RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 24/11/2024. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Campus de Rio Claro unesp PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR, MOLECULAR E MICROBIOLOGIA) TESE DE DOUTORADO LACASES MARINHAS: EXPRESSÃO HETERÓLOGA, ESTRUTURA E APLICAÇÃO IGOR VINICIUS RAMOS OTERO Rio Claro/SP Novembro de 2022 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Campus de Rio Claro unesp PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR, MOLECULAR E MICROBIOLOGIA) TESE DE DOUTORADO LACASES MARINHAS: EXPRESSÃO HETERÓLOGA, ESTRUTURA E APLICAÇÃO IGOR VINICIUS RAMOS OTERO Tese apresentada ao Instituto de Biociências de Rio Claro - UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Biologia Celular, Molecular e Microbiologia). Orientadora: Profa. Dra. Lara Durães Sette Co-orientador: Prof. Dr. Henrique Ferreira Rio Claro/SP Novembro de 2022 O87l Otero, Igor Vinicius Ramos Lacases marinhas: expressão heteróloga, estrutura e aplicação / Igor Vinicius Ramos Otero. -- Rio Claro, 2022 124 p. : il., tabs., fotos Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências, Rio Claro Orientadora: Lara Durães Sette Coorientador: Henrique Ferreira 1. Biotecnologia microbiana. 2. Enzimas microbianas. 3. Biodegradação. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências, Rio Claro. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. CERTIFICADO DE APROVAÇÃO TÍTULO DA TESE: LACASES MARINHAS: EXPRESSÃO HETERÓLOGA, ESTRUTURA E APLICAÇÕES AUTOR: IGOR VINICIUS RAMOS OTERO ORIENTADORA: LARA DURÃES SETTE Aprovado como parte das exigências para obtenção do Título de Doutor em Ciências Biológicas (Biologia Celular, Molecular e Microbiologia), área: Estrutura, Função e Produção de Biomoléculas pela Comissão Examinadora: Profa. Dra. LARA DURÃES SETTE (Participação Virtual) Departamento de Biologia Geral e Aplicada / IB Rio Claro Prof. Dr. FERNANDO ARARIPE GONÇALVES TORRES (Participação Virtual) Departamento de Biologia Celular / Universidade de Brasília Profa. Dra. ELIS MARINA TURINI CLARO (Participação Virtual) Unoeste / Universidade do Oeste Paulista Prof. Dr. RENATO NALLIN MONTAGNOLLI (Participação Virtual) Departamento de Ciências da Natureza, Matemática e Educação / UFSCar Rio Claro, 24 de novembro de 2022 Instituto de Biociências - Câmpus de Rio Claro - Avenida 24 A, 1515, 13506900 https://ib.rc.unesp.br/#!/pos-graduacao/secao-tecnica-de-pos/programas/biologia-celular-e-molecular/CNPJ: 48.031.918/0018-72. Título alterado para: "LACASES MARINHAS: EXPRESSÃO HETERÓLOGA, ESTRUTURA E APLICAÇÃO" UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” Campus de Rio Claro i PREFÁCIO Faço aqui uma breve introdução a dedicatória do presente trabalho, não por ser obrigado a fazê-la, mas pelo simples desejo de querer eternizá-la. A dedicatória deste trabalho será direcionada a mulher que mesmo não tendo tido o reconhecimento profissional que merecia, ao me ouvir dizer que gostaria de me tornar um professor, assim como ela, ao invés de me desmotivar, preferiu sugerir que eu seguisse uma carreira de docência que, segundo ela, teria melhores condições de trabalho e desenvolvimento. Encantado com essa nova possibilidade, aceitei a sugestão dela. Então ela, com uma didática impecável, explicou para mim, então uma criança de 12 anos, quais seriam as etapas que eu precisaria percorrer para me tornar um professor universitário. Explicou que depois de me graduar na universidade, eu teria que fazer Mestrado e depois o Doutorado, cursos que ajudariam a me formar e me dariam os títulos necessários para que eu pudesse realizar meu sonho. É verdade que 20 anos depois eu consiga compreender melhor a carreira do magistério superior, e, agora, duvide um pouco sobre esse ser o melhor caminho para a minha vida; mas de qualquer forma, eu me orgulho muito do que eu trilhei até agora. Caminho que eu só enxerguei graças a ela e que eu percorri sempre com o apoio dela. Dessa forma, não poderia ser diferente a dedicatória desta Tese de Doutorado. DEDICATÓRIA À mulher que foi minha primeira inspiração profissional; Minha primeira professora; Meu apoio incondicional; Meu maior guia; Minha mãe. Elizabete Nunes Ramos Com amor, dedico. ii AGRADECIMENTOS A professora Lara Durães Sette, minha orientadora, pela orientação deste trabalho de Doutorado, pelas oportunidades concedidas, pelo acolhimento no LAMAI desde o mestrado, passando pelo treinamento técnico e chegando até o presente momento. Pela amizade nesses oito anos de trabalho, pelo clima leve, pelas palavras de conforto quando necessárias, e, claro, pelas danças, sempre divertidas, durantes as confraternizações dos congressos e simpósios Brasil a fora. Ao professor Henrique Ferreira, meu coorientador, pelas aulas quase que particulares em biologia molecular, pelo acompanhamento do meu projeto, pelo acolhimento no LGB e pela disponibilização de todo espaço e equipamentos de seu laboratório para a realização dos meus experimentos. Ao professor Volker Sieber, meu supervisor na Alemanha, pelo aceite e acolhimento no CBR durante os 14 meses que passei lá. Pela disponibilização irrestrita de toda estrutura disponível em seus laboratórios, pelo acompanhamento contínuo e orientação do meu projeto, e pela preocupação com meu bem-estar durante a minha estadia no país estrangeiro durante a pandemia de COVID- 19. A Magdalena Halsbeck, por ter atuado como uma verdadeira tutora durante a minha estadia no CBR e ter me ensinado todos os protocolos do Pichia Toolkit, sempre com muita paciência e atenção. Obrigado pela amizade, por me ensinar que comida vegana pode ser deliciosa e por fazer eu me sentir bem-vindo naquele país distante. A Anja Schmidt e o Christoffer Schilling pelo auxílio com os experimentos de fermentação em biorreatores. Ao Vivian Willers pelo auxílio com a purificação da Lac1. Ao Samuel Sutiono, Samed Güner e Alexander Fuchs pelo auxílio com os experimentos de cinética e caracterização da Lac1, pela amizade, e pelas melhores cervejas que eu já experimentei na vida! A Lara Santello, Elisa Pelizzer, Adriano Uemura e Patricia Giovanella pelo auxílio com os experimentos de GC-MS e FTIR, pela amizade e parceria de sempre. A Livia Brenelli pelos dados de genoma do Peniophora sp. CBMAI 1063 e a Milene Ferro pelo auxílio com as análises de bioinformática. Às demais técnicas da Bioquímica, Fátima Neves e Carmen Casonato, pelo suporte técnico e auxílio durante todo o doutorado. A Angela Scatolin e ao Felipe Marchi pelo auxílio técnico envolvendo as burocracias do Departamento e do Programa de Pós-Graduação. Bem como a Elisabeth Aichner, secretária do CBR, que me ajudou não só com as questões da TUM, como também da imigração. iii Às minhas alunas Mariana Pupo, Vanessa Lourenço e aos meus alunos Eduardo Paes e Daniel Dovigo pelo auxílio com os experimentos, pela amizade e convivência, e por me formarem continuamente como orientador. Aos grupos de pesquisa LAMAI, LGB, CBR e LabQuim, incluindo todos os seus integrantes atuais e todos aqueles que já seguiram por outros caminhos, mas que de uma forma ou de outra contribuíram para a realização deste trabalho. Obrigado também pela convivência, pelas conversas e pela amizade, trabalhar ao lado de vocês foi uma honra e uma satisfação enorme. A todos os amigos e amigas da Bioquímica e da Unesp, bem como os de Rio Claro, Campo Grande/MS e Straubing-DE. Não irei citar nomes sob o risco de esquecer algum, mas saibam que tenho cada um de vocês no meu coração e que vocês foram fundamentais para a realização deste trabalho, sempre me motivando e me animando a continuar. Amo vocês. À senhora Ellen Limmer, que me recebeu em sua casa durante os 14 meses que passei em Straubing. Obrigado pela acolhida, pelos almoços, pelas tardes de chá e pelos passeios no centro antigo da cidade. À minha família, que é a base de tudo e sempre será o meu porto seguro. Obrigado por tudo! Amo vocês. Ao Lucas Miotelo, que acompanha este trabalho desde a escrita do projeto, que passou comigo todas as frustações e todos os momentos difíceis, sempre me motivando, oferecendo apoio e me incentivando a seguir em frente. Por ter suportado a barra do distanciamento por 14 meses durante o meu estágio no exterior, mas também por ter celebrado comigo cada resultado e cada conquista. Obrigado por tudo, amo você. Às agencias de fomento que financiaram o meu projeto de pesquisa e o meu trabalho. Processo nº 2018/12098-9, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Processo n° 170714/2017-9. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. A todos aqueles e aquelas que direta ou indiretamente contribuíram para a minha formação e realização deste trabalho, e, que por ventura eu tenha esquecido de mencionar aqui, meu muitíssimo obrigado. iv RESUMO Lacases de origem marinha podem oxidar diferentes compostos fenólicos e aminícos, além de apresentar boa termoestabilidade e tolerância a sais. A expressão heteróloga de lacases pode ser uma estratégia vantajosa para obter essas enzimas em larga escala, facilitando os processos de purificação, minimizando custos e otimizando o tempo de produção. Diferentes variáveis moleculares e metabólicas podem interferir na expressão heteróloga de lacases. Portanto, é necessário utilizar sistemas de expressão que possibilitem a análise dessas variáveis em menos tempo e com mais eficiência. No presente estudo, a lacase codificada pelo gene Pnh_Lac1 (Lac1) do fungo marinho Peniophora sp. CBMAI 1063 foi selecionada para expressão em Pichia pastoris utilizando o sistema Pichia Toolkit. Promotores constitutivos (n=5) e indutivos (n=3) foram avaliados em associação com diferentes peptídeos sinal (n=21) quanto à sua eficiência na produção da Lac1. A influência da his-tag na produção da Lac1 também foi avaliada. Após a seleção da variante com melhor construção molecular, diferentes condições de cultivo foram testadas, visando selecionar as melhores condições para expressão da enzima heteróloga. Posteriormente, a Lac1 foi purificada e caracterizada. Os promotores pGAP e pAOX1 apresentaram o melhor desempenho nas bibliotecas constitutivas e indutivas, respectivamente. A associação com o sinal peptídico a- amilase-aMFD foi mais eficiente para ambos os promotores. A expressão constitutiva da Lac1 teve uma produção 1,37 vezes maior que a expressão induzida por pAOX1. A variante 117 foi selecionada para otimização das condições de cultivo. Temperatura (18 ˚C) e pH (6) foram as variáveis que mais influenciaram a expressão heteróloga de Lac1. A lacase heteróloga apresentou tamanho aproximado de 72 kDa com alta afinidade para siringaldazina e ABTS, atividade ótima a 60 ˚C e pH 3 com boa termoestabilidade (T501h = 56 ˚C). Lac1 foi inibida por seus inibidores convencionais, mas apresentou grande tolerância a íons metálicos. Apesar de sua origem marinha, Lac1 não apresentou alta tolerância ao NaCl. Sob baixa concentração enzimática, condições não ótimas e na presença de mediadores, a Lac1 foi capaz de descolorir corantes sintéticos de diferentes classes, com excelente desempenho na descoloração do corante índigo carmim (93% após 2h de incubação). Experimentos em Erlenmeyer com o corante preto reativo 5 demonstraram a habilidade da enzima em descolorir 62% do corante após 36h de incubação, na presença do mediador siringaldeído. Análises de metabólitos em GC-MS revelaram a habilidade do LMS na degradação do corante tóxico em moléculas menores e menos recalcitrantes. Contudo, análises de toxicidade revelaram que a degradação do corante preto reativo 5 pela Lac1 na presença de siringaldeído, pode resultar em compostos com toxicidade ainda elevada. Até o momento, este é o primeiro caso da utilização de um Toolkit para a expressão heteróloga de uma lacase em P. pastoris. Os resultados obtidos neste estudo contribuem para o desenvolvimento da biotecnologia marinha mostrando o potencial da Lac1 para aplicação biotecnológica em processos de descoloração/degradação de corantes sintéticos em diferentes temperaturas, bem como na presença de íons metálicos e solventes. Palavras-chave: Biotecnologia microbiana, enzimas microbianas, biodegradação. v ABSTRACT Marine-derived laccases can oxidize different phenolic and amine compounds, in addition to showing good thermostability and salt tolerance. The heterologous expression of laccases can be an advantageous strategy to obtain these enzymes on a large scale, increasing the time of purification processes, minimizing the cost, and optimizing downstream processing. Different molecular and metabolic variables can interfere with the heterologous expression of laccases. Therefore, it is necessary to use expression systems that allow the analysis of these variables in less time and more efficiently. In the present study, the laccase encoded by the Pnh_Lac1 (Lac1) gene from the marine fungus Peniophora sp. CBMAI 1063 was selected for expression in Pichia pastoris using the Pichia Toolkit system. Constitutive (n=5) and inducible (n=3) promoters were evaluated in association with different signal peptides (n=21) for their efficiency in producing Lac1. The influence of his-tag on Lac1 production was also evaluated. After the selection of the variant with the best molecular construction, different culture conditions were tested, aiming to select the best conditions for the expression of the heterologous enzyme. Subsequently, Lac1 was purified and characterized. The pGAP and pAOX1 promoters showed the best performance in constitutive and inducible libraries, respectively. The association with the α-amylase-aMFD signal peptide was more efficient for both promoters. The constitutive expression of Lac1 had a production 1.37 times greater than the expression induced by pAOX1. Variant 117 was selected to optimize the culture conditions. Temperature (18 ˚C) and pH (6) were the variables that most influenced the heterologous expression of Lac1. The heterologous laccase had an approximate size of 72 kDa with high affinity for syringaldazine and ABTS, optimal activity at 60 ˚C and pH 3 with good thermostability (T501h = 56 ˚C). Lac1 was inhibited by its conventional inhibitors but showed great tolerance to metal ions. Despite its marine origin, Lac1 did not show high tolerance to NaCl. Under low enzyme concentration, non-optimal conditions, and in the presence of mediators, Lac1 was able to decolorize synthetic dyes of different classes, with excellent performance in decolorizing the indigo carmine dye (93% after 2h of incubation). Experiments in Erlenmeyer flasks with the reactive black 5 dye demonstrated the enzyme's ability to decolorize 62% of the dye after 36h of incubation, in the presence of syringaldehyde. Analysis of metabolites using GC- MS revealed the ability of the LMS to degrade the toxic dye into smaller and less recalcitrant molecules. However, toxicity analyses revealed that the degradation of the reactive black 5 by Lac1 in the presence of syringaldehyde, can result in compounds with still high toxicity. To date, this is the first time that a Toolkit is been used for the heterologous expression of laccase in P. pastoris. The results obtained in this study contribute to the development of marine biotechnology showing the potential of Lac1 for biotechnological application in the decolorization/degradation processes of synthetic dyes at different temperatures, as well as in the presence of metal ions and solvents. Keywords: Microbial biotechnology, microbial enzymes, biodegradation. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO GERAL ......................................................................................................... 1 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................................ 3 2.1. Estrutura das lacases fúngicas .................................................................................................. 3 2.2 Capacidade catalítica das lacases ............................................................................................... 5 2.3 Mediadores sintéticos e naturais de lacases presentes em reações do tipo 2 ................... 7 2.4 Características gerais de lacases fúngicas ................................................................................ 7 2.5 Ocorrência natural de lacases ..................................................................................................... 9 2.6 O fungo Peniophora sp. CBMAI 1063 e a produção de lacases marinhas ..................... 10 2.7 Expressão heteróloga de lacases ............................................................................................... 12 2.8 Novas tecnologias para a expressão heteróloga de lacases ................................................ 16 2.9 Aplicação das lacases .................................................................................................................. 18 3. OBJETIVOS GERAIS ........................................................................................................... 25 3.1 Objetivos específicos ................................................................................................................... 25 4. CAPÍTULO I. CARACTERIZAÇÃO DOS NOVOS GENES DE LACASE DO BASIDIOMICETO DE ORIGEM MARINHA Peniophora sp. CBMAI 1063 E ANÁLISE DO PERFIL DE EXPRESSÃO GÊNICA ................................................................................ 26 5. CAPÍTULO II. UTILIZAÇÃO DO PICHIA TOOLKIT PARA A EXPRESSÃO DA LACASE DE ORIGEM MARINHA Pnh_Lac1 (Lac1) .......................................................... 43 6. CAPÍTULO III. PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA LACASE MARINHA LAC1 ............................................................................................................................................ 73 7. CAPÍTULO IV. AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DA LAC1 NA BIORREMEDIAÇÃO DE CORANTES SINTÉTICOS ................................................................................................ 87 8. CONCLUSÕES GERAIS ..................................................................................................... 109 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 111 1 1. INTRODUÇÃO GERAL As lacases (EC 1.10.3.2) são enzimas multicobre-oxidases capazes de oxidar centenas de compostos fenólicos e não fenólicos. Devido a versatilidade, essas enzimas possuem potencial de aplicação em diferentes setores industriais e ambientais, e vêm sendo continuamente exploradas pelo campo da ciência que busca alternativas mais sustentáveis e menos prejudicais ao ambiente, quando comparado ao uso de reagentes químicos, muitas vezes derivados de recursos não renováveis. A busca por novos recursos genéticos impulsionou a prospecção de micro-organismos derivados do ambiente marinho. Baseado na hipótese de que as enzimas produzidas por tais micro- organismos possuem propriedades para aplicação biotecnológica distintas das produzidas pelos micro-organismos terrestres (e.g.: resistência a condições salinas), o fungo de origem marinha Peniophora sp. CBMAI 1063, isolado anteriormente pelo nosso grupo de pesquisa, vem sendo explorado quanto à sua aplicação em diferentes processos, incluindo a produção de enzimas ligninolíticas e a descoloração, degradação e destoxificação de poluentes ambientais como os hidrocarbonetos derivados do petróleo e os corantes têxteis. Considerado como um excelente produtor de lacases, o basidiomiceto Peniophora sp. CBMAI 1063 apresenta uma família multigênica de lacases, capaz de produzir diferentes proteoformas da enzima. A proteoforma Lac1, codificada pelo gene Pnh_Lac1, é a lacase mais secretada pelo fungo marinho em meio de cultivo salino, fazendo dela uma forte candidata para estudos de aplicação biotecnológica. Apesar de ser vasto o número de lacases terrestres, purificadas e caracterizadas, ainda são escassos os estudos desse tipo com enzimas derivadas do ambiente marinho, as quais podem apresentar novas propriedades. Uma das grandes vantagens da expressão heteróloga de proteínas é a possibilidade de manipulação genética das mesmas, possibilitando a inserção de características favoráveis para o processo de obtenção, como a inserção de caudas que facilitam o processo de purificação de enzimas heterólogas. A levedura Komagataella phaffii, também conhecida como Pichia pastoris, é um dos hospedeiros de expressão heteróloga mais utilizados para expressão de enzimas eucarióticas, devido a diversas vantagens sobre outros tipos de hospedeiros. Contudo, há muitas variáveis que podem interferir no sucesso da expressão de uma lacase heteróloga, algumas dessas variáveis estão relacionadas aos processos de regulação da expressão, enquanto outras estão relacionadas as condições de cultivo da levedura hospedeira. Visando obter 2 o melhor arranjo molecular para a expressão mais eficiente de proteínas heterólogas por P. pastoris, um sistema modular capaz de combinar diferentes fatores de regulação e montar bibliotecas de expressão com essas diferentes combinações foi criado, e chamado de Pichia Tollkit. No presente estudo, o Pichia Toolkit foi utilizado para expressar o gene Pnh_Lac1 que codifica uma lacase do fungo de origem marinha Peniophora sp. CBMAI 1063. Diferentes regiões controladoras da expressão foram avaliadas em todas as combinações possíveis. As condições de cultivo para a expressão da Lac1 pela melhor variante foram otimizadas. A Lac1 foi então purificada, caracterizada e aplicada em processos de descoloração, degradação e destoxificação de corantes têxteis, bem como de outros tipos de corantes sintéticos. 109 8. CONCLUSÕES GERAIS Os dados derivados das análises filogenéticas dos genes de lacase do fungo de origem marinha Peniophora sp. CBMAI 1063 em associação com outras análises in silico, demonstraram que os genes de lacase do fungo passaram por diferentes pressões seletivas e que mesmo que o fungo tenha sido isolado do ambiente marinho, é possível que nem todas as proteoformas estejam igualmente adaptadas ao ambiente salino. Dessa forma, a análise de expressão gênica em condições salinas, associada aos dados do secretoma obtidos anteriormente apontaram a Lac1 como uma das proteoformas mais aptas a atuar em ambiente salino e, portanto, a mais indicada para ser explorada nos experimentos de expressão heteróloga, purificação e caracterização. A estratégia de utilizar o sistema modular Pichia Toolkit para a expressão heteróloga da Lac1 foi considerada eficiente, pois o sistema foi capaz de selecionar, entre diferentes combinações possíveis, o melhor arranjo molecular para o controle da expressão. A associação do promotor constitutivo pGAP com o peptídeo sinal a-amilase-aDMF resultou na maior produção de lacase pela levedura P. pastoris, em comparação com as outras construções constitutivas e indutivas do sistema. Alterações nas condições de cultivo, como a expressão constitutiva da Lac1 a 18 ˚C permitiu otimizar o processo de produção da enzima. Apesar de inconclusivos, os experimentos em biorreator demonstraram que outras variáveis precisam ser testadas para o alcance da condição ótima de produção da lacase heteróloga. A purificação e a caracterização da Lac1 revelaram características interessantes para aplicação da enzima, como alta tolerância a íons metálicos, boa termoestabilidade e atividade próxima a ótima em uma janela ampla de temperaturas. Contudo, a alta tolerância a salinidade não foi encontrada para essa enzima. Com uma sensibilidade ao sal muito semelhante a outras lacases terrestres é possível que a origem da Lac1 na história evolutiva do fungo Peniophora sp. CBMAI 1063, tenha surgido antes do fungo habitar o ambiente marinho. Logo, sugere-se a aplicação dessa enzima em processos e ambientes não salinos ou com pouca salinidade. Experimentos adicionais precisam ser realizados visando compreender os mecanismos de regulação e expressão gênica do fungo marinho Peniophora sp. CBMAI 1063. Considerando o arsenal de lacases e os processos evolutivos, é possível que outras lacases do fungo sejam mais “recentes” e apresentem melhor adaptação ao ambiente salino. Apesar da baixa resistência a salinidade a enzima Lac1 apresentou forte potencial para a descoloração de diferentes corantes sintéticos, incluindo alguns utilizados na indústria têxtil. A presença de mediadores (LMS) foi essencial para obtenção dos melhores resultados de 110 descoloração, além disso, os experimentos realizados indicam que a presença de mediadores no meio reacional promove a degradação das moléculas de corante de forma diferente daquela realizada apenas pela enzima. Apesar da elevada afinidade por siringaldazina e ABTS, o melhor mediador foi siringaldeído na maioria dos casos. A degradação do azo corante têxtil Preto Reativo 5 pela Lac1 na presença do mediador siringaldeído gerou metabólitos de menor massa molecular, muitos dos quais com baixa ou nenhuma toxicidade, contudo alguns dos metabólitos (e.g. 3-(fenilsulfonil), Pirano-4-ona, 3,4-Dimethoxi tiofenol, N,N- Dimetildecanamida) podem apresentar elevada toxicidade para organismos aquáticos e, portanto, a aplicação do LMS com siringaldeído precisa ser associado a outras estratégias de metabolização e redução geral da toxicidade. Lacases marinhas apresentam características interessantes que podem ser aplicadas em diferentes condições. Tais enzimas representam novos recursos biotecnológicos ainda pouco explorados. A diversidade de lacases de um único fungo (Peniophora sp. CBMAI 1063) demonstra o quanto o vasto ecossistema marinho e a biotecnologia marinha ainda podem ser explorados. Os resultados do presente estudo contribuem para o avanço do conhecimento da micologia marinha e biotecnologia azul e abrem perspectivas para novos estudos que visem compreender melhor o processo de adaptação das lacases marinhas e dos diferentes substratos possíveis de serem utilizados por essas enzimas, visando futuras aplicações. 111 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABDEL-HAMID, A. M.; SOLBIATI, J. O.; CANN, I. K. O. Insights into lignin degradation and its potential industrial applications. Em: SARIASLANI, S.; GADD, G.M. Advances in Applied Microbiology (1st Ed.). New York: Elsevier, 2013. p. 1–28. ABDULRACHMAN, D. et al. Heterologous expression of Aspergillus aculeatus endo- polygalacturonase in Pichia pastoris by high cell density fermentation and its application in textile scouring. BMC Biotechnology, v. 17, n. 1, p. 1–9, 2017. ADNAN, L. A. et al. 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