� � UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU TURNOVER ISOTÓPICO DO 13C EM AVES POEDEIRAS ADRIELE NAYARA DIAS ISHIZUKA Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre BOTUCATU - SP JUNHO - 2014 � � UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU TURNOVER ISOTÓPICO DO 13C EM AVES POEDEIRAS ADRIELE NAYARA DIAS ISHIZUKA MÉDICA VETERINÁRIA Orientador: Prof. Dr. Carlos Ducatti Co-orientadora: Profa. Dra. Juliana Célia Denadai Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre � � � � � � � � � BOTUCATU - SP JUNHO - 2014 Ishizuka, Adriele Nayara Dias. Turnover isotópico do 13C em aves poedeiras / Adriele Nayara Dias Ishizuka. - Botucatu, 2014 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: Carlos Ducatti Coorientador: Juliana Célia denadai Capes: 50405004 1. Ave poedeira. 2. Análise por diluição isotópica. 3. Isótopos estáveis. 4. Sangue - Análise e quimica. 5. Carbono 13. Palavras-chave: Aves; Carbono-13; Diluição isotópica; Isótopos estáveis; Sangue. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE - CRB 8/5651 �� � DEDICATÓRIA À DEUS, por todas bençãos recebidas, principalmente por este mestrado. À NOSSA SENHORA DA APARECIDA, por todas as graças concedidas. AOS MEUS PAIS, Lindalva Dias e Jorge Ishizuka por tudo que fizeram por mim, por me apoiarem e estarem sempre comigo. AO MEU IRMÃO, José Guilherme Ishizuka por ser meu companheiro e amigo. À MINHA VÓ, Terezinha Soares Rosa por ser um exemplo de luta. AO MEU NAMORADO, Marco Antônio Gonzales de Carvalho por ter deixado tudo para vir fazer parte deste sonho e por você ser tão especial para mim. À DÓRIS, pelo seu amor incondicional e puro! ��� � AGRADECIMENTOS À FAPESP, pela bolsa de Mestrado (processo n° 2012/09422-2) e auxílio financeiro (projeto temático n° 2008/57411-4) concedidos para execução do projeto. À CAPES, pela bolsa de estudo concedida, anteriormente à FAPESP. Ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/UNESP-Botucatu, pela oportunidade e por acreditatem em mim. Ao Prof. Dr. Carlos Ducatti, pela amizade, orientação, confiança e conselhos. Ao Prof. Dr. Antonio Celso Pezzato e Prof. Dr. José Roberto Sartori pelo apoio, incentivo e instruções quando procurei a Pós-graduação no início de tudo. À Profa. Dra. Juliana Célia Denadai, por ser mais do que minha co-orientadora, ser minha amiga, dividir seus conhecimentos e acreditar em mim. À Profa. Dra. Maria Márcia Pereira Sartori, pela amizade, carinho, conselhos, análises estatísticas, enfim, por toda atenção, apoio e ensinamentos. Ao Prof. Dr. Edivaldo Antônio Garcia, pela parceria, instalações do experimento, estágio docência e ensinamentos. Aos funcionários da Seção de Pós-graduação da FMVZ Seila Cristina Cassineli, Ellen Cassemiro Guilhen e Carlos Pazini, pela atenção, paciência e auxílios prestados. Aos meus grandes amigos do Centro de Isótopos Estáveis Ambientais IBB/UNESP, Evandro Tadeu Silva, Cibele Regina de Souza-Kruliski, Silvia Américo Maschette e Mariana Sasso Andreasi por me acolherem, pela grande amizade construída ao longo destes anos, pela paciência e por me ajudarem de coração em tudo. À Tânia Maria Santarém Gonzales e Carlos Augusto Rosa pelo acolhimento, amor e paciência. Aos meus amigos isotópicos, que fazem parte do Centro de Isótopos Estáveis Ambientais IBB/UNESP, Marco Antônio Gonzales de Carvalho, Bárbara Cristina da Silva Fernandes, Vanessa Cristina Pelícia, Priscila Cavalca de Araujo, Luciene Seraphim, Vânia Fornou, Ana Cristina Stradiotti, Michelle Ravelli, Marcela Buosi Martins, Rhani Ducatti, Guilherme Emygdio Mendes Pimenta e Jéssica Conteçote Russo. E a todos que me ajudaram a tornar este sonho em realidade. ���� � SUMÁRIO Página CAPÍTULO 1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS ................................................................. 1� 1.� Revisão de literatura ............................................................................................... 2� 1.1.� O ovo como alimento ...................................................................................... 2� 1.2.� Formação dos ovos ......................................................................................... 4� 1.3.� Isótopos estáveis ............................................................................................. 5� 1.4.� Plantas ............................................................................................................. 6� 1.5.� Isótopos estáveis em avicultura ...................................................................... 7� 1.6.� Turnover.......................................................................................................... 8� 1.7.� Justificativas e objetivos ............................................................................... 10� 2.� Referências bibliográficas .................................................................................... 11� CAPÍTULO 2 TURNOVER ISOTÓPICO DO 13C EM SANGUE DE GALINHAS POEDEIRAS NA FASE DE PRÉ-POSTURA E FASE INICIAL DE POSTURA ...... 18� Resumo .................................................................................................................. 19� Abstract ................................................................................................................. 20� Introdução .......................................................................................................... 21� Material e Métodos ............................................................................................ 22� Resultados e Discussão ...................................................................................... 28� Conclusão........................................................................................................... 36� Agradecimentos ................................................................................................. 37� Referências......................................................................................................... 37� Tabelas ............................................................................................................... 42� CAPÍTULO 3 VARIAÇÃO ISOTÓPICA DO 13C EM OVOS DE GALINHAS POEDEIRAS NA FASE INICIAL DE POSTURA ........................................................ 44� Resumo .................................................................................................................. 45� Abstract ................................................................................................................. 46� Introdução .......................................................................................................... 47� Material e Métodos ............................................................................................ 48� Resultados e Discussão ...................................................................................... 54� Conclusão........................................................................................................... 63� Agradecimentos ................................................................................................. 64� ��� � Referências......................................................................................................... 64� Tabelas ............................................................................................................... 68� CAPÍTULO 4 IMPLICAÇÕES ...................................................................................... 70� 1.� Implicações .......................................................................................................... 71� �� � LISTA DE TABELAS Página CAPÍTULO 2 Tabela 1. Composição percentual dos ingredientes, níveis nutricionais calculados e valor isotópico das dietas experimentais da fase de pré-postura e postura inicial. ........................................................................................................... 42� Tabela 2. Valores isotópicos do �13C, expressos em ‰, dos tecidos amostrados no início e no fim dos períodos experimentais, a partir da substituição das dietas e os valores calculados de meia-vida (t(50%)) e troca total dos átomos de carbono (t(99%)), em unidade de dias. ....................................................... 43� CAPÍTULO 3 Tabela 1. Composição percentual dos ingredientes, níveis nutricionais calculados e valor isotópico das dietas experimentais na fase inicial da postura. ............ 68 Tabela 2. Valores isotópicos do �13C, expressos em ‰, do ovo e suas frações amostrados no início e no fim do período experimental, a partir da substituição das dietas e os valores calculados de meia-vida (t(50%)), e troca total dos átomos de carbono (t(99%)), em unidade de dias. ............................ 69 Tabela 3. Fator de fracionamento isotópico, expresso em ‰, do ovo e suas frações no fim do período experimental (∆= δ tecido - δ dieta). .................................. 69 ��� � LISTA DE FIGURAS Página CAPÍTULO 2 Figura 1. Curvas de turnover dos isótopos estáveis de carbono-13 em função do tempo de coleta no sangue das poedeiras na fase de pré-postura, alimentadas com dietas à base de quirera de arroz e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (ASFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (ASFCO). .............. 29� Figura 2. Curvas de turnover dos isótopos estáveis de carbono-13 em função do tempo de coleta no sangue das poedeiras no início da postura, alimentadas na pré-postura com dietas à base de quirera de arroz e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (ASFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (ASFCO), alternando para dietas à base de milho moído e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (MSFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (MSFCO). ..................................................................................................... 30� Figura 3. Curvas de turnover dos isótopos estáveis de carbono-13 em função do tempo de coleta no plasma das poedeiras na fase de pré-postura, alimentadas com dietas à base de quirera de arroz e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (ASFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (ASFCO). .............. 33� Figura 4. Curvas de turnover dos isótopos estáveis de carbono-13 em função do tempo de coleta no plasma das poedeiras no início da postura. alimentadas na pré-postura com dietas à base de quirera de arroz e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (ASFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (ASFCO), alternando para dietas à base de milho moído e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (MSFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (MSFCO). ..................................................................................................... 34� ���� � Página CAPÍTULO 3 Figura 1. Curvas de turnover dos isótopos estáveis de carbono-13 em função do tempo de coleta no ovo das poedeiras no início da postura, alimentadas no período pré-experimental com dietas à base de quirera de arroz e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (ASFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (ASFCO), alternadas para dietas à base de milho moído e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (MSFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (MSFCO) no período experimental. ............................................................ 56� Figura 2. Curvas de turnover dos isótopos estáveis de carbono-13 em função do tempo de coleta no albúmen dos ovos das poedeiras no início da postura, alimentadas no período pré-experimental com dietas à base de quirera de arroz e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (ASFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (ASFCO), alternadas para dietas à base de milho moído e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (MSFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (MSFCO) no período experimental. ......................... 57� Figura 3. Curvas de turnover dos isótopos estáveis de carbono-13 em função do tempo de coleta na gema dos ovos das poedeiras no início da postura, alimentadas no período pré-experimental com dietas à base de quirera de arroz e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (ASFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (ASFCO), alternadas para dietas à base de milho moído e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (MSFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (MSFCO) no período experimental. ......................... 58� Figura 4. Representação visual do turnover isotópico do carbono-13 na gema do ovo de galinha coletado e cozido nos dias 0, 7, 10 e 14 após a troca da dieta C3 para C4, com os valores isotópicos médios. ................................................. 61� 1 � CAPÍTULO 1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS 2 � 1. Revisão de literatura 1.1. O ovo como alimento O ovo é considerado um alimento nutricionalmente completo e ideal para o consumo, pois reúne mais de 14 vitaminas e minerais, tais como vitaminas B12 e A, ácido fólico, riboflavina, selênio, colina, e os carotenóides luteína e zeaxantina que lhe confere propriedades antioxidantes. Além de ser uma das poucas fontes exógenas de vitaminas K e D (AGUIAR; ZAFFARI; HÜBSCHER, 2009; HERRON; FERNANDEZ, 2004). Para demonstrar seu incontestável valor biológico, o ovo pode ser comparado ao leite materno. Também se destaca como fonte proteica de origem animal de alta qualidade e baixo valor calórico, que fornece aos mamíferos os aminoácidos essenciais cujo organismo é incapaz de sintetizar. Até mesmo o colesterol presente em sua gema apresenta propriedades fisiológicas importantes, por ser integrante da estrutura das membranas celulares e estar relacionado à síntese de hormônios esteróides, ácido biliar e vitamina D (NOVELLO et al., 2006). Sua excelente qualidade nutricional é elucidada pelo seu papel original de câmara embrionária provedora de componentes necessários para o desenvolvimento da ave, ou seja, da vida. Estes componentes tornam o ovo fonte de princípios ativos utilizáveis por médicos, farmacêuticos e pelas indústrias de cosméticos e biotecnologia (ANTON; NAU; NYS, 2006). O ovo também é considerado ingrediente polifuncional devido seu potencial de gelificação, emulsificação, formador de espuma, corantes, aromatizantes e outras especialidades que contribuem para a textura e as características organolépticas dos alimentos (ROSSI et al., 2010). Outra característica deste alimento é que seu sistema de produção gera uma proteína de origem animal mais sustentável do que outras produções de alimentos ricos em proteínas, como a carne bovina (ROCK, 2012). Por se tratar de alimento tradicional, de fácil acesso, baixo custo e versátil na culinária, o ovo apresenta ascensão em sua popularidade. Ao longo da ultima década, a produção mundial aumentou 25% (FAO, 2011) e até 2015 é esperada taxa de 3 � crescimento anual de aproximadamente 2%. Este crescimento pode ser atribuído aos países asiáticos, produtores tradicionais, que representam mais de 60% da produção mundial (PASCALE, 2010). Dentre os principais produtores mundiais, destaca-se a China, por abranger 60% do crescimento mundial da produção de ovos, nos últimos 10 anos (PASCALE, 2010). A China é seguida pelos Estados Unidos e Índia, enquanto o Brasil segue em sétimo lugar com produção de 2,03 milhões de tonelada de ovos (FAO, 2011). Segundo dados da União Brasileira de Avicultura (UBABEF), em 2012 as exportações brasileiras de ovos somaram 26,8 mil toneladas, tendo como principais regiões de destino a África com 14,1 mil toneladas e o Oriente Médio com 10,7 mil toneladas. O mercado interno brasileiro foi responsável pelo consumo de 99% da produção total de ovos, sendo a média de 161 ovos per capita (UBABEF, 2013). O aumento no consumo de ovos nos últimos dez anos foi resultado da desmistificação dos riscos à saúde que poderiam ser causados pelo colesterol do ovo, já que vários estudos não obtiveram relação entre o risco de cardiopatias em pessoas saudáveis com o consumo de ovos (NOVELLO et al., 2006), e da maior disponibilidade deste alimento em churrascarias, restaurantes, bares, lanchonetes e em supermercados, onde existem ovos beneficiados descascados ou em conservas, prontos para o consumo a preços acessíveis (COSTA et al., 2007; MÓRI et al., 2005). Contudo, em decorrência das consecutivas crises sanitárias que assolaram a Europa, como a crise da salmonela, crise da Encefalopatia Espongiforme Bovina – EEB, contaminações por dioxina, febre aftosa e a gripe aviária, nos dias de hoje, tanto os consumidores internos como os externos estão mais atentos e exigentes em relação à procedência dos alimentos que adquirem (CARFANTAN; BRUM, 2006). Apesar desta apreensão relacionada à ingestão de alimentos contaminados ter se desencadeado nos anos 90 (COSTA; EUCLIDES FILHO, 2005; MALUF; MENEZES; VALENTE, 1996) a mudança no perfil dos consumidores iniciou-se desde meados da década de 1970 onde surgiu a necessidade da implementação das boas práticas e monitoramento da produção de alimentos durante todas as etapas de produção e também a preocupação com o meio ambiente e o bem-estar animal (COSTA; EUCLIDES FILHO, 2005). 4 � A qualidade e a segurança alimentar são de fato preocupação mundial crescente, visto que a ocorrência de fraudes neste cenário também é muito frequente. Na China, só na primeira metade de 2012, foram registrados 15 mil casos de violação das leis de segurança alimentar. Inclusive este país vivencia epidemia de alimentos falsificados e adulterados, como o golpe lucrativo envolvendo a venda de ovos falsos e mortíferos a partir da mistura de gelatina, resina, parafina, gesso, corante e outras substâncias perigosas como óxido de alumínio que pode causar danos mentais (SILVEIRA, 2013). Deste modo, ferramentas que possibilitem sustentar a confiança dos consumidores, como a técnica dos isótopos estáveis são muito importantes. 1.2. Formação dos ovos Quando a ave atinge a maturidade sexual, quatro a seis oócitos aumentam de diâmetro e é estabelecida a hierarquia folicular designada “Categorias F.Folículos” em função da hierarquia, ou posição de desenvolvimento (F1, F2, F3, F4, etc), sendo F1 o folículo de maior diâmetro e o próximo a ovular, F2 ovulará no dia seguinte e assim sucessivamente (SESTI, 2003). Os folículos hierárquicos são selecionados a partir de pequeno grupo de pequenos folículos em desenvolvimento ou folículos não hierárquicos: Folículos Brancos Pequenos (FPB), Folículos Brancos Grandes (FBG), e Folículos Amarelos Pequenos (FAP). Estas denominações são derivadas do acúmulo em camadas concêntricas de vitelo branco ou amarelo produzido pelo fígado e transportado no sangue para serem incorporados aos folículos no ovário (JOHNSON, 2006; SESTI, 2003). A vitelogênese ou formação da gema consiste em processo longo que começa no momento da eclosão com a fase de crescimento lento, seguida por fase de crescimento intermediário e por fim pela fase de grande crescimento, sendo que esta última etapa tem duração de 8 a 10 dias antes da ovulação e o peso passa de 200 mg para cerca de 17g (COTTA, 1997). Nas galinhas o ciclo ovulatório é determinado principalmente pelo fotoperíodo. Quando a percepção de luz pelas aves é superior a 12 horas ocorre a estimulação dos fotorreceptores hipotalâmicos que ativam seus neurônios para secretar o hormônio de 5 � liberação de gonadotropina (GnRH). O GnRH é então transportado para a hipófise, a qual em reposta secreta o hormônio folículo estimulante (FSH), que atua aumentando o tamanho dos folículos e o hormônio luteinizante (LH), que estimula a saída do oócito de seu folículo (JOHNSON, 2006). O ovo inicia sua formação no ovário e vai se completando à medida que caminha nos diferentes compartimentos do oviduto, sendo necessárias aproximadamente 25 a 26 horas entre a liberação do oócito e a expulsão do ovo completo. O oviduto esquerdo é um tubo convoluto dividido em cinco regiões anatomicamente distinguíveis: infundíbulo, magno, istmo, útero e vagina. O infundíbulo consiste de um funil seguido por uma porção tubular e tem a função de captar o oócito e servir de sede para a fecundação, nesta porção o ovo em formação fica por volta de 18 minutos. No magno ocorre a formação de 80% do albúmen do ovo, neste segmento o ovo permanece 3 horas. O istmo é responsável por formar as duas membranas do ovo durante 90 minutos. No útero ocorre a finalização do albúmen e a formação da casca do ovo, o tempo de permanência nesta porção do oviduto pode variar entre 18 a 22 horas e por último a vagina, que serve de passagem do ovo para o meio externo (GÜRTLER et al., 1984; JOHNSON, 2006; SESTI, 2003). 1.3. Isótopos estáveis O termo isótopo vem do grego ISO (mesmo ou igual) e TOPOS (lugar), referindo-se ao fato de que ocupam o mesmo lugar na tabela periódica. Os isótopos são espécies atômicas do mesmo elemento químico (mesmo número de prótons), mas que diferem em número de nêutrons, apresentando diferentes massas. A utilização dos isótopos deve-se por estes terem características químicas semelhantes, ou seja, mesma eletrosfera, e propriedades físicas diferentes, por terem núcleos diferentes. Essa condição confere-lhes papel de traçadores naturais, pois possibilita sua passagem pelas membranas celulares de plantas e animais (DUCATTI, 2013). Por serem estáveis, ou seja, não emitirem radiações, são totalmente seguros e inofensivos para os humanos, animais e o meio-ambiente (DUCATTI, 2013; GANNES; DEL RIO; KOCH, 1998). 6 � Os isótopos podem ser explorados a partir de duas vertentes: substratos enriquecidos artificialmente, expresso em átomos % e variação na abundância natural isotópica, denotada em partes por mil (per mil, ‰) (DUCATTI, 2013; GANNES; DEL RIO; KOCH, 1998). Os compostos enriquecidos, assim como a abundância isotópica, são aplicados a diversas áreas da ciência, porém sua utilização requer altos custos (GANNES; DEL RIO; KOCH, 1998). Os isótopos estáveis do carbono (C), hidrogênio (H), oxigênio (O), nitrogênio (N) e enxofre (S) ocorrem naturalmente na atmosfera, hidrosfera, litosfera e biosfera. Cada elemento químico apresenta um isótopo estável leve, dominante: carbono-12 (12C), hidrogênio-1 (1H), oxigênio-16 (16O), nitrogênio-14 (14N) e enxofre-32 (32S) e um ou dois isótopos pesados, menos abundantes: carbono-13 (13C), hidrogênio-2 (2H), oxigênio-17 (17O), oxigênio-18 (18O), nitrogênio-15 (15N), enxofre-33 (33S) e enxofre-34 (34S) (DUCATTI, 2013). A mensuração da relação entre os isótopos estáveis do mesmo elemento químico do carbono é determinada através da espectrometria de massas, sob a forma de análise relativa, onde o enriquecimento relativo é expresso em delta (�). O resultado da razão isotópica do produto (�) é comparado a um padrão internacional, sendo que para os isótopos do carbono o padrão adotado é o Peedee Belemnite (PDB) (DUCATTI, 2013). 1.4. Plantas De acordo com o ciclo fotossintético as plantas terrestres podem ser classificadas em dois principais grupos: plantas C3 e C4, onde o primeiro composto orgânico a ser sintetizado é o ácido carboxílico, com três e quatro átomos de carbono, respectivamente. Segundo Ehleringer et al. (1991) aproximadamente 85% de todas as espécies de plantas utilizam a via C3. Dentre as plantas deste grupo estão a maioria das árvores e arbustos, a soja, o arroz, o trigo, a cevada, as frutas, as hortaliças e o algodão, entre outros. O grupo C4 engloba o milho, sorgo, cana-de-açúcar, as forrageiras e outras gramíneas tropicais ou subtropicais. As plantas com ciclo C4 discriminam menos 13CO2 ao longo da fotossíntese e, portanto, tem valores de �13C PDB maiores do que plantas C3. No geral, as plantas C3 apresentam �13C em torno de -28‰, embora haja uma variação entre -20‰ a -35‰, e as 7 � plantas C4 têm o �13C por volta de -12‰ com variação por volta de -9‰ a -16‰ (DUCATTI, 2013; O’LEARY, 1988; RUNDEL; EHLERINGER; NAGY, 1989; SMITH; EPSTEIN, 1971). Para fins ilustrativos existe ainda a interpretação genérica de uma régua isotópica com escala em �, onde o termo leve indica que a amostra analisada possui menos isótopo pesado em relação ao padrão internacional e o termo pesado sugere que a amostra apresenta mais isótopo pesado em relação ao padrão. A técnica dos isótopos estáveis tem sido muito utilizada nas áreas de fisiologia vegetal (EVANS, 2001; GLEIXNER et al., 1993), paleontologia (AMBROSE, 1990; BOCHERENS; CERLING, 2002; COLTRAIN et al., 2004; FIZET; MARIOTTI, 1994; FOGEL; HARE, 1988; HARE et al., 1991; KOHN; TUROSS;) e ecologia (FOX; FISHER, 2001; LON�ARI� et al., 2006; PETERSON; FRY, 1987) para traçar processos biológicos, químicos e físicos. Em situações onde há duas fontes alimentares isotopicamente distintas disponíveis para os animais, a análise isotópica dos tecidos dos mesmos pode fornecer informações quantitativas sobre as contribuições relativas de cada fonte para a dieta (HOBSON; CLARK, 1992), permitindo, por exemplo, comparar a participação relativa entre leguminosas e não leguminosas, ou entre organismos aquáticos e terrestres como fontes de alimento para animais ou até mesmo a reconstrução das dietas através de fósseis (DENIRO; EPSTEIN, 1978). 1.5. Isótopos estáveis em avicultura Na avicultura de postura a autenticação dos diferentes sistemas de produção tem sido validado a partir das assinaturas isotópicas dos componentes dos ovos (CAPUANO et al., 2013), conforme verificado por Van Ruth et al. (2012) que conseguiram diferenciar ovos orgânicos de ovos de celeiros e ovos de galinhas soltas e Rogers (2009) que distinguiu ovos de gaiolas e celeiros de ovos de galinhas soltas e criadas no sistema orgânico. valor negativo padrão valor positivo � mais leve mais leve 0‰ mais pesado mais pesado 8 � As análises isotópicas dos ovos e suas frações possibilitaram identificar e rastrear os ovos postos por poedeiras que consumiram apenas ração vegetal, diferenciando-os de ovos provenientes de aves cuja alimentação continha produtos de origem animal (DENADAI et al., 2005, 2011). Assim como possibilitou a detecção em ovos de codornas e suas frações a inclusão de até 1% de farinhas de origem animal na dieta dessas aves (MÓRI et al., 2013) e de diferentes farinhas de origem animal na alimentação de poedeiras comerciais pela análise do produto final (DENADAI et al., 2008, 2009). Nos últimos 30 anos a técnica dos isótopos estáveis vem sendo aplicada em diversas áreas, como na medicina humana para mensurar a atividade da tripsina pancreática no intestino delgado por meio do teste do 13C da expiração. Este teste pode ser baseado na variação isotópica natural de substratos ricos em proteínas como a caseína, algas, ovo inteiro (gema + albúmen), gema e albúmen, ou enriquecidos isotopicamente (WETZEL; FISCHER, 2005). No entanto, além de estudos de caracterização das cinéticas metabólicas (FISCHER; WETZEL, 2002), absorção e metabolização das proteínas (WETZEL; FISCHER, 2005), os isótopos estáveis também têm se mostrado muito promissores em nutrição e fisiologia animal (CARRIJO; PEZZATO; DUCATTI, 2000; GANNES; DEL RIO; KOCH, 1998; TIESZEN et al., 1983), em especial na área de avicultura, onde o atrelamento destes conhecimentos é aplicado em estudos de ovos marcados, origem geográfica das aves e certificação de sistemas de criação. 1.6. Turnover Os constituintes corporais se encontram em total estado dinâmico, sendo alterados constantemente nos tecidos do animal, processo denominado de turnover. Todas as substâncias do corpo, sejam elas metabólitos orgânicos ou inorgânicos, estão sujeitas ao turnover, que pode ocorrer por meio de renovação tecidual resultante do processo de síntese e degradação em tecidos adultos e/ou pelo próprio crescimento nos tecidos em formação (diluição isotópica). O turnover de componentes corporais e órgãos de animais podem ser mensurados a partir de dietas com assinaturas isotópicas contrastantes (GANNES; DEL 9 � RIO; KOCH, 1998), baseado no conceito de que o animal é o que ele come, ou seja, que a assinatura isotópica do animal é reflexo da composição isotópica da sua dieta (DENIRO; EPSTEIN, 1978). Neste sentido, estudos experimentais com galinhas poedeiras foram conduzidos a fim de investigar as taxas de turnover do �13C do fígado e em ovos (gema + albúmen) (CARRIJO; PEZZATO; DUCATTI, 2000) e do sangue e ovos inteiros (gema + albúmen) e de seus componentes albúmen e gema separadamente (DENADAI et al., 2006), assim como no Embora as fezes e produtos de origem animal como os ovos e o leite não sejam considerados tecidos, e por isto, não possuem renovação tecidual, o turnover nestes casos fornece indicativos da taxa de renovação dos nutrientes para a sua formação (DENADAI et al., 2006; MARTINS, 2010), sem que haja a necessidade de sacrificar os animais (HOBSON; CLARK, 1992). Nos estudos com turnover a escolha do tecido animal a ser analisado deve ser levada em consideração, devido os tecidos apresentarem diferentes taxas de substituição do carbono-13 provenientes da dieta. Tecidos metabolicamente mais ativos apresentam taxas de turnover isotópico mais rápido, logo irão indicar a dieta assimilada recentemente, enquanto os tecidos menos ativos refletem a dieta consumida em médio a longo prazo (HOBSON; CLARK, 1992; TIESZEN et al., 1983). A taxa de turnover do 13C de diferentes tecidos para codornas foram classificadas em fígado > sangue > músculo > colágeno (HOBSON; CLARK, 1992) e semelhantemente para gerbil: fígado > gordura > músculo > cérebro > cabelo (TIESZEN et al., 1983). De acordo com DeNiro e Epstein (1978) a distribuição dos isótopos de carbono através dos vários tecidos do animal não é uniforme, recomendando para pequenos organismos a utilização do animal inteiro para estimar o carbono da dieta. Alternativamente, Tieszen et al. (1983) sugerem a utilização de vários tecidos com taxa de renovação e fracionamento isotópico conhecido. Após a mudança da dieta, a alteração da composição isotópica no tecido ou corpo depende da velocidade com que esses constituintes são substituídos. A alta taxa de turnover de tecidos moles pode obscurecer a importância relativa de plantas C3 e C4 presentes em dietas distintas que variam através do tempo (TIESZEN et al., 1983). Ducatti et al. (2002), fundamentados em resultados da literatura, propuseram o modelo teórico capaz de exprimir os resultados do enriquecimento relativo do carbono (δ13C) em função do tempo de alimentação, fornecendo à animais adultos dietas 10 � contrastantes em δ13C, formuladas com grãos de plantas dos ciclos fotossintéticos C3 e C4. Partindo do pressuposto que o metabolismo de determinado tecido animal depende da taxa de entrada de compostos de carbono provenientes da dieta e da taxa de substituição dos compostos pré-existentes, os autores chegaram à seguinte equação: δ13C(t) = δ13C (f) + [δ13C (i) - δ13C(f)]e-kt (1) Onde: δ13C(t) = enriquecimento isotópico do tecido em qualquer tempo (t). Adimensional. δ13C(f) = enriquecimento isotópico do tecido no patamar de equilíbrio, ou condição final. Adimensional. δ13C(i) = enriquecimento isotópico do tecido, na condição inicial. Adimensional. k = constante de troca (turnover) em unidades de tempo-1 e t = tempo (em dias) desde a substituição da ração 1.7. Justificativas e objetivos Os dados obtidos neste estudo servirão de fundamentos para futuros experimentos de rastreabilidade de subprodutos de origem animal utilizados na composição de dietas de galinhas poedeiras, através da análise dos ovos. A taxa de turnover avaliará a velocidade que o isótopo do carbono-13 corporal será substituído e incorporado analisando sangue, plasma e ovos (gema e albúmen). A substituição avaliará também o tempo mínimo necessário para que haja a troca total do carbono (99% dos átomos trocados). O presente estudo tem por objetivo avaliar o turnover do carbono-13 pela substituição de dietas C4 por C3 e C3 por C4, em sangue e plasma de poedeiras comerciais durante a fase de pré-postura e sangue, plasma e ovos ao longo da fase inicial da postura utilizando a técnica de isótopos estáveis de carbono. O Capítulo 2, denominado “Turnover isotópico do 13C em sangue de galinhas poedeiras na fase de pré-postura e fase inicial de postura” apresenta-se de acordo com as normas para publicação na Pesquisa Agropecuária Brasileira. O objetivo deste 11 � estudo foi avaliar o turnover do carbono-13 em sangue e plasma de poedeiras comerciais na fase de pré-postura pela substituição de dietas C4 por C3 e na fase inicial de postura pela troca de dietas C3 por C4 utilizando a técnica de isótopos estáveis de carbono. O Capítulo 3, denominado “Variação isotópica do 13C em ovos de galinhas poedeiras na fase inicial de postura” apresenta-se de acordo com as normas para publicação na Pesquisa Agropecuária Brasileira. O objetivo deste estudo foi avaliar o turnover do carbono-13 pela substituição de dietas C3 por C4, em ovos inteiros (gema + albúmen) e suas frações de poedeiras comerciais durante a fase inicial da postura utilizando a técnica de isótopos estáveis de carbono. 2. Referências bibliográficas AMBROSE, S. H. Preparation and characterization of bone and tooth collagen for isotopic analysis. Journal of Archaeological Science, v. 17, n. 4, p. 431-451, 1990. AGUIAR, M. S.; ZAFFARI, S.; HÜBSCHER, G. H. 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Foram utilizadas 144 aves divididas ao acaso em 2 tratamentos na pré-postura que receberam por 42 dias dietas à base de quireta de arroz e farelo de soja, fosfato bicálcico ou farinha de carne e ossos bovinos. Na fase inicial da postura, as aves dos dois tratamentos da fase de pré postura, foram divididas em quatro tratamentos, consitituídos de dietas à base de milho moído e farelo de soja, fosfato bicálcico ou farinha de carne e ossos bovinos. Aos 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 19, 25, 32 e 42 de cada fase foram coletados sangue e plasma de 6 aves por tratamento. Os valores de meia-vida do sangue e plasma dos tratamentos ASFB e ASFCO da pré-postura foram maiores (17;4 e 15;5 dias respectivamente) do que os tratamentos ASFB-MSFB; ASFB-MSFCO; ASFCO-MSFB e MSFCO-MSFCO da postura inicial (meias-vidas de 11;10;11 e 9 para o sangue e 2;2;2 e 2 dias para o plasma). Deste modo, pode-se concluir que houve diferença da idade, mas não houve diferença em relação a dieta no turnover do sangue e plasma das aves. Termos para indexação: aves, carbono-13, diluição isotópica, Gallus gallus, isótopos estáveis, plasma 20 � Isotopic turnover of 13C on blood of laying hens during the pre-laying and laying period Abstract This study aimed to assess the turnover of carbon-13 on blood and plasma of laying hens by replacing C4 by C3 diets and C3 by C4 diets during the pre-laying period and initial laying period using the technique of stable carbon isotopes. We used 144 laying hens ramdomly divided into two treatments of which were fed by 42 days in the pre-posture period with diets based on rice grits and soybean meal, containing dicalcium phosphate or bovine meat and bone meal. On the beginning of laying period the diets were changed and the poultry of the pre-laying period were divided into four treatments whose diets contained ground corn, soybean meal and dicalcium phosphate; or ground corn, soybean meal and bovine meat and bone meal. On days 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 19, 25, 32, and 42 of each period the blood and plasma from six birds per treatment were randomly collected. The half-life of blood and plasma of ASFB and ASFCO from pre-laying period were greater (17;4 and 15;5 days, respectively) than the treatments from initial laying period: ASFB-MSFB; ASFB-MSFCO; ASFCO-MSFB e MSFCO- MSFCO (half-life of 11;10;11 and 9 for blood, and 2;2;2 and 2 days for plasma. We concluded that the age of hens influenced the blood and plasma turnover whereas the diets did not influenced them. Index terms: carbon-13, Gallus gallus, isotopic dilution, plasma, poultry, stable isotopes 21 � Introdução A técnica dos isótopos estáveis baseia-se na premissa de que o animal é o que ele consome, pois a assinatura isotópica do animal é reflexo da composição isotópica da sua dieta (DeNiro & Epstein, 1978). Deste modo, dietas com assinaturas isotópicas distintas podem ser utilizadas para mensurar o turnover de componentes corporais e órgãos de animais (Gannes et al., 1998). De acordo com Hobson (2011) o turnover isotópico determina o período de integração no qual as dietas contribuem para a síntese de tecidos, constituído por efeitos associados ao crescimento e catabolismo. Em estudos isotópicos utilizando aves em cativeiros, este autor notou que as taxas de turnover dos tecidos de interesse acompanharam as mudanças de dietas isotopicamente diferentes. Materiais biológicos podem apresentar diferentes assinaturas isotópicas em função de processos físico-químicos aptos a criar fracionamento isotópico. De acordo com Reich et al. (2008) pode ainda ter influência de outros fatores específicos, como o fracionamento metabólico entre dieta-tecido, turnover catabólico referente ao tipo de tecido, tamanho e a taxa de crescimento do animal. De acordo com Zuanon et al. (2006), a relação entre turnover e crescimento mensurado pela síntese e degradação de proteína do tecido e/ou corporal pode ser fornecida satisfatoriamente pela variação natural dos isótopos estáveis de carbono e/ou nitrogênio, sendo os resultados observados semelhantes a outras metodologias que utilizam isótopos radioativos ou enriquecidos. Carrijo et al. (2000) em seu experimento de alimentação controlada, usando duas dietas com valores de �13C distintos para investigar a taxa de turnover do carbono-13 22 � em ovos e fígado de galinhas poedeiras, utilizaram aves de postura adultas para evitar as possíveis influências do metabolismo de crescimento. Em experimento semelhante Denadai et al. (2006) também avaliaram a influência das dietas à base de plantas do ciclo fotossintético C3 e/ou C4 nas taxas de turnover do carbono-13 da gema, albúmen, ovo (gema + albúmen) e sangue de galinhas poedeiras no final da vida produtiva. Compreendendo que o turnover pode ser influenciado pela idade do animal e que os trabalhos de Carrijo et al. (2000) e Denadai et al. (2006) avaliaram o turnover de tecidos de galinhas poedeiras no final da fase de postura, tornam-se necessários novos estudos utilizando dietas balanceadas nutricionalmente para investigar o turnover do sangue e plasma de poedeiras na fase de pré-postura e no início da fase de postura. Sendo assim, este estudo tem por objetivo avaliar o turnover do carbono-13 em sangue e plasma de poedeiras comerciais na fase de pré-postura pela substituição de dietas C4 por C3 e na fase inicial de postura pela troca de dietas C3 por C4 utilizando a técnica de isótopos estáveis de carbono. Material e Métodos O experimento foi realizado na UNESP, Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - Campus de Botucatu/SP, no setor de Avicultura da Fazenda Experimental Edgárdia. Por estar em acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal, o projeto experimental foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) desta Universidade e recebeu o protocolo experimental nº 182/2012. 23 � Foram utilizadas 144 fêmeas, da linhagem LOHMANN LSL, alojadas em 24 gaiolas metálicas, medindo 100 cm de comprimento, 40 cm de altura e 45 cm de profundidade, dispostas em duas salas climatizadas. Cada gaiola era divida em dois compartimentos de 50 cm, contendo três aves por compartimento, e eram providas individualmente de comedouros metálicos e bebedouros tipo niple. A alimentação e a água foram fornecidas à vontade. O programa de luz adotado no início até a segunda semana de experimento foi de 13 horas de iluminação artificial, pois as aves vieram recendo esta quantidade de luz da granja de origem. Quando as aves estavam com 18 semanas de idade foi aumentada progressivamente mais uma hora de luz, atendendo às 14 horas recomendadas pelo programa padrão de horas de luz do guia de manejo da linhagem LOHMANN LSL (Lohmann do Brasil, 2011). As aves obtidas com 16 semanas de idade no início do experimento estavam recebendo dietas compostas predominantemente por grãos de plantas do ciclo fotossintético C4 (aproximadamente 70% de milho e 30% de farelo de soja), portanto seus tecidos corporais apresentavam valores isotópicos semelhantes ao destas dietas. No período anterior ao experimento também houve a desvermifugação e imunização contra Pneumovirose, Doença de Newcastle, Bronquite Infecciosa, Gumboro, Escherichia coli, Coriza, Micoplasmose, Bouba Aviária, Encefalomielite Aviária e Síndrome da Queda de Postura ou EDS-76. Os ingredientes utilizados no preparo das dietas experimentais tiveram seus valores de proteína, cálcio, fósforo, energia metabolizável e aminoácidos estimados por Rostagno et al. (2011). As dietas foram formuladas de modo a atender às exigências nutricionais das aves estabelecidas pelo guia de manejo da linhagem LOHMANN LSL 24 � (Lohmann do Brasil, 2011) e balanceadas para que os teores fossem isoenergéticos, isoprotéicos, isocálcicos, isofosfóricos e isoaminoacídicos para metionina + cistina e lisina (Tabela 1). Para a fixação da porcentagem de inclusão da farinha de carne e ossos bovinos foi levado em consideração o atendimento das exigências na fase inicial de postura para não houvesse desbalanceamento das dietas. Sendo que na fase de pré-postura foi utilizada metade da quantidade de farinha de carne e ossos bovinos usada na fase inicial da postura. Considerou-se neste estudo a fase de pré-postura como o período experimental de 42 dias, que teve início em 18 de dezembro de 2012 e término em 28 de janeiro de 2013. Nesta etapa as aves foram alojadadas em delineamento experimental inteiramente casualizado, constituindo dois tratamentos de 72 aves, as quais receberam dietas de plantas do ciclo fotossintético C3 à base de quirera de arroz, farelo de soja e fosfato bicálcico (ASFB) e quirera de arroz, farelo de soja e farinha de carne e ossos bovinos (ASFCO). Após o período experimental descrito acima, as aves foram novamente rearranjadas em delineamento experimental inteiramente casualizado e tiveram as dietas C3 substituídas pelas dietas C4, subdivididas em quatro tratamentos em que o tratamento da pré postura ASFB foi subdividido em milho, farelo de soja e fosfato bicálcico (ASFB-MSFB) e milho farelo de soja e farinha de carne e ossos bovino (ASFB- MSFCO), e o tratamento ASFCO foi subdividido em milho, farelo de soja e fosfato bicálcico (ASFCO-MSFB) e milho, farelo de soja e farinha de carne e ossos (ASFCO- MSFCO) da fase designada “inicial da postura”, porque abrangeu apenas 42 dias da fase 25 � da postura (29 de janeiro até 11 de março de 2013). Cada tratamento foi composto por 36 aves alojadas em seis gaiolas com seis aves cada. Foram amostrados aleatoriamente sangue e plasma de seis aves por tratamento, aos 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 19, 25, 32 e 42 dias após as trocas das dietas na pré-postura e no início da postura. O número de coletas das amostras foi mais concentrado nos primeiros dias de cada início dos tratamentos, devido à maior velocidade na diluição isotópica do carbono no tecido durante essa fase (Hobson & Clark, 1992). Também foram coletadas amostras das dietas experimentais e da farinha de carne e ossos bovinos, as quais foram acondicionadas em sacos plásticos identificados e congeladas a -18°C. A coleta de sangue foi realizada na veia braquial, da asa esquerda, com seringa, agulha descartável e anticoagulante heparina, sendo colhidos aproximadamente 2,5 mL de sangue de cada ave, dos quais 1 mL foi acondicionado em microtubo plástico identificado e o restante (1,5 mL) foi colocado em tubo de vidro e centrífugado a 5000 rpm por 5 min para a obtenção do plasma, o qual foi pipetado e acondicionado em microtubo plástico identificado. Posteriormente as amostras identificadas foram congeladas a -18ºC e armazenadas para posteriores análises isotópicas realizadas na UNESP, Campus de Botucatu, no Centro de Isótopos Estáveis Ambientais do Instituto de Biociências de Botucatu (CIE/IBB). As amostras de sangue e plasma foram descongeladas e liofilizadas a vácuo (Liotop® Model L108; Liobras, São Carlos, SP, Brazil) a -55°C e pressão de 50 µHg por 48 horas. Depois de secas, foram colocadas em frascos de policarbonato individuais com três esferas de aço inoxidável, que foram fechados e congelados em nitrogênio líquido a -196°C, para serem moídas no moinho criogênico (Model Geno/Grinder 2010; Spex SamplePrep LLC, Metuchen, NJ, EUA) em frequência de 700 rpm durante 2 min. 26 � As amostras das dietas e da farinha foram moídas semelhantemente ao sangue e o plasma, porém para obtenção da granulometria ideal foram necessárias três moagens de 5 min cada. Posteriormente, massas de 70 a 90 �g para sangue e plasma e de 50 a 70 �g para as dietas e a farinha de carne e ossos bovinos foram pesadas em cápsulas de estanho através de balança analítica de alta sensibilidade (Modelo MX5; Mettler Toledo, Suíça) para as medidas das razões isotópicas de 13C/12C. As cápsulas de estanho com as amostras foram introduzidas por meio de amostrador automático no analisador elementar (Flash 2000 Organic Elemental Analyzer EA for IRMS; Thermo Fisher Scientific Inc., Bremen, Alemanha), no qual as amostras sofreram individualmente o processo de combustão para a obtenção de CO2. Os gases formados foram separados em coluna cromatográfica gasosa e analisados no espectrômetro de massas de razões isotópicas (Delta V Advantage IRMS Model Finnigan DELTA-V; Thermo Fisher Scientific Inc., Bremen, Alemanha). Os resultados foram expressos em notação δ13C, em relação ao padrão PeedeeBelemnite (PDB), com erro de análise da ordem de 0,2‰ e calculado pela equação 1: δ13C(amostra, padrão) = [(Ramostra/Rpadrão) – 1] x 103 (1) Onde: δ13C = enriquecimento relativo da razão 13C/12C da amostra em relação ao padrão PDB, em partes per mil (‰). Adimensional. R = razão isotópica (13C/12C) da amostra e do padrão. Adimensional. 27 � Para mensurar o turnover isotópico do carbono (diluição isotópica) em determinado intervalo de tempo, foi empregada a função exponencial do tempo expressa pela equação 2 (Ducatti et al., 2002): δ13C(t) = δ13C (f) + [δ13C (i) - δ13C(f)]e-kt (2) Onde: δ13C(t) = enriquecimento isotópico do tecido em qualquer tempo (t). Adimensional. δ13C(f) = enriquecimento isotópico do tecido no patamar de equilíbrio, ou condição final. Adimensional. δ13C(i) = enriquecimento isotópico do tecido, na condição inicial. Adimensional. k = constante de troca (turnover). Expresso em dia-1. t = tempo (em dias) a partir da substituição da dieta. A constante k engloba os processos de turnover metabólico de carbono e o acréscimo de compostos de carbono, ambos para o processo de diluição isotópica do carbono. Para determinar o tempo de troca dos átomos de carbono e a porcentagem de átomos de carbono trocados, foi utilizada a equação 3: t= -(1/k) ln(1-F) (3) Onde: t = tempo de troca do carbono. Expresso em dias. k = constante de troca (turnover) em unidades de tempo-1. F = fração de átomos trocados, (F = 0,50, para meia vida e F = 0,99, para troca total). Os dados obtidos pela análise isotópica foram analisados pelo programa MINITAB®16 (2010). 28 � Resultados e Discussão Os valores isotópicos médios das dietas experimentais derivadas de plantas C3 e C4 (Tabela 1) foram de δ13C = -27,76‰, -27,82‰, -17,39‰ e -15,17‰ para as seguintes dietas à base de quirera de arroz, farelo de soja e fosfato bicálcico (ASFB), quirera de arroz, farelo de soja e farinha de carne e ossos bovinos (ASFCO), milho moído, farelo de soja e fosfato bicálcico (MSFB) e milho moído, farelo de soja e farinha de carne e ossos bovinos (MSFCO). As dietas C3 apresentaram diferença isotópica de apenas 0,06‰, pois estas, assim como as dietas C4, foram formuladas para serem isoenergéticas, isoprotéicas, isocálcicos, isofosfóricos e isoaminoacídicos. Contudo, entre as dietas C4 a variação foi mais acentuada, apontando na dieta de MSFCO um enriquecimento isotópico de 2,22‰, atribuído à maior inclusão e contribuição isotópica da farinha de carne e ossos bovinos. A avaliação isotópica deste ingrediente foi de δ13C = -14,14‰, que refletiu segundo Deniro & Epstein (1978) a composição isotópica da alimentação dos animais que lhe deram origem (bovinos à pasto C4), para o carbono-13. O sangue das aves no início do período da pré-postura comprovou que estas consumiam anteriormente na granja de origem dietas derivadas predominantemente das plantas C4, pois os valores isotópicos ajustados foram de δ13C = -19,87‰ e -19,68‰ para as aves que receberam ASFB e ASFCO, respectivamente. Ao longo do tempo estes valores foram se alterando gradativamente, de modo que aos 42 dias de coleta, este tecido apresentou valores isotópicos ajustados típicos das plantas C3, δ 13C = -28,10‰ e -27,76‰ para as aves que se alimentaram de ASFB e ASFCO (Figura 1). As substituições das dietas C3 por C4 na fase da postura inicial foi acompanhada pelo sangue, que no primeiro dia desta etapa apresentava valores ajustados de δ13C = 29 � -26,32‰, -25,80‰, -25,87‰ e -25,61‰ e no fim de δ13C = -17,98‰, -20,53‰, -18,02‰ e -20,49‰ para as poedeiras que consumiram ASFB-MSFB, ASFB-MSFCO, ASFCO-MSFB e ASFCO-MSFCO, respectivamente (Figura 2). Figura 1. Curvas de turnover dos isótopos estáveis de carbono-13 em função do tempo de coleta no sangue das poedeiras na fase de pré-postura, alimentadas com dietas à base de quirera de arroz e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (ASFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (ASFCO). De acordo com as trajetórias das curvas de turnover dos tratamentos do sangue das fases experimentais estudadas, constatou-se que este tecido não conseguiu atingir o patamar de equilíbrio isotópico no último dia de coleta, pois não existe tendência de platô nas curvas ajustadas para este tecido (Figuras 1 e 2). A fração de átomos trocados (F) até o 42° dia experimental (t) (equação 3) foi de 82% dos átomos para as poedeiras que consumiram ASFB e 85% dos átomos para as aves que se alimentaram de ASFCO durante a pré-postura. Na postura inicial os valores foram de 93%, 94%, 92% e 96% para os tratamentos ASFB-MSFB, ASFB-MSFCO, ASFCO-MSFB e ASFCO-MSFCO, respectivamente. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 -28 -26 -24 -22 -20 -18 -16 ASFB δ13C = -28,10 + 8,23 e-0,0403(t) R2 = 0,98 δ13 C ( ‰ ) Dias de coletas 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 -28 -26 -24 -22 -20 -18 -16 ASFCO δ13C = -27,76 + 8,08 e-0,0448(t) R 2 = 0,98 δ13 C (‰ ) Dias de coletas 30 � Figura 2. Curvas de turnover dos isótopos estáveis de carbono-13 em função do tempo de coleta no sangue das poedeiras no início da postura, alimentadas na pré-postura com dietas à base de quirera de arroz e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (ASFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (ASFCO), alternando para dietas à base de milho moído e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (MSFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (MSFCO). O turnover do carbono-13 no sangue das aves foi mais lento na pré-postura (t50% = 17 e 15 dias) quando comparado com poedeiras na postura inicial (t50% = 11, 10, 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 -28 -26 -24 -22 -20 -18 -16 ASFB-MSFCO δ13C = -20,53 - 5,27 e-0,0677(t) R 2 = 0,94 δ13 C ( ‰ ) Dias de coletas 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 -28 -26 -24 -22 -20 -18 -16 ASFB-MSFB δ13C = -17,98 - 8,34 e-0,0650(t) R2 = 0,96 δ13 C ( ‰ ) Dias de coletas 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 -28 -26 -24 -22 -20 -18 -16 ASFCO-MSFB δ13C = -18,02 - 7,85 e-0,0607(t) R2 = 0,96 δ13 C ( ‰ ) Dias de coletas 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 -28 -26 -24 -22 -20 -18 -16 ASFCO-MSFCO δ13C = -20,49 - 5,12 e-0,0784(t) R 2 = 0,92 δ13 C ( ‰ ) Dias de coletas 31 � 11, e 9 dias), mostrando que houve diferença na taxa de substituição dos carbonos do sangue pelos da nova dieta. Os valores de meia-vida e troca total dos átomos de carbono do sangue das aves na postura inicial foram semelhantes aos obtidos por Denadai et al. (2006) em poedeiras na fase final de postura. Nesta fase os valores de meia-vida e troca total (t99%) dos átomos foram de 11 e 74 dias quando houve a permuta da dieta predominantemente C3 para C4 e de 9 e 64 dias quando a substituição da dieta foi de C4 para C3 respectivamente. Acredita-se que não houve diferença dos dados deste estudo aos achados da literatura (Carrijo et al., 2000; Denadai et. al., 2006) porque com 16 semanas de idade as aves no início da fase de pré-postura já tinham passado pelo desenvolvimento corpóreo e estavam fisiologicamente na fase de amadurecimento do trato reprodutor feminino, pois as poedeiras possuem um padrão de crescimento multifásico, onde na 1ª até a 6ª semana há o desenvolvimento dos órgãos do trato digestivo e do sistema imune, durante a 6ª até a 12ª semana ocorre o crescimento rápido dos componentes estruturais (músculos e ossos), nesta etapa 95% do esqueleto se desenvolve no final da 12ª semana. Por fim, da 12ª até a 18ª semana a proporção de crescimento e peso diminui e o trato reprodutor amadurece e se prepara para a produção de ovos. O esqueleto completa seu desenvolvimento na 13ª semana (Kwakkel et al., 1997). Porém, a diferença no turnover entre a fase de pré-postura e postura inicial pode ser atribuída às modificações na fisiologia reprodutiva que requerem do organismo da ave suportes endócrinos específicos, maior aporte de nutrientes e um rico suprimento de sangue para fornecer ao embrião os componentes necessários para o seu desenvolvimento (Froman et al., 2004; Johnson, 2006). 32 � Na postura o controle da ovulação e da formação do ovo ocorre por interação neuro-hormonal, onde os hormônios secretados pelos folículos ovarianos em maturação coordenam vários efeitos fisiológicos através de uma série de eventos metabólicos. Os estrógenos, hormônios sexuais femininos, estão entre os principais hormônios produzidos, atuando na dilatação e vascularização do oviduto, mobilizando gordura para a síntese da gema e aumentando o metabolismo hepático, além de mobilizarem o cálcio ósseo para a formação da casca do ovo e atuarem na dilatação dos ossos púbicos e da cloaca, necessária para a oviposição (Moreng & Avens, 1990; Proudman, 1994). Tipicamente, a produção de ovos inicia-se na fase de pré-postura, entre 18 a 20 semanas de idade, após a fêmea alcançar a maturidade sexual pela exposição subsequente a um fotoperíodo crescente. Entretanto, a forma como isto acontece não é efetiva, pois os ovos são postos esporadicamente, por isto não ocorre a mesma influência no metabolismo das aves, como observado na fase inicial da postura. Além disso, a formação do ovo envolve o transporte pelo sangue não apenas de hormônios das glândulas endócrinas para as células alvo, mas também de grandes quantidades de nutrientes do lúmen intestinal para o fígado e demais tecidos para a síntese de substâncias como proteínas e lipídios (Moreng & Avens, 1990; Macari & Luquetti, 2002). Sendo assim, a ração da postura inicial destinada a suprir o aumento das exigências nutricionais ao longo do período de produção de ovos deve ser rica em energia, nutrientes e conter 85% a mais de cálcio do que a ração da pré-postura (Lohmann do Brasil, 2011). Quanto ao plasma, os valores isotópicos ajustados no início das coletas foram de δ13C = -18,90‰ e -18,84‰ para as aves que consumiram na pré-postura ASFB e ASFCO, respectivamente. No último dia de amostragem, esse tecido apresentava 33 � valores de δ13C = -26,63‰ para o tratamento de ASFB e δ13C = -27,19‰ para ASFCO (Figura 3). Figura 3. Curvas de turnover dos isótopos estáveis de carbono-13 em função do tempo de coleta no plasma das poedeiras na fase de pré-postura, alimentadas com dietas à base de quirera de arroz e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (ASFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (ASFCO). As poedeiras dos grupos ASFB-MSFB, ASFB-MSFCO, ASFCO-MSFB e ASFCO-MSFCO da postura inicial tiveram valores isotópicos do plasma ajustados de δ13C = -26,79‰, -27,00‰, -26,60‰ e -26,93‰. Com o passar dos dias os valores próximos das plantas C3 foram se modificando gradualmente, de modo que ao final da fase de postura os valores isotópicos médios refletiram a assinatura isotópica das plantas C4, sendo de δ13C = -18,20‰, -20,32‰, -17,87‰ e -20,59‰ para os tratamentos citados acima (Figura 4). As poedeiras da pré-postura que consumiram ASFB apresentaram para o plasma meia-vida (t50%) de 4 dias e troca total dos átomos (t99%) de 22 dias, enquanto as aves que receberam ASFCO tiveram meia-vida (t50%) de 5 dias e troca total (t99%) de 30 dias. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 -28 -26 -24 -22 -20 -18 -16 ASFB δ13C = -26,63 + 7,73 e-0,1979(t) R 2 = 0,95 δ13 C (‰ ) Dias de coletas 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 -28 -26 -24 -22 -20 -18 -16 ASFCO δ13C = -27,19 + 8,35 e-0,1512(t) R2 = 0,95 δ13 C (‰ ) Dias de coletas 34 � As meia-vidas (t50%) de todos os tratamentos do plasma na fase da postura inicial foram de 2 dias, e as trocas totais dos átomos (t99%) foram de 12, 11, 14 e 15 dias para os tratamentos ASFB-MSFB, ASFB-MSFCO, ASFCO-MSFB e ASFCO-MSFCO, respectivamente (Tabela 2). Figura 4. Curvas de turnover dos isótopos estáveis de carbono-13 em função do tempo de coleta no plasma das poedeiras no início da postura. alimentadas na pré-postura com dietas à base de quirera de arroz e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (ASFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (ASFCO), alternando para dietas à base de milho moído e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (MSFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (MSFCO). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 -28 -26 -24 -22 -20 -18 -16 ASFCO-MSFB δ13C = -17,87 - 8,73 e-0,3210(t) R 2 = 0,91δ13 C ( ‰ ) Dias de coletas 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 -28 -26 -24 -22 -20 -18 -16 ASFCO-MSFCO δ13C = -20,59 - 6,34 e-0,3136(t) R 2 = 0,90δ13 C ( ‰ ) Dias de coletas 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 -28 -26 -24 -22 -20 -18 -16 ASFB-MSFB δ13C = -18,20 - 8,59 e-0,3774(t) R2 = 0,94δ13 C (‰ ) Dias de coletas 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 -28 -26 -24 -22 -20 -18 -16 ASFB-MSFCO δ13C = -20,32 - 6,68 e-0,4158(t) R 2 = 0,92δ13 C ( ‰ ) Dias de coletas 35 � O plasma das aves da pré-postura e postura inicial tiveram as meia-vidas (t50%) semelhantes às encontradas por Hobson & Clark (1993), quando avaliaram o turnover do carbono no plasma de corvos que tiveram a dieta C3 substituída por C4. Estes autores encontraram meia-vida de 3 dias e verificaram que o tempo experimental de 60 dias foi satisfatório para que houvesse a substituição e incorporação da assinatura isotópica da nova dieta no plasma, pois assim como as galinhas poedeiras, com 42 dias de experimento, este tecido de troca isotópica rápida, já tinha atingido o patamar de equilíbrio isotópico. Os resultados de meia-vida (t50%) e troca total dos átomos de carbono-13 (t99%) do plasma também apontaram que as aves da postura inicial possuem o turnover mais rápido do que as aves da pré-postura. A elucidação para isto fundamenta-se nos mesmos esclarecimentos descritos anteriormente para o sangue, pois o plasma é a fração líquida do sangue, com sais e proteínas dissolvidos (Macari & Luquetti, 2002). Comparando os resultados isotópicos obtidos para o sangue e o plasma fica evidente que o plasma teve o turnover mais acelerado tanto na fase de pré-postura como na fase de postura inicial. Estas diferenças nas taxas de turnover entre o sangue e o plasma deve-se à velocidade de troca dos componentes destes tecidos, visto que o sangue total apresenta ritmo lento na taxa de turnover devido às células terem maior longevidade do que os constituintes do plasma, por este motivo fornecem informações de longo prazo, enquanto o plasma possui ritmo acelerado na taxa de turnover, fornecendo informações de curto prazo (Pearson et al., 2003). Em termos de velocidade na taxa de turnover o plasma pode ser equiparado até mesmo com o metabolicamente ativo fígado (Hobson & Clark, 1993) uma vez que as proteínas deste tecido são sintetizadas principalmente neste órgão (Michalopoulos & DeFrances, 1997). 36 � No entanto, o sangue segundo Hobson & Clark (1992), por apresentar taxa de turnover do carbono semelhante ao do musculo peitoral, que é intermediário aos tecidos de troca rápida como o fígado e aos de troca lenta (Tieszen et al., 1983), como a queratina, pode ser classificado como tecido de troca isotópica intermediária. Neste sentido, a taxa de turnover do carbono-13 de diferentes tecidos estabelecida por Hobson & Clark (1992, 1993) em uma sequência decrescente de: plasma > sangue > fração celular do sangue, atestou o conceito de que o turnover dos elementos realmente podem variar entre os diferentes componentes do corpo (Kennedy & Krouse, 1990). Em relação à utilização da farinha de carne e ossos bovinos nas dietas experimentais foi verificado que não houve influência deste ingrediente na taxa de turnover nos tecidos analisados na fase de pré-postura e postura inicial, provavelmente porque as dietas foram formuladas para suprirem igualmente as exigências das poedeiras durante as respectivas fases. As análises isotópicas do sangue e plasma ao longo do período experimental proporcionaram nova perspectiva para a interpretação da fisiologia animal, comprovando o potencial da técnica dos isótopos estáveis como ferramenta para esclarecer as influências do metabolismo das aves nas diferentes fases de produção. Conclusão De acordo com os resultados obtidos pode-se concluir que o turnovrer isotópico do carbono-13 no sangue e plasma foi mais rápido nas poedeiras da fase inicial da postura quando comparado com as aves da fase de pré-postura. O plasma teve o turnover mais acelerado tanto na fase de pré-postura como na fase de postura inicial. 37 � No entanto não houve diferença dentro da fase produtiva e em relação as dietas experimentais no turnover do sangue e plasma na fase de pré e inicial de postura. Agradecimentos À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo financiamento da pesquisa através do projeto temático n° 2008/57411-4 e pela bolsa de mestrado do projeto nº 2012/09422-2. Referências CARRIJO, A.S.; PEZZATO, A.C.; DUCATTI, C. Avaliação do metabolismo nutricional em poedeiras pela técnica dos isótopos estáveis do carbono (13C/12C). Revista Brasileira de Ciência Avícola, v.2, n.3, p.209-218, 2000. DENADAI, J.C.; DUCATTI, C.; PEZZATO, A.C.; CARRIJO, A.S.; CALDARA, F.R.; OLIVEIRA, R.P. Studies on carbon-13 turnover in eggs and blood of commercial layers. Revista Brasileira de Ciência Avícola, v.8, n.4, p.251-256, 2006. DENIRO, M.J.; EPSTEIN, S. 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Ingredientes (%) Dietas experimentais(1) Pré-postura Postura inicial ASFB ASFCO MSFB MSFCO Quirera de arroz 67,45 67,43 - - Milho moído - - 57,36 62,59 Farelo de soja (45%) 25,95 22,67 29,64 22,37 Farinha de carne e ossos bovinos - 3,40 - 6,60 Calcário calcítico 3,60 3,15 8,34 7,48 Fosfato bicálcico 2,07 1,10 1,92 - DL-Metionina 0,06 0,07 2,11 0,33 Sal comum 0,35 0,35 0,13 0,13 Suplemento vitamínico(2) 0,10 0,10 0,35 0,35 Suplemento mineral(3) 0,05 0,05 0,10 0,10 Inerte (caulim) 0,37 1,68 0,05 0,05 Total 100,00 100,00 100,00 100,00 Níveis Nutricionais Calculados Energia metabolizável (kcal/kg) 2800 2800 2800 2800 Proteína bruta (%) 17,50 17,50 18,00 18,00 Cálcio (%) 2,00 2,00 3,70 3,70 Fósforo disponível (%) 0,45 0,45 0,45 0,45 Fibra bruta (%) 1,71 1,54 2,56 2,27 Metionina (%) 0,37 0,37 0,40 0,40 Aminoácidos sulfurados (%) 0,66 0,65 0,70 0,68 Lisina (%) 0,92 0,90 0,96 0,91 δδδδ13C (‰) (Média±DP, n=6) -27,76±0,24 -27,82±0,20 -17,39 ± 0,43 -15,17 ± 0,28 (1)ASFB: quirera de arroz, farelo de soja e fosfato bicálcico; ASFCO: quirera de arroz, farelo de soja e farinha de carne e ossos bovinos; MSFB: milho moído, farelo de soja e fosfato bicálcico; MSFCO: milho moído, farelo de soja e farinha de carne e ossos bovinos. (2)Suplemento vitamínico: níveis mínimos de garantia/kg de produto: ácido fólico, 100mg; ácido pantotênico, 6.000mg; BHT, 1.000mg; biotina, 5mg; niacina, 20g; vitamina A, 7.000.000 UI; vitamina B1, 250mg; vitamina B12, 6.000mg; vitamina B2, 3.000mg/kg; vitamina B6, 150mg; vitamina D3, 2.500.000 UI; E, 8,000mg; K3, 1.200mg. (3)Suplemento mineral: níveis mínimos de garantia/kg de produto: manganês, 50g; zinco, 40g; ferro, 30g; cobre, 6g; iodo 400mg; selênio, 180mg. 43 � Tabela 2. Valores isotópicos do �13C, expressos em ‰, dos tecidos amostrados no início e no fim dos períodos experimentais, a partir da substituição das dietas e os valores calculados de meia-vida (t(50%)) e troca total dos átomos de carbono (t(99%)), em unidade de dias. (1)ASFB: quirera de arroz, farelo de soja e fosfato bicálcico; ASFCO: quirera de arroz, farelo de soja e farinha de carne e ossos bovinos; MSFB: milho moído, farelo de soja e fosfato bicálcico; MSFCO: milho moído, farelo de soja e farinha de carne e ossos bovinos. Fase da postura Tratamentos(1) Sangue Plasma δ13C t(50%) t(99%) δ 13C t(50%) t(99%) Início fim Início Fim Pré ASFB -19,87 -28,10 17 114 -18,90 -26,63 4 23 ASFCO -19,68 -27,76 15 103 -18,84 -27,19 5 30 Início ASFB-MSFB -26,32 -17,98 11 71 -26,79 -18,20 2 12 ASFB-MSFCO -25,80 -20,53 10 68 -27,00 -20,32 2 11 ASFCO-MSFB -25,87 -18,02 11 76 -26,60 -17,87 2 14 ASFCO-MSFCO -25,61 -20,49 9 59 -26,93 -20,59 2 15 44 � CAPÍTULO 3 VARIAÇÃO ISOTÓPICA DO 13C EM OVOS DE GALINHAS POEDEIRAS NA FASE INICIAL DE POSTURA 45 � Variação isotópica do 13C em ovos de galinhas poedeiras na fase inicial de postura Resumo Avaliou-se o turnover do carbono-13 pela substituição de dietas C3 por C4, em ovos inteiros e suas frações, utilizando a técnica de isótopos estáveis. Foram utilizadas 144 poedeiras que consumiram quirera de arroz e farelo de soja, e fosfato bicálcico ou farinha de carne e ossos bovinos, para marcar isotopicamente seus tecidos. Na fase inicial de postura, as aves foram distribuídas em quatro grupos que passaram a consumir por 42 dias milho moído e farelo de soja, e fosfato bicálcico ou farinha de carne e ossos bovinos. Aos 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 19, 25, 32 e 42 dias foram coletados aleatoriamente 12 ovos por tratamento para amostragem de ovo inteiro, albúmen e gema. As meia-vidas variaram de 3 a 4 dias para o ovo, de 2 a 3 dias para o albúmen e de 6 dias para a gema sendo condizentes com o processo fisiológico de síntese do ovo. O turnover do carbono-13 foi mais rápido no albúmen, seguido pelo ovo inteiro e gema. Conclui-se que o turnover do ovo inteiro foi de 3 a 4 dias, da gema em torno de 6 dias e do albúmem de 2-3 dias, independentemente da fase produtiva da ave e da dieta. Termos para indexação: albúmen, carbono-13, diluição isotópica, gema, isótopos estáveis, turnover 46 � Isotopic turnover of 13C on eggs of laying hens during the laying period Abstract This study evaluated the carbon-13 turnover by replacing C3 by C4 diets, in whole eggs and its fractions using the stable isotope technique. Were used 144 laying hens fed by 42 days at the pre-experimental period diets based on rice grits and soybean meal containing dicalcium phosphate or bovine meat and bone meal to mark their tissues isotopically. In the laying period the hens were redistributed into four groups that consumed by 42 days diets based on ground corn and soybean meal cointaining dicalcium phosphate or bovine meat and bone meal. On days 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 19, 25, 32, and 42, twelve eggs were randomly collected by treatment for sampling of whole egg, albumen and yolk. The half-lifes ranged between 3 to 4 days for eggs, 2 to 3 days for albumen, and 6 days for yolk. The results obtained were consistent with the process of egg formation. The turnover of carbon-13 was faster in albumen, followed by whole egg and yolk. We concluded that the turnover of whole egg (3 to 4 days), yolk (6 days), and albumen (2 to 3 days) were not impacted by the production period or the diets used. Index terms: albumen, carbon-13, Gallus gallus, isotopic dilution, stable isotope, yolk 47 � Introdução O ovo por ser alimento altamente consumido no mundo, também está relacionado à crescente preocupação com as questões de segurança alimentar, que é resultante da crescente globalização da cadeia alimentar, combinada com os recentes surtos de doenças transmitidas por alimentos (Thompson et al., 2005), como os casos de contaminação da carne de frango por dioxinas, surtos de febre aftosa, encefalopatia espongiforme bovina (EEB) ou doença-da-vaca-louca, alimentos geneticamente modificados, com resíduos químicos, pesticidas e hormônios (Morris & Young, 2000; Northen, 2001; Bailey et al., 2002; Opara, 2003). Nesse contexto, é indispensável a busca por ferramentas como os isótopos estáveis que proporcionam a rastreabilidade e autenticidade dos ovos, possibilitando a certificação de origem por agências governamentais reguladoras (Rock et al., 2013). No entanto, para isto são essenciais estudos experimentais de turnover isotópico dos constituintes corporais, para avaliar o impacto da troca das dietas em sistemas de produção de ovos sobre a composição isotópica destes (Rock, 2012). O turnover pode ser entendido como a taxa que cada isótopo é incorporado e eliminado de um compartimento biológico sob a condição de equilíbrio (Kennedy & Krouse, 1990). O período em que a assinatura isotópica da dieta será refletida no tecido dependerá, em parte, da taxa de turnover do tecido, se este for rápido a dieta refletida será a recente, agora se for lento indicará a dieta consumida de médio a longo prazo (Hobson & Clark, 1992). Estudos experimentais de turnover do carbono-13 em ovos de galinhas poedeiras foram realizados por Carrijo et al. (2000) e Denadai et al. (2006), que investigaram a taxa de turnover em sangue, ovo inteiro, gema e albúmen de poedeiras. Em ambos 48 � estudos foram utilizadas aves no final da vida produtiva com 82 e 120 semanas de idade, respectivamente, e com as dietas experimentais simplificadas e isentas de subprodutos de origem animal. Carrijo et al. (2000) recomendaram a utilização de ovos para estudos futuros que tivessem como objetivo investigar o turnover do carbono-13 em poedeiras, devido este possuir taxa de substituição do carbono semelhante à do fígado, tecido de troca rápida, e fornecer informações da dieta das aves sem a necessidade de sacrificá-las. Embora as fezes e produtos de origem animal como os ovos e o leite não serem considerados tecidos e portanto não possuem renovação tecidual, o turnover nesses casos fornece indicativos da taxa de renovação dos nutrientes para a sua formação (Denadai et al., 2006). Sendo assim, o presente estudo tem por objetivo avaliar o turnover do carbono-13 pela substituição de dietas C3 por C4, em ovos inteiros (gema + albúmen) e suas frações, de poedeiras comerciais durante a fase inicial da postura utilizando a técnica de isótopos estáveis de carbono. Material e Métodos O experimento foi realizado na UNESP, Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - Campus de Botucatu/SP, no setor de Avicultura da Fazenda Experimental Edgárdia. Foi gerado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) desta Universidade o protocolo n° 182/2012, aprovando o experimento por estar de acordo com os princípios éticos na experimentação animal. Foram utilizadas 144 fêmeas da linhagem LOHMANN LSL com 22 semanas de idade, no início do período experimental designado“fase inicial de postura”, visto que foi avaliado apenas a fase inicial de produção de ovos. As aves foram alojadas em 24 49 � gaiolas metálicas, medindo 100 cm de comprimento, 40 cm de altura e 45 cm de profundidade, que ocupavam duas salas. As gaiolas eram divididas em dois compartimentos de 50 cm que alojavam três aves cada e eram providas individualmente de comedouros metálicos e bebedouros tipo niple. A alimentação e água foram fornecidas à vontade. Foi utilizado o programa de 14 horas de luz artificial e 10 horas de escuro, sendo este necessário para o descanso das aves. Para o estabelecimento de zona de conforto térmico, a temperatura e a ventilação foram controladas por meio de ar condicionado e exaustores, sendo mantida entre 22 e 24°C. As aves foram adquiridas com 16 semanas de idade e recebiam dietas compostas predominantemente por grãos de plantas do ciclo fotossintético C4, No momento do alojamento as aves foram divididas em dois grupos de 72 aves cada (fase pré- experimental), que receberam dietas à base de plantas C3: quirera de arroz e farelo de soja, contendo fosfato bicálcico (ASFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (ASFCO), a fim de marcar isotopicamente os tecidos das aves com valor isotópico distinto das dietas experimentais. O período experimental compreendeu 42 dias (de 29 de janeiro até 11 de março de 2013). As aves foram distribuídas em delineamento experimental inteiramente casualizado, com quatro tratamentos contendo seis repetições de seis aves cada. As aves do período pré experimental que recebiam dieta contendo quirera de arroz, farelo de soja e fostato bicálcico, foram divididas em dois tratamentos na fase experimental, com milho moído e farelo de soja, contendo fostato bicálcico (ASFB-MSFB) ou farinha de carne e ossos bovinos (ASFB-MSFCO). Os animais que consumiam dieta à base de quirera de arroz, farelo de soja e farinha de carne e ossos bovinos na fase pré- 50 � experimental, foram divididos em dois tratamentos, passando para dietas à base milho moído e farelo de soja, com inclusão de fostato bicálcico (ASFCO-MSFB) ou farinha de carne a ossos bovinos (ASFCO-MSFCO) na fase experimental. Os ingredientes utilizados no preparo das dietas experimentais tiveram seus teores de proteína, cálcio, fósforo, energia metabolizável e aminoácidos, estimados por Rostagno et al. (2011) e as dietas foram formuladas de modo a atender às exigências nutricionais das aves, estabelecidas pelo guia de manejo da linhagem LOHMANN LSL (Lohmann do Brasil, 2011) e balanceadas para que fossem isoenergéticas, isoprotéicas, isocálcicas, isofosfóricas e isoaminoacídicas para metionina + cistina e lisina (Tabela 1). Para a fixação da porcentagem de inclusão da farinha de carne e ossos bovinos foi levado em consideração o atendimento das exigências na fase inicial de postura para não houvesse desbalanceamento das dietas. Foram tomados aleatoriamente 12 ovos por tratamento, para a coleta das amostras de gema, albúmen e ovo (gema + albúmen) nos dias 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 19, 25, 32 e 42 após a troca das dietas. Seis ovos foram utilizados para a amostragem de gema e albúmen separadamente e os outros seis homogeneizados em liquidificador para amostragem de ovo (gema + albúmen). As amostras foram colocadas em tubos plásticos identificados e congeladas a -18°C para armazenagem. Também foram coletadas amostras das rações experimentais e da farinha de carne e ossos bovinos, que foram identificadas, congeladas a -18°C e armazenadas para a futura obtenção dos valores isotópicos. O número de coletas das amostras foi concentrado nos primeiros dias de coleta devido à maior velocidade na diluição isotópica do carbono no tecido durante essa fase (Hobson & Clark, 1992). 51 � Para realização das análises isotópicas no Centro de Isótopos Estáveis Ambientais do Instituto de Biociências de Botucatu (CIE/IBB), da UNESP, Campus de Botucatu, todas as amostras foram retiradas do freezer e liofilizadas a vácuo (Liotop® Modelo L108; Liobras, São Carlos, SP, Brazil) a -55°C e pressão de 50 µHg por 48 horas. Após serem desidratadas, as amostras de ovo (gema + albúmen) e gema foram acondicionadas individualmente em papel filtro indentificado e desengorduradas no Soxhlet (Modelo MA491; Marconi, Piracicaba, SP, Brasil). Neste aparelho as amostras foram imersas em éter etílico por 4 horas sob temperatura de 55 a 65°C e suspensas por 1 hora para lavagem final com o éter evaporado. Após isto, foram mantidas por 1 hora em estufa de ventilação forçada (Modelo MA035; Marconi, Piracicaba, SP, Brasil) para uma completa volatilização do éter remanescente. A extração lipídica foi necessária porque os lipídios são empobrecidos em 13C (Ehrich et al., 2011). A próxima etapa constituiu-se da moagem e homogeneização das amostras por meio de moinho criogênico (Modelo Geno/Grinder 2010; Spex Sample Prep LLC, Metuchen, NJ, EUA) a -196°C. Para isto, estas foram acondicionadas individualmente em frascos de policarbonato, juntamente com três esferas de aço inoxidável, os frascos foram fechados e congelados por 1 min em nitrogênio líquido. Após o congelamento, os frascos foram encaminhados ao aparelho de moagem, que ao oscilar em movimentos para cima e para baixo em frequência de 700 rpm foi responsável por impactar as esferas e a amostra, culminando assim em amostras uniformes e com granulometria fina (�m). O tempo estimado de moagem foi de 3 min para o ovo inteiro (gema + albúmen) e suas frações. As rações e a farinha de carne e ossos bovinos foram submetidas da mesma forma ao congelamento e moagem em moinho criogênico, contudo, para 52 � obtenção da granulometria ideal, estes processos foram repetidos três vezes durante 5 min cada moagem. Depois de moídas, todas as amostras foram pesadas em balança analítica de alta sensibilidade (Modelo MX5; Mettler Toledo, Suíça) utilizando a massa de 50 a 70 �g e acondicionadas em cápsulas de estanho. Para a determinação da composição isotópica das amostras as cápsulas foram introduzidas por meio de amostrador automático no analisador elementar (Flash 2000 Organic Elemental Analyzer EA for IRMS; Thermo Fisher Scientific Inc., Bremen, Alemanha), no qual as amostras foram queimadas para a formação de CO2. Os gases formados foram separados em coluna cromatográfica gasosa e analisados no espectrômetro de massas de razões isotópicas (Delta V Advantage IRMS Model Finnigan DELTA-V; Thermo Fisher Scientific Inc., Bremen, Alemanha). Os resultados foram expressos em notação δ13C, em relação ao padrão PeedeeBelemnite (PDB), com erro de análise da ordem de 0,2‰ e calculado pela equação 1: δ13C(amostra, padrão) = [(Ramostra/Rpadrão)– 1] x 103 (1) Onde: δ13C = enriquecimento relativo da razão 13C/12C da amostra em relação ao padrão PDB, em partes per mil (‰). Adimensional. R = razão isotópica (13C/12C) da amostra e do padrão. Adimensional. Para mensurar o turnover isotópico do carbono (diluição isotópica) em determinado intervalo de tempo, foi empregada a função exponencial do tempo expressa pela equação 2, (Ducatti et al., 2002) ou o modelo sigmoidal de regressão de Boltzman segundo a equação 3, atribuindo-se a terminologia isotópica: 53 � δ13C(t) = δ13C (f) + [δ13C (i) - δ13C(f)]e-kt (2) Onde: δ13C(t) = enriquecimento isotópico do tecido em qualquer tempo (t). Adimensional. δ13C(f) = enriquecimento isotópico do tecido no patamar de equilíbrio, ou condição final. Adimensional. δ13C(i) = enriquecimento isotópico do tecido, na condição inicial. Adimensional. k = constante de troca (turnover). Expresso em dia-1. t = tempo (em dias) a partir da substituição da dieta. � �� ���� � � �� �� � � � � ������ � ���� ��� ������ �� (3) Onde: δ13C (t): enriquecimento isotópico do tecido em qualquer tempo (t). Adimensional. δ13C (f): enriquecimento isotópico do tecido no patamar de equilíbrio, ou condição final. Adimensional. δ13C (i): enriquecimento isotópico do tecido, na condição inicial. Adimensional. χ0 : ponto de inflexão da sigmóide. Representa a meia vida do carbono. Expresso em dias. dx: constante de tempo. Expresso em dias. t: tempo experimental. Expresso em dias. A constante k engloba os processos de turnover metabólico de carbono e o acréscimo de compostos de carbono, ambos para o processo de diluição isotópica do carbono. Para determinar o tempo de troca dos átomos de carbono e a porcentagem de átomos de carbono trocados, foi utilizada a equação 4: 54 � t= -(1/k) ln(1-F) (4) Onde: t = tempo de troca do carbono. Expresso em dias. k = constante de troca (turnover) em unidades de tempo-1. F = fração de átomos trocados, (F = 0,50, para meia vida e F = 0,99, para troca total). Para calcular o fracionamento isotópico, que pode ser resumido como um enriquecimento ou deplecionamento do isótopo, entre o δ do tecido e da dieta, foi empregada a equação 5: ∆= δ tecido - δ dieta (5) Os dados obtidos pela análise isotópica foram analisados pelo programa MINITAB®16 (2010). Resultados e Discussão As análises isotópicas das dietas experimentais (Tabela 1) mostraram que houve enriquecimento de 2,22‰ da dieta de milho moído, farelo de soja e farinha de carne e ossos bovinos (MSFCO) com valor de δ13C = -15,17‰ comparada à dieta de milho moído, farelo de soja e fosfato bicálcico (MSFB) com valor de δ13C = -17,39‰. Isto pode ser justificado pela influência do valor isotópico de δ13C = -14,14‰ da farinha de carne e ossos bovinos, a qual é reflexo direto da dieta consumida pelos animais que lhe deram origem (bovinos criados em pasto C4, em condições brasileiras), acrescido de ±2,0‰ para o carbono-13 (DeNiro & Epstein, 1978). Os valores isotópicos ajustados do primeiro dia de coleta do ovo inteiro (gema + albúmen) das poedeiras que se alimentaram de quirera de arroz, farelo de soja e fosfato bicálcico (ASFB) foram de δ13C = -27,05‰ e δ13C = -26,73‰ e passaram a apresentar 55 � valores de δ13C = -18,83‰ e δ13C = -20,18‰, para MSFB e MSFCO, respectivamente. Para as aves que receberam quirera de arroz, farelo de soja e farinha de carne e ossos bovinos (ASFCO) e depois MSFB e MSFCO os valores ajustados foram de δ13C = -25,86‰ e δ13C = -26,31‰ no início e de δ13C = -17,96‰ e δ13C = -19,97‰ no fim (Figura 1). As razões isotópicas ajustadas do albúmen durante a fase inicial da postura foram de δ13C = -26,75‰, -26,45‰, -26,23‰ e -25,96‰ e passaram para δ13C = -18,36‰, -19,58‰, -18,39‰ e -19,89‰ para os animais que consumiram ASFB-MSFB, ASFB-MSFCO, ASFCO-MSFB e ASFCO-MSFCO, respectivamente (Figura 2). Para a gema os valores isotópicos iniciais ajustados foram de δ13C = -27,40‰, -27,20‰, -28,05‰ e -27,04‰. Na última amostragem estes valores passaram para δ13C = -18,72‰, -20,77‰, -19,07‰ e -20,61‰ para os animais que receberam ASFB-MSFB, ASFB-MSFCO, ASFCO-MSFB e ASFCO-MSFCO, respectivamente (Figura 3). 56� � Figura 1. Curvas de turnover dos isótopos estáveis de carbono-13 em função do tempo de coleta no ovo