RESSALVA Atendendo solicitação do autor , o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 31/01/2020. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA ANIMAL DEFESA DE DOUTORADO EFEITO DA APLICAÇÃO INTRATESTICULAR DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS ALOGÊNICAS EM EQUINOS Patricia de Mello Papa Botucatu-SP Janeiro/2018 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA ANIMAL EFEITO DA APLICAÇÃO INTRATESTICULAR DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS ALOGÊNICAS EM EQUINOS Patricia de Mello Papa Tese apresentada a Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho, Campus Botucatu, para obtenção do titulo de Doutor em Biotecnologia Animal, área de Reprodução Animal. Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Alvarenga Botucatu-SP Janeiro/2018 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO – SERVIÇO TÉCNICO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - UNESP - FCA - LAGEADO - BOTUCATU (SP) Papa, Patricia de Mello, 1985- P213e Efeito da aplicação intratesticular de células tronco mesenquimais alogênicas em equinos / Patricia de Mello Papa. – Botucatu : [s.n.], 2018 94 f.: il., color., grafs., tabs. Tese (Doutorado)- Universidade Estadual Paulista, Facul- dade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2018 Orientador: Marco Antonio Alvarenga Inclui bibliografia 1. Equino. 2. Célula tronco mesenquimal. 3. Degeneração testicular. 4. Terapia celular I. Alvarenga, Marco Antonio. II. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Campus de Botucatu). Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. III. Título. Elaborada por Maria Lúcia Martins Frederico – CRB-8:5255 “Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte” Nome da autora: Patricia de Mello Papa Titulo: EFEITO DA APLICAÇÃO INTRATESTICULAR DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS ALOGÊNICA EM EQUINOS BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Marco Antonio Alvarenga Presidente e orientador Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ- UNESP- Botucatu/SP. Profa. Dra. Fernanda da Cruz Landim Membro Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ- UNESP- Botucatu/SP. Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza Membro Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ- UNESP- Botucatu/SP. Prof. Dr. Carlos Eduardo Ambrosio Membro Departamento de Medicina Veteriniária Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos USP- Pirassununga/SP. Prof. Dr. Marcio Teoro do Carmo Membro Veterinário autônomo, Botucatu/SP Data da Defesa: 31 de Janeiro de 2018. Dedicatória Dedico este trabalho aos meus pais, irmãos e meu noivo pelo apoio, incentivo e amor incondicional durante todos os momentos da minha vida. Agradecimentos À Deus, pela vida e pela força para superar os obstáculos e conquistar meus objetivos. Ao meu pai, por toda ajuda durante este experimento, por aceitar minhas ideias, não me deixar desistir, por compartilhar seus conhecimentos, pela dedicação, por cumprir com duplo papel nesta jornada de pai e mestre. Você é meu maior exemplo de profissional. À minha mãe por estar sempre ao meu lado, pelo carinho, pela ajuda com os pôneis, pelas palavras de consolo e incentivo por todo apoio nas minhas decisões e sonhos. Aos meus pais minha eterna gratidão, amor e admiração com certeza essa conquista não é só minha mais de vocês também. Aos meus irmãos Priscila por ajudar intensamente nessa fase final, pelo apoio, amizade e suporte nos momentos difíceis. Gustavo mesmo distante sempre presente incentivando em todos os momentos, por sempre torcerem por minhas vitórias. Ao meu noivo Cássio por estar sempre ao meu lado, pelo carinho e amor, pela ajuda, incentivo, paciência e compreensão, você com certeza foi muito importante e essa conquista também é sua. À minha família (avó,tios,tias,e primos) pelas palavras de incentivo, carinho e orações . Ao meu orientador Prof. Marco por acreditar em mim nesse experimento, por acalmar nas horas difíceis, por todo apoio, dedicação, compreensão e amizade. Muito obrigada. Aos professores e funcionários do Departamento de Reprodução Animal por todos esses anos de convívio e ensinamentos. À Prof.ª Fernanda pelo acolhimento em seu laboratório permitindo o desenvolvimento deste projeto. Á Prof.ª Noeme por ajudar na interpretação das histologias. Aos membros da banca por aceitarem o convite. À Camila e o Zé pelas analises estatísticas e ajuda nesse projeto. Ao Haras Itapuã e Dr. José Martins pelo uso dos animais, e toda ajuda prestada. Á Cabanha Guguiná pelo empréstimo dos pôneis. Aos colegas da pós-graduação e residentes por toda ajuda com o experimento, pela amizade e todo apoio. À Universidade Estadual Paulista UNESP/FMVZ pelo aprendizado e por possibilitar o desenvolvimento do projeto. À CAPES pela bolsa de estudos concedida. Aos animais, que inocentemente e sem saber foram os mais importantes colaboradores deste trabalho. À todos que de alguma forma estiveram envolvidos com esse trabalho e que permitiram assim, o desenvolvimento desse projeto. Muito obrigada a todos! EPÍGRAFE “Mantenha seus pensamentos positivos, porque seus pensamentos tornam- se suas palavras. Mantenha suas palavras positivas, porque suas palavras tornam-se suas atitudes. Mantenha suas atitudes positivas, porque suas atitudes tornam-se seus hábitos. Mantenha seus hábitos positivos, porque seus hábitos tornam-se seus valores. Mantenha seus valores positivos, porque seus valores... Tornam-se seu destino”. Mahatma Ganghi Lista de Tabelas Capítulo 1 Tabela 1 Médias e erro padrão da cinética espermática dos grupos controle e grupo (CTMs) pré e após a aplicação intratesticular................................................................................................. 54 Tabela 2 Médias e erro padrão dos dos volumes testiculares, dos grupos CTMs e grupo Controle pré e após aplicação das células tronco............................................................................................................. 54 Tabela 3 Médias e erro padrão das mensurações dos testículos em comprimento (cm), largura (cm) e altura (cm) dos grupos CTMs e grupo controle........................................................................................................ 55 Tabela 4 Médias e erro padrão dos índices de resistência (IR) e pulsabilidade (IP) da perfusão testicular avaliados com doppler nos grupos CTMs e grupo controle.................................................................... 55 Tabela 5 Médias e erro padrão da temperatura superficial escrtotal dos grupos CTMs e grupo Controle.................................................................... 56 Tabela 6 Médias e erro padrão da altura do epitélio seminífero e diâmetro dos túbulos seminíferos ................................................................................ 56 Tabela 7 Médias e erro padrão dos níveis séricos de testosterona (pg/mL) nos grupos CTMs e grupo controle............................................................ 57 Lista de Figuras Capítulo 1 Figura 1 Desenho esquemático do testículo dos locais onde foram realizadas as aplicações......................................................................... 51 Capítulo 2 Figura 1 Método utilizado para induzir o estresse térmico testicular.... 70 Figura 2 Desenho esquemático do testículo dos locais onde foram realizadas as aplicações......................................................................... 71 Figura 3 Esquema do delineamento experimental.................................. 72 Figura 4 Contagem de espermatozoides na luz do túbulo seminifero.... 73 Figura 5 Gravidade da lesão da arquitetura tubular............................... 74 Figura 6 Epitélio celular dos túbulos seminíferos................................... 75 Figura 7 Boxplot Mediana, mínimo e máximo dos escores do grupo controle e tratado dos diferentes momentos........................................... 77 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO......................................................................................... 16 2. REVISÃO DE LITERATURA................................................................... 19 2.1. Degeneração Testicular........................................................................ 19 2.2. Estresse Térmico.................................................................................. 21 2.3. Tratamento da Degeneração Testicular............................................... 24 2.4. Célula Tronco....................................................................................... 26 2.5. Célula Tronco Mesenquimal............................................................... 28 3. OBJETIVOS............................................................................................ 32 3.1. Objetivos específicos........................................................................... 32 4. REFERÊNCIAS ...................................................................................... 34 5. CAPÍTULO 1........................................................................................... 45 6. CAPÍTULO 2............................................................................................ 64 7. CONCLUSÕES........................................................................................ 84 8. ANEXOS ................................................................................................. 86 RESUMO RESUMO PAPA, P.M. EFEITO DA APLICAÇÃO INTRATESTICULAR DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS ALOGÊNICAS EM EQUINOS. Botucatu - SP. 2018, p.94 Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. O presente estudo propõe avaliar a segurança da aplicação intratesticular de células tronco mesenquimais alogênicas obtidas da medula óssea e verificar o efeito DO tratamento com as células tronco mesenquimais (CTMs) em garanhões submetidos a degeneração testicular. Para o primeiro estudo, foram usados 24 garanhões sadios, nos quais os testiculos foram mensurados, termografia, ultrassonografia doppler, cinética espermática e dosagem hormonal. Os grupos foram separados aleatoriamente em grupo controle (GC) e grupo células tronco mesenquimais (CTMs). No GC foram realizadas aplicações intratesticulares com PBS (solução tampão) e no CTMs solução contendo células. Os animais foram avaliados após a aplicação e aos 15 dias foram orquiectomizados. Os fragmentos testiculares foram destinados para histologia. Os exames clínicos não mostraram declínio na condição geral dos animais após a aplicação e não houve diferença significativa nas variáveis volume, temperatura superficial e ultrassonografia testicular, cinética espermática, analise sérica hormonal e histologia em ambos os grupos. Desta forma, conclui-se que a aplicação intratesticular de CTMs alogênicas da medula óssea é um processo seguro, pois não provocou alterações locais. Para o segundo estudo, um grupo de 10 garanhões foram divididos em dois grupos: grupo controle (CT) e grupo tratado (TT). Os animais foram submetidos ao estresse térmico escrotal, acoplando uma bolsa termica nos testiculos, durante 3 horas por 3 dias consecutivos. Após uma semana da indução, os animais foram tratados com 10 x 106 CTMs suspensas em 5 ml de PBS em cada testiculo. O grupo controle recebeu o mesmo volume contendo apenas PBS. Biopsias testiculares foram coletadas em quatro diferentes momentos: antes do estresse termico (T0); depois do estresse termico (T1); após aplicação de PBS/CTMs (T2); e após 30 dias estresse termico (T3). O método usado para promover a degenerção testicular foi eficiente, mostrando alterações no epitélio seminófero dos dois grupos. Entretanto o grupo tratado com CTMs foi capaz de recuperar mais rápido os padrões iniciais da arquitetura testicular do que o grupo controle. Podemos concluir que a aplicação intratesticular com CTMs foi eficiente e promoveu uma recuperação rápida nos animais que sofreram degeneração testicular devido aos fatores regenerativos liberados pelas CTMs. Palavras-chave: garanhão, degeneração testicular, aplicação intratesticular, célula tronco mesenquimal, alogênica. ABSTRACT PAPA, P.M. EFFECT OF INTRATESTICULAR APPLICATION OF MESENCHYMAL STEM CELLS IN STALLION. Botucatu - SP. 2018, p. 94 Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. The present study aim to evaluate the safety of intratesticular application of allogenic mesenchymal stem cells from the bone marrow and verification through the histological examinations of the effect cells in animals induced to testicular degeneration. For the first study, a group of 24 healthy stallion, measurements of testicular volume, testicular surface temperature, Doppler ultrasonography, sperm kinetics and hormonal dosing were performed. The groups were randomly divided into a mesenchymal stem cell group (MSC) and control group (CG). In the first, an intratesticular application of CTM was performed and in the CG only a buffer solution (PBS) was used. After the application, the animals were examined again. Fifteen days later, the animals were orchiectomized and histological analysis of the fragments were performed. Clinical examination showed no decline in the overall condition of the animals after application. There was no difference in the analysed variables, such as testicular volume, testicular surface temperature, ultrassonography, sperm kinetics, hormonal analysis and histology, in both groups after application. Thus, the results of the presente study support the hypothesis of the feasibility and safety of intratesticular application of allogeneic bone marrow MSC.For the second study, a group of 10 stallions submitted to scrotal thermal stress, testicular histological samples were analyzed before and after thermal insult, after intratesticular applications (PBS / MSC) and after 30 days of insult. The treated and control groups, after thermal stress, received mesenchymal stem cells and PBS respectively in their testicles. The method used to promote degeneration was efficient showing alterations in the seminiferous epithelium of both groups, however the treated group was able to recover a histological preview after 30 days of insult, while it was not observed in the control group. The characteristics that MSC has to stimulate tissue angiogenesis and proliferation, release of growth factors, eliminate free radicals, increase the capacity for renewal and cell differentiation, its immunomodulatory and immunosuppressive actions may be responsible for the outcome in the present study.It is concluded that the application of intratesticular mesenchymal stem cells is safe, in addition to promoting restoration of the initial patterns of the histological architecture of the testis in animals induced to testicular degeneration by thermal stress. Keys-word: stallion, testicular degeneration, application of intratesticular mesenchymal stem cell, allogenic. 33 REFERÊNCIAS 34 4. Refêrencias ALVARENGA, M.A.; PAPA, F.O. 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A ausência de alterações clínicas ou sistêmicas após as injeções intratesticulares de CTMs alogênicas da medula óssea mostrou ser um procedimento seguro, pois não provocou alterações locais, podendo ser realizado com segurança para o tratamento em animais com desordens testiculares. 5. Referência [1] Maia L., da Cruz Landim- Alvarenga F, Taffarel MO, de Moraes CN, Machado GF, Melo GD, Amorim RM. Feasibility and safety of intrathecal transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells in horses. BMC Veterinary Research, 2015,11, 63. [2] Chen JCJ, Goldhamer, D.J. Skeletal muscle stem cell. Reprod. Biol. Endocrinol. 2008; 1, 1-7. [3] Monteiro BS, Argolo Neto N, Del Carlo RJ. Células-tronco mesenquimais. Ciência Rural, 2010, 40,238-245. [4] Alvarenga MA, Papa FO. Principais distúrbios reprodutivos observados em garanhões no Brasil. In: Anais - Congresso Brasileiro de Reprodução Animal, 2009,6,204-209. [5] Crovace A, Lacitignola L, De Siena R, Rossi G, Francioso E. 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Artigo 2 Os resultados do presente estudo mostraram que as células tronco mesenquimais foram eficientes e promoveram a recuperação da histologia após o estresse térmico, provavelmente devido aos fatores regenerativos que essas células possuem, contribuindo assim para tratamento de degeneração testicular das diferentes espécies.