UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP Rastreabilidade em pescado: Influência do grau de domesticação, origem e sazonalidade na diferenciação de peixes Milena Penteado Chaguri Zootecnista Jaboticabal, São Paulo 2013 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP Rastreabilidade em pescado: Influência do grau de domesticação, origem e sazonalidade na diferenciação de peixes Milena Penteado Chaguri Orientadora: Prof. Dra. Léa Silvia SANT’ANA Tese apresentada ao Programa de Pós- graduação em Aquicultura do Centro de Aquicultura da UNESP - CAUNESP, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor. Jaboticabal, São Paulo 2013 Chaguri, Milena Penteado C433r Rastreabilidade em pescado: Influência do grau de domesticação, origem e sazonalidade na diferenciação de peixes. / Milena Penteado Chaguri. – – Jaboticabal, 2013 xix, 91 p. ; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Centro de Aquicultura, 2013 Orientador: Léa Silvia Sant’Ana Banca examinadora: Cintia Labussière Nakayama, Juliana Célia Denadai, Maria Márcia Pereira Sartori, Marta Verardino de Stéfani Bibliografia 1. Ácidos graxos. 2. Isótopos estáveis 3. Minerais. I. Título. II. Jaboticabal-Centro de Aquicultura da Unesp. CDU 639.3.05 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. 2 3 SUMÁRIO Dedicatória ............................................................................................................................................I Agradecimentos ..................................................................................................................................II Apoio financeiro ................................................................................................................................. V Lista de Abreviaturas ....................................................................................................................... VI Resumo ..................................................................................................................................................1 Abstract..................................................................................................................................................2 Capítulo I – Considerações Gerais ..............................................................................................3 Introdução .............................................................................................................................................4 Sistemas de produção ..........................................................................................................................5 Sazonalidade..........................................................................................................................................6 Origem e espécie ..................................................................................................................................7 Composição Química............................................................................................................................8 Minerais...................................................................................................................................................9 Perfil de ácidos graxos ...................................................................................................................... 10 Isótopos estáveis................................................................................................................................ 11 Corvina Portuguesa (Argyrosomus regius) .................................................................................... 12 Corvina (Micropogonias furnieri) ...................................................................................................... 13 Bacalhau .............................................................................................................................................. 14 Objetivos............................................................................................................................................. 17 Referências ........................................................................................................................................ 18 Capítulo II - Rastreabilidade de peixes: Utilização de diferentes ferramentas para diferenciação de corvina portuguesa (Argyrosomus regius) selvagem e de aquicultura ...................................................................................................................................... 25 Resumo ............................................................................................................................................... 26 Abstract............................................................................................................................................... 27 1. Introdução ...................................................................................................................................... 28 2. Material e Métodos....................................................................................................................... 29 3. Resultados e discussão............................................................................................................ 33 4 4. Conclusões.................................................................................................................................... 43 Capítulo III - Rastreabilidade do bacalhau: Utilização de diferentes ferramentas para a autenticação de peixes salgados ................................................................................ 47 Resumo ............................................................................................................................................... 48 Abstract............................................................................................................................................... 49 1. Introdução ...................................................................................................................................... 50 2. Material e métodos ...................................................................................................................... 52 3. Resultados e discussão ............................................................................................................. 55 4. Conclusões ................................................................................................................................... 64 5. Referências .................................................................................................................................... 64 Capítulo IV - Utilização de diferentes ferramentas na identificação de origem geográfica e sazonalidade em corvina brasileira (Micropogonias furnieri) ............... 68 Resumo ............................................................................................................................................... 69 Abstract............................................................................................................................................... 70 1. Introdução ...................................................................................................................................... 71 2. Material e métodos ...................................................................................................................... 73 3. Resultados e discussão ............................................................................................................. 77 4. Conclusões .................................................................................................................................... 85 5. Referências .................................................................................................................................... 86 Considerações finais....................................................................................................................... 91 I Dedicatória Ao meu grande Amor, Henrique, Dedico II Agradecimentos À Deus por sempre me conduzir ao caminho certo, por mais que às vezes não entenda. Aos meus pais Evaldo e Magali pelo amor incondicional, educação e grande incentivo durante todas as fases da minha vida! Amo vocês! Às minhas queridas irmãs Bia e Flávia, pela cumplicidade e amizade. Sinto muita a falta de vocês, desde quando sai de casa há dez anos e sempre sentirei! Ao Henrique, meu grande amor, pelo companheirismo, incentivo, carinho, amor e muita, mais muita paciência que teve durante o mestrado e doutorado, principalmente nos momentos que fiquei ausente, em que tomou conta de tudo sozinho! À todos meus familiares que sempre me apoiaram e deram força para seguir em frente. À Prof.ª Léa Silvia Sant’Ana pela orientação, oportunidades e espelho de uma profissional ética e competente. Ao Dr. António Marques pela orientação, paciência, ensinamentos e participação em todas as fases do meu doutorado, que mesmo do outro lado do oceano nunca deixou de me ajudar e incentivar. Foi um grande prazer trabalhar com uma pessoa tão doce, competente e amiga. À Eng.ª Leonor Nunes pela recepção ao Instituto Português do Mar e Atmosfera - IPMA, ensinamentos e esforços feitos para que tudo corresse bem no meu doutorado. Sem dúvida, um exemplo de profissional a ser seguido. Às minhas queridas amigas Ana Luísa, Patrícia Anacleto, Raquel e Sara Costa pela recepção, ajuda ensinamentos e grande amizade. Minha estadia em Portugal foi muito agradável graças à presença de vocês! À todos os funcionários do IPMA, Mária, Júlia, Helena Lourenço, Suzana e Margarida que nunca negaram esforços para me ensinar e ajudar nas rotinas dos laboratórios. Às Dras Amparo e Narcisa pela participação no projeto, ensinamentos e simpatia. III À Prof. Dra Maria Luísa Carvalho da Faculdade de Ciências de Lisboa pela disponibilização do laboratório e ajuda com o EDXRF. À querida Maristela, pela amizade e agradável companhia durante as viagens e trabalho. À minha querida amiga Ana Alexandrino, minha confidente e companheira, onde com ela pude dividir minhas aflições, saudades e momentos de felicidades e tristezas. Às orientadas da prof. Léa, Eliriane Jamas, Gelcirene Costa, Graziele Carvalho, Débora Santiago e Fabrizia Otani pela ajuda com as análises e momentos agradáveis durante congressos e visitas a Botucatu. Ao prof. Dr. Pedro de Magalhães Padilha pela parceria no projeto, participação na qualificação e disponibilização do laboratório. Ao Prof. Dr. Carlos Ducatti e todo Centro de Isótopos Estáveis - IB - UNESP Botucatu, pela parceria no projeto e análises desenvolvidas. À Dra. Marta Verardino de Stéfani pelas sugestões, participação da banca e pela ajuda desde o início do mestrado. À Dra. Juliana Denadai pela correção e ótimas sugestões na banca de qualificação e defesa. Às Dras. Cintia Labussière Nakayama e Maria Márcia Pereira Sartori pelas correções, sugestões e participação da banca. Aos meus amigos da Pousada da Juventude, Joaquim, António, Carlos, Teresa, Margarida e David, os brasileiros André, Ciro e Maurício, onde passei meus primeiros dias em Lisboa e desta pequena estadia nasceu uma grande amizade e carinho. Às minhas amigas Letícia (Japa), Milena e Taís que tive o prazer de conviver em Jaboticabal durante o mestrado e que se tornaram minhas grandes amigas. Aos meus amigos da ranicultura, Marcio Reche e Cleber Mansano pela companhia, cafezinhos e momentos muito agradáveis que passo quando estou lá (apesar das rãs)! IV À minha amiga, Josey pelos conselhos e amizade de uma vida inteira. Apesar da distância sempre está comigo em pensamento e no coração. Aos funcionários do CAUNESP em especial, aos secretários de pós-graduação Veralice Capatto e David Lorente. E a todos que de alguma forma contribuíram com este trabalho, MUITO OBRIGADA! V Apoio financeiro Bolsa de doutorado no país: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e tecnológico – CNPq. Processo: 140623/2010-8. Bolsa de doutorado no exterior: Programa de Cooperação Internacional, Capes/FCT Portugal. Processo 1542-11-7 . VI Lista de Abreviaturas ACP – Análise de Componentes Principais AOAC – Association of Official Analytical Chemists Methods ARA – Ácido Araquidônico As – Arsênio Br – Bromo 13C – Carbono – 13 Ca – Cálcio Cd – Cádmio Cl – Cloro cm – Centímetro CP – Componente Principal CAG – Corvina Aquicultura Grande CAP – Corvina Aquicultura Pequena CSG – Corvina Selvagem Grande CSP – Corvina Selvagem Pequena CSD – Corvina Santos Dezembro CSJ – Corvina Santos Julho CPD – Corvina Parnaíba Dezembro CPJ – Corvina Parnaíba Julho DHA – Ácido Docosahexaenóico DL – Limite de Detecção EDXRF – Espectrometria de Fluorescência de Raios-X por Energia Dispersiva EPA – Ácido Eicosapentaenóico eV –Elétron-volt FAAS – Espectrometria de Absorção Atômica com Chama VII Fe – Ferro g – Grama Hg – Mercúrio IRMS – Espectrometria de Massa de Razão Isotópica K – Potássio keV – Quilo elétron-volt Kg – Quilograma Li – Lítio L – Litro uL – Microlitro um – Micrômetro m – Metro mm – Milímetro mg – Miligrama mL – Mililitro MUFA – Ácidos Graxos Monoinsaturados 15N – Nitrogênio - 15 n-3 – Ácidos Graxos Ômega-3 n-6 – Ácidos Graxos Ômega-6 Pb – Chumbo PUFA – Ácidos Graxos Poli-insaturados Rb - Rubídio RSD – Desvio Padrão Residual S – Enxofre Se – Selênio SFA – Ácidos Graxos Saturados VIII Si – Silício Sr – Estrôncio UE – União Europeia Zn – Zinco δ – Delta ‰ – Por mil Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 1 Resumo A rastreabilidade é a capacidade de traçar a história, aplicação ou localização de um determinado produto e pode estar relacionada com a sua origem, história do processamento, distribuição e localização após a produção. A globalização do comércio de pescado aumentou a possibilidade de enganos não intencionais e fraudes na discriminação de espécies. Entre as diferentes questões relacionadas à rastreabilidade do pescado há necessidade de buscar metodologias químicas e físicas que sejam capazes de distinguir as diferentes espécies de pescado, a origem geográfica e o método de produção: cultivado ou selvagem. Os objetivos deste estudo foram diferenciar a corvina portuguesa (Argyrosomus regius) quanto ao sistema de produção e tamanho, a corvina brasileira (Micropogonias furnieri) quanto à sazonalidade e origem geográfica e o bacalhau (Gadus mohrua) de outras espécies com características similares. Para esta diferenciação foram utilizadas as técnicas de determinação da composição química, perfil de ácidos graxos, composição de minerais essenciais e não essenciais e isótopos estáveis de carbono e nitrogênio. Foi possível detectar diferenças significativas entre corvinas portuguesas de aquicultura e selvagem em diferentes tamanhos através da composição de lipídeos e umidade, alguns ácidos graxos, minerais e isótopos estáveis. Quanto à diferenciação do bacalhau, a espécie Pollachius virens apresentou as maiores diferenças no perfil de ácidos graxos e foi possível distinguir o gênero Gadus das demais espécies por níveis de 20:5 n-3, 18:3 n-3, Zn e Sr. A composição da corvina brasileira é diferente entre as origens geográficas e épocas do ano. As maiores partes das variações são provavelmente relacionadas à disponibilidade de alimentos e tipo de habitat. As corvinas brasileiras podem ser diferenciadas pelo teor de lipídeos totais, o teor de cinzas, a proporção de vários ácidos graxos, minerais e isótopos de carbono e nitrogênio. Palavras-chave: ácidos graxos, isótopos estáveis, elementos essenciais e não essenciais. Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 2 Abstract Traceability is the ability to trace the history, application or location of a particular product and may be related to their origin, history, processing, distribution and location after production. The fish trade globalization has increased the possibility of unintentional mistakes and frauds in species discrimination. Among the different issues related to fish traceability is necessary to seek physical and chemical methods that are able to distinguish the different fish species, geographical origin and production method: farmed or wild. The objectives of this study were to differentiate meagre (Argyrosomus regius) regarding system production and size, croaker (Micropogonias furnieri) regarding seasonal and geographical origin and cod (Gadus mohrua) of other species with similar characteristics. For this differentiation techniques were used to determine the chemical composition, fatty acid profile, essential and non-essential minerals and stable isotopes of carbon and nitrogen. It was possible to detect significant differences between aquaculture and wild meagre in different sizes through the composition of lipids and moisture, some fatty acids, minerals and stable isotopes. Differentiation of cod species, Pollachius virens showed the greatest differences in fatty acid profile and it was possible to distinguish the genus Gadus of other species by levels of 20:5 n-3, 18:3 n-3, zinc and Sr. The composition of croaker differs between geographical origins and seasons. Most of variations are probably related to the food availability and habitat type. The croakers can be differentiated by the total lipid content, ash content, the proportion of various fatty acids, minerals and carbon and nitrogen isotopes. Key-words: fatty acids, stable isotopes, essential and nonessential elements. Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 3 Capítulo I – Considerações Gerais Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 4 Introdução O hábito alimentar está entre as principais preocupações do ser humano, especialmente, no que se refere à qualidade dos alimentos, a ingestão de nutrientes para o bom funcionamento do organismo e a segurança dos alimentos a serem consumidos. O peixe é fonte de proteínas, vitaminas, minerais essenciais e ricos em ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (PUFA) (SIMOPOULOS, 2002), que fornecem diversos benefícios à saúde (CASTRO-GONZALEZ; MENDEZ-ARMENTA, 2008), além de atuar na prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares entre outras doenças (ARTS; ACKMAN; HOLUB, 2001; OKITA et al., 2002). No entanto, devido à grande comercialização de alimentos no mundo é crescente preocupação com a qualidade destes produtos. Por isso, é importante que os órgãos competentes estabeleçam uma legislação clara em relação à comercialização para evitar possíveis fraudes (THOMAS; JASMIN; LEES, 2005). O comércio internacional de pescado atualmente é muito influenciado pelas normas de autenticação e segurança dos alimentos, e várias diretivas da União Europeia introduziram aspectos de qualidade e segurança nos padrões para comercialização de produtos da cadeia produtiva do pescado (BUSETTO et al., 2008). Além da União Europeia, que desde 2005 exige informações básicas sobre o pescado como nome comercial e científico dos peixes, origem geográfica e o método de produção, leis similares no Japão (The Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries of Japan, 2004), e nos EUA (U.S. Food and Drug Administration, 2003) também são necessárias à comercialização do pescado. Assim, para garantir a segurança do alimento, é necessário considerar todos os elos da cadeia produtiva levando em consideração o sistema de produção, a alimentação animal, a estocagem e venda do produto ao consumidor (REGULAMENTO CE n° 178/2002). A rastreabilidade é uma ferramenta capaz de identificar possíveis falhas em qualquer fase da cadeia produtiva. A rastreabilidade é a capacidade de traçar a história, aplicação ou localização de um determinado produto e pode estar relacionada com a sua origem, história do processamento, distribuição e localização após a produção (REGULAMENTO CE n° 178/2002). Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 5 A regulamentação da União Europeia define a rastreabilidade de alimentos como a capacidade de seguir um alimento, ração, produtos da alimentação animal ou substância em todos os estágios da produção e distribuição (LARSEN, 2003). Entretanto, a capacidade de rastrear o pescado é dificultada, pois as características morfológicas externas dos produtos processados (enlatados, filetados, defumados e salgados) são removidas, dificultando a identificação e possibilitando a substituição de pescado de maior valor por espécies de menor valor comercial (ASENSIO et al., 2008). O aumento da comercialização global possibilitou que peixes com características similares possam ser provenientes de diferentes pontos de origem o que aumenta a possibilidade de enganos não intencionais e fraudes na discriminação de espécies (BELL et al., 2007). A composição química dos peixes pode ser influenciada por diversos parâmetros, incluindo fatores exógenos como espécie, localização, temporada de pesca, sexo, idade dos animais, nível de domesticação, disponibilidade e qualidade de alimentos, salinidade e temperatura (MAIRESSE et al., 2006; OLSSON et al., 2003; HAARD, 1992), e fatores endógenos por meio da mobilização de lipídeos e proteínas para as gônadas no período reprodutivo (TZIKAS et al., 2007). Sistemas de produção A população mundial está aumentando e consequentemente existe a necessidade do aumento da produção de alimentos. Atualmente os consumidores estão em busca de alimentos saudáveis e o consumo de peixe é associado ao teor de proteínas, ácidos graxos e minerais. No entanto, a pesca extrativista já ultrapassou os seus limites sustentáveis e cada vez mais o déficit da pesca vem sendo suprido pelos produtos da aquicultura (FAO, 2010). Segundo a FAO (2011), a produção mundial de pescado atingiu 62,7 milhões de toneladas em 2011, contribuindo com mais de 40% da produção total de peixes, por isso mais produtos provenientes da aquicultura estão disponíveis para os consumidores. Informações corretas sobre o método de produção do pescado são importantes, pois tantos os organismos criados em cativeiro quanto os selvagens podem carregar diferentes tipos de riscos e, portanto, devem ser submetidos a diferentes regulamentações e controles analíticos. Assim como qualquer outra produção animal, os peixes são cultivados em densas populações. Isto pode ter Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 6 consequências na quantidade de agentes patogênicos produzidos e, consequentemente na proliferação de doenças (Krkošek, 2010). Por outro lado, peixes selvagens geralmente apresentam maiores concentrações de contaminantes como Hg e As e relação aos espécimes criados em cativeiro (Minganti et al., 2010). Segundo Sapkota et al. (2008) a avaliação destes contaminantes é essencial para a compreensão dos riscos à saúde humana associados ao consumo de peixes de aquicultura e selvagens. A produção intensiva tem levantado preocupações sobre a qualidade do peixe cultivado em comparação ao peixe selvagem. Sabe-se também que a concentração lipídica varia entre peixes de aquicultura e selvagem da mesma espécie. Portanto, é de grande importância comparar a origem de produção destes em termos de sua composição química, perfil de ácidos graxos e minerais. Sazonalidade O interesse na composição do pescado é, principalmente, devido à sua importância nutricional na dieta humana. No entanto, sua composição não é constante, onde muitos fatores influenciam o produto final. A composição de diversas espécies de peixes varia de acordo com o seu ciclo natural, fase de maturidade e localização geográfica (HAARD, 1992). A disponibilidade de alimento na natureza é o principal fator que atua na variação da composição química do pescado. Sabe-se que sua composição, tais como o teor de proteína, lipídeos e água estão sujeitos a variações sazonais que podem influenciar na qualidade do produto final. Mudança no ciclo reprodutivo também tem efeito marcante sobre a composição corporal, pois armazenam gordura para fornecer energia necessária durante a escassez de alimentos e na fase reprodutiva. Muitos estudos observaram que a composição de peixe apresenta grandes variações no teor de gordura e composição de ácidos graxos de vários organismos marinhos durante o ano (BANDARRA et al., 1997; AIDOS et al., 2002; LUZIA et al., 2003). Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 7 Origem e espécie A sobrepesca provocou o declínio dos estoques pesqueiros e essa situação tem causado aumento na comercialização de espécies alternativas para atender a demanda dos consumidores e aumentar a oferta de produtos. Espécies com propriedades morfológicas e organolépticas similares podem ser comercializadas indevidamente em ações fraudulentas. Produtos de peixe são comercializados em muitas formas (salgado, em filés, sem pele) onde no processamento são removidas as características morfológicas externas, dificultando a identificação e possibilitando substituição por espécies de menor valor comercial (RASMUSSEN; MORRISSEY, 2009). A origem do pescado também é outro fator importante na comercialização. A identificação da origem pode agregar valor ao produto, a exemplo de muitos queijos, vinhos e azeites. O Gadus mohrua, conhecido no Brasil como bacalhau do Porto, apresenta alto valor comercial, sendo muitas vezes substituído por outras espécies de valor e qualidade inferiores. Pesquisa feita pelo Escritório Suíço Federal de Saúde Pública mostrou que a origem dos alimentos é importante para a decisão de compra de 82% dos clientes. Esta grande preocupação com a origem dos alimentos é devido principalmente a problemas com doenças como Salmonelose, gripe aviária e a EEB (encefalopatia espongiforme bovina). A confirmação da origem geográfica do alimento pode evitar possíveis problemas de qualidade e aumentar a confiabilidade do consumidor (FRANKE et al., 2005). Diretivas da UE introduziram normas de rotulagem exigindo que o peixe seja rotulado com informações como nome comum, espécie, origem geográfica e método de produção (CE, 2001). Neste sentido, o objetivo destas normas é determinar a rastreabilidade do pescado, para garantir a confiança dos consumidores e fornecer- lhes o mínimo de informações necessárias sobre a origem dos produtos. Entre as diferentes questões relacionadas à rastreabilidade do pescado há necessidade de buscar metodologias químicas e físicas que sejam capazes de distinguir diferentes espécies, origem geográfica e o método de produção: cultivado ou selvagem (MORETTI et al., 2003). Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 8 Composição Química O pescado é composto principamente por água, proteínas, lipídeos e minerais. A composição química dos peixes varia de acordo com a espécie, idade, sazonalidade, origem geográfica, maturidade sexual, parte do corpo, tipo de músculo e, principalmente pela dieta (RASOARAHONA et al, 2005). As propriedades organolépticas e o valor nutricional em conjunto com o frescor constituem a qualidade do pescado. Todas essas características dependem fortemente da composição química do peixe, que por sua vez depende de muitos fatores que afetam a qualidade, tais como as características intrínsecas do peixe, fatores ambientais e história de alimentação (GRIGORAKIS, 2007). Diferenças na composição química do pescado também podem interferir no sabor de sua carne. Sabe-se que diferenças na quantidade de gordura e umidade na carne do peixe podem afetar as características sensoriais (TURCHINI et al., 2009). Os lipídeos são precursores dos compostos aromáticos e a oxidação dos ácidos graxos produz compostos voláteis que caracterizam o sabor do peixe (KAWAI, 1996). O teor de proteínas do músculo do peixe também contribui para a qualidade organoléptica nos casos de proteínas que interagem com a água, bem como em casos de longos peródos de jejum onde existe a redução da proteína do tecido muscular conjuntivo que altera sua textura (LOVE, 1992). Outros fatores como diferenças no perfil de ácidos graxos, processos de oxidação, ingredientes alimentares, minerais e teor de aminoácidos também podem ocasionar diferenças nas características sensoriais (HAARD, 1992). O conteúdo bioquímico de organismos marinhos pode sofrer alterações devido à mudanças sazonais (ACKMAN, 1995). O teor de lipídeos de algumas espécies de peixes pode variar em cerca de 10%, de acordo com a época de captura (KRZYNOWEK, 1985). É esperada uma concentração maior de lipídeos totais no período do inverno que nas outras estações do ano (RAHMAN et al., 1995). O teor de lipídeos é maior em peixes cultivados em relação às espécies selvagens devido a uma variedade de fatores, incluindo disponibilidade e tipo de alimento, ingredientes alimentares, consumo de energia (GRIGORAKIS et al., 2002) e possíveis períodos de fome encontrados pelos peixes selvagens (HAARD, 1992). Segundo Shearer (1994), existe uma relação inversa entre a água e o teor de Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 9 lipídeos nos peixes, quanto maior a quantidade de gordura, menor a umidade e vice- versa. Segundo Lie (2001), peixes de viveiro são menos firmes do que os peixes selvagens, fator este atribuído a um maior teor de gordura nos peixes de viveiro, bem como níveis mais elevados de atividade em peixes selvagens que podem melhorar a textura. As cinzas são compostas por uma variedade de minerais e o total raramente ultrapassa 1-2% da carne do peixe (MURRAY; BURT, 1969). Os minerais são indispensáveis ao organismo dos peixes, pois são componentes da estrutura óssea, atuam na manutenção do sistema coloidal e regulação do equilíbrio ácido-base, além de constituir componentes importantes de hormônios, enzimas e ativadores de enzimas (LAL, 1995). Minerais O peixe é excelente fonte de minerais essenciais e a concentração desses elementos é influenciada por uma série de fatores, como diferenças sazonais e biológicas (espécie, tamanho, idade, sexo e maturidade sexual), fonte de alimentos e meio ambiente. Outras variações podem influenciar os resultados como: a variabilidade em processos de amostragem e os métodos empregados no processo de determinação e quantificação dos minerais (LAL, 1995). Os consumidores estão interessados na concentração dos minerais do peixe devido a disponibilidade de minerais essenciais (P, Na, K, Mg, Ca, Fe, Zn, Se, Cr, Co, Cu, Mn e Zn), porém, há uma grande preocupação quanto à presença de metais potencialmente tóxicos em sua carne. Os metais tóxicos são considerados perigosos quando encontrados em altas concentrações, sendo o Cd, Pb e o Hg considerados os mais tóxicos em pescado (MARQUES et al., 2010). Os metais potencialmente tóxicos, também chamados de elementos traço, são encontrados naturalmente no ambiente em pequenas concentrações, porém, as atividades industriais, agrícolas e os efluentes gerados aumentam o nível desses elementos no ambiente (STAFILOV; KARADJOVA, 2009). A contaminação dos ecossistemas aquáticos por elementos traço podem causar sérios problemas à saúde humana devido a sua toxicidade, longa persistência, bioacumulação e biomagnificação na cadeia alimentar (PAPAGIANNIS, et al., 2004). Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 10 Segundo Carpene et al. (1998) existem diferenças bioquímicas entre o músculo de peixes selvagens e cultivados em relação à quantidade de elementos traço. Assim, o músculo de peixes selvagens é significativamente mais rico em minerais não essenciais. Os cientistas deram três possíveis explicações para maiores concentrações de elementos traço no músculo peixes selvagens: A primeira explicação é que peixes selvagens recebem cátions da água e dieta e, possivelmente, seu ambiente natural é mais rico desses minerais, a segunda explicação é que peixes cultivados maior teor de lipídeos que apresenta uma menor afinidade para os metais. E a terceira explicação é que o maior exercício do peixe selvagem está ligado com o aumento da expressão da proteína que apresenta uma elevada afinidade aos elementos traço (Grigorakis, 2007). A idade, tamanho, hábito alimentar do peixe e o tempo de contato com esses elementos que determina o acúmulo de metais tóxicos nestes organismos (AL- YOUSUF; EL-SHAHAWI; AL-GHAISC, 2000). Metais como Cu, Zn e Fe são essenciais para o metabolismo dos peixes, enquanto outros como, Hg, Cd e Pb não têm nenhum papel conhecido em seu sistema biológico, porém, a rota desses metais não essenciais é semelhante ao dos essenciais que também são transportados e acumulados nos tecidos (CANLI; ATLI, 2003). Perfil de ácidos graxos Os ácidos graxos são classificados em saturados (SFA), monoinsaturados (MUFA) e poli-insaturados (PUFA). O ácido palmítico (16:0) é o principal ácido graxo saturado em peixes, está presente na gordura animal e óleos vegetais utilizados na ração. Este ácido graxo representa aproximadamente 70% do total de SFA. O ácido oléico (18:1n-9) é o principal MUFA e sua fonte é proveniente da gordura animal e óleos vegetais como: óleo de oliva, canola e outras sementes. Os peixes são importantes fontes de ácido linoléico e o ácido α-linolênico, ácidos graxos essenciais, que não podem ser sintetizados pelos humanos e, portanto, devem ser obtidos através da dieta (CONNOR, 2000). Entre os ácidos graxos poli-insaturados estão o ácido eicosapentaenóico (EPA, C20: 5n-3) e ácido docosahexanóico (DHA, C22: 6n-3) (ACKMAN, 1989). Estes ácidos graxos previnem doenças coronárias, doenças inflamatórias e arritmias (BELLUZZI, 2001). Estudos comprovaram que o EPA também e útil no tratamento de doenças cerebrais e câncer (FENTON; HIBBELN; KNABLE, 2000). Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 11 Estes ácidos graxos desempenham importantes papéis fisiológicos no peixe como depósito de energia, conformação das membranas celulares, sendo também precursores de substâncias, como as prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos (HARRIS, 1999). Os peixes marinhos são caracterizados por apresentar uma relação n-3/n-6 alta (STEFFENS, 1997). Isto se deve ao alto conteúdo de EPA e DHA encontrados nos alimentos marinhos como algas, fitoplânctons e peixes. Geralmente, a proporção de ácidos graxos n-3 é superior aos ácidos graxos n-6 em alimentos marinhos (OLSEN, 1998). Segundo Bell e Sargent (2003), as principais modificações quanto à constituição química do pescado, especialmente nos níveis de ácidos graxos é atribuído a qualidade e quantidade do fitoplâncton disponível no habitat, uma vez que estes representam a maior fonte de ácidos graxos do alimento, em especial os da série ômega-3. O ácido araquidônico (ARA) também tem uma função vital como o principal precursor dos eicosanóides (BELL et al., 1994). O ARA é mediador de uma grande variedade de funções fisiológicas incluindo regulação osmótica, funções cardiovasculares, controle neural e a funcionalidade do sistema reprodutivo (SORBERA; ZANUY; CARRILLO, 1998). Os ácidos graxos são os componentes que mais apresentam variações no pescado (MURRAY; BURT, 1969). A composição de ácidos graxos dos peixes pode diferir em função de uma variedade de fatores, incluindo espécie, idade, origem marinha ou água doce, sazonalidade (SAITO et al., 1999; ACKMAN, 1989; JUSTI et al., 2003) dieta e sistema de produção. A dieta representa o principal fator que influencia na composição de ácidos graxos (BANDARRA; BATISTA; NUNES, 2009). Isótopos estáveis A espectrometria de massa de razão isotópica (IRMS) é uma técnica capaz de diferenciar compostos quimicamente idênticos baseado em seu conteúdo isotópico (BRENNA et al., 1997). Os elementos que constituem um material biológico podem ser determinados através da proporção de isótopos estáveis (13C/12C, 15N/14N, 18O/16O e 2H/1H) (LUYKX; RUTH, 2008). Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 12 A IRMS pode oferecer inequívoca evidência de adulteração em alimentos, e, portanto, pode ser uma ferramenta prática para o uso diário por laboratórios de controle e agências de aplicação no processo de comércio fraudulento (KELLY, 2003). Vários trabalhos têm usado a IRMS para rastrear diferenças entre peixes cultivados e selvagens (BUSETTO et al., 2008; THOMAS et al., 2008), sazonalidade (SANT’ANA; DUCATTI; RAMIRES, 2010) e espécie (OLIVEIRA et al., 2011). Em geral, a composição isotópica depende de vários fatores, entre os mais importantes para o pescado estão os alimentos utilizados na dieta dos animais de criação e as variações sazonais (LUYKX; RUTH, 2008). Os isótopos estáveis mais utilizados em estudos biológicos são o carbono (13C) e o nitrogênio (15N) (MANETTA; BENEDITO-CECILIO, 2003). Composição isotópica é determinada tanto pela dieta consumida, como pelo ambiente em que o peixe é cultivado (KELLY; HEATON; HOOGEWERFF, 2005). Os valores de 13C refletem a ingestão de todas as fontes assimiladas pelos peixes selvagens, enquanto que esses valores em peixes cultivados estão relacionados com os ingredientes da ração utilizados na dieta. Segundo Morrison et al. (2007), a dieta afeta diretamente a concentração de 15N nos peixes, e que a proporção isotópica de 15N pode ser influenciada por série de fatores intrínsecos e extrínsecos, como maturidade, taxa de crescimento do animal e variações sazonais de 15N no ambiente. Corvina Portuguesa (Argyrosomus regius) A corvina, Argyrosomus regius, é uma espécie carnívora pertencente à família Sciaenidae. Habita os mares Mediterrâneo, Negro e a costa Atlântica da Europa onde vive nas plataformas costeiras perto do fundo, bem como em superfície, a cerca de 15 a 200 m de profundidade (WHITEHEAD et al., 1986). A corvina apresenta cabeça relativamente grande e corpo alongado, podendo atingir até 2 m de comprimento e 50 kg de peso (Figura 1). Esta espécie adapta-se facilmente ao cativeiro atingindo altas taxas de crescimento, apresenta boa capacidade de tolerar amplas faixas de temperatura e salinidade. Sua carne é magra de alta qualidade lipídica (QUEMENER, 2002). Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 13 Figura 1: Representação de Argyrosomus regius. Fonte: MONFORT, 2010. A história da corvina na aquicultura é bastante recente. Sua produção começou simultaneamente na França e Itália na década de noventa. Os principais mercados tradicionais para a criação da corvina são a Itália e Espanha, e novos mercados estão sendo abertos a cada dia. A indústria de alimentação e muitos restaurantes olham com interesse crescente para esta espécie, e existem potencialidades para mais vendas neste segmento, na maioria dos países europeus. A produção de corvina teve um aumento significativo nos últimos anos, atingindo 13.742 toneladas em 2011 (FAO, 2010). Atualmente a corvina é um dos melhores candidatos a aquicultura em grande escala na Europa, devido às suas condições de produção favoráveis citadas anteriormente (MONFORT, 2010). Corvina (Micropogonias furnieri) Devido à sua abundância, a corvina (Micropogonias furnieri) é considerada uma das espécies mais tradicionais e importantes da pesca brasileira, argentina e uruguaia. M. furnieri é uma espécie demersal eurialina costeira, chegando a atingir até 70 cm de comprimento (ELSDON; GILLANDERS, 2002) (Figura 2). É uma espécie onívora com preferência em pequenos crustáceos como camarões e caranguejos, possui grande tolerância às variações de salinidade. Está distribuída a partir da Península Yucatán (México) ao sul do Caribe e ao leste da América do Sul até a costa do Golfo de San Matías, na Argentina (ISAAC, 1988). Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 14 Figura 2: Representação de Micropogonias furnieri. Fonte: FAO, 2011. Em relação ao ciclo de vida, os indivíduos jovens migram para as zonas estuarinas enquanto que os adultos buscam o litoral para se reproduzir. Como consequência dessa migração e também da disponibilidade de alimentos existe uma variação da população de corvinas durante o ano (COSTA; ARAUJO, 2003). A corvina constitui uma das espécies de maior captura do litoral do Atlântico Sul (BRASIL, 2005) e é geralmente é comercializada fresca e salgada. Segundo a FAO (2011) a captura total desta espécie em 2011 foi de 93.824 toneladas. Devido à grande disponibilidade desta matéria-prima e o baixo preço de mercado em relação às outras espécies regionais (principalmente as de menor tamanho), torna a corvina uma espécie com grande potencial para o consumo, principalmente no Brasil. Bacalhau O bacalhau é um peixe amplamente conhecido em todo o mundo. Habita águas frias e profundas ainda que possa viver em águas de superficie quando as condições hidrográficas são desfavoráveis (MANSO; CRUZ, 1984). A grande maioria dos Gadídeos vive em recifes continentais ao longo do Atlântico Norte, mas também habitam áreas do Pólo Sul e outros oceanos (COHEN et al., 1990). O bacalhau do Atlântico tem sido explorado desde que o homem começou a pescar nos mares da Europa e é considerado um alimento nobre peixe quando salgado e seco. Atualmente, a captura de bacalhau vem diminuindo devido ao declínio dos estoques pesqueiros, mas ainda é a principal fonte de abastecimento do mercado com 1.049.666 toneladas em 2011, no entanto, a produção de bacalhau em cativeiro tem ganhado espaço. Sua produção teve início no final da década de Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 15 80 e a produção desta espécie totalizou 16.126 toneladas em 2011. A Noruega é o maior produtor e exportador de bacalhau salgado e seco. O preparo é feito a partir do peixe fresco decapitado, eviscerado e seco durante cerca de três meses. Finalmente, o produto é armazenado em lugar fresco e seco (LUCCIA et al., 2005). A família Gadidae, pertencente à ordem Gadiformes, é formada por um grupo de aproximadamente 50 espécies, distribuídas em 3 sub-famílias: Gadinae, Lotinae e Phycinae. Segundo o Decreto-Lei n.º 25/2005, de 28 de Janeiro, de Portugal, existem apenas três espécies que podem ser consideradas bacalhau legítimo, o bacalhau do Atlântico (Gadus mohrua) (Figura 3), o bacalhau da Groenlândia (Gadus ogac) e o bacalhau do Pacífico (Gadus macrocephalus). Figura 3: Representação do bacalhau do Atlântico (Gadus mohrua). Fonte: http://www.fishsource.com/species/show/1# O Gadus mohrua apresenta a carne mais branca entre os demais peixes pertencentes à família Gadídae, sendo um dos produtos tradicionais mais apreciados em todo o mundo, sobretudo, devido à estabilidade de armazenamento, sabor e alto valor nutricional (LAURITZSEN et al., 2004). A substituição de espécies de pescado tornou-se uma preocupação significativa nos mercados internacionais e domésticos em todo o mundo, por isso a aplicação de métodos para garantir a autenticação é necessária. Vários métodos têm sido desenvolvidos para diversos tipos de aplicações, no entanto, algumas técnicas são demoradas e onerosas. Portanto, a combinação das técnicas de determinação da composição química, perfil de ácidos graxos, minerais e isótopos estáveis na autenticação de peixes pode ser uma ferramenta eficiente na autenticação do pescado. Diferenças quanto à origem geográfica, sistemas de produção, tamanho e sazonalidade afetam a qualidade, preço e a segurança do alimento. Com a utilização dessas técnicas na autenticação do pescado é possível Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 16 evitar fraudes, enganos e proporcionar aos consumidores um maior número de informações sobre o produto a ser consumido. Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 17 Objetivos Geral O objetivo deste estudo foi utilizar a composição química, elementos essenciais e não essenciais, perfil de ácidos graxos e isótopos estáveis, como ferramentas de rastreabilidade para avaliar o grau de domesticação, origem e sazonalidade de peixes. Específico  Diferenciar a corvina (Argyrosomus regius) quanto ao sistema de produção grau de domesticação e tamanho utilizando a composição química, perfil de ácidos graxos, minerais e isótopos estáveis.  Utilizar a composição química, perfil de ácidos graxos, minerais e isótopos estáveis , como instrumentos de rastreabilidade para garantir a autenticidade do bacalhau do Atlântico (Gadus mohrua) e outras espécies de peixes salgados e secos, de modo a que a fraude possa ser detectada.  Utilizar a composição química, perfil de ácidos graxos, minerais e isótopos estáveis, como instrumentos de rastreabilidade para avaliar a origem geográfica e a sazonalidade da corvina (Micropogonias furnieri). Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 18 Referências AIDOS, I. Seasonal Changes in Crude and Lipid Composition of Herring Fillets, Byproducts, and Respective Produced Oils. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 50, p. 4589-4599, 2002. ACKMAN, R.G. 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Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 25 Capítulo II - Rastreabilidade de peixes: Utilização de diferentes ferramentas para diferenciação de corvina portuguesa (Argyrosomus regius) selvagem e de aquicultura Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 26 Resumo A globalização do comércio permitiu a possibilidade de erros não intencionais e fraudes na discriminação de espécies de pescado. Portanto, existe uma necessidade urgente de desenvolver métodos físicos e químicos de baixo custo capazes de diferenciar espécies de forma inequívoca, bem como sua origem geográfica e método de produção. O objetivo deste estudo foi utilizar composição química, elementos essenciais e não essenciais, perfil de ácidos graxos e isótopos estáveis de carbono e nitrogênio como ferramentas de rastreabilidade para avaliar o sistema de produção e o tamanho das corvinas portuguesas (Argyrosomus regius). As corvinas de aquicultura apresentaram níveis mais elevados de lipídeos e menor teor de umidade que as selvagens. As corvinas de aquicultura tiveram maior proporção de 14:0, 18:1n-9, 18:2n-6, 18:3n-3, 20:1n-9, 22:1n-11 que as selvagens. Foram detectadas diferenças significativas entre corvinas de aquicultura e selvagem em Cl e Zn. Este estudo mostrou que a maior concentração de Rb foi encontrado nas corvinas maiores e menores concentrações de Br inferiores mas corvinas menores. Os isótopos de carbono foram estatisticamente diferentes entre as corvinas de aquicultura e selvagem. Os valores δ15N de corvinas de aquicultura foram estatisticamente menores do que as selvagens. Valores isotópicos de nitrogênio só foram significativamente diferentes entre os tamanhos em corvinas selvagens. Assim, os isótopos estáveis, perfil de ácidos graxos e a composição mineral podem ser técnicas promissoras para a rastreabilidade de corvina portuguesa. Palavras-chave: corvina (Argyrosomus regius), espectrometria de massa de razão isotópica, ácidos graxos, minerais e contaminantes. Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 27 Abstract The global marketing has enabled the possibility of unintentional mistakes and frauds in the discrimination of seafood species. Therefore, there is an urgent need to develop cost-effective physical and chemical methods able to unequivocally distinguish the different seafood species, their geographical origin and production method. The aim of this study was to use proximate chemical composition, essential and non-essential elements, fatty acid profile and stable isotopes of carbon and nitrogen, as traceability tools to assess domestication level and size of meagre (Argyrosomus regius). Farmed meagre contained higher lipids and lower moisture content than its wild counterpart. Farmed meagre had higher proportion of 14:0, 18:1n-9, 18:2n-6, 18:3n-3, 20:1n-9, 22:1n-11 than wild ones. Significant differences were detected between farmed and wild meagre in Cl and Zn contents. This study showed that larger meagre was higher Rb contents and lower Br contents than smaller meagre. Carbon isotopic ratios were statistically different between farmed and wild meagre. δ15N values of farmed meagre were statistically lower than wild counterparts. Nitrogen isotopic values were only significantly different between sizes in wild meagre. Thus, isotopic ratio, fatty acid and mineral composition and can be promising traceability techniques for meagre A. regius. Keywords: meagre (Argyrosomus regius); isotope ratio mass spectrometry; fatty acids; macro and trace elements Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 28 1. Introdução O aumento da globalização do comércio aumentou a possibilidade de erros não intencionais e fraudes na discriminação de espécies de pescado (Bell et al., 2007). Por isso, a União Europeia criou regulamentos que definem a rastreabilidade dos alimentos. A rastreabilidade é a capacidade de rastrear a história, aplicação ou localização de um determinado alimento, alimentação, produtos de alimentação animal ou substância em todas as fases de produção e distribuição (Larsen, 2003). O objetivo destas normas é garantir a confiança do consumidor e proporcionar-lhe o mínimo de informações necessárias sobre a origem dos produtos. Vários métodos têm sido utilizados para distinguir as espécies de pescado, tais como a composição de ácidos graxos (Alasalvar et al., 2002; González et al., 2006; Thomas et al, 2008), a natureza dos carotenóides (Moretti et al., 2006), contaminantes (Fallah et al, 2011) e razões isotópicas (Bell et al. 2007; Busetto et al., 2008). Porém, é necessário o desenvolvimento de métodos físicos e químicos capazes de diferenciar inequivocamente as espécies, origem geográfica e método de produção: aquicultura ou selvagem. Molkentin et al. (2007) mostraram que a combinação de diferentes técnicas (análise isotópica e composição de ácidos graxos) permitiu distinguir amostras de salmão de diferentes origens: cultivado, selvagem e cultivado organicamente. A espectrometria de massa de razão isotópica (IRMS) é uma técnica capaz de distinguir os compostos quimicamente idênticos com base em seu conteúdo isotópico (Brenna et al., 1997) e tem sido utilizada para diferenciar origem de pescado (Bell et al., 2007; Molketin et al., 2007). Esta técnica pode oferecer evidências de adulteração de alimentos e, portanto, pode ser um instrumento prático para uso diário em laboratórios de controle e agências de aplicação no processo de comércio fraudulento (Kelly, 2003). Em geral, a composição isotópica depende de vários fatores, sendo que o mais importante é a ração utilizada na dieta dos animais de criação e as variações sazonais (Luykx & van Ruth, 2008). A composição química dos peixes pode ser influenciada por diversos parâmetros, tais como fatores genéticos, origem geográfica, nível de domesticação, disponibilidade e qualidade do alimento e época de captura (Haard, 1992). Esta variação está intimamente relacionada com a ingestão de alimentos, migração e Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 29 variações sexuais relacionadas à desova (Tzikas et al., 2007). Peixes selvagens e cultivados têm dietas diferentes que conduzem a diferentes características de composição. Vários estudos têm mostrado que existem diferenças no perfil de ácidos graxos entre peixes selvagens e cultivados (Grigorakis et al., 2002; Fernandez-Jover et al., 2007; Busetto et al, 2008). Em todos os casos, foi encontrado concentração lipídica muito mais elevada nos peixes de aquicultura do que nos seus homólogos selvagens. A corvina (Argyrosomus regius) é uma espécie carnívora, que habita os mares Mediterrâneo, Negro e a costa atlântica da Europa (Whitehead et al., 1986). Esta espécie se adapta facilmente ao cativeiro, apresenta elevadas taxas de crescimento e tem a capacidade de tolerar amplas variações de temperatura e salinidade. Sua carne é magra e muito apreciada devido à sua alta qualidade lipídica (Quéméner, 2002). O objetivo deste estudo foi utilizar a composição química, elementos essenciais e não essenciais, o perfil de ácidos graxos e isótopos estáveis de carbono e nitrogênio, como ferramentas de rastreabilidade para avaliar o tamanho e o grau de domesticação da corvina (Argyrosomus regius). 2. Material e Métodos 2.1. Coleta e processamento das amostras As amostras de corvina cultivada foram obtidas da estação de aquicultura do Instituto Português do Mar e da Atmosfera – IPMA, no Algarve, sul de Portugal, enquanto que exemplares selvagens foram adquiridos no mercado local, após verificação dos documentos de pesca. Em seguida, foi feita a biometria dos animais (Tabela 1). O número de amostras foi menor na corvina selvagem, devido ao pequeno número de amostras disponíveis no mercado. As amostras de músculo sem pele foram trituradas, homogeneizadas, congeladas e uma porção foi liofilizada durante 48 horas à temperatura de -40°C e a baixa pressão (cerca de 10-1 atm; Heto power dry LL 3000), e armazenada a -80°C sob condições de umidade controlada até as análises. Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 30 Tabela 1. Peso das corvinas de aquicultura e selvagens (média ± desvio padrão). Peso (kg) CAG (n=13) CAP (n=10) CSG (n=5) CSP (n=3) Média 1,498±0,200 0,600±0,040 4,460±2,420 0,597±0,020 Mínimo 1,210 0,549 2,350 0,575 Máximo 1,820 0,694 7,200 0,615 CAG :Corvina de Aquicultura Grande; CAP: Corvina de Aquicultura Pequena; CSP: Corvina Selvagem Pequena; CSG: Corvina Selvagem Grande. 2.2. Composição química aproximada Os teores de umidade, cinzas, proteína bruta e lipídeos foram determinados de acordo com a Association of Official Analytical Chemists methods (AOAC, 2005). O teor de umidade foi obtido por meio da secagem da amostra durante uma noite a 105°C (P-Selecta 207); as cinzas foram quantificadas após a combustão em mufla, durante 16 horas a 550°C (Heraeus Hanau, TYPMR170); a quantidade total de nitrogênio foi determinada pelo método de Kjeldahl (método 981,10), e os níveis de proteína foram estimados usando o fator de conversão 6,25. O conteúdo total de lipídeos foi determinado pelo método de extração de Soxhlet com éter etílico durante 7 horas (40 - 60°C; placa de aquecimento; SBS PC6L Instruments). Os resultados foram expressos em g por 100 g de peso seco. 2.3. Perfil de ácidos graxos O perfil de ácidos graxos foi determinado em duplicata para cada amostra, e baseou-se no procedimento experimental de Cohen et al. (1988). Cada amostra (300 mg de peso seco) foi dissolvida em 5 mL de cloreto de acetilo / metanol (01:19 v / v; Merck), agitado, e aquecido (80°C, 1 h). Após o resfriamento, foram adicionados 1 mL de água ultra pura (Milli-Q) e 2 mL n-heptano (Merck). As amostras foram agitadas e centrifugadas (2000 g, 5 min, Sigma 2K15) até a separação das fases. A umidade da fase superior foi removida com sulfato de sódio anidro (Panreac). Uma alíquota (2 uL) da fase superior foi injetada em cromatógrafo a gás (Varian Star 3800 Cp) equipado com um amostrador automático e com um detector de ionização de chama de 250°C. A separação foi feita com hélio como gás de arraste, com fluxo de 1 mL min-1, em uma coluna capilar DB-WAX (30 m de comprimento 0,32 mm de diâmetro interno, 0,25 µm de espessura do filme; Hewlett-Packard) programado a 180°C durante 5 min, aumentada para 220 a 4°C min-1, e mantida a 220°C durante Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 31 25 min, com o injetor a 250°C. Os ácidos graxos foram identificados por comparação dos tempos de retenção com os de padrões Sigma. Os dados quantitativos foram calculados utilizando a relação de área de pico (percentagem de ácidos graxos totais) e o software Varian. 2.4. Minerais essenciais e não essenciais A espectrômetria de fluorescência de raios X por energia dispersiva (EDXRF) foi utilizada para quantificar os elementos S, Cl, K, Ca, Fe, Zn, As, Se, Br e Sr. O espectrômetro é um sistema auto-construído, utilizando o gerador de raios-X Philips (PW 1140/00/60 3 kV). A técnica de EDXRF consiste em um tubo de raios X equipado com um excitador de molibdênio secundário. As radiações características emitidas dos elementos da amostra foram detectados por lítio derivado de silício [Si (Li)] com 30 mm2 de área ativa e janela de berílio de 8 μm. A resolução de energia foi de 135 eV em 5,9 keV. Cálculos quantitativos foram feitos pelo método dos parâmetros fundamentais (Custódio et al., 2003). O gerador de raios X foi operado a 50 kV, 20 mA e tempo de aquisição de 1000 s. Cada amostra liofilizada (1 g) foi prensada em pastilhas de 2 cm de diâmetro (n = 2), sem qualquer tratamento químico e coladas sobre filmes de Mylar em suportes de amostras e colocadas diretamente no feixe de raios X. A espectrometria de absorção atômica com chama (FAAS; Varian SpectrAA 55B Sydney, Austrália) foi utilizada para quantificar Cd e Pb em cada amostra (n = 2), de acordo com os procedimentos descritos por Jorhem (2000). Em resumo, 10 g do músculo foram incinerados a 500°C e dissolvidos em 15% v / v de ácido nítrico. As concentrações de Pb e Cd foram encontrados por meio da calibração externa linear com soluções padrão: Cd (NO3)2 e de Pb (NO3)2 (Merck, 1 g L-1 dissolvidos em 0,5 mol L-1 HNO3). As concentrações de Hg total foram determinadas por espectrometria de absorção atômica utilizando analisador automático de Hg (aparelho AMA 254, LECO). O procedimento baseia-se na decomposição da amostra liofilizada (10 mg, n = 2 para cada amostra), por meio da combustão, e técnica de pré-concentração por amalgamação através da fusão com ouro e espectrometria de absorção atômica. As concentrações foram calculadas a partir de calibração linear com solução padrão de absorbância de Hg (1 g L-1 dissolvidos em 0,5 mol L-1 HNO3; Merck). Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 32 A exatidão foi verificada por análise de material biológico certificado (Tabela 2). Tabela 2. Concentração elementar (mg kg−1 DW) e limites de detecção (mg kg−1, D.L.) de material de referência certificado (média ± desvio padrão) analisados por FAAS e EDXRF. Elemento Técnica D.L. Material de referência certificado Valor certificado Presente trabalho Hg FAAS 0,02 Dogfish muscle (DORM-2) 4,64±0,26 4,68±0,17 Cd FAAS 0,01 Lobster hepatopancreas (TORT-2) 27,00±1,00 27,00±0,00 Pb FAAS 0,02 Lobster hepatopancreas (TORT-2) 0,35±0,13 0,35±0,06 As EDXRF 0,7 Lobster hepatopancreas (TORT-2) 21,60±1,80 22,6±2,00 S EDXRF 100 Oyster tissue (SRM 1566) 7600* 8200±500 Cl EDXRF 100 Oyster tissue (SRM 1566) 10000* 10200±500 K EDXRF 50 Oyster tissue (SRM 1566) 9690±50 10000±80 Ca EDXRF 20 Oyster tissue (SRM 1566) 1500±50 1350±50 Fe EDXRF 3 Dogfish muscle (DORM-2) 142±10 141,3±1,5 Cu EDXRF 0,7 Oyster tissue (SRM 1566) 63,0±4,0 63,0±4,0 Zn EDXRF 1 Dogfish muscle (DORM-2) 25,6±2,3 23,9±0,1 Se EDXRF 1 Dogfish muscle (DORM-2) 1,4±0,09 1,2±0,1 Br EDXRF 0.8 Freeze-dried animal blood (IAEA- A-13) 22,0±3,0 22,0±2,0 Rb EDXRF 1.1 Orchard Leaves (SRM-1571) 11,4±0,7 12,0±1,0 ∗Os valores não certificados foram fornecidos por United States National Bureau of Standards. Os limites de detecção (DL) de cada um dos elementos foram determinados através de dois métodos: (1) EDXRF - com a abordagem de sinal-para-ruído, em que o equipamento compara o sinal de cada elemento com amostras em branco e estabelecido a concentração mínima à qual o elemento é detectado com segurança, e (2) FAAS - com o desvio-padrão residual (RSD) da resposta e o declive (S) da curva de calibração de cada solução padrão usada [DL = (3,3 x RSD) / S]. A concentração de todos os elementos foi expressa em miligramas por quilograma de peso em base seca (mg kg-1). 2.5. Análise isotópica A amostra liofilizada foi pulverizada usando um moinho criogênico (Spex Certipret) com nitrogênio líquido a -196°C, em seguida foram pesadas em balança Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 33 (MX5, Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland) cerca de 500 µg (15N) e 60 µg (13C) do material pulverizado e estes foram acondicionados em cápsulas de estanho cilíndricas, com 5 x 9 mm. As cápsulas foram submetidas a combustão total sob fluxo contínuo de Hélio, a 1020º C, através do analisador elementar (EA 1108 – CHN Fisons Elemental Analyzer), acoplado ao espectrômetro de massa Delta S (Finnigan Mat, Bremen, Alemanha. As razões isotópicas das amostras, analisadas em duplicata, foram comparadas aos padrões internacionais estabelecidos para o carbono – PDB (Pee Dee Belemnite, um fóssil de Belemnitella americana da formação Pee Dee, da Carolina do Sul, EUA) – e para o nitrogênio – ar atmosférico (N2). Esses valores, designados pela terminologia delta (δ), em unidade por mil (‰), foram calculados através da seguinte equação: δ amostra = [(Ramostra – Rpadrão) - 1] x 1000 2.6. Análise estatística A análise de variância ANOVA, foi utilizada para detectar diferenças significativas entre o nível de domesticação e tamanho na composição química, perfil de ácidos graxos, minerais essenciais e não essenciais, e isótopos estáveis, seguidos pelo teste Unequal N HSD (variação do teste de Tukey) para identificar essas diferenças. Sempre que necessário, os dados foram transformados para satisfazer os requisitos de distribuição normal e homocedasticidade, seguido de análise de variância não paramétrica com comparações múltiplas (Kruskall-Wallis), se os dados transformados não atenderam a esses pressupostos. A análise Fatorial exploratória com extração de componentes principais foi também empregada para reduzir os conjuntos de dados multidimensionais dos vários elementos para dimensões menores, simplificando assim a apresentação e interpretação dos dados. Todas as análises estatísticas foram testadas no nível de 0,05 de significância com o software STATISTICA 8,0 © (Statsoft, Tulsa, OK, EUA). 3. Resultados e discussão 3.1.Composição química aproximada A composição química aproximada das corvinas está apresentada na Tabela 3. Não foram observadas diferenças quanto à composição de cinzas entre o tamanho ou nível de domesticação. A corvina de aquicultura apresentou Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 34 significativamente maior teor de lipídeos e menor teor de umidade do que a corvina selvagem independentemente do tamanho. Em contraste, o teor total de proteína variou com o tamanho (maior nos exemplares grandes, embora apenas significativamente em corvinas de aquicultura), mas não com o nível de domesticação. Os resultados corroboram com outros trabalhos que compararam peixes selvagens e cultivados (Alasalvar et al, 2002; Grigorakis et al, 2002; González et al, 2006; Bell et al, 2007;. Fernandez-Jover et al, 2007; Busetto et al, 2008; Sant'Ana et al., 2010). Tabela 3. Composição química aproximada (g 100 g-1) de corvinas selvagens e de aquicultura com tamanhos diferentes. Sistema/Tamanho Umidade Lipídeos Cinzas Proteína CAG 75,17±0,65b 1,53±0,30ª 1,31±0,03ª 21,23±0,15ª CAP 76,28±0,35b 1,35±0,15ª 1,29±0,02ª 19,57±0,36b CSG 78,69±0,56a 0,51±0,14b 1,25±0,06ª 18,97±0,55bc CSP 79,79±1,25a 0,47±0,01b 1,24±0,05ª 17,94±0,80c CAG: Corvina de Aquicultura Grande; CAP: Corvina de Aquicultura Pequena; CSP: Corvina Selvagem Pequena; CSG: Corvina Selvagem Grande. aMédia ± D.P. com letras diferentes na mesma coluna são significativamente diferentes pelo teste Unequal N HSD (P ≤ 0,05). As diferenças encontradas no teor de lipídeos dos peixes de aquicultura em relação ao seu homólogo selvagem devem-se provavelmente ao alto teor de lipídeos no alimento, reduzida atividade animal em peixes de viveiro e longos períodos de fome em peixes selvagens (Haard, 1992). Tais diferenças podem ser menores quando o peixe é alimentado com ração com baixos níveis de lipídeos. (Usydus et al., 2012). Apesar do conteúdo de lipídeos no músculo dos peixes geralmente aumentar com a idade e peso, não foi detectada diferença significativa neste estudo. Isso pode refletir o fato de que a gordura dietética tem maior influência no nível de gordura muscular, do que no tamanho e idade dos peixes (Bell et al., 2007). Assim, o conteúdo lipídico da carne poderia ser usado como um fator discriminante entre corvina selvagem e de criação. 3.2 Perfil de ácidos graxos Os principais ácidos graxos saturados (SFA), monoinsaturados (MUFA) e poli- insaturados (PUFA) em todas as amostras foram, respectivamente, o ácido palmítico (16:0), ácido oléico (18:1 n-9) e DHA (22:6 n-3) (Tabela 4). O total de ácidos graxos saturados foram maiores nos peixes selvagens, particularmente nos exemplares Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 35 maiores. Resultados semelhantes também foram relatados em robalo (Alasalvar et al., 2002), perca amarela (González et al., 2006) e dourada (Grigorakis et al., 2002). O perfil de ácidos graxos da corvina revelou diferenças de acordo com o nível de domesticação e tamanho dos peixes (Tabela 4). A corvina de aquicultura apresentou estatisticamente maiores proporções de 18:1 n-9 e 18:2 n-6, 18:3 n-3, 20:1 n-9, 22:1 n-11 e MUFA que a corvina selvagem, e os níveis de 18:0, 16:2 n-4, 16:4 n-3, 20:4 n-6, 22:5 n-6, 22:6 n-3 e ácidos graxos eicosapentaenóico + docosahexaenóico (EPA + DHA) foram sempre menores nas corvinas de aquicultura. Em geral, os ácidos graxos n-3, foram maiores nos peixes selvagens (exceto 18:3n-3), o que está de acordo com trabalhos anteriores realizados com outras espécies de peixes (Alasalvar et al, 2002;. Fuentes et al., 2010). Para o grupo PUFA da família n-6, o principal ácido graxo foi o ácido araquidônico (20:4 n-6, ARA) para o peixe selvagem e o linoléico (18:2 n-6) para peixe de aquicultura. Níveis mais elevados de ARA também foram encontrados em outras espécies de peixes selvagens, em concordância com os resultados encontrados em outros trabalhos (Alasalvar et al., 2002; Grigorakis et al., 2002). Vários estudos também relataram maiores concentrações de ácido linoléico em peixes de viveiro (Grigorakis et al, 2002; Fuentes et al, 2010). Esse ácido graxo é encontrado em grande quantidade em óleos de plantas utilizados na alimentação de peixes de aquicultura (Serot et al., 1998). O 22:1 n-11 está presente em peixes cultivados mas ausente nos espécimes selvagens. Este MUFA se origina a partir de óleos de peixe da dieta produzidos a partir de peixes do norte do Atlântico. É derivado de alcoóis graxos contidos nos copépodes calanóides em que estes peixes se alimentam (Henderson & Tocher, 1987). O 22:1 n-11 não é um constituinte normal dos lipídeos corporais de peixes de água quente, mas é depositado quando os peixes são alimentados com óleos contenham este ácido graxo (Grigorakis et al., 2002). Em relação ao tamanho das corvinas, peixes menores apresentaram valores significativamente mais baixos de MUFA. Segundo Rodriguez et al. (2004) peixes jovens podem perder SFA, ácidos graxos n-6 e n-3, e acumular MUFA durante o crescimento. Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 36 Tabela 4. Concentração de ácidos graxos (%) de corvinas selvagens e de aquicultura em diferentes tamanhos. Ácidos Graxos CAG CAP CSG CSP 14:0* 2,29±0,41b 2,97±0,13a 1,74±0,22b 1,02±0,51c 15:0*** 0,49±0,02b 0,58±0,02a 1,17±0,57a 0,64±0,14ab 16:0** 19,82±0,60ab 19,05±0,30b 25,97±4,06a 21,29±2,52ab 16:1n-7+n-9** 4,81±0,35a 4,47±0,10ab 5,69±1,06a 2,41±0,29b 16:2n-4** 0,33±0,01b 0,36±0,10b 0,71±0,33a 0,72±0,15a 17:0** 0,58±0,02b 0,73±0,03ab 0,73±0,28ab 1,34±0,28a 16:3n-4** 0,32±0,03a 0,31±0,09a 0,38±0,19a 0,52±0,17a 17:1** 0,27±0,04ab 0,18±0,03bc 0,76±0,21a 0,02±0,02c 16:4n-3** 0,14±0,03b 0,15±0,01b 1,40±0,15a 1,73±0,15a 18:0* 5,72±0,13c 5,53±0,19c 8,28±0,19b 9,49±0,48a 18:1n-9* 19,80±0,50a 16,38±0,21a 8,39±1,59b 7,29±1,16b 18:1n-7* 2,57±0,07a 2,58±0,08a 2,71±0,15a 2,34±0,34a 18:2n-6* 875±0,17b 9,96±0,28a 1,30±0,28c 1,22±0,21c 18:3n-3*** 1,10±0,06a 1,16±0,05a 0,47±0,18b 0,21±0,14b 20:1n-9* 3,25±0,19b 3,51±0,09a 0,43±0,17c 0,25±0,19c 20:4n-6** 1,30±0,09b 1,33±0,09b 4,55±0,73a 3,77±0,39a 20:5n-3** 482±0,14a 4,78±0,17a 6,24±1,91a 5,27±1,11a 22:1n-11** 2,30±0,20a 2,81±0,27a 0,00±0,00b 0,00±0,00b 22:4n-6** 0,18±0,11b 0,19±0,07b 0,81±0,56b 1,36±0,46a 22:5n-6* 0,57±0,06b 0,58±0,04b 1,49±0,34a 1,72±0,53a 22:5n-3** 1,42±0,09b 1,49±0,04ab 2,58±0,89a 1,63±0,48ab 22:6n-3** 13,90±1,32c 14,54±0,74c 18,23±0,64b 29,22±2,14a SFA** 29,25±0,84b 29,70±0,41b 40,31±4,74a 34,72±2,70ab MUFA* 33,59±0,93a 31,24±1,47b 18,77±0,84c 13,55±1,46d PUFA** 34,51±1,22b 37,32±0,83ab 39,45±3,70a 49,33±3,77a ∑ n-3** 22,79±1,21c 24,08±0,82bc 29,55±2,88b 39,12±1,73a ∑ n-6** 10,46±0,16b 12,44±0,24a 8,51±1,50b 8,70±2,66b ∑ n-3/n-6** 2,18±0,13ab 1,94±0,07b 3,55±0,65a 4,76±1,36a EPA+DHA* 18,72±1,26c 19,32±0,81c 24,46±2,28b 34,49±1,98a CAG: Corvina Grande de Aquicultura; CAP: Corvina Pequena de Aquicultura; CSP: Corvina Selvagem Pequena; CSG: Corvina Selvagem Grande. SFA: Ácidos Graxos Saturados; MFA: Ácidos Graxos Monoinsaturados; PUFA: Ácidos Graxos Poli-insaturados; n-3: Ácidos Graxos Ômega 3; n-6: Ácidos Graxos Ômega 6; n-3/n-6: Proporção de Ácidos Graxos, EPA: Ácido Eicosapentaenóico, DHA: Ácido Docosahexaenóico. Diferentes letras sobrescritas em cada linha indicam diferenças significativas. * Diferenças significativas pelo teste Unequal N HSD (P ≤ 0,05). ** e *** Diferenças significativas pelo teste não paramétrico Kruskal-Wallis, P ≤ 0,01 e P ≤ 0,001, respectivamente. A variação na concentração de ácidos graxos da corvina de aquicultura e selvagem foi sobretudo devido às diferentes fontes de alimentos, porém, outros fatores também podem influenciar a sua composição de ácidos graxos, como tamanho, idade, estado reprodutivo, localização geográfica e sazonalidade (Saito et al., 1999). De acordo com Bell e Sargent (2003) as principais mudanças na composição dos peixes, especialmente nos níveis de ácidos graxos, é atribuído à qualidade e quantidade de fitoplâncton disponível no habitat, pois estes representam Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 37 a maior fonte de ácidos graxos no alimento, principalmente os da série ômega-3. Este fato mostra que o ambiente marinho proporciona uma fonte excelente de alimentos ricos em n-3. A quantidade de PUFA n-3 em lipídeos de peixes marinhos de aquicultura é geralmente inferior à dos seus homólogos selvagens porque a alimentação comercial geralmente contêm elevadas proporções de lipídeos ricos em SFA e MUFA, mas é deficiente em PUFA n-3, principalmente porque são derivados de fontes terrestres (óleo de plantas e gordura de animal terrestre). A menor proporção de PUFA n-3 em peixes de viveiro pode reduzir a qualidade nutricional dos seus componentes lipídicos (Ackman & Takeuchi, 1986). Mudanças na qualidade e quantidade dos lipídeos do peixe seriam esperadas se a fonte de alimentação terrestre fosse substituída por fontes de alimentos marinhos, isso possibilitaria o aumento dos níveis de n-3, especialmente de EPA e DHA. 3.3.Minerais essenciais e não essenciais Os elementos foram divididos em dois grupos: essenciais (Tabela 5) e não- essenciais (Tabela 6). Os elementos do primeiro grupo são essenciais para o metabolismo de peixe, enquanto elementos não essenciais não têm nenhum papel conhecido no seu sistema biológico. No entanto, a via dos elementos não essenciais é semelhante a dos essenciais, sendo também transportado e acumulado nos tecidos dos peixes (Canli & Atli, 2003). Os elementos essenciais, Cl, S e K foram os mais abundantes em todas as amostras. O sistema de produção e o tamanho tiveram influencia no teor de minerais. Foram encontradas diferenças significativas entre corvina de aquicultura e selvagem apenas para o Cl e Zn. Com relação ao tamanho dos peixes, as corvinas maiores apresentaram concentrações mais elevadas de Rb e menores níveis de Br do que as corvinas menores. O teor de minerais dos peixes selvagens pode ser influenciado por uma série de fatores, incluindo sazonalidade, espécie, tamanho, tecido, idade, sexo, maturidade sexual, fonte de alimentação e ambiente (Lal, 1995). Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 38 Tabela 5. Conteúdo de minerais essenciais (mg kg-1) de corvinas selvagens e de aquicultura em diferentes tamanhos. Minerais Sistema / Tamanho CAG CAP CSG CSP S*** 7138,31±787,61ab 6446,07±549,27b 9381,87±1569,35a 9858,15±1136,38a Cl* 2084,39±259,16c 3122,53±329,44a 2546,80±483,48b 2631,69±426,49b K* 18744,11±404,46a 18899,72±58,34a 19442,12±81,81a 19820,64±79,92a Ca* 604,43±89,65a 466,47±58,34b 508,03±81,81ab 612,31±79,92a Fe* 11,65±1,17b 25,30±6,51a 13,62±2,94b 11,34±1,68b Cu* 3,06±0,17a 2,98±0,23a 2,68±0,30b 2,92±0,31a Zn*** 21,33±0,59a 21,83±0,76a 14,53±0,47b 15,82±1,38b Se*** 1,40±0,60ab 0,94±0,12b 2,05±0,21a 2,30±0,89a Br* 13,74±0,86b 20,35±1,39a 16,14±2,38b 19,57±2,20a Rb* 4,56±0,46a 2,89±0,24c 3,46±0,41b 2,81±0,40c CAG: Corvina de Aquicultura Grande; CAP: Corvina de Aquicultura Pequena; CSP: Corvina Selvagem Pequena; CSG: Corvina Selvagem Grande. Diferentes letras sobrescritas em cada linha indicam diferenças significativas. * Diferenças significativas pelo teste Unequal N HSD (P ≤ 0,05). ** e *** Diferenças significativas pelo teste não paramétrico Kruskal-Wallis, P ≤ 0,01 e P ≤ 0,001, respectivamente. Em relação aos minerais não essenciais (Tabela 6), os elementos mais abundantes foram As e Hg. Os elementos não essenciais foram afetados apenas pelo tamanho das corvinas. As concentrações de Hg e As foram fortemente afetadas pelo tamanho nas corvinas selvagens (níveis mais elevados de Hg em peixes grandes e de As nos peixes menores), enquanto que não foram afetados pelo tamanho do peixe nas corvinas de aquicultura. As concentrações de Cd e Pb também foram afetadas pelo tamanho nas corvinas de aquicultura, sendo que foram maiores nas corvinas grandes. No entanto, de acordo com a Autoridade Europeia para a Segurança dos alimentos (EFSA, 2005) o consumo das corvinas tanto de aquicultura como as selvagens estão abaixo da ingestão semanal tolerável, não sendo assim considerado um risco para a saúde. De acordo com Canli e Atli (2003), a acumulação de metais tóxicos em tecidos de peixes é principalmente dependente da condição animal (teor de gordura, idade, tamanho) e da concentração de metais na água e nos alimentos, embora outros fatores ambientais podem também desempenhar um papel na acumulação destes como: salinidade, temperatura, pH e dureza. (Orban et al., 2006). Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 39 Tabela 6. Conteúdo de minerais não essenciais (mg kg-1) de corvinas selvagens e de aquicultura em diferentes tamanhos. Sistema/ Tamanho Contaminantes CAG CAP CSG CSP Hg*** 0,82 ± 0,02b 0,87 ± 0,02b 1,66 ± 0,02a 0,58 ± 0,22c Cd*** 0,05±0,02a 0,01±0,00b 0,02±0,01a 0,02±0,01a Pb*** 0,14±0,02a 0,07±0,01b 0,12±0,05ab 0,17±0,06a As* 10,55±1,10ab 11,38±1,27a 9,61±1,58b 13,22±2,27a CAG: Corvina de Aquicultura Grande; CAP: Corvina de Aquicultura Pequena; CSP: Corvina Selvagem Pequena; CSG: Corvina Selvagem Grande. Diferentes letras sobrescritas em cada linha indicam diferenças significativas. * Diferenças significativas pelo teste Unequal N HSD (P ≤ 0,05). ** e *** Diferenças significativas pelo teste não paramétrico Kruskal-Wallis, P ≤ 0,01 e P ≤ 0,001, respectivamente. 3.4. Análise isotópica Os resultados das análises isotópicas de corvinas selvagens e de aquicultura estão apresentados na Tabela 7. As razões de isótopos de carbono foram estatisticamente diferentes entre o nível de domesticação, mas não entre os tamanhos. A corvina de aquicultura apresentou menores valores de 13C do que as selvagens. A origem dos lipídeos da dieta em formulações de rações comerciais refletiu uma significante assinatura de óleos de plantas terrestres e apareceu em grande parte ser de origem C3 (plantas nas quais a fixação de dióxido de carbono segue o ciclo das pentoses ou ciclo de Calvin) susceptíveis de serem utilizadas em ração para a aquicultura (O'Leary, Madhavan & Paneth, 1992). Tabela 7. Razão isotópica de carbono (13C) e nitrogênio (15N) de corvinas selvagens e de aquicultura. Sistema/Tamanho δ13C (‰) Δ15N (‰) CAG -21,26±0,24b 10,29±0,10c CAP -21,23±0,17b 10,43±0,13c CSG -17,08±0,67a 19,29±0,10a CSP -18,05±0,55a 15,45±0,14b CAG: Corvina de Aquicultura Grande; CAP: Corvina de Aquicultura Pequena; CSP: Corvina Selvagem Pequena; CSG: Corvina Selvagem Grande. aMédia ± D.P. com letras diferentes na mesma coluna são significativamente diferentes pelo teste Unequal HSD (P ≤ 0,05). Diferenças entre os peixes de aquicultura e selvagem está relacionada com o tipo de alimentação. Segundo Busetto et al. (2008), os músculos de peixes de aquicultura tem valores mais negativos de 13C do que os selvagens devido a uma Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 40 dieta menos variável e mais rica em lipídeos. A dieta com alto teor de lipídeos dos peixes de aquicultura produz tecidos com teor lipídico superior, induzindo um maior fracionamento isotópico de 13C do que o encontrado em peixes selvagens, que apresentam menor acúmulo de lipídeos nos tecidos. Bell et al. (2007), afirma que a dieta de peixes marinhos são mais pesadas devido à fonte de carbono inorgânico. A diferença nos valores de 13C e 15N pode ser atribuída à fonte de alimentação, onde os habitats marinhos apresentam maior enriquecimento destes isótopos (Fry & Sherr, 1989). As razões isotópicas de nitrogênio foram estatisticamente menores em corvinas de aquicultura em comparação com as selvagens. A composição isotópica das corvinas de aquicultura é relativamente constante nos dois tamanhos, devido ao mesmo sistema de produção e composição da dieta. Por outro lado, diferenças podem ser observadas nos isótopos de nitrogênio para as amostras selvagem. A proporção de isótopos de nitrogênio depende da origem e tipo de proteínas na dieta. A corvina tem hábitos alimentares carnívoros, e sua composição pode variar de acordo com a disponibilidade de presas e a origem geográfica das áreas de pesca. Por esta razão, a variação dos valores de 15N pode ser devido a diferenças entre os alimentos naturais e as rações (Busetto et al., 2008). Valores de 15N foram significativamente diferentes entre os tamanhos apenas na corvina selvagem, onde as corvinas menores tinham níveis mais baixos. Isto pode ser atribuído ao fato de que a proteína animal utilizada na aquicultura é proveniente de organismos que estão nos níveis mais baixos da cadeia alimentar do que os alimentos consumidos pelas corvinas selvagens. A proporção de 15N também pode ter variado entre os tamanhos na corvina selvagem devido a diferentes hábitos alimentares e aspectos de migração. Os juvenis de corvinas selvagens alimentam-se de peixes demersais e pequenos crustáceos, enquanto que os adultos comem peixes pelágicos e cefalópodes (Monfort, 2010). Na análise de componentes principais dos isótopos estáveis (Figura 1) é possível diferenciar a corvina de aquicultura da selvagem. A variável responsável primeiro componente foi o 15N (0,946) e o 13C responsável pelo segundo componente (0,946). Doutoranda: Milena Penteado Chaguri Orientadora: Léa Silvia Sant’Ana 41 2,52,01,51,00,50,0-0,5-1,0 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 Primeiro Componente S e g u n d o C o m p o n e n te CAG CAP CSG CSP Figura 1. Análise de Componentes Principais dos isótopos estáveis de corvinas selvagens e de aquicultura de diferentes tamanhos. 3.5. Análise Fatorial Exploratória (AFE) A AFE foi utilizada para fornecer uma visão geral da capacidade das variáveis de composição química, perfil de ácidos graxos, minerais e isótopos estáveis para discriminar as diferenças entre o nível de domesticação e tamanho. Depois de aplicar a AFE para o conjunto de dados, dois fatores foram extraídos. A percentagem de variância explicada por cada fator foi de 48,74% e 19,97%, respectivamente. As variáveis que melhor descrevem o primeiro fator são 20:1n-11, 20:1n-9, n-6 total, proteína e 17:0, e as principais variáveis do segundo fator são 22:5n-6, 22:6n-3 (DHA), EPA+DHA total e 20:4n-6 (ARA) (Tabela 8). A representação gráfica das amostras de cor