividade e sensibilidade as análises por LC-MS/MS. Tabela 2 – Massa molar, íon preceursor, íon fragmento, energia de colisão e potencial de saída de célula referentes à cafeína e os produtos 1 e 2 obtidos na reação colorimétrica para experimentos de monitoramento de reação selecionada (SRM). Composto Massa Molar (Da) Íon precursor > íon fragmento (m/z) CE (V) CXP (V) Cafeína 194 195>138 195>110 195>83 27,0 31,0 37,0 4,00 Produto 1 480 481>241 241>198 241>170 15,0 30,0 30,0 4,00 Produto 2 323 324>182 324>125 30,0 30,0 4,00 Fonte: autor, 2018. 2.4 Aplicação do método desenvolvido em amostras de energético, esgoto e medicamentos As condições analíticas e instrumentais estabelecidas previamente foram aplicadas para amostras de bebida energética (Red Bull®), medicamentos que contêm cafeína em sua composição (Melhoral® e Doril®) e esgoto coletado nas proximidades do Campus 2 da USP (22°00’06.5’’S 47°55’47.3”W) em área urbana da cidade de São Carlos – São Paulo. As amostras referentes ao Doril® foram intituladas Medicamento 1 e as de Melhoral® de Medicamento 2. O efeito de interferência de matriz foi avaliado e as amostras foram diluídas para reduzir o comprometimento da resposta analítica em ambos os métodos. No dispositivo proposto, as concentrações de cafeína nas amostras, foram determinadas usando adição de padrão. 39 De forma semelhante, para as análises por LC-MS/MS (método referência) as amostras foram diluídas para minimizar o efeito de matriz e submetidas a análise para verificar se suas respectivas concentrações atendiam ao método desenvolvido. 2.4.1 Amostra de bebida energética A amostra de Red Bull® foi obtida a partir de uma lata de 250 mL contendo 80,0 mg de cafeína, ou seja, em 320 mg L-1 de cafeína, segundo informações fornecidas pelo fabricante. Embora este valor se mostre adequado a faixa avaliada para concentração de cafeína dos métodos referência e proposto, diluições foram realizadas a partir de uma alíquota de 60,0 µL do conteúdo da embalagem referência em 100 mL de água ultrapura para que o efeito de matriz fosse minimizado. A solução estoque obtida em 0,190 mg L-1 de cafeína foi fortificada a partir de diluições da solução estoque de cafeína e as concentrações de 3,00 a 900 mg L-1 foram avaliadas para o método do dispositivo proposto. 2.4.2 Amostra de medicamentos O medicamento 1 (Doril® – MS: 1.7817.0007, Cosmed Indústria de Cosméticos e Medicamentos S/A) e o medicamento 2 (Melhoral® – MS: 1.7817.0004, The Sydney Ross Co), ambos de uso adulto, foram analisados por apresentarem cafeína em sua composição. Segundo informação de seus respectivos fabricantes, ambos apresentam ácido acetilsalicílico (500 mg) e cafeína (30,0 mg) em suas composições, além de excipientes como amido e corante vermelho de eritrosina nº 3 para o Doril® 31 e amido, hipromelose e triacetina para o Melhoral® 32. O procedimento para análise da concentração de cafeína nesses fármacos foi adaptado do protocolo determinado pela Farmacopéia Brasileira para formas farmacêuticas sólidas em dose unitária de comprimidos não revestidos. Com a finalidade de verificar se as unidades apresentam uniformidade de peso foi previamente determinado o peso médio de 5,00 unidades da embalagem (caixa contendo 30,0 comprimidos). A condição de limite de tolerância menor do que duas unidades com relação aos limites especificados para comprimidos não revestidos foi atendida. A medida de peso médio apresentaram limite de variação de ± 10,0 %, 40 não estando acima ou abaixo do dobro das porcentagens indicadas, como exigido. Um comprimido contendo 30,0 mg de cafeína foi macerado e solubilizado em volume mínimo de água ultrapura. A solução foi filtrada em papel qualitativo e o filtrado transferido para um balão volumétrico e completado para 100 mL de água ultrapura, resultando em solução estoque de concentração 300 mg L-1 preparada para cada fármaco. O método portátil foi avaliado para concentrações entre 3,00 a 600 mg L-1 para ambos medicamentos. 2.4.3 Amostra de esgoto A amostra de esgoto obtida nas proximidades do Campus 2 da USP (22°00’06.5’’S 47°55’47.3”W) em área urbana da cidade de São Carlos – São Paulo foi coletada em frascos plásticos de polietileno tereftalato (PET) e armazenada no mesmo em geladeira à temperatura entre 6 e 10°C. As amostras foram analisadas em período máximo de 7 dias após a data de coleta e submetida a análises colorimétricas em método referência e proposto. Devido a sua complexidade, a amostra de esgoto foi previamente filtrada e fortificada com solução de cafeína em diferentes concentrações para um estudo da viabilidade da reação entre 3,00 a 900 mg L-1 do analito para o método proposto. 2.5 Validação do método propostos em LC-MS/MS dispositivo colorimétrico (DC) A validação foi feita seguindo a diretiva do Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (Inmetro) com base nos documentos necessários para acreditação (DOQ-CGCRE-008 – Rev. 06 – Nov/17)33. O método desenvolvido acorda ainda com outras agências nacionais de acreditação, como a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)34 e órgãos internacionais de supervisão da segurança da saúde pública como Food and Drug Administration (FDA)35. Os métodos propostos nesse estudo foram validados segundo parâmetros de precisão (intra e interdias), limite de quantificação, limite de detecção, sensibilidade e linearidade. O método foi avaliado em matriz aquosa e aplicado às amostras de medicamentos, bebida energética e esgoto para o método referência e proposto. 41 O LOD de ambos os métodos foi determinado a partir da razão entre o LOQ e um fator 3,30, representando o menor valor de concentração que o analito pode ser detectado por um método analítico com precisão. O LOQ dos métodos analíticos desenvolvidos no presente estudo baseou-se menor concentração do analito em que foi possível quantificar com precisão e exatidão especificados (DPR % inferior a 20,0 %). A linearidade foi avaliada fortificando as amostras de interesse em concentrações crescentes desse analito para uma faixa de 3,33 a 333 mg L -1 no método referência e de 3,00 a 900 mg L-1 para o método proposto. As análises das amostras por adição de padrão foram realizadas em triplicatas e a média dos valores obtidos como resposta analítica. A faixa linear de 3,33 a 333 mg L-1 no método referência, de 100 a 500 mg L-1 para o dispositivo em água e a amostras de energético e esgoto e de 100 a 300 mg L-1 para os medicamentos. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Considerações sobre a reação colorimétrica A ordem de adição dos reagentes à placa de porcelana foi adotada colocando-se primeiramente solução de cafeína, seguida da adição de ácido clorídrico 37 % e adição de solução de KBrO3, todos em volumes iguais de 100 µL. A placa de porcelana foi disposta sobre a mesa de aquecimento a 150°C e a medida que a reação ocorria foi observada a formação de um resíduo sólido avermelhado, como apresentado na Figura 5. Figura 5 – Placa de porcelana com resíduo sólido avermelhado obtido após a reação entre cafeína (75 mg L-1) e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %) ocorrer. Fonte: autor, 2018. 42 A intensidade da cor vermelha foi proporcional a concentração de cafeína presente no meio para reagir, sendo essa relação observada pelos valores de intensidade de sinal obtidos via celular e pelo LC-MS/MS. Essa variação é muito pouco perceptível ao olho humano. Embora a temperatura da mesa tenha sido programada e a placa de porcelana tenha dissipação homogênea do calor por todos os spots pôde-se observar variação de temperatura entre as regiões da mesa de aquecimento. 3.2 Desenvolvimento do método referência – LC-MS/MS O método de referência utilizado para comparação dos resultados com aquele proposto via celular foi o espectrométrico. Não foi possível utilizar um espectrofotômetro como técnica comparativa, uma vez que ao ressuspender o resíduo avermelhado para análise em cubeta, este perdeu coloração e tal técnica foi incapaz de gerar resposta analítica. A cafeína foi avaliada em concentração de 1,00 mg L-1. A massa molar da cafeína é 194,19 g mol-1 sendo possível avaliar o consumo desse analito a partir dos íons com relação m/z 195 ([M+H]+) para análises em modo positivo e m/z 193 ([M-H]-) em modo negativo de ionização. As análises em modo negativo não apresentaram sinais. A cafeína foi analisada usando LC-MS/MS, o íon m/z 195, referente a molécula de cafeína ionizada no modo positivo, foi detectado no tempo de retenção (tR) de 4,67 minutos (como ilustrado na Figura 6). As amostras obtidas em placa de porcelana após a reação colorimétrica foram submetidas ao experimento de varredura de íons para a verificação de cafeína remanescente e possíveis produtos. Os cromatogramas obtidos para a amostra padrão de cafeína bem como para a amostra pós reação são apresentados de maneira comparativa pela Figura 6. 43 (a) (b) Figura 6 – Cromatograma de íons totais (TIC): (a) referente ao padráao de cafeína (1,00 mg L-1) seguido do seu respectivo cromatograma de íon extraído (XIC) de m/z 195 e espectro de massas com tempo de retenção de 4,67 minutos da cafeína padrão e (b) TIC e XIC do produto avermelhado obtido pela reação entre a cafeína e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %). Fonte: autor, 2018 (Analyst) Software versão 1.4 (® 2018 Analyst). Esse procedimento de análise permitiu avaliar se a reação ocorreu de maneira efetiva sob as condições propostas, pois nenhuma banda cromatográfica referente a m/z 195 foi detectada em 4,67 minutos para a amostra pós reação. O mapeamento dos íons dos possíveis produtos formados também pôde ser avaliado. O XIC da amostra reacional Figura 6 (b), não apresentou nenhuma banda referente a relação m/z 195 no tempo de retenção de 4,67 minutos, o que indica que a cafeína foi totalmente consumida na reação. Os íons presentes na faixa de 120 a 920 Da foram adquiridos gerando espectros de massas de cada banda cromatográfica. Os íons que geraram bandas cromatográficas de maior intensidade nos experimentos de XIC foram selecionados 44 como possíveis produtos da reação. A Figura 7 ilustra os principais íons selecionados para o estudo, m/z 241 e 324. (a) (b) Figura 7 – (a) cromatograma de íon extraído (XIC) de m/z 241 seguido do respectivo espectro de massas com tempo de retenção de 4,15 minutos e (b) XIC de m/z 324 e respectivo espectro de massas com tempo de retenção de 4,74 minutos. Fonte: autor, (Analyst) Software versão 1.4 (® 2018 Analyst). O íons de m/z 241 e 324 foram observados nas amostras submetida à reação, porém não foram observados no padrão de cafeína e muito menos no branco (reagentes na ausência da cafeína), indicando que tais íons são provenientes da reação entre reagentes e cafeína e não um interferente. Observou- se ainda a presença do íon m/z 481, que pode ser um íon precursor de m/z 241, ou um dímero, pois ambos os íons quando extraídos apresentam o mesmo tempo de retenção. Experimentos de íons fragmentos foram realizados para os novos íons encontrados e os espectros de massas de íons fragmentos para cada um dos íons selecionados foi obtido, Figura 8. O comportamento de fragmentação desses íons foi avaliado usando de experimentos de íons fragmentos com diferentes energias de colisão (CE), para proporcionar informações para o desenvolvimento do método de monitoramento de reações selecionadas (SRM). Os experimentos de SRM conferem sensibilidade e seletividade para análises de diversos compostos simultâneos de maneira inequívoca, com confiabilidade analítica. 45 (a) (b) (c) Figura 8 – Espectros de massas dos íons fragmentos de m/z (a) 324, (b) 241 e (c) 481. Fonte: autor, (Analyst) Software versão 1.4 (® 2018 Analyst). Como esperado, pôde-se comprovar que o íon m/z 481 é um precursor do íon de m/z 241, já que m/z 241 é um íon fragmento do íon m/z 481, sendo que ambos os íons referem-se ao mesmo composto com tempo de retenção de 4,15 minutos. A Tabela 3 resume as informações dos íons precursor e fragmentos obtidos para os possíveis produtos encontrados após reação e para o padrão de cafeína, por LC-MS/MS. 46 Tabela 3 – Massa molar, íon precursor e íons fragmentos referentes à cafeína e aos produtos 1 e 2 obtidos na reação colorimétrica monitorados por LC-MS/MS. Compostos Massa Molar (Da) Íon Precursor (m/z) Íons fragmentos (m/z) Cafeína 194 195 138, 110, 83 Produto 1 480 481 241, 198, 170 Produto 2 323 324 267, 182, 125 Fonte: autor, 2018. A partir dos espectros de íons fragmentos foi desenvolvido um método no modo SRM para verificar a presença desses produtos nos demais experimentos realizados (como apresentado na Tabela 2, seção 2.3.4). O padrão de cafeína foi analisado por experimento de SRM, para a varredura das transições referentes à cafeína (3 transições), Figura 9. Figura 9 – Cromatograma de íons totais (TIC) para experimentos de monitoramento de reação selecionada (SRM) para padrão de cafeína, com varredura das transições de transições 195>138, 195>110 e 195>83. Fonte: autor, (Analyst) Software versão 1.4 (® 2018 Analyst). O tempo de retenção obtido em 4,69 é característico da cafeína nas condições determinadas pelo método de análise proposto. As amostras obtidas após a reação também foram analisadas no modo SRM, sendo observados produto 1 (3 transições) e do produto 2 (2 transições), como apresentado a Figura 10. 47 Figura 10 – Cromatograma de íons totais (TIC) para experimentos de monitoramento de reação selecionada (SRM) para o produto avermelhado obtido pela reação entre a cafeína e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %). Fonte: autor, (Analyst) Software versão 1.4 (® 2018 Analyst). O sinal obtido para o tempo de retenção de 4,14 minutos é referente as transições do produto 1 (481>241, 241>198 e 241>170). O produto 2 apresentou resposta analítica para as transições 324>182 e 324>125 com tempo de retenção em 4,72 minutos. As transições da cafeína 195>138, 195>110 e 195>83 não apresentaram sinal analítico no cromatograma, uma vez que reagiu completamente, de modo que nenhuma banda cromatográfica foi observada. A Figura 11 apresenta a relação da área obtida em função da concentração de cafeína para o produto 1. Figura 11 – Curva analítica obtida para o produto 1 da reação entre a cafeína e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %), por LC-MS/MS. Fonte: autor, 2018. 48 A Equação 1 mostra que o ajuste dos pontos dessa curva é melhor representado por uma equação polinomial do 4° grau, com coeficiente de determinacao (R2) de 0,908 indicando possível ajuste dos valores obtidos ao método proposto. Equação 1 y = 1,00 x 10-4x4 – 8,31 x 10-2x3 + 16,172 x 10-1x2 – 659,8x + 4,56 x 10-3 A curva analítica obtida para o produto 1 é descrita por uma distribuição Gaussina, onde o número de espécies apresenta queda após determinado tempo de reação. O perfil obtido sugere que a formação desse produto não está relacionada de forma direta com a concentração de cafeína, mas sim com uma possível reação paralela. Talvez o produto 2 só seja formado depois que uma quantidade razoável do produto 1 já tenha sido formada para então deslocar o equilíbrio químico para a formação do produto 2. O estudo dos parâmetros cinéticos da reação e a eficiência da reação proposta em reagir cafeína presente em amotras de composição complexa, sob as condições experimentais previamente estabelecidas, devem ser realizados com o objetivo de conhecer melhor seu mecanismo. Experimentos mais aprimorados de espectrometria de massas e até mesmo o isolamento desses produtos devem ser realizados para uma proposta mais conclusiva sobre a reação. De maneira análoga, a relação da área obtida por cada banda cromatográfica em função da concentração de cafeína foi obtida para avaliar o perfil de formação do produto 2, Figura 12. 49 Figura 12 – Curva analítica obtida para o produto 2 da reação entre a cafeína e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %), por LC-MS/MS. Fonte: autor,2018. A Equação 2 descreve a relação de linearidade para o produto 2 com R2 de 0,978. Equação 2 y = 6,0 x 10-3x - 8,35 x 10-4 O produto 2 apresentou uma relação linear e inversa com a concentração de cafeína inicialmente presente na amostra. A medida que a cafeína é consumida durante a reação, o produto 2 é formado e sua concentração aumenta com o passar do tempo. As amostras obtidas após a reação ocorrer em placa de porcelana foram analisadas para os spots nomeados de A a F, como ilustrado na Figura 13. Figura 13 – Representação esquemática da disposição dos spot-tests na placa de porcelana. Fonte: autor, 2018. 50 Embora a placa de porcelana tenha sido disposta sobre a região central da mesa de aquecimento foi possível observar que a evaporação dos reagentes não ocorreu de maneira uniforme por toda sua extensão. O efeito da variação de temperatura sobre o andamento da reação foi significativo e as concentrações dos produtos 1 e 2 obtidas em cada spot apresentaram variação. O monitoramento da presença de cafeína bem como dos produtos 1 e 2 foram fundamentais para que os experimentos fossem realizados de maneira mais seletiva e sensível permitindo a verificação do consumo de cafeína e da formação desses produtos também nas amostras de bebida energética, medicamentos e esgoto. 3.2.1 Validação do método referência – LC-MS/MS A curva analítica do método de referência foi obtida para concentrações de cafeína entre 3,33 e 333 mg L-1 em água ultrapura, Figura 14. Figura 14 – Curva analítica da área da banda de cafeína em função da concentração de cafeína entre 3,33 e 333 mg L-1, por LC-MS/MS. Fonte: autor, 2018. A Equação 3 descreve a linearidade obtida com R2 de 0,979. Equação 3 y = 7,25 x 10-4x + 5,26 x 10-5 51 As figuras de mérito obtidas para o método de referência são apresentadas na Tabela 4. Tabela 4 – Figuras de mérito obtidas para a cafeína em água ultrapura, por LC-MS/MS. Parâmetros analíticos Valores obtidos Faixa linear (mg L-1) 3,33 – 333 LOQ (mg L-1) 3,33 LOD (mg L-1) 1,00 DPR intradia (%) 0,750 – 22,3 Sensibilidade 7,25 x 10-4 Coeficiente linear 5,26 x 10-5 R2 0,979 Tempo de análise (minutos) 14,0 Fonte: autor, 2018 O método de referência teve precisão intradia avaliada a partir do desvio padrão relativo (DPR) de 0,750 a 22,3 %. Esse valor pode ser justificado pela limitação experimental da reação proposta com relação a variação de temperatura da mesa de aquecimento, em que concentrações variadas dos produtos 1 e 2 são formadas. O LOQ do método analítico desenvolvido foi obtido em 3,33 mg L-1 baseado na percepção da resposta colorimétrica obtida após a reação. Embora a técnica espectrométrica seja sensível o suficiente para detectar valores abaixo de 3,33 mg L- 1, valores menores de concentração não forneceram resposta colorimétrica precisas e exatas após a reação em placa de porcelana. O LOD foi de 1,00 mg L-1. Os valores obtidos mostraram ajuste ao método segundo a tratamento da tabela ANOVA com R2 0,98 para o método de referência proposto. O tratamento estatístico dos dados obtidos permitiu avaliar os métodos segundo a variância do grupo de dados considerado através do Teste F com F experimental (0,229) menor que o valor de F tabelado (2,45). O modelo utilizado foi considerado confiável para previsões e sem falta de ajuste. 52 3.3 Desenvolvimento do método de estudo – Dispositivo colorimétrico (DC) Os dados de intensidade de sinal (I) obtidos a partir da etapa de tratamento de imagens foram convertidos em densidade óptica (D.O.). A densidade óptica (D.O.) foi calculada para cada valor de concentração de cafeína pela relação negativa do logaritmo da razão entre o valor médio das triplicatas referentes a intensidade de sinal (I) e a intensidade de sinal do branco analítico (I0), Equação 4. Equação 4 D.O. = -log (I/I0) Os valores obtidos foram relacionados com a concentração de cafeína de 100 a 500 mg L-1 em água, Figura 15. Figura 15 – Curva analítica da densidade óptica (D.O.) em função da concentração de cafeína entre 100 e 500 mg L-1, em água ultrapura, por celular. Fonte: autor, 2018. A relação apresentou linearidade com R2 0,945 como descrito pela Equação 5. Equação 5 y = 1,00 x 10-4 x + 3,00 x 10-4 53 A Tabela 5 apresenta os parâmetros analíticos obtidos a partir do método desenvolvido no dispositivo colorimétrico. Tabela 5 – Figuras de mérito obtidas para a cafeína em água ultrapura, pelo método desenvolvido em dispositivo colorimétrico (DC), por celular. Parâmetros analíticos Valores obtidos Faixa linear (mg L-1) 100 – 500 LOQ (mg L-1) 100 LOD (mg L-1) 30,0 DPR intradia (%) 0,0800 – 0,760 Sensibilidade 1,00 x 10-4 Coeficiente linear 3,00 x 10-4 R2 0,945 Tempo de análise (minutos) 20,0 Fonte: autor, 2018. O método proposto para dispositivo teve o valor de LOQ determinado em 100 mg L-1 por ser o menor valor de concentração de cafeína que se obteve resposta colorimétrica após a reação ocorrer com variação de intensidade de sinal significativa com relação ao branco analítico. A partir desse valor, o LOD foi de 30,0 mg L-1. A precisão intradia obtida foi menor do que 1,00 %. O método proposto para cafeína em água no dispositivo colorimétrico apresentou ajuste de valores com R2 igual 0,945 sendo o modelo confiável para previsões e sem falta de ajuste, segundo ANOVA. A variância do grupo de dados considerado através do Teste F com F experimental (0,209) menor que o valor de F tabelado (2,45). 3.4 Comparação entre o método de LC-MS/MS e o dispositivo colorimétrico (DF) proposto. As figuras de mérito obtidas para ambos os métodos permitiram comparar os parâmetros de LOQ, LOD, precisão, sensibilidade, o tempo e o custo estimado de análise Tabela 6. 54 Tabela 6 – Figuras de mérito obtidas para a cafeína em água ultrapura pelos métodos desenvolvidos em LC-MS/MS e dispositivo colorimétrico (DC). Parâmetros analíticos LC-MS/MS DC Faixa linear (mg L-1) 3,33 – 333 100 – 500 LOQ (mg L-1) 3,33 100 LOD (mg L-1) 1,00 30,0 DPR intradia (%) 0,750 – 22,3 0,0800 – 0,760 Sensibilidade 7,25 x 10-4 1,00 x 10-4 Coeficiente linear 5,26 x 10-5 3,00 x 10-4 R2 0,979 0,945 Tempo de análise (minutos) 14,0 20,0 Fonte: autor, 2018. O método proposto em dispositivo colorimétrico apresentou valores de LOQ e LOD com variação significativa dos obtidos pelo método de referência. A resposta analítica colorimétrica obtida após a reação ocorrer permitiu observar coloração avermelhada no spot para concentração de cafeína a partir de em 3,00 mg L-1, visível ao olho humano. Esse produto, porém, apresentou coloração pouco intensa para avaliação visual e para o sistema óptico de detecção do celular, de modo a não fornecer variação de intensidade de sinal significativa com relação ao branco analítico. O dispositivo não conta com sistema óptico refinado, sendo a câmera do celular a principal ferramenta óptica que o compõe. Assim, enquanto o LOQ obtido para o método desenvolvido em LC-MS/MS foi considerado 3,33 mg L-1 e o LOD 1,00 mg L-1, o dispositivo apresentou LOQ 100 mg L-1 e LOD 30,0 mg L-1. A faixa de trabalho do dispositivo apresentou linearidade para valores de concentração de 100 a 500 mg L-1 do analito. Considerando os trabalhos de Soni e colaboradores, e ainda de Soare e colaboradores, o presente estudo apresentauma faixa de concentração relativamente ampla e confere vantagem ao método aqui proposto, uma vez que estudos envolvendo aquisição de imagem, apresentam perda de linearidade, ou seja, faixas lineares estreitas em virtude da limitação de apresentar um sistema óptico simplificado36, 37. A precisão dos métodos foi avaliada pela estimativa do desvio padrão relativo (DPR) e os valores obtidos para medidas intradia do LC-MS/MS foram próximos a 20 % enquanto que para o dispositivo proposto foi menor a 1,00 %. Análises por LC- MS/MS de cada spot-test mostraram que os produtos formados apresentaram 55 intensidade de coloração proporcional a concentração de cafeína consumida na reação. Ambos os métodos apresentaram R2 maior a 0,945 indicando possível ajuste dos dados obtidos aos respectivos modelos propostos. O tratamento estatístico, ANOVA, realizado para ambos os métodos mostrou que os modelos utilizados foram considerados confiáveis para previsões e sem falta de ajuste. Além dos parâmetros mensuráveis obtidos a partir da validação dos métodos analíticos desenvolvidos foi possível avaliar as vantagens e limitações de cada técnica utilizada. A Tabela 7 apresenta fatores que abrangem a portabilidade da técnica, os princípios da Química Verde e ainda o custo financeiro das análises. O maior número de sinais positivos (+) implica em maior vantagem, sendo 1 positivo o conceito mínimo e 4 o máximo da escala. Tabela 7 – Comparação das vantagens e limitações das técnicas de análise por LC-MS/MS e o dispositivo colorimétrico (DC), segundo parâmetros de consumo de amostra, consumo de solvente orgânico, resíduos, efeito de matriz,preparo de amostra, tempo de análise, portabilidade e custo estimado do equipamento / dispositivo. Parâmetros LC-MS/MS DC Consumo de amostra ++++ + Consumo de solvente orgânico + ++++ Resíduos + ++++ Efeito de matriz + ++++ Preparo de amostra + +++ Tempo de análise + ++++ Custo estimado da análise + ++++ Portabilidade + ++ Custo estimado do equipamento / dispositivo + ++++ Fonte: autor, 2018. O método miniaturizado conta com toda a quantidade de amostra gerada pela reação, em placa de porcelana, para obtenção do valor númerico do sinal analítico. Essa quantidade poderia ter sua escala reduzida ainda mais, e ainda assim detectada pelo método proposto, porém há uma limitação para captação do sinal. O 56 LC-MS/MS apresenta vantagem a essa limitação experimental, uma vez que mesmo que a coloração não seja perceptível ao olho humano, o detector dessa técnica é capaz de detectar até a ordem de nanogramas de concentração de analito e não baseada na intensidade de cor obtida pela reação. O consumo de solvente orgânico necessário para realizar a análise no LC- MS/MS é significativo por manter fluxo durante os 14,0 minutos de análise da amostra. O dispositivo dispensa essa etapa por contar com análise do resíduo avermelhado da reação no próprio spot e ainda sem necessidade de solubilização para tal. A geração de resíduos é proporcional ao volume de solvente gasto na etapa de análise, sendo uma vantagem para o dispositivo proposto tanto do ponto de vista da Química Verde quanto financeiro. O efeito de matriz e a etapa de preparo de amostras foram fundamentais para realizar as análises e em geral, é uma limitação dessa técnica de referência. O dispositivo mostrou-se tão sensível ao efeito de matriz quanto a técnica de referência sendo possível realizar análises de amostras em matrizes complexas sem comprometer ou interferir na resposta analítica de maneira significativa. A técnica de LC-MS/MS é bastante dependente da etapa prévia de preparo de amostras para garantir que os possíveis interferentes presentes na matriz sejam eliminados. Já o dispositivo proposto é capaz de realizar análises de maneira menos cautelosa, sendo sua principal limitação amostras que já apresentam coloração antes de serem submetidas a reação. Essas necessitam de etapas prévias de tratamento e estratégias para aquisição da imagem. O tempo de análise foi considerado como aquele necessário para adquirir informações sobre a amostra, para posterior interpretação desta. No LC-MS/MS esse tempo foi de 14,0 minutos, enquanto que para o método portátil é de alguns segundos até que a amostra seja fotografada. Considerando o gasto de solvente, energia elétrica por tempo de trabalho do equipamento, gás e o custo de um profissional qualificado, no caso do LC-MS/MS, para realizar uma análise de 14,0 minutos todos os itens supracitados são fundamentais. O dispositivo proposto dispensa o uso de solventes e de um profissional qualificado, sendo uma técnica acessível. O tempo de análise é de segundos até que a imagem seja adquirida ocorre usando celular, um equipamento eletrônico de uso comum por toda a população, com gasto reduzido de energia elétrica. 57 Embora etapa de aquecimento da reação seja uma limitação experimental para a portabilidade de ambos os métodos, a portabilidade do LC-MS/MS é pouco viável. Em contra partida, otimizações em um dispositivo miniaturizado podem ser promissoras para a etapa de aquecimento, possibilitando que todo o sistema seja portátil. As etapas desenvolvidas até o presente momento não conferem total portabilidade ao dispositivo proposto. O equipamento de LC-MS/MS utilizado para análises de referência nesse estudo foi estimado em R$ 250.000,00, sendo pouco viável financeiramente sua aquisição. Em contra partida, o dispositivo colorimétrico proposto apresenta custo de fabricação estimado em R$ 5,00. Esse valor não contabiliza o custo do aparelho celular, por ser uma tecnologia já bastante disseminada, atualmente. A validação e a comparação feita entre as técnicas utilizadas foram baseadas em resultados obtidos para a cafeína em água ultrapura. Os métodos foram desenvolvidos e otimizados sendo possível avaliar a aplicabilidade deles em amostras contendo cafeína em sua composição. 3.5 Aplicação dos métodos desenvolvidos pra reação colorimétrica em amostras de energético, esgoto e medicamentos. 3.5.1 Amostra de energético A amostra de energético foi submetida a reação nas condições descritas na seção 2.2, mas apresentou coloração preta após a reação inviabilizando a análise do resíduo. A complexidade da matriz dada pela presença de açúcares pode justificar tal comportamento, inviabilizando a análise da amostra bruta. A amostra foi então diluída para 1,00 mg L-1 em água ultrapura e a reação foi repetida resultando no resíduo avermelhado esperado, com coloração pouco intensa. Após essa etapa comum aos métodos de referência e proposto, o resíduo foi solubilizado em 300 µL de MeOH e analisado com o método desenvolvido em LC-MS/MS. O branco, amostra de energético com os reagentes substituídos por água ultrapura também foi submetido as condições de reação e analisados. A Figura 16 apresenta os 58 cromatogramas de íons totais no modo SRM para (a) amostra do branco de energético e para amostra do produto de reação com esse. (a) (b) Figura 16 – Cromatograma de íons totais (TIC) para experimentos de monitoramento de reação selecionada (SRM) para (a) amostra do branco de energético e (b) para amostra do produto avermelhado obtido pela reação entre a cafeína (contida na amostra de energético) e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %). Fonte: autor, (Analyst) Software versão 1.4 (® 2018 Analyst). O TIC da amostra do branco do energético apresentou sinal em tempo de retenção de 4,68 minutos, como previamente atribuído a presença de cafeína na amostra. A amostra de energético não apresentou cafeína em sua composição após a reação ocorrer, mas sim a presença do íon m/z 324 como único produto de reação no tempo de retenção de 4,70 minutos (banda referente as transições do produto 2). A reação foi realizada em triplicata com valor de concentração obtido pelo método de referência de 0,720 mg L-1, sendo inferior ao LOQ de 3,33 mg L-1 considerado para o método inicialmente proposto. A determinação de cafeína em amostra de energético foi feita por LC-MS/MS nas condições previamente propostas, mas mostrou-se inviável por falta de confiabilidade no modelo proposto, pois concentração encontrada pelo equipamento 59 para amostra diluída à 0,190 mg L-1 de cafeína estava abaixo da faixa linear inicialmente proposta pelo método desenvolvido para cafeína em água, isto é, de 3,33 a 333 mg L-1 de cafeína. Por esse motivo, a amostra de energético teve de ser fortificada para se adequar as condições do método previamente proposto. 3.5.2 Amostra de medicamentos O método desenvolvido foi aplicado às amostras de medicamentos 1 e 2. A reação ocorreu a partir de soluções independentes de cada medicamento em concentrações de 300 mg L-1. Após a reação, o resíduo avermelhado também pôde ser observado, sendo solubilizado em 300 µL de MeOH e analisado com o método desenvolvido em LC-MS/MS. O branco, amostra de cada medicamento com os reagentes substituídos por água ultrapura, também foram submetidos as condições análogas e foram analisados. A Figura 17 apresenta o TIC no modo SRM para as amostras do branco e da amostra do medicamento 1 após a reação. (a) (b) Figura 17 – Cromatograma de íons totais (TIC) para experimentos de monitoramento de reação selecionada (SRM) para (a) amostra do branco de medicamento 1 e (b) para amostra do produto avermelhado obtido pela reação entre a cafeína (contida nas amostra de medicamento 1) e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %). Fonte: autor, (Analyst) Software versão 1.4 (® 2018 Analyst). 60 O TIC referente ao branco do medicamento 1 apresentou uma banda cromatográfica em 4,67 minutos (referente as transições da cafeína), indicando presença de cafeína na amostra. A amostra do produto de reação desse mesmo medicamento não apresentou cafeína em sua composição, mas sim a presença dos produtos 1 e 2, caracterizados pelas bandas em 4,13 minutos e 4,74 minutos, respectivamente. De maneira análoga, as amostras do medicamento 2 foram analisadas e os dados obtidos são apresentados pela Figura 18. (a) (b) Figura 18 – Cromatograma de íons totais (TIC) para experimentos de monitoramento de reação selecionada (SRM) para (a) amostra do branco de medicamento 2 e (b) para amostra do produto avermelhado obtido pela reação entre a cafeína (contida na amostra de medicamento 2) e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %). Fonte: autor, (Analyst) Software versão 1.4 (® 2018 Analyst). O TIC do branco do medicamento 2 apresentou uma banda cromatográfica em 4,67 minutos, referente a presença de cafeína. A amostra do produto de reação desse mesmo medicamento não apresentou cafeína em sua composição, sendo esta totalmente consumida. A presença das bandas em 4,12 e 4,72 minutos referentes aos produtos 1 e 2, respectivamente, foram observadas. A reação ocorreu de maneira efetiva e para concentração de 300 mg L -1 de cada medicamento. Os valores médios de concentração obtidos pelo LC-MS/MS 61 para os brancos analíticos desses compostos foram de 188,43 mg L-1 para o medicamento 1 e de 254,13 para o medicamento 2. O excipientes presentes nos comprimidos, bem como seus respectivos ativos podem reagir com os reagentes (KBrO3 e HCl 37 %), reduzindo a presença do produto monitorado por LC-MS/MS. A variação que ocorreu no aquecimento foi um limitante principalmente ao aplicar o método em amostras com composição complexa. Apesar disso, a determinação de cafeína em amostra de medicamentos por LC-MS/MS nas condições previamente propostas mostrou confiabilidade no modelo proposto para faixa linear de trabalho de 3,33 a 333 mg L-1. 3.5.3 Amostra de esgoto O método desenvolvido foi aplicado em amostra de esgoto contendo cafeína. Após a reação, o resíduo avermelhado também pôde ser observado, sendo solubilizado em 300 µL de MeOH e analisado com o método desenvolvido em LC- MS/MS. O branco, amostra do esgoto com os reagentes substituídos por água ultrapura, também foram submetidos as condições análogas. Os TIC no modo SRM para amostra do branco de esgoto e para amostra do esgoto após a reação encontram-se apresentados na Figura 19. 62 (a) (b) Figura 19 – Cromatograma de íons totais (TIC) para experimentos de monitoramento de reação selecionada (SRM) para (a) amostra do branco de esgoto e (b) para amostra do produto avermelhado obtido pela reação entre a cafeína (contida na amostra de esgoto) e KBrO3 em meio ácido (HCl 37 %). Fonte: autor, (Analyst) Software versão 1.4 (® 2018 Analyst). O cromatograma de íons totais referente ao branco da amostra de esgoto apresentou banda cromatográfica em 4,68 minutos, indicando presença de cafeína na amostra, uma vez que a banda em questão trata-se das transições da cafeína. A amostra do esgoto após a reação indicou ausência de cafeína, e uma banda em 4,77 minutos referente ao produto 2. A concentração de cafeína no esgoto bruto é desconhecida, mas análises do branco analítico da amostra por LC-MS/MS apresentaram valor médio de 4,83 mg L -1 do analito. Assim, a determinação de cafeína em amostra de esgoto por LC-MS/MS nas condições previamente propostas mostrou confiabilidade no modelo proposto para faixa linear de trabalho considerada. 63 3.5.4 Comparação entre os resultados obtidos para amostras de energético, esgoto e medicamentos. A partir da curva analítica da D.O. da cafeína em água ultrapura, secção 3.3, foi possível otimizar as condições de análise para aplicar o método de estudo proposto às amostras de energético, medicamentos e esgoto obtendo curvas analíticas referentes cada amostra e avaliar as figuras de mérito do método utilizado. As soluções diluídas de cada amostra foram preparada em 1,00 mg L-1 de cafeína, e fortificadas com solução de cafeína para obtenção das respectivas curvas analíticas no dispositivo para uma faixa linear de 100 a 500 mg L -1. O medicamento 1 também foi avaliado para tal faixa de concentração, mas apresentou linearidade entre 100 a 300 mg L-1. A Figura 20 apresenta as curvas analíticas da D.O. obtidas para presença de cafeína em tais amostras pelo método de estudo a partir do dispositvo proposto. Figura 20 – Curvas analíticas da D.O. em função da concentração de cafeína para método colorimétrico em amostras de (a) energético entre 100 a 500 mg L-1, (b) esgoto entre 100 a 500 mg L-1, (c) medicamento 1 entre 100 a 300 mg L-1 e (d) medicamento 2 entre 100 a 500 mg L-1, por celular. Fonte: autor, 2018. Os dados