Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT 29409161812631978 01/04/2019 870190031416 17:08 Número do Processo: BR 10 2019 006618 0 Dados do Depositante (71) Depositante 1 de 1 Nome ou Razão Social: UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO Tipo de Pessoa: Pessoa Jurídica CPF/CNPJ: 48031918000124 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Jurídica: Instituição de Ensino e Pesquisa Endereço: Rua Quirino de Andrade, 215 Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 01049-010 País: Brasil Telefone: 11 56270217 Fax: 11 56270103 Email: auin@unesp.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 01/04/2019 às 17:08, Petição 870190031416 Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 1/34 Dados do Pedido Natureza Patente: 10 - Patente de Invenção (PI) Título da Invenção ou Modelo de Utilidade (54): MÉTODO DE OBTENÇÃO DE PEPTÍDEOS BIOATIVOS INIBIDORES DE PYTHIUM INSIDIOSUM Resumo: Trata-se de inibidor de ‘Pythium insidiosum’ causador de infecções fúngicas em animais e humanos; dito método compreende o desenvolvimento de peptídeos bioativos derivados de leite bovino, caprino e humano, mais particularmente obtidos a partir de bioprocesso utilizando enzimas fúngicas (proteases) de ‘Aspergillus oryzae’ (ATCC 1003) produzidas com ação inibitória do crescimento de ‘Pythium insidiosum’. 1Figura a publicar: Dados do Procurador Nome ou Razão Social: Renan Padron Almeida Procurador: Numero OAB: Numero API: CPF/CNPJ: 33778301896 Endereço: Rua Joaquim Antunes 819 Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 05415012 Telefone: 1156270570 Fax: Email: renan.padron@unesp.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 01/04/2019 às 17:08, Petição 870190031416 Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 2/34 Dados do Inventor (72) Inventor 1 de 4 Nome: LUCIANA FRANCISCO FLEURI CPF: 29564664888 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: Rua Prof. Dr. Antonio Celso Wagner Zanin, nº 250 Cidade: Botucatu Estado: SP CEP: 18618-689 País: BRASIL Telefone: Fax: Email: Inventor 2 de 4 Nome: MIRELLA ROSSITTO ZANUTTO ELGUI CPF: 34131275864 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Estudante de Pós Graduação Endereço: Rua Prof. Dr. Antonio Celso Wagner Zanin, nº 250 Cidade: Botucatu Estado: SP CEP: 18618-689 País: BRASIL Telefone: Fax: Email: Inventor 3 de 4 Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 01/04/2019 às 17:08, Petição 870190031416 Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 3/34 Nome: SANDRA DE MORAES GIMENES BOSCO CPF: 15672366856 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Veterinário, patologista (veterinário) e zootecnista Endereço: Rua Dr. Plinio Pinto e Silva, S/N Cidade: Botucatu Estado: SP CEP: 18618-691 País: BRASIL Telefone: Fax: Email: Inventor 4 de 4 Nome: JÉSSICA LUANA CHECHI CPF: 34503629840 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Estudante de Pós Graduação Endereço: Rua Dr. Plinio Pinto e Silva, S/N Cidade: Botucatu Estado: SP CEP: 18618-691 País: BRASIL Telefone: Fax: Email: Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 01/04/2019 às 17:08, Petição 870190031416 Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 4/34 NomeTipo Anexo Comprovante de pagamento de GRU 200 GRU 24 29409161812631978.pdf Comprovante de pagamento de GRU 200 GRU 24 631978.pdf Procuração Procuração.pdf CGEN Acesso Patrimônio Genético.pdf Relatório Descritivo Relatório.pdf Reivindicação Reivindicações.pdf Desenho Desenhos.pdf Resumo Resumo.pdf Documentos anexados Acesso ao Patrimônio Genético Declaração Positiva de Acesso - Declaro que o objeto do presente pedido de patente de invenção foi obtido em decorrência de acesso à amostra de componente do Patrimônio Genético Brasileiro, realizado a partir de 30 de junho de 2000, e que foram cumpridas as determinações da Lei 13.123 de 20 de maio de 2015, informando ainda: Número da Autorização de Acesso: A3B348F Data da Autorização de Acesso: 05/07/2018 Declaro, sob as penas da lei, que todas as informações acima prestadas são completas e verdadeiras. Declaração de veracidade Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 01/04/2019 às 17:08, Petição 870190031416 Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 5/34 [bb.com.br] - Boleto gerado pelo sistema MPAG. 29/11/2018 15:21:42 INSTRUÇÕES: A data de vencimento não prevalece sobre o prazo legal. O pagamento deve ser efetuado antes do protocolo. Órgãos públicos que utilizam o sistema SIAFI devem utilizar o número da GRU no campo Número de Referência na emissão do pagamento. Serviço: 200-Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT Clique aqui e pague este boleto através do Auto Atendimento Pessoa Física. Clique aqui e pague este boleto através do Auto Atendimento Pessoa Jurídica. 00190.00009 02940.916188 12631.978173 9 77520000007000 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO CPF/CNPJ: 48031918000124 RUA QUIRINO DE ANDRADE 215, SAO PAULO -SP CEP:01049010 29409161812631978 29409161812631978 28/12/2018 70,00 INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUST CPF/CNPJ: 42.521.088/0001-37 RUA MAYRINK VEIGA 9 24 ANDAR ED WHITE MARTINS , RIO DE JANEIRO - RJ CEP: 20090910 2234-9 / 333028-1 00190.00009 02940.916188 12631.978173 9 77520000007000 INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUST CPF/CNPJ: 42.521.088/0001-37 29/11/2018 29409161812631978 DS N 29/11/2018 29409161812631978 17 R$ A data de vencimento não prevalece sobre o prazo legal. O pagamento deve ser efetuado antes do protocolo. Órgãos públicos que utilizam o sistema SIAFI devem utilizar o número da GRU n o campo Número de Referência na emissão do pagamento. Serviço: 200-Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO CPF/CNPJ: 48031918000124 RUA QUIRINO DE ANDRADE 215, SAO PAULO-SP CEP:01049010 28/12/2018 2234-9 / 333028-1 29409161812631978 70,00 Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 6/34 https://www2.bancobrasil.com.br/aapf/login.jsp?url=pagamento/867-892.jsp?codT%3D1%26dataPagamento%3D29%2F11%2F2018%26valorDocumento%3D7000%26valor%3D7000%26desconto%3D0%2C00%26juros%3D0%2C00%26campo1%3D00190%26campo2%3D00009%26campo3%3D02940%26campo4%3D916188%26campo5%3D12631%26campo6%3D978173%26campo7%3D9%26campo8%3D77520000007000%26tipoCodigoBarras%3D1 https://aapj.bb.com.br/aapj/liemp.bb?codigoTransacao=867&data=29112018&campo1=00190&campo2=00009&campo3=02940&campo4=916188&campo5=12631&campo6=978173&campo7=9&campo8=77520000007000&valorDocumento=7000&valor=7000&valorDesconto=000&valorJurosMulta=000 20/12/2018 Internet Banking https://www.santandernetibe.com.br/Paginas/Compromissos/COMPROMISSOS_DETALHE_SEG_VIA.asp?txtEntidade=0033&txtCentroAlta=023… 1/1 FUNDACAO PARA O DESENVOLVIMENTO DA UNESP Agência: 0239 Conta Corrente: 13-002549-6 DETALHE DO COMPROMISSO Convênio: 0033-0239-004900019792 Conta de Débito: 0239-000430023105 Tipo de Pagamento: BLQ Outros Código de Barras: 00190000090294091618812631978173977520000007000 No. compromisso banco: 1029377000300022 No. compromisso cliente: 631978/DS1 101009853 Instituição Financeira Favorecida: 001 - BANCO DO BRASIL S.A. Nome/Razão Social do Beneficiário Original: INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUST CPF/CNPJ do Beneficiário Original: 42.521.088/0001-37 Nome/Razão Social do Pagador Original: UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE CPF/CNPJ do Pagador Original: 48.031.918/0001-24 Nome/Razão Social do Pagador Efetivo: FUNDACAO PARA O DESENVOLVIMENT CPF/CNPJ do Pagador Efetivo: 57.394.652/0001-75 Valor Nominal: 70,00 Desc./Abat.: 0,00 Juros: 0,00 Data de Vencimento: 28/12/2018 Data de Pagamento: 19/12/2018 Situação: Efetivado No. Lista de Débito: No. Protocolo: PGTFORNB19122018900134723 Autenticação: 11CBC4EDD2DEA004E5DDC70 Valor a Pagar: 70,00 Central de Atendimento Santander Empresarial 4004-2125 (Regiões Metropolitanas) SAC 0800 762 7777 0800 726 2125 (Demais Localidades) Ouvidoria 0800 726 0322 Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 7/34 javascript:window.close(); javascript:onPrint() Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 8/34 Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 9/34 Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 10/34 Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 11/34 Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 12/34 Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 13/34 Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 14/34 CONSELHO DE GESTÃO DO PATRIMÔNIO GENÉTICO Certidão Cadastro nº A3B348F Declaramos, nos termos do art. 41 do Decreto nº 8.772/2016, que o cadastro de acesso ao patrimônio genético ou conhecimento tradicional associado, abaixo identificado e resumido, no Sistema Nacional de Gest ão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado foi submetido ao procedimento administrativo de verificação e não foi objeto de requerimentos admitidos de verificação de indícios de irregularidades ou, caso tenha sido, o requerimento de verificação não foi acatado pelo CGen. Número do cadastro: Usuário: CPF/CNPJ: Objeto do Acesso: A3B348F UNESP 48.031.918/0001-24 Patrimônio Genético SISTEMA NACIONAL DE GESTÃO DO PATRIMÔNIO GENÉTICO E DO CONHECIMENTO TRADICIONAL ASSOCIADO Finalidade do Acesso: Ministério do Meio Ambiente Pesquisa Científica Bioprospecção Desenvolvimento Tecnológico Aspergillus niger Aspergillus niger Aspergillus niger 01 Fusarium sp 13 Penicillium sp Aspergillus fumigatus Penicillium expansum Fusarium oxysporum Candida albicans Trichoderma koningii Aspergillus ustus Aspergillus niger van Tieghem Aspergillus flavipes (Bainier & Satory) Thom Trichoderma atroviride Trichoderma virens Trichoderma harzianum Rifai Bacillus subtillis Bacillus subtillis Bacillus megaterium Bacillus amyloliquefaciens Pythium insidiosum Pythium insidiosum Espécie Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 15/34 Pythium insidiosum Prunus persica L. Batsch Vitis vinifera Mangifera indica Zea mays Passiflora edulis Arachis hypogaea Sorghum bicolor Manihot esculenta Nicotiana tabacum Triticum sp Glycine max Capra hircus Impossibilidade de identificação Streptomyces sp Impossibilidade de identificação Título da Atividade: Produção de biomoléculas a partir de resíduos F Fleuri UNESP Mirella Rossitto Zanutto UNESP Milene Stefani Pereira UNESP Débora Zanoni do Prado UNESP Valesca Cristiane Benelli Francisco UNESP Bruna Luiza Capoville UNESP João Vitor Inácio da Silva UNESP Érica Santos de Mello UNESP Juliana Garcia Carvalho Pupatto Água da Mata Desenvolvimento Sustentável Dafne Ângela Camargo UNESP Samara Louzada de Oliveira UNESP Marcela Pavan Bagagli IFSP Sandra de Moraes Gimenes Bosco UNESP Jéssica Luana Chechi UNESP Célio Júnior da Costa Fernandes UNESP Rodrigo Augusto da Silva UNESP Júlia Carolina Athanázio-Heliodoro UNESP Mayara Rodrigues Piveta UNESP Paula Kern Novelli UNESP Meliane Akemi Koike IFSP Clarissa Hamaio Okino-Delgado UNIRP/UNESP Paulo Henrique Ribeiro Lopes UNESP Mariana de Lara Campos Arcuri UNESP Willian Fernando Zambuzzi UNESP Equipe Resultados Obtidos Divulgação de resultados em meios científicos ou de comunicação Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 16/34 Identificação do meio onde foi divulgado: Relatórios científicos, resumos, artigos científicos, dissertações e teses e patentes (quando for o caso). Data do Cadastro: 05/07/2018 10:49:27 Situação do Cadastro: Concluído Conselho de Gestão do Patrimônio Genético Situação cadastral conforme consulta ao SisGen em 15:13 de 13/09/2018. Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 17/34 1 / 13    “MÉTODO  DE  OBTENÇÃO  DE  PEPTÍDEOS  BIOATIVOS  INIBIDORES  DE  PYTHIUM  INSIDIOSUM”.  CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO  [001] A  presente patente  de  invenção  trata  de método  de  obtenção  de  peptídeos  bioativos derivados de  leite bovino, caprino e humano  (LBaPs), por meio da ação de  enzimas fúngicas (proteases) de Aspergillus oryzae (ATCC 1003) produzidas, bem como  o uso terapêutico de composições farmacêuticas contendo as LBaPs produzidas contra  Pythium insidiosum.  HISTÓRICO DA INVENÇÃO  [002] Pythium  insidiosum  é  um  micro‐organismo  zoospórico,  fungo‐símile,  pertencente ao reino Stremenopila, filo Oomycota, família Pythiaceae, mais relacionado  às  diatomáceas  e  algas  do  que  aos  fungos  verdadeiros  (ALEXOPOULOS  et  a.,  1994,  SCHURKO et al., 2003, GAASTRA et al., 2010) que necessita de água e vegetação para a  formação de zoósporos (propágulos infecciosos) (MENDOZA et al., 1993, SUPABANDHU  et al., 2008). Esta espécie é a única do gênero com ação patogênica em mamíferos,  causando a pitiose, doença observada principalmente em equinos, cães, bovinos, gatos,  animais silvestres e também humanos em regiões tropicais e subtropicais (MENDOZA,  2005;  SANTURIO  &  FERREIRO,  2008;  GAASTRA  et  al.,  2010).  No  entanto,  têm  sido  relatados casos de pitiose em regiões que não se adequam a esta classificação climática  (Califórnia e Arizona), indicando a incidência de P. insidiosum decorrente das alterações  climáticas e agroculturais, em locais cujas plantações têm necessidade aquática (WHITE  et al., 2008).  [003] A pitiose progride rapidamente, comprometendo à vida de humanos e animais  (PUPAIBOOL et al., 2006; ÁLVAREZ et al., 2013). Em animais a infecção pode ser cutânea  (caracterizada por lesão ulcerativa nodular granulomatosa e necrosante, purido intenso,  chegando a levar a automutilação) (MARTINS DIAS et al., 2012); intestinal (acomete cães  mais  frequentemente,  caracterizada  por  vômitos,  perda  de  peso,  diarreia  e massas  abdominais);  pulmonar  (lesões  nodulares)  e  óssea  (caracterizadas  por  exotoses,  osteólises e osteomielite)  (REIS et al., 2003; SANTURIO et al., 2006). Em humanos, a  doença  foi descrita pela primeira vez em 1986 na Tailândia  (THIANPRASIT, 1986). No  Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 18/34 2 / 13    Brasil foi descrita pela primeira vez em 2005 (BOSCO et al., 2005, MARQUES et al., 2006).  Atualmente  observa‐se  a maioria  dos  casos  humanos  na  Tailândia,  sendo  a  pitiose  endêmica, principalmente em trabalhadores da agricultura do arroz (KRAJAEJUM et al.,  2006). Além da Tailândia,  casos em animais  são descritos no  sudeste asiático  (Índia,  Indonésia, Japão, Coréia, Nova Guiné, Tailândia), Oceania (Austrália e Nova Zelândia),  Américas (Argentina, Brasil, Uruguai, Colômbia, Venezuela, Costa Rica, Guatemala, Haiti,  Panamá, Nicarágua, México e Estados Unidos) e África (MENDOZA, 2005; PÉREZ et al.,  2005, RIVIERE et al., 2005). A  infecção em humanos  se manifesta de  forma  cutânea  (lesões granulomatosas e ulcerativas), vascular (tromboses, vasculites ou aneurismas),  ocular (ceratites, úlceras corneanas) e sistêmica (KRAJAEJUN et al., 2002), apresentando  elevada taxa de mortalidade.   [004] Os  oomicetos  diferem  estruturalmente  dos  fungos  verdadeiros  devido  à  ausência de quitina na parede celular (substituída por celulose) e também ausência de  ergosterol  na  membrana  plasmática.  Os  principais  antifúngicos  disponíveis  na  atualidade, como azólicos (fluconazol, itraconazol), alilaminas (terbinafina) e poliênicos  (anfotericina  B),  atuam  na  inibição/ligação  do  ergosterol,  causando  instabilidade  da  membrana  fúngica,  tal  fato  explica  o  insucesso  do  uso  desses  contra  P.  insidiosum  (SANTURIO & FERREIRO, 2008; GAASTRA et al., 2010).   [005] Outras  formas  de  tratamento  foram  testadas,  como  o  uso  associado  dos  antifúngicos citados acima com caspofungina, inibidora de β‐glucana (ARGENTA et al.,  2010); ou associados  com antibióticos  como metronidazol e  rifampicina e  com anti‐ inflamatório como  ibuprofeno  (CAVALHEIRO et al., 2009); e  também  imunoterápicos  (MENDOZA  &  NEWTON,  2005).  No  entanto,  os  resultados  apresentam  elevada  variabilidade da susceptibilidade‐resposta ao tratamento (CAVALHEIRO et al., 2009) e o  uso de antifúngicos sistêmicos em animais são pouco eficazes, nefrotóxicos e possuem  custo elevado (MARTINS DIAS et al., 2012). Assim, as melhores opções de tratamento  são  a  imunoterapia  (MILLER,  1981)  e  a  cirurgia.  Desta  forma,  a  ausência  de  um  tratamento  efetivo  contra  este  patógeno mobiliza  a  busca  por  um  composto  com  potencial de ação  (TROLEZI et al., 2017) que  seja biocompatível e produzido a baixo  custo.   Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 19/34 3 / 13    [006] Peptídeos  bioativos  derivados  de  leite  (LBaPs)  são  fragmentos  proteicos  que  apresentam  diversas  atividades  biológicas,  entre  elas  a  propriedade  antimicrobiana,  agindo de forma similar a uma droga ou hormônio, excercendo papel relevante na saúde  humana e  animal  (KORHONEN, 2009;  LIVNEY, 2010; NONGONIERMA &  FITZGERALD,  2018). Os LBaPs podem ser produzidos por hidrólise das proteínas de  leite utilizando  proteases  fúngicas  produzidas  por  Fermentação  em  Estado  Sólido  (FES).  Esse  bioprocesso  tem  caráter  custo‐efetivo  e  sustentável,  uma  vez  que  admite  o  uso  de  resíduos agroindustriais como substrato e necessita de pouca quantidade de água livre  no sistema (CASTRO & SATO, 2014).     [007] O uso terapêutico de LBaPs tem despertado grande interesse devido ao amplo  potencial de ação desses compostos, à seletividade comparado aos fármacos e também  por serem considerados seguros e de baixa toxicidade (CICERO et al., 2017; NIELSEN et  al., 2017). A busca por peptídeos bioativos com atividade antimicrobiana é vantajosa,  pois estes compostos demonstram eficácia no tempo de morte da célula alvo e amplo  espectro  de  ação,  inclusive  contra  cepas  resistentes  aos  antimicrobianos  existentes  (ZASLOFF, 2002; BENKERROUM, 2010).  ANÁLISE DO ESTADO DA TÉCNICA  [008] Em pesquisa realizada em bancos de dados especializados  foram encontrados  documentos referentes à métodos para tratamento e inibidores de Pythium insidiosum,  tal  como,  o  documento  de  nº.  US2002081308  que  trata  de  vacinas  de  antígeno  e  métodos de uso dos mesmos para o tratamento de infecções por Pythium insidiosum,  bem como profilaxia contra estas  infecções, em humanos e mamíferos. Além disso, é  apresentado  um método  para  preparar  a  vacina  para  o  tratamento  que  contém  os  antigénios intracelulares e extracelulares de Pythium insidiosum.   [009] O  documento  de  nº. US2007128208  trata  de método  para  o  tratamento  de  doenças alérgicas das vias aéreas em mamíferos relacionado à Pythium  insidiosum. O  método baseia‐se num produto imunoterapêutico das proteínas do P. insidiosum como  antigénios. O método é particularmente útil na cicatrização nas lesões em equinos.  [010] O  documento  de  nº.  US2011159042  trata  de  método  e  vacina  para  modularização  do  o  sistema  imunológico  dos  animais  com  outras  doenças  que  não  Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 20/34 4 / 13    causadas  por  P.  insidiosum.  compreendendo  a  administração  da  quantidade  moduladora  eficaz  do  P.  insidiosum,  strain  MTPI‐04.  A  vacina  usa  uma  resposta  imunológica que efetivamente trata e gerencia uma variedade de doenças humanas e  animais.  [011] É  fato  que  os  documentos  revelam  formas  de  tratamentos  contra  o mesmo  fungo, como imunoterapia e vacinas. No entanto, não há registros de tratamentos com  base em peptídeos bioativos derivados de  leite, tampouco utilizando um bioprocesso  inovador e vantajoso do ponto de vista econômico, ambiental e biotecnológico, que é a  fermentação  em  estado  sólido.  Essas  características positivas deste bioprocesso  são  pertinentes  pelo  meio  reacional  utilizado,  que  se  baseia  no  uso  de  resíduos  agroindustriais  como  substrato,  pouca  quantidade  de  água  e  fungos  seguros  para  produção de produtos de valor agregado como as proteases obtidas que foram aplicadas  na produção dos peptídeos bioativos com possíveis aplicações na área da saúde.   [012] Embora esteja descrito na literatura o sucesso no uso destas outras abordagens,  vale  ressaltar que não são  técnicas que oferecem  resultados positivos para  todos os  casos. O tratamento tradicional é o cirúrgico, no qual é excisada toda a área afetada  (incluindo‐se margens de bordos  e profundidade) e demonstra  limitações devido  às  estruturas anatômicas envolvidas (MILLER, 1981.).  Porém, alguns estudos reportaram  a  ausência  de  sucesso  da  cirurgia, mesmo  com  associação  de  agentes  antifúngicos  (MEIRELES, 1993.).    [013] O uso de  imunoterapia ofereceu resultados positivos para 3 a cada 5 animais  tratados (MENDOZA & ALFARO, 1986.). As vacinas foram eficientes em média de 65%  dos  casos,  de  acorda  com Mendoza  et  al.  (MENDOZA,  1992.).  Ainda, Dykstra  et  al.  (DYKSTRA, 1999.) registraram fracasso nas opções terapêuticas disponíveis para cães,  incluindo vacinas.  [014] Assim,  a  análise  do  estado  da  técnica  face  aos  resultados  encontrados  na  pesquisa  realizada  evidencia  o  potencial  dos  peptídeos  produzidos  em  inibir  o  crescimento  deste  fungo‐símile  in  vitro,  possibilitando  futuras  aplicações  farmacológicas. Os documentos encontrados no estado da  técnica  tratam do uso de  vacinas,  imunoterapia, entre outras  abordagens  contra o Pythium  insidiosum,  sendo  Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 21/34 5 / 13    esta a única similaridade com a presente invenção, qual seja o foco no mesmo agente  causador  da  infecção,  ficando  evidente  o  uso  de  abordagens  biológicas  totalmente  distintas da presente invenção.  OBJETIVOS DA INVENÇÃO  [015] A  inovação  na proposta  solicitada  consiste na  ação  contra o  agente Pythium  insidiosum por peptídeos bioativos derivados de leite bovino, caprino e humano, obtidos  por hidrólise com proteases fúngicas de Aspergillus oryzae através da FES.   [016] Os  resultados  encontrados na pesquisa  realizada  evidenciam o potencial dos  peptídeos produzidos em inibir o crescimento deste fungo‐símile in vitro, possibilitando  futuras aplicações farmacológicas.  [017] Ademais,  o  desenvolvimento  de  terapias  baseadas  em  peptídeos,  principalmente  quando  isolados  de  leite,  tem  se  tornado  uma  nova  alternativa  por  apresentarem potencial terapêutico, sendo os LBaPs mais seletivos quando comparados  a  outras  pequenas moléculas  empregadas  como  fármacos  e  considerados  seguros  devido ao contato prévio com o leite na fase neonatal (NIELSEN et al., 2017), evitando o  desencadeamento de resistência e efeitos colaterais (KORHONEN, 2009).  PESQUISA  [018] Amostras fúngicas de Aspergillus oryzae (ATCC 1003) foram obtidas do Instituto  Oswaldo  Cruz  (FIOCRUZ,  Rio  de  Janeiro,  Brasil)  e  foram  cultivadas  em  Ágar  Batata  Dextrose (PDA) (Himédia, Mumbai, Índia) e incubadas por 120 h a 30 °C. A produção de  proteases por A. oryzae foi realizada por FES em farelo de trigo em água 1:1 (p/v).   [019] Os frascos de Erlenmeyers contendo o substrato e água foram esterilizados por  15 min  a  121  °C  e,  posteriormente,  foram  inoculadas  suspensões  de  esporos  a  107  esporos mL‐1, preparadas com água destilada esterilizada e com esporos da cultura de  96 h de crescimento em meio PDA inclinado. Os frascos foram incubados por 120 h a 30  °C.   [020] Após, foram adicionados 50 mL de água destilada em cada frasco. Os meios de  cultivo foram homogeneizados e, após permanecerem em repouso por 1 h com agitação  de 15 em 15 min, foram filtrados com gaze e coletados em recipiente único tipo coletor  universal (CASTRO & SATO, 2014). Os filtrados foram considerados fonte de proteases  Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 22/34 6 / 13    brutas e foram fracionados por precipitação com sulfato de amônio ((NH4)2SO4) a 40%  de saturação. Após, a amostra foi centrifugada a 4.000 x g por 15 min a 5 °C.   [021] Os  precipitados  foram  ressuspendidos  em  tampão  fosfato  0,1M  pH  7,0  e  dialisados  contra  água  destilada  refrigerada  em membrana  de  celulose  de  tubo  de  diálise  43 mm  (Sigma‐Aldrich®,  St  Louis, USA). O  sobrenadante  foi  utilizado  para  o  prosseguimento  do  fracionamento  com  60%  e  80%  do  sal,  seguindo  o  mesmo  procedimento descrito anteriormente (WINGFIELD, 2001).   [022] Os extratos foram liofilizados (Liotop® L101, São Carlos, Brasil) a ‐90 °C em ciclo  de 96 h. A atividade da protease foi determinada utilizando azocaseína (Sigma‐Aldrich®,  St  Louis,  USA)  como  substrato,  conforme  descrito  por  Charney &  Tomarelli  (1947),  através do qual foram observadas as atividades de 32,3 U mL‐1 (40%), 36,6 U mL‐1 (60%),  29,8  U mL‐1  (80%).  Amostras  de  leite  foram  obtidas  de  animais  saudáveis  recém‐ ordenhados,  sendo  o  leite  bovino  obtido  do  Sítio  São  José‐  São Manuel,  SP,  Brasil  (latitude 22° 43' 52" S e longitude 48° 34' 14" O) e o caprino da Faculdade de Medicina  Veterinária e Zootecnia‐UNESP‐ Botucatu, SP, Brasil (latitude 22° 53' 09" S e longitude  48° 26' 42" O).   [023] Foram analisados  também  leites comerciais Ultra High Temperature  (UHT) de  bovino (Líder Alimentos do Brasil®, Brasil) e caprino (Capprys’S Indústria de Laticínios,  Brasil). As amostras de leite humano foram obtidas de duas doadoras (A e B) saudáveis  e em mesma fase de lactação da cidade de Botucatu (latitude 22° 53' 09" S e longitude  48° 26' 42" O), Brasil.   [024] As  concentrações  de  proteínas  totais  foram  determinadas  pelo  método  do  Biureto  (ROSE,  1833),  para  os  leites  parcialmente  purificados  diretamente  a  80%,  conforme descrito para as proteases fúngicas. As maiores concentrações de proteínas  totais  foram  observadas  para  as  amostras  de  leite  dos  animais  recém‐ordenhando  (p=0,01) obtendo‐se 3911,5 mg mL‐1 para bovino e 2795,5 mg mL‐1 para caprino, em  comparação com os leites UHT nos quais foram obtidas 1145,8 mg mL‐1 para leite bovino  e 2602,8 mg mL‐1 para caprino.   [025] Assim, foram selecionadas as amostras de leites recém‐ordenhadas para serem  submetidas  à  hidrólise  para  a  produção  dos  LBaPs.  Para  os  leites  humanos  foram  Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 23/34 7 / 13    observadas as concentrações de 3377,3 mg mL‐1 de proteínas totais para a doadora A e  2755,3 mg mL‐1 para a doadora B. Os peptídeos foram produzidos com alíquotas de 10  mL  (100 mg mL‐1) de proteínas do  leite bovino, caprino e das duas doadoras de  leite  humano e proteases parcialmente purificadas a 2% (m/v) foram incubados em tampão  fosfato 0,1M, pH 7 a 37 °C por 1 h (LOU et al., 2014‐ modificado). Após a hidrólise, a  protease  foi paralisada por adição de ácido acético 1M  (v/v). As misturas de  reação  foram centrifugadas a 4.000 x g por 20 min a 5 °C.   [026] Os sobrenadantes foram recolhidos e  liofilizados  ‐90 °C por 96h. Os peptídeos  foram  ressuspendidos em água ultrapura e  filtrados  separadamente com  filtros para  seringa com membrana poliéster sulfônica com poro de 0,22 µm (Kasvi®, São José dos  Pinhais, Brasl) para eliminação de  resíduos e  contaminantes.  Foram  selecionados os  peptídeos  B40  (leite  bovino  hidrolisado  com  protease  de  A.  oryzae  parcialmente  purificada  a  40%  por  salting‐out), B80  (leite  bovino  hidrolisado  com  protease  de A.  oryzae a 80%), C40 (leite caprino hidrolisado com protease de A. oryzae a 40%), HA80  (leite humano da doadora A hidrolisado com protease de A. oryzae a 80%) e HB80 (leite  humano  da  doadora  B  hidrolisado  com  protease  de  A.  oryzae  a  80%)  para  serem  avaliados quanto à atividade antimicrobiana. Proteases  inativadas  foram preparadas  ebulindo o extrato enzimático por 10 min e foi utilizada como controle negativo.   [027] A concentração de peptídeos foi determinada pela leitura da absorbância de 214  nm, utilizando o equipamento NanoVue™ Spectrophotometer (GE Healthcare®, Boston,  USA),  com  albumina  sérica  bovina  como  padrão,  proveniente  do  kit  Quick  Start™  Bradford Protein Assay (Bio‐Rad®, Hercules, USA) (KUIPERS & GRUPPEN, 2007; ANTHIS  & CLORE, 2013) apresentando as concentrações de 1,3 mg mL‐1  (B40); 1,3 mg mL‐1  (B80); 1,1 mg mL‐1 (C40); 0,6 mg mL‐1 (HA80) e 0,5 mg mL‐1 (HB80).  [028] Os  LBaPs  filtrados  foram  utilizados  para  a  determinação  da  atividade  antimicrobiana  contra  o  micro‐organismo  Pythium  insidiosum,  cujas  cepas  (n=4;  isolados 10, 15, 27 e 28) foram  isoladas de equinos previamente pelo Laboratório de  Micologia Médica, sob orientação da Profa. Dra. Sandra de Moraes Gimenes Bosco e  cultivadas  em  Ágar  Sabouraud  e,  após,  submetidos  ao  ensaio  de  difusão  em  disco,  através do alocamento de discos estéreis sobre o cultivo, sobre os quais foram pipetados  Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 24/34 8 / 13    60 µL dos BaPs (20 µL a cada 24 h). As placas foram incubadas por 72 h a 37 °C.   [029] Os resultados foram expressos em mm referente ao diâmetro do halo de inibição  formado pelo método de difusão  em disco  (Figura 1 e  2, painéis A  a D)  (MOTTA &  BRANDELLI, 2002; ATHANÁZIO‐HELIODORO et al., 2018). A capacidade de inibição dos  LBaPs  também  foi avaliada em 5 diferentes concentrações por diluição  seriada 1:10,  contudo, não foram observadas inibições para as demais concentrações, apenas para a  primeira (Figura 2, painel E).  DESCRIÇÃO DAS FIGURAS  [030] A  complementar  a  presente  descrição  de  modo  a  obter  uma  melhor  compreensão das características do presente invento e de acordo com uma preferencial  realização  prática  do mesmo,  acompanha  a  descrição,  em  anexo,  um  conjunto  de  desenhos  e  imagens,  onde,  de  maneira  exemplificada,  embora  não  limitativa,  se  representou o seguinte:  a  figura 1  revela  gráfico da  atividade  “fungistática” de pools de peptídeos bioativos  derivados  de  leite  (LbaPs)  bovino,  caprino  e  humano,  produzidos  por  hidrólise  com  proteases fúngicas de Aspergillus oryzae (ATCC 1003) produzidas por Fermentação em  Estado Sólido com farelo de trigo como substrato e purificadas parcialmente por salting‐ out (A); e  a figura 2 mostra imagens fotográficas da inibição do crescimento de Pythium insidiosum  por LBaPs de leite humano produzidos com proteases parcialmente purificadas a 80%  (B); inibição do crescimento de Pythium insidiosum por LBaPs de leite bovino produzidos  com proteases parcialmente purificadas a 40% (B); Inibição do crescimento de Pythium  insidiosum  por  LbaPs  de  leite  caprino  produzidos  com  proteases  parcialmente  purificadas a 40% (B); inibição do crescimento de Pythium insidiosum por LBaPs de leite  bovino  produzidos  em  diferentes  concentrações  com  proteases  parcialmente  purificadas a 40% (B).  DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO  [031] A  presente  patente  de  invenção  se  refere  à  “MÉTODO  DE  OBTENÇÃO  DE  PEPTÍDEOS  BIOATIVOS  INIBIDORES  DE  PYTHIUM  INSIDIOSUM”,  mais  precisamente  trata‐se de inibidor de Pythium insidiosum causador de infecções fúngicas em animais e  Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 25/34 9 / 13    humanos.  [032] Segundo a presente  invenção, o método  revelado estabelece um bioprocesso  para  desenvolvimento  de  peptídeos  bioativos  derivados  de  leite  bovino,  caprino  e  humano com ação inibitória do crescimento de Pythium insidiosum.  [033] Dito  bioprocesso  utiliza  meio  reacional  baseado  no  uso  de  resíduos  agroindustriais  como  substrato,  pouca  quantidade  de  água  e  fungos  seguros  para  produção  de  produtos  de  valor  agregado  como  as  proteases  obtidas  aplicadas  na  produção dos peptídeos bioativos com possíveis aplicações na área da saúde.  [034] Dito  bioprocesso  para  desenvolvimento  de  peptídeos  bioativos  derivados  de  leite bovino, caprino e humano compreende as seguintes etapas:  a) Produção de proteases  fúngicas de Aspergillus oryzae  (ATCC 1003) produzidas  por fermentação em estado sólido com farelo de trigo em água 1:1 (p/v) como substrato  aplicadas na hidrólise de proteínas de leite bovino, caprino e humano para a obtenção  de pools de peptídeos bioativos com potencial antimicrobiano;  b) As  enzimas  purificadas  parcialmente  a  40%  e  80%,  e  os  leites  purificados  parcialmente a 80% com sulfato de amônio pela técnica de salting‐out;  c) Os peptídeos produzidos inibem o crescimento de quatro isolados de ‘Pythium  insidiosum’ provenientes de equino.    Referências   ALEXOPOULOS, C. J., MINS, C. W., BLACKWELL, M. Introductory Mycology.  4. ed. New  York: John Wiley & Sons, 1996; Chap. 3, p.61‐85.  ÁLVAREZ,  J.C.; VILORIA, M.V.; AYOLA, S.P. Pitiose  cutânea em equinos: Uma  revisão.  Revista CES Medicina Veterinaria y Zootecnia, v. 8, n. 1, p. 58–67, 2013.   ANTHIS,  N.J.;  CLORE,  G.M.  Sequence‐specific  determination  of  protein  and  peptide  concentrations by absorbance at 205 nm. Protein Science: A Publication of the Protein  Society, v. 22, n. 6, p. 851–858, 2013.   ARGENTA, J.S.; ALVES, S.H.; SILVEIRA, F.; MABONI, G.; PEREIRA, D.I.; SPANAMBERG, A.;  SANTURIO, J.M.; FERREIRO, L. In vitro paradoxical growth of Pythium insidiosum in the  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ação  inibitória  do  crescimento  de  ‘Pythium  insidiosum’.  2. “MÉTODO”, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por bioprocesso  utilizando meio reacional baseado no uso de resíduos agroindustriais como substrato,  pouca  quantidade  de  água  e  fungos  seguros  para  produção  de  produtos  de  valor  agregado como as proteases obtidas aplicadas na produção dos peptídeos bioativos com  possíveis aplicações na área da saúde.  3. “MÉTODO”, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por o método para  desenvolvimento de peptídeos bioativos derivados de leite bovino, caprino e humano  compreender as seguintes etapas:  a)  produção de proteases fúngicas de ‘Aspergillus oryzae’ (ATCC 1003) produzidas  por fermentação em estado sólido com farelo de trigo em água 1:1 (p/v) como substrato  aplicadas na hidrólise de proteínas de leite bovino, caprino e humano para a obtenção  de pools de peptídeos bioativos com potencial antimicrobiano;  b)  as  enzimas  purificadas  parcialmente  a  40%  e  80%,  e  os  leites  purificados  parcialmente a 80% com sulfato de amônio pela técnica de ‘salting‐out’;  c)  obtenção dos peptídeos produzidos para inibir o crescimento de quatro isolados  de ‘Pythium insidiosum’ provenientes de equino.  4. “MÉTODO”, de acordo com as reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado por o método de  obtenção  de  Peptídeos  bioativos  derivados  de  leite  (LBaPs),  por meio  da  ação  de  enzimas  fúngicas  (proteases)  de  A.  oryzae  resultar  em  composições  farmacêuticas  contendo as LBaPs produzidas contra Pythium insidiosum. Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 31/34 FIG.1 1 /2 Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 32/34 FIG.2 2/2 Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 33/34 1 / 1    RESUMO  “MÉTODO  DE  OBTENÇÃO  DE  PEPTÍDEOS  BIOATIVOS  INIBIDORES  DE  PYTHIUM  INSIDIOSUM”.  Trata‐se de inibidor de ‘Pythium insidiosum’ causador de infecções fúngicas em animais  e  humanos;  dito  método  compreende  o  desenvolvimento  de  peptídeos  bioativos  derivados de leite bovino, caprino e humano, mais particularmente  obtidos a partir de  bioprocesso utilizando enzimas fúngicas (proteases) de ‘Aspergillus oryzae’ (ATCC 1003)  produzidas com ação inibitória do crescimento de ‘Pythium insidiosum’.  Petição 870190031416, de 01/04/2019, pág. 34/34 Peticionamento Eletrônico Formulário Comprovante de pagamento de GRU 200 Comprovante de pagamento de GRU 200 Procuração CGEN Relatório Descritivo Reivindicação Desenho Resumo 2019-04-01T17:08:59-0300 Brasil Documento Assinado - INPI