Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Instituto de Química Campus de Araraquara Renan Lira de Farias COMPOSTOS DE PALÁDIO(II) CONTENDO TIOSSEMICARBAZONAS: SÍNTESE, INTERAÇÃO COM ALVOS ENZIMÁTICOS E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTITUMORAL Araraquara 2020 Renan Lira de Farias COMPOSTOS DE PALÁDIO(II) CONTENDO TIOSSEMICARBAZONAS: SÍNTESE, INTERAÇÃO COM ALVOS ENZIMÁTICOS E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTITUMORAL Araraquara 2020 Tese apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Química. Orientador: Prof. Dr. Adelino Vieira de Godoy Netto Co-orientador: Prof. Dr. rer. nat. Adriano Bof de Oliveira Tese de Doutorado Farias, R. L. 2 Tese de Doutorado Farias, R. L. 3 Tese de Doutorado Farias, R. L. 4 DADOS CURRICULARES DADOS PESSOAIS Nome: Renan Lira de Farias E-mail: renanlira1402@gmail.com Data de Nascimento: 14/02/1988 Endereço: Av. Itápolis, 2291, Bella Vista, Araraquara/SP, CEP: 14800-040 Nacionalidade: Brasileira Naturalidade: Aracaju/SE Filiação: Silvânia Lira de Farias Genilson Mendes de Farias FORMAÇÃO ACADÊMICA 2016 – 2020 Doutorado em química Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, IQ-UNESP, Campus de Araraquara Projeto: Compostos de Paládio(II) contendo tiossemicarbazonas: síntese, interação com alvos enzimáticos e avaliação do potencial antitumoral Orientador: Prof. Dr. Adelino Vieira de Godoy Netto Co-orientador: Prof. Dr. rer. nat. Adriano Bof Oliveira 2012 – 2013 Mestrado em química Universidade Federal de Sergipe, DQI, Campus São Cristóvão. Projeto: Síntese e caracterização da (3’,4’-Metilenodioxi)acetofenona tiossemicarbazona Orientador: Prof. Dr. rer. nat. Adriano Bof Oliveira 2006 - 2010 Bacharelado em Química Universidade Federal de Sergipe, DQI, Campus São Cristóvão. 2007 - 2009 Curso técnico profissionalizante em Análise e Processos Químicos Instituto Federal de Sergipe, IFS Tese de Doutorado Farias, R. L. 5 ATUAÇÃO PROFISSIONAL Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP 2016 – 2020 Doutorando: bolsista de doutorado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES; 2019 – 2019 Docente auxiliar: Programa de Aperfeiçoamento e Apoio à Docência no Ensino Superior – PAADES (A); 2018 – 2019 Avaliador de painéis: CIC – Congresso de Iniciação Científica IQAr 2018 – 2018 Bolsista didático: Departamento de Química Geral e Inorgânica; 2016 – 2016 Estágio docência: Departamento de Química Geral e Inorgânica; MasterLimp Controle de Pragas e Serviços LTDA 2015 – 2016 Químico: responsável técnico; Universidade Federal de Sergipe 2013 - 2015 Professor Substituto: Departamento de Química; 2012 - 2013 Mestrando: Departamento de Química; National Oilwell Varco do Brasil 2010 – 2011 Técnico Químico Jr: Supervisor da CTC/AL; Prêmios e Títulos 2018 Best Poster: Brazilian Meeting on Inorganic Chemistry / VI Latin American Meeting on Biological Inorganic Chemistry / Brazilian Meeting on Rare Earths, SBQ – Divisão de Química Inorgânica; 2017 Best Poster: 18 th International Conference on Biological Inorganic Chemistry, Inorganics – MDPI; Orientações 2019-2020 Ana Maria Romão Polez Iniciação científica (co-orientador) Planejamento e obtenção de novos metalofármacos baseados em tiossemicarbazonas com pronunciadas atividades antitumorais. Bolsa CNPq-PIBIT; 2019-2019 Ana Beatriz Lazzarini Trabalho de conclusão de Curso (co-orientador) Novos complexos de Pd(II) contendo tiossemicarbazonas: citotoxicidade, estudos de interação com proteínas e avaliação do potencial antitumoral. Bolsa CNPq-PIBIC Tese de Doutorado Farias, R. L. 6 ATIVIDADES ACADÊMICAS RELEVANTES Artigos científicos publicados em periódicos 1. ROCHA, FILLIPE V. ; FARIAS, RENAN L. ; BATISTA, VICTOR S. ; NASCIMENTO- JÚNIOR, NAILTON M. ; GARRIDO, SAULO S. ; LEOPOLDINO, ANDRÉIA M. ; GOTO, RENATA N. ; OLIVEIRA, ADRIANO B. ; BECK, JOHANNES ; LANDVOGT, CHRISTIAN ; MAURO, ANTÔNIO E. ; NETTO, ADELINO V.G. Computational studies, design and synthesis of Pd(II)-based complexes: Allosteric inhibitors of the Human Topoisomerase-IIα. Journal of Inorganic Biochemistry, v. 199, p. 110725, 2019. (primeiro- autor equivalente). 2. GISLAINE A. DA CUNHA, RONAN F. F. DE SOUZA, RENAN L. DE FARIAS, MARIETE B. MOREIRA, DÉBORA E. S. SILVA, RENAN D. ZANETTI, DANIEL M. GARCIA, DANIEL G. SPINDOLA, LUIS F. G. MICHELIN, CLAUDIA BINCOLETTO, ALINE A. DE SOUZA, ALYNE A. ANTUNES, WAGNER A. DE S. JUDICE, RENAN C. F. LEITAO, VICTOR M. DEFLON, ANTÔNIO E. MAURO, ADELINO V. G. NETTO. Cyclopalladated compounds containing 2,6-lutidine: Synthesis, spectral and biological studies. Journal of Inorganic Biochemistry Vol 203, (2020), 110944 3. VIEIRA, M. A. ; FARIAS, R. L. ; NETTO, A. V. G. ; NASCIMENTO-JÚNIOR, NAILTON M. Phosphine- and Isatin-Copper Complexes: Anticancer Activity, Mechanisms of Action and Structure-Activity Relationship Examples from the Last Ten Years. Medicinal & Analytical Chemistry International Journal (MACIJ), v. 3, p. 000142, 2019. (Review) 4. BOZZA, GABRIELA F. ; DE FARIAS, RENAN L. ; DE SOUZA, RONAN F.F. ; ROCHA, FILLIPE V. ; BARRA, CAROLINA V. ; DEFLON, VICTOR M. ; DE ALMEIDA, EDUARDO T. ; MAURO, ANTONIO E. ; NETTO, ADELINO V.G. . Palladium orthometallated complexes containing acetophenoneoxime: Synthesis, crystal structures and hirshfeld surface analysis. JOURNAL OF MOLECULAR STRUCTURE, v. 1175, p. 195- 207, 2018. 5. FARIAS, R. L.; GODOY NETTO, ADELINO VIEIRA DE ; NASCIMENTO JUNIOR, N. M. ; MAURO, A. E. ; ROCHA, F. V. ; OLIVEIRA, A. B. ; JESS, I. ; NÄTHER, C. . 18th International Conference on Biological Inorganic Chemistry. JBIC. Journal of Biological and Inorganic Chemistry (on-line), v. 22, p. 1-278, 2017.(abstract) 6. VELASQUES, JECIKA MACIEL ; GERVINI, VANESSA CARRATU ; BORTOLUZZI, ADAÍLTON JOÃO ; FARIAS, RENAN LIRA DE ; OLIVEIRA, ADRIANO BOF DE . Crystal structure of (3 E )-5-nitro-3-(2-phenylhydrazinylidene)-1 H -indol-2(3 H )-one. Acta Crystallographica Section E, Crystallographic Communications, v. 73, p. 168-172, 2017. 7. OLIVEIRA, ADRIANO BOF DE ; BECK, JOHANNES ; LANDVOGT, CHRISTIAN ; FARIAS, RENAN LIRA DE ; FEITOZA, BÁRBARA REGINA SANTOS . Crystal structure of N -ethyl-2-(1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-ylidene)hydrazinecarbothioamide. Acta Crystallographica Section E, Crystallographic Communications, v. 73, p. 291-295, 2017. 8. OLIVEIRA, GABRIELA PORTO DE ; BRESOLIN, LEANDRO ; FLORES, DARLENE CORREIA ; FARIAS, RENAN LIRA DE ; OLIVEIRA, ADRIANO BOF DE . Crystal structure of (2 E )-3-[4-(dimethylamino)phenyl]-1-(thiophen-2-yl)prop-2-en-1-one. Acta Crystallographica Section E, Crystallographic Communications, v. 73, p. 476-480, 2017. 9. VELASQUES, JECIKA MACIEL ; GERVINI, VANESSA CARRATU ; KICKOFEL, LISLIANE ; FARIAS, RENAN LIRA DE ; OLIVEIRA, ADRIANO BOF DE . Hirshfeld analysis and molecular docking with the RDR enzyme of 2-(5-chloro-2-oxoindolin-3-ylidene)- N -methylhydrazinecarbothioamide. Acta Crystallographica Section E, Crystallographic Communications, v. 73, p. 702-707, 2017. http://lattes.cnpq.br/6731547818441441 Tese de Doutorado Farias, R. L. 7 10. MARTINS, BIANCA BARRETO ; BRESOLIN, LEANDRO ; FARIAS, RENAN LIRA DE ; OLIVEIRA, ADRIANO BOF DE ; GERVINI, VANESSA CARRATU . Crystal structure, Hirshfeld analysis and molecular docking with the vascular endothelial growth factor receptor-2 of (3 Z )-5-fluoro-3-(hydroxyimino)indolin-2-one. Acta Crystallographica Section E, Crystallographic Communications, v. 73, p. 987-992, 2017. 11. OLIVEIRA, ADRIANO BOF DE ; BECK, JOHANNES ; DANIELS, JÖRG ; FARIAS, RENAN LIRA DE . 2-[( E )-(2 S ,5 R )-2-Isopropyl-5-methylcyclohexylidene]- N - methylhydrazine-1-carbothioamide. IUCrData, v. 1, p. x160459, 2016. 12. OLIVEIRA, ADRIANO BOF DE ; NÄTHER, CHRISTIAN ; JESS, INKE ; FARIAS, RENAN LIRA DE ; RIBEIRO, IASMIN ALVES . Crystal structure of ( )-2-[1-(benzo[ ][1,3]dioxol-5-yl)ethylidene]- -methylhydrazine-1-carbothioamide. Acta Crystallographica. Section E, v. 71, p. o35-o36, 2015. 13. OLIVEIRA, ADRIANO BOF DE ; LIRA DE FARIAS, RENAN ; NÄTHER, CHRISTIAN ; JESS, INKE . Crystal structure of ( E )-2-[1-(1,3-benzodioxol-5-yl)ethylidene]- N - ethylhydrazine-1-carbothioamide. Acta Crystallographica Section E, Crystallographic Communications, v. 71, p. o208-o209, 2015. 14. OLIVEIRA, ADRIANO BOF DE ; BECK, JOHANNES ; DANIELS, JÖRG ; FARIAS, RENAN LIRA DE ; GODOY NETTO, ADELINO VIEIRA DE . Crystal structure of ( E )-2- [(2 S ,5 R )-2-isopropyl-5-methylcyclohexylidene]hydrazine-1-carbothioamide. Acta Crystallographica. Section E, v. 70, p. o903-o904, 2014. 15. OLIVEIRA, ADRIANO BOF DE ; FARIAS, RENAN LIRA DE ; NÄTHER, CHRISTIAN ; JESS, INKE ; BRESOLIN, LEANDRO . 1-(2 H -1,3-Benzodioxol-5-yl)ethanone thiosemicarbazone. Acta Crystallographica. Section E, v. 69, p. o644-o644, 2013. Manuscritos submetidos para publicação 1. RENATA C. ALVES, GUILHERME N LUCENA, RENAN L DE FARIAS, PATRÍCIA B DA SILVA, ISABEL C DA SILVA, FERNANDO R PAVAN, MARLUS CHORILLI, ANA MARIA C FERREIRA E REGINA C FREM. Copper(II) biocompatible coordination solids as potential platforms for diclofenac delivery systems. (manuscrito submetido ao periódico Powder Technology), Abril/2020; 2. CAUÊ B. SCARIM, RENAN L DE FARIAS, DIEGO E CHIBA, ADELINO V. G. NETTO, ELIZABETH I FERREIRA, CHUNG M CHIN. Current advances of medicinal inorganic chemistry against neglected tropical diseases as chagas disease, sleeping sickness, leishmania and malaria - new metal-based compounds. (manuscrito submetido ao periódico European Journal of Medicinal Chemistry), Fev/2020; Participação em bancas de trabalho de conclusão de curso 2019 Farias, R. L., Pilon, T.P.F., Resende, F. A. Participação em banca de Nayara Natsue Braga de Brito. Caracterização de espécies do gênero Cavernicola Barber 1937 (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae) pelo método MALDI-TOF-MS. Graduação em Farmácia – Universidade de Araraquara (UNIARA); Revisor de Periódico 2020 – atual Journal of Molecular Structure; 2020 - atual Journal of Drug Design and Medicinal Chemistry; Tese de Doutorado Farias, R. L. 8 Dedico esta Tese de Doutorado À minha amada noiva, Mônica Cardoso Santos, uma mulher guerreira, corajosa e determinada. Fonte da qual recebo amor, carinho e atenção em todos os momentos. A minha vitória também é sua. Amo-te além do que os olhos podem ver. Aos meus pais, Genilson e Silvânia, e irmãos, Danilo, Douglas e Mariana, como homenagem ao amor incondicional que sentimos. Ao Prof. Dr. Adelino V. G. Netto e ao Prof. Dr. Adriano Bof de Oliveira, como reconhecimento e profunda gratidão àqueles que deram a mim uma oportunidade para avançar e desenvolver. Tese de Doutorado Farias, R. L. 9 Agradecimentos Ao Deus todo poderoso no qual encontro grande força através da fé. Ao meu orientador, Prof. Dr. Adelino, por sua competência, amizade e bom humor. Sempre disposto a debater questões do trabalho com muita atenção. Muito obrigado por todos os ensinamentos e tentar compreender todas as minhas ideias sobre o trabalho. Pude desenvolver muitas habilidades e competências sob vossa orientação, sendo esses fatores imperativos ao desenvolvimento da tese. Ao meu coorientador, Prof. Dr. Adriano, pela amizade, pelos ensinamentos, sólida colaboração científica e, principalmente, por sempre acreditar no meu potencial. Além disso, reitero a minha gratidão pela indicação ao grupo de Química de Coordenação e Organometálicos. Ao Instituto de Química da UNESP pela excelente infraestrutura oferecida. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Aos meus pais Genilson e Silvânia, pelo exemplo de vida e por minha formação como ser humano. Aos meus irmãos Danilo, Douglas e Mariana pelo apoio incansável e, sobretudo pelo amor, otimismo e inspiração. À minha amada noiva Mônica por estar sempre presente, apoiando, incentivando e torcendo por mim. Aos meus sobrinhos de coração Ana Clara e Gustavo e aos meus sogros José Cardoso e Silvany. À minha amiga Jeane (Beca), a Enedina e Carlos Eduardo. Muito obrigado. Ao Prof. Dr. Nailton M. do Nascimento-Júnior e ao Prof. Dr. José Clayston Pereira, pelas contribuições ao comporem a banca de qualificação. Em especial, ao Prof. Nailton por abrir completamente as portas do Laboratório de Química Medicinal – Síntese Orgânica e Modelagem Molecular (LaqMedSOMM). Sua cooperação e amizade foram essenciais para a execução desse trabalho, sobretudo, os estudos in silico. Estendo meus agradecimentos aos colegas do LaqMedSOMM, Victor, Marcelle, Natália, Thaiz e Berthold. Ao Prof. Dr. Fillipe V. Rocha (UFSCar) pela amizade e firme cooperação científica através da qual publicamos bons trabalhos. Estendo meus agradecimentos aos colegas Mauro, Gabriela (Gabi), Herisson (Belém), Vitor (Vitão), Ludmila e George (Juvenil). Em especial agradeço ao Mauro pelos ensaios de inibição da Top2α e interação com DNA plasmideal por corrida eletroforética. Ao Prof. Dr. Javier Alcides Ellena (IFSC-USP) pelas medidas e resolução das estruturas cristalinas dos complexos 2, 3 e 6 através da técnica de difração de raios X por monocristal. À Dra. Zumira A. Carneiro (FCFRP-USP), pelos ensaios de citotoxicidade com as linhagens LLC-MK2 e MCF-7. Ao Prof. Dr. Saulo Santesso Garrido e a doutoranda Carolina Reis Zambom, pelos ensaios hemolíticos. À minha amiga Débora Soares, pelos inúmeros ensaios de viabilidade celular, troca de ideias, risadas e, obviamente, por todas as fatias de bolo de leite ninho que comemos no Gerhard Plus. Tese de Doutorado Farias, R. L. 10 À minha amiga Dra. Mariete B. Moreira por sua contribuição com os experimentos referentes aos estudos de ligação com as biomoléculas DNA/HSA, por sua amizade e grande coração. À Profa. Dra. Chung Man Chin por ter nos recebido em seu Laboratório de Desenvolvimento de Fármacos – Lapdesf da FCF/UNESP. Estendo meus agradecimentos ao meu amigo Dr. Cauê B. Scarim pelos valorosos ensaios in vivo e alguns churrascos, chopes e bom futebol. Ao Prof. Dr. Antônio Eduardo Mauro por quem apresento grande admiração e tive o privilégio de assistir aulas, ouvir conselhos e compartilhar o mesmo ambiente de trabalho. Muito obrigado pela convivência agradável, pelos livros e pelas conversas sobre os nossos times de futebol, Botafogo e Corinthians. À querida Profa. Regina Frem, uma pessoa muito gentil, animada e integradora. Uma pesquisadora com ideias inovadoras, sem medo de sair da zona de conforto. Uma professora prestativa e estudiosa. Aprendi demais atuando ao seu lado como bolsista didático. Gostaria ainda de estender meus agradecimentos aos colegas do grupo Applied MOFs, em especial a Camila, Carol, Gil, Guilherme, Jader, Lucas, Mariana, Olavo, Renan e Renata. A todos os técnicos do departamento de Química Geral e Inorgânica – DQGI, em especial ao meu amigo Rafael R. Domeneguetti (PT), pelos espectros de infravermelho, por sua amizade e toda dedicação em nos ajudar com a parte operacional dos laboratórios de pesquisa do térreo. Além disso, ao Dr. Nivaldo pelos conselhos acerca dos espectros de RMN de 1 H, 13 C e 31 P e bom humor. À Jécika (chinelagem), uma amiga gaúcha “faca na bota” muito especial que tive o prazer de conhecer no IQ, em 2017. Espero continuar dando muitas risadas ouvindo suas maluquices. Aos amigos Guilherme (Gibbs), Wesley (Baiano), Thales e York (Maricon) que usaram mais a minha churrasqueira do que eu. Assim como, os parceiros Marcelo (Morto), Mayra, Camilinha, Brenda, Rodrigo, Paca, Mineiro, Thúlio, Zé, Batera, Piauí, dentre outros que não estão descritos, mas contribuíram para uma excelente estadia em Araraquara durante os últimos quatro anos. Aos companheiros de laboratório, Ana Beatriz, Ana Polez, Bárbara, Gabriela (Vizinha), Gislaine, Manuela, Nathalia, Renan Zanetti e Ronan que direta ou indiretamente participaram do desenvolvimento deste trabalho. Muito Obrigado! Tese de Doutorado Farias, R. L. 11 “... se você só fizer o que sabe, não vai ser nada além do que já é...” Mestre Shifu em Kung Fu Panda III “Chemistry is wonderful! I feel sorry for people who don't know anything about chemistry. They are missing an important part of life, an important source of happiness, satisfying one's intellectual curiosity. The whole world is wonderful and chemistry is an important part of it.” Linus Carl Pauling Tese de Doutorado Farias, R. L. 12 RESUMO Prescrições semanais de 2 a 5 mg kg-1 de cisplatina tem oferecido um avanço no tratamento de vários tipos de cânceres geniturinários, sendo as taxas de sobrevida ca. 98%. Contudo, os complexos de Pt(II) se mostram inespecíficos frente às células normais de rápida proliferação, o que limita a dose a ser administrada. Nesta tese de doutorado, foram preparados oito complexos de Pd(II) do tipo [PdCl2(L)PPh3]Cl (família 1 a 4) e [Pd(L)2] (família 5 a 8), onde PPh3 = trifenilfosfina e L = trans- cinamaldeído-N4-R-tiossemicarbazona (R = H, Metila, Etila e Fenila). Os compostos foram caracterizados através das técnicas espectroscópicas de infravermelho com transformada de Fourier, ressonância magnética nuclear de 1H, 13C e 31P. As formulas mínimas e purezas dos compostos foram determinadas através de microanálise CHN%. Dados de condutância molar em DMF exibiram o perfil de eletrólito 1:1 para 1-4, enquanto os complexos 5 a 6 foram não eletrólitos. Os complexos 2, 3 e 6 formaram cristais aptos aos experimentos de difração de raios X por monocristal e obtiveram suas estruturas cristalinas resolvidas. Com o intuito de selecionar compostos líderes, ensaios in vitro de citotoxicidade e efeitos hemolíticos foram conduzidos como sequência de triagem. As respectivas citotoxicidades para todos os compostos foram investigadas pelo método colorimétrico MTT e expressas como CI50, frente às culturas tumorais humanas MCF-7 (adenocarcinoma mamário) e A549 (carcinoma de pulmão). Além disso, os índices de seletividade (IS) foram estimados a partir das razões entre os valores de CI50 frente às culturas celulares não tumorais MRC5 (fibroblasto de pulmão) e LLC- MK2 (rim de macaco Rhesus). Assim, três compostos foram considerados promissores (L3, 3 e 7), entretanto, apenas o complexo 3 exibiu padrões aceitáveis de hemólise, < 9 %. Ensaios de supressão de fluorescência evidenciaram que adições crescentes de 3 promovem decréscimo na banda de emissão correspondente a HSA (max = 333 nm) através de um mecanismo de supressão misto (dinâmico + estático). Os parâmetros termodinâmicos ∆H > 0 e ∆S > 0 indicaram que o processo ocorre por interações predominantemente hidrofóbicas. Outros estudos de ligação com a biomolécula ctDNA foram empregados. O valor da constante de formação aparente (Kb = 6,63 x 103 M-1), em combinação aos experimentos de CD e competição com a sonda Hoechst 33258 sugerem fraca interação do complexo 3 pelo ctDNA. A atividade antitumoral de 3 foi investigada in vivo através do implante de tumor xenográfico de células MCF-7 em camundongos nude BALB/c. Em dose única (i.p) de 5 mg kg-1, 3 exibiu atividade antitumoral capaz de retardar a progressão tumoral entre o 2º e 7º dia de tratamento, com regressão do tumor até o 16º dia de tratamento. É importante ressaltar que a partir do 7º dia de tratamento até o 4º dia após o tratamento, 3 induziu a redução de apenas 7,8 % no peso corporal dos animais. Esses resultados são promissores tendo em vista que a redução está de acordo com padrões éticos. A capacidade de 3, e seus análogos, 1, 2 e 4, em inibir a ação de decatenação do kDNA mediada pela enzima Topoisomerase IIα foi avaliada pela técnica de eletroforese em gel de agarose. Os dados mostraram que apenas 3 e 4 foram capazes de inibir parcialmente o funcionamento da enzima para as concentrações entre 1 a 100 μM, enquanto que 2 demonstra leve atividade a 100 μM. Cálculos in silico sugeriram que 2, 3 e 4 estariam atuando como moduladores alostéricos. Portanto, os resultados dessa tese são promissores e parecem convergir ao arcabouço molecular [Pd(II)(TSC)PR3] (sendo, TSC = tiossemicarbazona bidentada e PR3 = fosfina terciária) como arquitetura privilegiada para o design de novos metalofármacos antitumorais mais seletivos as células tumorais como resultado da afinidade por outro alvo terapêutico que não o DNA. Tese de Doutorado Farias, R. L. 13 Abstract Weekly, prescriptions ranging at 2-5 mg kg-1 of cisplatin have offered an advance in the treatment of several genitourinary cancers, being survival rates ca. 98%. On the other hand, Pt(II) complexes are no selective in rapidly proliferating normal cells, which limits the dose to be administered. Herein, eight Pd (II) complexes of the type [PdCl2(L)PPh3]Cl (1-4) and [Pd(L)2] (5-8) were prepared (where, PPh3 = triphenylphosphine and L = trans-cinnamaldehyde-N4-R-thiosemicarbazone; R = H, Methyl, Ethyl and Phenyl). The compounds were characterized by using infrared and NMR 1H, 13C and 31P spectroscopic techniques. The minimum formula and purities of them were determined by using CHN% microanalysis. Molar conductivity data (at DMF) showed the electrolyte profile 1:1 to 1-4, while complexes 5-6 were non-electrolytes. Complexes 2, 3 and 6 formed suitable crystals for single-crystal X-ray diffraction experiments and their crystalline structures were solved. To select leading compounds, in vitro cytotoxicity and RBC hemolytic assays were performed out as a screening. For all compounds, the cytotoxicities were investigated by the MTT colourimetric method and expressed as IC50 in human tumour cultures MCF-7 (mammary adenocarcinoma) and A549 (lung carcinoma). Besides, selectivity index (IS) were estimated from the ratios between IC50 values against non-tumour cells MRC5 (lung fibroblast) and LLC-MK2 (Rhesus monkey kidney). Accordingly, three compounds were considered promising (L3, 3 and 7), however, just 3 showed acceptable patterns of hemolysis, e.g., hemolysis < 9 %. Based on fluorescence trials, increasing concentration of 3 promotes a quenching of the emission band corresponding to HSA (max = 333 nm) through a mixed suppression mechanism. The thermodynamic parameters ∆H> 0 and ∆S> 0 indicated the process occurs by hydrophobic interactions. Other binding studies to ctDNA were employed out. The value of the binding constant, Kb = 6.63 x 103 M-1 with both CD and competition experiments with the Hoechst 33258 dye suggested a weak affinity of complex 3 for the ctDNA structure. The antitumor activity of 3 was investigated in vivo by tumour xenograft implantation of MCF-7 cells in BALB/c nude mice. Take into account a single dose (i.p) of 5 mg kg-1 day-1, 3 exhibited antitumor activity capable of delaying tumour progression between the 2nd and 7th day of treatment, also tumour regression until the 16th day of treatment. It is important to note that after the 7th day of treatment until the 4th day after treatment, 3 induced 7.8% of body weight loss. These results are promising considering the reduction does not exceed ethical standards. The ability of 3, and its analogues, 1, 2 and 4, to inhibit the kDNA decatenation action mediated by the Topoisomerase IIα enzyme was evaluated using the agarose gel electrophoresis technique. The data showed that only 3 and 4 were able to partially inhibit enzyme function in a concentration ranging at 1- 100 μM, whereas 1 was inactive and 2 shows poor activity at 100 μM. In silico calculations suggested that 2, 3 and 4 would be acting as allosteric modulators. Therefore, the results of this thesis are promising and seem to converge to the molecular scaffold [PdII(TSC) PR3] (being, TSC = bidentate thiosemicarbazone and PR3 = tertiary phosphine) as a privileged architecture for the design of new metallodrugs with greater selectivity against tumours cells, as a result of affinity by another therapeutic target than DNA. Tese de Doutorado Farias, R. L. 14 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Percentual mundial de óbitos provocados por algum tipo de câncer, em 2018. Dados normalizados para indivíduos entre 5 a 74 anos. À esquerda, gráfico de setores para indivíduos do sexo masculino. À direita, dados referentes aos indivíduos do sexo feminino. Fonte [3]. .................................................................................................................................. 28 Figura 2. Percentual estimado para novos casos, em 2018, considerando indivíduos de ambos os sexos. Os dados estão normalizados para pacientes entre 5 a 74 anos. Fonte [3]. .............. 29 Figura 3. Estágios da carcinogênese. ...................................................................................... 30 Figura 4. Angiogênese e metástase. Adaptado de [12]. .......................................................... 31 Figura 5. Esquema estrutural dos organoarsênicos de Ehrlich (Salvarsan e Neosalvarsan), assim como o complexo de Au(I), Auranofin, utilizados no tratamento da sífilis e artrite reumatoide, respectivamente. ................................................................................................... 32 Figura 6. Representação da supressão da mitose levando a filamentação. Fotografias tiradas ao longo do tempo com a completa regressão do tumor de sarcoma-180. Adaptado de [28] .. 33 Figura 7. Linha do tempo referente às aprovações de complexos metálicos, baseados na cisplatina, como fármacos antineoplásicos. Fonte, Autor. ....................................................... 34 Figura 8. Cisplatina, análogos e estruturas cristalinas dos adutos formados entre a cisplatina (PDB ID: 1AIO)[33] e a oxaplatina (PDB ID: 1PG9) [34] com o DNA através do link cruzado 1,2-intrafita. .............................................................................................................................. 35 Figura 9. Proposta de modos de ação para a cisplatina, e possíveis mecanismos de resistência ao fármaco. Fonte: Adaptado de [36]. ...................................................................................... 36 Figura 10. Algumas geometrias, números de coordenação (NC) e seus respectivos grupos pontuais para complexos metálicos discretos. M = metal, L = ligante monodentado. Fonte, Autor. ........................................................................................................................................ 38 Figura 11. Representação geral de uma molécula de ATP em seu sítio de ligação de uma proteína cinase. Adaptado de [55]. ........................................................................................... 39 Figura 12. Ilustração da região de ligação da adenina no sítio de ligação do ATP, o qual é conservado nas cinases GSK3 e Pim1. Da esquerda para direita, ATP, estaurosporina e complexos de Ru(II) miméticos. As ligações de hidrogênio estabelecidas com as cadeias laterais dos resíduos GLU81 e LEU83 estão representadas como linhas tracejadas. Adaptado de [39, 58] ................................................................................................................................ 40 Figura 13. Esquema estrutural dos complexos NP309, DW12, L-FL172 e L-FL411. Análise cristalográfica dos adutos formados no domínio ATPase da cinase PAK1. Os complexos estão representados na forma de volumes espaciais. Adaptado de [53]. ........................................... 41 Figura 14. Exemplos de complexos metálicos reportados como inibidores in vitro da cat B. Adaptado de [39]. ..................................................................................................................... 42 Figura 15. Regiões N- e C-terminal da cat B codificadas em azul e vermelho, respectivamente. O sítio catalítico está representado como de bastões e a alça de oclusão está representada na forma de tubo em cor cinza. ........................................................................... 42 Figura 16. Espécime com tumor de Walker-256 após 12 dias de inoculação. Pata esquerda tratada com (2). Pata direita, controle negativo. Adaptado de [68]. ........................................ 43 Tese de Doutorado Farias, R. L. 15 Figura 17. Ilustração simplificada do mecanismo enzimático da Top2α para o desenovelamento do DNA superenovelado (ou catenado). Adaptado de [84]. ....................... 45 Figura 18. Estruturas de inibidores da Top2α. Adaptado de [39] ........................................... 45 Figura 19. Estruturas de inibidores catalíticos da Top2α. Adaptado de [39]. ......................... 46 Figura 20. Representação geral das reações e estruturas de ligantes tiossemicarbazonas e complexos de Cu(II) avaliados por Zegglis e colaboradores. Adaptado de [89]. .................... 47 Figura 21. Ensaio de inibição da Top2α, em gel de agarose, pelos complexos de formula geral [Cu(TSC)Cl], onde TSC = tiossemicarbazonas, em (A) estão os onze complexos em [10 mM] e em (B) estão as onze TSC livres em [100 mM]. (C) experimento de Western blot. Adaptado de [89]. ..................................................................................................................... 48 Figura 22. Representação das estruturas dos complexos quadrático-planos de Cu(II) e octaédrico de Ni(II) e suas faixas de CI50 frente a linhagem celular humana U397 (linfoma histiocítico). A figura está simplificada para melhor visualização. Adaptado de [46]. ........... 48 Figura 23. Poses de ancoragem molecular melhores pontuadas para os complexos quadrático- planares de Cu(II) contendo tiossemicarbazonas derivadas da quinolina. Adaptado de [46]. . 49 Figura 24. Variação do desdobramento do campo cristalino no diagrama de orbitais do centro metálico n𝒅𝟖 (n = número quântico principal) como resultado do alongamento de ligações ao longo do eixo z. ........................................................................................................................ 50 Figura 25. Representação generalizada de o mecanismo associativo em complexos quadrático-planares de Pd(II). Fonte, Autor. ............................................................................ 51 Figura 26. Ilustração da hibridização entre os orbitais * e orbitais 3d vazios do átomo de P, retrodoação em uma ligação M—P e diagrama simplificado de orbitais moleculares [100, 102] ........................................................................................................................................... 53 Figura 27. Etapas reacionais envolvidas na hidrólise de ligantes quelantes. (1) dissociação do primeiro sítio de ligação e reorientação do ligante; (2) Entrada da primeira molécula de água; (3) dissociação do segundo sítio de ligação e reorientação do ligante; (4) entrada da segunda molécula de água. Adaptado de [111]. ..................................................................................... 54 Figura 28. Esquema geral de uma TSC, a ordem de numeração segundo a IUPAC e alguns modos de coordenação. Adaptado de [41, 120]. ...................................................................... 54 Figura 29. Agente antineoplásico, Padeliporfin. .................................................................... 55 Figura 30. Gráfico de barras (número de publicações por ano) desenvolvido a partir da coleta de informações na base SCOPUS, utilizando as palavras-chave "Topoisomerase II", "Palladium" e "inhibitor". Fonte: Autor. ................................................................................. 56 Figura 31. Complexos [PdX(N S)(PPh3)]X (onde, PPh3 = trifenilfosfina; N S = 4-fenil-3- tiossemicarbazida ou 4-metil-3-tiossemicarbazida; X = Cl - , Br - , I - , SCN - ). Adaptado de [48]. .................................................................................................................................................. 57 Figura 32. (A - D) ensaio de relaxação do DNA superenovelado pela Top2α. C- = controle negativo, C+ = controle positivo, 1-8 = complexos em concentrações de 5 a 100 μM. Adaptado de [48]. ..................................................................................................................... 58 Figura 33. Mecanismo sugerido para formação das tiossemicarbazonas deste trabalho com base nas reações de adição nucleofílica de compostos carbonilados e formação de iminas. Fonte, Autor. ............................................................................................................................ 77 Tese de Doutorado Farias, R. L. 16 Figura 34. Trajetória de Bürgi-Dunitz. Ângulo formado entre o plano da carbonila e o caminho de ataque do nucleófilo ao sítio de ligação eletrofílico. Fonte: Victor & Alves [158]. .................................................................................................................................................. 78 Figura 35. Espectros de ATR-FTIR dos ligantes tiossemicarbazonas (L1 – L4). .................. 80 Figura 36. Possíveis formas tautoméricas (tiona e tiol) para as tiossemicarbazonas (L1 - L4). .................................................................................................................................................. 81 Figura 37. Representações estruturais e esquema de numeração para os ligantes L1 a L4. ... 82 Figura 38. Espectro de RMN de 1 H para o composto L1 em DMSO-d6. Fonte, Autor. ......... 83 Figura 39. (A) Formas canônicas de ressonância para o fragmento tioamida e forma zwitteriônica. (B) Hidrogênios tioamídicos quimicamente não equivalentes. Fonte, Autor. .. 83 Figura 40. Esquema geral de tiossemicarbazonas: conformação anti com a presença de uma ligação de hidrogênio intramolecular e a conformação syn. Fonte, Autor. .............................. 84 Figura 41. Espectro de RMN de 1 H para o composto L2 em CDCl3. Fonte, Autor. ............... 85 Figura 42. Espectro de RMN 1 H para o composto L3 em CDCl3. Fonte, Autor. ................... 86 Figura 43. Espectro de RMN de 1 H para o composto L4 em DMSO-d6. Fonte, Autor. ......... 86 Figura 44. Representações simplificadas dos efeitos eletrônicos de doação e retrodoação de elétrons  entre os ligantes Cl - e PPh3 ao centro metálico de Pd(II). Fonte, adaptado de [102]. .................................................................................................................................................. 89 Figura 45. Ilustração simplificada para a competição da densidade eletrônica do centro metálico de Pd(II) ocorrendo coordenações de ligantes de natureza -aceitadora em posição trans. ......................................................................................................................................... 89 Figura 46. Espectros de ATR-FTIR para os complexos 1 a 4 na região entre 4000 – 500 cm -1 . Fonte, Autor. ............................................................................................................................ 91 Figura 47. Espectro de RMN de 1 H, em CDCl3, para o complexo 1 em (14,1 T). Fonte, Autor .................................................................................................................................................. 92 Figura 48. Efeito indutivo de polarização da densidade eletrônica através da coordenação. . 93 Figura 49. Espectro de RMN de 31 P do complexo 1 em DMSO-d6. Fonte, Autor. ................ 94 Figura 50. Espectros de ATR-FTIR para os complexos 5 a 8 entre 4000 – 500 cm -1 . Fonte, Autor. ........................................................................................................................................ 96 Figura 51. Espectro de RMN de 1 H para o complexo bisquelato 6 em DMSO-d6 (14,1 T). .. 97 Figura 52. Espectro de correlação HSQC de 13 C( 1 H) para o complexo 6. .............................. 98 Figura 53. Estruturas cristalinas dos complexos 2 e 3 e esquema de identificação dos átomos. Elipsoides térmicos em nível de 50% de probabilidade. Átomos de hidrogênio representados no padrão de esferas com raio 0,15 Å. ................................................................................... 100 Figura 54. Espectros de RMN de 1 H para 1 em CDCl3 (linha azul) e DMSO-d6 (linha vermelha). ............................................................................................................................... 103 Figura 55. Diagrama ORTEP para estrutura cristalina e molecular do complexo 6 e esquema de identificação dos átomos. Elipsoides térmicos em nível de 50 % de probabilidade. Átomos de hidrogênio representados no padrão de esferas com raio 0,15 Å. (i): 2-x, -y, 1-z. ............ 105 Tese de Doutorado Farias, R. L. 17 Figura 56. Reação de redução do MTT (sal de coloração amarela, solúvel em solventes polares) a formazan (cristais de cor violeta, insolúveis em solventes polares). ..................... 107 Figura 57. Esquema estrutural dos complexos binucleares de Pd(II) e Pt(II), assim como valores selecionados de IC50 frente a linhagem tumoral humana A278cisR (câncer de ovário resistente a cisplatina), relatados por Matesanz e colaboradores [184]. ................................ 109 Figura 58. Esquema estrutural, valores de CI50 (μM) e índices de seletividade (IS) para os compostos mais promissores após ensaio de viabilidade celular. .......................................... 110 Figura 59. Aspectos das suspensões de hemácias + complexos após 1 h de incubação a 37 ºC e centrifugação a 3000 rpm e concentração de 10 μM para (A) 3 e (B) 7. Fonte, Autor. ...... 112 Figura 60. Espectros de RMN de 1 H e 31 P( 1 H) para o composto-protótipo 3 (em 14,1 T) coletado nos tempos de 0, 24 e 48 h. ...................................................................................... 114 Figura 61. Estrutura cristalina da HSA (PDB ID: 2BDX)[197], resolvida por difração de raios X (3,05 Å) com identificação dos domínios (I, II e II) e subdomínios de ligação (Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa, IIIb). ................................................................................................................... 116 Figura 62. Esquerda, espectros de fluorescência da HSA a 298 K na ausência e na presença de quantidades crescentes do supressor, ex = 280 nm, tampão Tris-HCl (pH = 7,2), [HSA] = 1 μM e [3] = 0 – 8 μM. Direita, gráficos de Stern-Volmer, F0/F vs [3] para diferentes temperaturas 298 e 310 K. ...................................................................................................... 117 Figura 63. Gráfico de Log (F0 – F) / F em função do logaritmo da concentração do supressor em 298 e 310 K, para o complexo de interação 3-HSA. ........................................................ 119 Figura 64. Mapa de interações calculado para estrutura cristalina do complexo 3. O mapeamento foi gerado através do emprego de sondas contendo oxigênios carboxílicos e grupos NH neutros. As elipsoides térmicas estão representadas em 40 % de probabilidade. 120 Figura 65. (A) Representação do grupo peptídico em configuração trans, observado do N- terminal para o C-terminal. Distâncias e ângulos de ligação em Å e º, respectivamente. (B) Estruturas canônicas de ressonância. (C) Ângulos de torção (rotação ou ângulos de diedro) em torno da ligação Cα—N () e Cα—C (). Na figura,  =  = 180 °. Adaptado de [204]. .... 121 Figura 66. Espectros de CD para HSA livre e HSA na presença de diferentes concentrações do complexo 3. [HSA] = 5 μM; [3] = 5, 100 e 150 μM. Razões molares (r) = 1, 0,05 3 0,03, respectivamente. ..................................................................................................................... 122 Figura 67. (A) Adutos monofuncionais entre as bases nitrogenadas A, G e C do DNA com a forma ativa da cisplatina. (B) Adutos bifuncionais 1,2-intrafita (G-G), 1,3-intrafita (G-A) e ligação cruzada interfita (G-G). (C) Principais modos de interação não covalentes. Adaptado de [37]. ................................................................................................................................... 124 Figura 68. Espectros eletrônicos na região UV-Vis em tampão salino Tris-HCl (pH = 7,4). (A) 3 na ausência de DNA, [3] = 100 μM. (B) Diferentes razões molares entre ctDNA e 3, [3] = 20 μM e [DNA] = 0 – 60 μM. (C) determinação da constante de ligação Kb a partir da correlação linear de Benesi-Hidelbrand. Fonte, Autor. .......................................................... 125 Figura 69. Espectros de CD para o ctDNA livre (A) e na presença de concentrações crescentes do complexo 3 (B). Fonte, Autor. ......................................................................... 127 Figura 70. Forma canônica B do DNA com identificação dos sulcos. Na figura, os átomos encontram-se na representação de volume completo, no qual os fosfatos estão em destaque Tese de Doutorado Farias, R. L. 18 amarelo para identificação da cadeia principal açúcar-fosfato. O sulco maior em preto e sulco menor em vermelho. ............................................................................................................... 128 Figura 71. (A) Esquema estrutural do H33258. (B) Espectro de absorção (ex  352 nm) e emissão (em  454 nm) para H33258 livre apresentando o desvio de Stokes. (C) Complexo de interação H33258-DNA, dodecâmero d(CGCAAATTTGCG), no sulco menor. ............. 129 Figura 72. Espectro de supressão da fluorescência do aduto H33258 – ctDNA, [aduto] = 20 μM, na ausência e na presença de diferentes concentrações do supressor, [3] = 0, 4, 8, 12, 16 e 20 μM. Curva de Stern-Volmer modificada para determinação da constante de ligação Kb entre 3 e ctDNA. Fonte, Autor. .............................................................................................. 129 Figura 73. (Esquerda) camundongo mostrando um implante de células tumorais MCF-7 (0,8 cm x 0,7 cm) com 7 dias após o inóculo. Fonte, Autor. ......................................................... 131 Figura 74. Efeito do composto-protótipo no desenvolvimento tumoral dos camundongos nude BALB/c inoculados com células MCF-7. (Acima) Progressão dos tumores durante 31 dias. (Abaixo) Pesos tumorais dos animais tratados com PBS (POS), cisplatina (CIS) e 3 (RL- 3). Fonte, Autor. ..................................................................................................................... 132 Figura 75. Progressão tumoral observada nos dias 14, 21 e 31 após inoculação. Fonte, Autor. ................................................................................................................................................ 133 Figura 76. Análise de sobrevivência pelo método Kaplan-Meier para os grupos POS, CIS e RL-3 (n = 5). Fonte, Autor. .................................................................................................... 135 Figura 77. (Esquerda) espécime do grupo POS mostrando uma pequena ulceração sobre o implante xenográfico de tumor MCF-7 com 7 dias após o inóculo. (Direita) exérese de tumor SC após 26 dias de inóculo. Fonte, Autor. ............................................................................. 135 Figura 78. Peso relativo dos camundongos (%) em função dos dias após inóculo. .............. 136 Figura 79. Gráfico de barras entre os valores de CI50 de cada composto frente às linhagens tumorais humanas MCF-7 (mama) e A549 (pulmão). Fonte, Autor. ..................................... 139 Figura 80. Tipo celular por expressão de gene Top2α em TPM (transcrições por milhão). Fonte, adaptado de [239]. ....................................................................................................... 139 Figura 81. Representação esquemática das funções de alívio de tensão ou decatenação do DNA circular pela Top2α. Fonte, Adaptado de [83]. ............................................................. 140 Figura 82. (A) Micrografia eletrônica: corte longitudinal através de uma rede kDNA de C. fasciculata. Cada rede contém cerca de 5000 minicírculos com 2,5 kb cada. (B) Representação de uma rede isolada de minicírculos catenados sobre uma matriz plana. Adaptado de [240]. ................................................................................................................. 141 Figura 83. Ensaio de decatenação do kDNA mediada pela Top2α. ...................................... 141 Figura 84. (Acima) Capacidade inibitória dos complexos 1 a 4 frente ao mecanismo de decatenação do kDNA mediada pela Top2α. Da esquerda para a direita: canaleta 1 = kDNA (DMSO 3,3 % v/v); canaleta 2 = kDNA + Top2α; canaletas 3 – 12 = complexos de 1 a 4 + kDNA + Top2α. (Abaixo) processamento da imagem através do software ImageJ [242]. Fonte, Autor. .......................................................................................................................... 142 Figura 85. Estrutura homodimérica da Top2α (cadeias A e B), PDB ID: 1ZXM. Ambas as cadeias estão codificadas em região N-terminal (azul) e C-terminal (vermelho). No sítio de Tese de Doutorado Farias, R. L. 19 ligação do ATP encontra-se o ligante co-cristalizado ANP coordenado ao íon de função estrutural Mg(II). Fonte, Autor. ............................................................................................. 144 Figura 86. Gráfico de Ramachandran para estrutura cristalográfica PDB: 1ZXM. Regiões mais favoráveis em azul escuro (ideal ≥ 98%), regiões permitidas em azul claro e adicionalmente permitidas em marrom (ideal ≤ 2%) e regiões não permitidas em branco. Para 1ZXM = Favoráveis: 724 resíduos (97,3%), permitidos: 16 resíduos (2,2%) e não permitidos: 3 resíduos (0,4%). Fonte, Autor. ............................................................................................ 145 Figura 87. (Esquerda) gráfico de Ramachandran para a estrutura 1ZXM minimizada. (Direita) visão parcial da cadeia A destacando a distância entre o resíduo LYS276 e o sítio de ligação do ATP. A cadeia principal está representada na forma de “cartoon”. A molécula LYS276 está representada na forma de bastões, os átomos de C em larajna, N em azul e H em branco. Fonte, Autor. .............................................................................................................. 146 Figura 88. (Acima) subunidades referentes ao sítio de ligação do ATP para a cadeia A da Top2α. Bolsão hidrofóbico (azul), bolsão eletrostático (verde). (Abaixo) Gráfico 1 e 2: mapeamento in silico dos resíduos-chave para formação de ligações de hidrogênio e demais contatos intermoleculares, respectivamente. Fonte, Autor. ................................................... 147 Figura 89. (A) Variação conformacional da alça QTK como resultado da conversão do ATP (azul) em ADP (amarelo). (B) Variação do módulo transdutor da Top2α como resultado da alteração conformacional da alça QTK. Cadeias em azul e alça QTK em amarelo. Adaptado de [151]. ................................................................................................................................. 148 Figura 90. Comparação entre as conformações espaciais, experimental e teórica, da micromolécula ANP (Pose 7, RMSD = 0,588 Å) utilizando a função escore ChemPLP. Para o ANP: C = cinza, O = vermelho, N = azul e P = laranja. A estrutura modelada está em cor ciano. Os hidrogênios foram omitidos para melhor visualização. Fonte, Autor [70]. ........... 151 Figura 91. Desvio de átomos pesados para as estruturas teóricas e experimentais 2 e FIO7 [70]. Na figura, a estrutura molecular e cristalina está codificada como C (cinza), N (azul Royal), Cl (verde), I (roxo), P (laranja), S (amarelo) e Pd (azul petróleo). A estrutura modelada está codificada com C (ciano). Todos os hidrogênios foram omitidos a fim de melhor visualização. Fonte, Autor. ........................................................................................ 152 Figura 92. (A) orientação conformacional do ANP e do “hit” FIO7 no domínio ATPase da Top2α (PDB ID: 1ZXM). Proteína está representada na forma de “cartoon”. (B) Conformação bioativa: cadeias laterais dos resíduos de interação estão indicadas como varetas, sendo O (vermelho), (N) azul, (C) verde. FIO7 está representado como bolas e varetas, sendo C (cinza), P (laranja), I (roxo), N (azul Royal), S (amarelo), Pd (ciano). Os átomos de H não polares e resíduos que não interagem foram omitidos para melhor visualização. Fonte, Autor. ..................................................................................................... 153 Figura 93. Pose de docking melhor pontuada para os complexos 2 no domínio ATPase. Na figura, cadeia A (branca), cadeia B (verde), O (vermelho) N (azul Royal). Complexos: C (ciano), N (azul Royal), Cl (verde claro), P (laranja), S (amarelo) e Pd (azul petróleo). Todos os hidrogênios não polares foram omitidos para melhor visualização. .................................. 154 Figura 94. Poses de docking melhores pontuadas para os complexos 3 e 4 no domínio ATPase. Na figura, cadeia A (branca), cadeia B (verde), O (vermelho) N (azul Royal). Complexos: C (ciano), N (azul Royal), Cl (verde claro), P (laranja), S (amarelo) e Pd (azul petróleo). Todos os hidrogênios não polares foram omitidos para melhor visualização. ...... 155 Tese de Doutorado Farias, R. L. 20 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Classificação de topoisomerases em humanos e suscetibilidade a fármacos antineoplásicos. Adaptado de [69, 71]. .................................................................................... 44 Tabela 2. Ângulos de cone  (em, º) para vários ligantes e o modo de determinação, assumindo o comprimento da ligação M-L igual a 2,28 Å e os raios de van der Waals dos átomos mais externos de um ligante. Adaptado de [98]. ......................................................... 52 Tabela 3. Detalhes do cristal, coleta de dados e refinamento das estruturas cristalinas para 2, 3 e 6. ......................................................................................................................................... 68 Tabela 4. Resultados da análise elementar para C, H e N (%) das tiossemicarbazonas sintetizadas L1 - L4 (n = 2) e índice de deficiência de hidrogênio (IDH). Na tabela, Exp. = valor experimental, Cal. = valor teórico, F.M. = fórmula molecular e |E.A.| = (Exp. – Cal) em %. .............................................................................................................................................. 79 Tabela 5. Dados de RMN de 13 C para os ligantes. Cqar i = carbonos quaternários aromáticos. .................................................................................................................................................. 87 Tabela 6. Resultados da análise elementar para C, H e N (%) dos complexos 1-4 (n = 2) e condutância molar a 25 ºC (M /μS cm 2 mol -1 ). Na tabela, Exp. = valor experimental, Cal. = valor teórico, F. M. = fórmula molecular e |E.A.| = Exp. – Cal em %. .................................... 90 Tabela 7. Dados de análise elementar para C, H e N % e condutância molar (M), em DMF a 25 ºC, para os complexos 5 - 8. Exp. = experimental, Cal. = calculado, |E.A.| = erro absoluto em %. ........................................................................................................................................ 95 Tabela 8. Parâmetros geométricos de comprimentos de ângulos de ligação para as unidades assimétricas em 2 e 3. ............................................................................................................. 102 Tabela 9. Parâmetros geométricos selecionados de comprimentos e ângulos de ligação para a estrutura cristalina 6. .............................................................................................................. 106 Tabela 10. Atividade antiproliferativa in vitro dos compostos frente às linhagens tumorais MCF7, A549 e não tumoral MRC5 e LLC-MK2 representadas pelos valores de CI50, em μM. Além disso, índices de seletividade (IS). CDDP = cisplatina. IS * = EC50(LLC-MK2) / CI50(MCF-7) e IS ** = CI50(MRC5) / CI50(A549); N. d. = não determinado. ........................................................... 108 Tabela 11. Percentagem de hemólise em função da absorbância da hemoglobina em 405 nm para diferentes concentrações de L3, 3 e 7. (n = 2). ............................................................... 111 Tabela 12. Valores de KSV, Kq e coeficiente de correlação r, referentes à supressão de fluorescência da HSA com formação do aduto 3/HSA em diferentes temperaturas.............. 118 Tabela 13. Constante de formação aparente (Kb), número de sítios de ligação (n) e parâmetros termodinâmicos envolvidos na interação entre HSA e o complexo 3. ................................... 119 Tabela 14. Dados de constante de ligação Kb, coeficiente de correlação linear (r 2 ) e ponto isosbéstico para a titulação espectrofotométrica na região UV-Vis entre 3 e ctDNA. .......... 126 Tabela 15. Constante de ligação aparente (Kb), número de sítios de ligação (n) e espontaneidade do processo envolvidos na interação entre 3 e o ctDNA. ............................. 130 Tabela 16. Informações pré-clínica e clínica sobre a dose, modo de administração e toxicidade por redução do peso corporal. Fonte, Autor. ........................................................ 137 Tese de Doutorado Farias, R. L. 21 Tabela 17. Valores de Score e desvio (RMSD) para as 10 poses melhores pontuadas do ANP no domínio ATPase da Top2α. Dados gerados a partir do protocolo de ancoragem molecular para 50 corridas em cada função de scoring. Fonte, Autor. ................................................... 150 Tabela 18. Categoria de interação, identificação dos resíduos-chave acerca do reconhecimento molecular, obtidas a partir dos cálculos de ancoragem molecular. (Vermelho) contribuições de natureza eletrostática, (Azul) contribuições de natureza hidrofóbica. Fonte, Autor. ...................................................................................................................................... 156 LISTA DE ESQUEMAS Esquema 1. Planejamento estrutural de compostos-protótipos de Pd(II) a partir do composto [PdI(4-MeT)(PPh3)]I (PPh3 = trifenilfosfina; 4-MeT = 4-metil-3-tiossemicarbazida). Fonte, Autor. ........................................................................................................................................ 59 Esquema 2. Reação de obtenção dos ligantes, onde EtOH = etanol, R = H, metila, etila e fenila. Fonte, Autor. ................................................................................................................. 62 Esquema 3. Síntese dos complexos de Pd(II) 1, 2, 3 e 4 com fórmula geral [PdCl(L)PPh3]Cl, onde L = tiossemicarbazona derivada do cinamaldeído, PPh3 = trifenilfosfina e ACN = acetonitrila. Fonte, Autor. ........................................................................................................ 64 Esquema 4. Síntese dos complexos de Pd(II) 5, 6, 7 e 8 com fórmula geral [Pd(L)2], onde L = tiossemicarbazona derivada do cinamaldeído, ACN = acetonitrila e Pd(OAc)2 = acetato de paládio(II). Fonte, Autor. ......................................................................................................... 66 Esquema 5. Proposta de mecanismo reacional para formação dos complexos de Pd(II) com fórmula geral [PdCl(L)PPh3]Cl (1 a 4). Adaptado de [163]. ................................................... 88 Esquema 6. Síntese dos complexos de Pd(II) com fórmula geral [Pd(L)2], 5 - 8. Fonte, Autor. .................................................................................................................................................. 94 Tese de Doutorado Farias, R. L. 22 LISTA DE ANEXOS Figura S 1. Autorização para uso de animais em pesquisa, Protocolo CEUA/FCF/CAr 02/2019. .................................................................................................................................. 174 Figura S 2. Parecer número CEA 066/2016 para gestão de resíduos. ................................... 175 Figura S 3. Termos de licença de autoria Springer para uso de dados em tese e dissertações ................................................................................................................................................ 176 Figura S 4. Permissão de autor da Elsevier para uso de dados em teses e dissertações com fim não comercial. ........................................................................................................................ 177 Figura S 5. Espectro de 13 C( 1 H) (em 14,1 T) para o ligante L1 em DMSO-d6. .................... 178 Figura S 6. Espectro de 13 C( 1 H) (em 14,1 T) para o ligante L2 em DMSO-d6. .................... 179 Figura S 7. Espectro de 13 C( 1 H) (em 14,1 T) para o ligante L3 em DMSO-d6. .................... 180 Figura S 8. Espectro de 13 C( 1 H) (em 14,1 T) para o ligante L4 em DMSO-d6. .................... 181 Figura S 9. Espectro de RMN de 1 H em CDCl3 (14,1 T) para o complexo 2. Fonte, Autor. 182 Figura S 10. Espectro de RMN de 1 H em CDCl3 (14,1 T) para o complexo 3. Fonte, Autor. ................................................................................................................................................ 183 Figura S 11. Espectro de RMN de 31 P (9,4 T) para os complexos 2, 3 e 4 em DMSO-d6. ... 184 Figura S 12. Espectro de RMN 1 H em DMSO-d6 (14,1 T) para o complexo 5. ................... 185 Figura S 13. Espectro de RMN 1 H em DMSO-d6 (14,1 T) para o complexo 7. Fonte, Autor. ................................................................................................................................................ 186 Figura S 14. Espectro de RMN de 1 H em DMSO-d6 (14,1 T) para o complexo 8. Fonte, Autor. ...................................................................................................................................... 187 Tese de Doutorado Farias, R. L. 23 ACRÔNIMOS A549 Carcinoma de pulmão ACN Acetonitrila ANP -imino-adenina-trifosfato ATP Adenosina trifosfato CDDP Cisplatina CI50 Concentração inibitória media ctDNA DNA calf thymus DMF N,N’ - dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado EtOH Etanol GHKL Gyrase, Hsp90, histidina Kinase e MutL HSA Albumina do soro humano LLC-MK2 Células epiteliais de Rim (macaco Rhesus) MCF-7 Adenocarcinoma mamário humano MeOH Metanol MRC5 Fibroblasto de pulmão MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolio PDB Protein Data Bank PM7 Parametrized model 7 PPh3 Trifenilfosfina IS Índice de seletividade TCZ Tiossemicarbazida TOP1 Topoisomerase I TOP2A Topoisomerase IIα TOP2B Topoisomerase II TSC Tiossemicarbazona Tese de Doutorado Farias, R. L. 24 ESQUEMAS ESTRUTURAIS Tese de Doutorado Farias, R. L. 25 SUMÁRIO 1. Introdução 28 1.1. Dados Estatísticos Sobre o Câncer 28 1.2. Bases Moleculares e Tratamento do Câncer 29 1.3. Uso de Metais para o Tratamento de Enfermidades 32 1.4. Complexos de Pt(II) como Agentes Antineoplásicos 34 2. Revisão da Literatura 38 2.1. Complexos Metálicos como Inibidores de Enzimas 38 2.2. Inibidores de Proteínas Cinases 38 2.3. Inibidores de Cisteíno-Proteases 41 2.4. Inibidores de Topoisomerases 44 2.5. Complexos quadrático-planares de Pd(II) bioativos 50 3. Projeto 55 3.1. Justificativa e Hipótese 55 3.2. Desenho molecular dos complexos 59 4. Objetivos 60 4.1. Objetivos específicos 60 5. Parte Experimental 61 5.1. Procedência de reagentes e solventes 61 5.2. Medidas físicas 61 5.3. Síntese e caracterização dos compostos 62 5.2.1. Ligantes tiossemicarbazonas (N, S-quelantes) 62 5.2.2. Síntese do complexo precursor [PdCl2(ACN)2], ACN = acetonitrila 63 5.2.3. Síntese dos complexos do tipo [PdCl(L)PPh3] 64 5.2.4. Síntese dos complexos do tipo [Pd(L)2] 65 5.4. Coleta de dados e resolução das estruturas por difração de raios X 67 5.5. Ensaio de estabilidade em solução 69 5.6. Atividade antitumoral e interações com biomoléculas 69 5.6.1. Preparo do Tampão Tris-HCl 5 mM, Tris = 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanediol 69 5.6.2. Preparo do Tampão Tris-HCl 5 mM + 50 mM de NaCl 69 5.6.3. Preparo da solução de ctDNA (Calf thymus) 69 Tese de Doutorado Farias, R. L. 26 5.6.4. Preparo da solução de albumina do soro humano (1 mM) 70 5.6.5. Ensaio de viabilidade celular 70 5.6.6. Ensaio Hemolítico 70 5.6.7. Titulação espectrofotométrica do DNA por UV-vis 71 5.6.8. Ensaio de interação com DNA via dicroísmo circular 72 5.6.9. Ensaio de competição pelo DNA com Hoechst 33258 72 5.6.10. Ensaio de interação com a HSA por fluorescência 73 5.6.11. Ensaio de interação com a HSA por dicroísmo circular 74 5.6.12. Ensaio de inibição da Top2α: decatenação do DNA 74 5.7. Abordagem in silico 74 5.7.1. Optimização geométrica dos complexos 74 5.7.2. Preparo da enzima Top2α 75 5.7.3. Ancoragem molecular 75 5.8. Ensaio antitumoral com tumor xenográfico de células MCF-7 75 5.8.1. Aquisição e manutenção dos animais 75 5.8.2. Inoculação das células tumorais 76 5.8.3. Administração do complexo [PdCl(L3)PPh3]Cl (3) 76 6. Resultados e discussão 77 6.1. Ligantes tiossemicarbazonas L1 – L4 77 6.1.1. Análise elementar 78 6.1.2. Espectroscopia vibracional na região do infravermelho 79 6.1.3. Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1 H e 13 C( 1 H) 81 6.2. Complexos de Pd(II) do tipo [PdCl(L)PPh3]Cl (1 – 4) 88 6.2.1. Análise elementar e condutividade molar 90 6.2.2. Espectroscopia vibracional na região do infravermelho 90 6.2.3. Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1 H e 31 P 91 6.3. Complexos de Pd(II) do tipo [Pd(L)2] (5 – 8) 94 6.3.1. Analise elementar e condutividade molar 95 6.3.2. Espectroscopia vibracional na região do infravermelho 96 6.3.3. Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1 H 97 6.4. Análise estrutural via difração de raios X por monocristal 99 6.4.1. Estruturas cristalinas dos complexos 2 e 3 99 6.4.2. Estrutura cristalina do complexo 6 104 6.5. Ensaios biológicos de triagem in vitro 106 6.5.1. Avaliação da atividade antiproliferativa 106 6.5.2. Ensaio de efeito hemolítico 111 6.5.3. Teste de estabilidade química em solução 113 6.6. Ensaios de interação com biomoléculas (HSA / DNA) 115 6.6.1. Estudos de ligação com albumina do soro humano 115 6.6.2. Avaliação conformacional da HSA por dicroísmo circular 121 6.6.3. Estudos de ligação com DNA 123 6.6.4. Análise conformacional do DNA por CD 126 6.6.5. Ensaio de competição por deslocamento do Hoechst 33258 127 Tese de Doutorado Farias, R. L. 27 6.7. Avaliação antitumoral em camundongos nude BALB/c 130 6.7.1. Indução do tumor Xenográfico 131 6.7.2. Ação do composto-protótipo 3 sobre a progressão tumoral 132 6.7.3. Análise de sobrevida e efeito do tratamento sobre peso corporal 134 6.8. Prospecção de um alvo farmacológico proteico 138 6.9. Ensaio de inibição da Top2α: abordagem in vitro 140 6.10. Estudos in silico: ancoragem molecular 144 6.10.1. Análise topológica da estrutura proteica 144 6.10.2. Redocagem do ligante ANP (-imino-adenina-trifosfato) 149 6.10.3. Ancoragem molecular dos complexos de Pd(II) 152 7. Considerações finais 157 8. Referências 160 9. ANEXOS 174 Tese de Doutorado Farias, R. L. 28 1. Introdução 1.1. Dados Estatísticos Sobre o Câncer Em âmbito mundial, conforme os dados disponibilizados pela União Internacional Contra o Câncer (UICC) e pela Organização Mundial de Saúde (OMS), o câncer monopoliza quase 12% de todas as causas de óbitos, sendo considerada como a segunda enfermidade mais letal [1, 2]. Atualmente, as mortes ocasionadas por algum tipo de câncer contabilizaram em 9,6 milhões, dessas  42 % consistiam em indivíduos entre 30 a 69 anos [1]. Além disso, a previsão até 2025 incidi em uma média de 6 milhões de óbitos por ano. Dentre os tipos de câncer com maiores índices de mortalidade, se destacam os de pulmão, fígado, estômago, colorretal, esôfago, pâncreas e próstata para os homens, assim como os de mama, pulmão, colo do útero, colorretal, estômago, fígado e ovário para as mulheres, Fig 1. Figura 1. Percentual mundial de óbitos provocados por algum tipo de câncer, em 2018. Dados normalizados para indivíduos entre 5 a 74 anos. À esquerda, gráfico de setores para indivíduos do sexo masculino. À direita, dados referentes aos indivíduos do sexo feminino. Fonte [3]. Na América Latina, em 2018, ocorreram 1.064,235 casos novos de câncer. Desse montante, o Brasil correspondeu por quase 40 % (431 mil casos), Fig. 2. Além disso, foram notificadas 165 mil mortes, em território nacional, ocasionadas pela doença. Ou seja, 38 % dos pacientes brasileiros diagnosticados com câncer vieram a falecer no referido ano [3, 4]. Tese de Doutorado Farias, R. L. 29 Figura 2. Percentual estimado para novos casos, em 2018, considerando indivíduos de ambos os sexos. Os dados estão normalizados para pacientes entre 5 a 74 anos. Fonte [3]. Segundo o Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva (INCA), no Brasil, para o triênio 2020-2022 estima-se 625.000 casos novos. O câncer de pele não melanoma será o mais incidente com 177.000 ocorrências, acompanhado pelos cânceres de mama e próstata (66.000, cada), cólon e reto (41.000), pulmão (30.000) e estômago (21.000)[4]. Em resumo, afora os problemas com saúde pública, os dados supracitados anteveem um impacto econômico negativo, principalmente aos países emergentes. Esse episódio reafirma a necessidade por investimentos em projetos que estejam engajados na ampliação dos tratamentos, em práticas de conscientização sobre a doença e no desenvolvimento de novos fármacos com pronunciadas atividades anticâncer. 1.2. Bases Moleculares e Tratamento do Câncer Câncer é um nome geral utilizado para definir um conjunto multifacetado de doenças que lesionam tecidos do corpo à medida que células geneticamente mutadas se multiplicam descontroladamente [5]. Os diferentes tipos de câncer correspondem às várias linhagens celulares presentes no organismo. Dessa forma, são classificados como carcinomas (tecidos epiteliais e glandulares), sarcomas (tecidos moles), leucemias (medula óssea), linfomas Tese de Doutorado Farias, R. L. 30 (sistema linfático), mielomas (medula óssea) e tumores do sistema nervoso central (células gliais) [6]. A superexpressão de células anormais resulta na formação de tumores primários, os quais se expandem além de seus limites habituais e invadem tecidos circunvizinhos. O processo de formação da massa tumoral se denomina carcinogênese e pode ser compreendido por três etapas principais: iniciação, promoção e progressão [7], Fig. 3. Figura 3. Estágios da carcinogênese. No primeiro estágio (iniciação), seja por disfunções epigenéticas ou exposição prolongada a agentes carcinogênicos, o conteúdo genético de um pequeno número de células é alterado. Observa-se ativação da oncogene e inativação do gene p53 (supressor do tumor). Na segunda etapa (promoção), as células tornam-se malignas com metabolismos aberrantes. Finalmente, no terceiro estágio (progressão) ocorre a multiplicação descontrolada de células anômalas que culmina na formação do tumor [7]. Como o microambiente tumoral é hipóxico e ácido, a vascularização é estimulada para suprir a demanda de nutrientes e oxigênio para o crescimento tumoral [8, 9]. Esse processo é denominado angiogênese e tem relação íntima com quadros clínicos de cânceres invasivos. Tumores sólidos com superexpressão de proteases (principalmente as catepsinas B e L) facilmente comprometem a membrana basal, permitindo-lhes acesso a corrente sanguínea e, por conseguinte, se redistribuir para outras partes do corpo [10, 11]. Este processo é denominado metástase e se configura como um dos maiores entraves à terapêutica do câncer, Fig. 4. Tese de Doutorado Farias, R. L. 31 Figura 4. Angiogênese e metástase. Adaptado de [12]. Após o diagnóstico, a modalidade de tratamento a ser adotada dependerá do estadiamento, das características biológicas do tumor e do quadro de saúde do paciente. Portanto, podem ser prescritos procedimentos localizados (cirurgia e radioterapia), assim como os procedimentos sistêmicos (quimioterapia, hormonioterapia e terapia alvo). Nas últimas décadas, a escolha pela quimioterapia, ou uma combinação desta com outra modalidade, tem prevalecido [4]. Por exemplo, em estágios avançados, pacientes têm sido tratados com radioterapia combinada ao antimetabólico 5-Fluoracil (5-FU), capaz de bloquear a síntese do DNA [13]. Outro exemplo consiste na quimioterapia neoadjuvante que tende a diminuir o volume do tumor antes da cirurgia [14]. Todavia, para uma quantidade expressiva de pacientes, a quimioterapia não é eficaz ou deixará de ser. A ineficácia de muitos fármacos ocorre por conta dos quadros de resistência celular, seja ela intrínseca ou adquirida durante o tratamento. Ao mesmo tempo, outro empecilho faz referência à toxicidade dos agentes antineoplásicos disponíveis no mercado. Quimioterápicos apresentando baixos índices de seletividade (IS) têm desencadeado efeitos colaterais indesejados durante, ou após, o período de tratamento. Os danos mais recorrentes revelam nefrotoxicidade, neurotoxicidade, mielossupressão, ototoxicidade, toxicidade ocular, cardiotoxicidade, náuseas, vômitos e lesões gastrointestinais. Assim, dada a importância da quimioterapia para o tratamento do câncer, mas levando em consideração o atual panorama, se ressalta a urgência por novas estratégias que viabilizem a produção de novos quimioterápicos com pronunciadas atividades antineoplásicas, sobretudo que apresentem maiores índices de seletividade. Tese de Doutorado Farias, R. L. 32 1.3. Uso de Metais para o Tratamento de Enfermidades A química inorgânica não é apenas a química dos seres inanimados, mas sim uma parte essencial da vida [15-17]. Metais em sistemas biológicos possuem diferentes papéis. Por exemplo, elementos dos grupos 1 e 2 desempenham funções de manutenção dos balanços de carga e osmótico. O íon Zn(II) (grupo 12) possui função estrutural na superóxido dismutase (SOD). Por outro lado, metais com estados redox acessíveis em meio fisiológico, tal qual o par redox Fe II/III (grupo 8), são sítios transportadores de elétrons e participam dos processos da respiração celular [17]. O uso de metais para manutenção da saúde é milenar. Povos egípcios e chineses a 3000 a.C. já utilizavam cobre e ouro em elixires [17, 18]. Mais recente, durante a epidemia europeia de sífilis entre os séculos XV e XVI, compostos de Hg(II) foram aplicados [19]. Contudo, somente entre os anos de 1909 a 1930 que Paul Ehrlich e uma equipe multidisciplinar realizaram criteriosas observações em torno das relações estrutura-atividade para uma série de 2000 complexos de arsênio [20-22]. Este trabalho marcou a introdução do rigor científico ao uso medicinal de compostos metálicos, determinando o conceito do índice terapêutico (IT = LD50/ED50), isto é, a razão entre a dose necessária para matar 50 % dos animais testados (LD50) e a dose necessária que resulta numa resposta terapêutica efetiva em 50 % dos animais testados (ED50). A partir desses estudos, os complexos Salvarsan e seu análogo menos tóxico Neosalvarsan (Fig. 5) foram aprovados para o tratamento da sífilis [23]. Os organoarsênicos de Ehrlich foram amplamente utilizados na Europa até próximo a 1950, quando foram substituídos pela penicilina. Outro exemplo significativo da química inorgânica medicinal é a crisoterapia. Em 1985, o complexo de Au(I), Auranofin (Fig 5), foi aprovado para o tratamento da artrite reumatoide [24, 25]. Figura 5. Esquema estrutural dos organoarsênicos de Ehrlich (Salvarsan e Neosalvarsan), assim como o complexo de Au(I), Auranofin, utilizados no tratamento da sífilis e artrite reumatoide, respectivamente. Tese de Doutorado Farias, R. L. 33 Sem dúvida, o maior evento impulsionador para o desenvolvimento da química inorgânica medicinal atual ocorreu em meados da década de 1960 quando Barnett Rosenberg, na Universidade do Estado de Michigan, ao investigar o efeito do campo elétrico no crescimento da bactéria Escherichia coli, em solução, percebeu que o complexo cis- [PtCl2(NH3)2], cisplatina, formado acidentalmente no meio, era capaz de inibir a mitose celular [26, 27], Fig. 6. Figura 6. Representação da supressão da mitose levando a filamentação. Fotografias tiradas ao longo do tempo com a completa regressão do tumor de sarcoma-180. Adaptado de [28] Os efeitos citotóxicos da cisplatina foram posteriormente confirmados in vivo onde através de uma dose com 8 mg kg -1 regrediu e eliminou os tumores de sarcoma-180 em camundongos após 36 dias de protocolo, Fig. 6. Além disso, durante os 11 meses seguintes, as tentativas de reimplante dos tumores foram frustradas por rejeições imunológicas [28]. Em 1971, a cisplatina entrou para os testes clínicos, no National Cancer Institute – NCI, sendo aprovada em 1978 pela U.S. FDA (United State Food and Drug Adminstration) para o uso clínico em cânceres de testículo e ovário [28, 29]. Tese de Doutorado Farias, R. L. 34 1.4. Complexos de Pt(II) como Agentes Antineoplásicos O ano de 2020 marca os 42 anos em que a U.S. FDA aprovou o primeiro metalofármaco antitumoral baseado em Pt(II) [30]. Prescrições semanais de 5 mg kg -1 de cisplatina, em associação com outros quimioterápicos, implicou no avanço do tratamento de vários tipos de cânceres geniturinários, principalmente o testicular, no qual as taxas de sobrevida aumentaram em até 98% [14, 26, 29-31]. Contudo, esse complexo se mostra inespecífico frente às células normais de rápida proliferação, limitando assim a dose a ser administrada. O sucesso e as limitações da cisplatina motivaram a elaboração de outros metalofármacos inspirados nesse arcabouço molecular. A carboplatina, oxaplatina, nedaplatina, lobaplatina e heptaplatina podem ser citados [30-32], Fig 7. Figura 7. Linha do tempo referente às aprovações de complexos metálicos, baseados na cisplatina, como fármacos antineoplásicos. Fonte, Autor. Tese de Doutorado Farias, R. L. 35 O bioisosterismo estrutural faz com que, em fase clínica, esses compostos compartilhem os mesmos alvos biológicos [29]. O ambiente citoplasmático de uma célula tumoral é hidrofílico, ácido e exibe baixas concentrações de cloreto [Cl - ]  4 a 20 mM. Desse modo, ao adentrar no citoplasma, o complexo cis-[PtCl2(NH3)2] atua como pró-fármaco e sofre reações de substituição de ligantes, representadas de forma simplificada nas Eqs. 1 e 2. (1) (2) Os ligantes clorido são então deslocados por moléculas de água, formando as espécies ativas cis-[PtCl(NH3)2(H2O)] + e cis-[Pt(NH3)2(H2O)2] 2+ . Como resultado, esses aquacomplexos catiônicos podem interagir rapidamente com biomoléculas carregadas negativamente, em especial o DNA. A formação de adutos a partir de ligações coordenadas entre o centro metálico de Pt(II) e as bases nitrogenadas ( 1% via ligações cruzadas interfita e 96% por ligações cruzadas intrafita) promovem torções (lesões) na estrutura secundária desta biomacromolécula [14, 26, 29, 31], Fig. 8. Figura 8. Cisplatina, análogos e estruturas cristalinas dos adutos formados entre a cisplatina (PDB ID: 1AIO)[33] e a oxaplatina (PDB ID: 1PG9) [34] com o DNA através do link cruzado 1,2-intrafita. Essas lesões desestabilizam a estrutura do DNA duplex em  7 kcal mol -1 , modulando diferentes respostas celulares, tais como inibição da transcrição e replicação, estacionamento de fases do ciclo celular e apoptose da célula tumoral [35], Fig 9. Tese de Doutorado Farias, R. L. 36 Por outro lado, algumas desvantagens relacionadas ao mecanismo citado podem ser elencadas. Uma dessas consiste no fato do DNA estar em superexpressão tanto em células tumorais quanto em tecidos de rápida proliferação. Logo, ambas podem ser afetadas pelos mecanismos citotóxicos, resultando em efeitos colaterais aos pacientes. Além disso, se ressalta os mecanismos de defesa celular que envolve a polarizabilidade dos íons Pt(II) [29]. A platina é um ácido de Pearson macio e tende a reagir preferencialmente com bases de Pearson macias. Logo, é mais favorável à instauração de ligações com grupamentos sulfidrilas livres (R-SH, R2S e RS - ) das proteínas dispersas na biofase, em comparação aos átomos de nitrogênio presentes nas nucleobases do DNA [14, 26, 29-31, 35, 36]. No citoplasma de uma célula tumoral, as enzimas glutationa transferases (GSTs) catalisam a formação de ligações entre glutationas livres e os aquacomplexos de Pt(II) [26, 35]. Essa ação restringe a ação biológica dos fármacos e auxilia na expulsão dos adutos formados [Pt-GS e Pt-(GS)2] por bombas de efluxo GS-X, Fig. 9. Figura 9. Proposta de modos de ação para a cisplatina, e possíveis mecanismos de resistência ao fármaco. Fonte: Adaptado de [36]. Tese de Doutorado Farias, R. L. 37 Outro mecanismo de resistência à ação citotóxica da cisplatina, e seus análogos, ocorre no núcleo da célula e consiste no sistema de excisão, Fig 9. Lesões intrafita são reconhecidas por proteínas do grupo de alta mobilidade (HMG), enquanto que lesões interfita são identificadas por enzimas do sistema de reparo de mau pareamento do DNA (MMR) [37]. Dessa forma, almejando superar os obstáculos impostos aos análogos de Pt(II), existe uma vertente crescente de químicos medicinais que lançam mão do planejamento racional de compostos estruturalmente específicos [31, 38]. Isto é, compostos que exercem seus efeitos farmacológicos pela interação seletiva com uma determinada biomacromolécula-alvo, na maioria das vezes uma proteína. Isso significa que a etapa farmacodinâmica será dependente, mas não exclusiva, da complementariedade estérica e eletrônica entre as estruturas da micromolécula (fármaco) e da biomacromolécula-alvo [38]. Dentro desse contexto, muito esforço tem sido dedicado à obtenção de compostos de coordenação com outros centros metálicos, e outros ligantes, capazes de modularem seletivamente o funcionamento de enzimas importantes ao metabolismo celular [39]. Tese de Doutorado Farias, R. L. 38 2. Revisão da Literatura 2.1. Complexos Metálicos como Inibidores de Enzimas O esclarecimento das ligações coordenadas entre o DNA e os análogos de Pt(II) formulou uma concepção prematura de que qualquer complexo metálico possui essa propriedade farmacológica [17, 29, 39]. Entretanto, pesquisas recentes fornecem evidências que refutam tal imposição [20, 40-52]. As configurações eletrônicas associadas aos centros metálicos, principalmente os de transição, conduzem aos diferentes números e geometrias de coordenação inacessíveis aos compostos puramente orgânicos [17, 51, 52]. A Fig. 10 apresenta alguns números de coordenação e geometrias em comum ao átomo de carbono e centros metálicos, assim como alguns exclusivos aos metais. Figura 10. Algumas geometrias, números de coordenação (NC) e seus respectivos grupos pontuais para complexos metálicos discretos. M = metal, L = ligante monodentado. Fonte, Autor. O conhecimento da química de coordenação permite trabalhar os centros metálicos para que o complexo final seja ajustável a um sítio proteico receptor, sendo esta uma propriedade atraente no projeto de inibidores enzimáticos. Dentro dessa óptica, para localizar complexos metálicos com atividade antineoplásicas no “espaço químico biologicamente relevante” [53], os alvos terapêuticos recorrentes são as proteínas cinases, cisteíno proteases e as topoisomerases [54]. 2.2. Inibidores de Proteínas Cinases A inibição de cinases bloqueia os processos de mitose de células anômalas, anulando assim o ciclo de crescimento do tumor [53]. Existem mais de 500 membros na família das Tese de Doutorado Farias, R. L. 39 cinases, os quais mantêm o domínio ATPase conservado [55, 56]. Silva e colaboradores descrevem o sítio de ligação do ATP (adenosina trifosfato) como uma fenda dividida em cinco subunidades de ligação, Fig 11. (1) região da adenina, (2) região do açúcar, (3) bolso hidrofóbico, (4) canal hidrofóbico e (5) região de ligação do fosfato [55]. Figura 11. Representação geral de uma molécula de ATP em seu sítio de ligação de uma proteína cinase. Adaptado de [55]. O mapeamento adequado de descritores do sítio de ligação, integrados às informações experimentais de antagonistas, permitem a elaboração racional de complexos inibidores por analogia dos padrões de reconhecimento intermolecular, e não pela reatividade intrínseca do centro metálico [39]. Em uma série de artigos [53, 57-61], Meggers e colaboradores realizaram diversos estudos nesse sentido para 48 complexos de Ru(II) cujas as estruturas eram bioisostéricas a estaurosporina, um potente inibidor cinase, Fig. 12. Em decorrência, os complexos NP309 e DW12 apresentaram os melhores resultados de inibição (CI50 entre 0,14 e 0,32 nM) frente as cinases GSK3 e Pim1 [57, 59]. Tese de Doutorado Farias, R. L. 40 Figura 12. Ilustração da região de ligação da adenina no sítio de ligação do ATP, o qual é conservado nas cinases GSK3 e Pim1. Da esquerda para direita, ATP, estaurosporina e complexos de Ru(II) miméticos. As ligações de hidrogênio estabelecidas com as cadeias laterais dos resíduos GLU81 e LEU83 estão representadas como linhas tracejadas. Adaptado de [39, 58] Como pode ser observado, o fragmento estaurosporina se localiza basicamente na região de ligação da adenina do ATP, formando um padrão de ligações de hidrogênio similar com as cadeias laterais dos resíduos GLU81 e LEU83. Curiosamente, os compostos foram menos efetivos à cinase PAK1 (CI50 entre 770 a 1090 nM)[61]. Uma análise cristalográfica do aduto DW12/PAK1 revelou que devido o sítio de ligação na PAK1 ser mais amplo, o grupo 5 -ciclopentadienila não era volumoso o suficientemente para estabelecer contatos intermoleculares, Fig 13. Deste modo, os autores realizaram a síntese de complexos octaédricos de Ru(II), mantendo-se o grupamento farmacofórico estaurosporina, mas adicionando ao ambiente de coordenação o ligante 2-(N-feniliminometila)piridina. Como resultado, para os complexos -FL172 e -FL411, a subunidade iminopiridina atuou como grupo auxofórico preenchendo a região N-terminal do sítio de ligação do ATP [53, 58, 61], potencializando o efeito de inibição na PAK1 (CI50 entre 110 e 130 nM) [61]. Tese de Doutorado Farias, R. L. 41 Figura 13. Esquema estrutural dos complexos NP309, DW12, L-FL172 e L-FL411. Análise cristalográfica dos adutos formados no domínio ATPase da cinase PAK1. Os complexos estão representados na forma de volumes espaciais. Adaptado de [53]. É importante destacar o papel estrutural do íon Ru(II) para todos os complexos investigados por Meggers, o qual não apresentou relação direta com a inibição, mas sim possibilitou a orientação espacial apropriada dos ligantes no sítio de ligação [39, 53]. 2.3. Inibidores de Cisteíno-Proteases As cisteíno-proteases do tipo papaína-símile, tais como catepsinas, caspases e calpaínas, consistem em enzimas responsáveis pela proteólise de ligações peptídicas e são assim designadas por terem sua tríade catalítica composta por resíduos de cisteína (CYS), histidina (HIS) e asparagina (ASN) [10, 39]. Dentre as cisteíno-proteases, a catepsina B (cat B) é uma das mais exploradas como alvo terapêutico de novos antineoplásicos, pois as pesquisas nessa área as correlacionam com os processos de invasão tumoral [10, 11, 44, 45, 62-66]. Um número significativo de diferentes tipos de complexos metálicos tem mostrado habilidade em inibir a cat B, tais como complexos de Ru(II) do tipo “piano-stool” (1), Tese de Doutorado Farias, R. L. 42 ciclopaladados difosfínicos (2 e 3), complexos de Au(I) (4) e complexos de oxorênio(V) (5), Fig 14. Figura 14. Exemplos de complexos metálicos reportados como inibidores in vitro da cat B. Adaptado de [39]. Com peso molecular de  30 kDa, a cat B possui uma estrutura terciária bilobal, na qual os domínios N-terminal (helicoidal) e C-terminal (folhas-) se interconectam através do par iônico formado entre os resíduos de CYS29 e HIS199 (N—HS,  3,0 Å), Fig. 15 [67]. Além disso, o sítio catalítico está posicionado na reentrância entre os dois lobos sendo restringido por uma alça de oclusão, Fig. 15. Figura 15. Regiões N- e C-terminal da cat B codificadas em azul e vermelho, respectivamente. O sítio catalítico está representado como de bastões e a alça de oclusão está representada na forma de tubo em cor cinza. Tese de Doutorado Farias, R. L. 43 Bincoletto e colaboradores evidenciaram que o ciclopaladado binuclear difosfínico, [Pd2(C 2 ,N-S(-)dmpa)2(μ-dppf)Cl2] (onde, dmpa = N.N-dimetil-1-feniletilamina e dppf = 1,1’- bis(difenilfosfina)ferroceno), Fig 16, foi capaz de inibir reversivelmente a atividade catalítica da cat B [68]. Os resultados mostraram que o composto ciclopaladado se liga a cat B livre, com constante de dissociação KH = 12 μM, e também ao sistema enzima/substrato com αKH = 2,4 μM [39, 68]. Ensaios pré-clínicos com tumores de carcinoma mamário Walker-256, demonstraram a eficiência antitumoral do composto, em camundongos, a qual foi capaz de impedir completamente o crescimento dos tumores em 90 % dos casos investigados. Após 12 dias de tratamento (dose i.p. 2,0 mg kg -1 ), os tumores com  4 g regrediram para  0,3 g, Fig 16. Além disso, exames histopatológicos em tecidos dos rins, baço e fígado não evidenciaram lesões após administração de 100 mg kg -1 do ciclopaladado, isto é, uma concentração 50 vezes superior a dose aplicada no tratamento [68]. Figura 16. Espécime com tumor de Walker-256 após 12 dias de inoculação. Pata esquerda tratada com (2). Pata direita, controle negativo. Adaptado de [68]. Tese de Doutorado Farias, R. L. 44 2.4. Inibidores de Topoisomerases As enzimas nucleares DNA topoisomerases são responsáveis pelos alívios de tensão e reparos na topologia do DNA durante os processos de transcrição e replicação celular [69, 70]. Em humanos, existem duas classes de topoisomerases, I e II, subdivididas em seis genes, Tabela 1. Tabela 1. Classificação de topoisomerases em humanos e suscetibilidade a fármacos antineoplásicos. Adaptado de [69, 71]. Topoisomerase Humanos Suscetibilidade para fármacos Tipo Subtipo Proteínas I IA IB (Top3α; Top3) (Top1; Top1mt) Top1 (antineoplásicos) II IIA (Top2α; Top2) Top2(α e ) (antineoplásicos) As Top2α e Top2 possuem estreita relação na sequência peptídica, com aproximadamente 70% de similaridade. Essas isoformas se diferenciam quanto à expressão e localização, sendo a Top2α encontrada quase exclusivamente nos tecidos de proliferação rápida [69, 72-79]. O fato de muitas células tumorais de pulmão, mama, próstata e sarcomas superexpressarem Top2α justifica seu emprego como alvo terapêutico de muitos antineoplásicos [80]. O mecanismo enzimático proposto para Top2α (Fig. 17) resulta em qualquer um dos processos de decatenação e relaxação do DNA [81]. O ciclo enzimático envolve dois segmentos de DNA (denominados G e T). O segmento G (do inglês “gate”) é quebrado em ambas as fitas da dupla-hélice pela formação de ligações covalentes entre as cadeias laterais dos resíduos de tirosinas da enzima (TYR805A e TYR805B) e os fosfatos 5’ do DNA. O segmento T (do inglês “transported”) é capturado por um movimento de pinça da região N- terminal e passa através do domínio de clivagem até a região de saída C-terminal [69, 71, 82, 83]. Finalmente, a dupla-hélice do segmento G é religada. As modulações estruturais da Top2α são mediadas tanto pelo encaixe quanto pela hidrólise de duas moléculas de ATP. É estabelecido na literatura que a inibição da Top2α tem influência direta na morte celular por apoptose. Tese de Doutorado Farias, R. L. 45 Figura 17. Ilustração simplificada do mecanismo enzimático da Top2α para o desenovelamento do DNA superenovelado (ou catenado). Adaptado de [84]. Os inibidores da Top2α são divididos em duas categorias: Classe 1 (Venenos): atuam no domínio de clivagem bloqueando o processo de religamento da dupla-hélice. Assim, um aduto ternário Top2α/DNA/inibidor é formado (complexo de clivagem) promovendo sucessivos cortes às fitas do segmento G. Esse processo induz estresse oxidativo na célula tumoral, acúmulo de Ca(II) e a morte por apoptose. A Fig. 18 ilustra as formas estruturais de alguns agentes antineoplásicos que atuam como venenos para Top2α em fase clínica. Figura 18. Estruturas de inibidores da Top2α. Adaptado de [39] Tese de Doutorado Farias, R. L. 46 Classe 2 (Inibidores catalíticos): atuam em qualquer etapa do ciclo enzimático, porém não estabilizam a formação do complexo de clivagem. Os mecanismos de ação relatados na literatura ainda não estão claros, entretanto para uma grande parte dos inibidores catalíticos se tem observado o bloqueio da ligação Top2α/DNA, assim como a prevenção da hidrólise do ATP [85-88]. A Fig. 19 ilustra alguns potentes inibidores catalíticos da Top2α em fase clínica. Figura 19. Estruturas de inibidores catalíticos da Top2α. Adaptado de [39]. Em ensaios in vitro, complexos de metais de transição têm sido testados como inibidores da Top2α, sendo a classe 2 (inibidores catalíticos) a mais promissora. Zeglis e colaboradores estudaram o papel da metalação na inibição da Top2α e na atividade antiproliferativa para uma série de tiossemicarbazonas α-heterocíclicas-N(4)-substituídas, Fig 20 [89]. Essa classe de compostos, tiossemicarbazonas, é intensamente investigada em química medicinal por seus amplos efeitos farmacológicos in vitro e in vivo, tais como atividade antiviral, antifúngica, antileshimania e, principalmente, antineoplásica [41]. Tese de Doutorado Farias, R. L. 47 Figura 20. Representação geral das reações e estruturas de ligantes tiossemicarbazonas e complexos de Cu(II) avaliados por Zegglis e colaboradores. Adaptado de [89]. Em geral, as tiossemicarbazonas sintetizadas por Zeglis não se mostraram ativas frente à linhagem celular humana de câncer de mama luminal MCF-7, mas boa atividade frente à linhagem celular humana de CM HER2+ SK-BR-3, com CI50 entre 4,3 e 8,1 μM [89]. Além disso, foram incapazes de inibir a Top2α em concentrações menores que 76 μM. Em contrapartida, após a coordenação aos íons Cu(II) os novos compostos exibiram citotoxicidade frente às duas linhagens celulares com CI50 entre 0,4 - 6,3 μM para SK-BR-3 e 1,6 - 12,3 μM para MCF-7. O ensaio de relaxação do DNA superenovelado evidenciou a habilidade dos onze complexos em inibir a ação enzimática da Top2α, diferentemente dos ligantes livres, Fig 21 (A e B). Além disso, através do experimento de Western blot os pesquisadores verificaram que a linhagem SK-BR-3 tem maior expressão de Top2α em relação à MCF-7. Conforme os autores, essa observação justificou a maior sensibilidade das células SK-BR-3 aos complexos [89]. Tese de Doutorado Farias, R. L. 48 Figura 21. Ensaio de inibição da Top2α, em gel de agarose, pelos complexos de formula geral [Cu(TSC)Cl], onde TSC = tiossemicarbazonas, em (A) estão os onze complexos em [10 mM] e em (B) estão as onze TSC livres em [100 mM]. (C) experimento de Western blot. Adaptado de [89]. Em outro estudo [46], Bisceglie e colaboradores avaliaram uma série de complexos quadrático-planares de Cu(II) e octaédricos de Ni(II), todos coordenados por tiossemicarbazonas derivadas da quinolina (Fig 22) e concluíram que (1) as tiossemicarbazonas livres não foram ativas, (2) apenas os complexos quadrático-planares foram hábeis em inibir a Top2α em concentrações próximas dos valores de CI50, (3) os complexos de Cu(II) foram mais ativos que os de Ni(II) frente a linhagem celular de linfoma histiocítico U937 [46]. Isto é, os valores de CI50 variaram de 0,48 a 16 μM para os complexos de Cu(II), enquanto que apenas um complexo de Ni(II) apresentou um valor de CI50  a 8 μM e os demais CI50 > 42 μM. Figura 22. Representação das estruturas dos complexos quadrático-planos de Cu(II) e octaédrico de Ni(II) e suas faixas de CI50 frente a linhagem celular humana U397 (linfoma histiocítico). A figura está simplificada para melhor visualização. Adaptado de [46]. Tese de Doutorado Farias, R. L. 49 Com o auxílio de ferramentas computacionais, as estruturas 3D dos complexos de Cu(II) foram adicionadas como “input” em um “script” de ancoragem molecular. Para tal, o ligante lábil (clorido) foi removido e computado a carga +1 em todos os casos. Como resultado, as poses melhores pontuadas revelaram que o arcabouço molecular planar dos complexos de Cu(II) exerceu grande influência no processo de inibição da Top2α, Fig. 23 [46]. Em outras palavras, ocorreu melhor encaixe desses compostos em relação aos respectivos derivados octaédricos de Ni(II). Além disso, outro ponto crucial consistiu na carga residual negativa na entrada do domínio ATPase devido as cadeias laterais dos resíduos de ASP152, ASP153, ASP154, GLU155, Fig 23. Figura 23. Poses de ancoragem molecular melhores pontuadas para os complexos quadrático-planares de Cu(II) contendo tiossemicarbazonas derivadas da quinolina. Adaptado de [46]. A importante noção de uma restrição estérica no domínio ATPase da Top2α, avaliada a atribuir seletividade aos complexos planares, pode ser útil para o planejamento de compostos-protótipos estruturalmente específicos [38, 53]. Além disso, devido o mecanismo de duplicação aberrante de células tumorais, a importância de atingir este tipo de enzima está acoplada à menor toxicidade desses agentes e, consequentemente, uma mitigação dos efeitos colaterais [80]. Tese de Doutorado Farias, R. L. 50 2.5. Complexos quadrático-planares de Pd(II) bioativos A química de coordenação do paládio é regida praticamente por sua forma iônica Pd(II), a qual apresenta a configuração eletrônica [Kr] 4𝑑8. Logo, complexos de Pd(II) tendem a adotar a geometria quadrática-planar como consequência da maior estabilização do campo cristalino, Fig. 24. Esse modelo de arranjo eletrônico pode ser compreendido como sendo uma extensão do alongamento tetragonal com adicional remoção dos ligantes axiais ao longo do eixo z. Figura 24. Variação do desdobramento do campo cristalino no diagrama de orbitais do centro metálico n𝒅𝟖 (n = número quântico principal) como resultado do alongamento de ligações ao longo do eixo z. Complexos de Pd(II) são suscetíveis a processos de hidrólise, sendo pelo menos 10 5 vezes mais lábeis que complexos análogos de Pt(II) [29, 90-92]. Portanto, para garantir a integridade na biofase e, por conseguinte, a etapa farmacodinâmica, torna-se imperativo o conhecimento de conceitos fundamentais da química de coordenação. Complexos 𝑑8 quadrático-planares realizam reações de troca de ligantes por meio do mecanismo associativo, Fig. 25. Tese de Doutorado Farias, R. L. 51 Figura 25. Representação generalizada de o mecanismo associativo em complexos quadrático- planares de Pd(II). Fonte, Autor. De forma básica, a primeira etapa consiste na formação de um intermediário pentacoordenado, etapa lenta e determinante da velocidade, com posterior saída do grupo abandonador e retenção da estereoquímica inicial. A velocidade da reação de substituição em complexos é dependente da força da ligação M—L, bem como do grau de aglomeração de ligantes em torno do centro metálico (efeito estérico) [90, 91]. Consequentemente, a escolha apropriada dos ligantes pode modular a cinética de substituição, viabilizando que a micromolécula atinja seu alvo terapêutico. Assim, para diminuir a velocidade de substituição em complexos quadrático-planares o uso de fosfinas terciárias é uma estratégia promissora e recorrente [93-96]. Fosfinas terciárias são estericamente impedidas (Tabela 2) [97], logo quando estão presentes na esfera de coordenação se eleva a energia de ativação (Ea) alusiva ao intermediário pentacoordenado, Fig 25. Dessa forma, como k = A𝑒 −𝐸𝑎 𝑅𝑇⁄ , (onde, k = constante de velocidade; A = fator pré-exponencial de Arrhenius, Ea = energia de ativação, R e T são a constante dos gases e temperatura em Kelvin, respectivamente), é fácil perceber que aumentos em Ea resultarão na diminuição da velocidade reacional [92, 98]. Tese de Doutorado Farias, R. L. 52 Tabela 2. Ângulos de cone  (em, º) para vários ligantes e o modo de determinação, assumindo o comprimento da ligação M-L igual a 2,28 Å e os raios de van der Waals dos átomos mais externos de um ligante. Adaptado de [98]. Ligante  / º Ligante  / º Modo de determinação CH3 90 P(OC6H5)3 127 CO 95 PBu3 130 Cl, Et 102 PEt3 132 PF3 104  5 -C5H5(Cp*) 136 Br, Ph 105 PPh3 145 t-Butyl 126 P