RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 24/04/2019. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROTEOMA DO PLASMA SEMINAL, FLUIDO EPIDIDIMÁRIO E DOS ESPERMATOZOIDES COLHIDOS DO EJACULADO E DA CAUDA DO EPIDÍDIMO DE TOUROS DANIEL SAMITH SALGADO CÁRDENAS Botucatu - SP Abril/2017 i UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROTEOMA DO PLASMA SEMINAL, FLUIDO EPIDIDIMÁRIO E DOS ESPERMATOZOIDES COLHIDOS DO EJACULADO E DA CAUDA DO EPIDÍDIMO DE TOUROS DANIEL SAMITH SALGADO CÁRDENAS Dissertação apresentada á Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para a Defesa de Mestrado do Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Animal Orientadora: Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza Botucatu – SP Abril/2017 ii ii Nome do autor: Daniel Samith Salgado Cárdenas PROTEOMA DO PLASMA SEMINAL, FLUIDO EPIDIDIMÁRIO E DOS ESPERMATOZOIDES COLHIDOS DO EJACULADO E DA CAUDA DO EPIDÍDIMO DE TOUROS BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza Presidente e orientadora Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ - UNESP - Botucatu /SP Profa. Dra. Lucilene Delazari Dos Santos Membro Departamento Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP) - UNESP - Botucatu /SP Dra. Priscilla Nascimento Guasti Membro Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ - UNESP - Botucatu /SP Data da Defesa: 24 de Abril de 2017. iii Dedico A os meus pais, pela oportunidade da vida, pelo incentivo ao estudo, pelo amor, carinho e respeito. Minha filha que vem em caminho, que é o mais precioso que deus me deu. Minha irmã pelo apoio incondicional. À mim, por realmente acreditar que os sonhos são possiveis de cumprir e de fazer-se realidade. iv AGRADECIMENTOS Chegou o momento de escrever e relatar em poucas palavras e escrever em algumas folhas, tantos sentimientos, vivencia aprendidas e experiências de estes anos, desde que se iniciou á ilusão e o sonho de cursar meus estudos de mestrado. Tenho em minha mente tantas coisas que lembrar gratos momentos vividos e também de momentos difícieis como meu trabalho de laboratório. Foram muitas as pessoas que contribuiram para que eu consiguiera este objetivo, por isso eu quero expresar meus agradecimentos. A Deus por me permitir fazer uma realidade este sonho e pela perseverância que me deu para poder alcansar esta meta, que desde que era uma criança sonhava em fazer um Mestrado, que me tem permitido crescer pessoal e profissionalmente. A meus pais. Por seu apoio incondicional durante toda minha vida, por seus sábios conselhos, seus ensinamentos, sua formação em valores e por estar sempre ali para que este sonho não falhasse ante as dificuldades, por permitirme ter tido a experiência de vivir neste lindo país, e por ter conhecido a tantas maravilhosas pessoas ao longo de minha estadía, amigos que levo no meu coração com infinito carinho. A minha irmã. Por sua companhia, apoio e por estar me incentivando cada etapa, cada momento de felicidade ou dificuldade, por estos momentos compartilhados na distância de este sonho vivido em Brasil. Aos familiares, minha namorada Marcela Betin e amigos, que não participaram diretamente deste trabalho, mas que sempre me apoiaram incondicionalmente desde á distancia, para eu ter forças para não desistir e continuar com meus sonhos. A professora Eunice Oba pela oportunidade que me deu de fazer o mestrado, meus mais sinceros e profundos agradecimentos. v A professora Fabiana Ferreira de Souza. Agradeço pela incansável dedicação e valiosa contribuição na minha formação, por dar-me A oportunidade de iniciar meus estudos de Mestrado, por seus ensinamentos, seu constante apoio científico e confiança no desenvolvimento do meu trabalho de dissertação, é para mim um orgulho de ter como orientadora a uma excelente pessoa, mãe e grande investigadora. Ao professor Angelo Gardim de Cesar por facilitarme os animais para á colheita do material necessário para a realização do meu projeto, por que pessoas como ele fizeram a difrerença para que meu sonho de ser Mestre seja uma realidade de vida. A Dra Bertha Irina Gastelbondo Pastrana, por contribuir a que este projeto hoje seja uma realidade e por esse apoio a não desistir. Ao grupo de Pesquisa da Reprodução Animal, pelo apoio durante a realização desse trabalho. Aos incríveis colegas Viviana, Carol, Laiza, que fizeram tudo ser mais fácil e animado. vi LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS DNA Ácido desoxirribonucleico RNAm Ácido ribonucleico mensageiro RNAr Acido ribonucleico ribossomal MIF Macrophage migration inhibitory fator MiRNA Micro ácido ribonucleico PGs Prostaglandinas pH Potencial hidrogeniônico, escala logarítmica que mede o grau de acidez, neutralidade ou alcalinidade de uma determinada solução AMPc Adenosina monofosfato cíclico EROS Espécie reativa de oxigênio TP Proteínas de transição nuclear HBP Proteínas de ligação a heparina OPN Osteopontina BSP Proteína do plasma seminal bovino, Proteínas de ligação espermática aSFP Proteína ácida do fluido seminal pI Ponto isoeléctrico PLA-2 Fosfolipase A2 SPLN Plasmina seminal GAG Glicosaminoglicanos HDL Lipoproteína de alta densidade ELSPBP1 Proteína ligadora do espermatozoide epididimal GPI Glicosilfostatidilinositol BLVRA Biliverdina reductase A ADAM Disintegrina A and metaloprotease MDC Desintegrina metaloprotease rica em cisteína RA Reação acrossomal PDGS Prostaglandina D-sintetase tipo Lipocalina SPP1 Fosfoproteína secretória 1 vii SUMARIO CAPÍTULO 1 ................................................................................................................... 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ............................................................................ 1 2. REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................................... 2 2.1. Características morfológicas e fisiológicas das células espermáticas ................ 2 2.2. Síntese proteica na célula espermática .............................................................. 4 2.3. O epidídimo ....................................................................................................... 6 2.3.1. Transporte dos espermatozoides no epidídimo ............................................... 6 2.3.2. Maturação espermática no epidídimo ............................................................. 7 2.3.3. Armazenamento de espermatozoides no epidídimo ........................................ 8 2.3.4. Proteção dos espermatozoides no epidídimo .................................................. 9 2.3.5. Fluido epidídimário .........................................................................................10 2.4. Glândulas sexuais acessórias ...........................................................................10 2.5. Formação e componentes do ejaculado ...........................................................11 2.6. Proteômica espermática e dos fluidos do trato reprodutor masculino ...............11 2.6.1. Proteínas espermáticas .................................................................................12 2.6.2. Proteínas flagelares .......................................................................................14 2.6.3. Proteínas do fluido epididimário .....................................................................15 2.6.4. Proteínas do plasma seminal .........................................................................18 REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 23 HIPÓTESE .................................................................................................................. 37 OBJETIVO GERAL ..................................................................................................... 37 OBJETIVOS ESPECIFICOS ....................................................................................... 37 CAPÍTULO 2 ................................................................................................................... ARTIGO ...................................................................................................................... 36 RESUMO .................................................................................................................... 37 ABSTRACT ................................................................................................................. 38 1. Introdução ............................................................................................................... 39 2. Material e métodos .................................................................................................. 40 2.1. Reagentes ........................................................................................................40 2.2. Aspectos éticos .................................................................................................40 2.3. Animais .............................................................................................................40 2.4. Colheita dos espermatozoides do ejaculado e da cauda do epidídimo .............40 2.5. Análise seminal .................................................................................................41 viii 2.6. Preparação das amostras para análise de proteínas ........................................41 2.8. Precipitação de proteínas em acetona ..............................................................42 2.9. Digestão tríptica dos peptídeos e espectrometria de massas ...........................42 Análise estatística ....................................................................................................44 3. Resultados .............................................................................................................. 45 4. Discussão................................................................................................................ 53 Referências ................................................................................................................. 62 ix RESUMO SALGADO, D. S. PROTEOMA DO PLASMA SEMINAL, FLUIDO EPIDIDIMÁRIO E DOS ESPERMATOZOIDES COLHIDOS DO EJACULADO E DA CAUDA DO EPIDÍDIMO DE TOUROS. Botucatu – SP. 2017, p. 102. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista. As proteínas dos fluido e células do sitema reprodutor são constantes objetos de estudo, a fim de elucidar eventos fisiológicos e buscar biomarcadores das funções reprodutivas, facilitando a escolha de reprodutores. Em vista disso, este estudo objetivou caracterizar as proteínas dos espermatozoides do ejaculado e da cauda do epidídimo, do plasma seminal e do fluido epididimário de touros. Foram utilizados 10 touros adultos da raça Brangus. O sêmen foi colhido por eletroejaculação e, posteriormente os machos foram orquiectomizados para a colheita dos espermatozoides e fluido do epidídimo. As células do ejaculado e da cauda do epidídimo foram analisadas subjetivamente após a colheita, e o plasma seminal e fluido do epidídimo foram separados por centrifugação. Então, as amostras foram preparadas para a espectrometria de massas (ESI-QTof MS/MS), com um pool de cada grupo. A concentração de proteínas totais não diferiu entre os grupos. Foram encontradas 67 e 66 proteínas nos espermatozoides do ejaculado e da cauda do epidídimo, e 20 e 16 no plasma seminal e líquido epididimário, respectivamente. Além disso, 52 proteínas foram comuns entre os espermatozoides obtidos do ejaculado e epidídimo, e 9 entre o plasma seminal e fluido epididimário. Atividade catalítica foi a principal função molecular nas células espermáticas; já no plasma seminal foi de ligação e no fluido epididimário, atividade catalítica. As proteínas que se destacaram foram: 14-3-3 protein zeta/delta, A-kinase anchor protein, Calmodulin, Cytochrome c oxidase subunit 5A, mitochondrial, Disintegrin and metalloproteinase domain- containing protein 2, Fibronectin type III domain-containing protein 8, Glucose-6- phosphate isomerase, L-amino-acid oxidase, Phosphoglycerate mutase 2, Ropporin-1, Seminal ribonuclease, T-complex protein 1 subunit epsilon, Clusterin, Epididymal secretory protein E1, Serum albumin. Com base nos resultados, conclui-se que há uma importante contribuição das proteínas do plasma seminal para a célula espermática, fornecendo macromoléculas essenciais para a capacitação espermática, reação do acrossomo, ligação espermatozoide-oócito e fertilização; já o fluido epididimário apresenta como principal função manter a integridade e imobilidade dos espermatozoides. Palavras-chaves: Célula-espermática; Capacitação; Epidídimo; Proteômica; Reação- acrossomo x ABSTRACT SALGADO, D. S. PROTEOMICS OF SEMINAL PLASMA, EPIDIDYMAL FLUID, SPERMATOZOA COLLECTED OF EJACULATED AND CAUDA OF EPIDIDYMIS. Botucatu – SP. 2017, p. 102. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista. Proteins of fluid and cells from reproductive system are constant objects of study, in order to elucidate physiological events and to search biomarkers of the reproductive functions, facilitating the breeding selection. Thus, this study aimed to characterize the proteins of the ejaculate and epididymis spermatozoa, the seminal plasma and the epididymal fluid of bulls. Ten adult Brangus bulls were used. The semen was collected by electroejaculation and then, the males were orchiectomized for collection of spermatozoa and fluid from the epididymis. The ejaculate and epididymis cells were subjectively analyzed after collection, and the seminal plasma and epididymis fluid were separated by centrifugation. The samples were prepared for mass spectrometry (ESI-QTOF MS/MS), with a pool of each group. Total protein concentration did not differ between groups. We found 67 and 66 proteins in the ejaculate and epididymis spermatozoa, and 20 and 16 in the seminal plasma and epididymal fluid, respectively. Moreover, 52 proteins were common in the spermatozoa obtained from ejaculate and epididymis, and 9 in the seminal plasma and epididymal fluid. Catalytic activity was the main molecular function in sperm cells and epididymal fluid; in the seminal plasma was binding. The main proteins found were: 14-3-3 protein zeta/delta, A-kinase anchor protein, Calmodulin, Cytochrome c oxidase subunit 5A, mitochondrial, Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 2, Fibronectin type III domain-containing protein 8, Glucose-6-phosphate isomerase, L-amino-acid oxidase, Phosphoglycerate mutase 2, Ropporin-1, Seminal ribonuclease, T-complex protein 1 subunit epsilon, Clusterin, Epididymal secretory protein E1, Serum albumin. Based on the results, we concluded that there is an important contribution of seminal plasma proteins to the sperm cell, providing macromolecules essential for sperm capacitation, acrosome reaction, spermatozoa-oocyte binding and fertilization; whereas the epididymal fluid has main function maintained the integrity and nonmotile sperm cells. Keywords: Acrosome-reaction; Capacitation; Epididymus; Proteomic; Sperm-cell; xi CAPÍTULO 1 1 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA Em vista da necessidade de identificar touros de alta fertilidade, seja para utilização em centrais de comercialização do sêmen, assim como para aplicação em propriedades rurais, ferramentas moleculares têm sido estudadas. Estas ferramentas visam substituir o teste de progênie, um método utilizado para avaliar a capacidade reprodutiva de um macho, o qual é oneroso e demanda tempo para ser conduzido (LARSSON, 2000). Além disso, defeitos subcelulares nas células espermáticas, como as alterações nos componentes da sua superfície, só podem ser estudados utilizando métodos de avaliação molecular (LARSSON, 2000; SARSAIFI et al., 2015). Tanto a célula espermática como o oócito possuem proteínas indispensáveis para a fertilização (ALBERTS et al., 2002). Assim, as transformações ou modificações sofridas na célula espermática, para a fertilização, incluem várias fases, tais como maturação pós-testicular no epidídimo, capacitação, reação do acrossomo e ligação entre os gametas. Em cada uma dessas fases estão envolvidas proteínas específicas, que exercerão funções na célula espermática durante a fecundação (YANAGIMACHI, 1993). A adição de proteínas às membranas durante a passagem dos espermatozoides pelo epididimo e na ejaculação influencia sua capacidade fertilizante (ROBAIRE et al., 2006; MOURA et al., 2007; MOURA et al., 2010). Desta maneira, a análise das proteínas associadas ao espermatozoide durante a espermatogênese ou seu trânsito pelo trato reprodutor masculino, pode ser considerada uma ferramenta multiparamétrica, que além de apresentar uma visão global, também pode identificar marcadores proteicos específicos (BISSONETTE et al., 2009). Em vista disso, os espermatozoides ejaculados diferem dos espermatozoides do epidídimo em muitos fatores, incluindo os tipos de proteínas que estão ligadas à membrana plasmática e as suas características (GOOVAERTS et al., 2006). Apesar disto, as proteínas espermáticas ligadas no epidídimo e sua associação com a fertilidade têm sido pouco estudadas. Estabelecer a composição das proteínas espermáticas e entender sua relação com a fertilidade, pode ser um ponto de partida para alcançar resultados mais favoráveis nos sistemas de produção bovina (BELLIN et al., 1994), já que a subfertilidade tem que ser avaliada tendo como base transcritos e proteínas 2 codificadas e adicionadas aos espermatozoides, embora a maioria destas informações sejam consideradas resultado da formação da célula durante a espermatogênese, mas que pode refletir o potencial de fertilidade do ejaculado (BISSONETTE et al., 2009). Desta maneira, o objetivo deste estudo foi descrever as proteínas do plasma seminal, fluido epididimário e das células espermáticas colhidas do ejaculado e da cauda do epidídimo de touros, a fim de identificar a relação das células com os fluidos do trato reprodutor durante sua armazenagem e na ejaculação. 23 REFERÊNCIAS* ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P. Molecular Biology of the Cell. 4. ed. New York: Garland Science, 2002. AMANN, R.; KAVANAUGH, J.; GRIEL L.; VOGLMAYR, J. Sperm production of Holstein bulls determined from testicular spermatid reserves, after cannulation of rete testis or vas deferens, and by daily ejaculation. J Dairy Sci. v. 57, n. 1, p. 93- 9. 1974. AMANN, R.P., HAMMERSTEDT, R.H., SHABANOWITZ, R.B. Exposure of human, boar, or bull sperm to a synthetic peptide increases binding to an egg-membrane substrate. J Androl. v. 20, n. 1, p. 34-41, 1999. ASLAM, M. M.; KUMARESAN, A.; SHARMA, V. K.; TAJMUL, M.; CHHILLAR, S.; CHAKRAVARTY, A. 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