RESSALVA Atendendo a solicitação do(a) autor(a), o texto completo desse trabalho será disponibilizado no repositório a partir de 17/08/2025. 2023 LAÍS FERNANDA FERREIRA FERRAZ ADMINISTRAÇÃO DE Lactobacillus paracasei 28.4 NO TRATAMENTO DA PERIODONTITE: desenvolvimento in vitro de formulação probiótica usando gellan gum e ensaio clínico randomizado placebo-controlado São José dos Campos 2023 LAÍS FERNANDA FERREIRA FERRAZ ADMINISTRAÇÃO DE Lactobacillus paracasei 28.4 NO TRATAMENTO DA PERIODONTITE: desenvolvimento in vitro de formulação probiótica usando gellan gum e ensaio clínico randomizado placebo-controlado Tese apresentada ao Instituto de Ciência e Tecnologia, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus de São José dos Campos, como parte dos requisitos para obtenção do título de DOUTORA, pelo Programa de Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL. Área: Periodontia. Linha de pesquisa: Estudos sobre microbiologia, imunologia e terapia em periodontia e implantodontia. Orientador: Prof. Assoc. Mauro Pedrine Santamaria Instituto de Ciência e Tecnologia [internet]. Normalização de tese e dissertação [acesso em 2023]. Disponível em http://www.ict.unesp.br/biblioteca/normalizacao Apresentação gráfica e normalização de acordo com as normas estabelecidas pelo Serviço de Normalização de Documentos da Seção Técnica de Referência e Atendimento ao Usuário e Documentação (STRAUD). Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Prof. Achille Bassi e Seção Técnica de Informática, ICMC/USP com adaptações - STATI, STRAUD e DTI do ICT/UNESP. Renata Aparecida Couto Martins CRB-8/8376 Ferraz, Laís Fernanda Ferreira Administração de Lactobacillus paracasei 28.4 no tratamento da periodontite: desenvolvimento in vitro de formulação probiótica usando gellan gum e ensaio clínico randomizado placebo-controlado / Laís Fernanda Ferreira Ferraz. - São José dos Campos : [s.n.], 2023. 82 f. : il. Tese (Doutorado em Biopatologia Bucal) - Pós-graduação em Biopatologia Bucal - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos, 2023. Orientador: Mauro Pedrine Santamaria. 1. Probióticos. 2. Lactobacillus. 3. Doenças periodontais. 4. Periodontite. 5. Desbridamento periodontal. I. Santamaria, Mauro Pedrine, orient. II. Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos. III. Universidade Estadual Paulista 'Júlio de Mesquita Filho' - Unesp. IV. Universidade Estadual Paulista (Unesp). V. Título. BANCA EXAMINADORA Prof. Assoc. Mauro Pedrine Santamaria (Orientador) Universidade Estadual Paulista (Unesp)/Universidade do Kentucky (UK) Instituto de Ciência e Tecnologia/Faculdade de Odontologia Campus de São José dos Campos/Lexington Profa. Assoc. Andréa Carvalho De Marco Universidade Estadual Paulista (Unesp) Instituto de Ciência e Tecnologia Campus de São José dos Campos Prof. Ass. Emanuel da Silva Rovai Universidade Estadual Paulista (Unesp) Instituto de Ciência e Tecnologia Campus de São José dos Campos Prof. Dr. Felipe de Camargo Ribeiro Universidade Federal de São Paulo (Unifesp) Escola Paulista de Medicina Laboratório Especial de Micologia Profa. Dra. Mabelle de Freitas Monteiro Universidade Paulista (UNIP) Clínica Odontológica (Periodontia) Campus de Indianópolis São José dos Campos, 17 de agosto de 2023. DEDICATÓRIA Aos meus pais, Carlos e Elen, pelo amor incondicional e por não medirem esforços para que eu recebesse sempre o melhor. Por apoiarem minhas escolhas e serem exemplos de dedicação e bom trabalho. Por confiarem em mim e permitirem tamanha dedicação aos estudos. A vocês o meu eterno reconhecimento, amor e gratidão! AGRADECIMENTOS A Deus, pelo dom da vida, presença e proteção constante. À minha irmã, Larissa, por me entender como ninguém e ser fonte dos melhores conselhos. Por me amparar em qualquer circunstância com suas conversas, cuidados e escuta genuína. Ao meu noivo, Pedro, por todo o amor, respeito e confiança compartilhados ao longo desses anos. Por me incentivar constantemente e me lembrar que as escolhas não precisam ser eternas. Por permanecer em todas as nossas versões e caminhos. Às minhas avós, Darci e Rosa (in memorian), pelos inúmeros ensinamentos e por entenderem minha ausência nos aniversários e almoços em família. Honro suas existências e as levo comigo por onde vou. À querida Cida, que cuidou de mim como uma mãe e continua com esse zelo mesmo à distância. Por ser admirável exemplo de resiliência e fé. À amiga e quase irmã, Victória, por toda a amizade, histórias infinitas e suporte. Por ter sido fundamental em todas as minhas fases de Unesp. Sentirei saudades de dividir a casa e a vida com você. Que o sucesso te acompanhe por onde você for! Às amigas Amanda, Beatriz, Manuela, Cássia e Ana Bonafé, por toda a amizade, experiências compartilhadas e ajudas incansáveis. Sem vocês nada disso seria possível! Cada uma tem um significado especial na minha jornada, muito além das nossas salinhas da pós-graduação. À amiga Evelyn, por todos os ensinamentos, aventuras e companheirismo. Por abraçar comigo esse trabalho e se doar tanto aos nossos “ursinhos”. Sem você esse projeto não teria saído do papel! Às amigas Ana Beatriz e Giovanna, pelos anos de amizade, apoio e lares compartilhados. Por tornarem a minha permanência em São José mais leve e valiosa. Aos amigos que conheci na pós-graduação, em especial aos que compartilhei momentos nesse período de doutorado: Letícia, Clarissa, Eduardo, Tainá, Nátaly, Nicole, Mariana, Victória Oliveira, Bianca, Camila Lopes e Camila Moretto, por toda a convivência e boas risadas. À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Unesp) e ao Instituto de Ciência e Tecnologia de São José dos Campos, na pessoa do diretor Prof. César Rogério Pucci e da vice-diretora Profa. Symone Cristina Teixeira. Aos programas de Pós-graduação em Biopatologia Bucal e Ciências Aplicadas à Saúde Bucal, juntamente com todo o corpo docente e funcionários envolvidos. Ao meu orientador, Prof. Dr. Mauro Pedrine Santamaria, por me receber no seu grupo de pesquisa e permitir a realização desse e de outros estudos. Por toda orientação e ensinamentos diversos que colaboraram para a concretização dessa jornada de cinco anos e meio de muito trabalho e superações. À Profa. Dra. Juliana Campos Junqueira, por abrir as portas do Laboratório de Microbiologia e Imunologia do ICT-Unesp e apostar no sucesso das nossas “gominhas”. Por compartilhar conhecimento e recursos para o desenvolvimento desse trabalho. Ao Prof. Dr. Felipe de Camargo Ribeiro, por dividir tanto conhecimento e ideias mirabolantes para a construção desta metodologia. Por ter formado uma parceria fundamental num período tão louco envolvendo pandemia, gominhas e reality show. À Profa. Dra. Andréa Carvalho de Marco, por me acompanhar nas bancas desde o mestrado e ser exemplo de docência e gentileza. Sou grata por todos os ensinamentos durante a minha formação e período de estágio docência. Ao Prof. Dr. Emanuel da Silva Rovai, pelos aprendizados e incentivos. Nossas conversas foram importantes para que eu mergulhasse em novos desafios e oportunidades. À Profa. Dra. Mabelle de Freitas Monteiro, pela disponibilidade e participação em mais um marco da minha trajetória acadêmica. Por ser inspiração para mim e tantas outras mulheres na Ciência! Aos docentes Profa. Dra. Maria Aparecida Neves Jardini, Prof. Dr. José Benedito Oliveira Amorim, Prof. Dr. Sérgio Lúcio Pereira de Castro Lopes e Profa. Dra. Luciane Dias de Oliveira por contribuírem para a minha formação e serem grandes exemplos dentro da profissão. À psicóloga, Mariana, por seu papel essencial para que eu não desistisse pelo caminho. Por ter me apresentado o conceito de que “quando nós mudamos, o mundo também muda”. Às técnicas e amigas Valéria e Marcinha e à secretária Jacque, por acompanharem de perto essa caminhada, ajudando em tantos momentos difíceis e tornando os dias mais leves e felizes. Aos funcionários do Instituto de Ciência e Tecnologia de São José dos Campos, pelo apoio e colaboração nas atividades diárias em diversos setores como triagem, esterilização, portaria e limpeza. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da Bolsa de Doutorado, tão importante nesse período. A todos os pacientes a quem tive o privilégio de atender durante o doutorado. Em especial, àqueles que aceitaram participar desse estudo e contribuíram para o meu desenvolvimento profissional, intelectual e pessoal. “Não há nada de nobre em sermos superiores ao próximo. A verdadeira nobreza consiste em sermos superiores ao que éramos antes.” ― Ernest Hemingway SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS .................................................................................... 10 LISTA DE TABELAS .................................................................................... 11 RESUMO ........................................................................................................ 12 ABSTRACT .................................................................................................... 13 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 14 2 PROPOSIÇÃO ............................................................................................ 20 3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................ 21 3.1 PARTE A - Desenvolvimento da formulação probiótica para administração no tratamento de doenças periodontais: estudo in vitro ...... 22 3.1.1 Preparo da suspensão padronizada de L. paracasei 28.4 ..................... 22 3.1.2 Preparo da formulação probiótica em gellan gum .............................. 22 3.1.3 Viabilidade de L. paracasei 28.4 a partir da formulação ..................... 25 3.1.4 Recuperação de L. paracasei 28.4 da formulação de gellan gum após armazenamento...................................................................................... 25 3.1.5 Análise do sistema de liberação de L. paracasei 28.4 em PBS ............. 26 3.1.6 Sistema de liberação de L. paracasei 28.4 em saliva artificial ............. 28 3.1.7 Preparo da formulação placebo ............................................................ 28 3.1.8 Armazenamento das formulações de gellan gum ................................. 29 3.1.9 Análise estatística (parte A) .................................................................. 29 3.2 PARTE B - Administração de Lactobacillus paracasei 28.4 como terapia adjuvante no tratamento da periodontite: estudo clínico randomizado placebo-controlado de superioridade ..................................... 30 3.2.1 Desenho do estudo ................................................................................. 30 3.2.2 População-alvo e tamanho da amostra ................................................. 30 3.2.3 Critérios de inclusão .............................................................................. 31 3.2.4 Critérios de não inclusão e exclusão ..................................................... 32 3.2.5 Grupos de tratamento ........................................................................... 32 3.2.6 Randomização, ocultamento e cegamento ............................................ 33 3.2.7 Procedimentos clínicos .......................................................................... 34 3.2.7.1 Terapia inicial ..................................................................................... 34 3.2.7.2 Terapia periodontal não cirúrgica ..................................................... 35 3.2.8 Avaliações clínicas ................................................................................. 36 3.2.9 Adesão à terapia e consumo das formulações ...................................... 38 3.2.10 Percepção do paciente e monitoramento de efeitos adversos ............ 39 3.2.11 Análise estatística ................................................................................ 39 4 RESULTADO .............................................................................................. 41 4.1 Resultado in vitro (Parte A) ..................................................................... 41 4.2 Resultado clínico (Parte B) ...................................................................... 48 5 DISCUSSÃO ................................................................................................ 58 6 CONCLUSÃO ............................................................................................. 68 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 69 APÊNDICES .................................................................................................. 79 ANEXO ........................................................................................................... 79 LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Divisão metodológica e desenhos do presente estudo ...................... 21 Figura 2 –Formulações testadas durante adaptação da metodologia ................. 23 Figura 3 – Formas de silicone utilizadas para verter a solução ......................... 24 Figura 4 – Teste de viabilidade de L. paracasei 28.4 a partir da formulação ... 26 Figura 5 – Teste de análise da liberação de L. paracasei 28.4 (60 minutos) ..... 27 Figura 6 – Terapia inicial e raspagem supragengival ........................................ 34 Figura 7 – Terapia inicial: antes, durante e depois ............................................ 35 Figura 8 – Ultrassom utilizado na terapia periodontal não cirúrgica ................. 36 Figura 9 – Diferença entre as formulações de gellan gum ................................ 41 Figura 10 – Média e desvio-padrão de células de L. paracasei 28.4 (UFC/mL), recuperadas imediatamente após o preparo da formulação de gellan gum ........ 42 Figura 11 – Média e desvio-padrão de células de L. paracasei 28.4 (UFC/mL), recuperadas diariamente após armazenamento em refrigeração ........................ 43 Figura 12 – Média e desvio-padrão de células de L. paracasei 28.4 (UFC/mL), recuperadas semanalmente após armazenamento em refrigeração .................... 44 Figura 13 – Média e desvio-padrão de células de L. paracasei 28.4 (UFC/mL) liberadas das três amostras testadas durante período de 60 minutos em PBS .... 46 Figura 14 – Média e desvio-padrão de células de L. paracasei 28.4 (UFC/mL) liberadas das três amostras testadas durante período de 60 minutos em saliva .. 47 Figura 15 – Fluxograma segundo o CONSORT 2010 ...................................... 48 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Dados demográficos iniciais dos pacientes (n=40) .......................... 49 Tabela 2 - Dados clínicos de boca toda (baseline, 3 e 6 meses) ........................ 51 Tabela 3 - Estratificação das bolsas periodontais com PS ≥4mm e PS ≥5mm no baseline ....................................................................................................... 52 Tabela 4 - Estratificação das bolsas periodontais moderadas (PS =5-6mm) e profundas (PS ≥ 7mm) no baseline................................................................... 53 Tabela 5 – Adesão e consumo das formulações pelos pacientes ........................ 55 Tabela 6 – Percepção de sintomas e efeitos adversos ........................................ 56 Ferraz LFF. Administração de Lactobacillus paracasei 28.4 como terapia adjuvante no tratamento da periodontite: desenvolvimento in vitro de formulação probiótica usando gellan gum e ensaio clínico randomizado placebo- controlado [tese]. São José dos Campos (SP): Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia; 2023. RESUMO A periodontite é uma doença inflamatória do periodonto associada ao acúmulo de biofilme dental, com consequente disbiose da microbiota oral e alteração da resposta imuno-inflamatória. O controle da periodontite realizado por meio do tratamento periodontal não-cirúrgico altera o ambiente subgengival e pode ser associado a terapias adjuntas. O uso de probióticos como terapia adjuvante a esse tratamento parece favorecer a modificação do biofilme bacteriano e resposta imuno-inflamatória. Entretanto, os probióticos empregados até o momento não são próprios da cavidade oral e, por isso, a busca por cepas originadas da microbiota oral tem ganhado espaço na tentativa de favorecer a aderência e colonização permanente dessas bactérias. Recentemente, a cepa de Lactobacillus paracasei 28.4 foi isolada da cavidade oral, exibindo atividades antimicrobianas promissoras sobre o controle de patógenos orais. O presente estudo teve como objetivos o desenvolvimento de uma formulação probiótica de L. paracasei 28.4 incorporado em gellan gum para uso humano, bem como a avaliação dos efeitos clínicos da administração desta formulação como adjuvante no tratamento periodontal. Para tal, o trabalho foi dividido em 2 etapas, contemplando uma etapa laboratorial (parte A), para desenvolvimento da formulação probiótica; e um ensaio clínico randomizado (parte B, n=40), envolvendo um protocolo de tratamento periodontal não cirúrgico associado à terapia adjunta probiótica ou placebo. Os resultados da parte A permitiram encontrar a melhor forma de apresentação e armazenamento da formulação de gellan gum. Na parte B, aos 3 e 6 meses de acompanhamento, os dois grupos apresentaram melhoras significativas dos parâmetros periodontais (índice de sangramento, índice gengival, profundidade de sondagem e ganho de nível de inserção) em relação ao baseline, sem diferença estatística na comparação intergrupo. Como conclusão, uma formulação probiótica segura e possível de ser aplicada na prática clínica foi obtida; no entanto, sua administração não promoveu efeitos clínicos adicionais ao tratamento de pacientes com periodontite generalizada estágios III/IV e graus B/C. Palavras-chave: Probióticos. Lactobacillus. Doenças periodontais. Periodontite. Desbridamento periodontal. Ferraz LFF. Administration of Lactobacillus paracasei 28.4 as adjuvant therapy in the treatment of periodontitis: in vitro development of the probiotic formulation using gellan gum and placebo-controlled randomized clinical trial [doctorate thesis]. São José dos Campos (SP): São Paulo State University (Unesp), Institute of Science and Technology; 2023. ABSTRACT Periodontitis is an inflammatory disease of the periodontium associated with the accumulation of dental biofilm, with consequent dysbiosis of the oral microbiota and alteration of the immune-inflammatory responseThe control of periodontitis carried out through non-surgical periodontal treatment alters the subgingival environment and can be associated with adjunctive therapies.The use of probiotics as an adjuvant therapy in the periodontal treatment seems to favor the modification of the bacterial biofilm and modulation of the immune- inflammatory response. However, the probiotics used so far are not specific to the oral cavity and, therefore, the search for strains originating from the oral microbiota has gained space to favor the adherence and permanent colonization of these bacteria. Recently, strain of Lactobacillus paracasei 28.4 was isolated from the oral cavity itself, showing promising antimicrobial activities in the control of oral pathogens. The present study aimed to develop and characterize a probiotic formulation of L. paracasei 28.4 incorporated into gellan gum for human use, as well as to evaluate the clinical effects of administering this formulation as an adjuvant in the treatment of periodontitis. To this end, the study was divided into 2 stages, comprising a laboratory stage (part A), for the development of the probiotic, and a randomized clinical trial (part B, n=40) contemplating a non-surgical periodontal treatment protocol associated with adjunctive probiotic therapy or placebo. The results from part A made it possible to find the best way to present and store the gellan gum formulation. In part B, at 3 and 6 months of follow-up, both groups showed significant improvements in periodontal parameters (bleeding index, gingival index, probing depth and attachment level gain) in relation to baseline, with no statistical difference in the intergroup comparison. In conclusion, a safe probiotic formulation that can be applied in clinical practice was obtained; however, its administration did not promote additional clinical effects in the treatment of patients with stage III/IV and grades B/C generalized periodontitis. Keywords: Probiotics. Lactobacillus. Periodontal diseases. Periodontitis. Periodontal debridement. 68 6 CONCLUSÃO Dentro das limitações desse estudo, a formulação probiótica proposta foi desenvolvida com sucesso, sendo possível de ser usada na prática clínica e armazenada pelos pacientes, sem apresentar associação a efeitos adversos significativos locais ou sistêmicos. Clinicamente, a administração dessa formulação como terapia adjuvante ao tratamento periodontal não promoveu efeitos adicionais em pacientes com Periodontite Generalizada Estágios III e IV e Graus B e C. Análises microbiológicas e imunológicas são necessárias para investigar os efeitos da terapia probiótica na microbiota periodontal e na modulação da resposta imune do hospedeiro. 69 _______________________ * Baseado em: International Committee of Medical Journal Editors Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical journals: Sample References [Internet]. Bethesda: US NLM; c2003 [cited 2020 Jan 20]. U.S. National Library of Medicine; [about 6 p.]. 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