Campus de Botucatu João Leandro Chaguri Efeitos da exposição ao pesticida fipronil nas alterações pressóricas em ratos acordados Botucatu 2016 Campus de Botucatu Efeitos da exposição ao pesticida fipronil nas alterações pressóricas em ratos acordados Aluno: João Leandro Chaguri Orientador: Prof. Dr. Carlos Alan Candido Dias Junior Co-orientador: Prof. Dr. Antonio Francisco Godinho Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, Unesp, para a obtenção do título de Mestre em Farmacologia e Biotecnologia. Botucatu 2016 Quanto ao resto, sabemos que em todas as coisas Deus intervém para o bem daqueles que o amam; daqueles que são chamados segundo o seu desígnio. (Romanos 8,28) Dedico este trabalho ao grande amor de minha vida, minha esposa Alba, que tem sido a grande companheira e incentivadora nesta jornada e às minhas filhas-princesas Giovanna Maria e Maria Clara. Agradecimentos A Deus que, em sua Infinita Bondade, providenciou todas as coisas para que este trabalho fosse feito. Sem o Senhor eu nada seria. Aos meus orientadores Carlos Alan Candido Dias Junior e Antonio Francisco Godinho, que sempre acreditaram em minha capacidade e foram incentivadores deste processo. Obrigado pela paciência e pela amizade. Aprendi e aprendo muito com vocês. Aos companheiros de pós-graduação Fábio Anselmo, Victor Hugo Gonçalves Rizzi, Regina Aparecida do Nascimento, Daniel França Horta e José Sérgio Possomato Vieira, pela ajuda e pela amizade. Caminhar com vocês fez este percurso tornar-se menos pesado. Ao Hélio Kushima pela ajuda nas análises realizadas. Aos amigos e companheiros do CEATOX, Alaor Aparecido Almeida, Antonio Francisco Godinho, Fábio Iachel da Silva, Josie Michelle Juvencio, Julliano da Silva Otoni, Rita de Cássia Ferrari, Sarah Setznagl e Valéria Cristina Sandrim, pelo apoio e compreensão. Aos amigos, professores, funcionários e alunos da Faculdade Sudoeste Paulista – FSP. Com vocês tenho aprendido cada vez mais a arte de ensinar. Aos alunos de Iniciação Científica Kaio Henrique Luizetti, Bruna Bengosi Lopes, Fernando Gamaliel Theodoro da Silva, Taina Mazetto, Caique Faria, Faber Machado. A colaboração de vocês neste processo jamais será esquecida. Aos meus irmãos do Grupo de Oração Oásis e da Renovação Carismática Católica. Suas orações e a convivência em comunidade me sustentam. Ao amigo-irmão Wedson Maria Costa Junior. Amizade que surgiu de uma forma inesperada e tem sido uma grande escola para mim. Aos meus pais, Jairo Chaguri Filho e Santina Aparecida Caprioli Chaguri, e meu irmão Rodrigo Chaguri que há muito tempo ajudaram a dar o pontapé inicial nesta jornada. Vocês foram e são fundamentais. A minha esposa Alba Nascimento de Oliveira Chaguri e minhas princesas Giovanna Maria de Oliveira Chaguri e Maria Clara de Oliveira Chaguri, que souberam entender as ausências e todo o estresse vividos nestes tempos. Vocês são e sempre serão o porto para onde volto e renovo minhas forças, onde posso ser eu mesmo, amando e sendo amado. Amo vocês!!! LISTA DE FIGURAS E TABELAS Figura 1 – Fórmula estrutural do fipronil ...................................................................... 11 Figura 2 – Vias de Degradação do Fipronil no meio ambiente ..................................... 15 Figura 3 – Pressão arterial aumentada após exposição ao fipronil ............................... 26 Tabela 1 – Classificação Toxicológica dos Agrotóxicos ............................................... 13 LISTA DE ABREVIAURAS E SIGLAS ABIQUIM - Associação Brasileira da Indústria Química ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária CEATOX - Centro de Assistência Toxicológica CL50 - Concentração Letal média CYP - Citocromo P450 DDT - Diclorodifeniltricloroetano DL50 - Dose Letal Mediana EPA - Agência de Proteção Ambiental FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz GABA - Gamma-AminoButyric Acid ou Ácido Gama Aminobutirico INCA - Instituto Nacional do Câncer SNC - Sistema Nervoso Central T½ - tempo de Meia Vida T4 - Tiroxina TSH - Hormonio Estimulante da Tireóide Resumo RESUMO O fipronil é um inseticida fenilpirazol amplamente utilizado na Medicina Veterinária, na agricultura e domesticamente para o controle de pragas. O mecanismo responsável pela sua ação tóxica consiste na inibição seletiva dos receptores do ácido gama amino butírico GABA associado a canais de cloreto. Estudos recentes mostram que fipronil afeta organismos não-alvo, incluindo populações de espécies ambiental e, potencialmente, os seres humanos. O presente estudo verificou se a exposição a fipronil afeta a pressão arterial sistólica e biomarcadores relacionados. Assim, fipronil foi administrado oralmente a ratos (30 mg / kg / dia) durante 15 dias (grupo Fipronil) ou solução fisiológica (grupo controle). Fipronil aumentou significativamente a pressão arterial sistólica (158 ± 13 mmHg), em relação ao grupo controle (127 ± 3 mmHg). Significativamente, níveis mais elevados de fipronil no plasma foram observados no grupo Fipronil (0,46 ± 0.09μg / mL contra 0,17 ± 0.11μg / mL no grupo de controle). O grupo exposto ao Fipronil apresentou ganho de peso menor em comparação com o grupo controle. Enquanto o fipronil resultou num aumento das concentrações de endotelina-1, a redução da capacidade antioxidante e níveis menores de metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) e Nitrito/Nitrato em relação ao grupo controle, não foram observadas alterações em marcadores séricos renal e hepáticos. Portanto, este estudo sugere que o fipronil provoca hipertensão e a endotelina-1 desempenha um papel importante. Além disso, estes resultados sugerem que as reduções de tanto a MMP-2 e NO podem contribuir com a elevação da pressão sanguínea sistólica observada com fipronil. Palavras-chave: fipronil, toxicidade cardiovascular, praguicida, biomarcadores. SUMÁRIO PRÓLOGO INTRODUÇÃO 10 Fipronil 11 Toxicocinética 14 Mecanismo de Toxicidade 17 Ecotoxicidade 18 Neurotoxicidade 20 Carcinogênese 22 Genotoxicidade e Mutagenicidade 23 Toxicidade Reprodutiva 23 Hepatotoxicidade 24 Efeitos cardiovasculares 25 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 28 MANUSCRITO REFERENTE À DISSERTAÇÃO 42 Artigo publicado pelo Environmental Toxicology and Pharmacology Prólogo PRÓLOGO Esta dissertação será apresentada na forma de uma introdução consistindo em uma revisão sobre o Fipronil e seus aspectos toxicológicos, seguida pelo manuscrito referente a dissertação, publicado em março de 2016 Environmental Toxicology and Pharmacology conforme normas desta revista. Introdução 10 INTRODUÇÃO Nos últimos anos há uma crescente preocupação de que os praguicidas e outras substâncias químicas podem modificar a função endócrina normal de seres humanos e animais selvagens. Praguicidas hormonalmente ativos (também conhecido como desreguladores endócrinos) podem causar uma variedade de efeitos adversos, incluindo os riscos de desenvolvimento, reprodutivos e comportamentais. Sabe-se que a exposição de roedores e outros mamíferos, incluindo seres humanos, aos praguicidas pode gerar efeitos de toxicidade (TERÇARIOL; GODINHO, 2011). Os praguicidas estão entre os mais importantes fatores de risco para a saúde dos trabalhadores rurais e para o meio ambiente. Utilizados em grande escala por vários setores produtivos e mais intensamente pelo setor agropecuário, tratamentos de madeiras para construção, indústria moveleira, armazenamento de grãos e sementes, combate às endemias e epidemias. Enfim, as utilidades desses produtos excedem em muito o que comumente se conhece (SILVA et al., 2006). Começou-se a discutir os impactos ambientais e à saúde devido ao uso indiscriminado de praguicidas na década de 1960, o que culminou na proibição do uso do diclorodifeniltricloroetano (DDT) nos EUA pela Agência de Proteção Ambiental (EPA). (MURRAY; TAYLOR, 2000). Foi criado em 1986 o Código Internacional de Conduta para Distribuição e Uso de Agrotóxicos, estabelecendo-se padrões de conduta para o comércio e uso seguro e eficiente dos agrotóxicos, mas a fiscalização e vigilância do comércio destes produtos ainda são ineficientes (ABREU; ALONZO, 2014). Em 2013, a Associação Brasileira da Indústria Química (Abiquim) divulgou um aumento de 10,3% nas vendas de agrotóxicos no Brasil, atingindo movimentação de US$ 9,4 bilhões em 2012, ante US$ 8,5 bilhões em 2011 (ABIQUIM, 2013). Nos últimos 12 anos, o mercado brasileiro de agrotóxicos cresceu 190%, tornando o País, desde 2008, o maior consumidor dessas substâncias no mundo (CARNEIRO et al. 2012; RIGOTTO et al. 2012; ANVISA, 2009). O recorde de consumo de agrotóxicos e o contexto atual químico-dependente de produção de alimentos são reflexos da "modernização do campo" adotada pelo governo brasileiro, a partir da década de 1960, que modificou as práticas agrícolas no País (JACOBSON et al., 2009). O Instituto Nacional do Câncer (Inca), em abril de 2015, divulgou documento no qual afirma que o Brasil tem um consumo médio mensal de 5,2 quilos de veneno agrícola por habitante. Este instituto se posicionou contra as atuais práticas de uso de Introdução 11 praguicidas e ressaltou os riscos da exposição crônica, gerando infertilidade, impotência, abortos, malformações, neurotoxicidade, desregulação hormonal, efeitos sobre o sistema imunológico e câncer (INCA, 2015) Os problemas relacionados com o uso de praguicidas têm levado a uma crescente inquietação por parte dos órgãos responsáveis que atuam com o objetivo de se obter boas práticas de utilização destas substâncias. Principalmente porque os países que mais utilizam estes compostos nas culturas agrícolas dispõem de recursos humanos pouco treinados, pouca ou nenhuma infra-estrutura para fiscalização ou formação adequada e populações altamente suscetíveis com elevadas taxas de analfabetismo e precárias condições de saúde (WESSELING et al., 2005). FIPRONIL O Fipronil (C12H4Cl2F6N4OS, cujo nome químico é 5-amino-1-[2,6-dicloro-4- (trifluormetil) fenil]-4-[(trifluorometil) sulfinil]-1H-pirazol-3-carbonitrila – Figura 1) (CONNELLY, 2001) é um pesticida derivado quimicamente da família do fenilpirazol, considerado de segunda geração, altamente ativo e de amplo espectro (WILDE et al., 2001), sendo descoberto por Rhone Poulenc Agro em 1987, introduzido no mercado em 1993 e registrado como um pesticida nos Estados Unidos da América em 1996 (CONNELLY, 2001; GUNASEKARA et al., 2007). O fipronil foi o primeiro inseticida deste grupo utilizado para o controle de pragas (IKEDA et al., 2001). Fig. 1 – Fórmula estrutural do fipronil Fonte: TINGLE et al., 2003 É um desregulador do sitema nervoso similar em toxicidade para organoclorados clássicos, tais como dieldrin e endosulfan, mas com cerca de 500 vezes maior toxicidade seletiva para insetos e baixa toxicidade para mamíferos (GRANT et al., 1998; RATRA; CASSIDA, 2001). Introdução 12 Comercialmente pode ser encontrado com vários nomes como: Icon ® , Regent ® , Ascend ® , Chipco ® , Adonis ® , Frontline ® . É classificado toxicologicamente como moderadamente tóxico para ratos e camundongos (HAINZL; CASIDA, 1996). A DL50 oral para ratos é 97mg/kg, sendo considerado tóxico para os mamíferos através da ingestão. É levemente tóxico por via dérmica para ratos, com uma DL50 maior que 2000mg/kg (CONNELLY, 2001). O fipronil, em sua forma pura, é um pó branco, com massa molar de 437 g mol-1 (TINGLE et al., 2003; AMARAL, 2012) com odor de bolor (TINGLE et al., 2003). Apresenta ponto de fusão de 195,5 a 203°C, sua solubilidade de 0,0024 g L-1 em água no pH 5,0 e 0,0022 g L-1 no pH 9,0, sendo altamente solúvel em solventes orgânicos (545,9 g L-1 em acetona) (AMARAL, 2012). O fipronil é conhecido em mais de 70 países e utilizado em mais de 100 diferentes tipos de culturas para o controle de pestes (ZHAO; SALGADO, 2010; AMARAL, 2012). Foi introduzido na Europa e nos Estados Unidos em meados de 1990 (LI; AKK, 2008) e autorizado para comercialização na França em 1994 (BICHON et al., 2008), porém, por causa de sua possível implicação na mortalidade de abelhas, desde 2004, a sua utilização como produto fitossanitário foi suspensa neste país (OLIVEIRA, 2010). Nos Estados Unidos, o fipronil não é registrado para uso na agricultura no estado da Califórnia (GUNASEKARA et al., 2007). Também teve seu uso proibido nos demais países da Europa pelo alto grau de toxicidade, comprovado pelos problemas sérios registrados em organismos expostos (OLIVEIRA, 2010). No entanto, em alguns países não europeus, continua a ser um dos ectoparasiticidas mais utilizados para animais de estimação na medicina veterinária (LACROIX et al., 2010; ZHAO; SALGADO, 2010). Em medicina veterinária o fipronil tem sido amplamente utilizado para o controle de pulgas, carrapatos e piolhos mastigadores de bovinos, cães e gatos. Em agricultura este agente é usado como inseticida, formicida e cupinicida em culturas de algodão, arroz, batata, cevada, feijão, soja, milho, cana-de-açúcar, trigo e pastagens (HAINZL; CASIDA, 1996; MOHAMED et al., 2004; SZEGEDI et al., 2005; WILDE et al., 20001). É eficaz para o controle de cupins e gafanhotos, tanto na fase de larva como em estágio adulto (CONNELLY, 2001), bem como insetos resistentes aos inseticidas: piretróides, organofosforados, e carbamato (CONNELLY, 2001; GUNASEKARA et al., 2007). Segundo monografia publicada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária, o fipronil pode também ser utilizado como produto domissanitário no controle de Introdução 13 formigas em apresentações de isca granulada ou pó seco, para produtos de venda livre para jardinagem amadora. Pode ser utilizado também como preservante de madeira (ANVISA, 2012). Na agricultura pode ser empregado em aplicação no solo nas culturas de batata, cana-de-açúcar e milho. Aplicação foliar nas culturas do algodão, arroz, eucalipto e soja. Aplicação em sementes de algodão, amendoim, arroz, cevada, feijão, milho, pastagens, sorgo, soja e trigo. Aplicação foliar em mudas de eucalipto. Aplicação no controle de formigas e cupins, e aplicação na água de irrigação para o arroz irrigado (ANVISA, 2012). No Brasil o fipronil está na categoria de classificação toxicológica classe II - altamente tóxico (Tabela 1) (ANVISA, 2012). O fipronil é frequentemente aprensentado como isca de inseto, spray para pets e como produtos granulados para gramados, incluindo também líquidos, pós e grânulos e microgânulos dispersíveis em água (TINGLE et al., 2003) Estudos crônicos com alimentação incluindo fipronil para ratos mostraram que ocorrem: ansiedade, diminuição do ganho de peso, diminuição do consumo alimentar e da eficiência na conversão alimentar, diminuição dos valores hematológicos, alterações de parâmetros sanguíneos (colesterol, cálcio e proteína), alterações dos hormônios da tireóide, alterações na bioquímica da urina, alterações grosseiras à necropsia, aumento do peso do fígado e tireoide e efeitos renais (U.S. EPA, 1996). Além deste efeito, o fipronil também provoca efeitos de toxicidade reprodutiva (U.S.EPA, 1996), hepatotoxicidade (SOUSA et al., 1997), alterações comportamentais (TERÇARIOL; GODINHO, 2011) e desregulação endócrina (U.S.EPA, 1998). Foi publicado um caso clínico descrevendo os sintomas induzidos por fipronil em pacientes, relatando dor de cabeça, náuseas, vertigem e fraqueza (CHODOROWSKI Introdução 14 e ANAND, 2004). Este relato indica que inseticidas de 2° geração também podem provocar graves efeitos em humanos em casos de exposição prolongada. Embora várias investigações recentes tentem esclarecer a toxicidade neuronal de fipronil em mamíferos, há poucos dados acerca de efeitos fisiológicos detalhados (FUNG et al., 2003). Um dos grandes problemas observados é a ocorrência de risco de exposição ocupacional para seres humanos quando o fipronil é utilizado, por exemplo, pelo operador de pulverização. Fipronil é pouco penetrante em pele humana e quando ocorre é improvável ser maior que 1% - 3% da dose aplicada. Apesar disto, neste tipo de ocupação, podem ser observados sintomas como reações oculares, respiratória, gastrointestinal e outras reações sistêmicas, rapidamente reversíveis. (TINGLE et al., 2003). TOXICOCINÉTICA Segundo dados da literatura corrente fipronil pode sofrer transformações metabólicas e degradações abióticas a vários produtos fundamentais (Figura 2) gerando MB 46513 (fipronil desulfinil) por fotólise, MB 45950 (fipronil sulfeto) por redução, MB 46136 (fipronil sulfona) por oxidação e RPA 200766 (fipronil amido) por hidrólise (PEI et al., 2004). Fig. 2 – Vias de Degradação do Fipronil no meio ambiente Introdução 15 Fonte: PEI et al., 2004 Segundo TINGLE et al. (2003) o principal metabólito, fipronil-desulfinil (MB 46513), é extremamente estável e é mais tóxico que o composto de origem sendo aproximadamente 10 vezes mais tóxico para mamíferos, em testes de laboratório, que o produto original A degradação é lenta no solo argiloso, com uma meia vida de 34 dias (BOBE et al., 1997). Nos organismos vivos, tanto o metabólito fipronil-sulfona quanto o produto de degradação fipronil-desulfinil, foram relatados como sendo mais tóxicos para insetos, mamíferos, peixes e pássaros que o próprio composto original (DAS et al., 2006). Em estudo com ratos, após administração por via oral, fipronil foi rapidamente metabolizado e o pico plasmático foi alcançado 5,5 horas após o tratamento; a meia- vida de eliminação foi de 183 horas em machos e 245 horas em fêmeas. O fipronil se distribuiu por todos os tecidos, com maior predomínio no tecido adiposo (MARTINS, 2009). Estudos metabólicos mostraram que havia um potencial maior de bioacumulação do produto MB-46513 (fipronil-desulfinil), em tecidos gordurosos (U.S.EPA, 1998). Em carne bovina, outro estudo mostrou resultados semelhantes confirmando a lenta depuração do fipronil na gordura, resultando em uma acumulação leve sob constante condição de pasto. Segundo estes autores, a meia vida do fipronil na gordura da carne é em torno de 18 dias (TINGLE et al., 2003). Um estudo com o tratamento por via tópica em cães e gatos detectou fipronil concentrado em glândulas sebáceas, camadas epiteliais que rodeiam os pelos 2 meses após o tratamento, sugerindo a difusão passiva do fipronil no pelo e pele (JACKSON et al., 2009 Relativamente, pouco se sabe sobre a capacidade do fipronil ser metabolizado em vertebrados. Estudos in vivo de mamíferos indicam que a via metabólica principal para o fipronil envolve a formação oxidativa do metabólito sulfona (DAS et al., 2006; CID, 2012). Estudos com microssomas hepáticos humanos e isoformas do citocromo P450 (CYP) recombinantes demonstraram que a formação da sulfona é quase exclusivamente o resultado da atividade do CYP3A4. Embora limitado, o metabolismo por CYP2C19 também foi relatado. O metabólito sulfona, assim como produtos da fotodegradação, o fipronil-dessulfinil, foram relatados como sendo mais tóxicos para insetos, mamíferos, peixes e aves do que o próprio composto original (DAS et al., 2006; CID, 2012). TANG et al. (2004), em seus estudos, concluíram que, o CYP3A4 é a Introdução 16 principal enzima responsável pelo metabolismo do fipronil. Também constataram que a principal via metabólica ocorre por meio da oxidação do grupo tio éter para a formação do fipronil-sulfona e a enzima responsável pela oxidação é uma isoforma do citocromo P450. In vitro, fipronil aumenta atividades de CYP1A1 e 3A4 em hepatócitos humanos. Em contraste, nenhum efeito claro de fipronil foi evidenciado nas atividades de microssomas de ratos e coelhos tratados com fipronil (1,2 e 5 mg/kg/d por 4 e 14 dias) (LEGHAIT et al., 2009). Fipronil é metabolizado, principalmente, em sulfona (CABONI et al., 2003; SILVA, 2008; MARTINS, 2009; LACROIX et al., 2010), sulfeto, dessulfinil (CABONI et al., 2003; MARTINS, 2009) e amida por hidrólise (SILVA, 2008; MARTINS, 2009). Outro metabólito da transformação do fipronil resulta em ácido sulfônico, mas em menor grau (GAUTHIER et al., 2008). A via predominante do metabolismo do fipronil é a oxidação, em sulfona correspondente. Esta reação, principalmente catalisada pelo citocromo P450 isoforma CYP3A4, pode ser considerada como uma via de bioativação uma vez que o metabólito é a sulfona (CRAVEDI et al., 2013). A sulfona tem seis vezes mais afinidade do que o composto original para bloquear os receptores GABA no cérebro e vinte vezes maior potência em bloquear os canais de cloreto ativados pelo GABA em mamíferos (JACKSON et al., 2009; CID, 2012; CRAVEDI et al., 2013) do que nos insetos (JACKSON et al., 2009), em comparação com o fipronil inalterado. Fipronil-sulfona também é suspeito de ser mais tóxico do que o fipronil em diferentes espécies. Além disso, o fipronil-sulfona persiste no sangue por muito mais tempo que o próprio fipronil (CRAVEDI et al., 2013). Fipronil-dessulfinil, o primeiro metabolito ambiental (fotodegradação) do fipronil, é 9 a 10 vezes mais ativo sobre os canais de cloro de mamíferos do que o composto original, reduzindo a seletividade entre os insetos e humanos quando expostos para este metabólito (JACKSON et al., 2009). Fipronil-dessulfinil apresenta um nível de toxicidade para mamíferos 10 vezes superior ao fipronil, além de ser extremamente mais estável (FERREIRA, 2010; FERREIRA et al., 2011; FERREIRA et al., 2012). O fipronil é lentamente metabolizado e excretado em ratos (CRAVEDI et al., 2013). A concentração máxima do fipronil no sangue ocorre de 4 a 6 horas após sua ingestão e começa a declinar lentamente, sendo seu processo de eliminação lento (AMARAL, 2012). O tempo de meia vida (T½) longo do fipronil no sangue, de 150 a 245 horas em alguns casos, pode ser atribuído a liberação lenta de resíduos de gordura e pode sugerir potencial de bioacumulação de produtos metabólicos do fipronil (TINGLE et al., 2003; CID, 2012), pois, devido a intensa recirculação êntero-hepática, possui Introdução 17 elevado tempo de meia-via, tornando-se assim, um fator de acréscimo de sua toxicidade (SILVA, 2008). Em uma pesquisa com ratos, o fipronil apresentou tempo de meia-vida em sangue total, após administração oral na dose de 4 mg/Kg, de 6,2 a 8,3 dias (JACKSON et al., 2009; CID, 2012). A excreção do fipronil e de seus metabólitos é realizada principalmente através das fezes e em menor quantidade através da urina (AMARAL, 2012). Em ratos, a excreção do fipronil ocorre 75 % pelas fezes e 25 % pela urina (TINGLE et al., 2003; JACKSON et al., 2009; UDO, 2012) tanto para machos, quanto para fêmeas (TINGLE et al., 2003). MECANISMOS DE TOXICIDADE Fipronil é uma molécula extremamente ativa e um potente desregulador do Sistema Nervoso Central (SNC) dos insetos e dos mamíferos. O mecanismo responsável pela sua ação tóxica consiste na inibição seletiva dos receptores do ácido gama-amino butírico (GABA) associado a canais de cloreto (GARSSADI et al., 1994; ZHAO et al., 2004; GROSMAN et al., 2006). A molécula de fipronil inibe de forma não-competitiva o receptor do GABA, fixando-se na porção internalizada deste receptor ionotrópico, inibindo o influxo celular dos íons cloro, anulando assim o efeito neuro-regulador do GABA (SARTOR; SANTARÉM, 2006) e resultando em atividade neural excessiva; o aumento da atividade neural causa paralisia e, conseqüentemente, a morte do organismo exposto (MANRIQUE, 2009; ZHAO et al. 2004). Matsuda et al. (2001) observaram que fipronil possui maior afinidade por receptores-transmissores de insetos que de mamíferos que resulta em menor toxicidade em relação a outros inseticidas. Esta seletividade deve-se à elevada capacidade do fipronil de bloquear a isoforma dos canais de Cl- do receptor GABA de insetos (HAINZL; CASIDA, 1996). Apesar disso, o fipronil pode ligar-se aos receptores GABAA e GABAC de mamíferos (IKEDA et al., 2001; RATRA et al., 2002). Embora o canal iônico de GABA seja importante na transmissão nervosa tanto em vertebrados quanto em invertebrados (GRANT et al., 1990) e fipronil se ligue aos receptores GABA dos vertebrados, esta ligação é menos firme que aquela nos invertebrados, o que teoricamente proporciona a seletividade do fipronil (RHÔNE- POULENC, 1995; GRANT et al.,1998). Introdução 18 O principal mecanismo de ação da toxicidade de fipronil em humanos, se expostos, ocorre pelo mesmo princípio de ação tóxica observado em insetos, ou seja, inibição no receptor GABA (HAINZL; CASIDA, 1996; OZOE et al., 2000; TANG et al., 2004), fazendo bloqueio não competitivo dos canais de cloro dos neurônios no SNC. Há três rotas principais de intoxicação por fipronil: oral, dérmica e inalação (JENNINGS et al., 2002; FUNG et al., 2003). No primeiro caso, o fipronil parece não representar um agente tóxico grave para os mamíferos; no entanto, qualquer espécie pode ser afetada se a dose for maior do que a recomendada pelos fabricantes. De acordo com relatos na literatura, há casos de intoxicação devido à exposição acidental ou uso incorreto do composto (CHODOROWSKI; ANAND, 2004; LEE et al., 2010). Um caso de intoxicação aguda após a ingestão de uma dose alta de fipronil causou morte humana (MOHAMED et al., 2004). O mecanismo de ação do fipronil é muito semelhante ao de outros grupos de inseticidas, como os piretróides e o grupo dos ciclodienos dos organoclorados: aldrin, endrin, dieldrin. Estes compostos químicos também agem no receptor GABA na transmissão nervosa, mas há diferenças nos sítios de ligação entre classes inseticidas (TINGLE et al., 2003). ECOTOXICIDADE A utilização deste inseticida em grandes quantidades pode gerar resíduos no ambiente, principalmente nos recursos hídricos próximos às áreas nas quais foi utilizado. De acordo com Manrique et al. (2013), não existem informações suficientes sobre os impactos que este inseticidas e os demais agrotóxicos utilizados podem causar nos sistemas aquáticos. No ar o fipronil tem pressão de vapor relativamente baixa, segundo a lei de Hanry´s (constante), e não se volatiliza rapidamente. Em aplicações por aspersão é provável que não se encontre vapores presentes no ar (BCPC, 1997; U. S. EPA, 1996). No solo, o valor médio do coeficiente de adsorção do fipronil .à matéria orgânica do solo (Koc) é 803, que confere ao composto de baixa a moderada adsorção por área de superfície (MEDE RHÔNE-POULENC AGRICULTURAL LIMITED, 1997; DPR, 2001). A molécula tem baixa capacidade de dispersão na terra, mas isto não resulta em baixo potencial para a contaminação das águas subterrâneas (USEPA, 1996; BURR, 1997). Introdução 19 Em estudo comparativo da adsorção do fipronil, em dois tipos de solo no mediterrâneo, foi constatado que a adsorção estava diretamente relacionada com a quantidade de matéria orgânica presente no solo (BOBÉ et al., 1997). No ambiente aquático a solubilidade determinada para o fipronil foi de 2,0 a 2,4 mg.L-1 (USEPA, 1996; KIDD e JAMES, 1991; AYLIFFE, 1998). O fipronil foi adsorvido rapidamente em sedimento com areia contendo 8% de matéria orgânica e pH 5,8 (FEUNG e YENNE, 1997). A vida média do fipronil em condições aquáticas aeróbias é de aproximadamente 14,5 dias. Nesta condição, a maior quantidade de metabólito formado é de sulfito, que correspondeu a 74% do resíduo total depois de 30 dias (FEUNG e YENNE, 1997). Connelly (2001) descreveu a transformação do fipronil no meio aquático, onde gera o desulfinil, subproduto com ação neurotóxica semelhante à molécula original do fipronil, que mantém a ação tóxica aos organismos expostos. Em estudos metabólicos observa-se que há um potencial de bioacumulação do desulfinil em tecidos gordurosos (DEMCHECK; SKROBIALOWSKI, 2003; CONNELLY, 2001). Em estudos de campo e de laboratório em diferentes tipos de solo, sob diversas condições ambientais, foram estabelecidas as rotas de degradação do fipronil em água e em solo. O composto pode ser metabolizado via redução ao sulfeto, via oxidação a sulfona, e via hidrólise à amida. Em presença de luz solar, o fipronil é fotodegradado e forma o desulfinil fipronil (FENET et al., 2001). Os testes ecotoxicológicos podem ser utilizados como instrumento de predição (ESPÍNDOLA et al., 2003), antecipação e diagnóstico de possíveis impactos ecológicos causados pelos compostos tóxicos (CALOW, 1993), bem como para classificação, A ecotoxicidade aguda do fipronil foi avaliada para alguns organismos não- alvos. CHANDLER et al. (2004) estimaram a Concentração Letal média (CL50);96h de fipronil para o copépode Amphiascus tenuiremis em 0,0068 mg.L-1 e determinaram a sobrevivência de 90% expostos a 0,22 mg.L-1; 94 % de inibição da reprodução com 0,42 mg.L-1 e atraso no tempo de expulsão dos ovos pelas fêmeas. Para o microcrustáceo Daphnia pulex, a CL50;96h estimada foi de 0,016 mg.L-1 (STARK et al., 2005). A CL50; 96h calculada para truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) foi de 0,248 mg.L-1 (USEPA, 1996). Scott et al. (2008) determinaram o efeito do fipronil nos córregos usados para irrigação da cultura de arroz, por meio da avaliação da comunidade macroinvertebrada. Introdução 20 Verificaram que a persistência, após seis meses de uma única aplicação de 0,005 mg.L- 1 diminuiu a população dos macroinvertevrados aquáticos estudados. Fipronil é altamente tóxico para abelhas (DL50 de 0,004 µg/abelha), lagartos (DL50 para Acanthodactylus dumerili [Lacertidae] é de 30 µg/g peso corporal) e galináceos (DL50 de 11,3 mg/Kg para codornizes do Norte) (TINGLE et al., 2003). A utilização incorreta do fipronil causa sérias preocupações, pois no Brasil existem áreas totais sendo pulverizadas, não havendo a menor preocupação com possíveis contaminações e prejuízos aos ecossistemas. Há registros sobre redução do número de abelhas em várias partes do país. A sua utilização deve ser mais bem pesquisada com o objetivo de determinar os reais riscos apresentados ao ambiente (AMARAL, 2012). Jennings et al. (2002) encontraram grandes quantidades de fipronil em cães tratados com fipronil, mesmo após 24h de aplicação, indicando riscos para a saúde humana se a exposição é repetida. NEUROTOXICIDADE Segundo LARINI (1999) neurotoxicidade é a capacidade que um composto químico tem de provocar efeitos adversos no sistema nervoso central, no sistema nervoso periférico e órgãos do sentido, podendo ser reversíveis (quando ocorrem mudanças funcionais temporárias) e irreversíveis (mudanças estruturais com lesão ou degeneração de componentes estruturais do sistema nervoso). Alterações do comportamento em animais expostos a um determinado agente químico podem servir como indicativo de que a substância provoca neurotoxicidade. Comportamento tem sido utilizado como um bioindicador de função (WORMLEY et al., 2004) para estudar efeitos tóxicos de agentes químicos, como o fipronil, por exemplo. Cães mostraram sinais clínicos de neurotoxicidade crônica e exames neurológicos anormais (U.S.EPA, 1996). Na avaliação da neurotoxicidade subcrônica ao fipronil (TINGLE et al., 2003), ratos mostraram um aumento na incidência de anúria, aumento na incidência da resposta ao beliscão da cauda em machos, aumento na incidência da resposta exagerada a um estalido, em machos e fêmeas, e aumento na força de agarrar dos membros anteriores, na idade de 13 semanas, em fêmeas. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S094029931000206X#bib0130 Introdução 21 Um estudo crônico da ação do fipronil por via oral em cães da raça Beagle, com dose de 10 mg/Kg/dia, foi reportado perda de apetite, postura curvada, inatividade, convulsão, tremores no corpo e balançar de cabeça. Nesta dose também houve a morte da metade do número de animais expostos. Os estudos hematológicos e de urinálise não mostraram alterações (CID, 2012). Estudos utilizando metabólitos do fipronil também foram realizados. Ratos foram alimentados com fipronil-dessulfinil nas doses 0, 0.5, 2.0, e 10 ppm por dois anos (0, 0.025, 0.098 e 0.050 mg/Kg/d para machos e 0, 0.032, 0.130, e 0.550 mg/Kg/d para fêmeas). A dose inicial de 10 ppm foi reduzida para 6 ppm nas fêmeas, após 26 semanas, devido ao aumento da mortalidade. Machos e fêmeas apresentaram aumento da incidência de agressividade e irritabilidade ao toque, na maior dose testada. Fêmeas também apresentaram aumento da salivação na dose de 10 e 6 ppm, e convulsões, nas doses de 2, 6 e 10 ppm. Além disso, machos na dose de 10 ppm e fêmeas nas doses 2, 6 e 10 ppm, desenvolveram sinais clínicos de toxicidade, sem evidência de carcinogenicidade. Nenhum efeito foi observado em doses abaixo de 0.5 ppm (0.025 mg/Kg/d) (JACKSON et al., 2009). Uma pesquisa foi realizada em ratos machos e fêmeas para a avaliação aguda da neurotoxicidade do fipronil, utilizando doses entre 0,5 e 50 mg/Kg. Foi possível observar, na maior dose testada, morte em até dois dias após o tratamento. Na necropsia, notou-se hemorragia cerebral difusa. Sete horas após o tratamento, os animais apresentaram sinais de depressão (diminuição do número de levantamentos, diminuição dos reflexos e diminuição da temperatura corporal) e de estimulação do sistema nervoso central (tremores, convulsões tônico-clônicas, mioclonias) (MARTINS, 2009). No estudo de TERÇARIOL e GODINHO (2011) demonstrou-se que ratos expostos agudamente ao fipronil têm alterações comportamentais importantes pois foi observado aumento dos comportamentos de congelamento, limpeza e levantar sugerindo que o fipronil aumenta a emocionalidade e a atividade exploratória dos animais sem modificar sua atividade locomotora. CARCINOGÊNESE Fipronil é um dos vários praguicidas conhecidos que induzem câncer na tireóide de ratos, provavelmente como o resultado de sua habilidade de acentuar o metabolismo hepático e a excreção dos hormônios da tireóide. É possível que a indução de enzimas microssomais e a sua capacidade de melhorar o metabolismo hepático dos hormônios Introdução 22 tireoidianos e excreção inclusive aumento do peso do fígado e hipertrofia hepatocelular, possa ter um papel no desenvolvimento do tumor (HURLEY et al., 1998; DAS et al., 2006; TINGLE et al., 2003; MARTINS, 2009).). De acordo com a classificação pela U.S.EPA de carcinogênicos químicos, o fipronil foi classificado como pertencente ao grupo C (possível carcinogênico humano), baseado no aumento nos tumores de células foliculares da tireóide em ambos os sexos de ratos. Há 2 mecanismos básicos pelo qual substâncias químicas podem induzir neoplasia em glândula tireoideana em roedores, um devido a um efeito carcinogênico direto na própria tireóide e o outro no qual uma variedade de mecanismos que funcionam como desreguladores da tireóide, induzem neoplasia da glândula tireoideana, secundária ao desequilíbrio hormonal Como explicado anteriormente, fipronil parece agir por meio de mecanismo secundário (U.S.EPA 1998). Em estudo de LEGHAIT et al. (2009), demonstrou-se que ratos tratados com fipronil (3mg/kg/dia por via oral durante 14 dias) apresentaram diminuição da concentração plasmática de Tiroxina (T4) por aumento da depuração (provavelmente pelo aumento da atividade das enzimas hepáticas) e aumento da concentação plasmática de Hormonio Estimulante da Tireóide (TSH). Corroborando com estas observações para fipronil, estudos mostram que a exposição prolongada de células da tiróide para valores elevados de TSH predispõem ao desenvolvimento de tumores de tireóide em ratos (HURLEY et al., 1998; WILLIAMS, 1995; HOOD el al, 1999). Tigle et al. (2003) afirmaram que, devido a importantes diferenças na fisiologia da glândula tireóide entre roedores e humanos, isto poderia indicar que o rato não seria um bom modelo para mecanismos carcinogênios da tireóide em humanos. Uma associação entre a concentração de TSH elevado e câncer de tireóide foi recentemente relatada em seres humanos (BOELAERT, 2009). Porém em um estudo recente realizado em condições de exposição ocupacional ao fipronil em uma fábrica de produção de medicamentos veterinários, não demonstrou que a exposição crônica a fipronil foi associada a um aumento da incidência de testes TSH anormais. As concentrações de fipronil sulfona foram correlacionados negativamente com concentrações de TSH nos trabalhadores expostos ao fipronil, levantando a possibilidade de que o fipronil tem um efeito inibidor central sobre a secreção de TSH em seres humanos (HERIN et al., 2011). Estes dados juntos sugerem uma ação desreguladora endócrina do praguicida. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0300483X08004654 http://erc.endocrinology-journals.org/search?author1=Kristien+Boelaert&sortspec=date&submit=Submit Introdução 23 GENOTOXICIDADE E MUTAGENICIDADE: Vários estudos têm demonstrado que os praguicidas podem ter efeitos genotóxicos em organismos direta ou indiretamente expostos (incluindo seres humanos) (BORZSONYI et al., 1984, DULOT et al.., 1985 e NEHÉZ et al.., 1988) e, por conseguinte, a avaliação da genotoxicidade de praguicidas é atualmente de grande importância. Em estudo realizado por OLIVEIRA et al. (2012B), o ensaio cometa revelou que o fipronil para as doses de 15mg/kg e 25mg/kg não induzem danos no DNA em camundongos. Por outro lado, efeitos genotóxicos significativos foram observados no tratamento com 50mg/kg de fipronil. Camundongos tratados com esta dose exibiram uma frequência média mais elevada de células danificadas e índice de genotoxicidade com a maioria dos cometas classificados como classe 1. Com base nestes resultados, esta concentração de fipronil pode induzir danos no DNA de organismos expostos, os quais podem ou não serem reparados. TOXICIDADE REPRODUTIVA Os agroquímicos orgânicos como o fipronil, podem ocasionar prejuízos ao desenvolvimento embriofetal, provocando aborto ou deficiências na formação do feto, alterações fisiológicas como alterações na modulação do sistema endócrino de animais silvestres e do ser humano, além de alterações comportamentais (VOGEL; HAGLER, 1996; POHL et al., 1998). Um dos possíveis mecanismos de ação para esse efeito é a interferência com a síntese de esteróides, mais precisamente com a enzima CYP 19 aromatase, que catalisa a conversão de andrógenos em estrógenos, sendo responsável pelo balanço homeostático entre o que tradicionalmente são considerados hormônios femininos e masculinos (SIMPSON; DAVIS, 2001). Em estudo de TINGLE et al. (2003) sobre toxicidade reprodutiva em ratos, observou-se que fipronil está associado com efeitos reprodutivos, baseados nos efeitos sobre a tireóide, fígado e glândula pituitária, sinais clínicos de toxicidade, diminuição do tamanho da ninhada, diminuição do peso corporal, diminuição na porcentagem de acasalamento, redução do índice de fertilidade, redução na sobrevivência pós- implantação e sobrevivência pós-natal da prole e retardo no desenvolvimento físico. Estudos de OHI et al. (2004) demonstraram que os efeitos adversos do fipronil sobre o aparelho reprodutor de ratas estão relacionados às alterações provocadas no sistema endócrino dos animais. Estes agentes ativos hormonais (desreguladores http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S094029931000206X#bib0050 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S094029931000206X#bib0190 Introdução 24 endócrinos) podem causar uma variedade de efeitos adversos à saúde incluindo alterações do desenvolvimento comportamental e riscos reprodutivos; também resulta em alterações dos níveis de progesterona e estradiol, na duração do ciclo estral e taxa de gestação de fêmeas de ratos Wistar. Os níveis de desequilíbrio hormonal podem impedir o transporte dos espermatozóides, e consequentemente passagem do óvulo fertilizado para dentro do útero. Neste estudo observou-se prolongamento do ciclo estral (dias) após uma única administração tópica de 70 mg/kg quando comparado com o controle. Também reduziu o índice de gravidez (67%) no grupo da dose mais elevada (280mg/kg). Os níveis de progesterona e estradiol no plasma, obtidos em diferentes períodos após o tratamento com fipronil, foram significativamente diferentes depois de 96 h de tratamento, quando comparados com os controles, demonstrando que o fipronil pode alterar o funcionamento normal do sistema endócrino e causar efeitos reprodutivos adversos em ratas fêmeas, o que também contribui para engrandecer a sugestão de um efeito desregulador endócrino pelo praguicida. HEPATOTOXICIDADE: Das et al., (2006) observaram que o fipronil promove indução enzimática hepática (CYP1A1, CYP3A4, CYP2B6 e CYP3A5) de forma dose dependente, porém, doses muito altas podem fazer retornar o nível do citocromo a níveis normais. Fipronil sulfona induziu efeitos citotóxicos a doses baixas, e a possibilidade de que estes efeitos citotóxicos fossem devido a apoptose foi indicada por indução tempo e dose dependente, da atividade da enzima caspase – 3/7 em células HepG2 e hepatócitos humanos (DAS et al., 2006). Um estudo realizado por Silva (2008) avaliou os efeitos da exposição prolongada de ratos ao inseticida; foram observados hepatócitos edemaciados e aumento do peso do fígado em animais tratados com uma dose oral de 10 mg kg-1, o que corresponde a um décimo do valor da DL50 estabelecida para ratos (TINGLE et al., 2003). Além disso, os fígados de ratos analisados após a exposição a diferentes doses de fipronil (15, 25 e 50 mg kg-1) revelaram alterações citológicas, morfológicas e histoquímicas nos hepatócitos com processos autofágicos, esteatose e morte celular por necrose (OLIVEIRA et al., 2012A) Uma vez no sangue, o fipronil e os seus metabólitos são amplamente distribuídos, em particular nos tecidos adiposos, além de ter um elevado nível de recirculação entero-hepática (HAINZL; CASIDA, 1996; MOHAMED et al., 2004). A Introdução 25 formação do metabólito sulfona, que é derivado de uma reação de oxidação do grupo tioéter, corresponde à principal via de metabolismo hepático do composto (CABONI et al., 2003; TANG et al., 2004). De acordo com Leghait et al. (2009), esta oxidação é catalisada por enzimas do citocromo P450. Tanto o fipronil como seu metabólito sulfona podem induzir a morte celular em células HepG2 e em hepatócitos humanos (DAS et al., 2006). Os mecanismos hepatotóxicos do fipronil não são conhecidos. Em mitocôndria isoladas de fígado de rato Vidau et al. (2011) demonstraram que o fipronil exerce efeito desacoplador. Em outro estudo, o fipronil se mostrou inibidor da cadeia de transporte de elétrons, mais especificamente no complexo I, de forma dose dependente a partir da concentração de 5 μM (PALMA et al., 2013). EFEITOS CARDIOVASCULARES Recentemente, realizamos um estudo piloto para avaliarmos os possíveis efeitos nocivos do fipronil e verificamos que a aplicação diária de fipronil por via tópica (durante três dias) resultou em possíveis ações deletérias caracterizadas por níveis pressóricos elevados comparados aos animais não expostos ao fipronil (controle) (Figura 3). P r e s s ã o s is t ó li c a d e c a u d a ( m m H g ) C o n t r o l e F i p r o n i l d e r m a l 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 n = 8 n = 8 * Fig. 3 – Pressão arterial aumentada após exposição ao fipronil (estudo piloto no laboratório do CEATOX) Introdução 26 Curiosamente, alguns casos de intoxicação humana por fipronil deram entrada em nosso Centro de Assistência Toxicológica (CEATOX), os quais apresentaram sintomas tipicamente associados com o bloqueio dos receptores da função GABAérgica (tais como náusea, dor de cabeça e convulsões) e, surpreendentemente, alguns deles também apresentaram elevação da pressão arterial. No entanto, nenhum estudo anterior havia examinado os efeitos da exposição ao fipronil sobre a pressão arterial sistólica, e conforme o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo para elucidar os mecanismos envolvidos no desenvolvimento muito precoce da hipertensão induzida pelo fipronil em ratos. Alguns mecanismos têm sido propostos para explicar, ao menos em parte, as alterações cardiovasculares causadas por alguns praguicidas. Neste contexto, incluem- se: 1 - a formação aumentada de espécies reativas de oxigênio (ROS) induzidas pelo fipronil (KI et al., 2012); 2 - a redução da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO) (CASARES, MANTIONE, 2006); 3 – o aumento da reatividade vascular aos vasoconstritores endotelina, catecolaminas e angiotensina.(MONTICIELO et al., 2008) Sabe-se que o estresse oxidativo ativa as metaloproteinases (JACOB- FERREIRA; SCHULZ, 2013) e a associação entre atividade aumentada de metaloproteinases (especialmente a MMP-2) na hipertensão pode ser confirmado por estudos recentes sugerindo que a MMP-2 participe da patogênese da hipertensão em animais (CASTRO et al., 2011; WALTER et al., 2008) assim como em humanos hipertensos (AHMED et al., 2006; YASMIN et al., 2005). Os aumentos dos níveis de MMP-2 foram associados às significativas alterações funcionais bem como na remodelação vascular secundária a hipertensão em ratos. (CASTRO et al., 2012; GUIMARAES et al., 2011). O mecanismo preciso e pelo qual a atividade aumentada da MMP-2 correlaciona-se com o aumento da pressão sanguínea ainda não está esclarecido, no entanto, a MMP-2 pode aumentar a contratilidade vascular ao clivar peptídeos envolvidos no controle do tônus vascular, promovendo a degradação de peptídeos vasodilatadores, tais como o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) (FERNANDEZ-PATRON et al., 2000) e adrenomedulina (MARTINEZ et al., 2004), bem como a formação de peptídeos vasoconstritores, a endotelina-1 (FERNANDEZ-PATRON et al., 1999). Introdução 27 Referências Bibliográficas 28 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABREU, P. H. B.; ALONZO, H. G. A.Trabalho rural e riscos à saúde: uma revisão sobre o "uso seguro" de agrotóxicos no Brasil. Ciênc. 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