RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 05/02/2025. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU Ocorrência de Clostridioides difficile em bezerros: caracterização fenotípica e genotípica dos isolados toxigênicos FABRÍCIO MOREIRA CERRI Botucatu, São Paulo Fevereiro de 2024 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU Ocorrência de Clostridioides difficile em bezerros: caracterização fenotípica e genotípica dos isolados toxigênicos FABRÍCIO MOREIRA CERRI Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Mestre. Orientador: Prof. Dr. Alexandre Secorun Borges Botucatu, São Paulo Fevereiro de 2024 3 4 Nome do autor: Fabrício Moreira Cerri Título: Ocorrência de Clostridioides difficile em bezerros: caracterização fenotípica e genotípica dos isolados toxigênicos. COMISSÃO EXAMINADORA ____________________________________ Prof. Dr. Alexandre Secorun Borges Orientador Departamento de Clínica Veterinária FMVZ – UNESP – Botucatu ____________________________________ Profª. Drª. João Pessoa de Araújo Júnior Membro da banca Instituto de Biociências de Botucatu DCBQ – IBB-UNESP – Botucatu ____________________________________ Prof. Dr. Rodrigo Otávio Silveira Silva Membro da Banca Departamento de Medicina Veterinária Preventiva DMVP – EV- UFMG – Belo Horizonte Data da defesa: 05 de fevereiro de 2024 5 AGRADECIMENTOS Inicialmente gostaria de agradecer avós paternos (Pedro Cerri e Aparecida Ferreira Cerri), avós maternos (Marcílio Moreira Gomes e Dirce da Silva Moreira Gomes), meus pais (Elder Juliano Cerri e Flávia Augusta Moreira Gomes) e meus irmãos (Eduarda Moreira Cerri e Enzo Moreira Cerri) meus grandes incentivadores e apoiadores em todas as jornadas. A Minha namorada e companheira Roberta Martins Basso, por toda a jornada que construímos até o momento e por estar sempre comigo tornando os momentos difíceis mais fáceis. E ao seu avô Roberto Martins Brizolara com que posso conviver. Ao meu orientador Professor Alexandre Secorun Borges por todos os ensinamentos fornecidos e pelas oportunidades dadas nestes anos em Botucatu. Ao Professore Rogério Martins Amorim por compor a banca do exame de qualificação. A professora Eliane de Oliveira Ferreira por abrir as portas do laboratório de Biologia de Anaeróbios, por toda a receptividade e por participar da banca de qualificação. Ao professor Márcio Garcia Ribeiro e ao técnico de laboratório Fernando José Paganini Liston pelo período em que estive no Laboratório de microbiologia da FMVZ/Unesp. Ao professor Rodrigo Otávio Silveira da Silva e aos colegas da pós- graduação da UFMG pelos ensinamentos sobre o cultivo de C. difficile no período em que estive lá. E por toda colaboração na elaboração do artigo científico e por compor a banca de defesa. Ao Professor João Pessoa Araújo Júnior por todo auxílio fornecido durante a realização de todos os procedimentos experimentais, desde cultivo até a realização do sequenciamento de genoma completo. Da mesma forma, agradeço também por compor a banca de defesa. Agradeço também aos professores Wanderson Pereira Biscola e José Paes de Oliveira Filho pelo auxílio durantes as etapas experimentais, confecção do manuscrito e composição da banca. 6 A todos os colegas e amigos que auxiliaram nas coletas (Marco Antônio Simão, Lukas Albertino Garrido, Lídia Maria dos Santos Sperandio, Heitor Cestari e Glauder Rocha Lago). A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo fornecimento da Bolsa de mestrado (processo 2022/00708-2), utilização de recursos da reserva técnica para realizar treinamentos e participação em eventos científicos. Não poderia deixar de agradecer a liberação para ministrar aulas durante o mestrado (solicitação para Exercer Atividades SM002 e 003 do respectivo processo). A Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ-Unesp) e ao programa de pós-graduação em Medicina Veterinária (POSVET) pelo auxílio prestado durante o curso de mestrado com a liberação de recursos auxiliares em publicações paralelas. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Enfim agradeço a todos que colaboraram para que fosse possível realizar este trabalho científico. Sem a colaboração mútua não seria possível a realização deste estudo. A vocês o meu muito obrigado. 7 Lista de tabelas Tabela 1 - Estudos epidemiológicos sobre a ocorrência de Clostridioides difficile em bezerros.......................................................................................................29 Table Suppl 1 - Epidemiological data of the properties (n=20) included in the current study………………………………………………………………..…………86 Table 1. Epidemiological data and determination of toxin genes of 17 C. difficile strains found in nursing calves.……………………..…………..…………………..88 Table 2. Antimicrobial Susceptibility Test and Motility of Toxigenic C. difficile Strains (n=17) Isolated from Nursing Calves.……………………...………………89 8 Lista de figuras Figura 1: Locus de patogenicidade (PaLoc) do C. difficile com diferentes perfis diferentes de toxigencidade…………………………………………………………19 Figura 2: Estágios de formação do esporo do Clostridioides diffiicle. Os pontos de interrogação indicam mecanismos sugestivos, mas não confirmados………21 Figura 3: Formação de biofilme de C. difficile……………………………………..24 Figure 1 - Map of São Paulo state by macroregion - Brazil, describing the regions where fecal samples were collected from nursing calves………………………...84 Figure 2 (supplementary) - Calves collected in the current study, A: Property 19, B: Property 13; C: Property 5; D: Property 6; E: Property 15. F: Calf from farm 13 voluntarily ingesting soil (ground)………………………………………………..85 9 Lista de Abreviações cbpA – gene da proteína de ligação a carboidratos. CDI – infecção causada pelo Clostridioides difficile. CDT – toxina não binária produzida pelo Clostridioides difficile. cdtA – gene da toxina binária A. cdtB – gene da toxina binária B. cwp2 – gene da proteína de ligação a parede celular. cwp66 – gene da proteína de superfície celular. cwp84 – gene da cisteína protease. ermB - gene de resistência a clindamicina. fbpA – gene da fibronectina. fliA – gene do complexo sigma. fliC – gene da proteína flagelar. fliC – gene da proteína flagelar. fliD – gene da estrutura cristalina flagelar. fliD – gene de proteína da estrutura cristalina flagelar. groEL – gene da proteína de choque térmico. mdtD – gene da proteína de resistência múltiplas drogas. Mecl – gene da proteína reguladora de resistência a múltiplas drogas. msrD – gene de resistência a macrolídeos. NimB - gene da proteína de resistência à vancomicina. PaLoc – locus de patogenicidade. pilA1 - gene do complexo sigma. PMC – do inglês pseudomembranous enterocolitis. qnr – gene de proteína resistente a quinolonas. secA – gene da subunidade da proteína translocase. slpA – gene percussor de proteínas da camada S. SNA - sistema nervoso autônomo Spo0A – gene da proteína A do estágio 0 de esporulação. tcdA – gene da toxina A. TcdA – toxina A produzida pelo Clostridioides difficile. tcdB – gene da toxina B. TcdB – toxina B produzida pelo Clostridioides difficile. tet0 – proteína de proteção ribossômica resistente a tetraciclina. 10 tetW – gene da proteína de resistência a tetraciclina. TPC - tempo de preenchimento capilar. VanA – gene de proteínas resistente à vancomicina. VanW – gene de proteínas resistente à vancomicina. zmp1 – gene da metaloprotease. 11 Sumário Página Capítulo 1 ........................................................................................................14 Introdução........................................................................................................15 Revisão de literatura........................................................................................17 Clostridioides (Clostridium) difficile – História..............................................18 Clostridioides diffiicile – Agente, esporulação e patogenia..........................18 Clostridioides diffiicile – Toxinas e fatores de virulência..............................22 Clostridioides difficile em animais..................................................................24 Clostridioides difficile em suínos...................................................................25 Clostridioides difficile em equinos.................................................................26 Clostridioides difficile em bezerros................................................................27 Clostridioides difficile em animais de companhia.........................................31 Clostridioides difficile em animais selvagens...............................................31 Clostridioides difficile em seres humanos.....................................................32 Clostridioides difficile – diagnóstico..............................................................34 Referências.......................................................................................................36 Objetivo específico..........................................................................................61 Objetivos gerais...............................................................................................61 Capítulo 2 .........................................................................................................62 Occurrence of Clostridioides difficile in calves……......…...…………….......63 Capítulo 3..........................................................................................................81 Considerações finais.......................................................................................90 12 CERRI, F.M. Ocorrência de Clostridioides difficile em bezerros: caracterização fenotípica e genotípica dos isolados toxigênicos - 2024. 90p. Exame geral de qualificação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Unesp). RESUMO O Clostridioides difficile é uma das principais causas de diarreia em seres humanos em animais. A participação deste agente como causador de diarreia neonatal bovina não é completamente elucidada. O objetivo do presente estudo foi determinar a ocorrência de C. difficile em bezerros. Para isso, colheram-se amostras (n=300) de fezes de bezerros em fase de amamentação (diarreicos n=78 e não diarreicos =222), provenientes de vinte propriedades diferentes. Estas foram cultivadas em condições de anaerobiose (10% CO2, 5% H2 e 85% N2), as colônias foram consideradas positivas de acordo com as características morfológicas. Realizou-se a extração de DNA e a PCR multiplex para detecção dos genes 16S RNA, tcdA, tcdB, cdtA e cdtB. As amostras toxigênicas foram submetidas à ribotipagem e ao teste de susceptibilidade a antimicrobianos. Cinco amostras foram selecionadas para realização do sequenciamento do genoma completo para determinação da MLST (tipo de sequência/clado) e dos genes de resistência a antimicrobianos. O C. difficile foi isolado em 29,33% (88/300) dos animais, sendo 80,7% (71/88) de cepas não toxigênicas e 19,3% (17/88) de cepas toxigênicas (A+B+ cdtA/B- e A+B+ cdtA/B+). Os ribotipos (RT) identificados foram 046 (13/17- 76,47%) e 126 (4/17 – 23,53%). Em relação à cgMLST, as cepas selecionadas pertencentes ao RT046 (bezerros 38,182 e 243) foram classificadas como ST35 (clado 1), e RT126 (bezerros 40 e 49) como ST11 (clado 5). O perfil de resistência a antimicrobianos observado foi: vancomicina 0%, metronidazol 0%, rifamicina 52,9%, moxifloxacino 70,60%, tetraciclina 76,47% e eritromicina 100%. Não foram observadas correlações estatísticas entre os dados epidemiológicos e o isolamento do C. difficile. Os bezerros são fonte de cepas toxigênicas com perfil de multirresistência a antimicrobianos observado em seres humanos e outros animais. Palavras-chave: bezerros, diarreia, RT126, ST35, MLST. 13 CERRI, F.M. Clostridioides difficile in Calves. 2024. 90 p. General Qualification Examination (Master's Thesis) – Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science (FMVZ), Botucatu Campus, São Paulo State University “Júlio de Mesquita Filho” (Unesp). Abstract The objective of the present study was to determine the occurrence of C. difficile in calves. For this purpose, samples (n=300) of feces from nursing calves (diarrheic n=78 and non-diarrheic calves =222) were collected from twenty different properties. These samples were cultivated under anaerobic conditions (10% CO2, 5% H2, and 85% N2), colonies were considered positive based on morphological characteristics. DNA extraction and multiplex PCR were performed to detect genes 16S RNA, tcdA, tcdB, cdtA, and cdtB. Toxigenic samples underwent ribotyping and antimicrobial susceptibility testing. Five samples were selected for whole-genome sequencing to determine cgMLST (sequence type/clade) and antimicrobial resistance genes. C. difficile was isolated in 29.33% (88/300) of the animals, with 80.7% (71/88) being non- toxigenic strains and 19.3% (17/88) toxigenic strains (A+B+ cdtA/B- and A+B+ cdtA/B+). The identified ribotypes (RT) were 046 (13/17 - 76.47%) and 126 (4/17 – 23.53%). Regarding cgMLST, selected strains belonging to RT046 (calves 38, 182, and 243) were classified as ST35 (clade 1), and RT126 (calves 40 and 49) as ST11 (clade 5). The observed antimicrobial resistance profile was vancomycin 0/17 (0%), metronidazole 0/17 (0%), erythromycin 17/17 (100%), moxifloxacin 12/17 (70.60%), rifampicin 9/1 (52.9%), and tetracycline (13/17 - 76.47%). Most toxigenic strains (16/17 – 97.41%) were classified as multidrug-resistant to the tested antimicrobials. C. difficile can be isolated in the feces of nursing calves. No statistical correlations were observed between epidemiological data and C. difficile isolation. Calves are a source of toxigenic strains with a multidrug- resistant profile observed in humans and other animals. Keywords: cattle, diarrhea, RT126, ST35, MLST. 14 Capítulo 1 15 Introdução Clostridioides difficile (C. difficile) é uma bactéria anaeróbica, flagelada, capaz de esporulação. Em sua forma vegetativa, é descrita como bacilos gram- positivos. Sua primeira identificação ocorreu em 1935, quando Hall e O’Toole, no estado do Colorado, EUA. Neste momento realizou-se o isolamento em fezes de neonatos e a classificaram como Bacillus difficilis em função de suas características. O termo "difficilis" foi aplicado devido às dificuldades encontradas no isolamento por métodos tradicionais (HALL; O’TOOLE, 1935). Posteriormente, em 1938, o agente foi reclassificado, e incluído ao gênero Clostridium (PREVOT, 1938). Sua importância está associada ao desenvolvimento de alterações entéricas em seres humanos e animais (CZEPIEL et al. 2019; WEESE 2020). É a principal causa de diarreia associada ao uso de antimicrobianos em pacientes hospitalizados. Estes quadros são denominados como infecção causada pelo C. difficile (CDI) (MASLENNIKOV et al. 2022). Apesar da sua epidemiologia tradicional, a CDI foi descrita em pacientes jovens, sem histórico prévio de hospitalização ou tratamento com antimicrobianos (ANJEWIERDNEN et al. 2020). A CDI se desenvolve predominantemente pela via fecal-oral, iniciada com a ingestão de esporos. Os quais estão disseminados no ambiente, devido a eliminação por animais e seres humanos. No intestino ocorre a germinação do C. difficile em resposta a presença de sais biliares (taurina e glicina) e desenvolvimento de disbiose intestinal (SORG; SONESHEIN, 2008). Em condições favoráveis (anaerobiose e presença de nutrientes) ocorre a sua germinação. Em situações normais C. difficile não é capaz de aderir-se a mucosa intestinal e proliferar-se de maneira acentuada devido a microbiota intestinal estabelecida (ZHU et al. 2018). Desta forma, a disbiose é necessária para o desenvolvimento da CDI e disseminação do C. difficile (BÅVERUD et al. 2002). A resposta inflamatória é o segundo ponto crucial para o aparecimento desta síndrome (PENICHE et al. 2013). Os hospedeiros respondem de maneira 16 diferente aos estímulos oriundos das toxinas clostridiais (TENG et al. 2018; WEESE, 2020). As cepas toxigênicas de C. difficile produzem duas toxinas: a toxina A – TcdA (enterotoxina) e toxina B -TcdB (citotoxina) que causam lesões no epitélio intestinal e hipersecreção de mediadores inflamatórios (LYERLY et al. 1988). Os sinais clínicos da CDI podem variar de enterite pseudomembranosa a colite hemorrágica em função da necrose dos enterócitos (SLOVIS, 2009). Algumas cepas são capazes de produzir uma terceira toxina, conhecida como não binária (CDT), a sua participação na CDI ainda não é completamente elucidada (PENICHE et al. 2013). A partir de 1978, diversos estudos focaram no isolamento e caracterização do C. difficile em diversas espécies de animais. A incidência deste agente foi observada em potros (JONES et al. 1989), gatos (WEBER et al. 1989), cães (RILEY et al. 1991), suínos (MARTIROSSIAN et al. 1992) e avestruzes em cativeiro (FRAZIER et al. 1993). Estes estudos tiveram por objetivo determinar a ocorrência deste patógeno nestas espécies. O diagnóstico da CDI é baseado no isolamento e detecção das toxinas (TcdA, TcdB e CDT) associado a presença de fatores epidemiológicos e sinais clínicos compatíveis (DELMEÉ, 2001; CARVALHO et al. 2022). O isolamento clássico é realizado por meio de cultivos seletivos e manutenção da condição de anaerobiose (WHITTIER et al. 1993; LYERLY et al. 1998). As cepas toxigênicas são diferenciadas por meio da identificação das toxinas “in vitro” ou de seus genes por meio de técnicas de biologia molecular aplicada (KATO et al. 1991; ZIMMEL, 2008). Em seres humanos, a CDI é uma das causas mais importantes de infecção hospitalar associada à administração de antimicrobianos, em especial as fluorquinolonas (MARTIN et al. 2016; LIM et al. 2020). Após a sua germinação, ocorre a produção de suas toxinas. A TcdA causa a quebra das junções a TcdB atua sobre o citoesqueleto resultando na sua desorganização (LIM et al. 2020). As ações de ambas as toxinas causam a secreção de mediadores inflamatórios no lumem intestinal e modulam o sistema nervoso autônomo (SNA) (PENICHE et al. 2013; HRYCKOWIAN et al. 2017). 17 Consequentemente existe intensa migração leucocitária para a mucosa intestinal, que resulta na formação da pseudomembrana, típica da CDI (HOOKMAN et al. 2009). É possível estabelecer que algumas cepas de C. difficile são mais comuns em seres humanos e outras em animais (ZHU et al. 2018; CZEPIEL et al. 2022). A identificação de cepas semelhantes em seres humanos e animais iniciou a discussão sobre possível disseminação recíproca com compartilhamento de cepas (MULLIGAN, 1984; KEESSEN et al. 2013; LOO et al. 2016; HAIN- SAUNDERS et al. 2023). Apesar disso, a presença do patógenos nas fezes não está diretamente ligada a manifestação clínica da doença (JARDINE et al. 2013; RODRIGUEZ et al. 2016). Os casos de CDI em humanos aumentaram substancialmente na última década. Acredita-se que os animais tenham importância epidemiológica na transmissão da doença. De forma que a CDI começa a ser analisada pela perspectiva da saúde única (HENSGENS et al. 2012; SQUIREAND-RILEY, 2013). 36 Referências ABDEL-GIL, M.Y.; THOMAS, P.; SCHMOOCK, G.; EL-AZM, K.A.; WIELER, L.H.; NEUBAUER, H.; SEYBOLDT, C. 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Isso pode facilitar a transferência de genes de resistência entre diferentes cepas, destacando a importância da investigação do papel desses animais no ciclo de disseminação e evolução dos fatores de virulência do C. difficile. O sequenciamento completo do genoma revelou a presença de genes de resistência que podem ser compartilhados entre as cepas. Embora não seja o foco principal, compreender o envolvimento desse agente em casos de diarreia neonatal bovina parece ser um desafio cada vez maior. Portanto, não se pode incluir o C. difficile na lista de agentes causadores de diarreia em bezerros.