UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PRESENÇA E TIPIFICAÇÃO DE SALMONELLA spp. NO CONTEÚDO RUMINAL DE BOVINOS PÓS-ABATE . SALÉSIA MARIA PRODÓCIMO MOSCARDI Botucatu, SP FEVEREIRO, 2014 II UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PRESENÇA E TIPIFICAÇÃO DE SALMONELLA spp. NO CONTEÚDO RUMINAL DE BOVINOS PÓS-ABATE SALÉSIA MARIA PRODÓCIMO MOSCARDI Tese apresentada junto ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Doutora em Saúde Animal, Saúde Pública Veterinária e Segurança Alimentar. Orientador: Prof. Dr. José Paes de Almeida Nogueira Pinto III Agradecimentos A Deus, por mais essa conquista, por estar sempre comigo e por ser a minha fortaleza. À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP – Botucatu-SP, em especial ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, pela oportunidade de realizar este trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos. Ao Prof. Dr. José Paes de Almeida Nogueira Pinto, por me orientar com tamanha amizade, confiança, atenção e apoio em todos os momentos ao logo de tantos anos. Aos membros da Banca examinadora Andréa Pereira Pinto, Luiz Carlos de Souza, Rogério Salvador e Thais Helena Constantino Patelli por atenderem prontamente meu convite e pela imensa contribuição na correção deste trabalho. À Superintendência Federal de Agricultura no Paraná em especial aos Fiscais Federais Agropecuários Dra. Maria do Rocio Nascimento, Dr. Luis Gasparetto, Dr. Renato Menon e Dr. Paulo A. Barcellos Franco pela abertura do serviço à realização da pesquisa e aos Agentes de Inspeção Federal Nelson Gonçalves, José Brucinsk, Antonio e Ivonete pelo apoio quando necessário. Ao Agente de Inspeção Federal e Meteorologista Sergio Felipe Viana do Amaral pelo fornecimento dos dados meteorológicos utilizados nesse trabalho. À Prof. Dra. Elizabeth Santin e à Técnica de Laboratório Andreia Bueno da Silva do laboratório da Faculdade de Medicina Veterinária da UFPR pela colaboração e valiosa parceria na execução dos trabalhos. À Técnica de Laboratório Maristela Toledo e à doutoranda Mariana Camargo Lourenço do laboratório da Faculdade de Medicina Veterinária da UFPR, sempre presentes. Ao colega José Roberto de Lalla Júnior pela amizade, pelo incentivo, imensa atenção e competência oferecidos no decorrer deste trabalho. Aos funcionários do setor de Pós Graduação da FMVZ – Carlos Pazini e Maria pela atenção e esclarecimentos quando preciso. À chefe da Divisão de Vigilância Sanitária de Alimentos da Secretaria de Estado da Saúde do Paraná, Karina Ruaro de Paula, por toda amizade, confiança e incentivo na execução deste trabalho. IV Ao chefe da Superintendência de Vigilância em Saúde, Sezifredo Paz e ao chefe do Centro de Vigilância Sanitária Paulo Costa Santana - Secretaria de Estado da Saúde do PR - pela atenção e por possibilitarem o desenvolvimento dos trabalhos de pesquisa. Aos colegas de trabalho da Divisão de Vigilância Sanitária de Alimentos da Secretaria de Estado da Saúde do PR, Noeli Basso, Rose Sega, Pedro P. Pedroso, Silvio A. Brandt, Eliana Scucato e Alfredo Benato e Mariana Sasso, pelo companheirismo, entusiasmo e apoio ao longo desses anos. Aos primos Evandro Forte Lorenzetti Casini, Tiago Forte Lorenzetti Casini e Vanessa Nahsan pela ajuda valiosa nas etapas finais dessa tese. Aos meus irmãos, Sérgio Luiz Prodócimo, Sílvia Ap. Prodócimo Calore e Sílvio José Prodócimo, que mesmo distantes sempre estiveram presentes, torcendo por mim e me apoiando em todos os momentos. Aos meus cunhados Carlos Roberto Calore, Mônica Regina P. Prodócimo, Rita de Cássia Campana Prodócimo e Sylvia Cristina Mosccardi e aos sobrinhos Camila Regina Prodócimo, Carlos Augusto Calore, Felipe M. Beluzzo, Guilherme Luiz Prodócimo, e Thiago César Calore pelo entusiasmo, incentivo e ajuda incondicional. Aos tios e amigos Vera Forte Casini e José Augusto Lorenzetti Casini pelo carinho e pela infinita dedicação. Aos sogros Édio Moscardi e Vilma Forte pelo apoio nos momentos difíceis, pela compreensão e pela imensa dedicação para que esse trabalho pudesse ser concluído. Às amigas Ivany Teixeira de Cais, Andressa Batini Amorim, Letícia Alves, pela força, confiança e ajuda em todos os momentos. À Auxiliar de Inspeção Susmara Desplanches Paes pelo auxílio na coleta das amostras e pela companheirismo demonstrado ao longo do experimento. Aos meus pais Lourdes Sebastian Prodócimo e Lourival Prodócimo pela confiança, ajuda em todos os momentos, orações que tanto me abençoaram e pelo amor incondicional. Ao meu marido Édio Moscardi Júnior pela presença constante para que eu superasse todos os desafios, pelo entusiasmo ao longo de tantos anos me encorajando a seguir em frente, pela dedicação à tudo que pode nos fazer feliz – todo meu amor, todo meu coração... Às minhas filhas Júlia Prodócimo Moscardi e Alice Prodócimo Moscardi, por terem ficado por vezes sem companhia para brincar e ainda assim me presentearem a cada manhã com o mais lindo sorriso que uma mãe pode desejar – todo meu amor, toda minha vida... V A Deus por nos brindar a cada dia com uma nova oportunidade de fazer diferente; Ao meu marido Édio Moscardi Júnior por me encorajar a lutar pelos meus sonhos, pela dedicação sincera e pelo amor infinito que ilumina tudo o que fazemos. Sem ele essa pesquisa jamais poderia ter se realizado; Às minhas filhas Júlia e Alice por serem presentes preciosos na minha vida, razão de tudo o que faço; E aos meus pais Lourdes e Lourival que nunca mediram esforços amando, protegendo e abençoando cada um de seus filhos; DedicoDedicoDedicoDedico VI Nome do Autor: Salésia Maria Prodócimo Moscardi Título: PRESENÇA E TIPIFICAÇÃO DE SALMONELLA spp. NO CONTEÚDO RUMINAL DE BOVINOS PÓS-ABATE COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Dr. José Paes de Almeida Nogueira Pinto Presidente e Orientador Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ – UNESP - Botucatu-SP Prof. Dr. Luiz Carlos de Souza Membro Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ – UNESP - Botucatu-SP Profª. Drª. Andréa Pereira Pinto Membro Departamento de Zootecnia UFC – Fortaleza-CE Prof.Dr. Rogério Salvador Membro Departamento de Patologia Geral UENP – Campus Luiz Meneghel – Bandeirantes-PR Profª.Drª. Thais Heleno Constantino Patelli Membro Departamento de Veterinária e Produção Animal UENP – Campus Luiz Meneghel – Bandeirantes-PR VII LISTA DE FIGURAS Figura 1 Ordenhamento do esôfago para coleta do material ruminal. 36 Figura 2 Coleta do conteúdo ruminal expelido pelo esôfago 36 Figura 3 Figura 4 Prevalência de Salmonella spp. nos lotes avaliados Prevalência de Salmonella spp nos lotes avaliados 37 40 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Número de animais por lote abatido, porcentagem de animais positivos para Salmonella spp. em cada lote avaliado e distância percorrida (Km) dos animais das propriedades até o frigorífico Temperatura media mensal (ºC) durante os meses de coleta Temperatura média (ºC) durante os dias de coleta Valor médio de pH encontrado durante as coletas 41 42 42 43 VIII ABREVIAÇÕES A.G.V: Ácido Graxo Volátil APPCC: Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle ETA: Enfermidade Transmitida por Alimento EUA: Estados Unidos da América pH: Potencial Hidrogeniônico UFPR: Universidade Federal do Paraná IX SUMARIO Página RESUMO xi ABSTRACT xii 1. INTRODUÇÃO 13 2. REVISÃO DE LITERATURA 14 2.1 Salmonella spp. 3. OBJETIVO GERAL 3.1 Objetivo Específico 34 34 4. MATERIAL E MÉTODOS 34 4.1 Planta Frigorífica 34 4.2 Animais 34 4.3 Metodologia de Avaliação 35 4.3.1 Análises microbiológicas 35 4.3.2 Amostragem 35 4.3.2.1 Pesquisa de Salmonella sp. 37 4.3.2.2 Aferição do pH 4.3.2.3 Informações dos lotes 4.3.2.4 Informações sobre temperatura e umidade relativa 38 38 39 5. RESULTADOS 6. DISCUSSÃO 7. CONCLUSÕES 40 44 57 X 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 58 9. TRABALHOS CIENTÍFICOS 68 10. NORMAS PARA PUBLICAÇÃO 85 XI RESUMO PRODÓCIMO-MOSCARDI, S.M. Presença e tipificação de Salmonella spp. no conteúdo ruminal de bovinos pós-abate. Botucatu-SP, 2014. 54p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. O Brasil lidera o ranking de maior exportador de carne bovina no mundo desde 2008. Garantir a segurança microbiológica desses alimentos tem sido um dos principais focos da indústria processadora de carnes. A aplicação de análises nas diversas etapas do processo industrial tem sido vital para implantar e manter programas de autocontrole como o APPCC. Entre as enfermidades mais frequentes causadas pela ingestão de alimentos contaminados, especialmente os de origem animal, destacam-se as salmoneloses, sendo que sua transmissão se dá primariamente pela via fecal oral. Diante disso, esse trabalho teve como objetivo pesquisar a presença de Salmonella spp. em amostras de conteúdo ruminal coletadas durante o abate de bovinos em uma planta frigorífica localizada na região metropolitana de Curitiba - PR. Duzentos e dois animais distribuídos em oito lotes foram avaliados entre os meses de agosto a dezembro de 2013. Ao final do experimento, 37,5% dos lotes mostraram-se positivos para o agente sendo que 2,97% (6/202) das amostras de conteúdo ruminal isolaram o micro-organismo. A totalidade dos animais positivos recebia como alimento apenas pasto de azevém e aveia. Não foi observada a influência de fatores como o estresse do transporte ou temperatura ambiental sobre o isolamento do patógeno. Entretanto a detecção do mesmo sorovar, Salmonella Schwarzengrund na totalidade dos isolamentos nos permite levantar a hipótese de que a contaminação dos animais tenha se dado na própria indústria, a partir das estruturas físicas, responsáveis por conter os bovinos ou conduzi-los ao box de insensibilização. Palavras chave: Salmonella Schwarzengrund, conteúdo ruminal, Salmonella na carne bovina. XII ABSTRACT PRODÓCIMO-MOSCARDI, S.M. Presence and characterization of Salmonella spp. in ruminal contents of cattle post-slaughter. Botucatu-SP, 2014. 54p Doctorate Thesis - School of Veterinary Medicine and Animal Science, Botucatu campus, São Paulo State University. Brazil leads the world ranking of bovine meat exportation since 2008. To ensure the microbiological safety of these food products has been one of the primary focuses of the meat processing industry. The application of analyses on diverse stages of the industrial process has been vital for deploy and keeping of self-control programs like APPCC. Beyond the most frequent diseases caused by the ingestion of contaminated food, specially animal origin ones, the salmonellosis stand out being transmitted primarily via fecal-oral route. In light of this, the work had the objective to research the presence of Salmonella spp. in rumen fluid samples collected during cattle slaughter at a slaughtering plant localized in Curitiba’s metropolitan area. Two hundred animals distributed over eight lots was evaluated between august and december, 2013. At the end of the experiment, 37.5% of the lots were positive for the agent of which 2.97% (6/202) of samples of rumen contents isolated the micro-organism.The total of the positive animals had been feed with ryegrass pastures and oat. Not the influence of factors like transportation stress or environment temperature over pathogen isolation was observed. However, the detection of the same serovar, Salmonella Schwarzengrund on overall insulation allow us to raise the hypothesis that all animal contamination have been given inside the industry itself, from the infrastructure responsible of holding the cattle or conducting it to the stunning box. Keywords: Salmonella Schwarzengrund, rumen fluid, Salmonella on bovine meat. 13 1. INTRODUÇÃO O Brasil lidera o ranking de maior exportador de carne bovina no mundo desde 2008 e as estatísticas apontam para um crescimento nas exportações de 2,15% para os próximos anos (BRASIL, 2013). Estima-se que a produção brasileira cresça 22,5% entre 2013 e 2023. Projeções ainda mais otimistas preveem um aumento de 42,8% no consumo para o mesmo período. Isso considerando apenas o mercado interno que é responsável pelo consumo de 75% do produto nacional (BEEFPOINT, 2013). Garantir a segurança microbiológica desses alimentos tem sido o principal foco da indústria processadora de carnes. Com esse objetivo, a aplicação de análises nas diversas etapas do processo industrial tem sido vital para implantar e manter programas de autocontrole como o APPCC – Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle. A participação dos bovinos como reservatórios de agentes patogênicos é bem conhecida. Entretanto, há necessidade de dados mais específicos relacionados à contaminação que pode ocorrer durante as etapas de produção e/ou processamento (BRICHTA- HARHAY et al., 2007). Registre-se também que são escassas as informações da prevalência de agentes patogênicos específicos nos animais que chegam para o abate. Nos estudos realizados, a pesquisa dos patógenos, especialmente Salmonella spp. tem sido feita basicamente nas fezes, a partir de amostras individuais, colhidas diretamente do reto dos animas, ou em amostras de conjunto, colhidas nos caminhões de transporte ou nos currais de espera, antes do abate (JACOB et al., 2009, LENAHAN et al., 2010). A pesquisa do agente no conteúdo ruminal também tem sido realizada, mas neste caso os dados são muito escassos, embora informações importantes possam ser 14 obtidas a partir de seu encontro nesse tipo de material, já que ele pode ser indicativo das reais condições de criação dos bovinos, seja ela extensiva ou intensiva (DECLAN et al., 2011). Assim, no caso de nosso país, principal exportador mundial de carne bovina, tais dados podem auxiliar na composição de uma base de dados sobre a presença de Salmonella spp. em bovinos criados sob nossas condições, extensivas ou intensivas e, dessa forma, auxiliar no estabelecimento de estratégias que garantam a qualidade sanitária das carcaças, cortes e produtos derivados aqui produzidos. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Salmonella spp. O gênero Salmonella é constituído por duas espécies: Salmonella bongori e Salmonella entérica, esta com seis subespécies. São mais de 2600 sorovares diferenciados por propriedades de aglutinação dos antígenos somáticos O, flagelares H e capsulares Vi. Dentre as espécies e subespécies, Salmonella entérica subespécie entérica é a responsável por mais de 99% das infecções em humanos e animais de sangue quente. Nenhum outro patógeno bacteriano pertencente a uma única espécie mostra tamanha habilidade para infectar diferentes hospedeiros e induzir formas variadas de doença como ela (VELGE et al., 2012). As salmoneloses estão entre as causas mais frequentes de doenças veiculadas por alimentos de origem animal, sendo que a transmissão se dá primariamente pela via fecal oral. A veiculação do agente pode ocorrer através dos alimentos, da manipulação 15 de objetos ou pelo contato com superfícies ambientais igualmente contaminadas (KHAITSA et al., 2007). O gênero é responsável por perdas econômicas consideráveis nos plantéis animais e, no homem, é considerado um dos principais agentes etiológicos das enfermidades transmitidas por alimentos – ETA (POPOFF et al., 2002). Sua presença é uma ameaça à saúde do consumidor e um risco para a economia da indústria da carne. Além disso, a detecção de sorovares patogênicos e invasivos de Salmonella durante o abate de animais, aparentemente saudáveis, é de importância fundamental, uma vez que os produtos contaminados representam sérios riscos à Saúde Pública (WOLDEMARIAM et al., 2005, KALCHAYANAND et al., 2009). Mais de 95% das salmoneloses humanas são de origem alimentar e, entre os alimentos envolvidos na transmissão do agente ao homem, os de origem animal possuem um papel de destaque (JACKSON et al., 1991). Esses agentes têm levado enfermidades aos seres humanos através dos animais destinados à alimentação, a despeito do empenho de muitas indústrias na redução de cargas microbiológicas nas carcaças e produtos cárneos (CALLAWAY et al., 2008). A existência de muitas espécies animais que podem atuar como reservatórios da bactéria, a inespecificidade da grande maioria dos sorovares, o que permite a sua disseminação entre as diversas espécies e os sistemas intensivos de criação cada vez mais empregados no caso de animais de importância econômica, são alguns dos fatores que podem explicar essa participação importante dos alimentos de origem animal na epidemiologia dos surtos de ETA causados por Salmonella spp. (D’AOUST et al., 2001). 16 Ainda que programas de redução de patógenos sobre o processamento dos alimentos estejam sendo bem sucedidos no interior das fábricas, sua eficiência não tem sido capaz de evitar a ocorrência de enfermidades alimentares. Em consequência disso, alguns autores tem conduzido pesquisas buscando estratégias para a redução da carga microbiana nos animais antes mesmo do abate (LENAHAN et al., 2010). Parece claro que os patógenos alimentares estão disseminados dentro das unidades de criação e atuar nesse ponto é o primeiro passo para se buscar o controle dos perigos a que está exposta a saúde pública (DAVIS et al., 2003, REICKS et al., 2007). É necessário que os animais adentrem as indústrias carregando a menor carga de agentes patogênicos como consequência de um controle sanitário efetuado ainda nas fazendas (CALLAWAY et al., 2011). Só assim os riscos representados por agentes zoonóticos carreados pelos animais abatidos poderão ser minimizados. (AL-SAIGH et al., 2004, KALCHAYANAND et al., 2009). Vários são os micro-organismos causadores de enfermidades transmitidas por alimentos e sua origem nas unidades de produção animal é bem conhecida. No entanto, muito pouco se sabe sobre a ecologia desses agentes, principalmente no interior de unidades de confinamento (SMITH et al., 1997, BARKOCY-GALLAGHER et al., 2002). Esse manejo com características próprias de reunir animais de várias regiões em um mesmo local e submetê-los a diversos tipos de alimentos, pode abrigar fontes potenciais de contaminação do rebanho (BARHAM et al., 2002, GREEN et al., 2010). A concentração do gado no ambiente fechado pode facilitar a transmissão fecal oral de bactérias entéricas como Salmonella spp. (WOLDEMARIAM et al., 2005). Além disso, práticas de manejo como o reagrupamento de animais visando a 17 homogeneização dos lotes por peso podem expor animais sadios ao contato com indivíduos infectados fazendo com que a bactéria circule pelo rebanho ao longo de todo o período de confinamento (TABE et al., 2008). Segundo Griffin et al. (1998) é muito difícil estimar a incidência real de Salmonella nos rebanhos confinados, embora relate-se que a porcentagem de animais portadores assintomáticos do agente alcance valores de cerca de 8% nesse tipo de gado. Dados semelhantes foram encontrados por KALCHAYANAND et al. (2009) ao pesquisarem Salmonella em amostras de couro de 256 bovinos estabulados no interior dos EUA. A coleta do material, ainda na fazenda, apresentou uma prevalência de 7% para Samonella spp. Tabe et al. (2008) pesquisaram Salmonella nas fezes retais de 138 novilhos naturalmente infectados na Dakota do Norte – EUA. Um total de 458 amostras foi analisado revelando uma prevalência de 12,7% do agente. Levantamentos anteriores, realizados também nos Estados Unidos, no entanto, apontaram para valores bem mais elevados. Beach et al. (2002b) por exemplo, ao pesquisarem o patógeno em bovinos confinados encontraram uma prevalência de 22,3%, sendo que no gado criado extensivamente ela foi ainda maior, 31,4%. Esses dados mostram claramente que no tocante à contaminação, também não deve ser subestimada a importância assumida por animais criados a pasto. A escolha da unidade amostral a ser trabalhada na pesquisa de salmonelas em bovinos pode ser decisiva no levantamento da prevalência do patógeno. Isso talvez explique a discrepância existente entre os valores encontrados por esses autores. 18 Como exemplo, citamos a pesquisa de Stephens et al. (2007) que ao trabalharem com 50 bovinos confinados na Universidade do Texas – EUA coletaram swabs de seis diferentes pontos do couro dos animais além de amostras da cavidade oral, e fezes diretamente do reto identificando o patógeno em 100% dos animais pesquisados. Para os autores, se a coleta de amostras tivesse sido limitada a apenas um local, certamente a prevalência de Salmonella no lote teria sido subestimada. Kalchayanand et al. (2009) pesquisaram o agente em diferentes pontos do couro de bovinos abatidos nos EUA imediatamente após a sangria. Uma análise de seus dados permite concluir que a coleta de amostras apenas da área do lombo dos animais teria restringido os isolamentos a 39,5% e seria desconsiderada a positividade encontrada de 68,2% das amostras recolhidas da área ventral dos animais. É importante ressaltar a participação de outras espécies domésticas na disseminação dessa bactéria aos bovinos. Pequenos ruminantes confinados destinados à produção de carnes, por exemplo, têm sido identificados como portadores saudáveis desse agente. Woldemariam et al. (2005) pesquisaram a presença de Salmonella em amostras de fezes retais, fígado, baço, músculos abdominais e linfonodos mesentéricos de 47 ovinos e 60 caprinos na Etiópia. O agente foi isolado em 5,1% das amostras analisadas (33/642). Os rebanhos estudados mostraram prevalências de 9,3% para os caprinos e 2,8% para os ovinos. Logo, deve ser considerado que, ao se criar em consórcio, bovinos e outros animais domésticos portadores de Salmonella, fato que também pode ser observado no Brasil, é grande a possibilidade dessas espécies assim criadas compartilharem e disseminarem entre si o mesmo agente patogênico. 19 Do mesmo modo, o período de convívio entre animais sadios e portadores deve ser observado. Alguns autores têm relatado a participação crescente de indivíduos infectados na disseminação de Salmonella a outros integrantes do rebanho. Khaitsa et al. (2007) pesquisaram Salmonella spp. em novilhos confinados durante sete meses na Dakota do Norte, EUA. A positividade das amostras foi crescente e diretamente proporcional ao tempo de permanência dos animais nas baias, variando inicialmente de 0,7% até 62% ao final do experimento. Esses dados concordam com aqueles publicados por Fedorka-Cray et al. (1998) ao observarem que os bovinos confinados por um período menor de tempo apresentaram menor porcentagem de amostras de fezes positivas, 3,5% (88/2482), enquanto que para animais estabulados por períodos maiores, ela foi de 7,4% (185/2495), diferença essa significativa (p < 0,05). Os dados de Table et al. (2008) reafirmam essa influência positiva exercida pelo tempo de contato entre os animais durante o isolamento de Salmonella. Ao acompanharem um grupo de 72 bovinos confinados durante a fase de terminação, por 42 dias, os autores observaram que inicialmente 8,3% deles já eram portadores do patógeno. Ao final do experimento 12% dos animais sadios tornaram-se positivos elevando a prevalência para 20,3%. Os relatos desses autores contrastam com aqueles obtidos anteriormente por Frost et al. (1988) que identificaram um decréscimo no número de amostras positivas para Salmonella spp. no gado estabulado por períodos maiores que 80 dias. Para Fedorka-Cray et al. (1998) essa diferença pode ser atribuída aos diferentes sorovares 20 encontrados nos dois estudos, já que dos 14 identificados por Frost et al. (1988) somente 3 eram comuns a ambas as pesquisas. Como é possível observar, existe grande diferença entre as prevalências relatadas na literatura consultada. Vários fatores podem ter contribuído nesse sentido. Dentre eles, há que se considerar o plano amostral escolhido, o tipo de amostra coletada, a metodologia de isolamento e a própria distribuição das salmonelas dentro dos rebanhos (Woldemariam et al., 2005). Os animais infectados podem apresentar comportamentos diferentes na disseminação do agente patogênico. Enquanto alguns bovinos portadores podem vir a eliminar com frequência Salmonella através de suas fezes, outros o fazem de modo intermitente. Khaitsa et al. (2007) observaram que dentre os 143 novilhos que completaram seu experimento durante as quatro coletas realizadas, em 84 deles o agente foi isolado ao menos uma vez, enquanto 32 animais o fizeram por duas vezes. Dentre os animais infectados, apenas um mostrou-se positivo em três coletas. Em nenhum animal o patógeno foi isolado nas quatro coletas realizadas, mas um deles manteve-se eliminando Salmonella do início ao fim da pesquisa. Os dados desses autores ressaltam a importância de se monitorar individualmente os bovinos a fim de que possam ser identificados portadores assintomáticos. Desta forma, a segregação desses indivíduos poderia evitar que os mesmos atuassem como fontes de contaminação para o restante do grupo. No entanto, este procedimento é muito difícil do ponto de vista prático. 21 O isolamento de diversos sorovares nas várias pesquisas realizadas, bem como a participação dos mesmos como possíveis agentes etiológicos das salmoneloses em humanos, têm sido outro importante ponto de discussão nos trabalhos publicados. No levantamento realizado por Fedorka-Cray et al. (1998) 26 diferentes sorovares foram identificados, sendo os mais comuns: S. Anatun (27,9%), S. Montevideo (12,9%), S. Muenster (11,8%), S. Kentucky (8,2%) e S. Newington (4,3%). Segundo os autores, dos 10 sorovares mais comumente associados com a doença em humanos, somente um, S. Typhimurium, estava entre os 10 principais sorovares presente nas fezes dos bovinos nas unidades de confinamento. Para os autores, tais dados não devem ser tomados como indicativos de que os bovinos não são importantes na disseminação do agente ao homem. Ao contrário, para Fedorka-Cray et al. (1998) é de suma importância a continuidade do monitoramento dos diversos sorovares nas criações animais, já que os mesmos podem vir a emergir como patógenos potenciais ao homem. É o caso, por exemplo, de Salmonella Enteritidis, sorovar pouco implicado em doenças em animais e no homem no passado, mas que a partir da segunda metade da década de oitenta, passou a ser o principal agente das salmoneloses humanas em vários países do mundo, inclusive o Brasil (TAVECHIO et al., 1996, D’AOUST et al., 2001). Dargatz et al. (2000) ao analisarem fezes de conjunto de gado confinado, relataram uma maior prevalência de sorovares do Grupo C1 (33,3%) como Salmonella Mbandaka e Salmonella Montevideo. Segundo os autores, é possível que esse sorogrupo esteja tornando-se melhor adaptado à espécie bovina ou que suas fontes de contaminação se apresentem com maior frequência nos sistemas de confinamento. 22 Beach et al. (2002b) trabalhando com rebanhos confinados e rebanhos criados de forma extensiva, ambos aparentemente sadios, encontraram esses mesmos sorovares contaminando fezes, couro bovino, alimentos e o ambiente de criação dos animais. Destacaram também o isolamento de dois sorovares em gado confinado e quatro na criação extensiva, ambos despontando entre os dez mais implicados em surtos alimentares humanos. Esses dados reforçam a preocupação expressa por Fedorka-Cray et al. (1998) já que demonstram a possibilidade de uma estreita relação entre o consumo de carne bovina e a contaminação por Salmonella spp. no homem. De acordo com Poppe et al. (1998) o isolamento de Salmonella Typhimurium DT 104, a partir de animais e humanos com quadro clínico de salmonelose tem aumentado muito nos últimos anos em vários países como Inglaterra, Estados Unidos e Canadá. Tabe et al. (2008) encontraram Salmonella Typhimurim var. Copenhagem em 53 dos 58 isolamentos realizados sobre bovinos nos EUA. Ainda nos EUA, o mesmo sorovar foi identificado na totalidade das 89 amostras positivas pesquisadas por Khaitsa et al. (2007) em bovinos estabulados. Para esses autores isso não foi uma surpresa, pois os bovinos são comumente fontes de Salmonella Typhimurium. Entretanto, o sorovar encontrado em seu trabalho mostrou ser resistente a antibióticos de uso comum a humanos e animais, demonstrando a necessidade de maior preocupação com esse patógeno, haja vista sua potencial capacidade de impactar a saúde das duas espécies. O trabalho de Woldemariam et al. (2005) identificou 9 sorovares totalizando 33 cepas de Salmonella. O sorovar mais frequentemente isolado foi Salmonella Infantis (45,5%) seguido por Salmonella Butantan (24,2%), Salmonella Braenderup e 23 Salmonella Kingabwa, ambas com 6,1%. Outros sorovares identificados foram Salmonella Hadar, Salmonella Zanzibar, Salmonella Typhimurium, Salmonella Kottbus e Salmonella Anatum (3,0% cada). Para esses autores a detecção de sorovares patogênicos e invasivos como Salmonella Infantis e Salmonella Typhimurium em pequenos ruminantes, aparentemente saudáveis e destinados à alimentação humana, servem de alerta à Saúde Pública, pois suas carnes e derivados podem estar contaminados. Os dados desses pesquisadores chamam a atenção para o isolamento de dois sorovares que, até então, eram inéditos na Etiópia - Salmonella Kingabwa e Salmonella Zanzibar. Como observado, o isolamento de Salmonella spp. das fezes de animais tem sido documentado por vários autores. Ressalta-se com isso, a importância em se monitorar animais clinicamente sadios, criados a pasto ou terminados em confinamentos, para que sorovares emergentes e fontes diversas de contaminação possam ser identificadas e controladas. É evidente a necessidade de maior atenção para as contaminações cruzadas nas linhas frigoríficas (McEVOY et al., 2003, WOLDEMARIAM et al., 2005). A influência da época do ano sobre a prevalência do patógeno nos rebanhos também tem sido objeto de vários estudos. De modo geral, os autores têm observado uma maior prevalência do agente durante os meses quentes do ano ou ainda, naquelas regiões mais quentes durante uma mesma estação (FEDORKA – CRAY et al., 1998, LOSINGER et al., 1997, PUYALTO et al., 1997, DONKERSGOED et al., 1999, DARGATZ et al., 2000, BACON et al., 2002, BARKOCY-GALLAGHER et al., 2003, 24 McEVOY et al., 2003, MOSCARDI -JR et al., 2003 a, 2003 b, 2005, RIVERA- BETANCOURT et al., 2004). Khaitsa et al. (2007) destacaram em seu trabalho a interferência favorável das alterações climáticas na disseminação de Salmonella. Para os autores as temperaturas baixas mantém a viabilidade do patógeno nas fezes permitindo que novas infecções ocorram com a chegada de estações mais quentes. Além disso, esses pesquisadores observaram que na primavera as baias mostravam-se enlameadas como consequência do degelo do inverno anterior. Isso teria favorecido a disseminação de células viáveis de Salmonella entre os animais do experimento, uma vez que dentre eles havia um bovino eliminando o patógeno através das fezes. No levantamento de Cummings et al. (2010) os autores estudaram a prevalência de Salmonella em amostras de gado de leite e no ambiente. Os dados revelaram que a prevalência do patógeno em ambos os tipos de amostras variava a cada estação e aumentava conforme a temperatura se elevava. Declan et al. (2011) inocularam cepas de Salmonella em amostras de fezes incubadas a 6º C e a 15ºC em condições iguais de pH. Durante o período de incubação os autores acompanharam a viabilidade das células inoculadas. Após sete dias, foi possível identificar maior número de bactérias nas amostras incubadas a 15 º C. Para os autores a sazonalidade pode ter interferência direta sobre o micro-organismo nas fezes. A alimentação oferecida aos animais é outro ponto estudado como possível fonte de contaminação por Salmonella spp. Vários autores têm sugerido que a dieta pode ser usada para manipular a composição dos ácidos graxos voláteis – AGV e o pH do 25 rúmen. Entretanto os relatos são conflitantes sobre qual seria o alimento ideal capaz de reduzir a eliminação de agentes patogênicos nas fezes (DECLAN et al., 2011). Beach et al. (2002a, 2002b) citam que a dieta a que são submetidos os bovinos estabulados (altamente proteica e energética), em consequência da produção de grandes quantidades de AGV, poderia tornar o rúmen desses animais menos favorável ao desenvolvimento de Salmonella spp. devido a variações de pH intra-ruminal, fato que ocorreria em menor escala na criação a pasto. Do mesmo modo, a ausência de ingesta pela privação de alimentos não forneceria ao rúmen os substratos para a produção de AGV resultando em menor acidez ruminal beneficiando a recuperação das células do patógeno em seu conteúdo (Mc-EVOY et al., 2003). Dados contrastantes foram encontrados por Declan et al. (2011) ao analisarem amostras de fezes e líquido ruminal de 5 vacas com fístulas ruminais submetidas a 5 diferentes dietas. Durante o experimento as amostras foram artificialmente inoculadas com cepas de Salmonellas objetivando estudar o papel do pH e das concentrações de AGV na sobrevivência dos agentes. Segundo os autores, tanto pH como AGV não influenciaram na recuperação das cepas inoculadas sobre o líquido ruminal que foi baixa. O mesmo não ocorreu com amostras inoculadas em fezes, que se mostraram favoráveis ao crescimento e sobrevivência da bactéria. Esse trabalho sugere que as condições do ambiente ruminal para o desenvolvimento de Salmonella independem da dieta bovina, podendo ainda haver uma adaptação das cepas favorecendo sua sobrevivência quando no ambiente abomasal, com uma consequente recuperação melhor nas fezes. Entretanto, o experimento de Declan et al. (2011) se deu in vitro. Em condições naturais, talvez, os achados fossem 26 diferentes. De qualquer forma, estes autores ressaltam ainda a necessidade de práticas de gestão de resíduos agrícolas que possam restringir a disseminação dos agentes no ambiente. Diante dessa preocupação, alguns pesquisadores têm focado seus trabalhos na busca de propriedades antibióticas naturalmente presentes em alguns alimentos. A diminuição da microbiota patogênica através de derivados cítricos, por exemplo, é um conceito simples, que provavelmente seria visto pelo consumidor como uma “solução verde” para aumentar a segurança de alguns alimentos (CALLAWAY et al., 2008). Esses subprodutos da indústria da laranja vêm sendo empregados na alimentação de rebanhos devido ao baixo custo de sua aquisição e alto nível nutricional. Dentre suas propriedades a atividade antimicrobiana dos óleos cítricos tem chamado a atenção (LENAHAN et al., 2010, CALLAWAY et al., 2011). No experimento de Callaway et al. (2011) três grupos de ovelhas foram alimentados com diferentes dietas contendo 0, 10 e 20% de derivados cítricos durante 7 dias. Posteriormente esses animais foram inoculados com Salmonella Typhimurium. Suas fezes foram coletadas 24 h pós-inoculação, seguindo-se o abate – 96 h pós- inoculação - e coleta de conteúdo e tecido ruminal, cecal e do reto, que foram submetidos à análise. Os dados revelaram que os animais que receberam 10% de derivados cítricos em sua ração apresentaram menor isolamento do agente comparado àqueles que não foram alimentados com polpa cítrica ou que receberam 20%. Para esses últimos o excesso de polpa cítrica na dieta reduziu sua palatabilidade e consequente ingestão, interferindo negativamente nas propriedades bactericidas dos óleos cítricos. Esses pesquisadores sugerem que a utilização de produtos cítricos na 27 dieta animal em períodos que antecedem o carregamento e abate dos animais pode ser uma estratégia a ser usada na redução de Salmonella nos animais destinados a alimentação humana. Do mesmo modo, o isolamento de Salmonella spp. em amostras de alimentos antes do seu fornecimento aos animais é um indicativo do risco a que esse grupo está sujeito, uma vez que as quantidades amostradas são ínfimas quando comparadas aos grandes silos em que se encontram estocados (DAVIS et al., 2003). A verificação da qualidade higiênico-sanitária da ração animal é medida de controle na veiculação de patógenos, já que ela se constitui em parte integrante da cadeia alimentar, estendendo- se do sistema de produção até o consumidor (DOS SANTOS et al., 2000). Durand et al. (1990) identificaram Salmonella spp. em farinhas de origem animal (carne, ossos, carcaças, peixes e sangue) em porcentagens que variaram de 6,85% a 14,62%. Fato semelhante foi observado no trabalho de Losinger et al. (1997) que verificaram uma associação estatisticamente significativa entre o isolamento de Salmonella spp. nas fezes e o tipo de alimento oferecido aos animais no período de sete dias antes da colheita de amostras para análise (p < 0,05). Caroço de algodão, casca de algodão e sebo bovino foram os alimentos implicados (LOSINGER et al., 1997). Moscardi-Jr. et al. (2003a, 2003b), trabalhando com animais confinados no interior de São Paulo, identificaram Salmonella spp. no caroço de algodão que era servido aos bovinos e também em amostras de fezes e carcaças desses animais abatidos, vindo posteriormente em 2004, a recuperar o agente em outro constituinte da ração, o núcleo mineral proteico (dados não publicados). Após a sorotipagem das 28 cepas isoladas, Moscardi-Jr et al. (2005) verificaram a presença do mesmo sorovar Salmonella Tennessee nas amostras de caroço de algodão, fezes e carcaças, indicando uma possível correlação entre o isolamento da bactéria no alimento e sua recuperação nas fezes e carcaças dos animais. Tais resultados reforçam a importante participação que a alimentação, seja ela de origem animal ou vegetal, possui como fonte de infecção para os rebanhos, como já demonstrado em trabalhos anteriores (BERCHIERI et al., 1984, DURAND et al., 1990). Importância ainda maior assumem aqueles patógenos que requerem um número pequeno de células para desencadearem infecção e estão sendo isolados de quantidades pouco representativas de determinadas amostras de alimentos (DAVIS et al., 2003 ). Cabe salientar que a inoculação oral de Salmonella Typhimurium em gado confinado mostrou que a disseminação do agente ocorre de maneira rápida no rebanho e que parte dos animais permaneceu excretando-o pelas fezes por até 71 dias após o início do experimento (CLINTON et al., 1981). Esses dados concordam com aqueles encontrados por Tabe et al. (2008) que observaram um aumento na prevalência de Salmonella no rebanho ao longo de 42 dias de experimento. Esses autores encontraram positividade em 8,3% dos bovinos analisados no início do experimento. Ao final do período de estabulação estes valores atingiram 20,3% sendo que em 53 das 58 positivas isolou-se Salmonella Typhimurium. A participação de animais que atuam como vetores na disseminação do agente em ambientes de criação também é outro fator importante a ser considerado. Na cadeia produtiva de frangos de corte, por exemplo, Jones et al. (1991) pesquisaram o agente 29 em insetos e roedores capturados em diferentes locais, isto é, avozeiros, incubatórios, galpões de criação, tendo isolado Salmonella spp. em 13% dos insetos e 5,3% dos roedores. Dados semelhantes foram citados por Letellier et al. (1999) que verificaram a presença do patógeno em instalações de suínos no Canadá. Em relação a instalações destinadas a bovinos de corte, não dispomos de tais dados, mas as condições que propiciam o aparecimento de tais animais no caso das aves e suínos são muito semelhantes às encontradas para os bovinos. Outro ponto relevante relacionado à contaminação dos lotes de animais por Salmonella refere-se ao estresse sofrido pelos mesmos durante o transporte em caminhões no trajeto das fazendas de criação até o frigorífico. Vários autores têm observado um aumento da eliminação do patógeno através das fezes, por portadores assintomáticos, contribuindo para a contaminação do couro dos demais indivíduos do lote (PUYALTO et al., 1997, BACON et al., 2002, BARHAM et al., 2002, BEACH et al., 2002 a , SORENSEN et al., 2002, REICKS et al., 2007). São muitas as características de transporte e estabulação que podem influenciar na presença de Salmonella no couro do gado de corte, mas o contato direto entre bovinos sadios e infectados, sob condições estressantes, merece destaque. O próprio estado de agitação em que se encontram os animais pode auxiliar na disseminação das bactérias pelo ambiente (WOLDEMARIAM et al., 2005, DEWELL et al., 2008). Como estratégia de prevenção contra esses riscos microbiológicos, tem se praticado o jejum de sólidos pré-abate a fim de que mesmo havendo eventuais acidentes dentro da sala de matança durante a evisceração dos animais, a 30 contaminação seja a menor possível. Entretanto, Pointon et al. (2012) pesquisaram o efeito dessa prática sobre a contaminação fecal quando esta era realizada antes mesmo do transporte dos animais até o frigorifico. Os dados encontrados são contrastantes. Se por um lado a privação de alimentos reduz a defecação animal e a presença de sujidades sobre o couro favorecendo a esfola higiênica, por outro, a ausência de alimento no rúmen diminui a produção de AGV elevando o pH e propiciando o desenvolvimento de bactérias entéricas como Salmonella. Para esses autores o intervalo entre 24 e 48 h de jejum pré-transporte seria o ideal para compensar as duas situações e reduzir a contaminação sobre o couro Para Reicks et al. (2007) a poeira e sujidades encontradas em pontos de contenção, carregamento ou manejo de bovinos, tanto nas áreas de criação como nos frigoríficos, devem ser consideradas também fontes de contaminação para o couro dos animais, podendo resultar em contaminação cruzada durante a insensibilização e sangria. Assim, manter a higiene de abate é de fundamental importância uma vez que a disseminação fecal de patógenos de caráter zoonótico pelos animais está fortemente correlacionada com os riscos de contaminação das carcaças (Al-SAIGH et al., 2004). Em acordo com esses autores, Rivera-Betancourt et al. (2004) citam que a superfície de cobertura muscular dos animais abatidos é naturalmente estéril e pode tornar-se contaminada através do contato com o couro durante sua remoção. Logo existe um risco microbiológico real como evidenciado por Barkocy-Gallagher et al. (2003) que ao analisarem amostras de couro, fezes e carcaças, encontraram uma positividade de 71,0% para Salmonella spp. em 1066 amostras de couro pré-abate, havendo maior correlação entre o couro e as carcaças contaminadas em comparação 31 ao couro e amostras de fezes positivas. Esses mesmos autores ressaltam a participação do couro bovino como fonte principal de disseminação de patógenos para a carcaça no momento da esfola. Diante desses dados, é possível observar que a etapa da esfola é uma das principais fontes de contaminação cruzada para carcaças no interior de plantas frigorificas (DONKERSGOED et al., 1999, REID et al., 2002, McEVOY et al., 2003). Determinar a prevalência de Salmonella spp na superfície do couro antes da entrada dos animais nos estabelecimentos frigoríficos serviria como indicativo da potencial contaminação a que as demais carcaças, já esfoladas, estariam sujeitas (Bacon et al., 2002). Como observado, várias são as fontes e os fatores que podem levar à contaminação dos bovinos de corte por Salmonella e, posteriormente, de suas carcaças durante a obtenção da carne bovina. Neste sentido, medidas devem ser tomadas em todos os elos da cadeia de produção da carne para que o produto chegue ao mercado consumidor livre desse importante patógeno. Além disso, a possibilidade de transmissão de Salmonella spp. através da cadeia alimentar não pode ser desconsiderada especialmente em carnes cruas, defumadas ou levemente cozidas e subprodutos cárneos (MEYER et al., 2010). A literatura consultada mostra que a rota mais comum para a contaminação de carcaças e ambientes tem como via principal a eliminação das bactérias através das fezes. Acrescenta ainda que o rúmen é um reservatório de patógenos potenciais recolonizadores do trato intestinal. Diante disso, se as populações de Salmonella 32 pudessem ser reduzidas ainda em seu interior, isso aumentaria as chances de sucesso das medidas aplicadas para o controle desse agente (CALAWAY et al., 2008). Com base nessas informações, alguns autores têm estudado o perfil microbiológico e físico-químico do conteúdo ruminal e o seu papel na disseminação de Salmonella. Os dados levam a concluir que os alimentos podem ser usados para manipular a composição de AGV e pH ruminais e consequentemente interferir na sobrevivência desses micro-organismos. Contudo não é possível identificar um consenso entre os trabalhos consultados sobre qual seria a dieta ideal capaz de reduzir a eliminação fecal de patógenos (MATTILA et al., 1988, Mc-EVOY et al., 2003, LENAHAN et al., 2010, DECLAN et al., 2011, CALLAWAY et al., 2008/2011, Pointon et al., 2012). Em nosso país, no entanto, apesar de ser ele atualmente o principal produtor mundial de carne bovina, ainda são escassos os dados relativos à prevalência de Salmonella spp nesse produto. No caso do gado confinado, dados resultantes do projeto de pesquisa desenvolvido por Moscardi Jr. et al. (2005), financiado pela FAPESP (Proc. nº 02/11146-1), indicaram uma prevalência de 6,66% dentre os 60 animais analisados e 1,24% dentre as 322 amostras de fezes obtidas desses animais, todos estabulados por um período médio de 6 meses. O trabalho desenvolvido por esses autores foi realizado em uma unidade de confinamento experimental, sob condições ideais de manejo e sanidade dos lotes estabulados. Nesse sentido, torna-se importante realizar estudos adicionais que contemplem rebanhos criados sob condições naturais, confinados ou a pasto, haja vista que no Brasil poucas são as informações sobre a prevalência de Salmonella spp. em 33 bovinos, tanto aqueles criados extensivamente como os submetidos a regimes de confinamento. Torna-se interessante ainda que a pesquisa do patógeno se dê no conteúdo ruminal, pois nos trabalhos realizados em nosso país onde se procurou detectar Salmonella nos animais destinados ao abate, a pesquisa do agente se deu nas fezes e no couro. Os dados obtidos no presente trabalho poderão contribuir para um melhor entendimento do papel desse agente na criação dos bovinos sob nossas condições, haja vista a importância do Brasil no mercado produtor de carne bovina. 34 3. OBJETIVO GERAL Pesquisar a presença de Salmonella spp. em bovinos abatidos no estado do Paraná. 3.1 OBJETIVO ESPECÍFICO Pesquisar e, quando presentes, identificar quanto ao sorovar as cepas de Salmonella detectadas no conteúdo ruminal de bovinos; Discutir eventuais fatores associados à detecção do patógeno nas amostras avaliadas. 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Planta frigorífica A indústria em que as amostras foram coletadas localizava-se na região metropolitana de Curitiba – PR e realizava o abate diário de 500 bovinos, em média. A planta e os animais ficavam sob a responsabilidade do Serviço de Inspeção Federal (SIF). 4.2 Animais Os bovinos eram adquiridos de propriedades dentro do estado do Paraná e transportados até a planta frigorífica por caminhões boiadeiros com capacidade para 20 animais cada. Ao chegarem ao frigorífico eram alojados em currais para realização do descanso, dieta hídrica e jejum precedendo-se a seguir ao abate. 35 Durante o processo de matança os lotes eram aleatoriamente escolhidos para coleta de amostras anotando-se a identificação de cada bovino para posterior levantamento de informações sobre os animais. 4.3 Metodologia de Avaliação Para a realização das análises microbiológicas foram utilizados 202 animais, não tendo sido levado em consideração os parâmetros raça, idade ou sexo. 4.3.1 Análises microbiológicas Foram realizadas quatro coletas entre os meses de agosto e dezembro de 2013. Um dia por mês eram recolhidos da linha de abate 50 amostras de conteúdo ruminal. Em apenas uma das visitas ao frigorífico foram coletadas 52 amostras. 4.3.2 Amostragem Porções do conteúdo ruminal eram recolhidas do rumem de cada bovino imediatamente após sua despança durante o abate. Com o auxílio de dois colaboradores com mãos enluvadas, realizava-se a ordenha do órgão até que o mesmo expelisse conteúdo pela abertura esofágica (Figura 1). Esse material era recolhido em coletores universais estéreis com capacidade média de 80 mL cada (Figuras 2 e 3), sendo identificados com a posição dos animais na escala de abate e armazenados sob refrigeração em caixa isotérmica. 36 Figura 1: Ordenhamento do esôfago para coleta do material ruminal Figura 2: Coleta do conteúdo ruminal expelido pelo esôfago 37 Figura 3: Coletor universal para coleta de aproximadamente 80mL de amostra Ao final dos trabalhos diários as amostras eram transportadas até o laboratório da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal do Paraná onde ocorria a aferição do pH e realização das análises microbiológicas. 4.3.2.1 Pesquisa de Salmonella sp. Foi utilizada a metodologia preconizada por ANDREWS et al. (1998). As amostras de conteúdo ruminal (25 mL), foram transferidas para frascos contendo 225 mL de água peptonada tamponada 1%, e incubadas a 35ºC por 24h (etapa de pré-enriquecimento). O enriquecimento seletivo foi realizado utilizando-se 2 caldos: Rappaport- Vassiliadis (RV) e Tetrationato (TT). Das amostras pré-enriquecidas, foram 38 transferidos 0,1 mL e 1 mL para tubos contendo 10 mL de RV e TT respectivamente. A seguir, partindo de cada um dos caldos de enriquecimento seletivo, procedeu- se a semeadura em placas de ágar seletivo para Salmonella: ágar BS (Sulfito de Bismuto) e ágar XLD (Xilose Lisina Desoxicolato), que foram incubadas a 35ºC por 24h. Três a cinco colônias suspeitas de cada placa foram repicadas pata tubos contendo Tríplice Açúcar Ferro (TSI) e Lisina Ferro Agar (LIA), que foram incubados a 35ºC por 24h. A partir dos tubos que apresentaram reação característica para Salmonella, foi realizada a prova de soroaglutinação em lâmina, empregando-se anti-soro polivalente flagelar e somático (Probac, São Paulo). Amostras positivas nesse teste foram caracterizadas bioquimicamente através do sistema API 20E (BioMerieux, França). As cepas caracterizadas como Salmonella sp. foram enviadas à FIOCRUZ no Rio de Janeiro para sorotipagem. 4.3.2.2 Aferição do pH (potencial hidrogeniônico) A aferição do pH das amostras ocorreu imediatamente após retirada da alíquota destinada ao pré-enriquecimento. A técnica utilizada foi de acordo com as normas de utilização do fabricante do pHmetro - LABMOR. 4.3.2.3 Informações dos lotes: De acordo com a Padronização de Técnicas, Instalações e Equipamentos para a inspeção de carnes em bovinos as carcaças eram identificadas com carimbo 39 no peito e na pleura trazendo o número do bovino abatido, seu respectivo lote e a data do abate. Através desses dados e das informações presentes nas Guias de Trânsito Animal era possível identificar a origem dos bovinos e sua propriedade. Era então realizado contato telefônico com o proprietário dos animais onde se obtinham detalhes a respeito do manejo de criação e da dieta fornecida aos lotes. 4.3.2.4 Informações sobre temperatura e umidade relativa Esses dados foram obtidos através de consulta on line ao site www.weatherundergroud.com acessado em 07/01/2014. 5. RESULTADOS: Ao final dos trabalhos foram analisadas 202 amostras de conteúdo ruminal sendo que em seis delas investigados, três deles (37,5%) mesmo dia de coleta e no mês de outubro composto por 20 animais, dos quais três (15%) também com 20 bovinos, o agente pôde ser isolado em dois deles (10%) enquanto que no terceiro, com 10 animais, Todas as cepas foram identificadas Figura 4: Prevalência As distâncias entre as propriedades e o frigorífico 468 km sendo que os bovinos positivos ficaram assim distribuídos: três isolamentos para a propriedade mais próxima (70 km) dois isolamentos para 200 km e um para 302 km (Figura 5). 37,5% Ao final dos trabalhos foram analisadas 202 amostras de conteúdo ruminal sendo que em seis delas (2,97%) isolou-se Salmonella spp. Dentre os oito lotes investigados, três deles (37,5%) mostraram-se positivos para o patógeno no mês de outubro (Figura 4). O primeiro lote positivo era composto por 20 animais, dos quais três (15%) foram positivos também com 20 bovinos, o agente pôde ser isolado em dois deles (10%) enquanto que animais, em apenas um animal isolou-se Salmonella identificadas como Salmonella. Schwarzengrund Prevalência de Salmonella spp nos lotes avaliados ncias entre as propriedades e o frigorífico variaram 468 km sendo que os bovinos positivos ficaram assim distribuídos: três isolamentos para a propriedade mais próxima (70 km) dois isolamentos para 200 km e um para 302 62,5% lotes negativos (5/8) lotes positivos (3/8) 40 Ao final dos trabalhos foram analisadas 202 amostras de conteúdo ruminal, spp. Dentre os oito lotes se positivos para o patógeno, todos no . O primeiro lote positivo era positivos. No segundo lote, também com 20 bovinos, o agente pôde ser isolado em dois deles (10%) enquanto que Salmonella spp. (10%). . Schwarzengrund. avaliados variaram de 70 km a 468 km sendo que os bovinos positivos ficaram assim distribuídos: três isolamentos para a propriedade mais próxima (70 km) dois isolamentos para 200 km e um para 302 Figura 5: Quantidade de animais por lote abatido, Salmonella spp. em cada lote avaliado e distância percorrida (Km) propriedades e o frigorífico Quanto à alimentação fornecida aos animais, duas delas faziam recria em pastagens de média por 90 dias (silagem de milho planta + ração peletizada). Três os animais de pastagens de confinamento em média por 75 dias (silagem de cevada farelo de soja e núcleo mineral). As três outras restantes concluíam em pastagens consorciadas de azevem com aveia fornecendo sal mineral livremente no cocho. Nestes três últimos Salmonella. Durante os dias de coleta a temperatura (Tº) e umidade relativa (UR) do ar apresentaram as seguintes características - coleta em 26 agosto de 2013: Tº 10º ; UR 99% qtde bov/lote nº bovinos infectados distancia (km) d is tâ n ci a de animais por lote abatido, número de animais spp. em cada lote avaliado e distância percorrida (Km) Quanto à alimentação fornecida aos animais, das oito propriedades avaliadas, faziam recria em pastagens de azevém e aveia e confinavam os animais em média por 90 dias (silagem de milho planta + ração peletizada). Três os animais de pastagens de Brachiaria brizanta e finalizavam a engorda por confinamento em média por 75 dias (silagem de cevada + milho moído + triguilho + farelo de soja e núcleo mineral). As três outras restantes concluíam em pastagens consorciadas de azevem com aveia fornecendo sal mineral livremente no três últimos lotes foram detectadas as amos Durante os dias de coleta a temperatura (Tº) e umidade relativa (UR) do ar apresentaram as seguintes características (Figuras 6 e 7): coleta em 26 agosto de 2013: Tº 10º ; UR 99% 0 50 100 150 200 250 300 350 lote 1 lote 2 qtde bov/lote 20 20 nº bovinos infectados 3 2 distancia (km) 70 200 41 de animais infectados por spp. em cada lote avaliado e distância percorrida (Km) entre as das oito propriedades avaliadas, azevém e aveia e confinavam os animais em média por 90 dias (silagem de milho planta + ração peletizada). Três outras retiravam e finalizavam a engorda por + milho moído + triguilho + farelo de soja e núcleo mineral). As três outras restantes concluíam a recria e engorda em pastagens consorciadas de azevem com aveia fornecendo sal mineral livremente no foram detectadas as amostras positivas para Durante os dias de coleta a temperatura (Tº) e umidade relativa (UR) do ar lote 3 10 1 302 - coleta em 23 setembro de 2013: Tº - coleta em 21 outubro de 2012: Tº 22º C ; UR 73% - coleta em 03 dezembro de 2013: Tº 23º ; UR 64% Figura 6: Temperatura media mensal Figura 7: Temperatura média 0 5 10 15 20 25 T e m p e ra tu ra período de coleta 10 14 26.08 23.09 Temperatura Temperatura Temperatura Temperatura coleta em 23 setembro de 2013: Tº 14º C ; UR 94% coleta em 21 outubro de 2012: Tº 22º C ; UR 73% coleta em 03 dezembro de 2013: Tº 23º ; UR 64% : Temperatura media mensal (ºC) durante os meses de colet : Temperatura média (ºC) durante os dias de coleta período de coleta Temperatura Média Mensal 22 23 23.09 21.10 03.12 Temperatura Temperatura Temperatura Temperatura ---- diáriadiáriadiáriadiária Temperatura 42 durante os meses de coleta Quanto ao pH do material analisado neutralidade em todas as amostras os valores de 6,98 e 7,32 respectivamente Figura 8: valor médio de pH agosto pH (média) 7,29 6,8 6,9 7 7,1 7,2 7,3 7,4 p H R u m in a l - m é d ia Potencial Hidrogeniônico Quanto ao pH do material analisado, o mesmo mostrou neutralidade em todas as amostras, apresentando como menor e maior média mensal os valores de 6,98 e 7,32 respectivamente (Figura 8). valor médio de pH encontrado durante as coletas setembro outubro dezembro 7,32 7,25 6,98 Potencial Hidrogeniônico - pH 43 o mesmo mostrou-se dentro da apresentando como menor e maior média mensal pH 44 6. DISCUSSÃO A aferição do ph do conteúdo ruminal dos animais revelou, de modo geral, valores dentro da neutralidade. Isto ocorreu mesmo nas amostras provenientes de animais de propriedades onde a alimentação fornecida era à base de forragens (aveia e azevém), sendo que eram esperados valores mais baixos que os encontrados. Valores ainda menores deveriam ter sido identificados nas cinco propriedades onde os animais eram alimentados com dietas ricas em grãos. Potencialmente essa dieta elevaria a quantidade de ácidos graxos voláteis no rumem consequentemente reduzindo seu pH, diferentemente do observado. (LENAHAN et al., 2010). O trato digestivo bovino é adequado à fermentação de amido e açúcares a partir de plantas fibrosas que são degradadas por fungos, protozoários e bactérias presentes no rumem. Sua fisiologia é ditada pela presença dessas fibras. Quando os animais são submetidos a dietas pobres em fibras e ricas em grãos, o processo digestivo ocorre de forma adversa, gerando acúmulo de ácidos graxos voláteis que reduzem o pH local. Isso torna o ambiente inóspito à microbiota reduzindo a excreção de patógenos nas fezes (SHANKS et al.,2011). Os dados encontrados em nosso trabalho contrastam com aqueles encontrados na literatura consultada. Declan et al. (2011) avaliaram o pH do liquido ruminal e das fezes de bovinos submetidos a cinco diferentes dietas: somente capim, capim e concentrado, silagem de capim, apenas feno e silagem de milho com concentrado. Esta última, rica em grãos, apresentou menor pH que as anteriores (5,77). As dietas de capim (6,19) e capim com concentrado (6,11) resultaram em conteúdos ruminais mais ácidos que as dietas de silagem de capim (6,61) e apenas feno (6,54). Quanto aos 45 valores de pH fecal, não foram encontradas diferenças significativas. Para os autores o pH identificado na dieta rica em grãos está relacionado à quantidade de amido e açucares facilmente fermentáveis. Valores de pH semelhantes aos anteriores também foram também encontrados por Lenahan et al. (2010) ao analisarem o conteúdo ruminal de bovinos alimentados com dietas que variaram desde o fornecimento de somente capim até a alimentação com silagem adicionada de concentrados. Para os pesquisadores a dieta pode alterar a composição dos AGV e o pH ruminal, mas o grau desta alteração dependerá do tipo do alimento fornecido. Entretanto, os autores reconhecem que o comportamento apresentado pelo liquido ruminal durante seu experimento, não deveria ser considerado como regra uma vez que os testes realizados se deram in vitro. Para Lenahan et al. (2010), a raça e a idade dos animais, bem como a presença de microbiota competidora, além de características químicas do rumem em momentos diferentes da digestão, condições somente encontradas in vivo, poderiam alterar os resultados observados. Também podemos levantar a hipótese de que a neutralidade observada no pH das amostras das oito propriedades de nosso estudo talvez seja resultante da distância das mesmas até o frigorífico. Apenas uma fazenda estava a mais de três horas de viagem até a indústria. Todas as outras eram mais próximas. Logo, pode-se deduzir que o jejum de sólidos tenha se iniciado ainda nas unidades de produção, previamente ao carregamento dos bovinos. Essa pratica já citada por Pointon et al. (2012) objetiva minimizar a excreção fecal pelos animais durante o transporte, evitando assim, eventuais sujidades sobre o couro e reduzindo as possibilidades de contaminação cruzada durante a esfola dos 46 bovinos no frigorifico. Em nosso entendimento isso justificaria os índices de neutralidade do pH encontrados no conteúdo ruminal dos animais confinados concorrendo para os três isolamentos identificados. Assim, dentro dessa hipótese, é possível considerar, ainda em acordo com Pointon et al. (2012) que assim como haveria redução na excreção de fezes por pouca ingesta, aquela por sua vez, seria potencialmente mais contaminada. Logo, uma eventual presença de Salmonella no interior do rumem teria sua multiplicação viabilizada pela baixa produção de ácidos graxos voláteis. Esses relatos concordam com os dados encontrados por Declan et al. (2011). Estes autores sugerem que a existência de condições brandas presentes no conteúdo ruminal seriam capazes de causar alterações na expressão genética das cepas de Salmonella resultando no aumento de sua resistência a ambientes mais ácidos. Isso favoreceria o transito dos micror-organismos pelo abomaso auxiliando ainda na sua eliminação através das fezes dos indivíduos infectados. Baseado nesses relatos é possível levantar a hipótese que os animais positivos identificados em nosso estudo poderiam também ter excretado Salmonellas através das fezes, vindo a contaminar não somente outros indivíduos, mas também as estruturas de contenção e transito pertencentes ao frigorífico. Diante dessas possibilidades e, considerando que nosso experimento baseou-se na análise do conteúdo ruminal, não tendo como objetivo investigar a presença de Salmonella spp. nas fezes, alimentos ou outros tipos de amostras, é possível sugerir que a prevalência do agente nos bovinos analisados tenha sido subestimada. 47 Stephens et al. (2007) relatam que outras unidades amostrais devem ser exploradas, pois a determinação de variados pontos de coleta é fundamental para se determinar a prevalência de Salmonella nos bovinos. Esses autores demonstraram que ao trabalharem apenas com amostras de fezes retais estariam subestimando a real positividade dos animais analisados. Ao incluírem em sua pesquisa amostras de swabs de couro, coletadas próximas ao jarrete e períneo, os isolamentos da bactéria elevaram-se de 50 para 96%, levando-os a concluírem que o tipo e a localização da amostra são parâmetros críticos a serem considerados quando da determinação da prevalência de Salmonella spp em rebanhos confinados. Os lotes em que o micro-organismo foi isolado em nosso experimento eram constituídos por poucos animais. Os dois primeiros, pela ordem de abate do dia, continham 20 animais cada e neles foi isolado o agente em 15% e 10% deles, respectivamente. Um terceiro com 10 animais apresentou apenas um bovino positivo (10%). É importante observar que o número de bovinos que participaram do experimento representa apenas uma parcela do total de animais presente em suas unidades de criação. Assim, ao citarmos tais prevalências, fazemos referencia aos grupos abatidos no dia da coleta. Não se pode descartar a hipótese de outros animais positivos serem encontrados também nas fazendas de origem. Cabe ressaltar que prevalências iniciais bem menores que as encontradas em nosso estudo chamaram a atenção de Khaitsa et al. (2007) ao pesquisaram Salmonella nas fezes individuais de 144 novilhos distribuídos por 24 baias de confinamento na Dakota do Norte - USA. Na chegada dos animais às instalações, esses autores identificaram que em apenas um deles (0,7%) o agente havia sido isolado. Entretanto, 48 após seis meses de estabulação, esse número já havia se elevado para 89 animais (62% do rebanho), contaminando 22 das 24 baias ocupadas. Isso evidencia a capacidade do patógeno de sustentar sua infecção no hospedeiro e intermitentemente ser eliminado para o ambiente. Tratava-se de Salmonella Typhimurium sorovar. Copenhagen Diante desses dados, levantamos algumas possibilidades que poderiam justificar nossos achados. É possível que os animais positivos já estivessem contaminados em suas unidades de produção e eliminando a bactéria através das fezes. Entretanto, a contaminação maciça do lote analisado não teria se dado devido ao possível jejum realizado antes do carregamento dos animais, vindo a diminuir a excreção de fezes e a eliminação dos patógenos (POINTON et al., 2012). Neste caso, os animais positivos teriam apenas mantido sua condição de origem como portadores sem, contudo, influenciar na contaminação dos outros membros do grupo. Essa possibilidade é reforçada considerando que, se os bovinos tivessem recebido alimentos antes da viagem, seria esperada maior defecação dos animais devido ao estresse do transporte até o frigorífico (KALCHAYNAND et al., 2009). Curiosamente, o grupo que apresentou o maior número de amostras positivas (15%) foi também o que teoricamente teria sofrido menor estresse durante o transporte, uma vez que os animais foram submetidos a uma viagem de apenas 70 km. Do mesmo modo, os grupos que demonstraram prevalências menores, 10% (lotes 2 e 3) viajaram 200 km e 302 km respectivamente. Uma interpretação superficial desses dados poderia nos levar a concluir de maneira errônea que nossos achados contrariam a literatura consultada a qual 49 correlaciona positivamente o estresse do transporte com a eliminação de patógenos. Entretanto, cabe ressaltar que, a disseminação de Salmonella durante o transporte dos bovinos é diretamente proporcional às dificuldades oferecidas pelas condições de viagem destes animais (DEWELL et al., 2008). Entendemos que apenas o deslocamento, não necessariamente implica em estresse. Devem ser considerados fatores como as condições da estrada percorrida, o manejo humanitário dos animais durante seu carregamento e descarregamento, a superlotação dos veículos, a mistura de bovinos com diferentes origens na mesma baia e o estado fisiológico dos animais, dentre outros. Khaitsa et al. (2007) pesquisaram a participação do estresse bovino na disseminação do patógeno durante o transporte. Para os autores a condução dos animais até as plantas frigoríficas em épocas mais frias do ano proporcionariam condições menos estressantes aos animais. Esses dados concordam com Kalchaynand et al. (2009) que observaram menor prevalência de micro-organismos ao longo de seu experimento quando o transporte dos animais ocorreu durante o inverno. Reicks et al. (2007) citam que não apenas o transporte, mas o manuseio dos animais pode causar condições estressantes. Para os autores isso traria mudanças nos padrões de eliminação fecal aumentando possíveis pontos de contaminação. Para Lenahan et al. (2010), os bovinos destinados ao abate experimentam condições estressantes de inanição ao longo do transporte e também durante o período em que permanecem estabulados aguardando as operações da planta. Esses dados concordam com aqueles encontrados por Woldemariam et al. (2005) que identificaram 50 como causas de estresse a permanência dos animais no interior de baias superlotadas, aguardando o carregamento nas fazendas ou o abate nos frigoríficos. Para Pointon et al. (2012), o jejum praticado com os animais seria apenas um, entre tantos fatores, dentro do complexo processo que leva os bovinos ao estresse durante sua condução até as indústrias de abate. Pangloli et al. (2008) citam que o estado fisiológico do rumem é importante para a colonização e multiplicação das células de Salmonella. A interrupção das funções normais do trato gastrointestinal pode permitir sua colonização e multiplicação. Para esses autores, mudanças bruscas na rotina e na qualidade da alimentação, bem como as condições extremas de temperatura e o transporte, teriam influência direta nesse aspecto. Green et al. (2010) acrescentam ainda que a reunião de animais, que não compartilhavam do mesmo convívio, em uma mesma área seria motivo de estresse no grupo havendo entre eles a necessidade de se restabelecer uma hierarquia. Na análise de riscos realizada por Dewell et al. (2008) para avaliar a participação do transporte na prevalência de Salmonella sobre o couro bovino, os autores identificaram que os animais em que a agitação foi grande durante o carregamento até os caminhões, apresentaram o dobro de chances de isolar o patógeno em comparação àqueles que a operação foi realizada de maneira calma. Outro dado importante a ser considerado é a presença de parasitoses infestando os animais. Looper et al (2006) citam que o estado de infestação é também causador de estresse nos bovinos e pode levar à eliminação de Salmonella pelas fezes. Como visto, as condições estressantes a que estão expostos os animais destinados ao abate não se resumem às longas distancias percorridas por eles. Há, no 51 entanto, uma complexidade de fatores envolvidos que precisam ser melhor estudados. Desta forma, deduzimos que os bovinos de nosso experimento podem ter sofrido estresse durante seu transito até a unidade de abate, mas seus efeitos na disseminação de Salmonella não foram observados pela possível ocorrência de jejum pré-transporte. É importante que sejam discutidos outros fatores de risco que poderiam ter levado a infecção até os animais estudados. A alimentação fornecida aos três lotes em que o agente foi identificado era baseada no pastoreio de azevem e aveia. Já os cinco lotes negativos foram alimentados a pasto (Brachiaria, Azevem, Aveia) até serem confinados, quando passaram a receber dietas ricas em grãos por 90 dias, em média. A literatura pesquisada não possibilitou estabelecer correlações diretas entre o isolamento de Salmonella e a pastagem consorciada de azevém com aveia. Não foram encontrados relatos que apontassem esses alimentos como fontes do patógeno. Com relação aos lotes confinados, a dieta dos bovinos era baseada no fornecimento de silagem e ração concentrada rica em grãos. A participação destes últimos na redução do pH ruminal já foi discutida em nossa pesquisa. Quanto às silagens, era esperado que suas características ácidas se somassem ao efeito dos grãos contribuindo ainda mais para uma maior acidez ruminal. Entretanto isso não foi evidenciado no momento da coleta. Como já hipotetizado, os valores neutros encontrados para o pH das amostras estaria relacionado ao jejum antes do carregamento dos animais. Alguns autores têm pesquisado a participação da dieta na disseminação de Salmonella spp nos bovinos. Em sua maioria, estudos in vitro têm sido realizados para identificar a contribuição de determinados alimentos na sobrevivência e eliminação 52 destes patógenos no liquido ruminal. Contudo, o papel dos ingredientes da dieta na veiculação de Salmonella aos bovinos ainda é pouco conhecido. Na literatura atual são escassos os dados a esse respeito (JACOB et al., 2009, LENAHAN et al., 2010) Moscardi-Jr. et al. (2003a, 2003b, 2005) pesquisaram Salmonella em alimentos oferecidos a bovinos confinados no interior do estado de São Paulo encontrando o agente em amostras de caroço de algodão e núcleo mineral proteico. Esses autores identificaram positividade também nas amostras de fezes e carcaças dos animais alimentados com essa dieta. Dargatz et al. (2005) pesquisaram Salmonella em amostras de milho, feno e silagem fornecidos aos animais em dois confinamentos no Colorado-EUA. Os autores encontraram uma positividade de 5,3% em relação ao total de alimentos investigados (57/1070). Individualmente os alimentos apresentaram percentuais positivos de: 0,6% em 180 amostras de silagem; 0,6% em 180/milho de alta umidade; 1,7% em 360/feno; 4% em 175/milho seco e 24% em 175/alimentos misturados. Dentre os 57 isolamentos, 42 deles ocorreram na ração final (mistura de alimentos). Esses autores concluíram que a contaminação de ingredientes da dieta em confinamentos é aparentemente comum. Mesmo assim, não foram observados casos clínicos de doença nos animais que ingeriram os alimentos. Jacob et al. (2009) pesquisaram a eliminação fecal de Salmonella em bovinos alimentados com grãos de destilaria e rolo seco de milho vindo a concluir que essa dieta não interfere no processo de disseminação do patógeno. Green et al. (2010) realizaram analise de risco relacionada à presença de Salmonella em 73 confinamentos nos EUA. Seus dados permitiram concluir que a 53 inclusão de alimentos como caroço de algodão, glúten de milho seco, cevada e feno na ração, estão fortemente relacionados ao isolamento da bactéria. Para os autores o glúten de milho e as gorduras presentes no caroço de algodão reduzem a produção de AGV Em contrapartida, o uso de silagem de sorgo seria responsável pela diminuição dos riscos evidenciados, haja vista a grande quantidade de ácido lático presente em silagens bem fermentadas. No passado os alimentos mais implicados com a veiculação de Salmonella aos animais eram as fontes de proteína de origem animal e vegetal. Como visto, outros ingredientes podem tornar-se contaminados com a bactéria disseminando-a pelo ambiente de criação. Essa contaminação pode ocorrer nas fábricas de produção ou ainda durante o transporte e armazenamento nas fazendas, antes de serem servidos aos animais (DARGARTZ et al., 2005). É preciso destacar que em nosso estudo a pesquisa de Salmonella spp. ocorreu em condições naturais. Procurou-se com isso, investigar a prevalência do patógeno no conteúdo ruminal dos bovinos e discutir possíveis fatores que naturalmente estivessem contribuindo para o isolamento do agente nos animais. A grande maioria dos autores consultados pesquisou a bactéria em amostras de fezes presentes na superfície do couro bovino, no ambiente ou no reto dos bovinos. Poucos tentaram isolar Salmonella do interior do rumem. Quando o fizeram, praticaram ensaios in vitro e com inoculações artificiais do patógeno. Lenahan et al. (2010) por exemplo, também afirmam que ainda são poucos os trabalhos que correlacionam a dieta animal com a presença de Salmonella. Estes autores realizaram ensaios inoculando artificialmente cepas ácido resistentes e outras 54 não adaptadas a acidez em amostras de liquido ruminal. Após desafiarem essas amostras com fluido abomasal sintético os autores concluíram que não apenas a dieta fornecida aos animais, mas também características individuais do rumem podem interferir na sobrevivência dos micro-organismos. Callaway et al. (2011), alimentaram ovelhas confinadas com diferentes porcentagens de derivados cítricos durante 10 dias. Após esse período, os animais foram inoculados, via oral. Com 2 x 102 UFC de Salmonella Typhimurium e abatidos após 96h da inoculação, retirando-se amostras do conteúdo ruminal para análise. Os dados encontrados não informaram a prevalência da bactéria no material investigado, apenas o papel dos derivados cítricos na redução do agente no interior do rumem. Em nosso estudo não podemos afirmar que a contaminação teve origem na alimentação oferecida aos animais, pois não foi realizada a análise da mesma. De qualquer maneira, mesmo que isto tenha acontecido, podemos deduzir que no caso dos animais positivos, as condições ruminais não foram eficazes em eliminar o patógeno. No caso dos lotes que ingeriram pasto, havia condições de viabilidade para a sobrevivência de Salmonella. Do mesmo modo, os grupos alimentados com dietas ricas em grãos, ao contrário do esperado, apresentaram níveis de pH favoráveis ao isolamento no momento da coleta (LENAHAN et al., 2010). Assim, dentre os fatores que poderiam ter levado os animais deste estudo ao estado de portadores identificados, levantamos uma segunda possibilidade para explicar a contaminação dos bovinos avaliados. A infecção poderia ter ocorrido de forma fecal oral dentro das instalações do frigorífico, anteriores à sala de abate. A eliminação do micro-organismo por animais positivos, pertencentes aos lotes que 55 participaram da pesquisa ou a outros lotes que foram abatidos no mesmo dia, poderia ter contaminado estruturas físicas da indústria, responsáveis por conter os novilhos ou conduzi-los ao box de insensibilização. Baseado nessa interpretação não seria possível afirmar se o lote que deu origem a contaminação dos animais pertencia aos grupos estudados ou a lotes que foram abatidos anteriormente à coleta. De qualquer forma, podemos levantar a hipótese que no mínimo dois, dos três lotes positivos, contaminaram-se no interior das instalações do frigorífico. Dentro da programação diária da indústria os 15% (3/20) de bovinos em que a bactéria foi isolada pertenciam ao oitavo lote abatido naquele dia. Na sequência seguiram para o abate o nono e o décimo lotes que apresentaram em seus animais 10% (2/20) e 10% (1/10) de positividade respectivamente. Essas evidências são baseadas no fato de que os isolamentos identificados ocorreram todos no mesmo dia, de forma decrescente e sequencial na escala de abate. Antes da passagem destes animais pelos corredores que dão acesso ao interior da indústria, sete outros lotes já haviam por ali transitado. É possível que o material contaminante estivesse presente nas estruturas citadas e com o passar dos animais fosse reduzindo sua dose infectante. Por isso alguns indivíduos se infectaram e outros não. Além disso, o sorovar identificado dentro dos três lotes foi o mesmo, Salmonella Schwarzengrund isolado em todas as amostras. Essa hipótese está de acordo com os achados de Reicks et al. (2007) que pesquisaram o efeito do transporte de bovinos em caminhões sobre a prevalência de Salmonella spp. Esses autores identificaram fontes de contaminação relevantes presentes nas áreas de contenção e carregamento tanto das fazendas como nas 56 indústrias frigoríficas. Seus dados demonstram que o piso, paredes e os trilhos das áreas citadas podem ser fontes de contaminação para os animais que adentram na sala de abate. Assim, ainda que o tempo de permanência dos animais dentro dos currais de espera fosse insuficiente para o completo transito bacteriano, incluindo a excreção fecal, o isolamento de Salmonella na cavidade oral e no rumem destes bovinos contaminados tornou-se possível. 57 7. CONCLUSÕES: Com base nos resultados obtidos e na discussão efetuada, podemos concluir que: a) A detecção do patógeno, mesmo que tenha ocorrido em uma pequena porcentagem de amostras, mostra o potencial que o conteúdo ruminal pode ter na contaminação cruzada de carcaças e cortes, caso as operações de abate não sejam bem realizadas; b) Embora todas as amostras tenham mostrado valores de pH próximo da neutralidade, mesmo aquelas provenientes de animais em que a ração oferecida era rica em concentrados, a detecção do patógeno se deu no conteúdo ruminal apenas de animais criados a pasto, evidenciando que a alimentação pode ter uma influência importante na manutenção na viabilidade das células de Salmonella no interior do rumen; c) A detecção de um único sorotipo em um mesmo dia de coleta permite levantar a hipótese de que a contaminação dos animais tenha se dado na própria indústria, a partir das estruturas físicas, responsáveis por conter os bovinos ou conduzi-los ao box de insensibilização 58 8. 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Garantir a segurança microbiológica desses alimentos tem sido um dos princi