Jonathas Eduardo Virgilio Piassi Avaliação da resposta óssea a uma superfície de implante revestida com diferentes concentrações de Raloxifeno em ratas ovariectomizadas. Estudo experimental in vivo ARAÇATUBA-SP 2022 Jonathas Eduardo Virgilio Piassi Avaliação da resposta óssea a uma superfície de implante revestida com diferentes concentrações de Raloxifeno em ratas ovariectomizadas. Estudo experimental in vivo Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, FOA - UNESP, para a obtenção do título de em “Mestre em Odontologia” – Área de Concentração em Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial. Orientador: Prof. Associado Idelmo Rangel Garcia Júnior ARAÇATUBA-SP 2022 Catalogação na Publicação (CIP) Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP Piassi, Jonathas Eduardo Virgilio. P581a Avaliação da resposta óssea a uma superfície de implante revestida com diferentes concentrações de Raloxifeno em ratas ovariectomizadas: estudo experimental in vivo / Jonathas Eduardo Virgilio Piassi. – Araçatuba, 2022 44 f. : il. ; tab. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia de Araçatuba Orientador: Prof. Idelmo Rangel Garcia Júnior 1. Implantação dentária 2. Osteoporose 3. Osteointegração 4. Cloridrato de raloxifeno I. T. Black D7 CDD 617.6 Claudio Hideo Matsumoto CRB-8/5550 Dedico este trabalho à minha querida mãe. AGRADECIMENTOS Agradeço a minha família, em especial minha mãe e minha esposa, que sempre foram meu alicerce, apoiando-me nessa empreitada do início ao fim. Ao Professor Orientador Dr. Idelmo Rangel, pelo auxílio ao longo dessa caminhada e pelos conhecimentos compartilhados. Aos membros da banca avaliadora, Professores Francisley Ávila e André Fabris, os quais nutro profundo respeito e admiração. À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, em especial a Faculdade de Odontologia de Araçatuba, por toda estrutura e suporte que me proporcionou. “Todo começo é involuntário. Deus é o agente. O herói a si assiste, vário E inconsciente. À espada em tuas mãos achada Teu olhar desce. Que farei eu com esta espada? Ergueste-a, e fez-se.” Fernando Pessoa Piassi JEV. Avaliação da resposta óssea a uma superfície de implante revestida com diferentes concentrações de Raloxifeno em ratas ovariectomizadas: estudo experimental in vivo [dissertação]. Araçatuba: Universidade Estadual Paulista; 2022. RESUMO O recobrimento da superfície de implantes pode desempenhar um papel fundamental no processo de osseointegração. Esse processo pode ser ainda mais vantajoso especialmente em pacientes com doenças sistêmicas que afetam a qualidade do tecido ósseo, como a osteoporose. O presente estudo tem como objetivo avaliar a resposta óssea de superfícies de implante modificadas com raloxifeno em ratas ovariectomizadas. Os animais (n=48) foram divididos de acordo com o uso de raloxifeno e processo de indução de osteopenia induzido por ovariectomia. Cada rata recebeu um implante em cada tíbia. Os implantes do grupo intervenção tiveram sua superfície modificada com raloxifeno segundo o método biomimético de modificação de superfície em dois ciclo. O grupo controle (n=32) teve a superfície do implante tratada apenas com duplo ataque ácido. Os grupos foram divididos da seguinte forma: (G1) Duplo ataque ácido em ratas SHAM (CST); (G2) Duplo ataque ácido em ratas ovariectomizadas (COT); (G3) raloxifeno 0,06 mg/mL em ratas SHAM (R6ST); (G4) raloxifeno 0,06 mg/mL em ratas ovariectomizadas (R6OT); (G5) raloxifeno 1mg/mL em ratas SHAM (R1ST); e (G6) raloxifeno 1 mg/mL em ratas ovariectomizadas (R1OT). Os espécimes foram implantados cirurgicamente na tíbia dos animais e submetidos às análises histométricas após 15 e 40 dias. Os dados qualitativos foram avaliados pelo orientador com expertise no tema e os dados quantitativos foram avaliados utilizando análise de variância e teste de turkey com nível de significância de 0,05. Como resultado, os implantes do grupo controle foram superiores aos recobertos com raloxifeno na concentração de 0,06 mg/mL (tanto no grupo sham, quanto no grupo ovariectomizado), no que diz respeito a área óssea neoformada no período de observação de 15 dias. No entanto, não houve diferença estatisticamente significativa entre o controle e o raloxifeno na concentração de 1mg/mL para o mesmo período. Além disso, não foram observadas diferenças estatiticamente significativas com relaçao a área ossea neoformada no período de 40 dias e para a extensão linear de contato osso-implante para todos os períodos acompanhados. Deste modo, conclui-se que o recobrimento com raloxifeno embora apresentou resultado inferior ao controle em uma menor concentração no período inicial da osseointegração, revelou resultados bastante semelhantes ao controle entre os grupos submetidos à maior concentração do fármaco nos demais tempos avaliados, outros estudos devem ser conduzidos para otimizar a deposição na superfície dos implantes e avaliar a relação dose-resposta. Palavra-chave: Implantação dentária. Osteoporose. Osteointegração. Cloridrato de Raloxifeno. Piassi JEV. Evaluation of bone response to implant surfaces coated with different concentrations of Raloxifene in ovariectomized rats: in vivo experimental study. [dissertação]. Araçatuba: Universidade Estadual Paulista; 2022. ABSTRACT The surface covering of implants can play a key role in the osseointegration process. This process can be tissue even higher in quality with patients suffering from diseases like osteoporosis, osteoporosis. The present study aims to evaluate the bone response of implantation surfaces modified with raloxifene in ovariectomized rats. Animals (n=48) were divided according to raloxifene use and ovariectomy-induced osteopenia induction process. Each rat received one implant in each tibia. The implants in the intervention group (n=64) had their surface modified with raloxifene according to the biomimetic method of surface modification in two cycles. The control group (n=32) had a surface to be treated only with double acid etching. The groups were divided as follows: (G1) Double acid in SHAM rats (CST); (G2) Double acid attack in ovariectomized rats (TOC); (G3) raloxifene 0.06 mg/ml in SHAM rats (R6ST); (G4) raloxifene 0.06 mg/mL in ovariectomized rats (R6OT); (G5) 1mg/mL raloxifene in SHAM rats (R1ST); and (G6) 1 mg/mL raloxifene in ovariectomized rats (R1OT). The animals' tibia were surgically operated and the information was implanted to histometry after 15 and 40 days. Significance analysis data were used to use variation data and turkey test with a level of 0.5. As a result, the implants in the control group were superior to those coated with raloxifene at a concentration of 0.06 mg/mL (both in the sham group and in the ovariectomized group), with regard to the newly formed bone area in the 15-day observation period. . However, there was no statistically significant difference between the control and raloxifene at a concentration of 1mg/mL for the same period. In addition, no statistically significant differences were observed for the newly formed bone area in the 40- day period and for the linear extent of bone-implant contact for all periods followed. Thus, it is concluded that the coating with raloxifene, although it presented a lower result than the control at a lower concentration in the initial period of osseointegration, revealed very similar results between the groups submitted to the highest concentration of the drug in the other evaluated times, other studies should be conducted to optimize deposition on the surface of implants and evaluate the dose-response relationship Keyword: Dental implantation. Osteoporosis. Osseointegration. Raloxifene Hydrochloride. LISTA DE FIGURAS Fig. 1 Delineamento experimental do estudo ........................................................................... 19 Fig. 2 Divisão dos grupos de estudo ......................................................................................... 20 Fig. 3 Procedimento Cirúrgico realizado bilateralmente. (A): Após tricotomia e antissepsia, foi realizada incisão na região da metáfise tibial; (B): Acesso à tíbia do animal; (C) osteotomia bi- cortical com fresa espiral de 1,4mm de diâmetro; (D) Defeito ósseo de 1,4mm criado pela fresa; (E) Instalação de implante de 1,6 x 3,0 mm de diâmetro, tratado ou não com Raloxifeno; (F) e (G) Vista superior e lateral de implante instalado bicorticalmente com estabilidade inicial. ................................................................................................................... 23 Fig. 4 Microscopia eletrônica de varredura dos implantes: A) Região cervical do implante do controle (50X); (B) Região cervical do implante recoberto com raloxifeno 0,06 mg/mL (50X); (C) Região cervical do implante recoberto com raloxifeno 1 mg/mL (50X); (A2, B2 e C2) Região cervical do implante controle sem aumento ................................................................. 27 Fig. 5 Análise elementar com energia dispersiva de raios X do grupo (a) controle e (b) recoberto com raloxifeno 1mg/mL e (c) raloxifeno 0,06 mg/mL............................................. 28 Fig. 6 Imagens histológicas de lâminas provenientes de ratas Sham coradas com HE ............ 29 Fig. 7 Imagens histológicas de lâminas provenientes de ratas ovariectomizadas coradas com HE ............................................................................................................................................. 30 Fig. 8 AON em relação a concentração de raloxifeno .............................................................. 32 Fig. 9 ELCOI em relação a concentração de raloxifeno utilizada ............................................ 33 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Análise comparativa da AON em percentagem......................................................... 31 Tabela 2 Análise comparativa do ELCOI em percentagem ..................................................... 31 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANOVA Análise de Variância AON Área Óssea Neoformada C celsius CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais cm centímetro COBEA Comitê Brasileiro de Experimentação Animal ELCOI Extensão Linear de Contato Osso-Implante FOA UNESP Faculdade de Odontologia de Araçatuba – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” g grama HE Hematoxilina e Eosina JPEG Joint Photographics Experts Group Kg quilogramas L litro Mg miligramas mL mililitro MSREs Moduladores Seletivos de Receptores de Estrogênio NaOH hidróxido de sódio PVPI Polivinil Pirrolidona Iodo SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 13 2 PROPOSIÇÃO .................................................................................................................... 16 3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................... 18 3.1 Desenho experimental ...................................................................................................... 18 3.2 Revestimento da superfície dos implantes com raloxifeno .............................................. 20 3.3 Caracterização das superfícies dos implantes .................................................................. 21 3.3.1 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ................................................................ 21 3.3.2 Espectrometria de energia dispersiva ............................................................................ 21 3.4 Processo de indução de osteopenia .................................................................................. 21 3.5 Instalação dos implantes nas tíbias dos animais .............................................................. 22 3.6 Análise histológica e histomorfométrica .......................................................................... 24 3.7 Análise Estatística ............................................................................................................ 25 4 RESULTADOS ................................................................................................................... 27 4.1 Caracterização dos implantes ........................................................................................... 27 4.2 Espectrometria de energia dispersiva ............................................................................... 27 4.3 Análise histomorfométrica ............................................................................................... 28 5 DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 35 6 CONCLUSÃO .................................................................................................................... 38 REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 40 ANEXOS ................................................................................................................................ 44 INTRODUÇÃO 13 1 INTRODUÇÃO* O uso de implantes dentários em pacientes parcialmente ou totalmente edêntulos vem sendo considerado uma prática comum e crescente na reabilitação oral [1]. Embora essa abordagem seja considerada uma opção de tratamento com altas taxas de sucesso, muito casos podem ser afetados pela perda de estabilidade precoce dos implantes [2]. Neste contexto, o mecanismo de osseointegração pode ser considerada a etapa mais crítica para o sucesso da cirurgia de implante [3, 4]. A osseointegração pode ser compreendida como o processo fisiológico que resulta na conexão estrutural e funcional direta entre o osso e a superfície do implante. Assim, o sucesso a longo prazo e as taxas de sobrevivência podem estar diretamente ligadas a este processo [1]. Vários fatores tem sido reconhecidos na literatura por influenciar o mecanismo de osseointegração. Dentre estes, é possível destacar o formato do implante, o estado do leito ósseo, as condições de carga aplicada, a condição de saúde do paciente e o revestimento da superfície dos implantes [4]. Neste contexto, várias técnicas de tratamentos de superfície têm sido aplicadas para favorecer o mecanismo de osseointegração. Esta estratégia visa tornar mais rápida e eficiente a formação óssea e assim conferir melhor estabilidade durante o processo de cicatrização [5, 6]. Esse processo pode ser fundamental em áreas com baixa quantidade ou qualidade de osso. Dentro deste contexto, é possível citar os pacientes com doenças sistémicas como potenciais beneficiados das modificações das superfícies implantares. Nestes casos, o processo patofisiológico da doença pode alterar a de cicatrização e osseointegração do implante. Entre essas doenças, destaca-se a diabetes, as síndromes metabólicas e ,principalmente, a osteoporose [3, 7]. A osteoporose pode ser compreendida como um distúrbio esquelético caracterizado por baixa densidade e deterioração da microarquitetura óssea [8]. A doença esta relacionada principalmente ao processo de envelhecimento e diminuição dos hormônios sexuais. Essas mudanças levam a um desequilíbrio da reabsorção e remodelação dos ossos, resultando na diminuição da massa esquelética. Assim, o desenvolvimento da doença pode prejudicar a * Normalizado de acordo com a Clinical Oral Investigations - https://www.springer.com/journal/784/submission- guidelines#Instructions%20for%20Authors_References https://www.springer.com/journal/784/submission-guidelines#Instructions%20for%20Authors_References https://www.springer.com/journal/784/submission-guidelines#Instructions%20for%20Authors_References 14 qualidade de vida, aumentando a morbidade, mortalidade e incapacidade [9]. Existem vários tratamentos farmacológicos disponíveis para o tratatamento da osteoporose. Os fármacos são classificados como antirreabsortivos ou anabólicos. Os primeiros atuam diminuindo a taxa de reabsorção óssea, como os bisfosfonato e moduladores seletivos de estrogênio (MSREs), enquanto os últimos aumentam a formação óssea, por exemplo suplementos de cálcio, hormônio da paratireoide, entre outros. [10]. O raloxifeno é o MSRE mais conhecido para o tratamento da osteoporose. Este fármaco é considerado um modulador de estrogénio de segunda geração e está disponível há mais de uma década para o tratamento e prevenção da osteoporose em mulheres na menopausa [11]. O raloxifeno atua como um agonista estrogênico nos tecidos duros, diminuindo a reabsorção e a renovação óssea [12]. Além disso, o medicamente também atua modulando a diferenciação dos osteoblastos e aumentando a apoptose dos osteoclastos [13]. Devido a estas propriedades, os MSREs tem sido administrados em modelos animais com osteoporose para se investigar as alterações ósseas promovidas na superfície de implantes. Os trabalhos tem mostrado que o grupo tratado com raloxifeno apresentam melhores resultados histológicos, de contato osso-implante e de torque reverso comparados ao grupo controle. Esses resultados tem sido explicados pela capacidade do raloxifeno de inibir a reabsorção óssea tanto em curto como em longo prazo, melhorando a fixação do implante [3, 14, 15]. Embora os trabalhos mencionados tenham apresentado resultados promissores, eles avaliaram a administração do medicamento por via oral, promovendo o efeito do fármaco de maneira sistémica. Neste estudo, o uso do raloxifeno foi investigado a partir do revestimento da superfície dos implantes, que tem demonstrado sucesso em diversas aplicações com outros modificadores, incluindo o bifosfonato (também utilizado no tratamento da osteoporose) [16, 17]. Deste modo, a influência de diferentes concentrações de raloxifeno impregnadas na superfícies de implantes instalados na tíbia de ratas osteoporóticas foi investigada no presente estudo. OBJETIVO 16 2 PROPOSIÇÃO O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta óssea periimplantar de superfícies de implantes revestidas com diferentes concentrações de Raloxifeno em ratas ovariectomizadas, empregando-se análises histológicas e histométricas. MATERIAIS E MÉTODOS 18 3 MATERIAIS E MÉTODOS Este estudo foi realizado de acordo com os Princípios Éticos para a Experimentação Animal, adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). O projeto foi delineado de acordo com as diretrizes da ARRIVE guidelines[18] e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FOA-UNESP sob o processo FOA nº 00458-2020 (Anexo A). O cálculo amostral foi realizado utilizando o software G Power (Düsseldorf, Alemanha) utilizando como base um estudo piloto prévio conduzido pelo nosso grupo de pesquisa. A medida foi feita considerando um poder de teste de 80% e nível de confiança de 95%, que indicou que 48 animais seriam necessários. Assim, foram utilizados 96 ratas Albinus Wistar, fêmeas ,com 3 meses de idade e peso aproximado de 350-450g. Todos os animais foram cedidos pelo Biotério Central da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – FOA, UNESP onde foram mantidos em ambiente climatizado a uma temperatura de 21±2ºC, com ciclos de claro e escuro de 12/12 horas [19]. Os animais foram alimentados com ração sólida padrão e água “ad Libitum” durante todo o experimento. 3.1 Desenho experimental Os animais foram separados em 6 grupos de acordo com a intervenção (raloxifeno 1 mg/mL, raloxifeno 0,06 mg/mL ou controle) e processo de indução de osteopenia (sham ou cirurgia de ovariectomia). Foram utilizados 96 implantes de titânio comercialmente puro (1,6 mm de diâmetro e 3,0 mm de comprimento) (Implalife®, Jales, São Paulo, Brazil) em um total de 48 animais (corpo dividido). Dentre estes, 32 (16 para o grupo sham e 16 para o grupo ovariectomizado) tiveram a superfície tratada (método biomimético) com raloxifeno em concentração de 0,06 mg/mL e 32 implantes (16 para o grupo sham e 16 para o grupo ovariectomizado) foram tratados com raloxifeno em concentração de 1 mg/mL. Além disso, 32 (16 para o grupo sham e 16 para o grupo ovariectomizado) tiveram a superfície tratada com duplo ataque ácido como controle. Os desfechos (análise histomorfemétrica) foram medidos com 15 e 40 dias após a eutanásia. A Figura 1 ilustra uma representação esquemática do delineamento do estudo juntamente as legendas dos grupos de animais. Para facilitar a identificação dos grupos, eles foram formados com a primeira letra indicando o tratamento recebido: “C” para o grupo controle, “R6” para o grupo Raloxifeno 0,06 mg/mL e “R1” para o grupo Raloxifeno 19 1mg/mL. Em sequência, os grupos receberam outra designação conforme o processo de ovariectomização: “OT” se foram para o grupo ovariectomizados e “ST” se foram para o grupo Sham. Fig. 1 Delineamento experimental do estudo A figura 2 apresenta como foi feita a divisão dos implante nas tibias dos animais empregados no estudo. A distribuição foi feita para que a combinação de implantes tratados (Raloxifeno 0,06 mg/mL; Raloxifeno 1mg/mL) e controles pudessem ficar dispostos de maneira igualitária nas tíbias dos animais. Assim, foram necessários seis animais (três do grupo sham e três animais do grupo ovariectomizado) para a instalação da combinação de todos os pares de grupos de intervenção e controle (Raloxifeno 0,06 mg /controle; Raloxifeno 1mg/controle; Raloxifeno 0,06/Raloxifeno 1mg). 20 Fig. 2 Divisão dos grupos de estudo 3.2 Revestimento da superfície dos implantes com raloxifeno Todos os implantes utilizados passaram pelo processo de ataque ácido durante a fabricação industrial para alterar a rugosidade do material. Os implantes do grupo intervenção (n=64) tiveram sua superfície modificada com Raloxifeno segundo o método biomimético de modificação de superfície em dois ciclos [20, 21]. Primeiramente, eles foram colocados em uma placa de Petri e submersos em 50 ml de solução de hidróxido de sódio (NaOH) (5,0 mol.L-1). O material foi então colocado em estufa por 24 horas a 60ºC para a ativação da superfície. Após esta etapa, a solução de NaOH foi dispensada e os implantes foram mantidos em estufa por um período de 3 horas a 60ºC para secagem da superfície. Após a secagem, os implantes foram imersos em uma solução de raloxifeno preparada em água de injeção (pH 7,25) em duas concentrações diferentes (0,06 mg/mL e 1 mg/mL). As soluções permaneceram por um período de 4 dias em estufa a 37ºC para o recobrimento com o fármaco. Após esta etapa, os implantes foram mantidos em estufa por um período de 3 horas a 60ºC para secagem da superfície. 21 O grupo controle não passou por nenhuma etapa do método biomimético de modificação de superfícies 3.3 Caracterização das superfícies dos implantes 3.3.1 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) Os implantes foram caracterizados por um microscopio eletônico Philips XL-30 FEG sem aumento e em ampliações de 50X. Tanto os materiais que não receberam recobrimento como aqueles recobertos pelo método biomimético foram fotografados e comparados visualmente. 3.3.2 Espectrometria de energia dispersiva Os implantes também foram avaliados por espectrometria de energia dispersiva (EDS) usando um equipamento Oxford Inca-X-sight 7298 para avaliar a composição química DA formação da película formada no exterior do material. Tanto os materiais que não receberam recobrimento como aqueles recobertos pelo método biomimético foram registrados. 3.4 Processo de indução de osteopenia Para obter um modelo animal osteopênico, foi realizado o processo de indução de osteopenia através da cirurgia de ovariectomia e dieta com baixa ingestão de cálcio proposta por Gao et al. [19]. Previamente a instalação de implantes, foi realizada a verificação do ciclo estral dos animais e apenas aqueles que apresentarem três ciclos regulares foram selecionados para o estudo [22]. Para a indução da osteopenia, foi realizada a cirurgia de ovariectomia em 24 ratas do grupo ovariectomizado. Esse procedimento foi realizado com os animais em jejum (8 horas) utilizando cloridrato de xilazina (Coopers, SP, Brasil,.) e cloridrato de cetamina (Fort Dodge, SP, Brasil). Em seguida, as ratas foram imobilizadas sobre prancha cirúrgica em decúbito lateral e uma incisão de 1cm foi realizada nos flancos. Após este processo, foi realizada a divulsão por planos do tecido subcutâneo e do peritônio a fim de ter acesso à cavidade abdominal. Dessa forma, os ovários e os chifres uterinos foram localizados e laqueados com 22 fio de Poliglactina 910 5-0 (Vicryl 5-0®, Johnson, SP, Brasil). Após a remoção do tecido ovariano, foi feita a sutura por planos com fio de Poliglactina 910 4.0 Os animais do grupo sham foram submetidas ao mesmo procedimento, porém a exposição cirúrgica dos chifres uterinos e dos ovários foi realizada sem as etapas de laqueadura e remoção [23]. 3.5 Instalação dos implantes nas tíbias dos animais Trinta dias após a ovariectomia, os animais foram submetidos à instalação de implantes, após jejum pré-operatório de 8 horas. A anestesia por sedação foi realizada por administração via intramuscular de cloridrato de cetamina a 1% (Vetaset® –Fort Dodge, SP, Brasil), na dosagem de 60 mg/Kg, e de cloridrato de xilazina a 2% (Dopaser®, SP, Brasil), 8 mg/Kg. Foi realizada em complementação anestésica a infiltração local de solução de cloridrato de mepivacaína a 2% com epinefrina 1:100.000 (Mepiadre 100®, SP, Brasil) na dosagem de 0,3 mg/Kg na metáfise tibial. A tíbia foi acessada após prévia tricotomia da região lateral direita e esquerda e antissepsia pré-operatória por fricção de gaze embebida em Polivinil Pirrolidona Iodo Degermante a 10% (1% de iodo ativo) (PVP-I 10%, Riodeine®, SP, Brasil) associado ao PVP- I Tópico a 10%. O cirurgião foi o mesmo em todos os procedimentos e as cirurgias foram realizadas seguindo todos os princípios de assepsia para garantir a manutenção da cadeia séptica. Com o auxílio de uma lâmina de bisturi número 15C (Feather Industries Ltda, Tokyo, Japão) montada em cabo de bisturi número 3 (Hu-Friedy®, German), uma incisão linear por planos anatômicos de 1 cm foi feita na região lateral da metáfise tibial (Figura 3A). A pele e o periósteo foram cuidadosamente descolados e devidamente afastados com um descolador tipo Molt (Hu-Friedy®, German) o suficiente para a exposição da porção lateral da metáfase tibial (Figura 3B). Após exposição do tecido ósseo, foi realizada osteotomia bi-cortical com fresa espiral de 1,4 mm de diâmetro (Figuras 3 C e D) montada em contra- ângulo redutor de 20:1 (Kavo® do Brasil, Joinvile, Brasil). O sistema de fresa foi conectado a um motor elétrico de rotação controlada (modelo BLM 600 plus, Driller®, SP, Brasil) a 1500 rpm sob irrigação com solução isotônica de cloreto de sódio a 0,9% (Fisiológico®, SP, Brasil). Cada animal recebeu um implante de titânio (1,6 mm de diâmetro e 3,0 mm de 23 comprimento; Implalife, SP, Brazil) em cada tíbia com travamento e estabilidade inicial, (Figuras 3 E, F e G). Fig. 3 Procedimento Cirúrgico realizado bilateralmente. (A): Após tricotomia e antissepsia, foi realizada incisão na região da metáfise tibial; (B): Acesso à tíbia do animal; (C) osteotomia bi- cortical com fresa espiral de 1,4mm de diâmetro; (D) Defeito ósseo de 1,4mm criado pela fresa; (E) Instalação de implante de 1,6 x 3,0 mm de diâmetro, tratado ou não com Raloxifeno; (F) e (G) Vista superior e lateral de implante instalado bicorticalmente com estabilidade inicial. Finalizada a instalação do implante, o retalho cirúrgico foi reposicionado e suturado por planos. O plano muscular foi suturado por pontos contínuos simples com fio absorvível de Poliglactina 910 5-0 (Vicryl 5-0®, SP, Brasil) e o plano cutâneo por pontos interrompidos simples com fio de Nylon 4-0 (ETHILON Nylon Suture®, SP, Brasil). No pós-operatório imediato, os animais receberam administração intramuscular de Pentabiótico (0,1mL/Kg, Fort Dodge Saúde Animal, SP, Brasil) em dose única e três doses 24 de morfina (2,5 mg/kg) (Dimorf®, SP, Brasil) com intervalo de 24 horas. Aos 15 e 40 dias, foi realizada a eutanásia dos animais por dose excessiva de anestésico Tiopental (150mg/kg, Thiopentax, SP, Brasil) adicionado a lidocaína (4mg/kg, Xylestesin®, SP, Brasil). A remoção das tíbias foi feita com margem de um cm de tecido ósseo do implante dentário e os espécimes foram fixados por 48 horas em formol neutro (10%, tamponado) (Reagentes Analíticos, Dinâmica Odonto-Hospitalar Ltda, Catanduva, SP, Brasil). 3.6 Análise histológica e histomorfométrica Após a etapa de fixação, as tíbias foram descalcificados em EDTA 20% com trocas semanais da solução por um período de 6 a 9 semanas e desidratados com trocas crescentes de álcoois. Em seguida, foi feito a diafanização com xilol I e II, com trocas a cada 1 hora e 45 minutos, sendo posteriormente incluídas em parafina para obtenção de lâminas histológicas com cortes de 5 µm de espessura. Após estarem secas, as lâminas foram submetidas à coloração com hematoxilina e eosina (HE). As amostras foram codificadas e avaliadas por um único examinador, que desconhecia o respectivo grupo da secção (processo de cegamento para o avaliador). As lâminas histológicas coradas em HE foram fotografadas em microscópio óptico em aumento de 125x e 40x acoplado a uma câmera de captação de imagem e conectado a um microcomputador Core i5 com o software de processamento e análise de magens AxioVision 4.9.1® (Carl Zeiss, JA, Deutschland). As medidas histomorfométricas foram realizadas através do software analisador de imagens digitalizadas, ImageJ® (OA, Canadá). Foram calculadas: a área óssea neoformada (AON) e a extensão linear de contato osso-implante (ELCOI) em duas espiras na região medular ao redor do implante. Esse parâmetros foram determinado em estudo prévio que determinou a interferência da região cortical para os resultados histomorfométricos [24, 25]. Os dados obtidos nas análises foram transformados em valores absolutos de pixels para valores percentuais relativos, de modo a minimizar a interferência da diferença do tamanho negativo. 25 3.7 Análise Estatística Para a análise estatística, os dados foram primeiramente submetidos ao teste de normalidade de Shapiro-Wilk para a determinação da distribuição amostra e tipo de teste (paramétrico versus não paramétrico). Após a confirmação da distribuição normal, o teste Anova de duas vias foi utilizado. Em caso de diferenças entre os grupos o teste de post-hoc de Tukey foi utilizado. O nível de significância de 0,05 foi usado para todos os testes. O software SigmaPlot 12.3 (Exakt Graphs and Data Analysis, CA, USA) foi utilizado para realizar as determinações. RESULTADOS 27 4 RESULTADOS 4.1 Caracterização dos implantes As microscopias revelaram as diferenças entre os implantes modificados com raloxifeno (Figura 4 A, B e C). Enquanto é possível observar uma superfície lisa no implante controle, pode se observar um fino filme no implante com raloxifeno. Além disso, nota-se porosidade nas imagens de aumento nos implantes com duplo ataque ácido enquanto uma superfície homogênia naquela que recebeu raloxifeno. Fig. 4 Microscopia eletrônica de varredura dos implantes: A) Região cervical do implante do controle (50X); (B) Região cervical do implante recoberto com raloxifeno 0,06 mg/mL (50X); (C) Região cervical do implante recoberto com raloxifeno 1 mg/mL (50X); (A2, B2 e C2) Região cervical do implante controle sem aumento 4.2 Espectrometria de energia dispersiva Na análise elementar- nota-se a diferença dos implantes do grupo controle com os recobertos com raloxifeno pela diferença de composição química apresentada por ambos. Enquanto o grupo controle apresentou em sua composição praticamente 100% de titânio (Figura 5A) o grupo tratado com raloxifeno (Figura 5B e C) também apresentou majoritariamente outros elementos, como oxigênio (O) e carbono (C), que são os mais presentes na molécula de raloxifeno. Outos elementos como Cálcio (Ca), Cloro (Cl), Sódio (Na) podem ser dos reagentes de síntese. 28 Fig. 5 Análise elementar com energia dispersiva de raios X do grupo (a) controle e (b) recoberto com raloxifeno 1mg/mL e (c) raloxifeno 0,06 mg/mL 4.3 Análise histomorfométrica Após a realização da coloração com HE, os implantes foram submetidos às analises histomorfométricas. Qualitativamente, foi possível observar que os animais do grupo SHAM, tratados com implantes do grupo controle (duplo ataque acido) apresentaram, na avaliação de 15 dias, os seguintes achados histológicos: ossificação com corticalização, predomínio de osso cortical e tecido medular em algumas áreas. Em contrapartida, os animais SHAM que receberam raloxifeno na concentração de 0,06 mg/mL apresentaram atraso no processo de ossificação, regiões com presença de fibroses e baixa ossificação com predomínio de tecido conjuntivo fibroso. Já os animais SHAM tratados com raloxifeno na concentração de 1mg/mL neste mesmo período (15 dias), apresentaram atraso na ossificação com maior presença de áreas medulares e poucas trabéculas ósseas, como consequente predomínio de osso medular. No período de observação de 40 dias, os animais SHAM que receberam implantes do grupo controle apresentaram um perfil ósseo em remodelação com substituição de áreas corticais por medulares. O mesmo ocorreu com as ratas do grupo raloxifeno 1 mg/mL e 0,06 mg/mL, mas com maior predomínio de áreas medulares. Os animais ovariectomizados apresentaram características semelhantes ao grupo Sham no período de observação de 15 dias. No grupo controle, foi observado a presença osso corticalizado, com presença de algumas regiões medulares, sendo predominantemente do tipo cortical. Nos animais do grupo raloxifeno 1mg/mL, observou-se uma corticalização predominante, além de medula óssea presente. Em contrapartida, o grupo de animais em que foram administrados raloxifeno 0,06mg/mL, notou-se a presença de tecido conjuntivo fibroso e tecido osteióde (presença de condrócitos) e osso maturo, iniciando a diferenciação. No período de 40 dias, o grupo controle apresentou-se com trabéculas finas em corticalização e áreas medulares em remodelação. Já nos animais ovariectomizados que receberam raloxifeno 29 na concentração de 1 mg/mL, notou-se a presença de tecido medular e remodelação, muito similar ao controle no mesmo período. Por fim, no grupo que recebeu a menor concentração de fármaco foi verificada a atividade de deposição e remodelação em algumas áreas. Este grupo possuía, visualmente, semelhante quantidade ossificação que o raloxifeno na concentração de 1mg/mL no mesmo período de tempo, uma vez que ainda se encontrava em processo de deposição do osso, sendo isto relacionado ao atraso no processo de deposição inicial. As figuras 6 e 7 apresentam as laminas coradas pela técnica HE. Fig. 6 Imagens histológicas de lâminas provenientes de ratas Sham coradas com HE 30 Fig. 7 Imagens histológicas de lâminas provenientes de ratas ovariectomizadas coradas com HE Na determinação quantitativa, os parâmetros histomorfométricos (AON e ELCOI) foram avaliados estatísticamente por ANOVA. Para o ELCOI, não houve diferença estatística entre os tês grupos avaliados tanto para os animais controle, quanto para as ratas ovariectomizadas durante os períodos dois períodos avaliados (15 e 40 dias). Portanto, a análise de post-hoc de Tukey não foi conduzida. Para a AON, foi observada diferença estatisticamente significativa entre os implantes controle e o raloxifeno na concentração de 0,06 mg/mL nos animais Sham e ovariectomizados na avaliação de 15 dias. No entanto, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre o grupo controle e o grupo raloxifeno 1mg/mL para ambos os grupos neste mesmo período. Para as avaliações feitas em 40 dias, não houve diferenças estatiscamente significativas entre os grupos avaliados, tanto em animais do grupo Sham, como do grupo controle. Os dados estão presentes na Tabela 1 e 2 e figuras 8 e 9. 31 Tabela 1 Análise comparativa da AON em percentagem Animais Sham (AON) Animais ovariectomizados (AON) Tempo CST Média (DP) R6ST Média (DP) R1ST Média (DP) P valor COT Média (DP) R6OT Média (DP) R1OT Média (DP) P valor 15 dias 78,07 ± (0,38)☨ 21,34 ± (3,26) 66,05 ± (4,64) <0,001 60,56 ± (1,62) ☦ 12,7 ± (12,28) 67,08 ± (3,18) <0,001 40 dias 54,02 ± (13,46) 37,43 ± (3,06) 43,79 ± (1,31) 0,25 50,04 ± (9,52) 37,64 ± (11,63) 44,71 ± (2,68) 0,46 ☨ teste post-hoc de tukey indicando CST=R1ST>R6ST ☦ teste post-hoc de tukey indicando COT= R1OT > R6OT Tabela 2 Análise comparativa do ELCOI em percentagem Animais Sham (ELCOI) Animais ovariectomizados (ELCOI) Tempo CST Média (DP) R6ST Média (DP) R1ST Média (DP) P valo r COT Média (DP) R6OT Média (DP) R1OT Média (DP) P valo r 15 dias 1507,5 ± (-243,96) 320,5 ± (-96,88) 1338 ± (- 370,53) 0,81 1234,5 ± (- 603,17) 372,5 ± (-147,79) 577,5 ± (-54,45) 0,11 40 dias 1330,5 ± (-279,31) 974 ± (- 459,62) 912,5 ± (-7,78) 0,63 683 ± (- 48,09) 745,5 ± (-65,77) 1006 ± (- 568,52) 0,19 32 Fig. 8 AON em relação a concentração de raloxifeno 33 Fig. 9 ELCOI em relação a concentração de raloxifeno utilizada DISCUSSÃO 35 5 DISCUSSÃO Neste estudo, foram realizadas modificações na superfícies de implantes para melhorar a etapa de osseointegração. Embora existam estudos utilizando o raloxifeno por via sistêmica, a longa duração e a alta dosagem podem ser considerada uma desvantagem dessa abordagem. Além disso, também foi utilizados neste estudo o processo de ovariectomia, que é o modelo mais comumente empregado para causar osteoporose em animais. A preocupação com a osseointegração neste grupo específico deve-se ao fato de que a maioria dos pacientes que precisam obter implante são de idade avançada, os quais apresentam perda óssea progressiva ou desenvolvimento de osteoporose no local de implantação [26]. Os resultados obtidos demonstraram efeito da deposição do raloxifeno nas concentrações analisadas no processo de osseointegração. No período de observação de 15 dias (Sham e ovariectomizado), o grupo controle, ilustrado pela corticalização óssea com predomínio de osso cortical e tecido medular, apresentou maior ossificação, em relação ao grupo de menor concentração (raloxifeno 0,06 mg/ml). Este evento pode ser explicado pela elevada área superficial dos implantes tratados com duplo-ataque ácido, que apresentam um grande potencial de osseointegração. No entanto, o grupo controle não apresentou diferenças significativas quanto ao grupo raloxifeno na concentração de 1mg/ml. Em contrapartida, os animais que receberam raloxifeno na concentração de 0,06 mg/mL apresentaram maior atraso no processo de ossificação comparados com aqueles que receberam raloxifeno 1mg/mL. Esse fenômeno pode ser explicado pelo processo de recobrimento, que passa por reagentes e etapas que podem ser consideradas negativas para o processo de osseointegração. Neste caso, a maior concentração de raloxifeno pode ter minimizado estes eventos por mecanismos químicos diretos (durante a etapa de recobrimento) ou promovendo efeitos farmacológicos tardios. Em contrapartida, a AON não se apresentou estatisticamente significativa entre os grupos (sham e ovx), quando comparada ao controle, no período de observação de 40 dias. Isso pode ser explicado pela etapa de remodelação óssea já ter sido praticamente concluída. No entanto, neste período o grupo raloxifeno 0,06 mg/m (sham e ovx) apresentou um crescente processo de ossificação, bastante semelhante quando comparado ao grupo de concentração 1mg/mL. Delega-se a isto o fato de que o primeiro ainda se encontrava em processo de deposição óssea devido ao atraso da ossificação nos 15 dias iniciais. Isto pode ser avaliado pelas diferenças no conteúdo celular, como a presença de linfócitos, plasmócitos, ou 36 seja, células indiferenciadas e pela e morfologia do osso analisado. No entanto, são necessários outros achados histológicos ou histoquímicos para confirmar essas afirmativas bem como atestar a natureza do tecido produzido. Deste modo, este trabalho se mostrou convergente ao estudo proposto por Ramalho- Ferreira et al. [15] e Faverani et al. [14], que demonstraram efeito sistémico da administração de raloxifeno em ratas ovariectomizadas. Além disso, o estudo também corroborou ao conduzido por Gao et al. [26] que demonstraram de que os bifosfonatos foram capazes de promovere efeitos positivos na fixação de implante em osso osteoporótico, além de inibir o afrouxamento do implante em osso normal. Assim, pode-se atribuir os efeitos negativos deste estudo principalmente ao processo de recobrimento ou concentração do fármaco utilizado. De acordo com os resultados presentes neste estudo, observa-se que a modificação de superfície de implantes feita com raloxifeno foi alcançada. As análises de EDS indicam que o raloxifeno esta presente no implante por apresentar principalmente os elementos carbono e oxigênio (ausentes no grupo controle) corroborando o que foi observado em outros estudos [20]. Além disso, a caracterização foi observada pela modificação topográfica, evidenciado pela deposição de partículas na superfície dos implantes modificados. Contudo, foi possível observar nos experimentos utilizando-se 1mg/mL mudanças na coloração do implante, o que pode estar associado a ligações químicas em sua superfície. Todavia, não foi possível identificar se todo o medicamento foi impregnado no material ou se somente um filme muito fino foi adsorvido na superfície do metal. Deste modo, estudos futuros podem ser conduzidos para estimar com mais precisão a qualidade do recobrimento, bem como utilizar concentrações diferentes, uma vez que pode haver uma relação dose-resposta envolvida. Outro fator importante é a taxa e velocidade de liberação do fármaco, que pode ser relacionado a muitos fatores, como afinidades de ligação, taxa de dissolução, tensão interfacial e entre outros. Neste sentido, a investigação da liberação controlada deste fármaco faz-se necessária em estudos futuros para verificar se o medicamento estaria sendo liberado durante todo o processo de osseointegração ou somente no início do processo [26]. CONCLUSÃO 38 6 CONCLUSÃO Após o exposto, foi possível concluir que o raloxifeno, embora não tenha tido resultados superiores ao controle no início do processo de ossificação, apresentou aos 40 dias bastante semelhanças ao grupo controle, demonstrando sua efetividade e potencial de formação óssea, principalmente em períodos tardios. Contudo, os processos de deposição e a definição da concentração ideal do fármaco necessitam de novos ensaios e métodos para identificar comportamento do fármaco e tempos iniciais e tardios. REFERÊNCIAS 40 REFERÊNCIAS 1. Li J, Jansen JA, Walboomers XF, van den Beucken JJJP (2020) Mechanical aspects of dental implants and osseointegration: a narrative review. 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