RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo deste trabalho será disponibilizado somente a partir de 30/06/2018. 1 MILENA FONTES LUIZETE Aplicações de MALDI-MS na análise de peptídeos produzidos por cianobactérias. Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção de Título de Doutora em Química. Orientador: Prof. Dr. Humberto Márcio Santos Milagre ARARAQUARA 2017 DADOS CURRICULARES Nome: Milena Fontes Luizete Data de nascimento: 27/10/1988 Formação Acadêmica: Bacharela em Química com Atribuições Tecnológicas Instituição: Instituto de Química – UNESP Araraquara Título: Mestre em Química Instituição: Instituto de Química – UNESP Araraquara Produção Científica Sandonato, B. B., Santos, V. G., Luizete, M. F., Bronzel Jr, J. L., Eberlin, M. N., Milagre, H. M. S. MALDI Imaging Mass Spectrometry of Fresh Water Cyanobacteria: Spatial Distribution of Toxins and Other Metabolites, J. Braz. Chem. Soc., Vol. 28, No. 4, 521-528, 2017. Resumos apresentados em Eventos Científicos (1) Apresentação de resumo na forma de pôster sob o título: ‘Non-ribosomal cyanopeptides founded in Brazilian Cyanobacteria Bloom: Identification and characterization by MALDI-TOF-MS.’ 39ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química: Criar e Empreender. 2016. (2) Apresentação de resumo na forma de pôster sob o título: ‘Peptides Quantification: Improved Performance by the Binary Matrices System for MALDI-TOF-MS.’ 63rd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics. 2015. (3) Apresentação de resumo na forma de pôster sob o título: ‘Metabolomic profiling of cyanobacteria by mass spectrometry’ 38a Reunião anual da Sociedade Brasileira de Química, 2015. (4) Apresentação de resumo na forma de pôster sob o título: ‘MALDI-TOF-MS for the differentiation of Strains of Cyanobacteria by their secondary metabolites profile.’ 63rd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics. 2015. (5) Apresentação de resumo na forma de pôster sob o título: ‘A Binary Matrix for Improvement of Quantitative Analysis of Microcystins by MALDI-TOF-MS.’ na 62nd Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics. 2014. (6) Apresentação de resumo na forma de poster: ‘Otimização experimental da derivação de parabenos para análise via CG-EM.’ 5 Congresso Ibero Americano de Química Analítica, 2012. Dedico este trabalho aos meus pais Luis e Marilaine, à minha irmã Marina, ao meu companheiro de jornada e marido Érico, e aos meus avós Vanda, Lico (in memorian), Tonho e Cida (in memorian). Agradecimentos Ao Prof. Dr. Humberto M. S. Milagre, pela constante orientação, amizade e incentivo, serei eternamente grata por todos seus ensinamentos nos aspectos profissionais e pessoais. À Prof. Dra. Cíntia D. F. Milagre, juntamente com todo Milagre Research Group, pelas nossas reuniões e discussões amplamente proveitosas para minha formação. Ao Instituto de Química e o Programa de Pós-Graduação pelo apoio e infraestrutura. À FAPESP e CNPq, por fomentarem as pesquisas dispostas neste trabalho. À CAPES pela bolsa concedida e manutenção do Portal de Periódicos. Ao Instituto Pasteur e ao Laboratório ThoMSon, pela parceria e colaboração. Sou imensamente grata à Deus, à Maria, mãe das mães e aos meus protetores espirituais. Gratidão aos meus pais pela minha vida, e por passarem a vida deles se esforçando para que eu trilhasse o caminho dos estudos desde o pré-primário até este momento. À minha irmã Marina, pelos sorrisos e apoio constante. Ao meu marido e companheiro de jornada Érico, que a todo momento esteve do meu lado, me dando apoio em todos os aspectos. Aos meus avós, Vanda e Lico (in memorian), Tonho e Cida (in memorian), que me acompanham desde o nascimento e são exemplos em minha vida. Sou imensamente grata às minhas amigas irmãs Vanessa e Mi Murad, que há dois anos estão ao meu lado todos os dias desta caminhada. Gratidão ao Núcleo Ju Marconato, por ser meu refúgio e o bálsamo dos meus dias. Gratidão à Lu, Naira e Paulinha, pelos abraços sinceros. Gratidão aos amigos de laboratório, Luna, Maraylla, Iris, Carol, Raquel, Bruno, João, que me acompanharam no dia a dia. Não poderia deixar de agradecer também, os porteiros do Instituto de Química: Raquel, Joel e Seu Haliaben, pelos primeiros sorrisos que eu via quando aqui chegava. Em especial a Raquel pela sincera amizade. Agradeço também toda turma de manutenção, em especial ao Senhor Abraão, ao Rogério e o Carlos, que prontamente atendiam aos meus pedidos, quando o ar condicionado da sala do equipamento chorava, entre tantas outras manutenções que realizaram com profissionalismo. Meu sincero sentimento de GRATIDÃO a todos vocês. ‘’A experiência mais bela que podemos ter é a do mistério. Ela é a emoção fundamental que está na origem da arte e da ciência verdadeiras. Quem não a conhece e não consegue maravilhar-se com ela está praticamente morto e seus olhos estão obscurecidos. ’’ Albert Einstein Resumo Neste trabalho, a técnica Matrix Assisted Laser Dersoption/Ionization – Mass Spectrometry (MALDI-MS) foi utilizada em diferentes aplicações para a análise de peptídeos produzidos por cianobactérias. Esta técnica é extremamente rápida, possui alta resolução, requer pouquíssimo preparo de amostra e não permite que possíveis contaminantes presentes na amostra interfiram na análise. Por estes motivos MALDI- MS tem sido amplamente utilizada não somente na detecção de diferentes variantes de cianopeptídeos, mas também para quantificação das cianotoxinas. Este trabalho utilizou um sistema binário de matriz para a quantificação de microcistinas, utilizando as matrizes ácido α-ciano-4-hidroxicinamico e o ácido sinapínico (50/50, v/v) para obter uma mistura homogênea de matriz/analito, superando a baixa reprodutibilidade inerente da técnica MALDI-MS. Paralelamente, foi realizado o imageamento de espécies de cianobactérias de água doce cultivadas em meio sólido por MALDI-TOF-MS. Os resultados obtidos apresentaram novas perspectivas com relação à distribuição espacial dos peptídeos produzidos pelas espécies de cianobactérias estudadas, como a nodularina-R (m/z 825) e nodularina-[Har] (m/z 839) produzida pela espécie Nodularia harveyana PCC 7804, os peptídeos MC-LR (m/z 995) produzidos pela espécie Microcystis aeruginosa PCC 7820, e o sideróforo anaquelina (m/z 761.3) produzidos pela espécie Anabaena Cylindrica PCC 7122. Além disto, amostras da floração de cianobactérias, que ocorre na Represa Salto Grande, localizada na cidade de Americana – SP, foram analisadas e nelas foram identificados onze cianopeptídeos de quatro classes diferentes, sendo quatro microcistinas (MC-LR, MC-YR, MC-Hil e MC-RR), quatro aeruginosinas (602, 298 A, 644 e 646), duas cianopeptolinas (972 e 986), e uma variante de microviridina (1707). Palavras Chaves: MALDI-MS. Espectrometria de Massas. Cianobactérias. Microcistinas. Cianopeptídeos. Abstratc In this work, the technique Matrix Assisted Laser Dersoption/Ionization – Mass Spectrometry (MALDI-MS) were used in different application for analysis of peptides produces by cyanobacteria. This technique is extremely fast, has high resolution, requires very little sample preparation and does not allow any contaminants present in the sample to interfere with the analysis. For these reasons, MALDI-MS has been widely used not only in the detection of different variants of cyanopeptides, but also for the quantification of cyanotoxins. This work utilized a matrix binary system for the quantification of microcystins, using the α-cyano-4-hydroxynamic matrix and sinapinic acid (50/20, v/v) to obtain a homogeneous matrix/analyte mixture, overcoming the low reproducibility inherent to the MALDI-MS technique. Simultaneously, we performed the imaging of freshwater cyanobacteria cultivated in solid medium by MALDI-TOF-MS. The results obtained presented new perspectives regarding the spatial distribution of the peptides produced by the studied cyanobacteria species, for exemple the nodularin-R (m/z 825), nodularin-[Har] (m/z 839) for the species Nodularia harveyana PCC 7804, MC-LR peptides (m/z 995) for the species Microcystis aeruginosa PCC 7820, and the siderophore anaquelin (m/z 761.3) for the species Anabaena cylindrica PCC 7122. In addition, samples of cianobacteria’s bloom, present in Salto Grande Lagoon, located in Americana-SP, were analyzed and were identified some peptides, being four microcystins (MC-YR, MC-YR, MC-Hil and MC-RR), four aeruginosins (602, 298 A, 644 and 968), two cyanopeptolins (972 and 986), and one variant of microviridin(1707). Lista de Figuras FIGURA 1 - Estromatólito encontrado no Lago Innes - Sul da Austrália. Fonte: Falconer, I. R. Cyanobacterial Toxins of Drinking Water Supplies (FALCONER, 2003a) . ..................................................................................................................... 22 FIGURA 2 - Estrutura celular básica de uma cianobactéria. Fonte: http://reasonandscience.heavenforum.org/t1551-cyanobacteria (adaptado) ............. 23 FIGURA 3 – Microscopia ótica para visualização da espécie Microcystis aeruginosa PCC 7820. A) Vizualização das colônias (aumento 40x), B) Visualização das células (aumento de 100x). ................................................................................................... 24 FIGURA 4 – Microscopia ótica (aumento 100x) das espécies A) Anabaena cilyndrica PCC 7122, célula em destaque heterocisto e B) Nostoc sp. PCC 9237, célula em destaque acinete. ...................................................................................................... 25 Figura 5 - Imagens de cianobactérias em A) Fonte Termal (Yellowstone National Park) e B) Deserto. Fonte: A)http://www.webexhibits.org/causesofcolor/5D.html, B)http://www.kavlifoundation.org/science-spotlights/microbiome-astrobiology-how- search-life-other-worlds#.WL1UcPnyuUk .................................................................. 28 FIGURA 6 - Imagens de Florações de Cianobactérias obtidas por satélites. Lago Eire (EUA), Mar de Bering (Alasca), Golfo do México e Costa da Argentina. Fonte: NASA Goddard Space Flight Center/Flickr .......................................................................... 29 FIGURA 7 - Estrutura química das neurotoxinas Anatoxina, Anatoxina-a (s) e Saxitoxina. ................................................................................................................. 30 FIGURA 8 - Estrutura química de um lipossacarídeo (LPS) ..................................... 31 FIGURA 9 - Estrutura química da cilindrospermopsina ............................................. 32 FIGURA 10 - Hepatócitos isolados incubados na ausência ou presença de microcistina: (a) hepatócito controle; (b) hepatócito incubado por 30 minutos na presença de microcistina. Fonte: Microcystin Toxicity - Cyanobacterial Toxins of Drinking Water Supplies. ........................................................................................... 33 FIGURA 11 - Estrutura da microcistina-LR (MC-LR). Em azul: L-aminoácidos, posição 2, L e posição 4 R. Em vermelho: Adda, em preto: os quatro D-aminoácidos, posição 1, 3, 6 e 7. .................................................................................................... 33 FIGURA 12 - Estruturas de algumas microcistinas e sua nomenclatura. .................. 34 FIGURA 13 - Estururas e nomenclatura da nodularins- R e nodularina-Har. ............ 35 FIGURA 14 - Representação da fonte de ionização MALDI-MS. Fonte: Milagre, H.M.S. ....................................................................................................................... 38 FIGURA 15 - Principais matrizes utilizadas em UV-MALDI. ...................................... 40 FIGURA 16 - Mecanismo Unificado de ionização do analito por MALDI-MS. ........... 42 FIGURA 17 - Representação da formação de ‘hot-spots’ e a variabilidade dos espectros obtidos, dependendo do local onde o laser incide. Fonte: Bronzel, 2015 - adaptado. .................................................................................................................. 44 FIGURA 18 - Espectro MALDI-(+)-TOF/MS obtido pela análise de MC-RR (2.50 µmol/L) e da Angiotensina I (2.50 µmol/L). ................................................................ 52 FIGURA 19 - Filamento de Spirulina. Fonte: Jerine, P. S, Kadar, B. S, Giridharan, R., Udhaya, L. B, Sabina, E. P. (2017). .......................................................................... 63 FIGURA 20 - Estruturas químicas da Scytonemina e Mycosporina-2-glicina. ........... 64 FIGURA 21 – Metabólitos secundários produzidos pelas cianobactérias classificados de acordo com a classe estrutural. Fonte: Chipala, G. E., Mo, S., Orjala, J., 2011 (adaptado). ................................................................................................................ 65 FIGURA 22 - Exemplos de diferentes classes de cianopeptídeos. ........................... 67 FIGURA 23 - Amino ácidos e resíduos de aminoácidos não usuais presentes nas estruturas dos cianopeptídeos. ................................................................................. 68 FIGURA 24 – Esquema da biossíntese da Nodularina-R. Fonte: Moffitt, M. C., Neilan, B. J. (2004) (RANTALA et al., 2004). ........................................................................ 69 FIGURA 25 – Estrutura química da Aeruginosina 298A. ........................................... 70 FIGURA 26 - Estrutura química da Cianopeptolina 1083. ......................................... 71 FIGURA 27 - Estrutura de uma microviridina. As ligações em destaque podem ocorrer após a tradução da sequência primária de aminoácidos. ............................. 72 FIGURA 28 – Etapas realizadas para realização do imageamento por IMS. a) Amostra inserida na placa de MALDI-MS, b) análise por MALDI-TOF-MS (varredura de toda área por pixels), c) cada pixel possui um espectro de massas, d) associação dos sinais selecionados, com suas respectivas coordenadas no espaço, formando a imagem...................................................................................................................... 75 FIGURA 29 - Método de análise de cianobactérias por MALDI-TOF-MS. ................ 80 FIGURA 30 - Passo a passo para o imageamento das culturas de cianobactérias. Fonte: Sandonato, B. B. et al, 2017 (adaptado) (SANDONATO et al., 2017). .......... 82 FIGURA 31 - Imagem por microscopia óptica (aumento 100X) das espécies: Micocystis aeruginosa PCC 7820, Nodularia harveyana PCC 7804 e Anabaena cylindrica PCC 7122 .................................................................................................. 83 FIGURA 32 – Estrutura dos cianopeptídeos identificados pelas análises de MALDI- TOF-MS..................................................................................................................... 85 FIGURA 33 – Espectro de MALDI-(+)-TOF-MS obtido pela análise da espécie Microcystis aeruginosa PCC7820. ............................................................................ 86 FIGURA 34 - Espectro de MALDI-(+)-TOF-MS obtido pela análise da espécie Nodularia harveyana PCC7804. ................................................................................ 87 FIGURA 35 - Espectro de MALDI-(+)-TOF-MS obtido pela análise da espécie Anabaena cylindrica PCC7122. ................................................................................. 88 FIGURA 36 - MALDI-IMS slide com colônias de Microcistis artuginosa PCC 7820 com a área scaneada delimitada pelo retângulo em vermelho. Imagem MALDI-IMS gerada para: (b) íon m/z 603.3 correspondente a aeruginosina 602 e m/z 995.6 correspondente a molécula protonada de MC-LR. .................................................... 90 FIGURA 37 - a) MALDI-IMS slide com as colônias de cianobactérias N. harveyana PCC 7804, no lado direito do slide e A. Cylindrica PCC 7122 do lado esquerdo, b) imagem gerada por MALDI-IMS da distribuição do sideróforo anaquelina (m/z 761), c e d) imagens geradas por MALDI-IMS dos peptídeos cíclicos nodularina-R (m/z 825), nodularina-[Har] (m/z 839). .............................................................................. 91 FIGURA 38 - MALDI-IMS imagem para as três espécies de cianobactérias N. harveyana PCC 7804, M. aeruginosa PCC 7820 e A. cylindrica PCC 7122. Imagem (a) para os biomarcadores nodularina Nod-[Har] (m/z 839.5), microcistinas MC-LR (m/z 995.6) e anaquelina (m/z 761.3). Imagens (b) a (g) para os íons desconhecidos m/z 619.1, 638.5, 989.4, 1276.3, 1643.6 e 1971.5. ................................................... 92 FIGURA 39 - Imagens de Floração de Cianobactérias, Americana -SP. Fonte: arquivo pessoal do autor. .......................................................................................... 96 FIGURA 40 – Mapa de Hidrografia da cidade de Americana -SP. Fonte: http://www.americana.sp.gov.br/v6/images/perfil_municipio/perfil_2011_mapa_hidrog rafico.jpg .................................................................................................................... 97 FIGURA 41 – Espécies de cianobactérias encontradas na floração da Represa Salto Grande. A) Microcystis sp. CENA120, B) Cyanobium sp. CENA122, C) Romeria victoriae CENA123. Fonte: adaptado de Genuário, D. B., 2016. ............................... 98 FIGURA 42 - Esquema básico da Fonte de ionização por eletronspray. ................ 100 FIGURA 43 - A) Esquema de um experimento Full scan B) Esquema de um experimento de MS/MS. .......................................................................................... 102 FIGURA 44 – a) Imagem da floração de cianobactérias presente em Americana-SP, Brasil vista por satélite. Fonte: Google Maps. b) Imagem do Ponto de Coleta 1: 22°42.350’ S 047°16.058’ W. c) Imagem do ponto da margem da Represa na Associação Barco Escola. Fonte: Arquivo pessoal do autor. .................................. 104 FIGURA 45 – Fluxograma do procedimento experimental realizado para identificação dos cianopeptídeos encontrados na floração de cianobactérias da Represa Salto Grande. ................................................................................................................... 106 FIGURA 46 - Imagem das cianobactérias vistas ao microscópio óptico, zoom de 100x. A) Células em forma filamentosas, B e C) Células em forma de cocos de diferentes tamanhos, tais como Microcistis sp. ....................................................... 108 FIGURA 47 - Espectros MALDI-(+)-TOF/MS das amostras coletadas em diferentes pontos: a) Ponto de coleta 1; b) Ponto de coleta 2; c) Ponto de coleta 3. ............... 109 FIGURA 48- Espectros MALDI-(+)-TOF/MS das análises das células referentes as extrações realizadas utilizando metanol, a) análise referente às células restantes da extração 1, b) análise referente às células restantes da extração 2,c) análise referente às células restantes da extração 3, d) análise referente às células restantes da extração 4. .......................................................................................................... 111 FIGURA 49 - Espectros MALDI-(+)-TOF/MS das análises dos solventes das extrações realizadas utilizando metanol. a) análise referente ao solvente de extração 1, b) análise referente ao solvente de extração 2, c) análise referente ao solvente de extração 3, d) análise referente ao solvente de extração 4. .................................... 112 FIGURA 50 - Espectros MALDI-(+)-TOF/MS obtidos das análises das frações; a) espectro referente a análise da fração 20% MeOH, b) espectro referente a análise da fração 40% MeOH, c) espectro referente a análise da fração 60% MeOH, d) espectro referente a análise da fração 80% MeOH, e) espectro referente a análise da fração 100% MeOH ............................................................................................ 113 FIGURA 51 - Estrutura das aeruginosinas identificadas na floração de Americana. ................................................................................................................................ 114 FIGURA 52 - Estruturas das cianopeptolinas identificadas na floração de Americana. ................................................................................................................................ 116 FIGURA 53 - Estrutura das MC’s encontradas na floração de Americana. ............. 117 FIGURA 54 - Espectro de MS/MS do íon m/z 603. ................................................. 122 FIGURA 55 - Espectro de MS/MS do íon m/z 605. ................................................ 123 FIGURA 56 - Espectro de MS/MS do íon m/z 645. ................................................. 124 FIGURA 57 - Espectro de MS/MS do íon m/z 647. ................................................. 125 FIGURA 58 - Espectro de MS/MS do íon m/z 987. ................................................. 126 FIGURA 59 - Espectro de MS/MS do íon m/z 973. ................................................. 127 FIGURA 60 - Espectro de MS/MS do íon m/z 959. ................................................. 128 FIGURA 61 - Espectro de MS/MS do íon m/z 1072. ............................................... 129 FIGURA 62 - Espectro de MS/MS do íon m/z 995. ................................................. 130 FIGURA 63 - Espectro de MS/MS do íon m/z 1009. ............................................... 131 FIGURA 64 - Espectro de MS/MS do íon m/z 1045. ............................................... 132 FIGURA 65 - Espectro de MS/MS do íon m/z 1707. ............................................... 133 Lista de Tabelas Tabela 1 - Classificação de Ordens de cianobactérias de acordo com a classificação botânica e suas subseções correspondentes pela classificação bacteriológica. Fonte: Chemical and Biological Investigations of Vietnamese Cyanobacteria. .................... 26 Tabela 2 - Parâmetros utilizados para as análises por MALDI-TOF. ........................ 47 Tabela 3 - Estruturas das matrizes de MALDI-MS utilizadas neste trabalho. ............ 51 Tabela 4 - Imagens de microscopia ótica (aumento 40x) da cristalização para as diferentes matrizes utilizadas, e seus respectivos coeficientes de variação na análise de MC-RR (2,5 µmol/L) e Angiotensina I (2,5 µmol/L)............................................... 53 Tabela 5 - Resultados de CV, limite de detecção (MDL), limite de quantificação (LDQ), obtidos utilizando o sistema binário ácido sinapínico: ácido α-ciano-4-hidróxi- cinâmico (50:50, v/v). ................................................................................................ 55 Tabela 6 - Imagens de microscopia ótica (aumento 40x) da cristalização para as diferentes matrizes binárias, e seus respectivos coeficientes de variação na análise de MC-RR (2,5 µmol/L) e Angiotensina I (2,5 µmol/L)............................................... 57 Tabela 7 - Resultados de CV, limite de detecção (MDL), limite de quantificação (LDQ), obtidos utilizando o sistema binário ácido sinapínico: ácido α-ciano-4-hidróxi- cinâmico (50:50, v/v). ................................................................................................ 58 Tabela 8 - Dados obtidos por Puddick, 2007 utilizando ácido α-ciano-4-hidróxi- cinâmico como matriz. ............................................................................................... 58 Tabela 9 - Resultados de CV, limite de detecção (MDL), limite de quantificação (LDQ), obtidos utilizando o sistema binário ácido sinapínico: ácido α-ciano-4-hidróxi- cinâmico (50:50, v/v). ................................................................................................ 59 Tabela 10- Espécies de cianobactérias e seus respectivos meios de cultivo. .......... 78 Tabela 11- Meios de cultivo BG-110+ NaNO3 (2mM) + NaHCO3 (10mM). ................ 79 Tabela 12- Meios de cultivo BG-110 e solução de metais traços. ............................. 79 Tabela 13 - Espécies de cianobactérias e os respectivos m/z relativos aos cianopepitídeos identificados. ................................................................................... 84 Tabela 14 - Parâmetros utilizados para as análises por MALDI-TOF. .................... 105 Tabela 15- m/z referentes aos peptídeos identificados na floração por MALDI-TOF- MS. *Valores descritos na literatura. ....................................................................... 110 Tabela 16 - Fragmentações obtidas nos espectros de MS/MS gerados pelas análises por ESI-qQTOF-MS/MS das aeruginosinas detectadas e identificadas nesta floração. ................................................................................................................................ 115 Tabela 17 - Fragmentações obtidas nos espectros de MS/MS gerados pelas análises por ESI-qQTOF-HRMS/MS das cianopeptolinas detectadas e identificadas nesta floração. .................................................................................................................. 117 Tabela 18 - Fragmentações obtidas nos espectros de MS/MS gerados pelas análises por ESI-qQTOF-HRMS/MS das MC’s detectadas e identificadas nesta floração. ... 118 Lista de Abreviaturas ACN: acetonitrila Adda: ácido (2S,3S,8S,9S)-3-amino-9-metóxi-2,6-trimetil-8,10-deca-4,6-dienóico Asp: asparagina A: alanina BG: Blue-Green Medium CENA: Centro de Energia Nuclear na Agricultura CHCA: ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico Choi: 2-carboxi-6-hidroxioctahidroindol CV: coeficiente de variação DHB: ácido diidroxibenzóico DNA: ácido desoxirribonucleico ESI: Electrospray Ionization ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Har: homoarginina Hil: homoisoleucina Hpla: ácido hidroxi-fenillático HPLC: High performance liquid chromatography IMS: imaging mass spectrometry Ileu: isoleucina IR: infravermelho L: leucina LD50: dose letal mediana LDQ: lower limit of detection LPS: lipopolissacarídeos MC: microcistina MC’s: microcistinas m/z: razão massa/carga MALDI: Matrix Assisted Laser/Dessorption Ionization MCP: micro-channel plate MDL: minimum detection limit MMA’s: micosporinas MS: Mass Spectrometry MS/MS ou MS2: Tandem Mass Spectrometry PEG: Polietilenoglicol PCC: Pasteur Collection of Cyanobacteria PCP’s: Produtos de cuidado pessoal PP1: protein phosphatase 1 PP2: protein phosphatase 2 Q: quadrupolo R: arginina SA: ácido sinapínico TFA: ácido trifluoroacético TOF: analisador por tempo de vôo UPLC: Ultra High Performance Liquid Chromatography UV: ultravioleta (v/v): volume/volume Y: tirosina Sumário Prefácio ..................................................................................................................... 19 CAPÍTULO 1: Desenvolvimento de método de quantificação por MALDI-TOF-MS, utilizando matrizes binárias. ...................................................................................... 22 1. Introdução ............................................................................................................. 22 1.1. Cianobactérias: fósseis vivos .............................................................................. 22 1.2. Estrutura celular das cianobactérias ................................................................... 23 1.3. Nomenclatura e Classificação das Cianobactérias ............................................. 25 1.4. A ecologia das cianobactérias ............................................................................ 28 1.5. Cianotoxinas ....................................................................................................... 30 1.5.1. Neurotoxinas ................................................................................................... 30 1.5.2. Dermatotoxinas ............................................................................................... 31 1.5.3. Citotoxinas ....................................................................................................... 31 1.5.4. Peptídeos Hepatotóxicos ................................................................................. 32 1.6. Quantificação de Microcistinas: a importância, métodos utilizados e seus desafios ..................................................................................................................... 36 1.6.1. Matrix Laser Assisted Desorption/Ionization (MALDI) ..................................... 38 1.6.1.1. Principais componentes da fonte de ionização MALDI: o comprimento de onda do laser ............................................................................................................. 39 1.6.1.2. Principais componentes de MALDI – Matrizes, suas estruturas e funções .. 39 1.6.1.4. Metodologias de preparo de amostra para análise por MALDI-MS. ......... 42 1.6.2. A aplicação de MALDI-MS como ferramenta para a quantificação de microcistinas .............................................................................................................. 45 2. Objetivos ............................................................................................................... 46 3. Materiais e Métodos .............................................................................................. 47 3.1. Padrões químicos, solventes e matrizes ............................................................. 47 3.2. Parâmetros utilizados pelo Equipamento ............................................................ 47 3.3. A energia do laser utilizada ................................................................................. 48 3.4. Preparo das soluções de matriz .......................................................................... 48 3.5. Sistemas de Matrizes Binárias ............................................................................ 48 3.6. Soluções Padrão ................................................................................................. 48 3.7. Preparo de amostra ............................................................................................ 49 3.8. Tratamento estatístico dos dados obtidos........................................................... 49 4. Resultados e Discussões ...................................................................................... 51 5. Conclusões ........................................................................................................... 60 CAPÍTULO 2: Imageamento de Cianobactérias de água doce por MALDI Imaging Mass Spectrometry: Distribuição de toxinas e outros metabólitos. ........................... 62 1. Introdução ............................................................................................................. 62 1.1. Cianopeptídeos .................................................................................................. 65 1.1.1. Aeruginosinas .................................................................................................. 70 1.1.2. Cianopeptolinas ............................................................................................... 70 1.1.3. Microviridinas .................................................................................................. 71 1.1.4. Nodularinas e Microcistinas ............................................................................. 72 1.1.5. Cianopeptídeos como fontes de novos fármacos ............................................ 72 1.2. MALDI-IMS ......................................................................................................... 73 2. Objetivos ............................................................................................................... 77 3.Materiais e Métodos ............................................................................................... 78 3.1. Esterilização dos materiais ................................................................................. 78 3.2. Cultivo das espécies de cianobactérias.............................................................. 78 3.3. Preparo de amostra para as análises de cianobactérias cultivadas no laboratório e amostras ambientais por MALDI-TOF-MS. ............................................................ 80 3.4. Imageamento das culturas de cianobactérias Microcystis aeruginosa PCC 7820, Nodularia harveyana PCC 7804 e Anabaena cylindrica PCC 7122. ......................... 81 4. Resultados e Discussão ........................................................................................ 83 4.1. Identificação dos cianopeptídeos produzidos pelas espécies Micocystis aeruginosa PCC 7820, Nostoc sp. PCC 9237, Nodularia harveyana PCC 7804 e Anabaena cylindrica PCC 7122 por MALDI-TOF-MS ................................................ 83 4.2. Imageamento das espécies Micocystis aeruginosa PCC 7820, Nostoc sp. PCC 9237, Nodularia harveyana PCC 7804 e Anabaena cylindrica PCC 7122 por MALDI- TOF-IMS.................................................................................................................... 89 5. Conclusões ............................................................................................................ 93 CAPÍTULO 3: Identificação de cianopeptídeos presentes na floração de cianobactérias presente na Represa Salto Grande. .................................................. 95 1. Introdução ............................................................................................................. 95 1.1. Floração de Cianobactérias presente na Represa Salto Grande (Americana – SP) 95 1.2. Eletrospray ......................................................................................................... 99 1.3. Tandem Mass Spectrometry (MS/MS ou MS2) ................................................. 101 2. Objetivos ............................................................................................................. 103 3. Materiais e Métodos ............................................................................................ 104 3.1. Coleta de amostras ambientais de floração tóxica de cianobactérias. .............. 104 3.2. Análise das amostras ambientais por MALDI-TOF-MS .................................... 105 3.3. Análise das amostras ambientais de floração tóxica de cianobactérias por ESI- qQ-TOF-MS/MS. ..................................................................................................... 106 4. Resultados e Discussões .................................................................................... 108 5. Conclusões .......................................................................................................... 120 Apêndice: Espectros de MS/MS dos cianopeptídeos identificados na floração de cianobactérias. ........................................................................................................ 122 Referências ............................................................................................................. 134 19 Prefácio Cianobactérias são consideradas fósseis vivos, com origem a aproximadamente 3.5 bilhões de anos, habitando diversos ecossistemas, principalmente ecossistemas aquáticos. A facilidade de adaptação das cianobactérias deve-se a produção de uma enorme variabilidade de metabólitos secundários, que são em sua maioria oligopeptídeos com uma grande diversidade estrutural. Estes peptídeos podem ser agrupados de acordo com suas características estruturais como aeruginosinas, cianopeptolinas, nodularinas, microviridinas e microcistinas. A população de células de cianobactérias em corpos de água varia sazonalmente podendo alcançar um crescimento exacerbado aumentando sua densidade celular em até 500%. Este fenômeno é denominado de floração de cianobactérias, sendo uma preocupação mundial recorrente, pois geram custos socioeconômicos e ecológicos. Algumas espécies de cianobactérias presentes nestas florações produzem metabólitos tóxicos que causam efeitos agudos ou crônicos na saúde humana e de outros organismos vivos. Tais toxinas são denominadas de cianotoxinas e a classe das microcistinas é a mais tóxica e recorrente nas florações de cianobactérias presentes em todo mundo. Neste contexto, torna-se necessário o monitoramento de microcistinas e suas concentrações em reservatórios de água para abastecimento público. Além disto, a detecção e o estudo das diferentes classes de peptídeos produzidos pelas cianobactérias presentes nestas florações são de interesse econômico e ecológico, já que estes peptídeos podem apresentar diferentes bioatividades. Uma técnica eficiente para a análise de cianopeptídeos presentes nas florações, é a Matrix Assistided Laser Dersoption/Ionization – Mass Spectrometry (MALDI-MS). Esta técnica é extremamente rápida, possui alta resolução, requer pouquíssimo preparo de amostra e não permite que possíveis contaminantes presentes na amostra interfiram na análise. Por estes motivos MALDI-MS foi utilizada neste trabalho não somente na detecção de diferentes variantes de cianopeptídeos, mas também para quantificação de diferentes variantes de microcistinas. Sendo os objetivos gerais desta tese aplicar a técnica MALDI-MS no desenvolvimento de um método de quantificação de microcistinas avaliando o uso de diferentes matrizes e misturas binárias das mesmas; a aplicação de MALDI-IMS para o imageamento de cianobactérias de água doce, afim de verificar a dispersão espacial das cianotoxinas 20 produzidas pelas mesmas, e por fim, a análise de cianopeptídeos presentes em uma floração de cianobactérias da Represa Salto Grande (Americana-SP). 134 Referências AMERICANA. Perfil do município-hidrografia. Disponível em: . Acesso em: 26 maio 2017a. AMERICANA. Perfil do município-economia. Disponível em: . Acesso em: 26 maio 2017b. ARÁOZ, R.; MOLGÓ, J.; TANDEAU DE MARSAC, N. Neurotoxic cyanobacterial toxins. Toxicon, v. 56, p. 813-828, 2010. BAKER, P. D; FABRO, L. D. A guide to the identification of common blue green algae in Australian freshwaters. 2nd ed. Albury: Cooperative Research Center of Freshwater Ecolocy, 2002. BENT, S. 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