UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE ENGENHARIA CAMPUS DE ILHA SOLTEIRA WELLINGTON NEGRI TONDATO ESTUDO SOBRE A SÍNTESE E MODELAGEM MOLECULAR DE LACTONAS BENZODIAZEPÍNICAS Ilha Solteira 2020 PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DOS MATERIAIS- PPGCM WELLINGTON NEGRI TONDATO ESTUDO SOBRE A SÍNTESE E MODELAGEM MOLECULAR DE LACTONAS BENZODIAZEPÍNICAS Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciência dos Materiais. Orientadora: Profa. Dra. Rosangela da Silva de Laurentiz Ilha Solteira 2020 DEDICATÓRIA Aos meus pais, Elenice Negri Tondato e Luiz Carlos Tondato que, com afeto me ensinaram coisas importantes, valores que carrego subconscientemente em minha interação humana, dos quais me orgulho por terem uma grande culpa nesta incrível realização. À minha irmã Ligia, pela paciência e compreensão dos insights compartilhados, mesmo em conversas unilaterais, devido à sua falta de afinidade pela minha área, porém, sempre com um semblante inerte para não me deixar desconfortável durante meu raciocínio. À minha namorada Ingrid, que tem sido minha companheira em todos os momentos, pela paciência com minhas explicações científicas que, com destreza conseguiu não se interessar por eventos físicos e químicos, denominados por ela de “mentiras quânticas”. Às minhas células, que durante uma guerra psíquica, liberaram insistentemente adrenalina em momentos onde havia mais sinapses inibitórias me mantendo parado, serotonina em momentos que o cortisol tomava conta e dopamina em cada desafio concluído, que me impulsionou a me apaixonar cada vez mais pela pesquisa produzida, conhecimento científico e experiência de vida adquirida no processo. AGRADECIMENTOS Aos meus pais, pela compreensão e suporte admirável, onde devo muito além de agradecimentos. À minha orientadora, Profª Drª Rosangela da Silva de Laurentiz que, além de acreditar na minha capacidade, me aceitando para este trabalho, me ofereceu todo o suporte disponível, com paciência e empolgação em cada explicação científica, e em demonstrações de humildade para com as pessoas, onde sou muito grato por ter compartilhado essas experiências. Ao Prof. Dr. Alexandre Borges por ter cedido seu tempo com uma excelente didática para dividir suas habilidades e conhecimentos sobre Docking Molecular. Ao Departamento de Física e Química e seus funcionários pela estrutura cedida no desenvolvimento da pesquisa. Ao GPNSO por terem me recebido de braços abertos desde o início, pelo apoio na passagem dos conhecimentos adquiridos, pela disposição e companhia laboratorial oferecida. À cafeína, que há tempos vem enganando meus receptores de adenosina, e me dando a dose diária de dopamina para me sentir capaz. Aos amigos da república Deselegância, tanto pelas conversas movidas a crises existenciais, quanto pelas conversas científicas, ou não, utilizadas para eventos de total irrelevância acadêmica, porém, de total relevância para saúde mental. À CAPES pela bolsa concedida. À FAPESP pelo apoio financeiro do processo: 2018/00544-4 “The good thing about science is that is true whether or not you believe in it”. Neil deGrasse Tyson. RESUMO As benzodiazepinas são compostos que contêm estruturas heterocíclicas bicíclicas onde o termo refere-se a uma fusão entre anel benzênico com um anel diazepínico. A classe é de extrema importância para a química medicinal, pois, são utilizadas principalmente como fármacos psicotrópicos no auxílio do tratamento da depressão, do transtorno de ansiedade, do sono, de convulsões e como relaxante muscular. Devido à importância biológica desses compostos, nas últimas décadas várias rotas sintéticas foram propostas e otimizadas para a obtenção de novos derivados. Desta forma, este trabalho teve por objetivo propor uma rota sintética mais eficiente para a obtenção de lactonas benzodizepínicas através de uma reação dominó realizada sob catálise heterogênea. A primeira etapa da síntese foi a obtenção da butenolida intermediária, não isolada, resultante da reação assistida por micro-ondas entre o ácido tetrônico e a orto-fenilenodiamina, seguida pela adição do aldeído aromático ao mesmo frasco reacional, para então fornecer a lactona benzodiazepínica. A reação dominó forneceu o composto de interesse em maior rendimento do que a reação realizada por etapas com isolamento da butenolida intermediária. O uso de vários aldeídos aromáticos forneceu treze derivados benzodiazepínicos, em rendimentos variando 71 a 94% com tempos totais de reação de 55 a 75 min. A eficiência da amberlite IR-120 usada como catalizador na mesma reação foi verificada até quatro usos sem diminuição significativa nos rendimentos. Todos os produtos obtidos tiveram estruturas confirmadas por Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C e por Espectrometria de Massas. Os compostos obtidos foram avaliados quanto às propriedades luminescentes, onde os resultados observados mostram padrões semelhantes de absorção e de emissão. Os compostos tem interessantes espectros de emissão onde é possível observar as bandas de Raman, primeira e segunda harmônicas e uma intensa banda de reemissão. As características luminescentes desses compostos podem ser estudadas para possíveis aplicações como fluoróforos. A estrutura dos derivados 5a-m e estruturas modeladas foram submetidas à estudos de docking molecular utilizando a proteína GABAA-α1β3γ2. Estes estudos demonstraram que os compostos 5b, 5c, 5l e as estruturas modeladas 8l e 5a(7-Cloro) apresentaram similaridades nas interações com a proteína em comparação com o Alprazolam que foi usado como modelo de interação. Os resultados evidenciaram características que classificam esses compostos como possíveis alvos para a realização in vivo utilizando modelos de sedação. Palavras-chave: benzodiazepinas, lactonas, reação dominó, docking molecular, fluoróforos. ABSTRACT The benzodiazepines are compounds that contain bicyclic heterocyclic structures where the term refers to a fusion between benzene aromatic ring and diazepine ring. The class is extremely important for medicinal chemistry as it is mainly used as psychotropic drugs to aid in the treatment of depression, treatment of anxiety disorder, sleep, seizures and as a muscle relaxant. Due to the biological importance of these compounds, in the last decades several synthetic routes have been proposed and optimized for obtaining new compounds. Thus, this work aimed to propose a more efficient synthetic route for to obtaining of benzodiazepine lactones using domino reaction under heterogenous catalysis. The first step of the synthesis was to obtaining the butanolide intermediate, not isolated, by the Microwaves-assisted reaction between tetronic acid and ortho-phenylenediamine followed of the aromatic aldehyde addition to the same reaction flask to provide the benzodiazepine lactones. The domino reaction provided the compound of interest in higher yield than the reaction performed in stages with isolation of butanolide intermediate. The use of various aromatic aldehydes provided thirteen benzodiazepine derivatives, in yields ranging from 71 to 94% with total reaction times of 55 to 75 min. The efficiency of the amberlite IR-120, used as catalyst in the same reaction, was verified for up to four uses without drop in yields. All products obtained had their structures confirmed by Nuclear Magnetic Resonance of 1H and 13C and by Mass Spectrometry. The compounds obtained were evaluated for their luminescent properties and showed similar patterns of absorption and emission. These compounds presented interesting emission spectra where it is possible to observe the Raman bands, first and second harmonics and an intense re-emission band. The luminescent characteristics of these compounds can be studied for possible applications as fluorophores. The structure of the 5a-m derivatives and modeled structures were subjected to molecular docking studies using the GABAA-α1β3γ2 protein. These studies demonstrated that compounds 5b, 5c, 5l and the modeled structures 8l and 5a(7-Cloro) showed similarities in interactions with the protein compared to Alprazolam which was used as an interaction model. These results showed characteristics that classify these compounds as possible targets for in vivo sedation assays. Keywords: benzodiazepines, lactones, domino reaction, docking, fluorophores. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estruturas dos núcleos 1,4 e 1,5-benzodiazepínicos..............................................19 Figura 2. Representação esquemática da relação entre a concentração e efeitos clínicos dos benzodiazepínicos.....................................................................................................................20 Figura 3. Dados do WOS publicações por ano com o termo "Benzodiazepine*”...................................................................................................................21 Figura 4. Dados do WOS publicação (%) por área de pesquisa com o termo “Benzodiazepine*”...................................................................................................................22 Figura 5. Estruturas das benzodiazepinas e nomenclaturas seguindo o sistema Hantzsch- Widman ....................................................................................................................................24 Figura 6. (A) Estrutura do neurônio (B) Transmissão do impulso nervoso através de uma sinapse química.........................................................................................................................27 Figura 7. Representação dos receptores GABA-A................................................................29 Figura 8. Representação esquemática de um estudo de docking baseado no programa GOLD.31 Figura 9. Modelo de interação de dois compostos analisados por docking molecular (A) NSC659829 e (B) NSC35839 que demonstraram semelhança com os inibidores AChE........32 Figura 10. Diagrama de Jablonski - processos dos estados excitados singleto (fluorescência) e tripleto (fosforescência)..................................... ......................................................................35 Figura 11. Comportamento das sondas fluorescentes: (a) Representação esquemática do funcionamento das sondas, (b) Sondas baseadas em funcionamento PeT e (c) Sondas baseadas em funcionamento FRET..........................................................................................................36 Figura 12. Imagem de um tumor in vivo marcado por um anticorpo ligado à SiR700: (a) representação do fluoróforo ligado ao anticorpo, (b) imagem de fluorescência do tumor implantado, o círculo branco indica o tumor antes da injeção de anticorpos e (c) imagem 24h após a injeção de anticorpos......................................................................................................37 Figura 13. Estruturas de derivados benzodiazepínicos fluorescentes....................................38 Figura 14. Estrutura da proteína GABAA-α1β3γ2 complexada com Alprazolam (A) e após preparação (B)...........................................................................................................................48 Figura 15. Espectro de RMN de 1H de 5a...............................................................................53 Figura 16. Espectro de RMN de 13C de 5a..............................................................................53 Figura 17. Espectro de RMN DEPT-135 de 5a.......................................................................54 Figura 18. Espectro de RMN de 1H de 4.................................................................................56 Figura 19. Espectro de RMN de 1H de 6a..............................................................................59 Figura 20. Espectro de RMN de 13C de 6a.............................................................................59 Figura 21. Rendimentos obtidos na reciclagem da amberlite..................................................59 Figura 22. Espectros de UV-vis dos derivados 5a, 5c, 5d, 5f, 5h, 5j e 5l..............................62 Figura 23. Espectros de UV-vis dos derivados 5b, 5e, 5g, 5i, 5k e 5m..................................67 Figura 24. Espectro de emissão das amostras 5a-m excitadas a λ = 322 nm.........................67 Figura 25. Espectro de emissão convencional de moléculas denominadas fluoróforas (ou fluorócromas), contendo a dispersão de Rayleight-Tyndall (λ = 360 nm), espalhamentos Raman (λ = 310 e 410 nm), banda de emissão (λ = 540 nm) e a segunda dispersão harmônica (λ = 720 nm)............................................................................................................................................69 Figura 26. Espectros de emissão das amostras 5a-m excitadas com λexc = 322 nm. A) amostras com emissão detectada B) amostras sem emissão detectada, apenas a banda da dispersão Raman.......................................................................................................................................70 Figura 27. Resultado para a validação da simulação. Sobreposição do Alprazolam originário da estrutura cristalográfica (referência), em vermelho, e o Alprazolam resultante do processo de docking, em cinza.................................................................................................................73 Figura 28. Resultado do processo de docking molecular do Alprazolam no receptor GABAA- α1β3γ2.......................................................................................................................................73 Figura 29. Sobreposições entre o Alprazolam da simulação (cinza) e os melhores resultados entre os compostos ligantes.......................................................................................................74 Figura 30. Conformação dos ligantes 5b, 5c, 5e, 5g, 5j e 5l com a posição dos resíduos do sítio ativo da proteína GABAA- α1β3γ2............................................................................................756 Figura 31. Estruturas idealizadas 7l e 8l, obtidas a partir de 5l................................................79 Figura 32. Conformação dos ligantes 7l e 8l com a posição dos resíduos do sítio ativo da proteína GABAA-α1β3γ2.........................................................................................................80 Figura 33. Esqueletos idealizados: 5a-m(lactâmico) e 5a-m(7-Cloro)...................................81 Figura 34. Conformação dos ligantes 5b(lactâmico), 5c(lactâmico), 5a(7Cloro) e 5c (7Cloro) com a posição dos resíduos do sítio ativo da proteína GABAA-α1β3γ2..................................82 LISTA DE ESQUEMAS Esquema 1. Rota para a obtenção do Clordiazepóxido .......................................................... 23 Esquema 2. Reações de obtenção do núcleo 1,5- benzodiazepínico. a) o-fenilenodiamina com composto dicarbonílico, b) o-fenilenodiamina com composto carbonílico α,β-insaturado e c) o- fenilenodiamina com duas moléculas de cetonas e com uma dicetona e um aldeído . ........... 39 Esquema 3. Esquema reacional desenvolvido por Muños et al. (2019) para a síntese de 1,5- benzodiazepínico ...................................................................................................................... 40 Esquema 4. Esquema reacional desenvolvido por Shaikh et al (2019), para obtenção de derivados benzodiazepínicos. ................................................................................................... 40 Esquema 5. Síntese desenvolvida por Isaeva et al., (2019) para obter 1,5-benzodiazepinas. 41 Esquema 6. Síntese de 1,5-benzodiazepinas por Zhu et al. (2014)......................................... 41 Esquema 7. Síntese de 1,4-benzodiazepin-2-ona .................................................................... 42 Esquema 8. Reação de Sasiambarrena et al., (2019). ............................................................. 42 Esquema 9. Síntese de triazolo-benzodiazepinas por Shafie et al., (2019)............................. 43 Esquema 10. Esquema geral para obtenção dos derivados benzodiazepínicos 5 ................... 43 Esquema 11. Reação multicomponente para obtenção do composto 5a ................................ 45 Esquema 12. Reação para obtenção do intermediário 4 ......................................................... 45 Esquema 13. Reação de obtenção do derivado 5a através do intermediário 4 isolado. ......... 46 Esquema 14. Reação dominó para a síntese do produto 5a .................................................... 47 Esquema 15. Síntese de 5a via reação multicomponente ....................................................... 51 Esquema 16. Mecanismo de formação do derivado benzimidazol 6a. ................................... 57 Esquema 17. Mecanismo proposto para a formação do produto 5 ......................................... 63 Esquema 18. Mecanismo proposto para a formação do produto 6 a partir do intermediário II .................................................................................................................................................. 65 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Diferentes estruturas e nomes para compostos Benzodiazepínicos e análogos comercializados como fármacos .............................................................................................. 25 Tabela 2. Resumo dos principais subtipos dos GABA-ARs e suas características .............. 30 Tabela 3. Dados de RMN de 1H e 13C do composto 5a (400 MHz, DMSO-d6). .................. 52 Tabela 4. Dados de RMN de 1H de 4 (400 MHz, DMSO-d6). .............................................. 56 Tabela 5. Dados de RMN de 1H e 13C de 6a (400 MHz, DMSO-d6). ................................... 58 Tabela 6. Resultado da otimização das reações para a obtenção de 4 em função do solvente e catalisador ................................................................................................................................ 60 Tabela 7. Reações de otimização para obtenção de 5a a partir da reação entre 4 e 3a. ......... 61 Tabela 8. Rendimentos das reações para formação dos produtos 5a-m ................................ 63 Tabela 9. Dados de UV-vis e Fluorescência dos compostos benzodiazepínicos 5 ................ 71 Tabela 10. Resultado detalhado das interações receptor-ligante das estruturas virtuais, Alprazolam, 5b, 5c, 5e, 5g, 5j e 5l. ........................................................................................ 77 Tabela 11. Resultado detalhado das interações receptor-ligante das simulações, Alprazolam e estruturas teóricas 7l e 8l. ......................................................................................................... 79 Tabela 12. Resultado detalhado das interações receptor-ligante das simulações com o Alprazolam e estruturas teóricas 5b(lactâmico), 5c(lactâmico), 5a(7Cloro) e 5c (7Cloro). 83 LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIATURAS BDZ’s Benzodiazepinas SNC Sistema Nervoso Central WOS Web of Science BET BromoDomain Extra Terminal IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry CCD Cromatografia em Camada Delgada DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO-d6 Dimetilsufóxido Deuterado EM Espectrometria de Massa GABA Ácido gama-aminobutírico GABA-ARs Receptores GABA-A J Constante de Acoplamento MO Micro-ondas PF Ponto de Fusão REM Rapid Eye Movement RMN Ressonância Magnética Nuclear s singleto dl dupleto largo dd duplo dupleto d dupleto dt duplo tripleto t tripleto m multipleto UV-Vis Ultravioleta visível Rf Fator de retenção LISTA DE ESPECTROS – APÊNDICE Figura 1. Espectro de RMN de 1H de 5a em DMSO-d6 ....................................................... 102 Figura 2. Espectro de RMN de 13C de 5a em DMSO-d6...................................................... 103 Figura 3. Espectro de RMN DEPT-135 de 5a em DMSO-d6 .............................................. 104 Figura 4. Espectro de HRMS de 5a ...................................................................................... 105 Figura 5. Espectro de RMN de 1H de 4 em DMSO-d6 ......................................................... 106 Figura 6. Espectro de RMN de 1H de 6a em DMSO-d6 ....................................................... 107 Figura 7. Espectro de RMN de 13C de 6a em DMSO-d6..................................................... 108 Figura 8. Espectro de RMN de 1H de 5b em DMSO-d6 ...................................................... 109 Figura 9. Espectro de RMN de 13C de 5b em DMSO-d6 ..................................................... 110 Figura 10. Espectro de RMN DEPT-135 de 5b em DMSO-d6 ............................................ 111 Figura 11. Espectro de HRMS de 5b .................................................................................... 112 Figura 12. Espectro de RMN de 1H de 5c em DMSO-d6 ..................................................... 113 Figura 13. Espectro de RMN de 13C de 5c em DMSO-d6 .................................................... 114 Figura 14. Espectro de RMN DEPT-135 de 5c em DMSO-d6 ............................................. 115 Figura 15. Espectro de HRMS de 5c .................................................................................... 116 Figura 16. Espectro de RMN de 1H de 5d em DMSO-d6 .................................................... 117 Figura 17. Espectro de RMN de 13C de 5d em DMSO-d6 .................................................... 118 Figura 18. Espectro de RMN DEPT-135 de 5d em DMSO-d6 ............................................ 119 Figura 19. Espectro de HRMS de 5d .................................................................................... 120 Figura 20. Espectro de RMN de 1H de 5e em DMSO-d6 ..................................................... 121 Figura 21. Espectro de RMN de 13C de 5e em DMSO-d6 .................................................... 122 Figura 22. Espectro de RMN DEPT-135 de 5e em DMSO-d6 ............................................. 123 Figura 23. Espectro de HRMS de 5e .................................................................................... 124 Figura 24, Espectro de RMN de 1H de 5f em DMSO-d6 ..................................................... 125 Figura 25. Espectro de RMN de 13C de 5f em DMSO-d6 .................................................... 126 Figura 26. Espectro de RMN DEPT-135 de 5f em DMSO-d6 ............................................. 127 Figura 27. Espectro de HRMS de 5f ..................................................................................... 128 Figura 28. Espectro de RMN de 1H de 5g em DMSO-d6 ..................................................... 129 Figura 29. Espectro de RMN de 13C de 5g em DMSO-d6 .................................................... 130 Figura 30. Espectro de RMN DEPT-135 de 5g em DMSO-d6 ............................................ 131 Figura 31. Espectro de HRMS de 5g .................................................................................... 132 Figura 32. Espectro de RMN de 1H de 5h em DMSO-d6 .................................................... 133 Figura 33. Espectro de RMN de 13C de 5h em DMSO-d6 ................................................... 134 Figura 34. Espectro de RMN DEPT-135 de 5h em DMSO-d6 ............................................ 135 Figura 35. Espectro de HRMS de 5h .................................................................................... 136 Figura 36. Espectro de RMN de 1H de 5i em DMSO-d6 ...................................................... 137 Figura 37. Espectro de RMN de 13C de 5i em DMSO-d6 .................................................... 138 Figura 38. Espectro de RMN DEPT-135 de 5i em DMSO-d6 ............................................. 139 Figura 39. Espectro de HRMS de 5i ..................................................................................... 140 Figura 40. Espectro de RMN de 1H de 5j em DMSO-d6 ..................................................... 141 Figura 41. Espectro de RMN de 13C de 5j em DMSO-d6 .................................................... 142 Figura 42. Espectro de RMN DEPT-135 de 5j em DMSO-d6 ............................................ .143 Figura 44. Espectro de RMN de 1H de 5k em DMSO-d6 .................................................... 144 Figura 45. Espectro de RMN de 13C de 5k em DMSO-d6 ................................................... 145 Figura 46. Espectro de RMN DEPT-135 de 5k em DMSO-d6 ............................................ 146 Figura 47. Espectro de HRMS de 5k .................................................................................... 147 Figura 48. Espectro de RMN de 1H de 5l em DMSO-d6 ...................................................... 148 Figura 49. Espectro de RMN de 13C de 5l em DMSO-d6 .................................................... 149 Figura 50. Espectro de RMN DEPT-135 de 5l em DMSO-d6 ............................................. 150 Figura 51. Espectro de HRMS de 5l ..................................................................................... 151 Figura 52. Espectro de RMN de 1H de 5m em DMSO-d6 ................................................... 152 Figura 53. Espectro de RMN de 13C de 5m em DMSO-d6 .................................................. 153 Figura 54. Espectro de RMN DEPT-135 de 5m em DMSO-d6 ........................................... 154 Figura 54. Espectro de HRMS de 5m ................................................................................... 155 SUMÁRIO 1. Introdução 19 1.1. Apresentação ............................................................................................................ 19 1.2. Contexto Histórico ................................................................................................... 22 1.3. Estruturas e nomenclatura dos BZD’s ..................................................................... 23 1.4. Propriedades Biológicas .......................................................................................... 26 1.4.1. Mecanismo de ação .............................................................................................. 26 1.5. Docking Molecular .................................................................................................. 30 1.6. Principais atividades biológicas .............................................................................. 33 1.7. Fluorescência ........................................................................................................... 34 1.7.1. Sondas biológicas ................................................................................................ 35 1.8. Sínteses ..................................................................................................................... 38 2. Objetivos 43 2.1. Gerais ....................................................................................................................... 43 2.2. Objetivos específicos ................................................................................................ 44 3. Metodologia 44 3.1. Reagentes e Equipamentos....................................................................................... 44 3.2. Sínteses ..................................................................................................................... 44 3.2.1. Reação Multicomponente para obtenção de 5a ....................................................... 45 3.2.2. Procedimento para a obtenção de 4 ........................................................................ 45 3.2.3. Procedimentos para a otimização da reação de obtenção de 4 .............................. 46 3.2.4. Otimização do procedimento para a obtenção dos compostos 5a através do intermediário 4 isolado ........................................................................................................ 46 3.2.5. Reação dominó para obtenção do produto 5a ......................................................... 47 3.3. Estudo de reciclabilidade do catalisador ................................................................ 48 3.4. Estudo de Docking Molecular .................................................................................. 48 3.5. Análises de UV/Vis e Fluorescência ........................................................................ 50 4. Resultados e Discussão 51 5. Conclusão 85 6. Referências 87 APÊNDICE 96 Dados de caracterização dos derivados 5a-m..........................................................................97 Espectros de HRMS e RMN dos derivados 5a-m.....................................................................102 19 1. Introdução Apresentação As Benzodiazepinas (BDZ’s) são substâncias utilizadas como drogas psicotrópicas com ação no Sistema Nervoso Central (SNC) e causam potencialização nas atividades depressoras do neurotransmissor inibitório ácido gama-aminobutírico (GABA). Essa inibição resulta em efeitos terapêuticos, principalmente na diminuição do transtorno de ansiedade (ansiolítico)1,2, transtornos do sono (hipnótico e sedativo)3 ,4 , atenuação de sintomas depressivos (antidepressivo)5 , crises epiléticas (anticonvulsivante)6, dores e espasmos musculares (relaxante muscular)7. As BDZ’s são compostos heterocíclicos que possuem um núcleo benzodiazepínico constituído de um anel benzênico fundido a um anel de 7 membros que contem 2 átomos de nitrogênio. A posição desses átomos de nitrogênio no anel de 7 membros dá origem a vários núcleos benzodiazepínicos (Figura 1). Entretanto, maior ênfase nas pesquisas sobre as propriedades biológicas dessa classe são encontradas para derivados que possuem os núcleos 1,4 e 1,5 benzodiazepínico8. Figura 1. Estruturas dos núcleos 1,4 e 1,5-benzodiazepínicos Fonte: Próprio autor O interesse nesta classe de compostos também se deve ao fato de que os efeitos terapêuticos são dose-dependente, ou seja, em baixas dosagens os benzodiazepínicos produzem efeitos 20 ansiolíticos e anticonvulsivantes, entretanto, com o aumento da concentração, causam sedação, amnésia e por fim, hipnose (sono)4 (Figura 2). Figura 2. Representação esquemática da relação entre a concentração e efeitos clínicos dos benzodiazepínicos Fonte: Adaptado de Olkkola K.T., Ahonen J. (2008) O uso das BDZ’s tem como vantagens a maior eficácia e menor toxidade, gera menos efeitos adversos em relação ao uso de outros medicamentos utilizados para mesma finalidade, como é o caso dos brometos de sódio e potássio e os barbitúricos9. A descoberta das BZD’s revolucionou o tratamento dos distúrbios psicológicos10 devido aos estudos sobre seu mecanismo de ação, a classe revolucionou até mesmo o conhecimento sobre o transtorno de ansiedade, distúrbios do sono e as convulsões11 e, por isso, tem merecido especial atenção de vários grupos de pesquisa tanto pelas atividades biológicas quanto pela descoberta de novos derivados, a partir do desenvolvimento de novas rotas sintéticas12. 21 Segundo pesquisas com a base de dados do Web of Science a primeira publicação com o termo em Inglês “Benzodiazepine*” surgiu em 1957, com o artigo de Archer, S. et al., intitulado “1-Ethyl- 4-(3-tropanyl)-tetrahydro-1H-1,4-benzodiazepine”13, a partir de então, houve um aumento gradativo até 1991, onde houve um salto para 1.311 publicações, e a partir desse ponto, até 2019 manteve-se acima de 1.000 publicações/ano, chegando em 1.510 publicações em 2019 (Figura 3). Figura 3. Dados do WOS publicações por ano com o termo "Benzodiazepine*” Fonte: Próprio autor No total são 41.716 publicações até o ano de 2019 citando as BDZ’s, essas publicações encontram-se distribuídas em várias áreas de pesquisa, sendo observado na área de Farmacologia o maior número de artigos com 29,2% do volume de estudos publicados (Figura 4). Contudo, estudos sobre o desenvolvimento de rotas sintéticas para a obtenção de BDZ’s com maior seletividade em ações biológicas e menos efeitos colaterais têm crescido nas últimas décadas. Neste contexto, a Química Orgânica e a Química Medicinal tem papeis estratégicos e juntas somam 10% de todas a pesquisa sobre essa classe de compostos13,14. 0 200 400 600 800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 1 9 5 7 1 9 6 1 1 9 6 3 1 9 6 5 1 9 6 7 1 9 6 9 1 9 7 1 1 9 7 3 1 9 7 5 1 9 7 7 1 9 7 9 1 9 8 1 1 9 8 3 1 9 8 5 1 9 8 7 1 9 8 9 1 9 9 1 1 9 9 3 1 9 9 5 1 9 9 7 1 9 9 9 2 0 0 1 2 0 0 3 2 0 0 5 2 0 0 7 2 0 0 9 2 0 1 1 2 0 1 3 2 0 1 5 2 0 1 7 2 0 1 9 P U B LI C A Ç Õ ES ANO "Benzodiazepine*" 22 Figura 4. Dados do WOS publicação (%) por área de pesquisa com o termo “Benzodiazepine*” Fonte: Próprio autor Contexto Histórico Entre os anos de 1920 a 1950, os barbitúricos, como o fenobarbital (Gardenal®), eram praticamente as únicas drogas utilizadas no tratamento de distúrbios psicológicos 15. Também era comum o uso do álcool (bebidas alcóolicas), alcaloides do ópio (papoula), beladona e outras plantas com propriedades analgésicas, narcóticas e hipnóticas10. No início da década de 1960, com a descoberta de Leo Henryk Sternbach (Hoffmann-La Roche), a indústria farmacêutica introduziu uma nova classe de psicotrópicos com propriedades biológicas para o tratamento de distúrbios psicológicos chamados então de benzodiazepínicos. Sternbach procurava compostos com propriedades tranquilizantes e sintetizou o primeiro benzodiazepínico em 1955, o Clordiazepóxido, comercializado como Librium® nos Estados Unidos16. Após alguns anos, foram feitas modificações estruturais na molécula com a obtenção do Diazepam, que foi comercializado em 1963 como Valium®17 . Farmacologia 29% Neurociência 21% Psiquiatria 17% Neurologia Clínica 10% Bioquímica Molecular 6% Medicina Geral 5% Química Medicinal 5% Química Orgânica 5% Outras 2% "BENZODIAZEPINE*" WOS (2019) ÁREAS DE PESQUISA (%) 23 Sternbach obteve os compostos que ele idealizou a partir da rota sintética descrita no esquema 1. A descoberta do Clordiazepóxido deu origem à classe dos BDZ’s que até hoje são os fármacos mais utilizado para o tratamento de transtornos de ansiedade18. Esquema 1. Rota para a obtenção da estrutura do Clordiazepóxido Fonte: Adaptado de Sternbach, L. H., (1978) Estruturas e nomenclatura dos BZD’s Nos derivados BZD’s os dois átomos de nitrogênio podem estar em diferentes posições um em relação ao outro dentro do anel de 7 membros, por isso vários tipos de estruturas são possíveis com os nitrogênios configurados nas posições: 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 2,3 e 2,4, (Figura 5). Segundo regras da IUPAC, os compostos heterocíclicos são nomeados através do sistema Hantzsch-Widman19, onde o Prefixo diz respeito ao heteroátomo. Compostos contendo o elemento nitrogênio no anel, recebem a denominação “Azo” e a multiplicidade do mesmo heteroátomo é indicado anteriormente pelo prefixo “Di” (2), “Tri” (3), etc. Quando o heteroátomo aparece mais de uma vez no anel, é escolhida a numeração para fornecer os locais em que ele se encontra. 24 Figura 5. Estruturas das benzodiazepinas e nomenclaturas seguindo o sistema Hantzsch-Widman Fonte: Próprio autor O Infixo diz respeito ao número de elementos, onde 7 átomos se referem a “-ep” e o Sufixo se refere ao anel insaturado da quantidade de átomos “-epina”. O anel diazepínico fundido ao anel benzênico, fornece o anel heterocíclico bicíclico benzodiazepínico. Quando há isômeros, o nome precisa ser especificado utilizando a indicação do hidrogênio, ou radicais que estão entre os elementos com ligações duplas (), ou seja, no elemento com apenas ligações simples (σ) do anel, indicando a numeração da localização do átomo seguido de um H maiúsculo e itálico, ex.: 3H-1,4- Benzodiazepina indicando o H no C-3, 5H-1,2-Benzodiazepina indicando o H no C-5, em casos onde o átomo com ligação simples no anel e outro grupo além do Hidrogênio, também será indicado da mesma maneira20. Além do Clordiazepóxido, Diazepam, Bromazepam, Nitrazepam, Oxazepam, Clonazepam, Lorazepam, Temazepam21, que foram os primeiros BDZ’s existem muitos outros derivados das BDZ’s, (Tabela 1), com diferentes configurações nos átomos de Nitrogênio22,23,24,25. 25 Tabela 1. Diferentes estruturas e nomes para compostos Benzodiazepínicos e análogos comercializados como fármacos Classificação Estrutura Nome genérico Nome IUPAC 1,4-Benzodiazepinas Diazepam 7-cloro-1,3-dihidro-1- metil-5-fenil-3H-1,4- benzodiazepin-2-ona Clonazepam 5-(2-clorofenil)-7-nitro- 1,3-dihidro-1,4- benzodiazepin-2-ona 1,5-Benzodiazepinas Clobazam 7-cloro-1-metil-5-fenil- 1,5-benzodiazepin-2,4- diona 2,3-Benzodiazepinas Tofisopam 1-(3,4-dimetoxifenil)-5-etil- 7,8-dimetoxi-4-metil-5H- 2,3-benzodiazepina 26 Triazolobenzodiazepinas Triazolam 8-cloro-6-(2-clorofenil)- 1-metil-4H- [1,2,4]triazolo[4,3- a][1,4]benzodiazepina Tienodiazepinas Clotiazepam 5-(2-clorofenil)-7-etil-1- metil-3H-tieno[2,3- e][1,4]diazepin-2-ona Fonte: Ashton, C. H., (2007)26, Taylor et al., (2000)27, Niwa T et al., (2005)28 Propriedades Biológicas 1.4.1. Mecanismo de ação Benzodiazepínicos são drogas psicotrópicas ou psicoativas, ou seja, elas agem principalmente nos neurônios do Sistema Nervoso Central (SNC), alteram algumas funções cerebrais como, o humor, a percepção, o comportamento e a consciência29. Os neurônios são células nervosas que se excitam eletricamente e se comunicam com as outras células por dois meios, o meio elétrico, que ocorre quando há somente cargas elétricas passando de um neurônio para outro, e o meio químico, que ocorre quando as informações são passadas a outros neurônios através de substâncias químicas (neurotransmissores), essa transferência de informação chama-se sinapse30. A estrutura do neurônio é definida resumidamente por um corpo celular (soma) onde fica o núcleo e ocorre a síntese proteica, o axônio, por onde passa a informação e o terminal do axônio, que se liga a outro neurônio vizinho31 (Figura 6A). 27 Nas sinapses químicas, a partir da vesícula sináptica que fica no terminal do axônio são liberados os neurotransmissores para a fenda sináptica, onde há o fluido extracelular que contém íons, então, os neurotransmissores vão para o citoplasma do corpo celular ou dendritos. No citoplasma os neurotransmissores se ligam aos neuroreceptores específicos e, então mudam a conformação da proteína responsável da membrana plasmática da célula pré-sináptica que abre (ou fecha) os canais de permeabilidade, onde o íon (Ca2+, K+, Cl-) que tem afinidade com esse canal entra no outro neurônio, nesse momento acontece a troca de informação, a sinapse, que será modulada no núcleo, e através do axônio, mais neurotransmissores serão transportados a outros neurônios vizinhos32 (Figura 6B). Figura 6. (A) Estrutura do neurônio (B) Transmissão do impulso nervoso através de uma sinapse química Fonte: Adaptado de Tonel, D., (2013)33 A B 28 Há dois tipos de estímulos com forças opostas nas sinapses, a excitação e a inibição34,35. As sinapses feitas pelos neurônios no SNC, utilizando os neurotransmissores como um análogo à função de códigos binários em um computador, podemos atribuir que zero (0) significa cortar energia (desligado) ao neurotransmissor GABA, inibidor do SNC, e um (1), que significa fornecer energia (ligado), atribui-se ao neurotransmissor Glutamato, excitador do SNC. Em síntese, o cérebro através de vários neurotransmissores, neuroreceptores e tipos de sinapses desenvolvem atividades motoras, sensitivas e associativas para modular as ações desse sistema, refletindo-as para o corpo como um todo através das células nervosas.36,37. As BDZ’s são agonistas e moduladores alostéricos positivos dos neuroreceptores do GABA os GABA-ARs 38. A exceção a esse mecanismo de ação é o flumazenil, a imidazobenzodiazepina que se ligam com alta afinidade a locais específicos nos receptores GABAérgicos e inibem as propriedades hipnóticas e sedativas dos demais benzodiazepínicos39. Os GABA-ARs são proteínas transmembranares ionotrópicas, ou seja, elas ficam localizadas entre a membrana neuronal e a fenda sináptica, e são responsáveis pela permeabilidade dos íons Cloreto (Cl-) entre a fenda sináptica e o citoplasma do outro neurônio. Há pelo menos 19 subunidades e 8 subtipos de GABA-ARs no cérebro dos mamíferos (α1–6, β1–3, γ1–3, δ, ε, π, θ, ρ1–3), porém, a maioria são compostos por cinco subtipos, sendo uma γ (1-3), duas β (1-3) e duas α (1-6)40 (Figura 7). A função das BDZ’s nos GABA-ARs é mudar a conformação do sitio ativo da proteína para fazer com que haja a abertura no canal iônico, isso permite o aumento da passagem de íons Cl-, que resulta na diferença de potencial elétrico negativo, a hiperpolarização da membrana neuronal que causa a potencialização dos efeitos depressores do SNC característicos das sinapses inibitórias41. 29 Figura 7. Representação dos receptores GABA-A Fonte: Adaptado de Blaus B., (2014)42 Cada composto benzodiazepínico tem afinidade a subtipos e subunidades específicas dos GABA-ARs por meio de resíduos dos aminoácidos que formam a sequência da proteína alvo (Tabela 2). Essa condição diz respeito a propriedades biológicas características, como por exemplo, a presença de um resíduo de histidina na posição 101 da sequência primária de aminoácidos do subtipo α na subunidade 1 (há a mesma sequência em α2, α3 e α5), oferece alta afinidade ao Diazepam, induzindo efeitos sedativos, entretanto, a presença de um resíduo de arginina em α4 e α6, oferece baixa afinidade. Nem todos os subtipos e as subunidades são sensíveis as BDZ’s, porém, diferentes composições resultam em propriedades biológicas distintas43. Estas observações são comumente utilizadas em estudos computacionais, como de docking molecular, para comparar as interações feitas entre a molécula e a proteína em simulações que visam prever possíveis propriedades biológicas44. 30 Tabela 2. Resumo dos principais subtipos dos GABA-ARs e suas características Subtipo e subunidade ou composição Características relatadas 1 Responsável pelos efeitos sedativos e de amnésia anterógrada relacionados ao Diazepam 2 Responsável pelos efeitos ansiolíticos do Diazepam 4 ou 6 e  Necessário para inibição tônica 122 A composição de subtipos e subunidades mais comum 122, 232, 3n2, 51/32 Sensíveis às benzodiazepinas 4n, 4n, 6n, 62,3 Insensíveis às benzodiazepinas 33 Insensível para 1,4 e 1,5-benzodiazepinas 132 Relacionado à sedação e ataxia 2/332 Relacionado às atividades ansiolíticas 532 Possivelmente relacionado à sedação Fonte: Adaptado de Sankar, R. (2012)45 Docking Molecular O docking molecular é uma importante ferramenta de virtual screening46, essencialmente para a química medicinal com foco na descoberta de novos fármacos, pois, auxilia no refinamento e na modelagem de estruturas com potenciais ações biológicas, através de simulações que preveem o comportamento que a molécula estudada (ligante) terá em complexo estabilizado com a proteína alvo47, ou seja, isso faz com que sejam escolhidas as moléculas que demonstrarem, in silico, ter maior afinidade com o receptor antes mesmo da realização de ensaios in vitro e/ou in vivo. O estudo de docking molecular, sucintamente, é feito através de programas que realizam simulações computacionais, como DOCK48, AUTODOCK49, GOLD50 e FlexX51, estes buscam soluções baseadas em algoritmos com métodos probabilísticos, que podem ser determinísticos ou estocásticos, como no programa GOLD, que é regido por um Algoritmo Genético (AG) de método 31 estocástico, no qual, aplica conceitos da teoria da evolução e seleção natural. Por funções de pontuação, como a ChemScore que leva em consideração o ΔG (energia livre de Gibbs), a área de contato hidrofóbico-hidrofóbico, ligação de hidrogênio, a flexibilidade do ligante e a interação do metal52 para estimar a pontuação de cada solução (pose) gerada pela simulação, fazem assim um ranking de melhores poses dos modelos de interação proteína-ligante obtidos53. O resumo de um estudo de docking molecular baseado no programa GOLD é mostrado na representação esquemática da Figura 8. Figura 8. Representação esquemática de um estudo de docking baseado no programa GOLD. Fonte: Próprio Autor Geralmente, no estudo de docking o ligante é selecionado para ter ação agonista ou antagonista da proteína alvo, que foi selecionada cujas propriedades biológicas são conhecidas, e o objetivo é modificar o “modus operandi” deste sistema endógeno, para obter o efeito desejado. Citando como exemplo o estudo de Shin-Hua Lu et al., (2011), que descreveram um virtual screening utilizando docking molecular que resultou na descoberta de potenciais inibidores da enzima acetilcolinesterase (AChE), a qual é responsável pela hidrólise do neurotransmissor acetilcolina, que desempenha um papel fundamental na memória e na cognição, a deficiência de acetilcolina no sistema colinérgico é a causa de doenças cognitivas como o Alzheimer. Os autores, utilizando a proteína humana 32 acetilcolinesterase do PDB ID: 1B41 realizaram o refinamento de 252 moléculas com potenciais propriedades biológicas encontradas na base de dados do NCI (National Cancer Institute). A análise dos resultados obtidos pelo programa LibDock sugeriu, interações hidrofóbicas π-π com os resíduos Trp86 ou Trp286 (Figura 9), de 9 estruturas ligantes que são as mesmas do modelo de interação dos inibidores da AChE já existentes54. Figura 9. Modelo de interação de dois compostos analisados por docking molecular (A) NSC659829 e (B) NSC35839 que demonstraram semelhança com os inibidores AChE. Fonte: Adaptado de Shin-Hua Lu et al., (2011). O docking também vai de encontro com estudos da relação estrutura-atividade dos compostos estudados, pois há a opção de modelar as estruturas previamente analisadas, e com isso, novas interações são observadas, fazendo com que a saída ou entrada de novos grupos químicos na molécula modifiquem os potenciais propriedades biológicas. 33 Principais atividades biológicas As BDZ’s são indicadas para o gerenciamento a curto prazo de vários tipos de transtornos de ansiedade como, Transtorno do Pânico (Ansiedade Paroxística Episódica 55 ), Transtorno de Ansiedade Generalizada (TAG), Transtorno de Ansiedade Social (TAS), além de serem adjuvantes dos ISRS’s para o tratamento de Transtorno obsessivo-compulsivo (TOC)56,57. A classe é frequentemente utilizada para atenuar sintomas ansiosos no gerenciamento de quadros depressivos, com a inclusão de outras terapias, entretanto, faltam dados que afirmem a ação antidepressiva específica na monoterapia. No entanto, as BDZ’s podem ser prescritas no tratamento da depressão ansiosa58. Também possuem ação hipnótica e sedativa, pois diminuem o tempo para adormecer, aumentando o tempo de sono, com a diminuição do número de despertares. Entretanto, reduzem o sono REM, por isso devem ser utilizadas por curto período de tempo ou com uso intermitente59. Sua ação músculo relaxante ocorre pela redução do tônus muscular esquelético produzindo um efeito miorrelaxante, podendo ajudar a aliviar dores de espasmos musculares ocasionados por patologias neurológicas. A ação anticonvulsivante das BDZ’s ocorre mais especificamente em convulsões por síndrome de abstinência alcoólica ou por agentes tóxicos e são indicados em altas doses e longos prazos para se obter altas concentrações no cérebro com a finalidade de prevenir convulsões crônicas60,61. Nos últimos anos, os benzodiazepínicos vêm sendo investigados pela possível ação como inibidores BET. As proteínas Domínio Bromo e Extraterminal (BET), são proteína com dois domínios (D1 e D2) e estão envolvidas na regulação e transcrição da cromatina (complexo de DNA), as BET fazem ligações de hidrogênio com as histonas H3 e H4, que são proteínas que empacotam e ordenam o DNA nos nucleossomos da cromatina. A função descoberta das moléculas denominadas inibidores BET é que elas bloqueiam a ligação com as histonas, e vários estudos demonstraram que a inibição da interação BET-histona pode resultar em profunda interrupção dos 34 programas de transcrição, resultando em atividade anticâncer e anti-inflamatória, entre outros 62. Em recente estudo 63 foi comprovado que 1,2,3-triazolobenzodiazepinas inibem as BET. Os compostos sintetizados tem valores de CI50 em nM, ou seja, extremamente ativos em bloquear a ligação BET-histona o que demonstra um possível caminho para o desenvolvimento de fármacos anticâncer com base nos 1,2,3-triazolobenzodiazepinas54. As BDZ’s devido às características estruturais podem emitir luz pelo fenômeno da fluorescência, e com isso, além de participar diretamente em processos biológicos, também pode auxiliar indiretamente, se comportando como ferramenta biológica, como marcadores fluorescentes75. Fluorescência As substâncias que emitem luz através de estados eletronicamente excitados, sofrem um fenômeno chamado de luminescência, esse efeito é especificamente dividido em duas categorias, fluorescência e fosforescência, a diferença entre ambos é a natureza do estado eletrônico excitado. O diagrama de Jablonski (Figura 10) mostra quando uma molécula absorve um fóton, os elétrons são excitados e a configuração do seu spin mantém-se no emparelhamento original ao estado fundamental, essa condição é nomeada como estado excitado singleto, onde há a emissão do fóton após a conversão interna do estado S1→So, isso caracteriza a fluorescência, em que essa ação é realizada na escala de 10 nanosegundos. Na fosforescência, o elétron é excitado pelo fóton, e após há a passagem do intersistema, mecanismo que converte a orientação do spin, resultando na condição denominada de estado excitado tripleto, posteriormente, T1→So e será emitido o fóton com um atraso de tempo maior do que o estado singleto, devido a essa conversão do spin para o estado fundamental novamente, o processo leva de milissegundos a segundos64. 35 Figura 10. Diagrama de Jablonski - processos dos estados excitados singleto (fluorescência) e tripleto (fosforescência) Fonte: Adaptado de Menéndez, G. O., et al., (2015)65. Durante o processo da fluorescência, parte da energia do fóton absorvido será dissipado através de vias não radiativas, essa perda de energia resulta na diferença entre os comprimentos de onda (λ) de absorção e de emissão, onde o fóton será emitido em maiores λ66. A fluorescência em compostos orgânicos se desenvolve em moléculas que apresentam estruturas rígidas com abundância de elétrons π em suas ligações. A fluorescência molecular é usada extensivamente em ciências médicas, químicas, físicas e biológicas como ferramentas com o poder de detectar e analisar, visualizar, investigar propriedades locais e diagnosticar. Além dessas aplicações de visualização, os compostos fluorescentes também são utilizados como sondas, indicadores, rastreadores e sensores que fornecem informações sobre parâmetros químicos e físicos locais como pressão, temperatura, viscosidade, pH, entre outras67. 1.7.1. Sondas biológicas As sondas biológicas são moléculas fluorescentes também nomeadas de fluoróforos, são utilizadas como ferramentas essenciais para estudar moléculas biológicas, a vantagem dessa técnica de microscopia fluorescente em comparação com microscopias como a eletrônica é a compatibilidade com células, tecidos e animais vivos, além de promover imagens dinâmicas minimamente invasivas68. As sondas são capazes de marcar posicionalmente células, agir na 36 coloração de organelas, avaliar morfologias celulares69, entre outras aplicações, como a ligação de fluoróforos a uma macromolécula purificada, no intuito de detectar alterações conformacionais70,71. Os fluoróforos tem aplicabilidades não apenas no espectro visível, comumente as aplicações de sondas fluorescentes em imagens com alto poder de penetração nos tecidos são feitas por compostos cuja emissão é próxima ao comprimento de onda infravermelho72. Os fluoróforos podem ser classificados como proteínas e peptídeos, pequenos compostos orgânicos, polímeros sintéticos e sistemas multicomponentes. As moléculas fluoróforas podem ser utilizadas sozinhas ou ligadas à uma outra molécula para formar um sistema funcional, como PeT (Photoinduced electron transfer) e FRET (Fluorescence resonance energy transfer) (Figura 11). Figura 11. Comportamento das sondas fluorescentes: (a) Representação esquemática do funcionamento das sondas, (b) Sondas baseadas em funcionamento PeT e (c) Sondas baseadas em funcionamento FRET. Fonte: Terai, Takuya et al., (2013). Moléculas que contêm essas propriedades óticas estão sendo utilizadas comumente como marcadores ou sondas fluorescentes como uma técnica não invasiva em tempo real para detecção de imagens de células vivas como o uso do fluoróforo à base de Rodamina substituída por Silício 37 “SiR700”. Este fluoróforo tem alta afinidade pelo anticorpo (Anti-Tenascina C), o fluoróforo consegue demarcar in vivo tumores específicos de camundongos (Figura 12). Após 24 h da injeção de anticorpo as moléculas do fluoróforo se ligam ao anticorpo se comportando como um corante fluorescente para marcar a área do tumor73,74. Figura 12. Imagem de um tumor in vivo marcado por um anticorpo ligado à SiR700: (a) representação do fluoróforo ligado ao anticorpo, (b) imagem de fluorescência do tumor implantado, o círculo branco indica o tumor antes da injeção de anticorpos e (c) imagem 24h após a injeção de anticorpos. Fonte: Terai, Takuya et al. (2013). Entretanto, para que um composto possa ser usado como sonda biológica é necessário que tenha alta afinidade pelo receptor biológico que vai marcar. Por exemplo, as BDZ’s têm alta afinidade por receptores GABA e com base nessa afinidade é possível medir a distribuição e a mobilidade lateral desses receptores em células nervosas vivas através da fluorescência74. Outro trabalho envolvendo a síntese e propriedades fluorescentes das BDZ’s foi desenvolvido por Qomi et al., (2017) 75 que sintetizaram BDZ’s com diferentes substituintes (Figura 13) e encontraram que derivados contendo grupos doadores de elétrons apresentaram maiores intensidades e maiores deslocamentos de emissão. 38 Figura 13. Estruturas de derivados benzodiazepínicos fluorescentes Fonte: Qomi, H. R., Habibi, et al., (2017) Apesar das BDZ’s não terem bandas de emissão com grande intensidade ou λ de emissão em regiões acima de 400 nm, como as descritas pelos autores75, o interesse neste tipo de molécula como sonda biológica está na sua alta afinidade com os receptores GABA e na facilidade de introdução de grupos com capacidade de aumentar a fluorescência da molécula sem alterar a afinidade por esses receptores. Sínteses A síntese de 1,5-BDZ’s geralmente ocorre pela reação entre a o-fenilenodiamina como fonte dos dois átomos de nitrogênio e diferentes fontes de carbonilas. 39 Esquema 2. Reações de obtenção do núcleo 1,5- benzodiazepínico. a) o-fenilenodiamina com composto dicarbonílico, b) o-fenilenodiamina com composto carbonílico α,β-insaturado e c) o- fenilenodiamina com duas moléculas de cetonas e com uma dicetona e um aldeído76. O uso de compostos dicarbonílicos gera benzodiazepinas com insaturações nos dois nitrogênios e substituições nos carbonos 2 e 4 como as BDZ’s análogas mostradas no Esquema 2a. Muños et al. (2019) obtiveram este tipo de estruturas ao utilizar cinzas vulcânicas (aluminosilicatos) para catalisar a reação entre o-fenilenodiamina (e derivados) e compostos dicarbonilicos derivados da 1,3-difenilpropanodiona (Esquema 3). 40 Esquema 3. Esquema reacional desenvolvido por Muños et al. (2019) para a síntese de 1,5- benzodiazepínico Os autores obtiveram os derivados benzodiazepínicos em rendimentos satisfatórios variando de 61 a 91% 77 . Esses compostos exibem sistemas altamente conjugados diferentes das benzodiazepinas descritas utilizando outros tipos de compostos carbonílicos (Esquema 2b, 2c). Derivados benzodiazepínicos com estrutura análoga aos descritos no Esquema 2b foram obtidos por Shaikh et al (2019) usando um nanocatalisador de Cobre, na ausência de solvente e aquecimento em micro-ondas. Os autores obtiveram 20 derivados com rendimentos superiores a 90% e tempo de reação variando de 8 a 12 min78 (Esquema 4). O uso do nanocatalisador de Cobre promoveu a síntese desses derivados de forma mais eficiente e em menor tempo em comparação com outras rotas já utilizadas para a obtenção desses mesmos derivados 79,80,81 . Entretanto, a obtenção do nanocatalisador de Cobre requer várias e longas etapas e não há descrição de seu reuso o que pode encarecer a metodologia. Esquema 4. Esquema reacional desenvolvido por Shaikh et al (2019), para obtenção de derivados benzodiazepínicos. 41 Benzodiazepinas análogas às descritas no Esquema 2b com o-fenilenodiaminas e cetonas, na proporção de 1:2, foram obtidas por Isavera et al. (2019) (Esquema 5) utilizando vários catalizadores. Foram obtidos seis derivados de 1,5-benzodiazepinas com rendimentos variando de 68 a 95% em tempos de até 480 min, entretanto, os nanocatalisadores utilizados são baseados em Calix[n]arenes de difícil acesso e o exemplos citados envolvem apenas cetonas simples 82. Esquema 5. Síntese desenvolvida por Isaeva et al., (2019) para obter 1,5-benzodiazepinas. Os 1,5-benzodiazepínicos análogos ao esquema 2c foram obtidos através da reação entre dimedonas (dicetonas cíclicas), o-fenilenodiamina e aldeídos aromáticos. Xiao-Tong Zhu et al. (2014), obtiveram 17 derivados 1,5-benzodiazepínicos através da reação dominó entre a o- fenilenodiamina e a dimedona em água à temperatura ambiente, com adição sequencial do aldeído aromático usando ácido acético como catalisador sob aquecimento em MO. Os compostos foram obtidos em rendimentos de 74 a 92%, com tempos reacionais de 10 a 24 min83 (Esquema 6). Esquema 6. Síntese de 1,5-benzodiazepinas por Zhu et al. (2014) Para a síntese de 1,4-benzodiazepinonas uma das reações mais clássicas utilizadas é a síntese de Kyungjin Kim (1998) que se baseia84 na reação entre o-aminobenzofenona e o brometo de bromoacetil (Esquema 7). Este composto foi obtido em 73% de rendimento e foi utilizado como 42 material de partida para a síntese de outros derivados substituídos no carbono α à carbonila através da reação de alquilação com haletos de alquila85. Esquema 7. Síntese de 1,4-benzodiazepin-2-ona Além dos métodos convencionais86,87,88, sínteses mais recentes como a de Sasiambarrena et al., (2019) utiliza como precursor o o-nitrobenzaldeído, que em reação de aminação fornece o intermediário com dois átomos de nitrogênio que, após várias etapas, fornece os compostos 1,4- benzodiazepínicos (Esquema 8) em rendimentos de 65 a 89% com tempos reacionais variando de 2 a 24 h. Esquema 8. Reação de Sasiambarrena et al., (2019)89. A síntese desenvolvida por Shafie et al., (2019) se baseia na reação entre ácidos azidobenzóicos, propargilaminas, benzaldeídos e isocianetos para a obtenção de triazolo- benzodiazepinas com substituições em três locais diferentes da molécula, gerando a possibilidade de inúmeros derivados (Esquema 9). Os autores obtiveram quinze derivados de 1,2,3-triazolo- benzodiazepinas com a configuração 1,4 no anel benzodiazepínico em rendimentos variando de 65 a 79 % após 24h de reação90. 43 Esquema 9. Síntese de triazolo-benzodiazepinas por Shafie et al., (2019). Desta forma, devido ao interesse biológico das benzodiazepinas as pesquisas sobre a síntese dessa classe de compostos são de extrema importância, pois visa a otimização de rotas sintética para a obtenção de moléculas já conhecidas e o desenvolvimento de metodologia para a obtenção de novos derivados buscando compostos que possam apresentar maior seletividade biológica. 2. Objetivos 2.1. Gerais Sintetizar derivados 1,5-Benzodiazepinicos onde o anel benzodiazepínico está condensado a um anel butirolactônico nas posições 2 e 3. A proposta se baseia na reação entre ácido tetrônico (1), o-fenilenodiamina (2) e um aldeído aromático (3). Para tal serão avaliadas metodologias envolvendo reações multicomponentes ou reações dominó. Esquema 10. Esquema geral para obtenção dos derivados benzodiazepínicos 5 44 2.2. Objetivos específicos -Otimizar as condições reacionais através da variação de solventes, catalizadores e temperatura; -Avaliar as propriedades luminescentes dos compostos sintetizados; -Avaliar por docking molecular o modo de interação dos compostos sintetizados na proteína GABAA-α1β3γ2. 3. Metodologia 3.1. Reagentes e Equipamentos 3.1.1. Reagentes Todos os reagentes e solventes foram utilizados sem purificação adicional. As análises por CCD foram realizadas em placas Merck de sílica gel 60F254, que foram visualizadas em irradiação UV-365 nm ou por revelação em solução de vanilina sulfúrica. 3.1.2. Equipamentos Todas as reações assistidas por micro-ondas foram realizadas no reator Discover Reflux (CEM corporation, 200 W) com energia de irradiação contínua de 0 a 200 W em vaso aberto. Os espectros de 1H e 13C RMN foram determinados em um espectrômetro Bruker ARX 400 em DMSO-d6. As análises de Espectrometria de Massas de alta resolução (HRMS) foram realizadas usando um espectrômetro Bruker Daltonics (micrOTOF-Q) equipado com um ionizador por eletropulverização que opera no modo de íons positivos. 3.2. Sínteses 45 3.2.1. Reação Multicomponente para obtenção de 5a Esquema 11. Reação multicomponente para obtenção do composto 5a A mistura equimolar (0,5 mmol) de ácido tetrônico (1), o-fenilenodiamina (2), e 4-benzilóxi- 3-metoxibenzaldeído (3) em 3 mL de acetonitrila foi colocada em um balão de 10 mL equipado com uma barra magnética e um condensador de refluxo. A mistura foi então irradiada em um reator de micro-ondas por 10 minutos sob modo refluxo. A reação foi monitorada por CCD (20% de acetato de etila em hexano) e após o consumo dos materiais de partida a reação foi resfriada à temperatura ambiente. O solvente foi então removido à pressão reduzida e o resíduo obtido purificado em coluna de sílica gel usando como eluente a mistura de hexano: acetato de etila na proporção 7:3. Os produtos obtidos forma submetidos à analises de RMN de 1H e 13C para a determinação de suas estruturas. 3.2.2. Procedimento para a obtenção de 4 Esquema 12. Reação para obtenção do intermediário 4 46 Uma mistura equimolar (1 mmol) de ácido tetrônico (1) e o-fenilenodiamina (2) em 2 mL de solvente foi aquecida a refluxo, sob agitação magnética, em um reator de micro-ondas. A reação foi monitorada por CCD (20% de acetato de etila em hexano) e após o consumo do ácido tetrônico (1) foi resfriada à temperatura ambiente. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo obtido purificado por lavagem com hexano:acetato de etila (8:2). O sólido resultante foi submetido a análises de RMN de 1H e 13C para determinação da estrutura. 3.2.3. Procedimentos para a otimização da reação de obtenção de 4 A reação foi otimizada pela variação do solvente (etanol e acetonitrila) e pelo uso de catalizadores em proporções variando de 0 a 30% em massa (HOAc, amberlite IR-120® e TiO2) através do mesmo procedimento descrito no item 3.2.2. 3.2.4. Otimização do procedimento para a obtenção dos compostos 5a através do intermediário 4 isolado Esquema 13. Reação de obtenção do derivado 5a através do intermediário 4 isolado. A mistura equimolar (0,26 mmol) do intermediário 4 e do aldeído aromático 3a, em 2 mL de solvente, foi aquecida a refluxo em micro-ondas. A reação foi monitorada por CCD (20% de acetato 47 de etila em hexano) e após o consumo dos materiais de partida a mistura foi resfriada à temperatura ambiente. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo obtido purificado por sucessivas lavagens com acetonitrila, etanol e hexano:acetato de etila (8:2). O composto obtido foi submetido a análises de RMN de 1H e 13C para determinação da estrutura. Nesta etapa, a reação foi avaliada com e sem solvente (etanol e acetonitrila) e com catalizador variando na proporção de 0 a 30% em massa (TiO2, HOAc e amberlite IR-120®). 3.2.5. Reação dominó para obtenção do produto 5a Esquema 14. Reação dominó para a síntese do produto 5a A mistura de ácido tetrônico (1) (0,5 mmol), o-fenilenodiamina (2) (0,5 mmol), amberlite IR- 120® (20% em massa) e 2 mL etanol foi aquecida a refluxo em MO. A reação foi monitorada por CCD (20% de acetato de etila em hexano) e após o consumo dos materiais de partida a mistura foi resfriada à temperatura ambiente e o aldeído aromático 3a (0,5 mmol) foi adicionado ao mesmo balão reacional. Essa mistura foi novamente aquecida a refluxo por MO e o curso da reação foi acompanhado por CCD. Após o término da reação o solvente foi removido à pressão reduzida e o sólido resultante foi purificado por sucessivas lavagens com acetonitrila e etanol. Esse mesmo procedimento foi utilizado para a obtenção dos derivados 5b-m variando-se o aldeído aromático 3b- 48 m. Todos os compostos obtidos foram submetidos a análise de EM e RMN de 1H e 13C para determinação das estruturas (APÊNDICE). 3.3. Estudo de reciclabilidade do catalisador A amberlite IR-120® usada na reação de obtenção do derivado 5a a partir do procedimento em reação dominó foi recuperada por filtragem. Sucessivas lavagens da resina com acetonitrila e etanol forma realizadas para garantir que nenhum contaminante da reação anterior atrapalhasse o resultado da reação seguinte. Esse processo foi repetido por mais 3 vezes e rendimento do produto e os tempos reacionais foram avaliados a fim de medir a eficiência do catalisador no reuso. 3.4. Estudo de Docking Molecular Inicialmente, foi selecionada a proteína α1β3γ2 GABAA, devido à sua relação com as propriedades sedativas e de ataxia conhecidas e demonstradas na literatura43. Foi feito o download da proteína humana cristalizada em complexo com o benzodiazepínico Alprazolam do PDB ID: 6HUO. A seguir, essa proteína foi preparada através da otimização dos meros da interface da proteína em que o Alprazolam interage (Figura 14A), pelo programa Discovery Studio Visualizer (DSV) e, posteriormente, pela extração do ligante pelo programa GOLD validado pelo cálculo de RMSD no pré-docking. O resultado foi uma proteína pura e otimizada, somente com os meros C e D (Figura 14B). 49 Figura 14. Estrutura da proteína GABAA-α1β3γ2 complexada com Alprazolam (A) e após preparação (B) Fonte: Próprio autor Os ligantes foram desenhados no programa ChemDraw Professional 16.0.1.4, e a partir dos cálculos conformacionais de menor energia baseadas no mecanismo molecular MM2 do ChemDraw3D, posteriormente tratados com cálculos de aromaticidade no DSV para rodar no GOLD. O estudo de docking molecular foi regido por uma simulação computacional onde é possível avaliar e analisar a formação de complexos proteína-ligante detalhadamente, e então, usar os resultados para virtual screening 91 , tendo como vantagem o fato de utilizar menor tempo computacional por manter a proteína rígida, isso permite que a estrutura da proteína e suas interações sejam representadas por um conjunto, isso evita o cálculo explícito de todas as interações entre todos os átomos do ligante e os átomos da proteína em cada etapa da pesquisa conformacional. O programa 50 inclui princípios físico-químicos modelos otimizados, a função de pontuação, e algoritmos de busca conformacional, o algoritmo docking83. A simulação computacional deste trabalho foi feita pelo programa GOLD 5.192,93,94, que utiliza o algoritmo genético95 para buscar soluções docking, que reproduz múltiplas cópias do modelo flexível do ligante no sítio ativo do receptor (proteína) e recombinando segmentos destas cópias aleatoriamente até que um conjunto convergente de estruturas seja gerado (pose). A seleção da pose é acompanhada pelo uso de função de pontuação, o scoring function, que incorpora os componentes: energia de ligação de hidrogênio do complexo, energia interna do ligante e energia torsional93,94,95. Os cálculos de docking no GOLD 5.1 foram realizados utilizando a função de pontuação Gold Score e os sítios receptores escolhidos utilizando a estrutura GABAA-α1β3γ2 em complexo com Alprazolam (PDB ID: 6HUO). A estrutura do complexo foi analisada e os sítios de ligação do ligante, foram calculados usando o programa Discovery Studio Visualizer. 3.5. Análises de UV/Vis e Fluorescência Os espectros de absorção na região UV-Vis foram obtidos em um intervalo de 260 a 500 nm usando o espectrofotômetro Shimadzu UV-1800 tendo como fonte de luz a lâmpada de Xenônio, 150W. As curvas de emissão de fluorescência foram obtidas a partir do espectrofluorímetro Shimadzu RF-6000 utilizando o comprimento de onda de excitação determinado pelos máximos de absorção no UV-Vis. O rendimento quântico (Φ) foi medido comparando-se as intensidades de fotoluminescência integrada e os valores de absorbância com o composto de referência 9,10- difenilantraceno (ɸ = 0,9 em ciclo-hexano) de acordo com a Eq. (1), em que onde Φ é o rendimento quântico de fluorescência, A é a absorção do comprimento de onda de excitação, F é a área sob a curva de emissão n é o índice de refração dos solventes utilizados. Std subscrito, denota o padrão. Os compostos foram avaliados na concentração de 10−6 M utilizando DMSO como solvente. 51 Equação 1: Cálculo do rendimento quântico usando 9,10-difenilantraceno 4. Resultados e Discussão Para a obtenção dos derivados de interesse, inicialmente foi realizada a reação multicomponente entre ácido tetrônico (1), o-fenilenodiamina (2) e o aldeído aromático 3a em reação assistida por MO. O monitoramento da reação foi realizado a cada 5 min por CCD e após 10 min de reação observou-se o consumo dos materiais de partida e a formação de três compostos com diferentes Rfs. Após purificação as análises de RMN confirmaram a formação do derivado benzodiazepínico 5a, da azo-butenolida 4 e do benzimidazol 6a (Esquema 15). Esquema 15. Síntese de 5a via reação multicomponente Os dados de RMN de 5a estão descritos na Tabela 4 e os espectros de RMN nas Figuras 15- 17. Os valores dos desvios químicos (δ) nos espectros de RMN estão em ppm, as constantes de acoplamento (J) estão em Hz e os padrões de divisão dos prótons são descritos como s (singleto), d (dupleto), dd (duplo dupleto), t (tripleto) e m (multipleto). A numeração dos átomos de carbono e hidrogênio das estruturas analisadas e descritas neste trabalho não obedecem às regras da IUPAC, sendo utilizadas apenas para facilitar a atribuição de sinais nos espectros de RMN de 1H e 13C. 52 Tabela 3. Dados de RMN de 1H e 13C do composto 5a (400 MHz, DMSO-d6). C C (ppm) H H (ppm) Multiplicidade J (Hz) 1 65,9 1a 1b 4,89 s - 2 158,7 - - - - 3 172,8 - - - - 4 - 4 9,80 s - 5 131,6 - - - - 6 122,9 6 6,88 dl 7,3 7 120,6 7 6,64 dl 7,3 8 122,8 8 6,68 – 6,76 m - 9 118,6 9 6,47 dl 8,2 10 136,6 - - - - 11 - 11 6,04 d 4,4 12 96,8 - - - - 13 56,9 13 5,01 d 4,4 14 137,1 - - - - 15 111,7 15 6,94 sl - 16 55,3 16 3,65 s - 17 146,4 - - - - 18 119,4 18 6,68 - 6,76 m - 19 112,6 19 6,78 d 8,2 20 148,6 21 69,7 21 4,96 s - 22 137,5 - - - - 23 127,7 23 7,28 - 7,45 m - 24 128,3 24 7,28 - 7,45 m - 25 122,8 25 7,28 - 7,45 m - 26 128,3 26 7,28 - 7,45 m - 27 127,7 27 7,28 - 7,45 m - 53 Os sinais dos H4 e H11, ambos ligados aos nitrogênios do anel benzodiazepínico, aparecem em locais bastante distintos do espectro onde H11 aparece como um dupleto em 6,05 ppm acoplando com H13 com J = 4,4 Hz, enquanto H4 aparece como um singleto em 9,8 ppm. Os sinais em 4,89 ppm e 4,96 ppm integrando para dois hidrogênios cada são atribuídos aos dois H1 e aos dois H21 benzílicos, respectivamente. Em 5,1 ppm o dupleto com J = 4,4 Hz é relativo ao H13 em acoplamento com H11. Os sinais que aparecem no intervalo de 6,47 ppm a 6,88 ppm são dos hidrogênios ligados ao anel aromático no núcleo benzodiazepínico H6, H7, H8 e H9 (Tabela 4). O multipleto em 6,68 - 6,76 ppm é relativo ao H18 acoplando com H15 e H19. H19 aparece como um dupleto em 6,78 ppm acoplando com H18 com J = 8,2 Hz. O singleto largo em 6,94 ppm é relativo a H15 que acopla com H18, este acoplamento resultaria em um dupleto, mas como o J meta é pequeno o que se vê é um singleto largo. Os demais sinais no intervalo de 7,45 - 7,28 ppm são relativos aos hidrogênios aromáticos do anel benzílico H23-H27. O sinal em 3,65 ppm é relativo aos três H16 do grupo metoxila. A associação entre os espectros de 13C (Figura 16) e o DEPT-135 (Figura 17) possibilitou a atribuição dos sinais aos respectivos carbonos da estrutura, identificando, no DEPT-135, os carbonos terciários (CH), primários (CH3) para cima e secundários (CH2) com o sinal para baixo, entretanto alguns dos sinais referentes a carbonos aromáticos podem estar trocados. A partir da combinação das duas técnicas foi possível atribuir os sinais em 172,8 ppm, 158,7 ppm, 148,6 ppm e 146,4 ppm aos carbonos C3, C2, C20 e C17 que são carbonos terciários onde a desblindagem é maior e estão ligados a átomos eletronegativos como oxigênio e nitrogênio, por isso aparecem em campo mais baixo. 54 Figura 15. Espectro de RMN de 1H de 5a. Figura 16. Espectro de RMN de 13C de 5a. Os sinais em 137,5 ppm, 137,1 ppm, 136,6 ppm e 131,6 ppm são carbonos quaternários aromáticos (Figura 17) e correspondem respectivamente ao C22, C14, C10 e C5. Os dois sinais bem intensos em 128,3 ppm e 127,7 ppm são correspondentes aos C-H aromáticos C23 a C27. Aos sinais respectivos a C6, C7, C8, C9 e C18 aparecem em 122,9 ppm, 120,6 ppm, 122,8 ppm, 118,6 ppm e 55 119,4 ppm. Em 112,6 ppm e 111,7 ppm estão os sinais, respectivamente atribuídos a C19 e C15. O sinal correspondente a C12, que não faz parte do núcleo aromático, mas é um carbono sp2, aparece em 96,8 ppm. Os sinais em 69,7 ppm e 65,9 ppm foram atribuídos ao C21 e C1, respectivamente. Esses carbonos contém dois hidrogênios cada (Figura 17), sendo C21 um CH2 benzílico ligado a um oxigênio e C1 o carbono vizinho ao átomo de oxigênio no anel lactônico e, por isso ocorrem em campo mais baixo do que os sinais atribuídos a C13 e C16 que aparecem em 56,9 ppm e 55,3 ppm, respectivamente (Figuras 16 e 17). Figura 17. Espectro de RMN DEPT-135 de 5a. O segundo composto obtido foi identificado através do espectro de 1H RMN (Figura 18) como a butenolida 4. Os dados de RMN para esse composto são apresentados na Tabela 5. 56 Tabela 4. Dados de RMN de 1H de 4 (400 MHz, DMSO-d6). H H (ppm) Multiplicidade J (Hz) H H (ppm) Multiplicidade J (Hz) 1a 4,78 s - 7 7,01 dl 7,8 1b 4,51 s 8 6,54 t 7,5 2 - - - 9 6,91 t 7,5 3 4,78 s - 10 6,72 dl 8,0 4 - - - 11 - - - 5 8,74 s - 12a 12b 5,0 sl - 6 - - Figura 18. Espectro de RMN de 1H de 4 Esse composto apresenta um singleto em 8,74 ppm integrando para um hidrogênio e um singleto largo integrando para dois hidrogênios em 5,01 ppm que foram atribuídos, respectivamente 57 aos H5 e H12. O dupleto largo em 7,01 ppm foi atribuído ao H7 que acopla com H8 com um J orto e com H9 com um J meta relativamente pequeno que acaba resultando em um dupleto largo com um J = 7,8 Hz. O tripleto largo em 6,91 ppm foi atribuído a H9 e é resultante do acoplamento orto com H8, orto com H10 e meta com H7. A H10 foi atribuído o dupleto largo em 6,72 ppm com J = 78,0 Hz é resultante do acoplamento em orto com H9 e em meta com H8. O tripleto largo em 6,54 ppm foi atribuído a H8 que acopla com H7 e H9 com J orto e com H10 com J meta, entretanto, somente é possível calcular um J com valor de 7,5 Hz. Em 5,01 ppm aparece um singleto largo integrando para dois hidrogênios que foi atribuído aos H12. Em 4,78 ppm aparece um singleto integrando para dois hidrogênios o qual foi atribuído a H1a em sobreposição ao H3 e o outro singleto em 4,51 ppm foi atribuído a H1b. O último composto foi identificado como o benzimidazol 6a formado através da reação entre o aldeído 3a e a o-fenilenodiamina (2) como descrito no esquema 16. Essa reação acontece mais rapidamente do que a reação com o ácido tetrônico devido à maior reatividade da carbonila do aldeído. Esquema 16. Mecanismo de formação do derivado benzimidazol 6a. Os dados de caracterização de 6a são apresentados na Tabela 6 e os espectros de RMN nas Figuras 19 e 20. A identificação do núcleo benzimidazol de 6a se baseou na presença dos sinais em 151,82 ppm atribuído C7 e 137,32 ppm atribuído a C1 e C6, com mesmo deslocamento. Ainda em relação ao núcleo benzimidazol aos sinais em 113,95 ppm e 119,65 ppm foram atribuídos aos C2/C5 e 58 C3/C4, respectivamente. Os outros sinais fazem parte do anel benzílico proveniente do aldeído de partida, com maior destaque para C11 e C12 em 149,80 ppm e 149,73 ppm, C14 em 70,41 ppm, C15 em 56,15 ppm e o conjunto de sinais dos C18 a C22 em 128,26 ppm a 128,96 ppm. Tabela 5. Dados de RMN de 1H e 13C de 6a (400 MHz, DMSO-d6). C C (ppm) H H (ppm) Multiplicidade J (Hz) 1 137,32 - 2 113,95 2 7,17-7,20 m 3 119,67 3 7,62-7,53 m 4 119,67 4 7,62-7,53 m 5 113,95 5 7,17-7,20 m 6 137,32 - 7 151,82 - 8 123,4 - 9 122,35 9 7,72 dd 1,9 e 8,4 10 110,52 10 7,22 d 8,4 11 149,73 - - - - 12 149,80 - 13 113,95 13 7,79 d 1,9 14a 14b 70,41 14 5,17 s 15 56,15 15 3,90 s - 16 12,78 sl 17 137,32 - m 18 128,36 18 7,32-7,52 m 19 128,92 19 7,32-7,52 m 20 128,42 20 7,32-7,52 m 21 128,92 21 7,32-7,52 m 22 128,36 22 7,32-7,52 m 59 Figura 19. Espectro de RMN de 1H de 6a Figura 20. Espectro de RMN de 13C de 6a Com a formação do benzimidazol 6a como produto majoritário em 50% e o derivado benzodiazepínico em apenas 20% a reação multicomponente foi abandonada e outra rota foi estudada com a formação de 5a ocorrendo em duas etapas através de uma reação dominó. Na primeira etapa a reação entre a o-fenilenodiamina (2) e o ácido tetrônico ocorre a formação do 60 composto 4 como produto principal e a adição sequencial do aldeído 3a produz 5a de forma majoritária. Entretanto, para avaliar a reação dominó em duas etapas foi necessário avaliar cada etapa separadamente para a escolha das melhores condições racionais. Portanto, para a otimização da etapa de obtenção do intermediário 4 foi realizada a reação entre o ácido tetrônico e a o-fenilenodiamina (2) em diferentes solventes e catalizadores sob refluxo em MO (180W) (Tabela 6). O composto 4 foi formado em todas as condições utilizadas, porém a melhor condição de síntese foi obtida utilizando etanol como solvente, sob refluxo em MO e Amberlite IR-120® como catalizador na proporção de 20% em massa em relação à massa do ácido tetrônico. Apesar dessa condição ser a melhor outras condições em que 4 foi formado em bons rendimentos também foram avaliadas para a obtenção de 5a. Tabela 6. Resultado da otimização das reações para a obtenção de 4 em função do solvente e catalisador Reação Solvente catalisador Tempo (min) Rendimento 4 (%) 1 CH3CN ------------- 60 92 2 EtOH ------------- 60 87 3 EtOH Amberlite (20%) 45 90 61 A otimização da segunda etapa da reação dominó foi feita através da avaliação da reação entre o intermediário 4 isolado e o aldeído 3a variando-se o solvente e o catalizador como descrito na Tabela 7. Tabela 7. Reações de otimização para obtenção de 5a a partir da reação entre 4 e 3a. Reação Solvente Catalisadorb Tempo (min) Rendimento 5a (%) 1 CH3CN ______ 60 50 2 CH3CN TiO2 25 75 3 EtOH HOAc (10%) 20 80 4 EtOH HOAc (20%) 15 90 5 Sem Solvente Amberlite (30%) 60 72 6 Sem Solvente Amberlite (30%) 60 82 7 EtOH Amberlite (20%) 10 93 8 EtOH Amberlite (30%) 10 94 O produto obtido dessas reações foi comparado por CCD com aquele obtido da reação multicomponente caracterizado por RMN como 5a. A condição reacional para a obtenção de 5a descrita na reação 8 da Tabela 7 foi a que forneceu maior rendimento do produto, porém com maior uso de catalizador, portanto a reação 7 foi tida como a mais eficiente. 62 A amberlite usada como catalisador na reação 7 (Tabela 7) foi recuperada a fim de se determinar se mesmo após o uso a resina mantem suas propriedades catalíticas. Após os testes foi constatado que, a resina mantem sua eficiência catalítica em 91% mesmo após três usos sob as mesmas condições de obtenção de 5a (Figura 21). Este resultado demonstra que o método utilizado para síntese de 5a usando a amberlite como catalisador além de fornecer o produto desejado em excelente rendimento, traz vantagens pela possibilidade da reutilização do catalizador, somente pela lavagem deste com etanol. Figura 21. Rendimentos obtidos na reciclagem da amberlite Desta forma, a condição reacional descrita na reação 7 foi utilizada para a síntese dos demais derivados benzodiazepínicos (5a-m). De acordo com o mecanismo proposto no esquema 17, a reação entre o ácido tetrônico (1) e a o-fenilenodiamina (2) ocorre pelo ataque do par de elétrons do nitrogênio da o-fenilenodiamina à carbonila da função cetona do ácido tetrônico, com a formação do intermediário I que após eliminação de uma molécula de água dá origem ao composto 4. A reação entre 4 e o aldeído aromático 3 ocorre pelo ataque nucleofílico do nitrogênio do grupo NH2 de 4 à carbonila de 3 com a perda de uma molécula de água e a formação do intermediário não isolado II. Este intermediário 93% 93% 92% 91% 1 2 3 4 Reciclabilidade R en d im en to ( % ) Ciclo 63 após sofrer reação de ciclização promove a formação do composto 5 96,97 , essas etapas podem ocorrer simultaneamente. Esquema 17. Mecanismo proposto para a formação do produto 5 Tabela 8. Rendimentos das reações para formação dos produtos 5a-m Reação Aldeído Grupo (R) Produto Tempo (min)a Rendimento (%)b 1 4a 4-OBn-3-OCH3 5a 10 93 2 4b 4-OH-3,5-OCH3 5b 20 87 3 4c 4-OH-3-OCH3 5c 10 86 4 4d 3,4,5-OCH3 5d 15 85 64 5 4e 3,4-CH2OCH2 5e 15 81 6 4f 4-SCH3 5f 15 89 7 4g 3-OH 5g 20 76 8 4h 3-OCH3 5h 15 94 9 4i 6-NO2-3,4-CH3 5i 5 73 10 4j 4-Cl 5j 15 71 11 4k 4-N-(CH3)2 5k 25 89 12 4l 3,4-OH 5l 30 81 13 4m 6-NO2-3,4- CH2OCH2 5m 15 85 a Tempos referentes à reação do intermediário 4 com 3a-m; b Rendimento do produto isolado obtido através da recristalização Compostos análogos a 5 foram obtidos em rendimentos de 80 a 92% por Savina et al (2007)98 a partir da reação entre 3 e 4, usando como solvente butanol ou etanol em meio ácido (HOAc) após 3 horas de reação sob refluxo. Os autores utilizaram a síntese em duas etapas, mas somente foi contabilizado o rendimento da segunda reação. Em outro estudo Wang et al (2011)99, também partindo de reação dominó e utilizando água em meio ácido (HOAc) como solvente obteve compostos de estrutura análoga a 5, porém em rendimentos menores (70 a 89%) do que os obtidos em nosso trabalho (Tabela 9). Durante a otimização para a obtenção do derivado 5a foi avaliada a condição descrita pelo autor acima citado, porem foi constatada a formação do respectivo benzimidazol 6a em 20% de rendimento sob essas condições. Em outro estudo Amari et al (2002) 100 também sintetizaram derivados com estruturas análogas aos derivados 5 utilizando o composto 4 isolado. Os autores usaram etanol como solvente e refluxo por 6 horas obtendo os análogos a 5 em rendimentos de 80 a 85%, mas este rendimento é relativo apenas a etapa em questão. 65 A formação de 6a dificulta o processo de purificação. Em nossos estudos, via reação dominó, os respectivos benzimidazois 6 foram obtidos em maior proporção nas reações com maior tempo reacional, pois nestas reações a ciclização do intermediário II (influência dos substituintes do anel aromático) demora mais e com isso a reação de formação de 6 acontece pelo ataque de uma molécula de água (utilizada durante a otimização)91 ou do álcool no carbono beta do anel lactônico com a quebra da ligação C-N e regeneração da carbonila, na sequência esse nitrogênio ataca o carbono benzílico gerando o anel imidazol (Esquema 18) Esquema 18. Mecanismo proposto para a formação o produto 6 a partir do intermediário II O uso de catalizador ácido diminuiu o tempo reacional, porem dentre os catalisadores avaliados a Amberlite IR-120® foi a melhor escolha devido ao maior rendimento do produto, baixo custo, facilidade de recuperação e possibilidade de reuso. Os rendimentos obtidos nesta rota sintética foram bastante expressivos e mostram a viabilidade da rota. Em relação à natureza do aldeído não se notou um padrão de comportamento em relação aos grupos sacadores e doadores de elétrons ligados ao anel aromático. Os menores rendimentos foram obtidos com 4-clorobenzaldeido (71%), 6-nitro-3,4-dimetoxibenzaldeido (73%) e 3-hidroxibenzaldeido (76%). Como se pode observar esses aldeídos possuem grupos doadores (OH, OCH3) e sacadores de elétrons (Cl e NO2), portanto os menores rendimentos obtidos com esses aldeídos, possivelmente devem ter relação com problemas na etapa de purificação. Todos os compostos sintetizados tiveram as respectivas estruturas confirmadas através de análises de EM e RMN de 1H e 13C (APÊNDICE). 66 Durante as análises por CCD os compostos obtidos apresentam forte emissão de luz quando submetidos a luz UV de comprimento de onda 354 nm e, por isso foram submetidos a análises de UV-vis e de Fluorescência. Em todos os derivados observa-se bandas de absorção semelhantes, independentemente da natureza do grupo substituinte; o fato de não ter influência nos espectros de absorção pode indicar que a absorção da molécula se deve principalmente ao grupo benzodiazepínico, porém não exclusivamente. Os espectros de UV-vis dos derivados 5 foram separados em dois grupos para melhor compreensão e são apresentados nas Figuras 22 e 23. Figura 22. Espectros de UV-vis dos derivados 5a, 5c, 5d, 5f, 5h, 5j e 5l. 67 Figura 23. Espectros de UV-vis dos derivados 5b, 5e, 5g, 5i, 5k e 5m Os comprimentos de onda máximos de absorção dos derivados 5 foram utilizados como comprimentos de onda de excitação nos estudos de fluorescência, apresentados na Figura 24. Analisando as regiões dos picos de emissões, foi observado o mesmo padrão para todos os derivados 5. A primeira banda de emissão, a mais intensa, ocorre no mesmo comprimento de onda da excitação (λex = 322 nm), indicando uma reemissão de grande parte dos fótons incididos. A segunda banda na região de λ = 355 a 357 nm, menos intensa, tem Δν menor que 45 nm, a terceira banda entre 409 e 461 nm e uma a quarta banda em 644 nm que é o dobro da banda de emissão. A reemissão, segundo a literatura, pode ser explicada pela dispersão dos fótons incidentes. Existem algumas formas de dispersão que podem ser caracterizadas devido ao comportamento, dentre elas, a dispersão de Rayleigh e o efeito Raman, caracterizados por processos de espalhamento de luz101. 68 Figura 24. Espectro de emissão das amostras 5a-m excitadas a λ = 322 nm A diferença entre os métodos em que a molécula absorve e emite luz dos processos que dispersam os fótons (Rayleigh e Raman) é que na dispersão, não há estado eletrônico excitado pelo átomo ou molécula dispersora, sendo considerado apenas um processo de colisões elásticas no caso da dispersão de Rayleigh. Esse tipo de dispersão consiste no espalhamento da luz incidida pelo dispersor, onde o fóton não tem ganho ou perda de energia após a colisão, mantendo constante seu comprimento de onda (λ “incidente” = λ “espalhado”). No caso da dispersão Raman as colisões são inelásticas onde, quando o comprimento de onda do fóton espalhado é menor do que o incidido (λ “incidente” > λ “espalhado”) este processo é chamado de Raman Anti-Stokes. No processo chamado de Raman Stokes, o fóton perde energia, resultando no aumento do seu comprimento de onda (λ “incidente” < λ “espalhado”) esses dois processos alteram a direção dos fótons incididos102. Nos espectros de fluorescência dos derivados 5 (Figura 24), as colisões elásticas de Rayleigh, podem ser observadas nos picos mais intensos de reemissão em λ = 322 nm, enquanto as colisões inelásticas de Raman Stokes podem ser observadas na região de λ = 355 a 357 nm. O espalhamento 69 Raman é considerado um efeito muito fraco, na escala de aproximadamente 1 em cada 10 milhões de fótons produzem a transição, ou seja, estatisticamente, quanto mais intensa for a fonte de luz (laser do fluorímetro) mais se vê do fenômeno103, por isso as baixas intensidades visualizadas nos espectros dos derivados 5. Os mecanismos descritos para o efeito Raman e a dispersão de Rayleigh resumidamente, são embasados em cálculos teóricos de um campo elétrico oscilante interagindo com átomos ou moléculas, no qual somente os elétrons de luz seguem rapidamente a frequência externa de oscilação94. Existem correlações entre as propriedades luminescentes dos derivados benzodiazepínicos 5 e de moléculas fluoróforas, pois as mesmas bandas descritas para moléculas fluoróforas são também observadas nos espectros dos derivados 5: a banda de reemissão (Rayleigh-Tyndall scattering), as bandas do fenômeno Raman (Stokes ou Anti-Stokes), a banda de emissão verdadeira (fluorescência) e a banda da segunda dispersão harmônica da excitação. Apesar dessas bandas serem descritas como bandas de emissão, somente a banda de emissão verdadeira corresponde à fluorescência da molécula104, (Figura 25). Figura 25. Espectro de emissão convencional de moléculas denominadas fluoróforas (ou fluorócromas), contendo a dispersão de Rayleight-Tyndall (λ = 360 nm), espalhamentos Raman (λ = 310 e 410 nm), banda de emissão (λ = 540 nm) e a segunda dispersão harmônica (λ = 720 nm) 70 Fonte: Juan Carlos Stockert et al. (2017). Os derivados 5 foram divididos em dois grupos de acordo com seus espectros de emissão em Grupo A: compostos com bandas de emissão verdadeira e Grupo B: compostos sem bandas de emissão (Figura 26). Figura 26. Espectros de emissão das amostras 5a-m excitadas com λexc = 322 nm. A) amostras com emissão detectada B) amostras sem emissão detectada, apenas a banda da dispersão Raman. A B 71 Os parâmetros de fluorescência dos derivados 5 que apresentam bandas de emissão verdadeira são apresentados na Tabela 9. Os derivados tem bandas de emissão possuem deslocamentos de Stokes (Δν) variando entre 87 a 139 nm. Esses compostos possuem em suas estruturas diferentes substituintes no anel benzílico que influenciam suas propriedades luminescentes. O derivado 5a contém os grupos OBn e OCH3, que são fortemente doadores de elétrons, e dentre os derivados é o que apresenta maior intensidade de fluorescência e o maior λ de emissão (Tabela 9). Entretanto, esse fator não deve ser avaliado isoladamente, pois outros derivados contendo também grupos fortemente doadores de elétrons não apresentaram fluorescência como 5b e 5c (Figura 26 B). Tabela 9. Dados de UV-vis e Fluorescência dos compostos benzodiazepínicos 5 Amostraa λabs (nm) λem (nm)b Intensidade emissão Δν (nm) ɸc 5a 322 461 648 139 0,0018 5d 322 415 462 93 0,0020 5g 322 414 547 92 0,0019 5i 314 409 471 95 0,0016 5j 320 413 497 93 0,0019 5k 322 409 557 87 0,0018 5l 324 419 481 95 0,0022 5m 316 416 438 100 0,0016 a Concentração = 10-5 M, b λ de excitação 322 nm, c 9,10-difenilantraceno usado como padrão para cálculo de ɸ do (0,9 em ciclohexano) No caso de 5a, o fator mais importante é a presença do anel aromático do grupo OBn que também tem sua parcela de contribuição na intensidade da fluorescência e no λ de emissão. No caso de 5g e 5k, que são os outros derivados com maior intensidade de fluorescência, existem grupos em posições que favorecem estruturas de ressonância que diminuem a energia do estado excitado 72 aumentando a intensidade da fluorescência. O número de substituintes também pode aumentar a dispersão dos fótons como no caso dos derivados 5d, 5i e 5m.105 Os grupos doadores e sacadores de elétrons participam de inúmeros mecanismos intermoleculares e intramoleculares como transferência fotoinduzida de próton, transferência fotoinduzida de elétron e formação de excímeros63 que alteram as propriedades fluorescentes de núcleos fluoróforos. Esses grupos também influenciam o gap de energia (ΔELUMO-HOMO) após a excitação da molécula72. Baixos rendimentos quânticos de fluorescência foram obtidos para os derivados 5 (0,0016 a 0,0022) indicando que (Tabela 9) grande parte dos fótons incididos sofrem os processos de dispersão discutidos acima resultando na baixa fluorescência observada. Para que estes derivados possam vir a ser utilizados como sondas seria necessária a introdução de grupos ligados aos átomos de nitrogênio que possam aumentar a fluorescência desses derivados, entretanto sem alterar a ligação com os receptores GABA84. Para entender como os derivados 5 se comportam na proteína alvo GABAA-α1β3γ2, as estruturas foram submetidas a simulações de docking molecular, visando as propriedades sedativas características de fármacos da classe das benzodiazepínicos. Antes do docking molecular foi realizada a validação do processo, usando como composto de referência o Alprazolam da estrutura cristalográfica, que segundo a literatura43 é responsável pela sedação e ataxia, GABAA-α1β3γ2 (PDB ID: 6HUO). O resultado emitido de RMSD foi de 1,03Å, que segundo a literatura106, está dentro dos valores que validam o processo, ou seja, abaixo de 2Å. O resultado do processo de validação do docking pode ser visualizado a partir da Figura 27. 73 Figura 27. Resultado para a validação da simulação. Sobreposição do Alprazolam originário da estrutura cristalográfica (referência), em vermelho, e o Alprazolam resultante do processo de docking, em cinza. Fonte: Próprio Autor. Após a validação do processo foi realizado docking molecular do Alprazolam na proteína para estudar seu modelo de interação (Figura 28) que será utilizado comparativamente aos resultados do docking molecular da proteína com as BDZ’s sintetizadas 5a-m. Figura 28. Resultado do processo de docking molecular do Alprazolam no receptor GABAA- α1β3γ2 Fonte: Próprio Autor 74 De acordo com a literatura as principais interações com a proteína e que definem a função do Alprazolam são principalmente interações com a His102 e a Asn60 além de interações com os resíduos de Tyr58, Phe77, Phe100, Tyr160, Val203, Ser205 e Tyr210107. A partir dos resultados do docking molecular foi possível identificar interações hidrofóbicas com os resíduos Tyr58, Phe77, Phe100, His102 e Tyr210 e a interação por ligação de hidrogênio (L.H.) não clássica com a Ser205 (Figura 28) assim como relatado na literatura107. As estruturas das BDz’s foram então submetidas a análises de comparação das poses com o Alprazolam. Sendo que, para a seleção dos melhores ligantes, foi utilizado como parâmetro, além dos cálculos de porcentagem da função de pontuação, a semelhança no modelo de interação do Alprazolam com a proteína, e principalmente com os resíduos de His102 e/ou Asn60. Os resultados são apresentados nas Figuras 29 e 30 e nas Tabelas 10 e 11. Figura 29. Sobreposições entre o Alprazolam da simulação (cinza) e os melhores resultados entre os compostos ligantes. 5b 5c 5e 5g 5j 5l Fonte: Próprio Autor 75 A análise de sobreposição, exibida na Figura 29, das estruturas ligantes com o Alprazolam indica que estes ocupam a mesma região do sítio ativo que o Alprazolam. Além disso, os compostos 5b, 5c, 5e, 5g, 5j e 5l apresentam em comum a sobreposição (marcado com um círculo) do seu anel aromático do grupo benzodiazepínico com o anel aromático substituído no grupo benzodiazepínico do Alprazolam, o que parece, segundo análise dos resultados que serão mostrados a seguir, interferir de forma positiva no modelo de interação destes compostos com a proteína. Em relação aos modelos de interação, sugere-se que, as estruturas testadas no docking, mostradas na Figura 29, partilham dos mesmos resíduos que são importantes na interação do Alprazolam com a proteína alvo (GABAA-α1β3γ2). Inicialmente, observa-se um padrão de interações hidrofóbicas, que se assemelham às descritas na literatu