Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT 00.000.2.2.16.0406524.3 22/09/2016 870160053215 09:32 Número do Processo: BR 10 2016 021753 9 Dados do Depositante (71) Depositante 1 de 1 Nome ou Razão Social: UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO Tipo de Pessoa: Pessoa Jurídica CPF/CNPJ: 48031918000124 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Jurídica: Instituição de Ensino e Pesquisa Endereço: Rua Quirino de Andrade, 215 Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 01049-010 País: Brasil Telefone: 11 56270217 Fax: 11 56270103 Email: auin@unesp.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 22/09/2016 às 09:32, Petição 870160053215 1/36 Dados do Pedido Natureza Patente: 10 - Patente de Invenção (PI) Título da Invenção ou Modelo de Utilidade (54): MÉTODO DE OBTENÇÃO DE BENZENOSSULFONAMIDAS, BENZENOSSULFONAMIDAS E SEU USO Resumo: A presente invenção faz referência a um novo método de obtenção de benzenossulfonamidas capazes de bloquear canais de potássio através de voltagem Kv3.1, bem como as ditas benzenossulfonamidas obtidas e o uso das mesmas, o qual permite o retardamento da repolarização das membranas, reduzindo a excitabilidade celular e permitindo a atuação no tratamento antitumoral. 5Figura a publicar: Dados do Procurador Nome ou Razão Social: Fabíola de Moraes Spiandorello Procurador: Numero OAB: 244141SP Numero API: CPF/CNPJ: 13521027813 Endereço: Rua Faustina Barbosa Stackfleth, 149, Parque Centenário Cidade: Jundiaí Estado: SP CEP: 13214-773 Telefone: (11) 992340347 Fax: Email: spianfm@terra.com.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 22/09/2016 às 09:32, Petição 870160053215 2/36 Inventor 1 de 4 Nome: EDUARDO RENÉ PÉREZ GONZÁLEZ CPF: 21623042879 Nacionalidade: Cubana Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: R. Roberto Simonsen, nº 305, Vila Santa Helena Cidade: Presidente Prudente Estado: SP CEP: 19060-900 País: BRASIL Telefone: (11) 339 37904 Fax: Email: auin@unesp.br Inventor 2 de 4 Nome: CARLOS ALBERTO ZANUTTO BASSETTO JUNIOR CPF: 35513457830 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Estudante de Pós Graduação Endereço: R. Roberto Simonsen, nº 305, Vila Santa Helena Cidade: Presidente Prudente Estado: SP CEP: 19060-900 País: BRASIL Telefone: (11) 339 37904 Fax: Email: auin@unesp.br Inventor 3 de 4 Dados do Inventor (72) Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 22/09/2016 às 09:32, Petição 870160053215 3/36 Nome: CARINA COUTO MARTINS CPF: 38494149814 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Estudante de Pós Graduação Endereço: R. Roberto Simonsen, nº 305, Vila Santa Helena Cidade: Presidente Prudente Estado: SP CEP: 19060-900 País: BRASIL Telefone: (11) 339 37904 Fax: Email: auin@unesp.br Inventor 4 de 4 Nome: WAMBERTO ANTONIO VARANDA CPF: 67699634853 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: Av. Bandeirantes, nº 3900, Monte Alegre Cidade: Ribeirão Preto Estado: SP CEP: 14049-900 País: BRASIL Telefone: (11) 339 37904 Fax: Email: auin@unesp.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 22/09/2016 às 09:32, Petição 870160053215 4/36 NomeTipo Anexo Comprovante de pagamento de GRU 200 16AUIN035 - BLOQUEADOR Kv3-1 - GRU.pdf Procuração PROCURACAO UNESP LEOPOLDO-FABIOLA 2016.pdf Portaria DOESP_Nomeacao_Durigan_Marilza.pdf Relatório Descritivo 16AUIN035 - BLOQUEADOR Kv3-1 - RELATORIO DESCRITIVO.pdf Reivindicação 16AUIN035 - BLOQUEADOR Kv3-1 - REIVINDICACOES.pdf Desenho 16AUIN035 - BLOQUEADOR Kv3-1 - DESENHOS.pdf Resumo 16AUIN035 - BLOQUEADOR Kv3-1 - RESUMO.pdf Documento de Cessão 16AUIN035 - BLOQUEADOR Kv3-1 - TERMO CESSAO ASSINADO.pdf Documentos anexados Acesso ao Patrimônio Genético Declaração Negativa de Acesso - Declaro que o objeto do presente pedido de patente de invenção não foi obtido em decorrência de acesso à amostra de componente do Patrimônio Genético Brasileiro, o acesso foi realizado antes de 30 de junho de 2000, ou não se aplica. Declaro, sob as penas da lei, que todas as informações acima prestadas são completas e verdadeiras. Declaração de veracidade Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 22/09/2016 às 09:32, Petição 870160053215 5/36 6/36 7/36 8/36 9/36 10/36 1/16 MÉTODO DE OBTENÇÃO DE BENZENOSSULFONAMIDAS, BENZENOSSULFONAMIDAS E SEU USO Campo da invenção: [1] Esta invenção se insere no campo da química, mais especificamente no que se refere à síntese de moléculas orgânicas, e faz referência a um novo método de obtenção de benzenossulfonamidas capazes de bloquear canais para potássio dependentes de voltagem do tipo Kv3.1. [2] A invenção ainda descreve as benzenossulfonamidas obtidas, as quais têm atividade inibitória reversível em canais para potássio dependentes de voltagem, e o uso das mesmas, o qual permite o retardamento da repolarização das membranas, reduzindo a excitabilidade celular. Fundamentos da invenção: [3] Organismos complexos necessitam de uma rápida e precisa transmissão de informação intracelular e tecidual para a estreita coordenação das funções fisiológicas. [4] Na biologia, a transmissão de informações ocorre por meio de sinais elétricos e estes dependem da rápida e da altamente sensível resposta de canais iônicos dependentes de voltagem a pequenas variações no potencial de membrana. [5] O processo de transmissão de informação ocorre por meio da frequência de disparos de potenciais de ação (PA) nas fibras nervosas. Em células excitáveis, o início de um PA é comumente induzido pelo influxo de íons sódio ou cálcio carreado por proteínas transmembrânicas específicas que promovem a despolarização da membrana celular. Desse processo, decorre o aumento da probabilidade de abertura de canais para potássio dependentes de voltagem (chamados de 11/36 2/16 KVs), promovendo o início do mecanismo de repolarização da membrana (retorno da membrana ao potencial de repouso), terminando, assim, o decurso temporal do PA. [6] Dessa forma, os canais para potássio atuam na gênese e na regulação dos potenciais de membrana, com a função de reestabelecer o potencial de repouso após um PA. [7] Os KVs são proteínas de membranas que possuem quatro domínios de segmentos transmembrânicos arranjados simetricamente em torno de um poro condutor central, o qual possui quatro sensores de voltagem. [8] Os KVs apresentam topologias semelhantes, porém diferenciam-se uns dos outros nas sequências de aminoácidos que lhes conferem diferentes características e propriedades cinéticas. [9] Assim, defeitos em KVs expressos em células excitáveis neuronais podem estar relacionados a certas patologias e, portanto, podem se constituir em alvos terapêuticos na tentativa de se recuperar a normalidade funcional. [10] Ao contrário do que ocorre com PA codificados por outras famílias de KV, o bloqueio das correntes de K+ carreadas por KV3.1 leva à diminuição dos disparos de PAs. [11] O alto limiar de ativação e a rápida velocidade de fechamento dos KVs3.1 sugerem que, quando presentes em quantidades suficientes nas células excitáveis, os KVs3.1 podem facilitar a repolarização e regulam a duração do PA. [12] Dessa forma, devido à importância e às múltiplas regiões de expressão desse canal, depreende-se que os mesmos têm grande apelo farmacológico e o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos que atuem sobre os KV3.1 12/36 3/16 apresenta grande interesse farmacológico e médico. [13] Do ponto de vista farmacológico, os canais para K+ podem ser modulados de três maneiras diferentes: por pequenas moléculas orgânicas, por peptídeos de veneno / toxinas e por íons metálicos. Além disso, pode ocorrer a inibição por meio de mecanismos alostéricos e por bloqueio. [14] O primeiro processo está relacionado à ligação da molécula a uma região que estabiliza o canal no estado fechado, por exemplo, no domínio sensor de voltagem. O segundo processo está relacionado à oclusão do poro pela ligação do bloqueador no vestíbulo do canal. [15] As moléculas que bloqueiam os canais em seu estado aberto são denominadas bloqueadores de canal aberto e a literatura apresenta vários relatos sobre grupamentos químicos presentes em moléculas bloqueadoras de canais para potássio. [16] O grupamento mais encontrado e que provavelmente se constitui em um bom ponto de partida para a elaboração de um protótipo de molécula que possa atuar em canais de potássio KV3.1 é o grupamento nitrobenzenossulfônico. [17] Assim, a presente invenção ensina o efeito de moléculas orgânicas, em especial as benzenossulfonamidas, sobre os canais iônicos para potássio dependentes da voltagem, mais especificamente sobre o canal KV3.1. Aqui, é descrito um processo de obtenção de benzenossulfonamidas, bem como as moléculas obtidas e seu uso. [18] Alguns documentos do estado da técnica, tais como KR 20150131647, JP 2015120710 e CN 105085504 descrevem novos bloqueadores de canais de potássio, tais como compostos a base de benzenossulfonamidas substituídas. No 13/36 4/16 entanto, nenhum dos processos ou moléculas descritas se assemelha ao proposto nesta invenção. Breve descrição da invenção: [19] A presente invenção faz referência a um novo método de obtenção de benzenossulfonamidas capazes de bloquear canais de potássio através de voltagem Kv3.1, bem como as ditas benzenossulfonamidas obtidas e o uso das mesmas, o qual permite o retardamento da repolarização das membranas, reduzindo a excitabilidade celular. Breve descrição das figuras: [20] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se fazem referências, conforme se segue. [21] A figura 1 representa graficamente os efeitos inibitórios e reversibilidade dos efeitos das moléculas SMD2, SMD2_APP e SMD2_SN sobre os KV3.1. [22] A figura 2 representa graficamente os efeitos inibitórios e reversibilidade do efeito das moléculas SMD3, SMD3_APP e SMD3_SN sobre os KV3.1. [23] A figura 3 representa graficamente a corrente dos KV3.1 na presença de várias concentrações das moléculas que promoveram efeitos inibitórios sobre o canal. [24] A figura 4 representa graficamente as curvas dose-resposta para a carga e para a corrente no final do pulso para as moléculas SMD2, SMD3, SMD2_APP, SMD3_APP, SMD2_SN e SMD3_SN. [25] A figura 5 mostra as semelhanças estruturais entre as moléculas SMD2_SN, SMD2, SMD2_APP, SMD3_SN, SMD3 e SMD3_APP. [26] As figuras 6A e 6B representam graficamente 14/36 5/16 adependência de voltagem do efeito de SMD2 em KV3.1. [27] A figura 7 representa graficamente a mudança da cinética de ativação de KV3.1 pelo SMD2. [28] A figura 8 representa graficamente a ausência de mudança na constante de tempo de desativação de KV3.1 pelo SMD2. Descrição detalhada da invenção: [29] Esta invenção descreve o processo de obtenção de benzenossulfonamidas, bem como as moléculas obtidas e seu uso. [30] O processo de obtenção das benzenossulfonamidas consiste em uma reação Schotten–Baumann modificada acoplada a uma arilaçãode Meisenheimer. [31] Mais especificamente, o processo de obtenção das benzenossulfonamidas desta invenção compreende, em uma primeira etapa, a reação entre benzeno sulfonilcloreto com diferentes aminas para a obtenção de p-cloro-N-alquil benzenossulfonamida. [32] Devido à importância farmacológica do grupo lactâmico, a segunda etapa do processo consiste em uma reação de substituição aromática nucleofílica, em que a p- cloro-N-alquilbenzenossulfonamida obtida atua como composto intermediário para a síntese de sulfonamida p-(N-alquil) lactama. [33] Para os estudos eletrofisiológicos, foi utilizada a linhagem de célula L-929, que expressa estavelmente os canais para potássio KV3.1. [34] Os experimentos foram realizados no modo Whole- cell, que permite medir correntes macroscópicas através das membranas celulares. As correntes iônicas, em resposta a 15/36 6/16 pulsos de voltagem, foram medidas com amplificador e filtradas em 5 KHz. Os sinais provenientes do amplificador foram amostrados através de um conversor AD/DA e analisados por software. [35] A reação de síntese de benzenossulfonamidas utiliza o cloreto de 4-cloro-3-nitrobenzenossulfonila ou o cloreto de 4-clorobenzenossulfonila dissolvido em acetonitrila. [36] Em seguida, é adicionada a essa solução uma quantidade em excesso de amina (de 1,5 a 3 equivalentes). Para evitar perdas do solvente, a mistura é agitada em um sistema de refluxo a 80 - 85 °C, por um intervalo que varia de 2 a 8 horas. [37] O precipitado formado é separado por filtração à pressão reduzida e o filtrado é submetido à evaporação a pressão reduzida para remoção do solvente. O resíduo é lavado com uma solução diluída (15-20%) de NaHCO3. Assim, uma solução de sulfonamida em DMSO é sintetizada conforme mostrado no esquema 1 – etapa 1. [38] Em seguida, na etapa 2, sob agitação, adiciona-se lentamente, em um intervalo de tempo que varia de 30 minutos a 2 horas, a solução de N-(3-aminopropil)-2- pirrolidona (APP) ou N-(3-aminopropil)-2-azepanona (APA) em uma relação molar de 1:1 a 2:1. [39] A mistura foi deixada em um sistema de refluxo a 80 - 85 °C, sob agitação por 12 a 18 horas. Após o término da reação, adicionou-se lentamente uma solução de HCl (5 a 15 %), até que o meio ficasse levemente ácido (pH = 5 a 6). Em seguida, o produto foi precipitado por adição de gelo à mistura. 16/36 7/16 [40] O sólido foi separado por filtração à pressão reduzida e lavado com uma mistura de éter de petróleo / éter etílico (em uma proporção que varia de 40:60 a 60:40). Os produtos foram analisados por EI-MS. [41] Ambas as etapas reacionais são mostradas no esquema abaixo, em que R pode ser substituído por furfuril, butil, benzil, ciclohexil, 4-clorobenzil e 2,4- diclorobenzil e X pode ser substituído por um grupo nitro (NO2) ou hidrogênio (H): Esquema 1 - Reação Schotten–Baumann modificada acoplada a arilação de Meisenheimer [42] Dentre as moléculas sintetizadas, as moléculas abaixo atuaram como bloqueadores de canais para potássio KV3.1: 17/36 8/16 [43] A nomenclatura oficial das moléculas, bem como a solubilidade das mesmas, estão descritas na Tabela 1 abaixo: Tabela 1: Nomenclatura oficial e solubilidade das sulfonamidas Nomenclatura Oficial Nome adotado Solubilidade 4-cloro-3-nitro-N- butilbenzenossulfonamida SMD2 2,9 mg / mL NaOH (0,5 Molar) 4-cloro-3-nitro-N- furfurilbenzenossulfonamida SMD3 3,2 mg / mL NaOH (0,5 Molar) 4-[ N-(3'-aminopropil)-2- pirrolidona]-3-nitro-N- butilbenzenossulfonamida SMD2_APP 54 mg / mL (DMSO) 4-[N-(3'-aminopropil)-2- pirrolidona]-3-nitro-N- furfurilbenzenossulfonamida SMD3_APP 3,1 mg / mL NaOH (0,2 Molar) 4-cloro-N- butilbenzenossulfonamida SMD2_SN 2,5 mg / mL NaOH (0,7 Molar) 4-cloro-N- SMD3_SN 2,7 mg / mL NaOH 18/36 9/16 furfurilbenzenossulfonamida (0,5 Molar) [44] As amostras Sar_APP, Sar_APA e as Amostras 7 e 8 não apresentaram efeitos inibitórios sobre KV3.1, logo, não atenderam ao objetivo da presente invenção. [45] Para as demais moléculas, a carga normalizada em função do tempo variou substancialmente em resposta aos pulsos de voltagem, indicando que há efeitos inibitórios dessas moléculas sobres os KV3.1. Assim, do ponto de vista farmacológico, as moléculas obtidas podem constituir uma nova classe de moduladores de canais para potássio do tipo KV3.1. Efeito inibitório das moléculas: [46] Na figura 1, são apresentados os resultados do efeito inibitório das moléculas SMD2, SMD2_APP e SMD2_SN e, na figura 2, apresentam-se os resultados para as moléculas SMD3, SMD3_APP e SMD3_SN. [47] Nas figuras 1 e 2, o efeito das moléculas sobre os Kv3.1 se instalam rapidamente, uma vez que após 20 segundos da aplicação da molécula, há um declínio abrupto da carga normalizada. [48] Após esse período, há uma estabilização do efeito próximo de 40 a 60 segundos para as moléculas SMD2, SMD2_APP, SMD3 e SMD3_APP. Já para as moléculas SND2_SN e SMD3_SN, o efeito máximo observado é menor, na concentração utilizada. Reversibilidade do efeito: [49] Outro aspecto interessante a se destacar é a reversibilidade do efeito após a lavagem da molécula. Para todas as moléculas testadas, é possível observar que o canal recupera suas propriedades intrínsecas. 19/36 10/16 [50] Além disso, observa-se também que o processo de lavagem é rápido, necessitando de apenas um minuto a dois minutos, para voltar a patamares comparáveis a situação controle. [51] Na figura 3, os traçados representativos de correntes para as moléculas que exerceram efeitos inibitórios sobre os KV3.1 em função de suas concentrações são mostrados. [52] A corrente em resposta a pulsos despolarizantes de voltagem (-88 a +32 mV) atinge um valor máximo (pico), e em seguida inativa-se lentamente, decaindo até um novo valor estacionário. Com o aumento das concentrações das moléculas, constata-se que a velocidade de decaimento das correntes aumenta, comportamento típico de bloqueadores de canais que atuam no estado aberto. Curvas dose-resposta: [53] Para todas as moléculas SMD2, SMD3, SMD2_APP e SMD3_APP, o efeito do aumento da velocidade de decaimento da corrente aparenta ser maior e mais evidente do que para as moléculas SMD2_SN e SMD3_SN. Além disso, para estas últimas duas moléculas mencionadas, percebe-se que o efeito sobre o pico é mais intenso, com um decaimento quase imperceptível. Para a análise da relação dose-resposta, tanto se utiliza a corrente no final do pulso aplicado quanto a carga total transferida pelo canal. [54] A análise de ambas as grandezas é interessante, pois, como pode ser observado na figura 3, os traçados representativos de corrente na presença das moléculas mostram que o efeito é mais pronunciado no final do pulso aplicado. 20/36 11/16 [55] A análise pela carga total transferida tem o propósito de mensurar todo o efeito das moléculas sobre o transporte dos íons pelo canal, que a carga é a integral da corrente para todo o tempo de aplicação do pulso despolarizante. [56] Na figura 4, são apresentados os valores experimentais tomados a partir da corrente no final do pulso aplicado e também da integral sobre o traçado de corrente em função daconcentração da molécula aplicada sobre os KV3.1. [57] Com os dados da corrente e da carga, pode-se calcular os valores de IC50 por meio das equações de Hill. Os dados estão disponíveis na Tabela 1 abaixo: Tabela 1. Valores de IC50 (μM) para as moléculas testadas Molécula IC50 Corrente Carga SMD2 9,3 ± 0,6 13,5 ± 0,5 SMD3 11,3 ± 0,7 16,9 ± 0,5 SMD2_APP 20,5 ± 1 25,9 ± 1,5 SMD3_APP 29,9 ±1,9 34,2 ± 1,8 SMD2_SN 29,7 ± 2,3 34,9 ± 0,7 SMD3_SN 53,1 ± 2,2 60 ± 2,2 [58] Os valores de IC50 são diferentes, de forma significativa, para todas as moléculas testadas. [59] O que se observou é que os respectivos valores de IC50 são significantemente diferentes para todas as moléculas testadas. A discrepância entre os valores de IC50 sugerem a interpretação de que o bloqueio por essas moléculas é um efeito dependente de estado e que essas 21/36 12/16 moléculas são bloqueadores de canal aberto. [60] Ainda, a molécula SMD2 foi a que apresentou os menores valores de IC50 dentre as estudadas. Relação estrutura / atividade: [61] Ao comparar as moléculas SMD2, SMD2_APP, SMD2_SN, SMD3, SMD3_APP e SMD3_SN, foram analisadas as semelhanças estruturais presentes nos elementos ligados ao grupo sulfônico. [62] Como pode ser observado na figura 5, tanto SMD2, SMD2_APP e SMD_SN assemelham-se pela presença de uma cadeia N-butílica ligada ao grupo sulfônico. A diferença entre as moléculas SMD2 e SMD2_SN é a ausência do grupo nitro em SMD2_SN e a diferença para a molécula SMD2_APP é a presença de uma N-alquil-lactâma ligada ao nitrogênio de anilina. [63] As diferenças entre as moléculas SMD2 e SMD3 são o grupamento ligado ao grupo sulfônico: N-butila em SMD2 e de N-furfurila em SMD3. A diferença entre as moléculas SMD3 e SMD3_SN é a ausência do grupo nitro em SMD3_SN, sendo que as diferenças para a molécula SMD3_APP é a presença de uma N-alquil-lactama ligada ao nitrogênio anilínico. [64] Tomando-se essas considerações em conjunto, infere-se que, para que as benzenossulfonamidas desta invenção apresentem atividades inibitórias, as mesmas devem conter um grupamento amino ligado ao grupamento sulfônico (-SO2NH-). Em vermelho na figura 5, é apresentada a estrutura proposta como essencial na atividade bloqueadora dos KV3.1. O efeito de SMD2 no canal KV3.1 [65] A partir das informações acima, nota-se que a molécula que mostrou melhor eficácia no bloqueio foi a 22/36 13/16 molécula SMD2. Foi assumido 13,5 µM como valor de IC50 e este valor se refere à carga transferida pelo canal. [66] Em vista desse fato, esta molécula foi melhor analisada, inclusive de acordo com parâmetros cinéticos. Caracterização da molécula de SMD2: [67] O SMD2, quimicamente denominado 4-cloro-3-nitro- N-butil benzenossulfonamida, é um sólido amarelo claro que apresenta: PF = 68–69 °C; MM = 292,73 g/ mol; RMN de ¹H (400 MHz, DMSO) δ 8.42 (d, J = 1.8Hz, 1H), 8.05 (dd, J = 8.5, 2.0 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.95 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 2.80 (dd, J = 12.8, 6.9 Hz, 2H), 1.40–1.32 (m, 2H), 1.24 (sext, J = 14.0, 7.0 Hz, 2H), 0.81 (t, J =7.3 Hz, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 147.45, 140.88, 133.09, 131.26, 129.12, 123.86, 42.21, 31.05, 19.12, 13.40. EI-MS m/z encontrado: 292. ESI(+)-MS m/z encontrado:291.02251, m/z calculado para [C10H13ClN2O4S+H]+: 291.02118. Fração de bloqueio e as curvas de condutância: [68] A fração de bloqueio é a relação de quanto a molécula consegue bloquear a passagem de íons através do canal, quando comparada à situação controle, para as várias voltagens aplicadas. [69] Essa análise é útil para entender o processo de bloqueio e pode fornecer informações acerca da fração do campo elétrico do sítio de ligação da molécula no canal. A relação entre a condutância do canal e a voltagem foi obtida através de medidas de correntes no estado 23/36 14/16 estacionário, a partir da lei de Ohm. [70] Pode-se observar, na figura 6A, dois efeitos distintos sobre a fração de bloqueio. [71] Primeiro, o valor da fração de bloqueio aumenta gradativamente para valores de voltagem entre -8 mV a +32 mV, indicando que, nessa faixa de voltagem, o bloqueio aparece nas voltagens em que os canais começam a se abrir, aumentando até o valor máximo de 70% de bloqueio, em torno da voltagem de 30 mV. [72] Depois, para valores de voltagem acima de +32 mV, a fração de bloqueio diminui linearmente com o aumento da voltagem, atingindo o valor de aproximadamente 60 % de bloqueio para a voltagem de +92 mV. [73] A figura 6B mostra a relação entre condutância e voltagem, na presença e na ausência de SMD2. Observa-se que a curva de condutância começa a atingir seu ponto máximo próximo a +32 mV, sendo que a partir de +42 mV atinge-se um platô, ou seja, a partir dessas voltagens, o canal se encontra com sua máxima probabilidade de abertura. Além disso, pode-se observar que o canal começa a abrir próximo à voltagem de -30 mV. [74] Na presença de SMD2 (círculos verdes, figura 6B), observaram-se dois comportamentos distintos para a curva de condutância. Para valores de voltagem menores que +12 mV, a curva desloca-se para potenciais mais negativos. Já para valores maiores que +12 mV, houve mudança para potenciais mais positivos e a subida da curva de forma quase linear. Efeitos sobre a cinética de ativação do canal KV3.1: [75] Na figura 7, é mostrada a cinética de ativação do canal. Em 7A, têm-se os traçados de corrente em resposta a 24/36 15/16 pulsos despolarizantes de voltagem entre -8 mV e +42 mV em situação controle e em 7B, as mesmas respostas na presença de 13,5 µM de SMD2. Uma exponencial simples foi ajustada na região de subida da corrente (entre 10-90 % da amplitude máxima - círculos laranjas na figura 7), de modo a obter-se os valores para as constantes de tempo da ativação (τA) para cada voltagem aplicada, mostrados na figura 7C. [76] Na presença de SMD2, a velocidade com que o canal passa do estado fechado para o aberto é mais intensamente dependente da voltagem através da membrana. Fazendo a subtração de τA controle pelo τA na presença de SMD2, observa-se que essa diferença é -8 mV. Além disso, observa- se que τA na presença de SMD2 é menor em relação ao controle, indicando que o canal abre mais rapidamente na presença da molécula. Portanto, essas informações, suportam a hipótese de que na presença de SMD2, o processo de abertura do canal, nessa faixa de potencial, é facilitado. Efeitos sobre a desativação do canal KV3.1: [77] A cinética de fechamento do canal também foi avaliada. [78] Nas figuras 8 A e B, são mostrados traçados representativos da corrente em resposta aos pulsos de voltagem aplicados, na ausência e na presença de SMD2, respectivamente. Como esperado, observa-se que durante a despolarização de 20 ms, a corrente aumenta devido a abertura dos canais e, quando pulsos hiperpolarizantes são aplicados, a corrente decai, sendo denominada de corrente de cauda. [79] Para avaliar o efeito do SMD2 sobre a cinética de fechamento, foram ajustadas exponenciais simples em todas 25/36 16/16 as correntes de cauda, tanto na presença como na ausência de SMD2 e calculadas as constantes de tempo do processo. Os valores de τD foram dispostos em um gráfico contra a voltagem em escala logarítmica, como mostrado na figura 8C. [80] Observa-se que os valores para potenciais menos hiperpolarizados (-28 mV, por exemplo), a constante de tempo de desativação é maior que para pulsos mais hiperpolarizados (por exemplo, -78 mV), indicando que, quanto maior a diferença de potencial hiperpolarizante, mais rápido é o fechamento do canal. [81] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas. 26/36 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Método de obtenção de benzenossulfonamidas caracterizado pelo fato de consistir em duas etapas, em que estas consistem de uma reação Schotten–Baumann modificada acoplada a uma arilação de Meisenheimer. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na primeira etapa, o p-cloro-N- alquil benzeno sulfonamida ser obtido a partir da reação entre benzeno sulfonilcloreto, preferencialmente o cloreto de 4-cloro-3-nitrobenzenossulfonila ou o cloreto de 4- clorobenzenossulfonila, com diferentes aminas de fórmula em que R é furfuril, butil, benzil, ciclohexil, 4- clorobenzil e 2,4-dicloro benzil. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de o benzeno sulfonilcloreto ser dissolvido em acetonitrila e a amina ser adicionada em excesso, que varia de 1,5 a 3 equivalentes, em sistema de refluxo a 80 - 85 °C, por 2 a 8 horas. 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a segunda etapa ser uma reação de substituição aromática nucleofílica, em que a p-cloro-N- alquil benzenossulfonamida obtida atua como composto intermediário para a síntese de sulfonamida p-(N-alquil) lactama. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, caracterizado pelo fato de adicionar-se lentamente, em um intervalo de tempo que varia de 30 minutos a 2 horas, a solução de N-(3-aminopropil)-2-pirrolidona (APP) ou N-(3- aminopropil)-2-azepanona (APA) em uma relação molar de 1:1 27/36 2/3 a 2:1 em sistema de refluxo a 80 - 85 °C, sob agitação por 12 a 18 horas. 6. Método, de acordo com a reivindicação 1, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de, após acidificação do meio com HCl 5 a 15 % até pH que varia de 5 a 6, o produto ser precipitado por adição de gelo à mistura, separado por filtração à pressão reduzida e lavado com uma mistura de éter de petróleo / éter etílico e concentração que varia de 40:60 a 60:40. 7. Benzenossulfonamidas caracterizadas por serem obtidas conforme o método definido nas reivindicações 1 a 6, em que as mesmas apresentam as seguintes fórmulas moleculares: 8. Benzenossulfonamidas, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadas pelo fato de ser preferencialmente 4- cloro-3-nitro-N-butilbenzenossulfonamida. 9. Benzenossulfonamidas, de acordo com a reivindicação 28/36 3/3 8, caracterizadas pelo fato de a 4-cloro-3-nitro-N-butil benzenossulfonamida ser um sólido amarelo claro que apresenta PF igual a 68 – 69 °C e MM igual a 292,73 g / mol. 10. Uso das benzenossulfonamidas, conforme definidas nas reivindicações de 7 a 9, caracterizado por apresentar atividade bloqueadora de canais para potássio KV3.1. 29/36 1/4 FIGURA 1 FIGURA 2 30/36 2/4 FIGURA 3 FIGURA 4 31/36 3/4 FIGURA 5 FIGURA 6 32/36 4/4 FIGURA 7 FIGURA 8 33/36 1/1 Resumo MÉTODO DE OBTENÇÃO DE BENZENOSSULFONAMIDAS, BENZENOSSULFONAMIDAS E SEU USO A presente invenção faz referência a um novo método de obtenção de benzenossulfonamidas capazes de bloquear canais de potássio através de voltagem Kv3.1, bem como as ditas benzenossulfonamidas obtidase o uso das mesmas, o qual permite o retardamento da repolarização das membranas, reduzindo a excitabilidade celular e permitindo a atuação no tratamento antitumoral. 34/36 35/36 36/36 Peticionamento Eletrônico Formulário Comprovante de pagamento de GRU 200 Procuração Portaria Relatório Descritivo Reivindicação Desenho Resumo Documento de Cessão 2016-09-22T09:32:55-0300 Brasil Documento Assinado - INPI