Juliana Akinaga “Investigação da dessensibilização e internalização de adrenoceptores �1A nativos e recombinantes” Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências de Botucatu – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração Farmacologia Orientador: Prof. Dr. André Sampaio Pupo 2008 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus Akinaga, Juliana. Investigação da dessensibilização e internalização de adrenoceptores � 1A nativos e recombinantes / Juliana Akinaga. – Botucatu : [s.n.], 2008. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Botucatu, 2008. Orientador: André Sampaio Pupo Assunto CAPES: 21000000 1. Farmacologia CDD 615.1 Palavras-chave: Adrenoceptores � 1; Dessensibilização; Feniletilaminas; Imidazolinas; Internalização; Taquifilaxia Dedicatória Dedicatória Aos meus pais, Jorge e Angélica, pela minha existência, por acompanharem meus passos e por torcerem pelo meu sucesso eu dedico esse trabalho. Agradecimentos Agradecimentos À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelo auxílio financeiro na forma de bolsa de estudo (processo nº 05/57569-9) Agradecimentos Ao mestre, prof. Dr. André Sampaio Pupo, pelos ensinamentos ao longo desses anos. Obrigado por me ajudar a realizar um sonho. Ao meu namorado Cristiano, por esses muitos anos juntos, pela força e incentivo durante todo esse meu caminho. Aos meus irmãos Bruno e Rafael e à minha cunhada Rúbia, muito obrigado pelos momentos caseiros, quando voltar pra casa fica melhor. A todos meus tios, tias e primos, que são muitos, seria injusto lembrar de uns e esquecer de outros quando todos são importantes. Aos meus avós Takeo e Hirono Takata, Shitsue Akinaga por serem exemplos de vida e ao meu avô Kiyoshi Akinaga (in memorian), por me olhar sempre lá de cima. Aos amigos, mais do que companheiros de laboratório, Vanessa, Fernanda, Luiz Ricardo, Ênio e Andrea pela jornada do dia-a-dia e pelos momentos de descontração. Aos amigos de graduação, pós graduação e do Departamento de Farmacologia pelos muitos momentos ao longo desses anos. Ao Dr Chris Hague por nos ceder os vetores dos �1-ARs conjugados com GFP. À profª Drª Maria de Fátima Lázari por nos ceder as células HEK293. Ao prof. Dr Ivan Maia e seus orientados do Departamento de Genética pelo auxílio na amplificação dos vetores. À profª Drª Soraya Smaili, Drª Hanako Hirata e Rodrigo Ureshino, da UNIFESP pelo suporte na Microscopia Confocal. Aos funcionários do departamento, Cris, Luiz, Paulo e Janete, sem vocês a gente não conseguiria. Agradecimentos Aos funcionários da sessão de pós-graduação Sérgio, Luciene, Maria Helena e Herivaldo pela atenção e pelas dicas quando a gente precisa. Sumário Resumo ....................................................................................................................... 2 Abstract ....................................................................................................................... 4 Introdução ................................................................................................................... 6 Adrenoceptores �1 (�1-ARs) .................................................................................... 6 Dessensibilização e Taquifilaxia .............................................................................. 8 Dessensibilização e Internalização induzidas por agonistas e vias de sinalização . 9 Linhas gerais sobre a presente pesquisa .............................................................. 12 Objetivos ................................................................................................................... 13 Material e Métodos .................................................................................................... 14 Estudos de contração ............................................................................................ 14 Avaliação de parâmetros de contração em curvas concentração-resposta consecutivas .......................................................................................................... 14 Investigação da taquifilaxia cruzada e determinação da menor concentração taquifilática ............................................................................................................. 15 Determinação da duração da taquifilaxia ............................................................... 15 Estudos de inibição da taquifilaxia ......................................................................... 16 Cultura de células e transfecção ............................................................................ 16 Purificação do plasmídeo em larga escala ............................................................ 17 Microscopia confocal ............................................................................................. 18 Análise estatística .................................................................................................. 18 Resultados ................................................................................................................ 20 Parâmetros de contração em curvas concentração-resposta consecutivas .......... 20 Taquifilaxia cruzada e determinação da menor concentração taquifilática ............ 26 Determinação do tempo de taquifilaxia cruzada .................................................... 29 Inibição da taquifilaxia cruzada pelo prazosin ........................................................ 32 Internalização de �1A-ARs conjugados com GFP .................................................. 34 Discussão .................................................................................................................. 36 Conclusões ................................................................................................................ 40 Referências Bibliográficas ......................................................................................... 41 Artigo Publicado ........................................................................................................ 48 � � Resumo Resumo Resumo Os �1-ARs são membros da superfamília de receptores acoplados à proteína G (GPCR), podendo ser divididos em três diferentes subtipos (�1A-, �1B- e �1D-ARs), sendo todos semelhantemente ativados pela noradrenalina e adrenalina. Os agonistas seletivos de �1-ARs podem ser classificados em duas classes químicas, as feniletilaminas e as imidazolinas e são utilizados, por exemplo, para tratamento de hipotensão e também como descongestionantes nasais. O presente estudo investigou a capacidade dos agonistas de �1-ARs induzirem taquifilaxia nas contrações do ducto deferente de rato e internalização de �1A-ARs conjugados com proteína fluorescente verde (GFP) expressos em células HEK293. Os resultados mostram que dentre todos os agonistas testados da classe das feniletilaminas (noradrenalina, metoxamina e fenilefrina) e imidazolinas (A61603, nafazolina e oximetazolina) apenas a oximetazolina foi capaz de induzir taquifilaxia em curvas concentração-resposta consecutivas próprias e também em curvas concentração- resposta de noradrenalina feitas em preparações de ducto deferente de rato. A taquifilaxia induzida pela oximetazolina é dependente da ativação de �1A-ARs, uma vez que a incubação concomitante da oximetazolina com o antagonista seletivo de �1-ARs, o prazosin, inibiu a taquifilaxia. Estudos feitos com microscopia confocal utilizando �1A-ARs conjugados com GFP mostram que a oximetazolina é capaz de induzir um aumento da fluorescência intracelular já nos primeiros 5 minutos de incubação enquanto que a noradrenalina não é capaz de induzir aumento do mesmo parâmetro mesmo após 30 minutos de incubação. Esse aumento da fluorescência intracelular é um indicativo do processo de internalização dos �1A-ARs conjugados com GFP induzido pela oximetazolina mas não pela noradrenalina e pode estar 2 Resumo 3 relacionado com a taquifilaxia observada nos experimentos funcionais. Entretanto, estudos adicionais mais profundos devem ser feitos para melhor compreensão dos mecanismos de dessensibilização e internalização induzidos pela oximetazolina no presente estudo. Abstract Abstract Abstract The �1-ARs are G-protein coupled receptors (GPCR) composed by three subtypes (�1A-, �1B- e �1D-ARs), similarly activated by epinephrine an norepinephrine. The selective agonists of �1-ARs can be classified into two different chemical classes, the phenylethylamines and imidazolines, which are used for treatment of hypertension and as nasal decongestants. The present study investigated the ability of some �1-ARs agonists to induce tachyphylaxis in the contractions of rat vas deferens and internalization of the �1A-ARs tagget with green fluorescent protein (GFP) expressed in HEK293 cells. It was observed in the rat vas deferens that, among all agonists tested (the phenylethylamines norepinephrine, metoxamine, phenylephrine and imidazolines A61603, naphazoline and oxymetazoline), only oxymetazoline can induce tachyphylaxis in consecutive concentration-response curves and also in concentration-response curves to norepinephrine. The tachyphylaxis induced by oxymetazoline is dependent on �1-ARs activation, since it was inhibited in presence of prazosin, a �1-ARs selective antagonist. Confocal microscopy studies of HEK 293 cells expressing �1A-ARs tagget with GFP show that oxymetazoline can induce prompt and time-dependent increase in intracellular fluorescence already after 5 minutes of incubation, whereas norepinheprine was unable to increase intracellular fluorescence even after 30 minutes of incubation. This increase in intracellular fluorescence indicates that oxymetazoline, but not norepinephrine, induces internalization of the �1A-ARs tagget with the GFP. The internalization of �1A-ARs tagget with the GFP induced by oxymetazoline may be related to the tachyphylaxis observed in funtional experiments. However, other 4 Abstract 5 studies are necessary to understand the mechanisms of tachyphylaxis and internalization induced by oxymetazoline in the present study. Introdução Introdução Introdução Adrenoceptores �1 (�1-ARs) Os �1-ARs são receptores farmacológicos pertencentes à família dos receptores acoplados à proteína G (G-protein coupled receptors; GPCRs), uma superfamília de receptores que possui como característica prinicipal a conformação estrutural disposta em 7 domínios transmembrana, a porção amino-terminal (N- terminal) extracelular e a porção carboxi-terminal (C-terminal) intracelular de tamanhos variados. Todos os componentes da família dos GPCRs interagem com proteínas G (proteína heterotrimérica composta por 3 subunidades: �, � e �), ativando cascatas bioquímicas intracelulares que culminam em suas respostas funcionais. Através da interação com a proteína G, os �1-ARs são responsáveis por respostas fisiológicas importantes como contração de musculatura lisa vascular e não vascular, diferenciação e divisão celular, entre outros (Zhong & Minneman, 1999). Os �1-ARs podem ser divididos em três diferentes subtipos: �1A-, �1B- e �1D- ARs (para revisão ver (Hieble et al., 1995)), codificados por diferentes genes (em humanos localizados nos cromossomos 8, 5 e 20 respectivamente (Schwinn et al., 1990; Yang-Feng et al., 1990; Yang-Feng et al., 1994)), sendo todos semelhantemente ativados pela adrenalina e pela noradrenalina. Os subtipos de �1-ARs são co-expressados em vários tecidos podendo haver a predominância de um subtipo específico nas respostas fisiológicas observadas. Por exemplo, em estudos funcionais observa-se que há a predominância de �1A-ARs em ducto deferente humano (Furukawa et al., 1995; Lima et al., 2005), �1B-ARs em 6 Introdução baço (Han et al., 1987) e fígado de ratos (Garcia-Sainz et al., 1992) e �1D-ARs em aorta de rato (Lima et al., 2005), apesar de combinações de proproções variadas de mRNAs que codificam cada um dos subtipos de �1-ARs serem encontradas nestes tecidos. Apesar dos �1-ARs interagirem preferencialmente com a proteína G, as porções C-terminais desses receptores também possuem sítios de interação com outras proteínas (tabela 01), além de serem alvos de fosforilação enzimática. Tabela 01. Proteínas interagentes com porções C-terminais de �1-ARs e suas funções Proteína Subtipos de �1-ARs interagentes Função Referências gC1qR �1B; �1D Proteína multifuncional; pode modular localização celular do receptor (Pupo & Minneman, 2003) (Xu et al., 1999) nNOS �1A Formação de NO (ativação da proteína pelo aumento de Ca+2 intracelular) (Pupo & Minneman, 2002) (Christopoulos & El- Fakahany, 1999) BMP-1 �1A Formação de matriz extracelular (Xu et al., 2003) Subunidade �2 do complexo AP2 �1B Internalização do receptor (Diviani et al., 2003) Ezrin �1B Mobilização do receptor por vias dependentes de actina (Stanasila et al., 2006) Sintrofina �1D Expressão do receptor na superfície celular, importante também na funcionalidade do receptor (Chen et al., 2006) (Lyssand et al., 2008) Filamina C �1A; �1B; �1D Localização do receptor e sinalização celular (Zhang et al., 2004) Snapin �1A Interação concomitante com canais de Ca+2 do tipo TRPC6; influxo de íons (Suzuki et al., 2007) 7 Introdução Uma vez que os �1-ARs controlam importantes ações fisiológicas, drogas que interagem com esses receptores são úteis em muitas terapêuticas farmacológicas. Por exemplo, agonistas de �1-ARs são utilizados na terapêutica farmacológica de hipotensão e choque (Stewart et al., 2002) e também como midriáticos e descongestionantes nasais (Johannssen et al., 1997). Os agonistas de �1-ARs podem ser divididos em dois grupos principais de acordo com sua estrutura química: as feniletilaminas e as imidazolinas. As feniletilaminas, dentre as quais estão as catecolaminas noradrenalina e adrenalina, são, em sua maioria, agonistas totais de alta eficácia em �1-ARs e possuem afinidade maior para o subtipo �1D-AR (Minneman et al., 1994). As imidazolinas, por sua vez, são, em grande parte, agonistas parciais, sendo seletivas para o subtipo �1A-AR (Horie et al., 1995; Kamikihara et al., 2005). Dessensibilização e Taquifilaxia A perda de resposta funcional como conseqüência de vários estímulos sucessivos de uma mesma droga é particularmente importante para drogas cujo efeito terapêutico é conseqüência da atividade agonista em um sistema receptor. A perda gradual da resposta faz com que sejam necessárias doses maiores para a obtenção do mesmo efeito ou, em usos muito prolongados, até a perda completa do efeito. Por exemplo, em casos de descongestionantes nasais tópicos, cujo efeito terapêutico advém da atividade de um agonista de �1-ARs, o uso prolongado ou exacerbado, com a aplicação do composto em intervalos de tempo menores do que o recomendado e sem uma dosagem controlada, resulta na perda gradual do efeito terapêutico (Graf & Juto, 1995; Graf, 1996). 8 Introdução Segundo definição da International Union of Pharmacology (IUPHAR), a perda de resposta funcional gerada por estímulos sucessivos é denominada taquifilaxia e quando a taquifilaxia é uma conseqüência direta da ativação de receptores, pode ser denominada dessensibilização (Neubig et al., 2003). Dessensibilização e internalização induzidas por agonistas e vias de sinalização O processo de dessensibilização e internalização de GPCRs mediadas por agonistas é muito bem descrito na literatura para adrenoceptores � (Broadley, 1999), receptores de angiotensina (Franca et al., 2002) e, no caso dos �1-ARs, o processo já foi bem descrito para os �1B-ARs (Garcia-Sainz et al., 2000). Para entender o processo de dessensibilização e internalização de receptores, é fundamental o entedimento das cascatas bioquímicas desencadeadas por eles e as enzimas envolvidas. Quando estimulados por agonistas, os �1-ARs ativam preferencialmente a proteína Gq/11, resultando na ativação de cascatas bioquímicas intracelulares que resultam em suas respostas funcionais. Uma das principais vias ativadas por �1-ARs é a via da fosfolipase C (PLC). Uma outra via ativada por �1-ARs é a via da proteína quinase ativada por mitógeno (mitogen-activated protein kinase; MAPK), responsável pela estimulação da síntese protéica e importante nos processos de divisão e diferenciação celular (Koshimizu et al., 2003). Após a ativação dos �1-ARs, a subunidade �q/11 da proteína G ativa a PLC que hidrolisa as moléculas de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) presentes na membrana plasmática, resultando na produção de dois segundos mensageiros: o inositol trifosfato (IP3), uma molécula solúvel que se difunde no meio intracelular interagindo com receptores específicos no retículo endoplasmático liberando íons 9 Introdução cálcio armazenados, aumentando a concentração citoplasmática desse íon e o diacilglicerol (DAG) molécula hidrofóbica que fica ancorada na membrana e que, juntamente com íons cálcio (Ca+2), ativa a proteína quinase C (protein kinase C; PKC). É sabido que a ativação de GPCRs também pode ativar um grupo de quinases denominadas quinases de receptores acoplados à proteína G (G-protein coupled receptor kinase; GRK). A GRK, assim como a PKC, é responsável pela fosforilação de resíduos de serina e treonina na porção C-terminal dos receptores. Porém, enquanto a GRK é específica e fosforila apenas resíduos da porção C- terminal de receptores que foram expostos a agonistas (Ferguson, 2001; Premont & Gainetdinov, 2007), a PKC é inespecífica e fosforila resíduos da porção C-terminal de receptores expostos ou não a agonistas (Ferguson, 2001). A fosforilação dos resíduos de aminoácidos na porção C-terminal dos receptores serve de sinalização para ligação de proteínas da família das �-arrestinas que, uma vez ligadas ao receptor, impedem a interação do mesmo com as unidades heterotriméricas da proteínas G, mantendo o receptor desacoplado e caracterizando assim a dessensibilização desse receptor (Garcia-Sainz et al., 2000; Premont & Gainetdinov, 2007). A �-arrestina ligada ao receptor, além de dessensibilizá-lo, pode servir de sinalização para a formação de vesículas de clatrina, um componente do citoesqueleto celular (Krupnick et al., 1997; Pediani et al., 2005). O receptor então é envolto em uma vesícula e internalizado para o citoplasma (figura 01). Uma vez internalizado, o receptor ainda pode sofrer dois processos: desfosforilação dentro da própria vesícula por enzimas específicas (fosfatases) ou digestão por lisossomos. 10 Introdução O complexo receptor-arrestina internalizado ou ainda a própria �-arrestina podem estimular direta ou indiretamente a via da MAPK (Pierce et al., 2001; Luttrell & Lefkowitz, 2002; Tohgo et al., 2003). Figura 01. Desenho ilustrativo esquematizando o processo de internalização de GPCRs. Ag: agonista; GRK: quinase de receptores acoplados à proteína G; �-Arr: �- arrestina; P: resíduos fosforilados. 11 Introdução 12 Linhas gerais sobre a presente pesquisa Estudos anteriores feitos em nosso laboratório e também descritos na literatura mostraram que a oximetazolina, apesar de ser um agonista parcial de baixa eficácia, foi capaz de promover taquifilaxia nas contrações de ducto deferente de rato (Ruffolo et al., 1977), ao passo que, a noradrenalina, um agonista total de alta eficácia, não promoveu perda de sensibilidade do tecido. Uma vez que a taquifilaxia pode ser uma conseqüência da dessensibilização de receptores mediadas por agonistas, é relevante investigar as causas desse fenômeno. Não é de nosso conhecimento estudos na literatura que investiguem comparativamente a dessensibilização de �1A-ARs induzida por agonistas de diferentes classes químicas. Esse estudo comparativo é importante principalmente quando os efeitos terapêuticos das drogas estão relacionados com suas atividades agonistas em um mesmo sistema receptor. Objetivos Objetivos Objetivos - Quantificar e analisar comparativamente a taquifilaxia induzida por agonistas feniletilamínicos e imidazolínicos através da ativação dos �1A-ARs do ducto deferente de rato, determinando-se: a) a menor concentração desses agonistas capazes de promover taquifilaxia. b) a duração da taquifilaxia induzida por esses agonistas. c) se a taquifilaxia é cruzada ou não, isto é, se a exposição prévia às imidazolinas também promove taquifilaxia nas respostas às feniletilaminas. - Analisar comparativamente a internalização de �1A-ARs recombinantes marcados com GFP expressados em células HEK-293 induzida por agonistas feniletilamínicos e imidazolínicos. 13 Material e Métodos Material e Métodos Material e Métodos Experimentos de Contração Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética para o Uso Animais de Experimentação da UNESP – Botucatu. Ratos Wistar machos adultos (16 a 20 semanas de idade, 260 a 380g) foram decapitados em guilhotina e os ductos deferentes foram retirados e preparados para o registro digital de contrações isométricas como se segue: os órgãos foram limpos de tecidos aderentes e montados em câmaras musculares de 10 ml sob tensão ótima de 9.8 mN em solução nutriente com a seguinte composição (mM): NaCl 138; KCl 5.7, CaCl2 1.8, NaH2PO4 0.36, NaHCO3 15, dextrose 5.5, preparada em água destilada e deionizada e mantida a 30oC, pH 7.4, continuamente borbulhada com mistura de 95%O2/5%CO2. Todos os experimentos foram feitos na presença de um coquetel de inibidores contendo cocaína (6�M), corticosterona (10�M), ioimbina (0.1�M) e propranolol (0.1�M) para bloquear a captação neuronal, extraneuronal, �2- e �- adrenoceptores, respectivamente. Avaliação de parâmetros de contração em curvas concentração-resposta consecutivas Para investigar possíveis alterações nos parâmetros pEC50 (-log concentração efetiva 50%) e resposta máxima em curvas concentração-resposta consecutivas, foram construídas três curvas concentração-resposta para cada agonista com 30 minutos de intervalo entre as curvas. As curvas concentração-resposta foram construídas pelo método cumulativo com a adição de concentrações crescentes dos 14 Material e Métodos agonistas feniletilamínicos (noradrenalina, fenilefrina e metoxamina) e imidazolínicos (A61603, oximetozalina e nafazolina). Foi utilizado apenas um agonista por preparação. Investigação da taquifilaxia cruzada e determinação da concentração taquifilática A construção de curvas concentração-resposta consecutivas para os agonistas mostrou que apenas as contrações induzidas pela oximetazolina apresentavam taquifilaxia. Assim, foi investigada a capacidade da oximetazolina promover taquifilaxia cruzada nas contrações induzidas pela noradrenalina, o agonista de referência. Para observar a indução da taquifilaxia cruzada e a concentração mínima de oximetazolina capaz de induzir esse fenômeno, após a construção de uma curva concentração-resposta controle de noradrenalina os ductos deferentes foram incubados por 5 minutos com quatro diferentes concentrações de oximetazolina correspondentes a 0.1, 1, 10 e 30 vezes a pEC50, lavados e após 30 minutos, uma nova curva concentração-resposta de noradrenalina foi determinada. Determinação da duração da taquifilaxia Para determinar a duração da taquifilaxia induzida pela oximetazolina 10�M por 5minutos (correspondente a 30 vezes a pEC50), foram construídas curvas concentração-resposta cumulativas de noradrenalina após 30, 60, 120 e 180 minutos da aplicação do protocolo taquifilático, com troca da solução nutritiva a cada 20 minutos. Estes experimentos foram acompanhados de controles temporais 15 Material e Métodos paralelos nos quais curvas concentração-resposta de noradrenalina foram determinadas em ductos deferentes que não foram submetidos ao protocolo taquifilático. Estudos de inibição da taquifilaxia Para os estudos de inibição da taquifilaxia foi utilizado o antagonista competitivo de �1-ARs prazosin. Nestes experimentos os ductos deferentes foram incubados previamente com prazosin 10nM por 30 minutos e, sem a remoção do antagonista, foram submetidos ao protocolo taquifilático, com a incubação de oximetazolina 10�M por 5 minutos. Após o tratamento, os tecidos foram lavados pelo menos 30 vezes e, após 30 minutos, foi determinada a curva concentração-resposta de noradrenalina. Cultura de Células e Transfecção Células derivadas do rim embrionário humano (HEK293) foram mantidas em DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) com 1 mM piruvato de sódio, suplementado com 10% de soro fetal bovino (v/v), 10 mg/l de estreptomicina e 100 U/ml de penicilina a 37o C em atmosfera umidificada (5% CO2). Células HEK293 foram transfectadas com os vetores pEGFP-N3 contendo a seqüência que codifica �1A-ARs conjugados com GFP em sua porção N-terminal por precipitação com fosfato de cálcio (20 �g de DNA/4X105 células). 16 Material e Métodos Purificação do plasmídeo em larga escala A purificação em larga escala do plasmídeo foi realizada com o kit UltraClean™ - 250 to 500 ml Plasmid Prep Kit (MO BIO Laboratories Inc., USA) seguindo instruções recomendadas pelo fabricante. Uma colônia de bactérias E.coli DH5� competentes transformadas com o plasmídeo codificador de �1A-AR conjugado com a proteína fluorescente verde (GFP) foi selecionada e inoculada em 500 ml de meio LB líquido contendo antibiótico canamicina (100 �l/ml). Após incubação overnight a 37ºC, as bactérias foram separadas do meio de cultura por centrifugação a 3500 x g por 15 minutos. Descartado o sobrenadante, foram adicionados 5 ml da Solução P1 (Tris, EDTA, RNase A) e as bactérias foram ressuspendidas por agitação até homogeneização. Posteriormente, foram adicionados 10 ml de solução P2 (SDS e NaOH) deixando agir por 30 segundos para lise celular alcalina. A seguir para promover neutralização, 30 ml da solução P3 (Acetato de Potássio) foram acrescentados e misturados por inversão. Para separação de debris celulares, o conteúdo foi transferido para um tubo de 50 ml e centrifugado a 3500 x g por 10 minutos. Com cuidado para não transferir o precipitado de debris celulares, 20 ml do sobrenadante foram transferidos para um tubo com filtro e este foi centrifugado durante 5 minutos a 3500 x g. O sobrenadante restante foi adicionado no mesmo tubo e a centrifugação foi repetida. Nesta etapa o DNA se liga à membrana de sílica branca do filtro e impurezas não desejadas como RNA ou debris celulares atravessam o filtro. Depois, o filtro foi lavado pela adição de 20 ml da Solução P4 (Tris, NaCl e etanol 50%) e centrifugado por 5 minutos a 3500 x g. A seguir, o filtro foi removido, colocado em um novo tubo e 1.0 ml de água milliQ autoclavada a 65ºC foram adicionados ao filtro e centrifugados por 5 minutos a 3500 x g para a coleta do DNA. 17 Material e Métodos A quantificação do DNA extraído foi determinada por espectrofotometria através da leitura da absorbância nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm. Microscopia confocal Os experimentos de microscopia confocal foram realizados no Departamento de Farmacologia da Universidade Federal de São Paulo (INFAR/UNIFESP). As células HEK293 transientemente transfectadas e expressando �1A-ARs conjugado com GFP foram cultivadas em lamínulas de quartzo tratadas com poli-D- lisina para os experimentos. As imagens foram capturadas em tempo real por microscópio confocal (LSM510, Carl Zeiss) a cada 5 minutos a partir da incubação dos agonistas noradrenalina (10�M) e oximetazolina (10�M) até o tempo total de 30 minutos. Todas as imagens foram feitas em imersão em óleo utilizando objetivas (Plan-Neofluar) em aumento de 40X. A excitação foi feita por laser de argônio e filtro HFT em comprimentos de onda de 488nm e a emissão captada por filtro LP em comprimento de onda de 505nm. A mensuração da fluorescência foi feita com o auxílio do software ImageJ 1.38x (National Institutes of Health - NIH, Estados Unidos). A fluorescência foi determinada como média de intensidade em áreas circulares selecionadas em regiões adjacentes à membrana plasmática. Análise Estatística Os dados serão apresentados como média±erro padrão da média (EPM) de n experimentos. Diferenças entre valores médios serão investigadas pelo teste t de 18 Material e Métodos 19 Student (p<0.05) pareado ou não, ou Anova seguido de Newman-Keuls para comparações múltiplas. Resultados Resultados Resultados Parâmetros de contração em curvas concentração-resposta consecutivas A figura 02 mostra curvas concentração-resposta consecutivas das imidazolinas nafazolina, A61603 e oximetazolina no ducto deferente. Não houve diferença significativa entre as três curvas concentração-resposta consecutivas de nafazolina. Os valores de contração máxima e pEC50 foram semelhantes para as três curvas (figura 02a, tabela 02). As três curvas concentração-resposta consecutivas de A61603 no ducto deferente apresentaram contrações máximas e pEC50 semelhantes (figura 02b, tabela 02). Não foi possível a construção de curvas concentração-resposta consecutivas para a oximetazolina, pois após a primeira curva concentração-resposta foi observada intensa taquifilaxia e mesmo altas concentrações de oximetazolina não induziram contrações no ducto deferente (figura 02c, tabela 02). 20 Resultados 21 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1a CCR 2a CCR 3a CCR (a) log [Nafazolina] M C on tr aç ão (g ) -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 1a CCR 2a CCR 3a CCR (b) log [A61603] M C on tr aç ão (g ) -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1a CCR 2a CCR 3a CCR (c) log [Oximetazolina] M C on tr aç ão (g ) Figura 02. Curvas concentração-resposta (CCR) consecutivas das imidazolinas nafazolina (a), A61603 (b) e oximetazolina (c) no ducto deferente de rato. Cada símbolo representa a média e a linha vertical, quando maior que o símbolo, o erro padrão da média de 4 a 6 experimentos. Resultados Tabela 02. Valores médios de pEC50 e contração máxima (gramas de tensão) encontrados em três curvas concentração-resposta consecutivas para os agonistas imidazolínicos nafazolina, A61603 e oximetazolina. pEC50 Contração máxima (g) 1ª CCR 2ª CCR 3ª CCR 1ª CCR 2ª CCR 3ª CCR Nafazolina 5.51 � 0.13 5.98 � 0.27 5.47 � 0.17 0.66 � 0.08 0.55 � 0.10 0.79 � 0.11 A61603 7.55 � 0.12 7.80 � 0.09 7.86 � 0.09 1.48 � 0.21 1.23 � 0.11 1.39 � 0.10 Oximetazolina 6.19 � 0.21 n.d. n.d 0.62 � 0.05 0 0 Os valores representam a MÉDIA � EPM de 4 a 6 experimentos. CCR: curva concentração-resposta. n.d= não-determinado 22 Resultados A figura 03 mostra curvas concentração-resposta consecutivas das feniletilaminas noradrenalina, fenilefrina e metoxamina no ducto deferente. As curvas concentração-resposta consecutivas para a noradrenalina apresentaram pEC50 e contração máxima semelhantes (figura 03a, tabela 03). Já as curvas concentração-resposta consecutivas de fenilefrina não diferiram em relação ao parâmetro pEC50, porém as contrações máximas da segunda e da terceira curva concentração-resposta consecutivas foram maiores que aquela determinada na primeira (figura 03b, tabela 03). As três curvas concentração-resposta consecutivas de metoxamina não diferiram quanto à pEC50 e contração máxima (figura 03c, tabela 03). 23 Resultados 24 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 1ª CCR 2ª CCR 3ª CCR (a) log [Noradrenalina] M C on tr aç ão (g ) -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 1ª CCR 2ª CCR 3ª CCR (b) log [Fenilefrina] M C on tr aç ão (g ) -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 1ª CCR 2ª CCR 3ª CCR (c) log[Metoxamina] M C on tr aç ão (g ) Figura 03. Curvas concentração-resposta (CCR) consecutivas das feniletilaminas noradrenalina (a), fenilefrina (b) e metoxamina (c) no ducto deferente de rato. Cada símbolo representa a média e a linha vertical, quando maior que o símbolo, o erro padrão da média de 4 a 6 experimentos. Resultados Tabela 03. Valores médios de pEC50 e contração máxima (gramas de tensão) encontrados em três curvas concentração-resposta consecutivas para as feniletilaminas noradrenalina, fenilefrina e metoxamina. pEC50 Contração máxima (g) 1ª CCR 2ª CCR 3ª CCR 1ª CCR 2ª CCR 3ª CCR Noradrenalina 6.73 � 0.05 6.99 � 0.07 6.99 � 0.11 1.61 � 0.08 1.73 � 0.12 1.81 � 0.05 Fenilefrina 5.60 � 0.09 5.63 � 0.08 5.69 � 0.07 1.51 � 0.06 1.73 � 0.07* 1.88 � 0.06* Metoxamina 5.32 � 0.06 5.47 � 0.06 5.30 � 0.07 1.57 � 0.04 1.62 � 0.07 1.59 � 0.11 Os valores estão expressos como MÉDIA � EPM de 4 a 6 experimentos. CCR: curva concentração- resposta. * diferença significativa entre as curvas no respectivo parâmetro determinado para o mesmo agonista (p<0.05). 25 Resultados Taquifilaxia cruzada e determinação da concentração taquifilática As contrações induzidas pela oximetazolina no ducto deferente apresentaram intensa taquifilaxia. Assim, foi investigado se a oximetazolina é capaz de promover taquifilaxia cruzada nas contrações induzidas pela noradrenalina, o agonista de referência. A figura 04 mostra curvas concentração-resposta de noradrenalina antes (controle) e após a incubação de diferentes concentrações de oximetazolina por 5 minutos (30nM, 300nM, 3�M e 10�M). A incubação de oximetazolina 10�M/5min reduziu a potência da noradrenalina, indicando que a oximetazolina causa taquifilaxia cruzada nas contrações induzidas pela noradrenalina (tabela 4). 26 Resultados -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Controle OXI 30nM OXI 300nM OXI 3�M OXI 10�M log [Noradrenalina] M C on tr aç ão (g ) Figura 04. Curvas concentração-resposta de noradrenalina antes (controle) e após incubação com diferentes concentrações de oximetazolina por 5 minutos. Cada símbolo representa a média e a linha vertical, quando maior que o símbolo, o erro padrão da média de 4 a 5 experimentos. 27 Resultados Tabela 04. Valores médios dos parâmetros pEC50 e contração máxima (gramas de tensão) para a noradrenalina antes (controle) e após a incubação de diferentes concentrações de oximetazolina. pEC50 Contração Máxima (g) Controle 6.42 � 0.10 1.42 � 0.11 Após OXI 30nM/5 min 6.43 � 0.12 1.43 � 0.16 Após OXI 300nM/5 min 6.35 � 0.12 1.41 � 0.11 Após OXI 3�M/5 min 6.01 � 0.11 1.51 � 0.11 Após OXI 10�M/5 min 5.50 � 0.06* 1.34 � 0.08 Os valores estão expressos como MÉDIA � EPM de 4 a 5 experimentos. *diferença significativa em relação ao controle no respectivo parâmetro determinado para os diferentes tratamentos (p<0.05). 28 Resultados Determinação do tempo de duração da taquifilaxia cruzada A oximetazolina promoveu taquifilaxia cruzada nas contrações induzidas pela noradrenalina. A duração da taquifilaxia cruzada foi investigada pela construção de curvas concentração-resposta de noradrenalina após 30, 60, 120 e 180 minutos da aplicação do protocolo taquifilático (oximetazolina 10�M/5 min). As curvas concentração-resposta de noradrenalina foram comparadas a seus respectivos controles temporais determinados em ductos deferentes que não foram tratados com oximetazolina 10�M/5 min. Após 30 minutos da aplicação do protocolo taquifilático, houve deslocamento à direita da curva concentração-resposta de noradrenalina (figura 05a, tabela 05), caracterizando a taquifilaxia cruzada induzida pela oximetazolina. A curva concentração-resposta de noradrenalina determinada após 60 minutos da aplicação do protocolo taquifilático também se apresentou deslocada à direita da curva concentração-resposta controle (figura 05b, tabela 05), indicando que a taquifilaxia cruzada induzida pela oximetazolina é duradoura, perdurando por pelo menos 60 minutos. Já as curvas concentração-resposta de noradrenalina determinadas após 120 e 180 minutos da aplicação do protocolo taquifilático (figuras 05c e 05d respectivamente), não diferiram de seus respectivos controles temporais, indicando que a taquifilaxia cruzada foi revertida (tabela 05). 29 Resultados -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 (a) controle temporal 30' após OXI 10�M log [Noradrenalina] M C on tr aç ão (g ) -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 (b) controle temporal 60' após OXI 10�M log [Noradrenalina] M C on tr aç ão (g ) -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 (c) controle temporal 120' após OXI 10�M log [Noradrenalina] M C on tr aç ão (g ) -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 (d) controle temporal 180' após OXI 10 �M log [Noradrenalina] M C on tr aç ão (g ) Figura 05. Gráficos das curvas concentração-resposta de noradrenalina após incubação com 10�M de oximetazolina. Cada gráfico apresenta uma curva controle temporal (símbolos abertos) e uma curva feita com diferentes intervalos após a incubação (símbolos fechados) para avaliação do tempo de duração da taquifilaxia induzida pela oximetazolina. Cada símbolo representa a média e a linha vertical, quando maior que o símbolo, o erro padrão da média de 4 experimentos. 30 Resultados Tabela 05. Valores de pEC50 obtidas após diferentes intervalos da aplicação do protocolo taquifilático (oximetazolina 10�M/5min) e seus respectivos controles temporais. Após 30’ Após 60’ Após 120’ Após 180’ Controle 6.22 � 0.07 6.20 � 0.09 6.64 � 0.05 6.68 � 0.06 Incubado 5.27 � 0.05* 5.83 � 0.10* 6.49 � 0.09 6.49 � 0.09 Os valores estão expressos como MÉDIA � EPM de 4 experimentos. * diferença significativa entre os grupos (p<0.05). Tabela 06. Valores de contrações máximas (em gramas de tensão) obtidas após diferentes intervalos da aplicação do protocolo taquifilático (oximetazolina 10�M/5min) e seus respectivos controles temporais. Após 30’ Após 60’ Após 120’ Após 180’ Controle 1.80 � 0.05 1.86 � 0.13 1.97 � 0.05 1.97 � 0.06 Incubado 1.61 � 0.11 1.61 � 0.08 1.78 � 0.08 1.85 � 0.07 Os valores estão expressos como MÉDIA � EPM de 4 experimentos. 31 Resultados Inibição da taquifilaxia cruzada pelo prazosin Para investigar se a taquifilaxia cruzada promovida pela oximetazolina depende da ativação de �1-ARs, os ductos deferentes foram incubados com oximetazolina 10�M/5 min na presença ou ausência de prazosin 10 nM, um antagonista seletivo de �1-ARs. A figura 06 mostra curvas de noradrenalina em preparações de ducto deferente controle (sem a aplicação do protocolo taquifilático) e em preparações onde o protocolo taquifilático foi aplicado na ausência e na presença de prazosin 10nM. Na ausência de prazosin, o tratamento com oximetazolina 10�M/5 min promoveu um deslocamento à direita da curva concentração-resposta de noradrenalina. Porém, quando a oximetazolina 10�M/5 min foi incubada na presença de prazosin 10 nM, o deslocamento à direita na curva concentração-resposta de noradrenalina foi menos acentuado, indicando que o prazosin inibe, pelo menos parcialmente, a taquifilaxia cruzada induzida pela oximetazolina. Para investigar se a inibição apenas parcial da taquifilaxia cruzada pelo prazosin resulta da lavagem incompleta deste antagonista lipofílico, uma curva concentração-resposta de noradrenalina foi determinada em ductos deferentes que haviam sido incubados apenas com prazosin 10 nM/35 min e lavados sucessivamente durante 30 min. A curva concentração-resposta de noradrenalina determinada nos ductos deferentes tratados apenas com prazosin 10 nM não diferiu daquela determinada em tecidos que receberam o protocolo taquifilático (oximetazolina 10�M/5 min) na presença de prazosin 10 nM. Tal resultado indica que a lavagem do prazosin foi imcompleta e que a taquifilaxia cruzada promovida pela oximetazolina depende da ativação de �1-ARs 32 Resultados -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Controle OXI 10�M OXI + PZS PZS 10nM log [Noradrenalina] M C on tr aç ão (g ) Figura 06. Curvas concentração-resposta (CCR) de noradrenalina controle ( ); após incubação prévia de oximetazolina 10�M/5min (�); após incubação de prazosin 10nM concomitante com a oximetazolina (�); após incubação apenas com prazosin (�). Cada símbolo representa a média e a linha vertical, quando maior que o símbolo, o erro padrão da média de 4 a 6 experimentos. Tabela 07. Valores médios de pEC50 e contração máxima (em gramas de tensão) encontrados nas curvas concentração-resposta de noradrenalina feitas após tratamentos específicos. Controle OXI OXI+PZS PZS pEC50 6.66�0.05a 5.53�0.06b 5.97�0.08c 5.86�0.09c Contração máxima (g) 1.87�0.07 1.70�0.06 1.73�0.10 1.87�0.14 Os valores representam a MÉDIA � EPM de 4 a 6 experimentos. Letras superescritas diferentes indicam diferença significativa entre os grupos em relação ao respectivo parâmetro (p<0.05). 33 Resultados 34 Internalização de �1A-ARs conjugados com GFP Estudos de microscopia confocal foram realizados em células HEK293 transfectadas com o gene codificador de �1A-AR conjugado com GFP. Nas imagens de microscopia confocal, as células apresentaram marcação fluorescente tanto na região da membrana plasmática como em regiões perinucleares. Essa marcação indica a presença do receptor tanto na membrana plasmática como em regiões intracelulares. A figura 07 mostra imagens representativas de microscopia confocal de células tratadas com noradrenalina (10�M) ou oximetazolina (10�M) durante os primeiros 20 minutos de experimento. A célula tratada com noradrenalina não apresenta aumento da fluorescência intracelular durante o período experimental, já a célula tratada com oximetazolina apresenta um aumento evidente da fluorescência intracelular. O gráfico apresentado na figura 07 mostra o aumento da fluorescência intracelular, em relação ao basal, nos experimentos com oximetazolina. O aumento da fluorescência já se mostrou significativo nos primeiros 5 minutos de experimento, sendo esse aumento tempo-dependente em todos os 30 minutos de experimento. Já nos experimentos com noradrenalina, não houve aumento na fluorescência intracelular. (a ) 0 10 20 30 40 024681012 O xi m et az ol in a N or ad re na lin a * * * * * te m po ( m in ut os ) Aumento relativo no sinal intracelular do GFP * (b ) Fi gu ra 07 . (a ) Im ag en s re pr es en ta tiv as de m ic ro sc op ia co nf oc al da s cé lu la s tra ta da s co m ox im et az ol in a (1 0� M ) ou n or ad re na lin a (1 0� M ); (b ) gr áf ic o re pr es en ta nd o a flu or es cê nc ia in tra ce lu la r re la tiv a m en su ra da e m 3 e xp er im en to s. * di fe re nç a si gn ifi ca tiv a co m re la çã o à in te ns id ad e ba sa l (p <0 .0 5) . Resultados O XI M E TA ZO LI N A 10 �M N O R A D R E N A LI N A 10 �M O XI M E TA ZO LI N A 10 �M N O R A D R E N A LI N A 10 �M 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 35 Discussão Discussão Discussão O presente estudo investigou a taquifilaxia nas contrações resultantes da ativação de �1A-ARs em ducto deferente de rato e a internalização de �1A-ARs conjugados com a proteína fluorescente verde (GFP) em células HEK293. A taquifilaxia é um fenômeno fisiológico descrito como a perda de resposta funcional após estimulações sucessivas (Neubig et al., 2003). A perda da capacidade de resposta pode estar relacionada a várias causas, como redução do número de receptores na membrana por internalização através de vesículas recobertas de clatrina (Krupnick et al., 1997; Krupnick & Benovic, 1998; Ferguson, 2001; Kohout & Lefkowitz, 2003; Pediani et al., 2005), alterações de eventos posteriores à sua ativação (ex. produção de segundos mensageiros; (Lamers et al., 1993)) ou fosforilação do receptor, diminuindo sua afinidade pela proteína G (Krupnick et al., 1997; Vazquez-Prado et al., 2000). No presente estudo, as curvas concentração-resposta consecutivas determinadas para vários agonistas no ducto deferente de rato como a noradrenalina, fenilefrina, metoxamina, A61603 e nafazolina não diferiram entre si, sugerindo que as contrações induzidas por essas drogas não apresentam taquifilaxia. Interessantemente, apenas as contrações induzidas pela oximetazolina apresentaram intensa taquifilaxia tanto em contrações induzidas por ela mesma como em contrações induzidas por outros agonistas como a noradrenalina. De fato, alguns estudos sugerem que derivados imidazolínicos, em especial a oximetazolina, induzem taquifilaxia em contrações de ducto deferente de rato induzidas por outros agonistas. Foi observado que a administração repetitiva de oximetazolina 10 �M no ducto deferente de rato induziu taquifilaxia nas contrações induzidas por outras 36 Discussão imidazolinas (Ruffolo et al., 1977) e nas contrações induzidas pela adrenalina (Rice et al., 1991). O presente estudo observou que o tempo de duração da taquifilaxia induzida pela oximetazolina é longo, perdurando por pelo menos 60 minutos. Dados obtidos na literatura especulam que a oximetazolina possa atuar como um antagonista “pseudo-irreversível”, apresentando uma baixa taxa de dissociação do receptor (Rice et al., 1991). Essa hipótese poderia explicar o longo tempo de duração da taquifilaxia observado no presente experimento. Porém, é sabido que a oximetazolina comporta-se como um antagonista competitivo reversível contra as contrações induzidas pela noradrenalina no ducto deferente de rato, uma vez que a inclinação da reta no gráfico de Schild não diferiu da unidade teórica (Campos et al., 2003). Caso a hipótese de “pseudo-irreversibilidade” da interação da oximetazolina com os �1A-ARs fosse correta, a inclinação da reta no gráfico de Schild deveria ser maior que a unidade teórica uma vez que o efeito de uma concentração de oximetazolina sofreria um efeito aditivo da concentração anterior, promovendo assim um deslocamento à direita da curva concentração-resposta maior do que o teoricamente previsto. A taquifilaxia induzida pela oximetazolina no ducto deferente se mostrou dependente da ativação de �1A-ARs uma vez que a incubação concomitante do antagonista prazosin preveniu o deslocamento à direita na curva concentração- resposta de noradrenalina. A dependência da ativação de �1A-ARs juntamente com o descarte de um efeito de “pseudo-irreversibilidade” indicam que processos relacionados a dessensibilização e internalização de �1A-ARs possam estar envolvidos na taquifilaxia induzida pela oximetazolina no ducto deferente de rato. No entanto, é difícil estudar os processos envolvidos na dessensibilização e 37 Discussão internalização de �1A-ARs nativos principalmente em razão da ausência de anticorpos suficientemente específicos que permitam, por exemplo, a detecção de receptores fosforilados em ensaios de imunoprecipitação ou de receptores internalizados em ensaios de imunohistoquímica. Por outro lado, a utilização de �1A- ARs recombinates conjugados à GFP permite que a localização do receptor em compartimentos celulares diferentes seja determinada com resolução temporal através de estudos de microscopia confocal. Experimentos de microscopia confocal utilizando células HEK293 transfectadas com �1A-ARs conjugados à GFP em sua porção N-terminal foram realizados para investigar a capacidade da oximetazolina de induzir internalização desses receptores. Os resultados observados na microscopia confocal são claros em relação ao aumento de fluorescência intracelular induzido pela oximetazolina 10�M, sendo este aumento significativo em relação ao basal após apenas 5 minutos de incubação da oximetazolina, indicando internalização dos �1A-ARs conjugados à GFP. Interessantemente, o tratamento das células HEK293 transfectadas com �1A- ARs conjugados à GFP com noradrenalina 10�M não foi capaz de promover aumento de fluorescência intracelular, sugerindo que esse agonista não é capaz de promover internalização dos �1A-ARs, mesmo após 30 minutos de incubação. Tais resultados são surpreendentes, pois a oximetazolina é um agonista parcial de baixa eficácia relativa nos �1A-ARs. Estima-se que a eficácia intrínseca relativa da oximetazolina nos �1A-ARs é cerca de 30 a 100 vezes menor que a da noradrenalina (Minneman & Abel, 1984; Minneman et al., 1994). Alguns estudos sugerem que a fenilefrina, uma feniletilamina que é um agonista seletivo de �1-ARs, induz 38 Discussão 39 internalização de �1A-ARs somente após 50-60 minutos de incubação (Chalothorn et al., 2002; Wang et al., 2007). É tentador sugerir que a internalização dos �1A-ARs induzida pela oximetazolina está relacionada com a taquifilaxia observada nas contrações do ducto deferente. Porém, é importante reconhecer que as características particulares de cada sistema de estudo (receptores nativos versus receptores recombinantes heterologamente expressados num sistema celular) impedem o estabelecimento de uma relação direta entre os dois fenômenos observados para a oximetazolina e os �1A-ARs. Sendo assim, experimentos adicionais devem ser feitos para um melhor esclarecimento acerca dos processos de taquifilaxia e internalização observados no presente estudo. Conclusões Conclusões Conclusões - dentre os agonistas testados (imidazolinas e feniletilaminas), apenas a oximetazolina foi capaz de promover taquifilaxia em curvas concentração-resposta consecutivas; - a oximetazolina também é capaz de promover taquifilaxia cruzada, diminuindo a resposta contrátil do ducto deferente induzida pela noradrenalina; - a taquifilaxia apresentada pela oximetazolina é dependente da ativação de �1A- ARs, uma vez que o antagonista prazosin foi capaz de reverter a taquifilaxia; - a oximetazolina, mas não a noradrenalina, induz intensa e rápida internalização de �1A-ARs em células HEK293. 40 Referências Bibliográficas Referências Bibliográficas Referências Bibliográficas BROADLEY, K.J. (1999). Review of mechanisms involved in the apparent differential desensitization of beta1- and beta2-adrenoceptor-mediated functional responses. J Auton Pharmacol, 19, 335-45. CAMPOS, M., DE LUCENA MORAIS, P. & PUPO, A.S. (2003). 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Therefore, this study investigated whether sympathectomy with reserpine would induce supersensitivity in proximal segments of the rat tail artery, a tissue in which α1D- adrenoceptors are already functional. Proximal segments of tail arteries from reserpinised rats were three- to sixfold more sensitive to phenylephrine and methoxamine than were arteries from control rats (n=6–2; p<0.05). The imidazolines N-[5-(4,5-Dihydro-1H-imidazol-2-yl)-2-hy- droxy-5,6,7,8-tetrahydronaphthalen-1-yl]methanesulfona- mide hydrobromide (A-61603) and oxymetazoline, which activate selectively α1A-adrenoceptors, were equipotent in tail arteries from control and reserpinised rats (n=4–2; p< 0.05), whereas buspirone, which activates selectively α1D- adrenoceptor, was ≈4-fold more potent in tail arteries from reserpinised rats (n=4–6; p<0.05). Prazosin (nonselective) and 5-methylurapidil (α1A-selective), were competitive antagonists of contractions induced by phenylephrine and were equipotent in tail arteries from control and reserpinised rats (n=4–6). The selective α1D-adrenoceptor antagonist 8- [2-[4-(2-methoxyphenyl)-1-piperazinyl]ethyl]-8-azaspiro [4.5]decane-7,9-dione dihydrochloride (BMY-7378) pre- sented similar complex antagonism in tail arteries from control and reserpinised rats, with Schild slopes much lower than 1.0 (p<0.05, n=4–6). Semiquantitative reverse tran- scriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) revealed that mRNA encoding α1A-and α1B-adrenoceptors are similarly distributed in tail arteries from control and reserpinised rats, whereas mRNA for α1D-adrenoceptors is twice more abundant in the tail artery from reserpinised rats. In conclusion, the supersensitivity induced by reserpine is related only to α1D-adrenoceptors, even in tissues where this receptor subtype is already present and functional. Only the use of subtype-selective α1-adrenoceptor agonists detected the increased α1D-adrenoceptor component after reserpinisa- tion, as the antagonists behaved similarly in tail arteries from control and reserpinised rats. Keywords α1-adrenoceptors .α1D-adrenoceptors . α1-adrenoceptor agonists . Rat tail artery . Reserpine . Sympathectomy Introduction Important actions of norepinephrine and epinephrine result from the activation of α1-adrenoceptors , including the contractions of vascular and nonvascular smooth muscle and the control of glycogenolysis, neuronal excitability, glandular secretion and cell growth, division and differen- tiation. There are three different α1-adrenoceptors, named α1A-, α1B- and α1D-adrenoceptors, and separate genes encode each of these subtypes (Koshimizu et al. 2003). All three α1-adrenoceptors are members of the subfamily 1A of the G protein-coupled receptors, which means that the binding site for the endogenous catecholamines is in a Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol (2007) 376:117–126 DOI 10.1007/s00210-007-0176-4 S. Y. Kamikihara :A. Mueller :V. Lima : J. Akinaga : F. D. Nojimoto :A. S. Pupo (*) Department of Pharmacology, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, SP 18618-000, Brazil e-mail: aspupo@ibb.unesp.br A. Castilho : J. Buratini Jr. Department of Physiology, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, SP 18618-000, Brazil hydrophilic cavity and shares residues located at the membrane level of the third to the sixth transmembrane α-helices (Bockaert and Pin 1999). The α1-adrenoceptors couple preferentially to a Gq/11 protein, and the activation of these receptors leads to the activation of phospholipase Cβ and formation of diacylglycerol and inositol phosphates (Koshimizu et al. 2003). Drugs that activate α1-adrenoceptors are currently used as local vasoconstrictors, nasal decongestants, mydriatics, antihypotensives and to revert atrial paroxysmal tachycar- dia. In addition, α1-adrenoceptor agonists are promising candidates for the treatment of migraine (Willems et al. 2003). Great effort has been dedicated to the identification of the predominant α1-adrenoceptor subtype(s) involved in each of the therapeutic actions of the α1-adrenoceptor agonists, as the use of subtype-selective compounds would be advantageous. The α1-adrenoceptor agonists can be classified accord- ing to their chemical structures into two main classes as phenethylamine derivatives and imidazoline-containing compounds. The selectivity of the commonly used phene- thylamines (phenylephrine and methoxamine) for any of the α1-adrenoceptors is unclear, although some studies indicate that methoxamine is a poor agonist of α1B- adrenoceptors (Marucci et al. 2005; Oshita et al. 1993). On the other hand, the imidazolines N-[5-(4,5-Dihydro-1H- imidazol-2-yl)-2-hydroxy-5,6,7,8-tetrahydronaphthalen-1-yl] methanesulfonamide hydrobromide (A-61603) and oxyme- tazoline show considerable selectivity for α1A-adrenoceptors (Knepper et al. 1995; Minneman et al. 1994). The azaspirone buspirone is a partial agonist at 5-HT1A receptors that has been shown to present selective agonism at α1D-adrenoceptor (Eltze et al. 1999; Yamamoto and Koike 2001). The contractions of the rat tail artery in response to α1- adrenoceptor agonists are predominantly mediated by α1A- adrenoceptors (Lachnit et al. 1997; Villalobos-Molina and Ibarra 1996). However, depending on the segment of the tail from which the arterial preparation is isolated, either α1B- or α1D-adrenoceptors can be found to coparticipate with α1A- adrenoceptors in the contractions induced by adrenoceptor agonists (Kamikihara et al. 2005). Significant coparticipation has been observed of α1D-adrenoceptors in rings taken from proximal segments and α1B-adrenoceptors in rings from distal segments (Jahnichen et al. 2004; Kamikihara et al. 2005). These features make the rat tail artery an interesting model for the study of the pharmacological properties of selective and nonselective α1-adrenoceptor agonists in tissues with heterogeneous receptor populations. It is well known that chemical sympathectomy with reserpine induces supersensitivity of the rat tail artery to some adrenoceptor agonists. Interestingly, it has been recently shown that the supersensitivity to phenylephrine induced by reserpine is due to the specific expression of α1D- adrenoceptors, as 8-[2-[4-(2-methoxyphenyl)-1-piperazinyl] ethyl]-8-azaspiro[4.5]decane-7,9-dione dihydrochloride (BMY-7378) at 30 nM, a concentration that antagonises selectively α1D-adrenoceptors, inhibited the supersensitivity to phenylephrine but was ineffective in tail arteries from nonreserpinised rats (Taki et al. 2004). It is unknown what effects of reserpinisation are in proximal segments of the tail artery where α1D-adrenoceptors are already present and functional. In addition, it remains to be determined what the effects of reserpinisation are on the actions of subtype-selective agonists, as the study by Taki et al. (2004) employed only phenylephrine as the agonist. Therefore, this study investigated the actions of the phenethylamines phenylephrine and methoxamine, the imi- dazolines A 61603 and oxymetazoline, and the azaspirone buspirone in proximal segments of the tail artery from control and reserpinised rats to determine what the effects of reserpine are in arterial segments where α1D-adrenoceptors are already present and functional. The effects of reserpine on the expression of α1-adrenoceptors transcripts were also determined. Methods Animals and treatment with reserpine Male Wistar rats weighing between 250 and 380 g (16– 20 weeks old) were kept in a controlled environment with temperature at 25±1°C; humidity 55±5%; 12-h light/dark cycle (lights on at 6:00 A.M.) and free access to regular lab chow and tap water. Some animals received daily intra- peritonial injections of reserpine (5 mg Kg−1) for 7 days and were killed by decapitation in a guillotine 24 h after the last injection. The experimental procedures were approved by the ethics committee for the Use of Experimental Animals from UNESP-Botucatu and are in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals [National Institutes of Health (NIH)]. Functional studies Proximal segments of the ventral artery of the tail (located within the initial 4 cm of the tail) from control and reserpinised rats were removed carefully, cleaned of adhering tissue and endothelium by gentle rubbing with a stainless steel wire, cut into 3- to 4-mm rings and mounted under 19.6mN of optimal tension in 10 ml organ baths containing a physiolog- ical solution of the following composition (mM): NaCl 119; KCl 4.7; CaCl2 2.5; MgSO4 1.2; KH2PO4 1.2 and dextrose 11, prepared in glass-distilled, deionised water, maintained at 37°C and bubbled with 5% CO2/95% O2. Changes in tail artery tension were recorded using FORT10 isometric force 118 Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol (2007) 376:117–126 transducers (WPI, USA) connected to Transbridge 4M Transducer Amplifier (WPI, USA) connected to a PC-based MP100 system and analysed off-line using AcqKnowledge version 3.5.7 software. (Biopac Systems Inc., USA). A cocktail containing cocaine (6 μM), corticosterone (10 μM), yohimbine (0.1 μM) and propranolol (0.1 μM), was included in all experiments to block neuronal uptake, extraneuronal uptake, α2-adrenoceptors and β1-and β2-adrenoceptors, respectively. The effectiveness of the chemical sympathec- tomy with reserpine was checked by the absence of contractile response to the indirect sympathomimetic agent tyramine (30 μM) and was higher than 85% in the sense that less than 15% of the tail arteries from reserpinised rats contracted to tyramine. Only unresponsive organs were used. After an equilibration period of 60 min with adjustments of basal tension and changes of physiological solution at each 20 min, the arteries were repeatedly challenged with phenylephrine 10 μM at 20 min intervals until contractions of similar magnitude were obtained (usually three times). Then, concentration response-curves to α1-adrenoceptor agonists were obtained in the absence or presence of increasing concentrations of the α1-antagonists prazosin, BMY-7378 and 5-methylurapidil previously incubated for at least 45 min. Not more than four consecutive concentration- response curves were obtained from each preparation, as preliminary experiments showed that after the fourth concentration-response curve, there are significant changes in the sensitivity of the tail artery. The pA2 values for competitive antagonists were calculated by Schild regression analysis (Arunlakshana and Schild 1959). The ratios between the half-maximal concentrations of agonists (concentration ratios, r) were calculated only when the maximal amplitude of the concentration-response curve in the presence of the compet- itive antagonists was similar to that obtained in its absence. Data were plotted as log-antagonist concentrations (M) vs. log (r−1). For calculation purposes ,the slope parameter was constrained to 1.0 when statistically not different from unity. When the slope parameter differed from the theoretical unity, the antagonist affinity was estimated as pKB calculated through the formula pKB ¼ � log [lowest effective concen- tration of the antagonist (M)] + log (r−1). Curve fitting and pD2 calculation was performed with the software package GraphPad Prism version 3.00, San Diego, CA, USA. All values are shown as means ± standard error of mean (SEM) of n experiments. Differ- ences between mean values were tested for statistical significance (p<0.05) using Student’s paired or unpaired t tests or analysis of variance (ANOVA) followed by New- man-Keuls for multiple comparisons. Drugs were obtained from the following sources: A-61603, Tocris Cookson Ltd, UK, cocaine (Cocainum Hydrochlor- icum puriss.) C.H. Boehringer, Germany; buspirone hydro- -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 10 20 30 phenylephrine methoxamine control (open) reserpinised (closed) a log [phenethylamines] M T en si on ( m N ) -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 10 20 30 control (open) reserpinised (closed) b oxymetazoline A 61603 log [imidazolines] M T en si on ( m N ) -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0 10 20 c control reserpinised log [buspirone] M T en si on ( m N ) Fig. 1 Concentration-response curves obtained for phenethylamine (a, phenylephrine and methoxamine) and imidazoline (b, A-61603 and oxymetazoline) agonists and buspirone (c) in rings from proximal segments of the tail artery of control and reserpinised rats. Each symbol represents the mean, and the vertical line, when greater than the symbol, represents the standard error of mean of four to 14 experiments Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol (2007) 376:117–126 119 chloride, corticosterone, phenylephrine and methoxamine from Sigma Chemical Co, USA; BMY-7378, oxymetazoline HCl, prazosin HCl, (±)-propranolol HCl and yohimbine HCl from Research Biochemicals Inc. (RBI/SIGMA), USA. Total RNA extraction A proximal segment of the ventral artery of the rat tail (taken from the initial 4 cm of the tail, corresponding to those isolated for functional studies) was rapidly dissected, cleaned of connective and fat tissue in ice-cold saline (0.9% NaCl), and the endothelium was removed by gentle rubbing with stainless steel wire in the lumen. These segments of the tail artery were homogenised in TRIzol (Invitrogen, São Paulo, Brazil) with a Polytron, and total RNAwas extracted according to the recommended protocol from a pool of samples composed by tissues from four animals. Total RNA concentration was measured by absorbance at 260 nm (BioPhotomether-Eppendorf). Semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) The sequence of the specific primers were described by Queiroz et al. (Queiroz et al. 2002) as follow: α1a sense, GTA GCC AAG AGA GAA AGC CG (628-647) and α1a antisense, CAA CCC ACC ACG ATG CCC AG (820– 839); α1b sense, GCT CCT TCT ACA TCC CGC TCG (629–649), and α1b antisense, AGG GGA GCC AAC ATA AGA TGA (908–928); α1d sense, CGT GTG CTC CTT CTA CCT ACC (759–779), and α1d antisense, GCA CAG GAC GAA GAG ACC CAC (1042–1062); GAPDH sense, CGG GAA GCT TGT GAT CAA TGG (258–277) and GAPDH antisense, GGC AGT GAT GCC ATG GAC TG (614–595). The size expected for the amplified products are 212, 300, 304 and 357 base pairs for α1a, α1b, α1d and GAPDH genes, respectively. The GAPDH gene was used as an internal control for data normalisation. To remove contaminating genomic DNA, 1 μg of total RNA was treated with DNAse I (Invitrogen, São Paulo, Brazil), and reverse transcription was then performed with 8 μl of the DNAse-treated RNA solution using a SUPER- Script III RT kit (Invitrogen, São Paulo, Brazil) according to manufacturer’s instructions. Polymerase chain reaction (PCR) was performed on 2 μl (each of the α1-adrenoceptors subtypes) or 0.5 μl (for GAPDH) of cDNA in a PCR mastermix containing 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM deoxyribonucleotides (dNTPs), 0.4 μM (for α1-adrenoceptors subtypes) or 1.6 μM (for GAPDH) specific primers, 1.25 units Taq DNA polymerase (Invitrogen, São Paulo, Brazil) and H2O in a total volume of 25 μl. PCR conditions for α1-adrenoceptors subtypes were adapted from (Queiroz et al. 2002) as follow: one cycle of denaturation 96° C, 30 s, followed by 29 cycles of denaturation 96°C, 10 s; annealing 58°C (α1a) or 55°C (α1b , α1d ), 10 s; extension 74°C, 40 s (α1b , α1d ) or 15 s (α1a). A final extension of 74°C, 2 min was performed for all samples. GAPDH was amplified under one cycle of denaturation 94°C, 3 min; followed by 33 cycles of denaturation 94°C, 45 s; annealing 60°C, 45 s; extension 70°C, 1 min. PCR products (15 μl) were separated in 1.5% agarose gel, stained with ethidium bromide and visualised under ultraviolet light and digitalised with Image Master VDS (Pharmacia Biotech, D&R, Israel). Band intensities were measured by computerised densitometry using the Image Gauge V.3.12 software (FujiFilm) and were expressed as arbitrary units (AU). Semiquantitative RT-PCR was vali- dated by choosing the number of PCR cycles and amount of RNA within the linear range of the amplification curve for each gene. Experiments were performed on three independent pools, and the mean ± SEM were compared. Results General effects of reserpine The rats treated with reserpine presented the characteristic reduction in locomotor activity, ptosis, piloerection, diar- rhoea and reduction of body weight (27%, n=24, p<0.05). Table 1 Parameters of agonist action in rings isolated from proximal segments of the tail artery from control and reserpinised rats Phenethylamines Imidazolines Phenylephrine (n=8–12) Methoxamine (n= 6–7) A-61603 (n=4) Oxymetazoline (n=8–14) Buspirone (n=4–6) pD2 Control 7.3±0.1 5.8±0.1 8.7±0.1 8.0±0.1 6.5±0.1 Reserpinised 8.1±0.1* 6.3±0.1* 8.7±0.1 8.1±0.1 7.1±0.1* Emax (millinewtons) Control 32.3±1.6 27.1±1.6 28.7±1.9 17.1±1.5 19.7±1.3 Reserpinised 34.7± 3.3 28.9±1.6 23.2±3.1 15.3±1.1 20.2±3.1 Values are mean ± standard error of mean of n independent experiments *Different from the respective pD2 found in rings from control rats (p<0.05). 120 Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol (2007) 376:117–126 The mortality rate in the group of rats treated with reserpine was 14% (six deaths in 44 rats), whereas during the same period, there was no mortality in the control group (treated with vehicle, n=24). Effects of selective and nonselective agonists in the tail arteries from control and reserpinised rats Figure 1 shows concentration-response curves obtained in rings from proximal segments of tail arteries from control and reserpinised rats in response to the phenethylamines phenylephrine and methoxamine (Fig. 1a), to the selective α1A-adrenoceptor agonists A-61603 and oxymetazoline (Minneman et al. 1994; Knepper et al. 1995) (Fig. 1b), and to the selective α1D-adrenoceptor agonist buspirone (Eltze et al. 1999; Yamamoto and Koike 2001) (Fig. 1c). The pD2 and maximal contractions (in mN) are shown in Table 1. Phenylephrine and methoxamine were approxi- mately three to six times more potent in tail arteries from reserpinised rats than in control rats (Fig. 1a, Table 1), whereas the imidazolines A-61603 and oxymetazoline were equipotent in rings from arteries of both control and reserpinised rats (Fig. 1b, Table 1). Buspirone was approximately four times more potent in the tail artery from reserpinised rats (Fig. 1c, Table 1). The maximal contractions induced by the agonists in rings from control rats were not different from those induced in rings from reserpinised rats (p>0.05, Table 1). -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 25 50 75 100 0 1 3 10 30 prazosin [nM]: a log [phenylephrine] M co nt ra ct io n (% ) -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 25 50 75 100 prazosin [nM]: b 1 3 10 30 0 log [phenylephrine] M co nt ra ct io n (% ) -10 -9 -8 -7 0 1 2 control reserpinezed c log [prazosin] M lo g (C R -1 ) -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 25 50 75 100 5-m-urapidil [nM]: d 0 10 30 300 100 log [phenylephrine] M co nt ra ct io n (% ) -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 25 50 75 100 5-m-urapidil [nM]: e 10 30 100 300 0 log [phenylephrine] M co nt ra ct io n (% ) -9 -8 -7 -6 0 1 2 control reserpinezed f log [5-m-urapidil] M lo g (C R -1 ) -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 25 50 75 100 BMY 7378 [μM]: g 0.01 0.03 0.1 0.3 0 1 3 log [phenylephrine] M co nt ra ct io n (% ) -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 25 50 75 100 BMY 7378 [μM]: h 0.03 0.1 0.01 0.3 1 3 0 log [phenylephrine] M co nt ra ct io n (% ) -8 -7 -6 0 1 2 i control reserpinized log [BMY 7378] M lo g (C R -1 ) Fig. 2 Effects of increasing concentrations of prazosin (a, b), 5- methylurapidil (d, e) and BMY-7378 (g, h) on concentration-response curves to phenylephrine in rings from proximal segments of the tail artery of control (a, d, g) and reserpinised (b, e, h) rats. Each symbol represents the mean, and the vertical line, when greater than the symbol, the standard error of mean (SEM) of four experiments. Schild plots for the antagonism of contractions induced by phenylephrine by prazosin (c), 5-methylurapidil (f) and BMY-7378 (i) in rings from proximal segments of the tail artery of control and reserpinised rats. Each symbol represents the mean, and the vertical line, when greater than the symbol, the SEM of four to six individual experiments Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol (2007) 376:117–126 121 Effects of adrenoceptor antagonists on contractions induced by phenylephrine in tail arteries from control and reserpinised rats The actions of prazosin, 5-methylurapidil and BMY-7378 were investigated against the contractions induced by phenylephrine in rings from proximal segments of tail arteries from control and reserpinised rats. Prazosin behaved as a competitive antagonist against the contrac- tions induced by phenylephrine, showing similar affinities in tail arteries from control and reserpinised rats (Fig. 2a,b, and Table 2). Similarly, 5-methylurapidil, a selective antagonist of α1A-adrenoceptors, also behaved as a com- petitive antagonist and was equipotent in tail arteries from control and reserpinised rats (Fig. 2d and e). However, the α1D-adrenoceptor-selective antagonist BMY-7378 pre- sented complex antagonism of the contractions of tail arteries from both control and reserpinised rats in response to phenylephrine (Fig. 2g,h). These complex antagonisms were characterised by the effectiveness of the low concen- trations of BMY-7378 (10–300 nM), which induced rightward shifts in the concentrations-response curves to phenylephrine that where concentration dependent but not linearly related; i.e. in this concentration range, a threefold increase in BMY-7378 did not result in a threefold reduction in the potency of phenylephrine, as predicted by the dynamics of the competitive antagonism at a single receptor. The Schild plots resulted in lines with slopes much lower than 1.0 (Fig. 2i, Table 2). Similar results were obtained with methoxamine (data not shown). Effects of BMY-7378 on contractions induced by selective adrenoceptor agonists The effects of BMY-7378 on contractions induced by A- 61603, oxymetazoline and buspirone in tail arteries from control and reserpinised rats were determined to further investigate the α1-adrenoceptor subtypes activated by the selective agonists. In contrast to what was observed with phenylephrine, the contractions induced by the imidazolines A-61603 (Fig. 3a,b for tail arteries from control and reserpinised rats, respectively) and oxymetazoline (Fig. 3c,d for tail arteries from control and reserpinised rats, respec- tively) were competitively antagonised by BMY-7378 with low pA2 values (≈6.5, Table 3). On the other hand, the contractions induced by buspirone where also competitively antagonised by BMY-7378 (Fig. 3e, f for tail arteries from control and reserpinised rats, respectively), but with affinity approximately 80-fold higher (pA2≈8.4, Table 3). Expression of mRNA for α1-adrenoceptor subtypes in different segments of the rat tail artery The mRNA encoding each of the α1-adrenoceptor subtypes was amplified by RT-PCR from total RNA extracted from proximal segments of tail arteries of control and reserpi- nised rats using specific primers for each subtype. The amplified products were separated by agarose gel electro- phoresis, quantified by densitometry and compared with the mRNA encoding GAPDH. This semiquantitative procedure allows convenient comparisons of the expression levels of mRNA for the same receptor subtype in arteries from control and reserpinised rats. However, this procedure does not allow comparisons of the expression levels among different receptor subtypes. Figure 4 shows that the relative expressions of transcripts for α1A- and α1B-adrenoceptors in the rat tail artery are not affected by reserpinisation. However, the relative expression of α1D-adrenoceptor mRNA in proximal segments of tail arteries from reserpi- nised rats was approximately twice as high as that in control rats (p<0.05). Discussion This study investigates the effects of subtype-selective and nonselective α1-adrenoceptor agonists in proximal seg- ments of tail arteries from control and reserpinised rats. We recently showed that contractions of the tail artery in response to α1-adrenoceptor agonists are predominantly mediated by α1A-adrenoceptors, but depending on the segment of the tail from which the arterial preparation is Table 2 Parameters of antagonist action against contractions induced by phenylephrine in rings isolated from proximal segments of the tail artery from control and reserpinised rats Prazosin 5-methylurapidil BMY-7378 pA2 Slope pA2 Slope pKBa Slope Control 9.7±0.2 0.9±0.1 8.2±0.1 0.9±0.1 8.3±0.2 0.6±0.1* Reserpinised 9.3±0.2 1.1±0.1 8.3±0.2 0.9±0.1 8.2±0.2 0.7±0.1* Values are mean ± standard error of mean of four to six independent determinations *Different from the theoretical unity (p<0.05). aWhen the slope was different from 1.0, the potency of the antagonist was estimated through the formula pKB ¼ log r � 1ð Þ � log [lowest effective molar concentration of the antagonist (M)]. 122 Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol (2007) 376:117–126 isolated, either α1B- or α1D-adrenoceptor can be found to coparticipate with α1A-adrenoceptors (Jahnichen et al. 2004; Kamikihara et al. 2005). There is significant coparticipation of α1D-adrenoceptors in rings taken from proximal segments and α1B-adrenoceptors in rings from distal segments. It has been shown that chemical sympathectomy with reserpine induces specific expression of α1D-adrenoceptors in this artery (Taki et al. 2004). In our experiments, the arterial rings taken from proximal segments of the tail artery from reserpinised rats were three- to fivefold more sensitive to phenylephrine and methoxamine than rings taken from control rats. However, A-61603 and oxymetazo- line were equipotent in tail arteries from control and reserpinised rats. These results show that the supersensitiv- ity induced by chemical sympathectomy with reserpine is not a phenomenon that can be generalised to all α1- adrenoceptors agonists. In addition, the supersensitivty a log [A 61603] M -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 25 50 75 100 0 0.3 1 3 10 BMY 7378 [μM]: C on tr ac tio n (% ) b log [A 61603] M -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 25 50 75 100 BMY 7378 [μM]: 0 0.3 1 3 10C on tr ac tio n (% ) c -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0 25 50 75 100 BMY 7378 [μM]: 0.3 1 3 10 0 log [oxymetazoline] M C on tr ac tio n (% ) d -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0 25 50 75 100 BMY 7378 [μM]: 0.3 1 3 10 0 log [oxymetazoline] M C on tr ac tio n (% ) e -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0 25 50 75 100 BMY 7378 [nM]: 10 30 100 300 0 log [buspirone] M C on tr ac tio n (% ) f -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0 25 50 75 100 BMY 7378 [nM]: 10 30 100 300 0 log [buspirone] M C on tr ac tio n (% ) -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 1 2 A 61603 oxymetazoline buspirone control (open) reserpinized (closed) g log [BMY 7378] M lo g (C R -1 ) Fig. 3 Effects of increasing concentrations of BMY-7378 on concentration-response curves to A-61603 (a, b), oxy- metazoline (c, d) and buspirone (e, f) in rings from proximal segments of the tail artery of control (a, c, e) and reserpinised (b, d, f) rats. The Schild plot for the antagonism of these con- tractions by BMY-7378 is pre- sented in (g). Each symbol represents the mean, and the vertical line, when greater than the symbol, the standard error of mean of four to 12 experiments Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol (2007) 376:117–126 123 induced by reserpine does not involve α1A-adrenoceptors, as A-61603 and oxymetazoline are selective agonists of α1A-adrenoceptors (Knepper et al. 1995; Minneman et al. 1994). The fact that the tail artery from reserpinised rats was more sensitive to the selective α1D-adrenoceptor agonist buspirone than the tail artery from control rats also supports the specific involvement of α1D-adrenoceptors in the supersensitivity induced by reserpine. The effects of subtype-selective and nonselective α1- adrenoceptor antagonists in proximal segments of tail arteries from control and reserpinised rats were also investigated to check whether these compounds would be useful to identify the α1-adrenoceptors involved in the supersensitivity induced by reserpine. The contractions induced by phenylephrine in tail arteries from control and reserpinised rats were similarly antagonised by prazosin. These were not unexpected results, as prazosin is a nonselective antagonist of α1-adrenoceptors subtypes. Inter- estingly, 5-methyl urapidil, a selective antagonist of α1A- adrenoceptors, also presented similar antagonism of the contractions induced by phenylephrine in tail arteries from control and reserpinised rats. One would expect that 5- methyl-urapidil should detect the increased participation of α1D-adrenoceptors in the contractions of tail arteries from reserpinised rats. The similar antagonism presented by 5- methyl urapidil in tail arteries from control and reserpinised rats may result from the relatively low selectivity of this drug for α1A- over α1D-adrenoceptors. Whereas the affinity of 5- methyl urapidil for α1A-adrenoceptors is approximately 30- to 100-fold higher than for α1B-adrenoceptors, its affinity for α1D-adrenoceptors is only three- to tenfold lower than that for α1A-adrenoceptors. On the other hand, the participation of α1D-adrenoceptors in the contractions of tail arteries from both control and reserpinised rats is promptly detected by the effects of the α1D-selective antagonist BMY-7378. This selective antagonist discriminated two different components in the contractions of proximal segments of tail arteries from both control and reserpinised rats in response to phenyleph- rine: the first component was blocked by “low” concen- trations of BMY-7378 (10–300 nM), whereas the second was competitively antagonised by higher concentrations (1– 10 μM); the pKB estimated from the lowest effective concentration of BMY-7378 (10 nM) through the formula pKB ¼ � log BMY � 7378 Mð Þ½ � þ log r � 1ð Þ in tail arter- ies from control (8.2±0.1, n=4) and reserpinised rats (8.5± 0.1, n=4) indicates that part of the contractions of proximal segments of tail arteries from both control and reserpinised rats results from the activation of α1D-adrenoceptors. Conversely, if only the effects of 0.3–10 μM are used to construct the Schild plots, the slopes are not different from unity (1.2±0.1 in tail artery from control rats and 1.2±0.1 in tail artery from reserpinised rats), but the derived pA2 (6.9± 0.1 in tail artery from control rats and 6.8±0.1 in tail artery from reserpinised rats) is much lower than that expected for the involvement of α1D-adrenoceptors. It is important to note that although the antagonism presented by BMY-7378 allowed the prompt detection of α1D-adrenoceptors, this antagonist was unable to uncover the increased involvement of α1D-adrenoceptors in the contractions of tail arteries from reserpinised rats. The actions of BMY-7378 on the contractions induced by the selective agonists A-61603, oxymetazoline (α1A-selec- tive) and buspirone (α1D-selective) further support the involvement of multiple α1-adrenoceptors in the contractions 0.00 0.25 0.50 0.75 control reserpinised α1A α1B α1D * α 1 -A R /G A P D H m R N A Fig. 4 Expression of mRNA encoding each of the α1-adrenoceptors in relation to that for GAPDH in rings from proximal segments of the tail artery of control and reserpinised rats. * p<0.05 in relation to the respective mRNA expression found in proximal segments of tail arteries from control rats Table 3 Antagonism of contractions induced by different agonists in proximal segments of the tail artery from control and reserpinised rats by BMY-7378 BMY-7378 vs. A-61603 Oxymetazoline Buspirone pA2 Slope pA2 Slope pA2 Slope Control 6.6±0.1 1.2±0.1 6.4±0.1 0.9±0.1 8.3±0.2 0.8±0.1 Reserpinised 6.5±0.1 1.2±0.2 6.5±0.1 0.9±0.2 8.5±0.2 0.9±0.1 Values are mean ± standard error of mean of four to six independent determinations 124 Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol (2