RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 23/02/2025. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - CÂMPUS DE BOTUCATU PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA E BIOTECNOLOGIA EFEITOS DA MEMBRANA CELLFATE®, ASSOCIADA À ADIÇÃO DE MELATONINA NO MEIO DE CULTIVO, NA PRODUÇÃO E QUALIDADE DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO ADRIANO FELIPE MENDES Médico veterinário Botucatu, SP 2024 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - CÂMPUS DE BOTUCATU PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA E BIOTECNOLOGIA EFEITOS DA MEMBRANA CELLFATE®, ASSOCIADA À ADIÇÃO DE MELATONINA NO MEIO DE CULTIVO, NA PRODUÇÃO E QUALIDADE DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO ADRIANO FELIPE MENDES Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia e Biotecnologia, do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista, para obtenção do título de Doutor em Farmacologia e Biotecnologia. Orientadora: Profa. Dra. Claudia Maria Bertan Membrive Botucatu, SP 2024 3 4 5 6 7 Autor: Adriano Felipe Mendes Título: Efeitos da membrana Cellfate®, associada à adição de melatonina no meio de cultivo, na produção e qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro Banca avaliadora Profa. Dra. Claudia Maria Bertan Membrive Presidente e orientadora Universidade Estadual Paulista - UNESP, Dracena, SP Profa. Dra. Fernanda da Cruz Landim Membro titular Universidade Estadual Paulista - UNESP, Botucatu, SP Prof. Dr. Leonardo de Oliveira Mendes Membro titular Universidade do Oeste Paulista - UNOESTE, Presidente Prudente, SP Prof. Dr. Juliano Coelho da Silveira Membro Titular Universidade de São Paulo - USP, Pirassununga, SP Prof. Dr. Felipe Rydygier de Ruediger Membro titular Universidade do Oeste Paulista - UNOESTE, Presidente Prudente, SP Data: 23/02/2024 8 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente à minha família, especialmente minha mãe Elza; minhas irmãs Andréia e Adriana; e amiga Jacqueline. Consegui chegar a esta defesa de tese de Doutorado porque estive rodeado de amor. Tive o privilégio de caminhar pelo mundo acompanhado de pessoas especiais. No início desse caminho fui acompanhado de perto por minha mãe, minhas irmãs e meu irmão, e, mais a frente, por uma pessoa que hoje também é família, Jacqueline que proporcionou uma amizade que nasceu, cresceu e floresceu, um amor que pode ser difícil de explicar no ocidente, mas que, há séculos, encontra definição em uma lenda do oriente “Unmei no akai ito” onde duas pessoas estão ligadas por um fio vermelho invisível e as circunstâncias da vida as levariam a um encontro, independente do tempo e distância. Amo vocês, família. Ao meu irmão André, alguém que amei e que me amou de volta, uma pessoa especial que participou também da minha caminhada, infelizmente por um período finito. Hoje ele não está mais presente, mas suas lembranças seguirão comigo para sempre na forma de amor convertido em saudade. Ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia e Biotecnologia e seus docentes, ao Instituto de Biociências e a Universidade Estadual Paulista - UNESP de Botucatu/SP, pela oportunidade, confiança e ensinamentos. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (Processo no 2022/01110-3), pelo auxílio financeiro ao referido projeto. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES, pela concessão da bolsa de estudos que possibilitou minha dedicação exclusiva ao Doutorado. A minha orientadora, Profa. Dra. Claudia Maria Bertan Membrive, pela orientação que construiu meu crescimento como pesquisador durante os anos em que estivemos juntos no desenvolvimento dos estudos que compuseram esta tese. Aos membros do Laboratório de Fisiologia e Endocrinologia Molecular - LFEM, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - FMVZ da Universidade de São Paulo - USP, 9 especialmente à Dra. Isabella Rio Feltrin, pelo auxílio nas análises de RT-qPCR e pela disposição em me auxiliar nas análises estatísticas dos dados. Ao Prof. Dr. Guilherme Pugliesi, responsável pelo LFEM, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - FMVZ da Universidade de São Paulo - USP, pelo incondicional apoio científico. A Profa. Dra. Angela Gonella-Diaza, da Universidade da Flórida, pela contribuição científica na avaliação dos dados obtidos. A Dra. Janice Koepp que, à frente da Biocelltis Biotecnologias S.A., cedeu as matrizes CellFate®, imprescindíveis para o estudo desenvolvido. Agradeço também aos demais colaboradores da Biocelltis Biotecnologias S.A. envolvidos indireta ou diretamente no projeto. Aos membros titulares da comissão avaliadora Profa. Dra. Fernanda da Cruz Landim da Universidade Estadual Pauista - UNESP de Botucatu/SP; Prof. Dr. Leonardo de Oliveira Mendes da Universidade do Oeste Paulista - UNOESTE de Presidente Prudente/SP, Prof. Dr. Juliano Coelho da Silveira da Universidade de São Paulo – USP de Pirassununga/SP e Prof. Dr. Felipe Rydygier de Ruediger da Universidade do Oeste Paulista - UNOESTE de Presidente Prudente/SP, que aceitaram o convite para participar deste momento tão importante. Obrigado por toda contribuição pessoal e científica. Aos membros do Laboratório de Investigação da Fisiologia do Endométrio e do Embrião - LIFE, da Faculdade de Ciências Agrarias e Tecnológicas - FCAT da Universidade Estadual Pauista - UNESP de Dracena/SP, em especial à Dra. Mariângela Bueno Cordeiro Maldonado; Ms. Valeska de Castro Lourenço; aos mestrandos Lucas de Oliveira Bezerra e Laura Chuba Machado Rolniche; aos alunos de Iniciação Científica Ana Laura Silva, Maria Eduarda Rocha Pinto, Emily Silva do Nascimento, Gabriel Souza da Silva e Catarina Lazarevicius Prestes. 10 Ao médico veterinário, Lucas Henrique Gaspar, que junto ao frigorífico ACOVACAT e seus colaboradores, não mediu esforços para garantir a disponibilidade dos ovários que serviram de base para as pesquisas desenvolvidas. Aos amigos que encontrei em Dracena/SP, e deixo aqui um agradecimento especial aos amigos do “Massacre do coco elétrico”, grupo que agora também faço parte. Aos professores e funcionários técnico-administrativos da Faculdade de Ciências Agrárias e Tecnológicas - FCAT de Dracena/SP, por todo o suporte oferecido. A todas as pessoas que foram fundamentais para o desenvolvimento desse estudo. A todos, minha enorme gratidão! 11 RESUMO A hipótese é que a utilização do sistema de cultivo tridimensional (3D) com o emprego de uma membrana de nanocelulose bacteriana (CellFate®; Biocelltis S.A., Brasil), durante a maturação oocitária (MIV) e cultivo embrionário (CIV) associada à adição de melatonina na MIV, aumenta a produção e qualidade dos embriões bovinos produzidos in vitro. Para tanto, esta tese foi construída em três capítulos: revisão de literatura (Capítulo 1); efeito dose-resposta da melatonina adicionada durante a MIV e/ou CIV no sistema de cultivo convencional (bidimensional, 2D) na produção e qualidade embrionária (Capítulo 2; Estudo 1) e associação do cultivo 3D (CellFate®) na MIV e CIV, com a adição de 10 µM (10000 nM) de melatonina na MIV sobre a produção e qualidade embrionária (Capítulo 3; Estudo 2). No estudo 1, objetivou-se avaliar os efeitos de 0,01, 10 e 10000 nM de melatonina (Sigma Aldrich, M5250), durante a MIV (Experimento 1), CIV (Experimento 2) e MIV e CIV (Experimento 3). Dessa forma, ovários de fêmeas Nelore (Bos taurus indicus) foram coletados em abatedouro e oócitos derivados desses ovários foram submetidos à MIV por 24 horas em meio próprio acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB), além dos tratamentos. A seguir, oócitos e espermatozoides forma co-cultivados por 18 horas. Os prováveis zigotos foram transferidos para o meio fluido sintético de oviduto acrescido com 2,5% de SFB, além dos tratamentos, onde foram cultivados por 9 dias. Todas as etapas foram realizadas gotas de cultivo submersas em óleo mineral para cultivo dispostas em placas de Petri em incubadora a 38,5°C e atmosfera úmida com 5% de CO2. A taxas de clivagem, blastocisto e eclosão foram avaliadas aos 3, 7 e 9 dias de cultivo, considerando a FIV como dia 0 (D0). Aos 9 dias, blastocistos eclodidos foram colhidos para avaliar a expressão de OCT4 (POU class 5 homeobox 1), SOD2 (superoxide dismutase 2), GPX1 (glutathione peroxidase 1), e BAX (BCL2 associated X) por RT-qPCR. Os dados foram submetidos à análise de variância seguida da aplicação de contrastes. A taxa de clivagem não foi alterada nos três experimentos. No Experimento 1, o uso de melatonina no D7 determinou uma tendência para maior número de blastocistos eclodidos (P = 0,0686) e totais (P = 12 0,0892) no grupo 10000 nM comparado ao grupo 0,01 nM. No D9, observou-se maior número de blastocistos totais (P = 0,0216) no grupo 10000 nM comparado ao grupo 0,01 nM e uma tendência (P = 0,0741) de maior número de blastocistos eclodidos no grupo 10000 nM comparado ao grupo 0,01 nM. Não foram observadas diferenças para a RT-qPCR. Nos experimentos 2 e 3 não foram observadas diferenças significativas na produção embrionária. Em conclusão, a adição com melatonina apenas na MIV determina uma tendência para melhores taxas de produção embrionária quando 10000 nM foi comparado a 0,01 nM e que tal adição não alterou a expressão dos transcritos OCT4, SOD2, GPX1 e BAX. No estudo 2, objetivou-se avaliar o efeito do sistema 3D na MIV, CIV ou MIV e CIV, bem como o impacto de 10 µM de melatonina na MIV na presença ou não do sistema 3D durante a MIV. Ovários de fêmeas Bos taurus indicus × Bos taurus taurus foram colhidos em abatedouro para a recuperação oocitária. As etapas de MIV, FIV e CIV, bem como as análises seguiram o protocolo descrito para o Estudo 1, exceto que todas as etapas foram realizadas placas de 4 poços. O sistema 3D com melatonina apresentou maior taxa de clivagem em D3 comparado ao controle (P = 0,0300) e ao sistema 3D sem melatonina (P = 0,0313). No D7, o sistema 3D com melatonina apresentou maior taxa de blastocisto inicial comparado ao controle (P = 0,0079). No D9, o sistema 3D com melatonina apresentou maior taxa de blastocisto expandido comparado ao sistema 3D sem melatonina (P = 0,0491), maior taxa de blastocisto geral comparado aos grupos controle (P = 0,0160) e sistema 3D sem melatonina (P = 0,0193). A utilização do sistema 3D isolado na MIV resultou em taxa de blastocisto geral semelhante ao sistema 3D com melatonina, sendo esses dois sistemas superiores aos sistemas 3D sem melatonina, 3D somente no CIV e controle (P = 0,0323). Em conclusão, o sistema 3D com ou sem melatonina, resulta em maior taxa de blastocisto geral no D9, sem alterar a expressão de OCT4, GPX1, SOD2 e BAX em embriões bovinos. Com base nos dois estudos, conclui-se que a utilização de 10 µM, bem como a utilização do sistema 3D CellFate® melhoram produção embrionária in vitro. Palavras-chave: reprodução, oócito, embrião, antioxidante, cultura tridimensional. 13 ABSTRACT The possibility is that the use of the three-dimensional (3D) culture system, with the use of a bacterial nanocellulose membrane (CellFate®), during in vitro oocyte maturation (IVM) and in vitro embryonic culture (IVC) associated with the addition melatonin in OM increases the production and quality of bovine embryos produced in vitro. To achieve this, this thesis was constructed in three chapters: literature review (Chapter 1); dose-response effect of melatonin added during IVM and/or IVC in the conventional culture system (two-dimensional, 2D) on embryonic production and quality (Chapter 2; Study 1) and association of 3D culture (CellFate®) in IVM and IVC, with the addition of 10 µM (10000 nM) of melatonin in IVM on embryonic production and quality (Chapter 3; Study 2). In study 1, the objective was to evaluate the effects of 0.01, 10 and 10000 nM of melatonin (Sigma Aldrich, M5250), during IVM (Experiment 1), IVC (Experiment 2) and IVM and IVC (Experiment 3). Thus, ovaries from Nellore females (Bos taurus indicus) were collected in a slaughterhouse and oocytes derived from these ovaries were subjected to IVM 24 hours in specific medium with 10% fetal bovine serum (FBS), in addition to the treatments. Next, oocytes and sperm are formed co-cultured 18 hours. The probable zygotes were transferred to the synthetic fluid oviduct medium added with 2.5% FBS, in addition to the treatments, where they were cultured for 9 days. All stages were carried out in drops of cultivation submerged in oil for interested cultivation in Petri dishes in an incubator at 38.5°C and a humid atmosphere with 5% CO2. Cleavage, blastocyst and hatching rates were evaluated at 3, 7 and 9 days of culture, respectively, considering IVF as day 0 (D0). At 9 days, hatched blastocysts were collected to evaluate the expression of OCT4 (POU class 5 homeobox 1), SOD2 (superoxide dismutase 2), GPX1 (glutathione peroxidase 1), and BAX (BCL2 associated X) by RT-qPCR. The data were subjected to analysis of variance followed by the application of contrasts. The cleavage rate was not changed in the three experiments. In Experiment 1, the use of melatonin determined on D7, a tendency for a greater number of hatched (P = 0.0686) and total (P = 0.0892) blastocysts in the 10000 nM group compared to the 0.01 nM group. On D9, 14 we encouraged a greater number of total blastocysts (P = 0.0216) in the 10000 nM group compared to the 0.01 nM group and a tendency (P = 0.0741) for a greater number of blastocysts hatched in the 10000 nM group compared to the 0.01 nM group. No differences were observed for RT-qPCR. In experiments 2 and 3, no important differences in embryo production were observed. In conclusion, the addition of melatonin only to IVM determines a trend towards better embryonic production rates when 10000 nM was compared to 0.01 nM and that such addition did not alter the expression of OCT4, SOD2, GPX1 and BAX transcripts. In study 2, the aim was to evaluate the effect of the 3D system on IVM, IVC or IVM and IVC, as well as the impact of 10 µM melatonin on IVM in the presence or absence of the 3D system during an IVM. Ovaries from Bos taurus indicus × Bos taurus taurus females were collected in a slaughterhouse for oocyte recovery. The IVM, IVF and IVC steps, as well as the analyzes followed the protocol described for Study 1, except that all steps were performed in 4-well plates. The IVM, IVF and IVC steps, as well as the analyzes followed the protocol described for Study 1. The 3D system with melatonin showed higher cleavage rates in D3 compared to control (P = 0.0300) and to the 3D system without melatonin (P = 0.0313). On D7, the 3D system with melatonin showed higher early blastocyst rates compared to the control (P = 0.0079). On D9, the 3D system with melatonin showed higher expanded blastocyst rates compared to the 3D system without melatonin (P = 0.0491), higher overall blastocyst rates compared to the control (P = 0.0160) and 3D system without melatonin groups. melatonin (P = 0.0193). The use of the 3D system alone in IVM resulted in an overall blastocyst rate similar to the 3D system with melatonin, with these two systems being superior to the 3D systems without melatonin, 3D only in IVC and control (P = 0.0323). In conclusion, the 3D system with or without melatonin results in higher overall blastocyst rates at D9, without altering the expression of OCT4, GPX1, SOD2 and BAX in bovine embryos. Based on our two studies, in conclusion, the use of 10 µM as well as the use of the 3D CellFate® system improves in vitro embryo production. Keywords: reproduction, oocyte, embryo, antioxidant, three-dimensional culture. 15 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 16 2. CAPÍTULO 1: REVISÃO DE LITERATURA.......................................................... 20 2.1.PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES.................................................................. 20 2.2.ESTRESSE OXIDATIVO EM OÓCITOS E EMBRIÕES DURANTE A PIVE....... 21 2.3.PROPRIEDADES BENÉFICAS DA MELATONINA.............................................. 23 2.4.EFEITOS DA MELATONINA EM COMPLEXOS CUMULUS-OÓCITO E EMBRIÕES................................................................................................................ 24 2.5.SISTEMAS DE CULTIVO TRIDIMENSIONAL...................................................... 30 2.6.SISTEMAS DE CULTIVO TRIDIMENSIONAIS BASEADOS EM MATRIZES DE NANOCELULOSE BACTERIANA................................................................... 31 2.7.HIPÓTESE.................................................................................................................. 32 2.8.OBJETIVOS............................................................................................................... 33 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................ 35 CAPÍTULO 2: ESTUDO 1............................................................................................... 56 CAPÍTULO 3: ESTUDO 2............................................................................................... 107 16 1. INTRODUÇÃO A demanda mundial por alimentos cresce de forma proporcional ao aumento da população. O Brasil possui alta representatividade quando se trata da atual e futura produção de alimentos. Em busca de alcançar o máximo de êxito no que se refere aos 17 objetivos preconizados pela Organização das Nações Unidas (ONU) até 2030, especialmente "Fome Zero, Consumo e Produção Responsável, Ação Climática e Vida na Terra", o Brasil busca ferramentas para a produção mais eficiente de alimentos, incluindo a produção de proteína animal. A Organização das Nações Unidas para a Alimentação e Agricultura (FAO, 2022) reconheceu o Brasil como o detentor do maior rebanho bovino comercial do mundo, estimado em 234,4 milhões de animais. Considerando o sistema de produção de carne e a fase de cria, a importância no aumento da eficiência reprodutiva, aliado ao melhoramento genético dos produtos nascidos, fez com que a produção in vitro de embriões (PIVE) se estabelecesse como uma ferramenta biotecnológica com aplicação crescente no mundo e especialmente no Brasil. A PIVE em bovinos, possibilita a multiplicação exponencial de fêmeas geneticamente superiores. Estabelecendo uma análise comparativa, fêmeas submetidas à inseminação artificial em tempo fixo produzem um bezerro ao ano e até 10 bezerros ao longo de sua vida reprodutiva (LOIOLA et al., 2014). Tal número pode ser grandemente ampliado com o uso intensivo da aspiração folicular guiada por ultrassonografia aliada à PIVE. A associação dessas biotécnicas utilizada intensivamente possibilita às fêmeas a contabilização do equivalente a um bezerro por semana, gerando assim um grande aumento no número de proles ao longo da vida produtiva e reprodutiva (VARAGO; MENDONÇA; LAGARES, 2008; LOIOLA et al., 2014). De acordo com Viana (2022), em 2021 foram produzidos no mundo 1.521.018 embriões bovinos pelo sistema in vitro, número 3,96 vezes maior que a produção in vivo, que foi de 386.374 no mesmo ano. A PIVE envolve as etapas de coleta de oócitos, maturação in vitro dos oócitos (MIV), fertilização in vitro dos oócitos (FIV) e cultivo in vitro dos embriões (CIV). As etapas de MIV e FIV são 17 realizadas com aceitável eficiência. Entretanto, sete dias após o início do CIV, a porcentagem de oócitos inicialmente cultivados que se desenvolvem até o estágio de blastocisto é de aproximadamente 40% (RIZOS et al., 2008). Assim, torna-se de grande interesse o aperfeiçoamento da PIVE, para um maior êxito na taxa de conversão de oócitos em blastocistos após sete dias de cultivo. A manipulação exercida sobre os oócitos e embriões na execução da PIVE, assim como as próprias condições do cultivo, reconhecidamente se associam para promover o estresse oxidativo (GUÉRIN et al., 2001; SOTO-HERAS e PARAMIO, 2020). Tal estresse é caracterizado pelo desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a remoção delas através de sistemas enzimáticos ou não. As EROs determinam danos celulares e favorecerem o desencadeamento dos mecanismos apoptóticos nas células (LI et al., 2019). Níveis supra fisiológicos de EROs foram relacionados ao envelhecimento e aberrações cromossômicas em oócitos (LORD; MARTIN; AITKEN, 2015; MIHALAS et al., 2017; SASAKI et al., 2019). A melatonina (N-acetilsalicílico-5-metoxitriptamina) é um hormônio com propriedades antioxidantes e reconhecidamente determina efeitos importantes na proteção dos tecidos ovarianos contra o estresse oxidativo (TAMURA et al., 2012; MANCHESTER et al., 2015; REITER et al., 2016; RAI; GOSH, 2021), regulando a expressão das enzimas superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPX), ambas envolvidas na remoção de EROs (TATEMOTO et al., 2004; WANG et al., 2014a). Reportou-se que a melatonina, encontrada no fluído folicular, protege diretamente os oócitos das EROs (TATEMOTO et al., 2004; FATEHI et al., 2005; TAMURA et al., 2012) e age inibindo a formação de EROs (TAMURA et al., 2020). Observações recentes permitem sugerir que a melatonina favorece o desenvolvimento de oócitos e/ou embriões em diferentes espécies, como murinos (TIAN et al., 2017b; KESHAVARZI et al., 2018a; EZZATI et al., 2018), ovinos (TIAN et al., 2017a), bovinos (YANG et al., 2017; MARQUES et al., 2018; AN 18 et al., 2019; PANG et al., 2019), suínos (LEE et al., 2018; NIE et al., 2018; WANG; ZENG, 2018) e caprinos (SAEEDABADI et al., 2018). Para a espécie bovina, a melatonina já foi testada na maturação oocitária e/ou cultivo embrionário. Cebrian-Serrano et al. (2013), em seu estudo, utilizaram a melatonina em ambas as etapas da PIVE. Nesse estudo, os autores investigaram a capacidade da melatonina atenuar efeitos nocivos do estresse térmico durante a PIVE que foi realizada a partir de ovários provenientes de abatedouro. O grupo genético dos animais utilizados não foi especificado no referido trabalho e, até o momento, não temos conhecimento de estudos com o uso de melatonina durante a PIVE com oócitos e embriões provenientes de fêmeas Nelore (Bos taurus indicus). O desenvolvimento embrionário inicial, in vivo, ocorre no oviduto sob influência de estímulos hormonais sistêmicos e locais, entre o embrião e epitélio tubário, onde o embrião modula localmente a expressão gênica, síntese de proteínas e atividade secretora das células tubárias, bem como sua velocidade de trânsito da tuba até a cavidade uterina (KÖLLE; HUGHES; STEELE, 2020). Na PIVE convencional, as etapas de MIV e CIV são realizadas em um sistema de cultivo bidimensional (2D), onde oócitos e embriões são cultivados em placas na presença de um meio de cultivo estabelecido, padecendo da ausência dos estímulos provenientes do tecido materno. No sistema 2D, parte do oócito ou embrião se adere na superfície da placa de cultivo ocasionando; na área em contato direto com a placa, a restrição de troca entre a estrutura e os componentes do meio de cultivo. Além disso, nos primeiros quatro dias de desenvolvimento in vivo dos embriões, o oviduto apresenta contrações musculares que determinam movimentos progressivos e retrógrados repetitivos do embrião no lúmen do oviduto. Tal movimentação é determinada por uma força mecânica que não é estabelecida nos cultivos in vitro (LI; WINUTHAYANON, 2017). Frente a esse contexto, surge a necessidade de se buscar novas perspectivas que possam melhor mimetizar o ambiente fisiológico que envolve os oócitos e embriões, com a expectativa de contribuir para um aumento na produção e qualidade dos embriões produzidos. Dentro dessa proposta, uma 19 das alternativas pode ser o cultivo tridimensional (3D), que permite ao oócito e embrião estabelecer a área de troca nas suas três dimensões, ampliando a área de superfície de troca entre tais estruturas e os componentes do meio de cultivo. Relata-se que o ambiente 3D oferece um ambiente fisiologicamente mais similar ao microambiente uterino materno quando comparado ao 2D, com a possibilidade de exercer in vitro, a depender do material utilizado, força mecânica semelhante àquela exercida pela matriz extracelular in vivo, condição favorável ao desenvolvimento in vitro (WOODRUFF; SHEA, 2007). Com base nessas informações, um novo tipo de membrana, denominada Cellfate® (Biocelltis Biotecnologia S.A, Brasil), constituída por biopolímeros naturais à base de nanocelulose bacteriana foi desenvolvida para o cultivo de diferentes tipos celulares. Até o momento, não foram realizadas pesquisas que avaliassem o emprego da membrana Cellfate® na PIVE e, considerando que o aperfeiçoamento das condições de cultivo de gametas e embriões bovinos se faz necessário diante do que foi exposto, esse trabalho foi desenvolvido para investigar os efeitos da utilização do referido sistema 3D. Além disso a utilização de melatonina durante a PIVE foi implementada. Essas modificações foram propostas com o objetivo de melhorar a taxa de sucesso da PIVE. O ineditismo do trabalho apresentado refere-se aos efeitos do cultivo 3D com membrana Cellfate® associado a melatonina, adicionada aos meios de cultivo de oócitos e embriões bovinos a partir de oócitos obtidos de fêmeas da raça Nelore, no desenvolvimento embrionário. 134 5. CONCLUSÃO Em conclusão, a PIVE em sistema 3D CellFate® associado com a melatonina na MIV, bem como a utilização do sistema 3D CellFate® isoladamente na MIV, resultam em melhor taxa de blastocisto geral no D9, sem alterar a expressão dos transcritos OCT4, GPX1, SOD2 e BAX em embriões bovinos. 135 AGRADECIMETOS O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de Doutorado. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (Processo no 2022/01110- 3), pelo auxílio financeiro ao referido projeto. 136 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANTOLÍN, I.; RODRÍGUEZ, C.; SÁINZ, R. M.; MAYO, J. C.; URÍA, H.; KOTLER, M. L.; RODRÍGUEZ-COLUNGA, M. J.; TOLIVIA, D.; MENÉNDEZ-PELÁEZ, A. Neurohormone melatonin prevents cell damage: effect on gene expression for antioxidant enzymes. The FASEB Journal, [s. l.], v. 10, n. 8, p. 882–890, 1996. Disponível em: . BAHADORI, M. 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