MARIA LUIZA SILVA FAZIO QUALIDADE MICROBIOLÓGICA E OCORRÊNCIA DE LEVEDURAS EM POLPAS CONGELADAS DE FRUTAS Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto, para a obtenção do título de Mestre em Engenharia e Ciência de Alimentos (Área de Concentração em Ciência e Tecnologia de Alimentos). Orientador: Prof. Dr. Fernando Leite Hoffmann São José do Rio Preto 2006 MARIA LUIZA SILVA FAZIO QUALIDADE MICROBIOLÓGICA E OCORRÊNCIA DE LEVEDURAS EM POLPAS CONGELADAS DE FRUTAS COMISSÃO JULGADORA DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE Prof. Dr. Fernando Leite Hoffmann Presidente e Orientador Dra. Miyoko Jakabi 2º . Examinador Prof. Dr. Crispin Humberto Garcia Cruz 3º . Examinador São José do Rio Preto, 10 de Fevereiro de 2006. DADOS CURRICULARES MARIA LUIZA SILVA FAZIO NASCIMENTO: 23.11.1974 - Catanduva - SP FILIAÇÃO: Alcides Tinti Fazio Zaira Aparecida Silva Fazio 1994/1998: Curso de Graduação em Engenharia de Alimentos - Universidade Estadual Paulista - UNESP - SP 2004/2006: Curso de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos (Área de Concentração: Ciência e Tecnologia de Alimentos), nível de Mestrado, no Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas - Universidade Estadual Paulista (UNESP) - Campus de São José do Rio Preto - SP Este trabalho foi realizado no Laboratório de Microbiologia de Alimentos, Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto (IBILCE), Universidade Estadual Paulista (UNESP). À Deus, que está sempre presente em todos os momentos de minha vida dando saúde, perseverança e força; Aos meus pais, Alcides e Zaira, e irmã Ana Paula, pelo amor, compreensão, colaboração e incentivo em mais uma etapa de minha vida; Aos meus sobrinhos, Victor e Jullia, por existirem, sendo sempre razão de alegria e incentivo em tudo o que faço. Agradecimentos Ao meu orientador Prof. Dr. Fernando Leite Hoffmann, pela incomparável orientação, colaboração, confiança, paciência, compreensão e amizade, sem as quais este trabalho não seria concretizado; Ao Centro Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pelo apoio financeiro; Aos membros titulares, Dra. Miyoko Jakabi e Prof. Dr. Crispin Humberto Garcia Cruz, e suplentes, Profa. Dra. Elisa Yoko Hirooka e Prof. Dr. Vanildo Luiz Del Bianchi, da banca examinadora, pelas valiosas sugestões que contribuíram para a melhoria desta Dissertação; À Tânia Maria Vinturim Gonçalves, pelo apoio, carinho, paciência e amizade para comigo; À amiga Andréia Aparecida Jacomassi Carneiro, pela amizade e apoio constantes; Às colegas do Curso de Pós-Graduação Sandra Isabel Franzotti Gubolino, Fátima Aparecida Carnicel, Jacqueline Tanury Macruz Peresi, Patrícia Guedes Yonemoto e Janaína Alves dos Reis, pelo incentivo, amizade e auxílio; Ao Dr. Alexandre Rodrigo Coelho, pelo auxílio prestado; Ao amigo João Paulo, pela amizade e auxílio prestado na área de informática; Aos professores e funcionários do Curso de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, pelo apoio e incentivo; À minha família e amigos que sempre acreditaram e torceram por mim; Ao meu cunhado Valdir, pela colaboração; À minha irmã Ana Paula, pelo amor, cumplicidade, confiança e por estar sempre me incentivando; Aos meus pais Alcides e Zaira, pelo amor, exemplo de vida e esforços realizados para a minha formação. ”O covarde nunca começa, o fracassado nunca termina, o vencedor nunca desiste”. Norman Vicent Peale RESUMO As frutas são constituintes importantes da dieta humana devido aos seus valores nutritivos e por satisfazerem os hábitos alimentares de grande parte dos consumidores. A polpa é o produto obtido por esmagamento das partes comestíveis de frutas carnosas por meio de processos tecnológicos adequados. As frutas com atividade de água (Aa) maior que 0,98 são muito susceptíveis à deterioração por bactérias, bolores ou leveduras. O desenvolvimento e o metabolismo microbiano exigem a presença de água numa forma disponível e a Aa é um índice desta disponibilidade. As polpas de frutas apresentam como características gerais: elevada Aa, potencial de óxido-redução positivo e baixo pH. Destes fatores a elevada acidez restringe a microbiota deterioradora, que se limita principalmente a bactérias lácticas e acéticas, bolores e leveduras; sendo que os dois últimos constituem os mais importantes agentes de deterioração de polpas e sucos de frutas. Neste trabalho objetivou-se avaliar a qualidade microbiológica de 62 amostras de polpas congeladas de frutas comercializadas na região de São José do Rio Preto - SP. Os resultados obtidos para coliformes termotolerantes e Salmonella spp revelaram que todas as amostras (100%) encontravam-se em conformidade com o padrão federal em vigor, sendo consideradas, portanto, “produtos em condições sanitárias satisfatórias”. Foram ainda isoladas 136 leveduras, as quais foram submetidas, para identificação, aos testes taxonômicos (morfológicos, fisiológicos e de assimilação de fontes de carbono). Os resultados destes testes mostraram a ocorrência de 57 (41,90%) culturas classificadas como Saccharomyces cerevisiae, 24 (17,65%) Debaryomyces hansenii var. fabryi, 13 (9,55%) Dekkera bruxellensis, 13 (9,55%) Torulaspora delbrueckii, 6 (4,40%) Rhodotorula mucilaginosa, 4 (2,94%) Rhodotorula glutinis, 4 (2,94%) Trichosporon beigelii, 2 (1,47%) Hanseniaspora vineae, 2 (1,47%) Sporidiobolus johnsonii, 2 (1,47%) Candida apis, 1 (0,74%) Cryptococcus albidus, 1 (0,74%) Debaryomyces hansenii var. hansenii, 1 (0,74%) Stephanoascus ciferrii, 1 (0,74%) Rhodotorula minuta, 1 (0,74%) Pichia farinosa, 1 (0,74%) Debaryomyces vanrijiae var. vanrijiae, 1 (0,74%) Bullera variabilis, 1 (0,74%) Schizosaccharomyces pombe, 1 (0,74%) Sporobolomyces roseus. Foi também verificada a resistência dessas culturas em relação aos conservantes alimentícios sorbato de potássio, benzoato de sódio e metabissulfito de sódio em diferentes concentrações e ao tratamento térmico (90°C/60 segundos).O conservante sorbato de potássio não inibiu nenhuma das leveduras testadas. O metabissulfito de sódio apresentou maior eficácia que o benzoato de sódio, uma vez que inibiu 100% das culturas a partir da concentração de 0,06%, contra a de 0,10% do outro conservante. O tratamento térmico empregado inibiu 81 (70,40%) leveduras. Sob condições experimentais, benzoato de sódio a partir de 0,05% e metabissulfito de sódio a partir 0,04% inibiram maior número de leveduras testadas do que o tratamento térmico. ABSTRACT The fruits are important constituents of the human diet due to their nutritional values and because they satisfy the food habits of large number of the consumers. The fruit pulp is obtained by crushing the edible parts of fruits by right technological process. Fruits that have water activity (aw) over 0.98 are susceptible to deterioration by bacteria, molds and yeasts. The development and the microbial metabolism require the presence of water in an available way and aw is an indicator of this availability. Fruit pulps have the general characteristics: high aw, positive oxide - reduction potential and low pH. Of these factors the high acidity limits the decay agents, mainly to acetic and lactic bacteria, molds and yeasts; but molds and yeasts are the most important deterioration agents in fruit pulps and juices. In this study was evaluated the microbiological quality of 62 samples of fruit frozen pulps commercialized in the region of São José do Rio Preto - SP. The results obtained for fecal coliforms and Salmonella spp revealed that all samples (100%) were in accordance with the current federal standard, being considered therefore “products in satisfactory sanitary conditions”. One hundred and thirty six yeasts were isolated from the samples, which were submitted, for identification, to taxonomic tests (morphological, physiological and to carbon sources assimilation). The results of the taxonomic tests showed the occurrence of 57 (41.90%) cultures classified as Saccharomyces cerevisiae, 24 (17.65%) Debaryomyces hansenii var. fabryi, 13 (9.55%) Dekkera bruxellensis, 13 (9.55%) Torulaspora delbrueckii, 6 (4.40%) Rhodotorula mucilaginosa, 4 (2.94%) Rhodotorula glutinis, 4 (2.94%) Trichosporon beigelii, 2 (1.47%) Hanseniaspora vineae, 2 (1.47%) Sporidiobolus johnsonii, 2 (1.47%) Candida apis, 1 (0.74%) Cryptococcus albidus, 1 (0.74%) Debaryomyces hansenii var. hansenii, 1 (0.74%) Stephanoascus ciferrii, 1 (0.74%) Rhodotorula minuta, 1 (0.74%) Pichia farinosa, 1 (0.74%) Debaryomyces vanrijiae var. vanrijiae, 1 (0.74%) Bullera variabilis, 1 (0.74%) Schizosaccharomyces pombe, 1 (0.74%) Sporobolomyces roseus. The cultures were tested for resistance to food preservatives potassium sorbate, sodium benzoate and sodium metabisulphite in different concentrations, and to thermal treatment (90°C/60 seconds). The food preservative potassium sorbate didn’t inhibit any of the yeasts tested. The sodium metabisulphite was more efficient than sodium benzoate, because it inhibited 100% of the cultures from the concentration of 0.06%, against the one of 0.10% of the other preservative. The thermal treatment used inhibited 81 (70.40%) of the yeasts. Under experimental conditions, sodium benzoate from 0.05% and sodium metabisulphite from 0.04% inhibited more yeasts tested than the thermal treatment. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 17 2. JUSTIFICATIVA 25 3. OBJETIVOS 26 4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 26 5. MATERIAIS E MÉTODOS 46 5.1. Obtenção das amostras 46 5.2. Preparo das amostras 46 5.3. Enumeração de bolores e leveduras 46 5.4. Determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais 47 5.5. Determinação do NMP de coliformes termotolerantes 47 5.6. Pesquisa de Escherichia coli 47 5.7. Pesquisa de Salmonella spp 48 5.8. Isolamento das culturas de leveduras 48 5.9. Provas taxonômicas 49 5.10. Provas morfológicas 49 5.11. Provas fisiológicas 49 5.11.1. Capacidade fermentativa 49 5.11.2. Desenvolvimento em diversas temperaturas 50 5.11.3. Desenvolvimento em meio de cultura contendo nitrato 50 5.11.4. Resistência à pressão osmótica 51 5.11.5. Desenvolvimento em meio de cultura contendo cicloheximida (actidione) 51 5.11.6. Síntese de amido 51 5.11.7. Provas de assimilação de fontes de carbono 52 5.12. Ensaio de resistência aos principais conservantes alimentícios contidos na legislação vigente para produtos de frutas e frutos 52 5.13. Prova de sensibilidade ao tratamento térmico (90°C/60 segundos) 53 5.14. Técnica de replica-plate 53 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO 54 6.1. Análises microbiológicas 54 6.2. Isolamento das culturas de leveduras 62 6.2.1. Marca B 63 6.2.2. Marca C 64 6.3. Ensaio de resistência aos principais conservantes alimentícios contidos na legislação para produtos de frutas e frutos 104 6.3.1. Sorbato de potássio (INS - 202) 104 6.3.2. Benzoato de sódio (INS - 211) 105 6.3.3. Metabissulfito de sódio (INS - 223) 109 6.4. Prova de sensibilidade ao tratamento térmico (90°C/60 segundos) 113 7. CONCLUSÕES 116 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 117 LISTA DE TABELAS TABELA 1. Apresentação dos resultados das diferentes análises microbiológicas (marca A) 58 TABELA 2. Apresentação dos resultados das diferentes análises microbiológicas (marca B) 59 TABELA 3. Apresentação dos resultados das diferentes análises microbiológicas (marca C) 61 TABELA 4. Distribuição das leveduras segundo a origem (marca B) 74 TABELA 5. Distribuição das leveduras segundo a origem (marca C) 76 TABELA 6. Freqüência relativa das leveduras isoladas 77 TABELA 7. Freqüência relativa das leveduras isoladas (marca B) 79 TABELA 8. Freqüência relativa das leveduras isoladas (marca C) 81 TABELA 9. Freqüência relativa dos cinqüenta e oito grupos de leveduras isolados 82 TABELA 10. Resultados das provas morfológicas, fisiológicas e de assimilação apresentados pelas leveduras 87 TABELA 11. Leveduras sensíveis ao benzoato de sódio nas diferentes concentrações empregadas 108 TABELA 12. Leveduras sensíveis ao metabissulfito de sódio nas diferentes concentrações empregadas 111 TABELA 13. Freqüência relativa dos sete gêneros de leveduras resistentes ao tratamento térmico (90°C/60 segundos) 115 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Fluxograma do processamento de polpas congeladas de frutas 22 1. INTRODUÇÃO Alimentos de origem vegetal, por exemplo frutas, têm grande importância na nutrição humana devido ao grande conteúdo de vitaminas e sais minerais (NASCIMENTO et al., 1999). Existe uma grande diversidade de frutas no Brasil e muitas delas são utilizadas como alimento. Devido à falta de conhecimento dos produtores com relação ao processamento de alimentos, freqûentemente ocorrem perdas na produção de frutas, especialmente por meio da ação deteriorante de microrganismos (TRINDADE et al., 2002). Mesmo não havendo evidências de que os tecidos das frutas abriguem qualquer tipo de microrganismo, na superfície das mesmas em estado fresco, tem sido encontrada uma grande variedade; portanto, havendo rompimento de forma natural ou mecânica, os mesmos penetram e proliferam rapidamente nos tecidos internos (GRAY, 1959; EVANGELISTA, 1989). A ocorrência e multiplicação de microrganismos no meio ambiente são comuns, e as reações químicas e enzimáticas associadas a eles resultam em decomposição de materiais, inclusive alimentos. Essa decomposição causa modificações na aparência, sabor, textura, cor, consistência e qualidade nutricional do produto. Além disso, certos microrganismos são patogênicos para o ser humano, podendo causar infecções ou toxinfecções quando proliferam em alimentos. Portanto, exceto em fermentações microbiológicas úteis, o desenvolvimento de microrganismos em alimentos é indesejável, sendo necessário evitá-lo ou inibí-lo por meio de métodos de conservação (SOFOS, 1995). As frutas são importantes microhabitats para uma variedade de espécies de leveduras na natureza devido à alta concentração de açúcares simples, baixo pH e intensa visitação por insetos vetores (LACHANCE; STARMER, 1998). Prováveis vetores nos trópicos podem incluir animais envolvidos em polinização como beija- flores, morcegos e insetos como abelhas e lepdopteros que visitam flores abertas. Drosophila está entre os mais importantes vetores de leveduras de frutas maduras e apodrecidas (SANTOS et al., 1996). No Nordeste do Brasil, muitas frutas têm importância econômica, e elas são comercializadas ou são congeladas para futura utilização em sucos e alimentos processados (TRINDADE et al., 2002). Devido aos seus valores nutritivos e por satisfazerem os hábitos alimentares de grande parte dos consumidores as frutas são constituintes importantes da dieta humana. A polpa é o produto obtido por esmagamento das partes comestíveis de frutas carnosas por meio de processos tecnológicos adequados. Constituem o melhor meio para se reverter o problema de manuseio, transporte e armazenamento de frutas in natura em função das condições climáticas, da distância e da perecibilidade. Seu processamento deve se apresentar dentro dos padrões de higiene e qualidade (ABREU; NUNES; OLIVEIRA, 2003). A legislação (BRASIL, 2001) estabelece os seguintes padrões microbiológicos para polpa de frutas concentradas ou não, com ou sem tratamento térmico, refrigeradas ou congeladas: ¬ Coliformes termotolerantes (fecais): 10²/g ¬ Salmonella spp: ausência em 25 g A produção de polpas congeladas de frutas (FlGURA 1) engloba as seguintes etapas: 1. Recepção: as frutas devem ser pesadas e selecionadas quanto ao seu ponto de maturação. Aquelas sem condição de despolpamento devem ser dispensadas neste momento. 2. Lavagem, que deve ser feita em duas fases: 2.1. Banho por imersão: onde os frutos são submetidos à imersão em água com elevadas concentrações de cloro por determinado tempo. Para as que são colhidas ao invés de apanhadas do chão e que apresentem incrustações leves em sua superfície se empregam baixas concentrações por um tempo reduzido. Em contra partida, para aquelas em condições de recepção muito ruins se utilizariam máximas concentrações de cloro por tempos maiores. 2.2. Aspersão: para a remoção das impurezas remanescentes além da retirada do excesso de cloro. Esta deve ser realizada com água tratada em quantidades ideais retirando o excesso de cloro da lavagem anterior sem desperdícios de água. 3. Seleção: muito importante, pois é a responsável pela classificação final da fruta que será processada. Nesta fase as frutas são expostas sobre mesas ou esteiras apropriadas onde são avaliadas quanto à maturação, firmeza, machucaduras, defeitos causados por fungos, roedores e insetos. São retiradas todas aquelas que venham comprometer a qualidade do produto final. 4. Preparo: alguns frutos exigem uma preparação prévia ao despolpamento envolvendo descasque, retirada de talos e de sementes. Após esta etapa são levados ao despolpamento ou prensagem. 5. Despolpamento: retirada da polpa do fruto por meio do esmagamento de suas partes comestíveis, processado em centrífuga horizontal. Para despolpar se utilizam peneiras com furos a partir de 1,0 mm. Deve ser realizado em equipamentos fabricados em aço inox e materiais apropriados. 6. Refino: a polpa, após sua extração, pode exigir um refinamento para melhorar o seu aspecto visual, podendo ser feito utilizando-se a despolpadeira com peneiras de furos pequenos (1,0 mm ou menor), onde serão retiradas as impurezas da polpa (fibras, pedaços de semente, etc.). Além da substituição da peneira, trocam-se as palhetas de borracha por escovas e cerdas. Nesta etapa a redução da massa não deve ultrapassar os 3%. 7. Envase: realizado em sistema semi-automático. A polpa é colocada no tanque do dosador e para preenchimento adequado regula-se a máquina para a medida desejada. A embalagem colocada neste equipamento pelo operador é em seguida levada à bandeja. Outro operário fecha os sacos plásticos na seladora. O produto é normalmente comercializado em embalagens contendo 100 gramas. Os tanques de equilíbrio com parede dupla para um pré-resfriamento são recomendados para a manutenção da qualidade da polpa além da economia do sistema de congelamento. Outra opção é o sistema de embaladeira automática, onde o fluxo é semelhante, porém não há manuseio das embalagens. 8. Congelamento: na produção de polpa congelada, o produto não é submetido a nenhum outro tratamento visando à inibição de reações químicas e enzimáticas e/ou redução da atividade de microrganismos que possam levar a perda de qualidade. Portanto deve ser efetuado o mais rápido possível para manter as características da fruta fresca. Existem várias maneiras de se efetuar o congelamento. O uso de freezer, do tipo doméstico, apresenta limitação quanto ao tempo exigido para congelar um determinado lote de produto, pois neste tipo de equipamento a retirada de calor da massa é feita por meio do contato direto com as paredes do mesmo e por condução no interior da polpa. Desse modo o processo se torna bastante lento. O emprego de câmaras de congelamento com ventilação forçada é mais eficiente, e portanto, deve ser preferido. A temperatura recomendada para polpa se situa na faixa de - 23 ± 5º C, no entanto, o tempo necessário para abaixar a temperatura do produto para - 5º C não deve ultrapassar 8 horas. A temperatura de - 18º C deverá ser atingida em um tempo máximo de 24 horas e deve ser mantida durante todo o tempo de armazenamento e transporte até o momento do consumo (www.itametal.com.br). FIGURA 1. Fluxograma do processamento de polpas congeladas de frutas. RECEPÇÃO LAVAGEM SELEÇÃO PREPARO DESPOLPAMENT O REFINO ENVASE CONGELAMENTO Todos os alimentos, independente de sua origem, podem apresentar uma microbiota natural extremamente variável, concentrada principalmente na região superficial, embora os tecidos internos, tanto de vegetais como de animais, possam eventualmente, apresentar formas microbianas viáveis. As frutas com atividade de água (Aa) maior que 0,98 são muito susceptíveis à deterioração por bactérias, bolores ou leveduras. O desenvolvimento e o metabolismo microbiano exigem a presença de água numa forma disponível e a Aa é um índice desta disponibilidade para utilização em reações químicas e multiplicação microbiana (ABREU; NUNES; OLIVEIRA, 2003). Leveduras são fungos unicelulares capazes de reproduzir-se vegetativamente por meio de brotamento das células ou, mais raramente, por fissão celular. Essa característica confere às leveduras a capacidade de multiplicar-se rapidamente em ambientes líquidos, que favorecem a dispersão das células. Muitas leveduras desenvolvem-se sob condições anaeróbias, o que também favorece o seu desenvolvimento em líquidos. Por outro lado, a reprodução vegetativa das células não é favorável ao espalhamento das colônias na superfície dos alimentos sólidos ou à sua penetração nesse tipo de produto, nos quais os fungos filamentosos são favorecidos (TANIWAKI; SILVA, 2001). Como todos os fungos, as leveduras multiplicam mais lentamente do que as bactérias, não competindo bem em ambientes que permitam o desenvolvimento bacteriano, ou seja, condições de alta atividade de água, pH próximo ao neutro e temperaturas ótimas de bactérias mesófilas (TANIWAKI; SILVA, 2001). A multiplicação de leveduras é normalmente acompanhada da produção de CO2 e etanol, mas a deterioração também pode manifestar-se pela formação de película, turvação, floculação e, em alguns casos, podem esses microrganismos produzir pectinesterases que atacam a pectina e eliminam a turvação natural dos sucos (INTERNATIONAL COMMISSION ON MICROBIOLOGICAL SPECIFICATIONS FOR FOODS - ICMSF, 1980). Podem utilizar os ácidos orgânicos, resultando em elevação do pH e também produzir acetaldeído, que contribui para o odor fermentado. As exigências nutricionais são mínimas, sendo que muitas podem sintetizar uma ampla variedade de substâncias essenciais para o desenvolvimento, como vitaminas, aminoácidos e carboidratos, utilizam fontes simples de nitrogênio e são relativamente resistentes à inibição pelo CO2 (UBOLDI EIROA, 1989). Assim, conforme destacam Pitt e Hocking (1997), as leveduras são deteriorantes associados principalmente aos alimentos ácidos líquidos ou semi sólidos, no interior dos quais a dispersão das células é facilitada e a disponibilidade de oxigênio é reduzida. As leveduras integram a microbiota natural de frutas e vegetais, embora os números relativos da população variem de um habitat para outro, sendo influenciados pelo meio ambiente e pelas condições de colheita e armazenamento (UBOLDI EIROA, 1989). As vinte leveduras mais comuns em alimentos são: Candida glabrata, C. sake, C. tropicalis, C. versatilis, Cryptococcus albidus, Debaryomyces hansenii, Issatchenkia orientalis, Kluyveromyces marxianus, Pichia anomala, P. fermentans, P. guilliermondii, P. membranaefaciens, Rhodotorula glutinis, R. mucilaginosa, Saccharomyces cerevisiae, S. exiguus, Sporobolomyces roseus, Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces bailii e Z. rouxii (DEAK; BEUCHAT, 1986). A microbiota natural de leveduras em frutas é geralmente constituída por espécies de Kloeckera, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Hansenula, Hanseniaspora, Debaryomyces, Torulopsis, Candida, Rhodotorula, Trichosporum, etc. (UBOLDI EIROA, 1989). Infelizmente, a maioria dos dados sobre as espécies de leveduras disponíveis na literatura é de regiões temperadas, havendo a necessidade de mais estudos que explorem melhor a grande diversidade de espécies encontradas nos trópicos, já que importantes linhagens utilizadas biotecnologicamente são resultantes destes estudos. Ao lado do clássico exemplo representado pela exploração comercial de diferentes linhagens de Saccharomyces cerevisiae para produção de álcool combustível e bebidas, vários outros produtos metabólicos como, enzimas, vitaminas, carotenóides, lipídeos e ácido cítrico já são produzidos comercialmente por várias linhagens de leveduras, enquanto outras representam potencial para futuras explorações (DEMAIN; PHAFF; KURTZMAN, 1998). 2. JUSTIFICATIVA Uma grande e variada população de microrganismos, incluindo os esporos de muitos tipos de fungos, contaminam a superfície durante o desenvolvimento e maturação das frutas. Relativamente poucos fungos são capazes de atacar o fruto antes da colheita. O processo de amadurecimento aumenta a susceptibilidade do fruto à invasão. Frutos colhidos do chão apresentam uma biota mais variada do que os apanhados na árvore. A queda causa machucaduras, e o contato com grama e solo fornece uma fonte adicional de inóculo. A presença de bolores e leveduras pode ocasionar alterações (principalmente sensoriais), sendo a rejeição do produto a principal conseqüência. O isolamento e identificação de leveduras de polpas de frutas permitem o conhecimento da microbiota potencial de contaminação; sendo possível por meio de processamento específico (temperatura e tempo adequados) reduzir tal contaminação. 3. OBJETIVOS Este trabalho teve como objetivos, considerando os aspectos abordados: - Realizar as análises microbiológicas prescritas na legislação brasileira vigente, assim como a enumeração de bolores e leveduras, em diferentes amostras de polpas congeladas de frutas, - Identificar as diversas leveduras isoladas deste tipo de produto, - Verificar a resistência das mesmas em relação aos principais conservantes alimentícios contidos na legislação brasileira e - Investigar a sensibilidade dessas leveduras frente ao tratamento térmico. 4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA As polpas de frutas apresentam como características gerais: elevada Aa, potencial de óxido-redução positivo e baixo pH. Destes fatores a elevada acidez restringe a microbiota deterioradora, que se limita principalmente a bactérias lácticas e acéticas, bolores e leveduras; sendo que os dois últimos se constituem nos mais importantes agentes de deterioração de polpas e sucos de frutas (LEITÃO, 1968; CARR, 1975). Foram analisadas as características microbiológicas das polpas congeladas de abacaxi, cajá, caju, goiaba, manga e maracujá de alguns produtores do estado da Bahia. As polpas de caju (70% apresentaram contagens > 103 UFC/g), cajá (62,5% entre 103 e 105 UFC/g), goiaba (63% entre 103 e 105 UFC/g), manga (50% > 103 UFC/g) e maracujá (70% entre 103 e 106 UFC/g) mostraram contaminação média por bolores e leveduras relativamente alta; além de evidenciarem, com freqüência, a presença de bactérias indicadoras de contaminação fecal. A polpa de abacaxi (67% entre 101 e 103 UFC/g) apresentou também contaminação por bolores e leveduras e ausência de coliformes termotolerantes (LEITE et al., 2000). Avaliaram-se as amostras de diferentes polpas de frutas congeladas comercializadas no estado do Ceará quanto à presença de bolores e leveduras, coliformes totais e termotolerantes. Os resultados indicaram que 32 amostras (74,5%) atendiam aos padrões e 11 (25,5%) apresentaram-se fora dos limites estabelecidos (LIMA; MARTINS; SILVA, 2001). Setenta e uma amostras de polpas congeladas de frutas sendo 28 de acerola, 21 de cajá e 22 de caju produzidas e comercializadas nos estados da Paraíba e Pernambuco foram analisadas quanto ao aspecto microbiológico. Os resultados indicaram que 83,9% das amostras atenderam ao padrão para bolores e leveduras, e que 2,8% apresentaram coliformes termotolerantes. Em relação à contagem de bactérias aeróbias mesófilas, observou-se que as amostras apresentaram resultados dentro dos limites aceitáveis pela legislação. Não foi detectada a presença de Salmonella spp em nenhuma das amostras analisadas (FEITOSA et al., 1999b). Bueno et al. (2002) avaliaram a qualidade de polpas de frutas congeladas de uma única marca comercial. Os resultados obtidos indicaram que, do ponto de vista microbiológico, todas as amostras avaliadas (abacaxi, açaí, acerola, cacau, cajá, caju, cupuaçu, goiaba, mamão, manga, melão, morango, siriguela, umbu e uva) atendiam a legislação em vigor. Avaliou-se a qualidade higiênico-sanitária de amostras de polpas congeladas de acerola, cajá e caju produzidas e comercializadas nos estados do Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba e Pernambuco; sendo 51 de polpa de acerola, 41 de cajá e 38 de caju. Constatou-se que 31 amostras apresentaram contagens de bolores e leveduras acima do permitido pela legislação. A presença de coliformes termotolerantes foi constatada em 3% das amostras de polpa de caju num intervalo de 4 a 23 UFC/g. Não foi constatada a presença de Salmonella spp em 100% das amostras (FEITOSA et al., 1999a). Foram determinados os parâmetros microbiológicos de 10 amostras diferentes de polpas de frutas (abacaxi, acerola, cacau, coco, graviola, manga, morango, murici, umbu e uva) encontradas no comércio de São José do Rio Preto - SP. Verificou-se que 90% estavam de acordo com todos os padrões estabelecidos pela legislação estadual e 1 (10% - polpa de coco) continha Salmonella spp (HOFFMANN et al., 1997). Analisou-se o perfil microbiológico de 43 polpas de frutas produzidas e comercializadas nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte. Inicialmente foram avaliados os sabores acerola, cajá e caju. Do ponto de vista sanitário constatou-se que 49,02% das amostras de polpa de acerola; 25% das de cajá e 51,42% das de caju apresentavam-se fora dos padrões quanto à contagem de bolores e leveduras; e que 8,11% das de polpa de caju apresentavam coliformes termotolerantes. Não foi detectada a presença de Salmonella spp. De acordo com os resultados obtidos concluiu-se que a maioria das amostras apresentavam condições higiênicas insatisfatórias (FEITOSA et al., 1997). Realizou-se a análise microbiológica de 9 amostras de polpa de abacaxi e 10 de acerola produzidas e comercializadas na ilha de São Luís, MA. Os resultados indicaram que 20% das polpas de acerola (2) e 100% das de abacaxi (9) encontravam-se fora dos padrões quanto à contagem de bolores e leveduras e 10% das de acerola (1) apresentavam coliformes termotolerantes. Não foi observada a presença de Salmonella spp nas amostras analisadas (NASCIMENTO et al., 1999). Foi realizada a monitorização da qualidade microbiológica de polpas de caju e abacaxi durante o processamento. Os resultados indicaram contagens relativamente altas de bolores e leveduras no abacaxi in natura, fato considerado normal, visto que estes tipos de microrganismos estão presentes naturalmente no fruto. No caso do caju, foram encontradas contagens elevadas de coliformes a 35 e 45°C, indicando que o produto chega contaminado do campo. Porém, foi observado que após tratamento térmico preliminar a 72°C, a contagem de coliformes foi reduzida a níveis aceitáveis. O tratamento térmico utilizado foi satisfatório para eliminar os microrganismos estudados (BRUNO; NASSU; MORAIS, 2004). Morais, Nassu e Bruno (2004) avaliaram requisitos relacionados a Boas Práticas de Fabricação (BPF) em indústria de polpa e sucos de frutas. Os resultados da análise do produto final indicaram a presença de Salmonella spp e elevada contagem de bolores e leveduras para a polpa de caju no início do período, porém a qualidade foi melhorando no decorrer do ano. Este fato reflete que medidas adotadas surtiram efeito na qualidade microbiológica dos produtos. O mesmo ocorreu em relação à elevada contagem de bolores e leveduras na de abacaxi. No que se refere à análise de água, ambiente e manipuladores, os resultados foram satisfatórios. Na avaliação dos equipamentos, utensílios e superfícies constatou-se que 88,2% dos pontos avaliados estavam na região limpa. Um estudo do perfil microbiológico de polpas de frutas comercializadas em Teresina - PI realizado por Abreu, Nunes e Oliveira (2003) mostrou que das 265 amostras coletadas, 85% não estavam contaminadas e 15% apresentaram níveis de contaminação por coliformes a 45°C acima do limite estabelecido. Nenhuma amostra apresentou Salmonella spp. Tais fatos demonstram que a grande maioria das indústrias produtoras de polpas de frutas comercializadas em Teresina oferece à população produtos de qualidade. Foram isoladas e identificadas leveduras de frutas, polpas de frutas e ambiente industrial. Entre as linhagens identificadas a de maior ocorrência foi a do gênero Candida. Nos diferentes produtos foram encontradas: ¬ Candida pelliculosa - polpa de morango congelada adicionada de açúcar; ¬ Candida inconspicua, Kloeckera apiculata, Trichosporon pullulans - polpa de maracujá; ¬ Torulopsis magnoliae, Yeast like fungi (levedura com micélio verdadeiro) - maracujá in natura; ¬ Candida magnoliae (também isolada da sala próxima ao preparo e do desintegrador), Kloeckera apiculata (isolada ainda do desintegrador) - morango in natura (TORREZAN; UBOLDI EIROA; PFENNING, 2000). Bastos et al. (2002) realizaram a avaliação microbiológica das mãos de manipuladores de polpas de frutas congeladas; sendo as amostras coletadas em 3 empresas (A, B e C) por meio de swab. Com relação à contagem de Staphylococcus aureus observou-se que 94% das amostras apresentaram resultados < 10 UFC/mão, sendo constatada a presença desta bactéria em 6% das provenientes de uma das empresas. Observou-se, ainda, a ausência de coliformes termotolerantes em 100% das amostras analisadas. Concluiu-se que o plano de higienização estabelecido nas BPF está sendo rigorosamente seguido pelas empresas B e C, enquanto que a A precisa ainda assumir um maior comprometimento em relação ao que foi proposto, para assim melhorar a qualidade de seus produtos. Estudou-se o comportamento da Escherichia coli O157:H7, inoculada em polpas de abacaxi, cacau, goiaba, graviola, manga e umbu. As mesmas foram contaminadas, armazenadas em temperaturas de 6 e - 10°C e analisadas durante um período de 13 dias. Os resultados mostraram que os baixos valores de pH das polpas de frutas e as temperaturas empregadas para o armazenamento não foram fatores limitantes para a sobrevivência desse patógeno durante o período de armazenamento. Assim sendo, mediante a possibilidade de E. coli O157:H7 vir a contaminar as frutas utilizadas para o processamento de polpas, esse produto pode representar um perigo para a população consumidora (LEITE et al., 2002). Foram avaliadas as condições higiênico-sanitárias de três empresas produtoras de polpas congeladas de frutas, na cidade de Fortaleza. Em relação à qualidade microbiológica de equipamentos, as empresas A, B e C mostraram resultados satisfatórios em 75, 83 e 74% das amostras, respectivamente. Para utensílios não houve diferença significativa para as empresas A e C, sendo satisfatório em aproximadamente 73% das amostras; para a empresa B verificou-se que 50% das amostras apresentaram resultados satisfatórios. Para a qualidade do ar, a contagem de colônias teve alta variação, apresentando colônias que caracterizam presença de fungos. Com a variabilidade obtida nos resultados, concluiu-se que as empresas necessitam adotar corretamente as BPF e estabelecer planos de higiene e sanitização em todos os estágios do processo (BASTOS et al., 2001). Trabalho desenvolvido por Cunha et al. (2000) teve como objetivo diagnosticar as condições higiênico-sanitárias dos equipamentos utilizados na linha de produção de polpa de fruta congelada de três indústrias (A, B e C) localizadas na região metropolitana de Fortaleza. Foram coletadas 46 amostras em equipamentos (despolpadeiras e dosadoras), sendo 12, 20 e 14 das empresas A, B e C, respectivamente. Os resultados obtidos demonstraram que as empresas avaliadas não estão padronizando os procedimentos de higiene e sanitização. Embora a contaminação observada, principalmente nas empresas A e B não implique em riscos à saúde pública; prejudica a qualidade do produto final. A empresa C apresentou equipamentos com as melhores condições higiênico-sanitárias. Bastos et al. (1997) caracterizaram 7 empresas produtoras de polpa de fruta congelada nos estados do Rio Grande do Norte e Ceará em relação ao controle de qualidade no processamento de polpas de acerola, cajá e caju. Quanto à procedência da matéria prima, 70% das empresas recebem frutas de terceiros. Os procedimentos de controle de qualidade restringem-se à matéria prima e ao produto acabado. Os principais problemas encontrados dizem respeito à dificuldade na seleção de frutas, perda de coloração das frutas e polpa, oxidação das frutas e falta de equipamentos ideais para processo eficiente. Concluiu-se que a maioria das indústrias trabalha com fornecedores variados, dificultando a padronização dos processos (produtos), além do risco de fechamento das que não se adequam às exigências dos consumidores. Vale ressaltar que a maioria dos produtores está utilizando os procedimentos básicos de controle de qualidade e enviando amostras para órgãos oficiais efetuarem avaliações físico-químicas e microbiológicas. Beckenkamp (1997) analisou 24 amostras de polpas de frutas, sendo 12 não pasteurizadas e 12 pasteurizadas para o isolamento de leveduras das seguintes frutas: abacaxi, acerola, cajá, caju, cupuaçu, goiaba, graviola, manga, mangaba, maracujá, morango e uva. Entre as leveduras isoladas de polpas não pasteurizadas foram identificadas 10 espécies pertencentes aos gêneros Brettanomyces, Candida, Dekkera e Hansenula; entre aquelas isoladas de polpas pasteurizadas foram identificadas 11 espécies pertencentes aos gêneros Brettanomyces, Candida, Dekkera, Hansenula, Rhodotorula e Trichosporon. A espécie prevalente foi Candida pelliculosa. Ivo (1982) isolou do abacaxi 99 amostras de leveduras pertencentes por ordem decrescente aos gêneros Candida, Torulopsis, Saccharomyces, Pichia, Saccharomycodes, Brettanomyces, Dekkera, Hansenula e Kloeckera. De frutas cítricas tais como laranjas, limas, tangerinas produzidas na região de Tucuman na Argentina foram isoladas as espécies Kloeckera apiculata, K. apiculta, Candida guilliermondii, C. stellata, Pichia kluyveri, P. membranaefaciens e Geotrichum candidum consideradas responsáveis pelo apodrecimento de referidas frutas (SPENCER et al., 1992). Kamra e Madan (1987) isolaram leveduras de polpas de frutas, constatando a existência de 16 gêneros e 38 espécies. Predominaram os gêneros Candida (23,98%) e Hansenula (12,82%); as espécies Kloeckera apiculata (11,5%) e Hanseniaspora uvarum (8,95%) foram as mais freqüentes. Em trabalho desenvolvido por Silva et al. (2005) foram isoladas e identificadas as seguintes leveduras presentes na superfície do cacau: Zygosaccharomyces fermentati, Candida krusei, Pichia guilliermondii e Zygosaccharomyces cidri. De La Torre et al. (1999) informaram que leveduras tais quais Sporobolomyces roseus, Cryptococcus albidus, Rhodotorula rubra e Candida spp compunham a microbiota natural de certas variedades de uvas. Determinou-se a microbiota da superfície de bananas colhidas do ambiente árido e subtropical de Carnarvon (Austrália). Leveduras pertencentes ao gênero Cryptococcus foram as mais encontradas (45%) (Cryptococcus laurentii, C. albidus, C. uniguttulatus, C. neoformans). Além disso, 27% pertenceram ao gênero Candida, 16% foram identificadas como Rhodotorula glutinis e 12% representaram outros gêneros (POSTMASTER; SIVASITHAMPARAM; TURNER, 1997). Davenport (1976) estudou as populações de leveduras em maçã e uva, encontrando uma variedade de espécies, dentre as quais Rhodotorula glutinis e Cryptococcus albidus. Sancho et al. (2000) identificaram 19 espécies de leveduras, representando 12 gêneros; leveduras estas isoladas de polpas e concentrados de frutas. Aquelas mais frequentemente isoladas pertenceram aos gêneros Saccharomyces, Pichia, Cryptococcus, Kluyveromyces e Candida. ¬ concentrado de laranja: Pichia ohmeri, P. anomala, P. farinosa, Rhodotorula mucilaginosa, Cryptococcus humicolus, C. laurentii, Saccharomyces cerevisiae; ¬ concentrado de maçã: Cryptococcus albidus; ¬ polpa de pêssego: Debaryomyces hansenii, Cryptococcus laurentii, C. albidus; ¬ polpa de pêra: Rhodotorula mucilaginosa, Sporobolomyces roseus, Debaryomyces hansenii. Foram isolados os seguintes gêneros de leveduras da casca do abacaxi: Candida, Cryptococcus, bem como Rhodotorula aurantiaca, R. glutinis e Pichia guilliermondii (REYES; ROHRBACH; PAULL, 2004). Parish e Higgins (1989) pesquisaram uma variedade de produtos cítricos, incluindo casca seca de laranja utilizada como forragem de gado, suco de laranja pasteurizado e não pasteurizado, e suco de laranja refrigerado com relação à microbiota fúngica. As seguintes leveduras foram isoladas: Candida maltosa, C. sake, Hanseniaspora guilliermondii, Hanseniaspora spp.; Pichia membranaefaciens, Saccharomyces cerevisiae (suco de laranja não pasteurizado - comercial); Saccharomyces cerevisiae e Torulaspora delbrueckii (suco de laranja não pasteurizado - experimental) e Rhodotorula spp (casca de laranja seca). A presença de leveduras foi investigada em 4 grupos de alimentos: frutas frescas, frutas processadas, derivados de leite e carne industrializada. Foram isoladas 392 leveduras pertencentes aos gêneros: Candida, Debaryomyces e Pichia. De frutas frescas foram isoladas as seguintes leveduras: pitanga - Debaryomyces polymorphus e Debaryomyces spp; mangaba - Candida diddensiae, C. haemulonii, Candida spp, Debaryomyces spp e Pichia membranaefaciens (MAGALHÃES; QUEIROZ, 1991). Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis, S. fragilis, Candida utilis, C. tropicalis e Lipomyces kononenkoae são exemplos de leveduras empregadas como suplemento alimentício devido ao seu alto valor protéico, assim como a presença de vitaminas do complexo B em suas respectivas células (COOK, 1958; GRAY, 1959; ROSE; HARRISON, 1987; HORN; DU PREEZ; LATERGAN, 1988). Deak e Beuchat (1993) determinaram as populações e a freqüência da ocorrência de leveduras em concentrados de suco de abacaxi, cereja, laranja, maçã e uva congelados. Foram isoladas 154 leveduras de 33 amostras de sucos de frutas concentrados, que representaram 12 gêneros e 21 espécies. As espécies mais frequentemente isoladas foram Saccharomyces cerevisiae (24,7%), Candida stellata (22,1%) e Zygosaccharomyces rouxii (14,3%); seguida em ordem decrescente por Torulaspora delbrueckii, Rhodotorula mucilaginosa, Issatchenkia orientalis, Hanseniaspora occidentalis, Lodderomyces elongisporus, Kluyveromyces thermotolerans, Hanseniaspora guilliermondii, Candida glabrata e Pichia anomala. Candida magnoliae, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, Clavispora lusitaniae, Cryptococcus humicolus, C. laurentii, Pichia membranaefaciens e Sporidiobolus salmonicolor foram representados por isolados únicos. Saccharomyces cerevisiae e Zygosaccharomyces rouxii foram isoladas, respectivamente de 5 e 4 tipos de concentrados de frutas. Trindade et al. (2002) investigaram a biodiversidade de leveduras em frutas maduras e polpas congeladas de acerola, mangaba, pitanga e umbu. Um total de 480 colônias foram isoladas e agrupadas em 405 linhagens diferentes. Candida sorbosivorans, Pseudozyma antarctica, C. spandovensis-like, C. spandovensis, C. parapsilosis, C. krusei (isolada apenas de polpa de mangaba congelada), Kloeckera apis, Rhodotorula graminis, Kluyveromyces marxianus, Cryptococcus laurentii, Metschnikowia spp (isolada apenas de pitanga madura), Issatchenkia occidentalis foram as mais freqüentes. A comunidade de leveduras de pitanga madura exibiu a mais alta freqüência de espécies, seguida pelas comunidades de acerola madura e polpa congelada de mangaba. Populações de leveduras de umbu maduro e polpa congelada de umbu tiveram o mais baixo número de espécies. Santos et al. (1996) determinaram as comunidades de leveduras associadas a algumas frutas típicas (cajá, caju, manga e umbu) economicamente importantes da região Nordeste do Brasil. As espécies de leveduras presentes nas flores, no campo, e nos frutos (verdes e maduros) foram dominadas pelas “leveduras pretas” e Cryptococcus laurentii. A espécie Metschnikowia pulcherrima foi frequentemente isolada de flores de caju e das abelhas associadas a este substrato. Uma espécie fenotipicamente semelhante à Candida entomaea predominou em frutos de cajá coletados no campo. Nos frutos maduros prevaleceram as espécies Issatchenkia orientalis e Kloeckera javanica. Frutos de caju dos mercados do Rio de Janeiro apresentaram comunidades de leveduras dominadas por Kloeckera apiculata. Mangas destes mesmos mercados mostraram predominância de Candida krusei, Issatchenkia terrícola e Kloeckera apiculata na superfície. A levedura que prevaleceu na casca e polpa desses frutos foi Candida krusei. Em trabalho realizado por Hoffmann et al. (1997) foram isoladas e identificadas leveduras de polpas de frutas, sendo também determinada a resistência das mesmas aos conservantes sorbato de potássio, benzoato de sódio e metabissulfito de sódio. As leveduras isoladas pertenciam aos gêneros Candida, Rhodotorula e Saccharomyces. Dos conservantes testados, o benzoato de sódio foi o mais eficiente, pois todas as leveduras foram inibidas por ele na concentração de 0,05%. A conservação de alimentos sempre foi de grande importância na vida do homem desde que ele começou a viver em grupos e a estocar sua colheita. Compostos como sal, açúcar, ácidos e fumaça de madeira têm sido usados como conservadores de alimentos há séculos. Atualmente, a conservação de alimentos é feita principalmente com o uso de conservadores químicos, os quais atuam como agentes antimicrobianos, protegendo os alimentos contra contaminação por bolores, leveduras e bactérias (KIMBLE, 1977; LÜCK, 1977; MARSH, 1966; SIMÃO, 1989). Com o início da industrialização, esta conservação se tornou mais importante e o homem passou a questionar a qualidade dos conservadores, uma vez que muitos deles alteravam significativamente as propriedades e estruturas dos alimentos. Desta forma, aumentaram-se os esforços para que estas substâncias, além de conservar os alimentos, protegessem suas propriedades nutricionais e sensoriais (LÜCK, 1977). A presença de conservadores associada à aplicação de calor leva a uma diminuição dos valores de tempo e temperatura necessários para destruir os microrganismos, assim como é necessária uma menor concentração do aditivo quando os alimentos são armazenados em uma câmara frigorífica e não em temperatura ambiente (LÜCK, 1977). Muitos conservantes são efetivos sob baixos pHs: ácido benzóico (pH < 4,0), ácido propiônico (pH < 5,0) e ácido sórbico (pH < 6,5), além de sulfetos (pH < 4,5). Os parabenzenos (ácidos-ésteres benzóicos) são mais efetivos em condições de pHs neutros. Os ácidos acético, benzóico, láctico e sórbico são fracos, comumente utilizados na conservação de alimentos. Essas moléculas inibem o desenvolvimento de bactérias e fungos. Utiliza-se, geralmente, uma concentração de aproximadamente 500 ppm de ácido benzóico para a conservação de bebidas com base de sucos de frutas (FORSYTHE, 2002). Em solução, os ácidos fracos conservantes existem em um equilíbrio pH- dependente (medido pelo valor pK) entre os estados associados e dissociados. A atividade ótima de inibição ocorre em condições de pH baixo, pois isso favorece o estado associado e não carregado da molécula que é livremente permeável através da membrana plasmática (lipolítica) e, assim, é capaz de penetrar na célula. A molécula se dissociará após entrar na célula, resultando em liberação de prótons e ânions carregados que não são capazes de atravessar a membrana plasmática. Dessa forma, a molécula de conservante difunde-se na célula até que o equilíbrio seja atingido. Isso resulta em acúmulo de ânions e prótons no interior da célula (BOOTH; KROLL, 1989). O ácido benzóico foi o primeiro conservador utilizado em alimentos nos Estados Unidos da América do Norte, sendo atualmente bastante intensa a sua utilização. Normalmente, é empregado na forma de sal sódico, devido à pequena solubilidade do ácido livre. Quando em solução, o sal se converte na forma ácida, que é a forma ativa (TOCCHINI; NISIDA; DE MARTIN, 1995). Devido ao seu baixo custo, facilidade de incorporação nos produtos, ausência de cor e relativa baixa toxicidade, o ácido benzóico tornou-se um dos conservadores mais utilizados no mundo (CHIPLEY, 1993). Os vários sais, assim como o dióxido de enxofre, quando dissolvidos em água, resultam em misturas de íons sulfito e bissulfito, sendo que a proporção relativa de cada forma é dependente do pH do meio. Desta maneira, a escolha da forma química para sulfitar alimentos é uma questão de conveniência, já que todas as formas são quimicamente equivalentes (ARAÚJO, 1988). O mecanismo de inibição do sulfito a nível celular se explica por meio das reações: ¬ Redução de ligações bissulfídricas essenciais em enzimas; ¬ Formação de compostos de adição que interferem na cadeia respiratória, envolvendo o NAD+ (nicotinamida adenina dinucleotídeo); ¬ Reação com acetaldeído (ARAÚJO, 1988). Todos os sais de enxofre parecem atuar de maneira análoga (FÚRIA, 1968). Inibem o desenvolvimento de fungos e bactérias, mas são seletivos, no sentido de que as leveduras são mais resistentes do que as bactérias lácticas e acéticas, bem como muito bolores (TOCCHINI; NISIDA; DE MARTIN, 1995). Os sais tendem a decrescer no teor de SO2 disponível durante o armazenamento, em conseqüência da oxidação. O SO2 é muito utilizado para a conservação de polpas em geral a nível doméstico. Este aditivo pode ser empregado com certas vantagens no caso da conservação de purês para a fabricação de doces, principalmente, pois sendo o componente ativo (SO2) volátil, a grande maioria dele é eliminada por ocasião da concentração do produto. Mesmo assim parte dele permanece combinado a radicais de compostos da polpa, não sendo, portanto, eliminado. No entanto, o aquecimento excessivo visando eliminar o SO2 acaba alterando as características de cor, aroma e sabor da polpa (TOCCHINI; NISIDA; DE MARTIN, 1995). Esse tipo de conservação de polpa ou purê é muito mencionado na literatura internacional e bastante utilizado em diversos países da África, Ásia e América Central que estudam a conservação das polpas de goiaba, mamão e manga, principalmente (TOCCHINI; NISIDA; DE MARTIN, 1995). Os mercados externos têm, atualmente, severas restrições com relação à utilização de SO2. Os países da Europa (a Alemanha, por exemplo) sempre tiveram restrições com relação a conservadores à base de enxofre para diversos produtos. Nos Estados Unidos, porém, seu emprego era permitido para frutas desidratadas (frutas-passa), bases para bebidas (limonadas e laranjadas), polpas e outros manufaturados (TOCCHINI; NISIDA; DE MARTIN, 1995). O uso do ácido sórbico como conservador de alimentos é bastante amplo em todo o mundo, devido ao fato de não interferir no sabor e ser fisiologicamente inócuo (LÜCK, 1977). Assim como para os benzoatos, a atividade antimicrobiana dos sorbatos está relacionada com a molécula não dissociada, o que determina sua maior atividade em alimentos ácidos ou acidificados. O ácido sórbico apresenta maior atividade em pH < 6. Em pH entre 4 e 6 o ácido sórbico e seus sais são mais eficientes que os benzoatos (JAY, 1996 e 2001). Os sorbatos são mais eficientes principalmente contra fungos e leveduras, embora atuem também contra uma variedade ampla de bactérias (JAY, 1996 e 2001). A principal desvantagem dos sorbatos é o seu custo relativamente maior que o dos benzoatos e propionatos. Entretanto, em produtos de maior pH eles são geralmente utilizados em quantidades menores do que os benzoatos e propionatos de modo a obter o efeito desejado (ROBACH, 1980). Organismos resistentes a conservantes incluem uma grande variedade de espécies de leveduras do gênero Candida, Debaryomyces, Dekkera, Issatchenkia, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces e Zygosaccharomyces (PITT; HOCKING, 1985). Determinou-se o efeito de vários agentes antimicrobianos (conservantes e compostos naturais) sobre o desenvolvimento de Aspergillus flavus em meio formulado com valores de pH e atividade de água selecionados. Importantes diferenças foram observadas, sendo em geral, os antimicrobianos naturais menos dependentes do pH do que os conservantes. Aspergillus flavus exibiu sensibilidade mais elevada a timol, eugenol, carvacrol, sorbato de potássio, bissulfito de sódio e benzoato de sódio em pH = 3,5 (LÓPEZ-MALO; ALZAMORA; PALOU, 2005). Tchango Tchango et al. (1997) examinaram a resistência térmica de Candida pelliculosa e Kloeckera apis, duas leveduras deteriorantes isoladas de sucos de frutas pasteurizados e néctares. C. pelliculosa demonstrou ser mais resistente ao calor do que K. apis. Os tempos mínimos de pasteurização (para destruir quase todas as formas vegetativas) de 27,81; 20,25 e 16,83 minutos foram obtidos para C. pelliculosa, respectivamente, em suco de abacaxi, néctar de maracujá e de goiaba, considerando-se 70°C como temperatura de referência para pasteurização daquelas bebidas. Empregando-se 75°C como temperatura de referência, os tempos mínimos foram 13,5 minutos para suco de abacaxi e 9,27 minutos para néctar de maracujá. Os tempos de tratamento térmico necessários a 80 e 94°C para se obter o mesmo resultado foram, respectivamente, 9,39 e 3,40 minutos para suco de abacaxi; 8,69 e 3,44 minutos para néctar de goiaba e 5,94 e 1,91 minutos para néctar de maracujá. Ethiraj e Suresh (1988) estudaram a distribuição microbiana associada durante o processamento de manga. A lavagem de frutas em água corrente reduziu a biota superficial consideravelmente. Devido ao baixo pH e ao alto teor de açúcar, produtos de manga são altamente susceptíveis a leveduras deteriorantes. Espécies de Kloeckera e Hyphopichia em frutas não lavadas e Kloeckera e Pichia em frutas lavadas foram predominantes. No entanto, polpas de ambas as frutas, lavadas e não lavadas, continham espécies de Kloeckera, Hyphopichia e Candida como as principais leveduras. Espécies de Candida, Kloeckera e Kluyveromyces foram predominantes na polpa de manga não tratada termicamente, enquanto a polpa tratada termicamente não mostrou a presença de nenhuma levedura. Foi avaliado o efeito do benzoato de sódio, sorbato de potássio e metabissulfito de potássio sobre o desenvolvimento de algumas leveduras predominantes. Verificou-se que benzoato de sódio a 500 ppm inibiu todas as leveduras, exceto Saccharomycodes ludwigii; enquanto sorbato de potássio e metabissulfito de potássio na mesma concentração inibiram todas as leveduras. O efeito do aquecimento sobre o desenvolvimento dessas leveduras indicou que nenhuma sobreviveu ao tratamento térmico a 60°C/20 min., exceto Pichia membranaefaciens. Em trabalho desenvolvido por Beuchat (1981) foi determinada a porcentagem de redução de células viáveis resultante de tratamento térmico durante 20 minutos, obtendo-se os seguintes resultados: Leveduras Temperatura (°C) Redução - (%) Debaryomyces hansenii 48 98 Hansenula anômala 45 74 Kluyveromyces fragilis 51 99 Lodderomyces elongisporus 51 93 Metschnikowia pulcherrima 45 76 Pichia membranaefaciens 48 51 Saccharomyces cerevisiae 50 50 Brettanomyces anomalus 45 88 Candida krusei 53 76 Kloeckera apiculata 45 87 Rhodotorula rubra 51 96 Torulopsis lactis-condensi 45 99 5. MATERIAIS E MÉTODOS 5.1. Obtenção das amostras Foram analisadas 62 amostras de polpas congeladas de frutas, em embalagens de 100 g, dentro do prazo de validade, sendo 7 da marca A, 38 da B e 17 da C. As mesmas foram acondicionadas em caixas de material isotérmico (isopor) contendo cubos de gelo e transportadas de imediato ao Laboratório de Microbiologia de Alimentos (HARRIGAN; MC CANCE, 1976; ICMSF, 1978). 5.2. Preparo das amostras No Laboratório cada amostra recebeu um código de identificação, ou seja, PFn onde PF = polpa de fruta e n = número da amostra. A seguir, assepticamente 10 g da mesma foram colocados em um frasco de Erlenmeyer contendo 90 mL de água destilada estéril sendo homogeneizados posteriormente (diluição 10-1). A partir desta foram realizadas as demais diluições decimais seriadas, até 10-5 utilizando-se o mesmo diluente. As cinco diluições obtidas, assim como a 100, foram usadas, conforme necessárias, nas análises subseqüentes (ICMSF, 1974; ICMSF, 1980). 5.3. Enumeração de bolores e leveduras Foi pipetado assepticamente 1 mL de cada diluição e distribuído em placas de Petri esterilizadas e identificadas. Foi adicionado a cada placa 15 mL de ágar batata dextrose acidificado com ácido tartárico a 10% (pH = 4,0), ambos esterilizados; após solidificação foram incubadas em estufa a 25°C por 5 dias. As unidades formadoras de colônias (UFC) foram calculadas de acordo com as diluições (ICMSF, 1978). 5.4. Determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais Foi utilizada a técnica dos tubos múltiplos, empregando-se o caldo lauril sulfato triptose com incubação a 35°C durante 48 horas. 5.5. Determinação do NMP de coliformes termotolerantes Foi também usada a técnica dos tubos múltiplos, utilizando-se o caldo EC com incubação a 44,5°C durante 24 horas (BRASIL, 1981 e 2003). A determinação do NMP de coliformes totais e termotolerantes foi realizada empregando-se a tabela de Hoskins (ICMSF, 1978). 5.6. Pesquisa de Escherichia coli A partir dos tubos de ensaio contendo caldo EC, usados na quantificação de coliformes termotolerantes que apresentaram turvação, com ou sem gás no interior do tubo de Durham foram realizadas semeaduras por esgotamento na superfície de placas de Petri contendo ágar eosina azul de metileno e incubação a 35°C durante 48 horas. As colônias suspeitas foram identificadas utilizando-se os testes bioquímicos (IMVIC), isto é, de indol/vermelho de metila/Voges-Proskauer/citrato (MARTH, 1978; SPECK, 1976). 5.7. Pesquisa de Salmonella spp Em 225 mL de caldo lactosado e de água peptonada a 1% foram homogeneizados, respectivamente 25 g de cada amostra. Depois da incubação a 35°C por 24 horas, 1 mL de cada cultivo foi transferido para tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo tetrationato de Kauffmann e 10 mL de caldo selenito cistina que foram incubados a 35°C. Após 24, 48 e 120 horas foram feitas semeaduras, em superfície de placas de Petri contendo ágar Salmonella Shigella e ágar verde brilhante, as colônias suspeitas foram submetidas aos testes bioquímicos (principalmente inoculação em ágar tríplice açúcar e ferro, ágar lisina e ferro, teste de urease, degradação do malonato, desaminação da fenilalanina e descarboxilação da lisina) e sorológicos (BRASIL, 1981 e 2003). 5.8. Isolamento das culturas de leveduras A partir do experimento realizado para enumeração de bolores e leveduras, foram isoladas após cinco dias de incubação a 25°C, 136 culturas de todos os tipos morfológicos existentes, sendo que colônias mais numerosas no ágar batata dextrose acidificado foram isoladas em maior proporção, visando conhecer aquelas predominantes. Em seguida, cada cultura pura recebeu um código de identificação, ou seja, PFn,n1 onde PF = polpa de fruta, n = número da amostra e n1 = número da levedura isolada desta amostra e foi estocada em tubos de ensaio de 12 x 100 mm contendo meio Gymp (glicose, extrato de levedura, extrato de malte, NaH2PO4 e ágar), para posterior identificação, sendo então coberta com óleo mineral para evitar ressecamento e mantida a 8 ± 2°C. 5.9. Provas taxonômicas Nos testes taxonômicos (morfológicos e fisiológicos) foram empregados os métodos descritos por Kreeger Van Rij (1984) e Barnett, Payne e Yarrow (1983 e 1990). A identificação das culturas realizou-se segundo as chaves descritas por Barnett, Payne e Yarrow (1990) e Kurtzman e Fell (1998). 5.10. Provas morfológicas Para a verificação da produção de esporos foram utilizados o meio de cultura de Gorodkowa (glicose, peptona, NaCl e ágar) e o ágar acetato de McClary (glicose, KCl, extrato de levedura, acetato de sódio e ágar). As placas de Petri foram mantidas à temperatura ambiente e as observações feitas periodicamente entre 7, 14 e 21 dias. 5.11. Provas fisiológicas 5.11.1. Capacidade fermentativa Para verificar a capacidade fermentativa das culturas foi utilizado o meio básico para fermentação (peptona e extrato de levedura). O mesmo foi colocado em tubos de ensaio de 12 x 100 mm contendo tubo de Durham invertido. Os açúcares foram esterilizados separadamente do meio de cultura. Inicialmente foi testada a capacidade fermentativa frente à glicose. As culturas que apresentaram resultado positivo foram então submetidas a três dissacarídeos: sacarose, maltose e lactose. Os tubos de ensaio foram mantidos à temperatura ambiente sendo as leituras feitas periodicamente entre 7 e 21 dias. Considerou-se resultado positivo quando 1/3 a 3/3 do tubo de Durham estivesse preenchido com gás e negativo quando não houvesse tal produção (KREEGER VAN RIJ, 1984; BARNETT; PAYNE; YARROW, 1983 e 1990). 5.11.2. Desenvolvimento em diversas temperaturas Foi analisada a capacidade de desenvolvimento a 35, 40 e 42°C, utilizando-se o meio básico para fermentação (peptona e extrato de levedura) acrescido de 2,0% de glicose. Para a temperatura de 35°C, os tubos de ensaio foram mantidos em estufa de incubação e para as demais foi utilizado o banho-maria. As leituras foram feitas através do Cartão de Whickerham (KREEGER VAN RIJ, 1984), após 48-72 horas de incubação. Foi considerado desenvolvimento positivo quando as linhas do cartão não foram visíveis e negativo quando estas foram visualizadas. 5.11.3. Desenvolvimento em meio de cultura contendo nitrato Utilizou-se o Yeast Carbon Base (YCB-Difco) contendo 0,078% de KNO3 como fonte de nitrogênio e 2,0% de ágar (KREEGER VAN RIJ, 1984; BARNETT; PAYNE; YARROW, 1983 e 1990). 5.11.4. Resistência à pressão osmótica Neste teste, foram utilizadas duas substâncias distintas. O meio básico para ambas foi o ágar Sabouraud glicose. Para um dos testes, foi acrescentado 50% de glicose e para o outro 10% de NaCl (KREEGER VAN RIJ, 1984; BARNETT; PAYNE; YARROW, 1983 e 1990). 5.11.5. Desenvolvimento em meio de cultura contendo cicloheximida (actidione) Para esta prova foi empregado o Yeast Nitrogen Base (YNB-Difco) acrescido de 1,0% de glicose, 2,0% de ágar e alíquotas de cicloheximida que variaram de acordo com a concentração desejada (100 ou 1000 partes por milhão-ppm), segundo metodologia descrita por Kreeger Van Rij (1984). 5.11.6. Síntese de amido Para a verificação da produção de compostos amilóides foi utilizado o ágar Sabouraud glicose. Após o desenvolvimento das culturas, foi gotejada sobre as mesmas uma solução de lugol. O aparecimento de coloração azul escura indicou resultado positivo (KREEGER VAN RIJ, 1984; BARNETT; PAYNE; YARROW, 1983 e 1990). 5.11.7. Provas de assimilação de fontes de carbono Foram usadas as seguintes substâncias: glicose, galactose, L-sorbose, maltose, sacarose, celobiose, trealose, lactose, melibiose, rafinose, melezitose, inulina, amido solúvel, D-xilose, L-arabinose, D-arabinose, D-ribose, L-ramnose, etanol, glicerol, eritritol, ribitol (adonitol), galactitol (dulcitol), D-manitol, D-glucitol (sorbitol), salicina, citrato, m-inositol e glicosamina. Todas as substâncias foram utilizadas na concentração de 0,5%, exceto a rafinose que foi a 1,0%, acrescidas ao Yeast Nitrogen Base (YNB-Difco) mais 2,0% de ágar (KREEGER VAN RIJ, 1984; BARNETT; PAYNE; YARROW, 1983 e 1990). 5.12. Ensaio de resistência aos principais conservantes alimentícios contidos na legislação vigente para produtos de frutas e frutos Para esta prova foi utilizado o ágar Sabouraud glicose, pH = 3,0; onde foram acrescentados os conservantes alimentícios sorbato de potássio (código INS - 202) nas concentrações 0,025; 0,05; 0,1; 0,2 e 0,4%; benzoato de sódio (código INS - 211) nas de 0,005; 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,3 e 0,4% e metabissulfito de sódio (código INS - 223) nas de 0,005; 0,01; 0,015; 0,02; 0,03; 0,04; 0,06; 0,075; 0,15 e 0,3%. Para verificar o desenvolvimento microbiano foi empregado como controle o mesmo meio de cultura, porém sem a adição de conservante. Para esta avaliação o pH do meio foi ajustado para 3,0; porque neste valor se obtém uma ótima atividade antimicrobiana dos conservantes empregados. Foram também esterilizados separadamente, por autoclavagem ou filtração em membrana filtrante (0,45 ì m), o meio básico (sem o ágar), o ágar e os conservantes, para se evitar, em primeiro lugar, a hidrólise do ágar durante o aquecimento, com a perda do poder de gelificação e ainda no que se refere aos conservantes utilizados eventuais perdas por hidrólise ou evaporação. 5.13. Prova de sensibilidade ao tratamento térmico (90°C/60 segundos) Neste teste as respectivas culturas puras isoladas foram previamente inoculadas em tubos de ensaio contendo caldo nutriente e incubadas a 25°C por 24 horas. Depois desse período tais culturas foram submetidas à temperatura de 90°C por 60 segundos (TOCCHINI; NISIDA; DE MARTIN, 1995). Após o tratamento térmico as leveduras foram então semeadas em placas de Petri contendo ágar nutriente e incubadas a 25°C. As leituras foram feitas após 5 dias. 5.14. Técnica de replica-plate A técnica de replica-plate foi usada para as provas descritas nos ítens 5.10., 5.11.3. a 5.11.7., 5.12 e 5.13. Nos testes onde foi utilizado este método, como inóculo, culturas de 24-48 horas em meio Gymp, foram transferidas e pré-incubadas durante 3 a 5 dias à temperatura ambiente em Yeast Nitrogen Base (YNB-Difco) líquido contendo 0,1% de glicose, sendo agitadas periodicamente para o consumo do endógeno (nutriente). A partir daí, cada inóculo foi transferido assepticamente para um sistema replica- plate multitiped, que permite a inoculação de vinte e cinco colônias/placa de Petri (LEDERBERG; LEDERBERG, 1952; SHEREE LIN, FUNG; COX, 1987). As placas de Petri foram incubadas em estufa a 25°C com leituras de 7, 14 e 21 dias de incubação. 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO 6.1. Análises microbiológicas Os resultados obtidos após a enumeração de bolores e leveduras, determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais, NMP de coliformes fecais (termotolerantes), pesquisa de Escherichia coli e de Salmonella spp das 62 amostras de polpas congeladas de frutas das marcas A, B e C estão demonstrados respectivamente nas TABELAS 1, 2 e 3. As contagens de bolores e leveduras apresentaram valores compreendidos nos intervalos de: < 1 a 4,0 x 100 UFC/g (marca A), < 1 a 1,2 x 105 UFC/g (B) e < 1 a 4,2 x 102 UFC/g (C). Em estudos realizados por outros pesquisadores foram encontrados para esses microrganismos intervalos de respectivamente < 10 a 1,2 x 105; < 10 a 4,4 x 102; < 10 a 1,5 x 106; 5,4 x 102 a 1,0 x 106; < 10 a 3,0 x 106 e < 10 a 6,2 x 104 UFC/g (FEITOSA et al., 1999a; HOFFMANN et al., 1997; FEITOSA et al., 1999b; NASCIMENTO et al., 1999; LEITE et al., 2000; LIMA; MARTINS; SILVA, 2001); os quais são superiores aos obtidos para as marcas A e C, no entanto inferiores, iguais ou superiores aos da marca B. A legislação atual (BRASIL, 2001) não apresenta padrão para esses microrganismos, contudo Feitosa et al., 1999a demonstraram que 24% das amostras por eles analisadas estavam em desacordo com o padrão de 5,0 x 103 UFC/g vigente na época da realização do estudo (BRASIL, 1998). Apenas 5 amostras pertencentes à marca B (13,1%) apresentaram valores superiores ao mencionado. Nascimento et al. (1999) ao analisarem polpas de abacaxi e acerola constataram que 100% das de abacaxi e 20% das de acerola encontravam-se em desacordo com o padrão em vigor (BRASIL, 1987), cujo limite máximo permitido era de 103 UFC/g. Se considerarmos este padrão, estariam em desacordo com o mesmo 6 amostras da marca B (15,8%). Feitosa et al. (1997) analisaram polpas de acerola, cajá e caju comercializadas nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte. Os seus resultados para bolores e leveduras variaram de < 10 a 2,1 x 104 (polpa de acerola); < 10 a 4,1 x 105 (cajá) e < 10 a 8,1 x 103 UFC/g (caju); estando os valores obtidos neste trabalho, para estas polpas, compreendidos nestes intervalos. A avaliação microbiológica de polpas congeladas de frutas (abacaxi, cajá, caju, goiaba, manga e maracujá) produzidas no estado da Bahia foi realizada por Leite et al. (2000). O valor máximo foi encontrado na polpa de abacaxi (3,0 x 106 UFC/g); resultado este superior aos obtidos para as polpas de abacaxi das marcas A, B e C. Bruno, Nassu e Morais (2004) encontraram valores maiores para bolores e leveduras no abacaxi após lavagem (3,5 x 106 UFC/g) e no resíduo de caju - despolpadeira (7,2 x 105 UFC/g). Coliformes totais foram encontrados respectivamente em 0; 5,2 e 0% das polpas congeladas de frutas das marcas A, B (açaí e milho verde) e C. Hoffmann et al. (1997) e Feitosa et al. (1999a) obtiveram, para estes microrganismos, resultados semelhantes aos exibidos pelas marcas A e C. Polpas avaliadas por Lima, Martins e Silva (2001) e Feitosa et al. (1999b) apresentaram coliformes totais em respectivamente 6,9 e 18,8% das amostras. Considerando o percentual (5,2%) obtido neste estudo para as amostras da marca B verifica-se que o mesmo foi inferior. Leite et al. (2000) analisaram polpas de cajá, caju, goiaba, manga e maracujá, as quais apresentaram respectivamente os valores máximos de: 2,4 x 103; 2,4 x 103; 1,1 x 103; 4,3 x 101 e 4,3 x 101 NMP/g; estando estes acima dos obtidos para as polpas da mesma fruta das marcas A, B e C. Não foi constatada a presença de coliformes termotolerantes em 100% das amostras pertencentes às marcas A e C. Em estudos similares, Hoffmann et al. (1997) e Santos et al. (2004) também não detectaram a presença destas bactérias. Com relação à marca B, estes microrganismos foram encontrados em 2,6% das amostras; contudo Feitosa et al. (1999a); Feitosa et al. (1999b); Abreu, Nunes e Oliveira (2003) e Feitosa et al. (1997) obtiveram percentuais superiores; sendo os mesmos respectivamente de 3; 2,8; 15 e 8,11%. Polpas de goiaba e maracujá analisadas por Leite et al. (2000) apresentaram estes microrganismos em respectivamente 60 e 20% das amostras; as mesmas polpas avaliadas neste trabalho não apresentaram tais bactérias. Coliformes termotolerantes foram encontrados em polpas de abacaxi, goiaba e mamão analisadas por Lima, Martins e Silva (2001); estando os índices dentro do padrão (1 NMP/g) permitido (BRASIL,1999), assim como as polpas das marcas A e C. Porém, uma amostra referente à marca B apresentou resultado superior à 1 NMP/g. A presença de Escherichia coli não foi detectada em 100% das polpas referentes às marcas A e C; o mesmo pode ser verificado por meio de avaliações realizadas por Hoffmann et al. (1997) e Santos et al. (2004). Este microrganismo foi confirmado em 2,6% das amostras (marca B), as quais foram representadas apenas pela polpa de açaí. Em estudos realizados por Nascimento et al. (1999), foi constatada a presença deste microrganismo em 10% das de acerola; estando em desacordo com o padrão (1 NMP/g) federal (BRASIL, 1987) e sendo este valor superior ao apresentado por uma amostra da marca B. No que se refere à Salmonella spp, 100% das amostras das marcas A, B e C não apresentaram esta bactéria; o mesmo pode ser constatado em trabalhos semelhantes desenvolvidos por Nascimento et al. (1999); Feitosa et al. (1999b), Bueno et al. (2002); Abreu, Nunes e Oliveira (2003) e Feitosa et al. (1997). No entanto, Hoffmann et al. (1997) em estudo similar constataram que 10% das amostras (polpa de coco) apresentavam o patógeno, assim como a polpa de caju analisada por Morais, Nassu e Bruno (2004). TABELA 1. Apresentação dos resultados das diferentes análises microbiológicas (marca A). Bolores Coliformes Coliformes Escherichia Salmonella Polpa de: e totais fecais1 coli spp leveduras (UFC/g) (NMP/g) (NMP/g) (confirmativo) (-/+) Abacaxi 4,0 x 100 < 3 < 3 - - Acerola 1,5 x 100 < 3 < 3 - - Goiaba 0,5 x 100 < 3 < 3 - - Graviola 2,0 x 100 < 3 < 3 - - Maracujá < 1 < 3 < 3 - - Seriguela 1,5 x 100 < 3 < 3 - - Umbu 0,5 x 100 < 3 < 3 - - Variação < 1 < 3 < 3 - - a 4,0 x 100 Padrão Federal2 102 ausência em (BRASIL, 2001) 25 g 1termotolerantes. 2Resolução RDC n. 12/2001. TABELA 2. Apresentação dos resultados das diferentes análises microbiológicas (marca B). Bolores Coliformes Coliformes Escherichia Salmonella Polpa de: e totais fecais1 coli spp leveduras (UFC/g) (NMP/g) (NMP/g) (confirmativo) (-/+) Abacate 2,7 x 101 < 3 < 3 - - Abacaxi 1,2 x 105 < 3 < 3 - - Abacaxi + Hortelã 1,1 x 105 < 3 < 3 - - Abacaxi + Laranja 1,0 x 102 < 3 < 3 - - Açaí 5,7 x 103 3 3 + - Acerola 1,1 x 102 < 3 < 3 - - Amora 2,3 x 102 < 3 < 3 - - Banana 5,9 x 102 < 3 < 3 - - Cacau < 1 < 3 < 3 - - Cajá 1,0 x 101 < 3 < 3 - - Caju 1,2 x 102 < 3 < 3 - - Carambola < 1 < 3 < 3 - - Clorofila* 6,4 x 101 < 3 < 3 - - Coco < 1 < 3 < 3 - - Cupuaçu 0,5 x 100 < 3 < 3 - - Framboesa 9,5 x 101 < 3 < 3 - - Frutas Vermelhas** 2,0 x 101 < 3 < 3 - - Goiaba 5,3 x 101 < 3 < 3 - - Graviola 0,5 x 100 < 3 < 3 - - Kiwi 1,0 x 100 < 3 < 3 - - Laranja 1,9 x 102 < 3 < 3 - - Laranja + Acerola 7,2 x 103 < 3 < 3 - - Limão 1,0 x 100 < 3 < 3 - - Maçã 0,5 x 100 < 3 < 3 - - Mamão 5,0 x 100 < 3 < 3 - - Manga 4,5 x 101 < 3 < 3 - - Maracujá 4,1 x 102 < 3 < 3 - - Melancia 1,1 x 102 < 3 < 3 - - Milho Verde 5,1 x 104 460 < 3 - - continua TABELA 2. Apresentação dos resultados das diferentes análises microbiológicas (marca B) (continuação). Bolores Coliformes Coliformes Escherichia Salmonella Polpa de: e totais fecais1 coli spp leveduras (UFC/g) (NMP/g) (NMP/g) (confirmativo) (-/+) Morango 1,3 x 102 < 3 < 3 - - Pêra < 1 < 3 < 3 - - Pêssego 8,0 x 100 < 3 < 3 - - Pitanga 0,5 x 100 < 3 < 3 - - Tamarindo < 1 < 3 < 3 - - Tangerina 4,4 x 103 < 3 < 3 - - Umbu 1,0 x 100 < 3 < 3 - - Uva 1,9 x 102 < 3 < 3 - - Vitamina*** 2,7 x 101 < 3 < 3 - - Variação < 1 < 3 < 3 - - a a a a 1,2 x 105 460 3 + Padrão Federal2 102 ausência em (BRASIL, 2001) 25 g * Polpa mista de kiwi, abacaxi, maçã e folhas verdes. ** Polpa mista de morango, amora e framboesa. *** Polpa mista de banana, morango, maçã e mamão. 1termotolerantes. 2Resolução RDC n. 12/2001. TABELA 3. Apresentação dos resultados das diferentes análises microbiológicas (marca C). Bolores Coliformes Coliformes Escherichia Salmonella Polpa de: e totais fecais1 coli spp leveduras (UFC/g) (NMP/g) (NMP/g) (confirmativo) (-/+) Abacaxi 8,5 x 100 < 3 < 3 - - Açaí 4,5 x 100 < 3 < 3 - - Acerola 2,5 x 100 < 3 < 3 - - Cacau 1,0 x 100 < 3 < 3 - - Caju 8,5 x 100 < 3 < 3 - - Cupuaçu 0,5 x 101 < 3 < 3 - - Goiaba 4,2 x 102 < 3 < 3 - - Limão < 1 < 3 < 3 - - Mamão 4,8 x 101 < 3 < 3 - - Manga 7,5 x 100 < 3 < 3 - - Maracujá < 1 < 3 < 3 - - Melão 6,5 x 100 < 3 < 3 - - Morango 4,0 x 100 < 3 < 3 - - Seriguela 1,5 x 101 < 3 < 3 - - Tamarindo 0,5 x 101 < 3 < 3 - - Umbu 1,0 x 100 < 3 < 3 - - Uva 1,5 x 100 < 3 < 3 - - Variação < 1 < 3 < 3 - - a 4,2 x 102 Padrão Federal2 102 ausência em (BRASIL, 2001) 25 g 1termotolerantes. 2Resolução RDC n. 12/2001. 6.2. Isolamento das culturas de leveduras As leveduras são frequentemente associadas com o processo fermentativo relacionado com a produção de pães e bebidas, principalmente a cerveja e os vinhos. Entretanto, este conceito é muito restrito, pois muitas espécies não são fermentadoras e é mais prudente considerá-las como fungos cujo estágio vegetativo se reproduz principalmente por brotamento ou fissão, resultando em desenvolvimento onde a fase unicelular pode ser predominante (KURTZMAN; FELL, 1998). As leveduras não ocorrem ao acaso por meio da biosfera. Elas formam comunidades de espécies, as quais podem ser definidas pelo habitat, que é o verdadeiro local onde um grupo de leveduras vive e pelos nichos de suas espécies componentes (LACHANCE; STARMER, 1998). Uma das fontes alimentares utilizadas pelos insetos são os frutos, inclusive aqueles que estão em processo de apodrecimento os quais, geralmente, são colonizados por leveduras apiculadas (gêneros Kloeckera, Hanseniaspora e Saccharomycodes), fermentadoras e com grandes restrições quanto às suas capacidades de assimilação de diferentes fontes de carbono. Tais espécies são extintas nos estágios seguintes de sucessão, conforme suas fontes de alimento se esgotam (e a presença de etanol aumenta) e a diversidade de espécies presente nos frutos aumenta quanto mais o fruto se deteriora (MORAIS et al., 1995). Também, os produtos secundários dessa fermentação podem ser outra fonte de energia para as leveduras, que são “inoculadas” por vetores que acabam visitando os frutos em decomposição, como vespas, besouros e moscas (LACHANCE, 1995; MORAIS et al., 1995). Um total de 136 (100,00%) leveduras foi isolado de 55 amostras de polpas congeladas de frutas, apesar de terem sido analisadas 62 amostras, sendo 87 culturas isoladas das polpas da marca B e 49 da C. A distribuição das leveduras segundo a origem está exibida, respectivamente, nas TABELAS 4 e 5. Todas as leveduras isoladas estão na TABELA 6. Nas TABELAS 7 e 8 são apresentadas as freqüências das leveduras isoladas, respectivamente, das marcas B e C. 6.2.1. Marca B O maior número de leveduras foi isolado das polpas de amora (10) e melancia (10). Com relação às leveduras isoladas das polpas de frutas da marca B, o gênero Saccharomyces foi o mais numeroso, compreendendo 28 culturas (32,18%) e representado apenas pela espécie Saccharomyces cerevisiae. Tais leveduras foram isoladas das polpas congeladas de abacaxi + laranja, banana, caju, clorofila, goiaba, laranja, melancia, pêssego, pitanga, tangerina e uva. Em trabalho similar realizado por Hoffmann et al. (1997) o gênero Saccharomyces predominou, representando 46,1% das culturas. O gênero Debaryomyces foi o segundo mais numeroso, sendo representado por 20 leveduras (22,99%), das quais 19 (21,84%) pertencentes à espécie Debaryomyces hansenii var. fabryi e 1 (1,15%) à espécie Debaryomyces vanrijiae var. vanrijiae. As culturas pertencentes à espécie Debaryomyces hansenii var. fabryi foram isoladas das polpas congeladas de abacate, abacaxi + hortelã, açaí, banana, frutas vermelhas, goiaba, laranja, melancia, milho verde, tangerina e uva. Aquela pertencente à espécie Debaryomyces vanrijiae var. vanrijiae foi isolada também de polpa congelada de frutas vermelhas. Dekkera bruxellensis representou 14,94% das culturas isoladas das polpas da marca B, sendo este percentual superior ao obtido (7,33%) por Beckenkamp (1997). Leveduras dos gêneros Saccharomyces e Rhodotorula foram isoladas das polpas de laranja. Sancho et al. (2000) detectaram os mesmos gêneros ao analisar concentrado de laranja. 6.2.2. Marca C Polpa de melão apresentou o maior número de culturas isoladas (12). Culturas isoladas das polpas de frutas da marca C apresentaram como gênero mais numeroso o Saccharomyces. Este totalizou 29 culturas (59,19%), sendo representado apenas pela espécie Saccharomyces cerevisiae. As leveduras foram originadas de polpas congeladas de abacaxi, caju, mamão, melão e uva. Valor inferior (24,7%) foi obtido por Deak e Beuchat (1993). O gênero Torulaspora foi o segundo mais numeroso, compreendendo 11 culturas (22,45%) e representado apenas pela espécie Torulaspora delbrueckii. As leveduras foram isoladas das polpas congeladas de goiaba, manga e melão. Cultura pertencente ao gênero Saccharomyces foi isolada de polpa de abacaxi. O mesmo foi constatado em trabalho realizado por Ivo (1982). Rhodotorula foi um dos gêneros isolados de polpa de manga, sendo também encontrado no mesmo produto analisado por Santos et al. (1996). Saccharomyces cerevisiae foi isolada das polpas de caju e uva das marcas B e C, assim como Debaryomyces hansenii var. fabryi foi isolada das de goiaba das marcas em questão. Após serem submetidas aos testes taxonômicos as leveduras foram divididas em 58 grupos (TABELA 9) de acordo com a discordância em alguns dos resultados em relação à descrição padrão. Do total de leveduras isoladas verificou-se que 57 (41,90%) representadas por Saccharomyces cerevisiae estavam contidas nos grupos I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X; 24 (17,65%) por Debaryomyces hansenii var. fabryi incluídas nos grupos XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI; 13 (9,55%) por Dekkera bruxellensis contidas nos grupos XXVII, XXVIII, XXIX, XXX, XXXI, XXXII; 13 (9,55%) por Torulaspora delbrueckii contidas nos grupos XXXIII, XXXIV; 6 (4,40%) por Rhodotorula mucilaginosa contidas nos grupos XXXV, XXXVI, XXXVII, XXXVIII; 4 (2,94%) por Rhodotorula glutinis contidas nos grupos XXXIX, XL, XLI; 4 (2,94%) por Trichosporon beigelii contidas nos grupos XLII, XLIII, XLIV, XLV; 2 (1,47%) por Candida apis contidas no grupo XLVI; 2 (1,47%) por Sporidiobolus johnsonii contidas no grupo XLVII; 2 (1,47%) por Hanseniaspora vineae contidas nos grupos XLVIII, XLIX; 1 (0,74%) por Bullera variabilis contida no grupo L; 1 (0,74%) por Cryptococcus albidus contida no grupo LI; 1 (0,74%) por Debaryomyces hansenii var. hansenii contida no grupo LII; 1 (0,74%) por Debaryomyces vanrijiae var. vanrijiae contida no grupo LIII; 1 (0,74%) por Pichia farinosa contida no grupo LIV; 1 (0,74%) por Rhodotorula minuta contida no grupo LV; 1 (0,74%) por Schizosaccharomyces pombe contida no grupo LVI; 1 (0,74%) por Sporobolomyces roseus contida no grupo LVII e 1 (0,74%) por Stephanoascus ciferrii contida no grupo LVIII, como exibido na TABELA 9. Pode-se constatar que tais leveduras apresentaram variações em seus resultados, em relação à descrição padrão, conforme demonstra a TABELA 10. As leveduras do grupo I diferiram da descrição padrão, por não fermentar glicose e usar nitrato. O grupo II diferiu por não fermentar glicose, assimilar sorbose, inulina e nitrato. O III por não fermentar glicose, assimilar salicina, eritritol e nitrato. O IV por utilizar nitrato. O V diferiu do padrão por não fermentar glicose, assimilar inulina e nitrato. O VI por não fermentar glicose, usar salicina, lactose, galactitol e nitrato. O VII diferiu por não fermentar glicose, utilizar salicina, galactitol e nitrato. O VIII por não fermentar glicose, e por assimilar sorbose, glicosamina, lactose e nitrato. O IX por não fermentar glicose, assimilar galactitol e nitrato. O X por não fermentar glicose, utilizar eritritol e nitrato. As culturas do grupo XI diferiram da descrição padrão por assimilar nitrato e se desenvolver a 40°C. O grupo XII diferiu por assimilar nitrato e m-inositol, se multiplicar a 40°C e não usar citrato. O XIII por não utilizar xilose, ribitol e citrato, usar nitrato e se desenvolver a 40°C. O XIV por utilizar m-inositol e nitrato e por se desenvolver a 40°C. O XV diferiu por usar nitrato, se multiplicar a 40°C e produzir pigmento (“pink” = rosa intenso). O XVI por não assimilar xilose, usar nitrato e se desenvolver a 40°C. O XVII por assimilar nitrato, se multiplicar a 40°C e por não se desenvolver em glicose 50%. O XVIII diferiu por não utilizar xilose, ribitol, manitol e etanol; por assimilar nitrato e se desenvolver a 40°C. O grupo XIX diferiu por assimilar nitrato, não usar etanol e se desenvolver a 40°C. O XX por usar nitrato, não assimilar manitol e citrato e por se multiplicar a 40°C. O XXI por não usar ribitol, assimilar m-inositol e nitrato e se desenvolver a 40°C. O XXII diferiu da descrição padrão por assimilar m-inositol e se multiplicar a 40°C. O XXIII diferiu por não usar melezitose e citrato, utilizar m-inositol e nitrato e por se desenvolver a 40°C. O XXIV por não assimilar xilose, melezitose, ribitol e glucitol, por usar nitrato e se multiplicar a 40°C. O XXV por não utilizar etanol, assimilar nitrato, se desenvolver a 40°C e produzir pigmento. O XXVI diferiu por não usar ribitol, utilizar nitrato e se multiplicar a 40°C. As leveduras do grupo XXVII diferiram da descrição padrão por não fermentar sacarose, não se desenvolver em cicloheximida 100 ppm e se multiplicar em glicose 50%. O grupo XXVIII diferiu por não fermentar sacarose, não se desenvolver em cicloheximida 100 ppm, assimilar lactose e se multiplicar em glicose 50%. O XXIX por não fermentar sacarose, utilizar sorbose, não se multiplicar em cicloheximida 100 ppm e se desenvolver em glicose 50%. O XXX por não fermentar sacarose e não se multiplicar em cicloheximida 100 ppm. O XXXI por não fermentar sacarose, assimilar manitol, não se desenvolver em cicloheximida 100 ppm e se multiplicar em glicose 50%. O XXXII por não fermentar sacarose, utilizar citrato e não se desenvolver em cicloheximida 100 ppm. As culturas do grupo XXXIII diferiram da descrição padrão por não fermentar glicose, usar nitrato e se desenvolver a 40°C. O XXXIV diferiu por não fermentar glicose, assimilar celobiose e nitrato e se multiplicar a 40°C. Aquelas do grupo XXXV diferiram da descrição padrão por utilizar amido solúvel, se desenvolver a 40°C e apresentar esporos. O grupo XXXVI diferiu por não assimilar xilose, se multiplicar a 40°C e ser ascosporógenos. O XXXVII por não utilizar trealose, se desenvolver a 40°C e apresentar esporos. O XXXVIII por não usar xilose e ribitol, assimilar amido solúvel, se multiplicar a 40°C e ser ascosporógenos. As leveduras do grupo XXXIX diferiram da descrição padrão por assimilar melibiose, não utilizar etanol, se desenvolver a 40°C, não produzir pigmento e ser ascosporógenos. O grupo XL diferiu por não usar melibiose, se multiplicar a 40°C, não produzir pigmento e apresentar esporos. O grupo XLI por não utilizar melezitose, se desenvolver a 40°C, não produzir pigmento e serascosporógenos. A cultura do grupo XLII diferiu da descrição padrão por não usar ribose, assimilar nitrato, não se multiplicar em cicloheximida 100 ppm e apresentar esporos. O grupo XLIII diferiu por utilizar inulina, galactitol e nitrato, não usar xilose, não se desenvolver em cicloheximida 100 ppm e ser ascosporógenos. O XLIV por assimilar nitrato, não utilizar ribose, xilose e etanol; não se multiplicar em cicloheximida 100 ppm e apresentar esporos. O XLV por não usar xilose e etanol, assimilar nitrato e galactitol e ser ascosporógenos. As leveduras pertencentes ao grupo XLVI diferiram da descrição padrão por não utilizar manitol, se desenvolver a 40°C e não se multiplicar em glicose 50%. Aquelas do grupo XLVII diferiram por se multiplicar a 40°C, não produzir pigmento e apresentar esporos. A levedura do grupo XLVIII diferiu por não fermentar glicose, assimilar melibiose, galactitol e nitrato. Aquela do grupo XLIX diferiu por não fermentar glicose e utilizar nitrato. O grupo L diferiu por usar nitrato, se desenvolver a 35 e 40°C, se multiplicar em glicose 50% e ser ascosporógenos. O LI diferiu por assimilar inulina, se multiplicar a 40°C e apresentar esporos. O LII por utilizar m-inositol e nitrato e por não usar etanol. O LIII por não assimilar eritritol, usar nitrato e se desenvolver a 40°C. O LIV por utilizarrafinose, m-inositol e nitrato e por não assimilar citrato. O LV diferiu por usar nitrato, se multiplicar a 40°C e serascosporógenos. O LVI por utilizar salicina e nitrato. O LVII por assimilar melibiose e se desenvolver a 35 e 40°C. O LVIII por não usar m-inositol e por utilizar nitrato. Saccharomyces cerevisiae, a mais isolada neste estudo, caracterizada como um exemplo de levedura fortemente fermentativa, mas pouco freqüente como deteriorante. Em xaropes de glicose com pH neutro se desenvolve em Aa abaixo de 0,89 e o pH mínimo encontra-se na faixa de 1,6 a 2,0, dependendo do ácido presente. É pouco resistente aos conservantes, com tolerância máxima a 100 mg/kg de ácido benzóico em pH = 2,5 a 4,0 e 200 mg/kg de ácido sórbico em pH = 4,0. O valor D60 das células vegetativas é de 0,1 a 0,3 minutos, mas os ascósporos são muito mais resistentes, com D60 = 17,5 minutos. A redução da Aa também aumenta a resistência térmica, tendo sido observado que, em sucos de frutas com Aa = 0,99 (pH = 3,1), o valor D60 foi 0,3 a 2 minutos, mas com Aa = 0,93 esse valor aumentou para 5 minutos ou mais. É amplamente distribuída nos alimentos e eventualmente pode provocar a deterioração, já tendo sido implicada na perda de sucos de frutas, incluindo-se produtos tratados pelo calor (TANIWAKI; SILVA, 2001). Desenvolvimento em extrato de malte 5%: após 3 dias a 25°C as células apresentam-se esféricas, ovais ou alongadas e normalmente se apresentam isoladas ou formando pequenos grupos. Após 1 mês a 20°C forma-se sedimento. Desenvolvimento sobre ágar malte 5%: depois de 1 mês a 20°C as colônias apresentam coloração creme clara. A superfície é lisa, normalmente plana e opaca. As células vegetativas transformam-se em ascósporos esféricos ou elipsoidais. A formação dos mesmos, observada quase exclusivamente em ágar acetato, é normalmente inferior a 10%, exceto em linhagens muito férteis onde a esporulação varia de 40-95% em 6-10 dias a 20°C. Tem sido isolada de solo de vinha e de caverna, Drosophila, cerveja, vinho, cana-de-açúcar, destilaria, mosto de uva e etc. (KURTZMAN; FELL, 1998). Valor D: tempo em minutos, a uma certa temperatura, necessário para destruir 90% dos organismos de uma população, ou para reduzir uma população a um décimo do número original. Um grande número de investigações ecológicas e tecnológicas tem direcionado para a hipótese de que S. cerevisiae é a principal espécie responsável pela fermentação alcoólica de sucos de frutas (KURTZMAN; FELL, 1998). Desde a descoberta de que algumas linhagens desta levedura são capazes de produzir uma toxina killer letal para outros membros da mesma espécie, muitos estudos têm sido realizados sobre o modo de ação e as propriedades físicas e químicas da toxina, assim como a biologia do plasmídeo killer (KURTZMAN; FELL, 1998). Debaryomyces hansenii distingue-se da maioria das outras leveduras pela forma esférica das células, por utilizar uma grande variedade de compostos de carbono e, particularmente, por se desenvolver na presença de altas concentrações de NaCl (até 24%), o que a torna um freqüente deteriorador de salmouras utilizadas na produção de bacon, presuntos e outros alimentos, nos quais forma filmes superficiais. Pode sobreviver por 20 minutos a 55°C e 10 minutos a 60°C, mas não sobrevive por 20 minutos a 60°C ou 10 minutos a 62,5°C. Tem sido isolada de produtos cárneos curados e/ou fermentados, sucos de laranja, iogurtes, queijos, frutas, vinhos e cervejas (TANIWAKI; SILVA, 2001). Desenvolvimento em caldo extrato de malte - extrato de levedura (caldo YM): após 3 dias a 25°C as células são esféricas a ovais, apresentam-se isoladas, aos pares ou formando cadeias curtas (KURTZMAN; FELL, 1998). Quando em ágar YM: após 1 mês a 17°C, a cultura inoculada apresenta-se branca-acinzentada a amarelada, brilhante ou opaca, lisa ou rugosa (KURTZMAN; FELL, 1998). Os esporos são esféricos com uma parede coberta por verrugas. A presença de um grande número de esporos confere à cultura coloração marrom (KURTZMAN; FELL, 1998). A variedade fabryi pode ser fisiologicamente distinguida da variedade hansenii apenas pela temperatura de desenvolvimento máximo. Para a variedade fabryi o valor é de 36-39°C, enquanto que para ahansenii é de 31-35°C (KURTZMAN; FELL, 1998). Origem das linhagens pertencentes à variedade hansenii: queijo, salsicha, unha e mão infectadas, coalho (KURTZMAN; FELL, 1998). Origem das linhagens pertencentes à variedade fabryi: unha infectada, lesão na pele, sake deteriorado, vinagre de arroz (KURTZMAN; FELL, 1998). Rhodotorula glutinis e Rhodotorula rubra são espécies estreitamente relacionadas, que distinguem-se das demais leveduras pela formação de colônias pigmentadas de vermelho. Barnett, Payne e Yarrow (1983) reúne ambas as espécies em apenas uma, mantendo o nome R. glutinis. O pH mínimo é 2,2, são relativamente sensíveis à redução de Aa (não se desenvolvem abaixo de 0,92) e aos conservantes (não se desenvolvem em presença de 100 mg/kg ou menos). Por outro lado, dentre as leveduras imperfeitas são as mais resistentes ao calor, sobrevivendo por 10 minutos a 62,5°C. São amplamente distribuídas em frutas e vegetais, mas menos freqüentes como deteriorantes dos produtos processados, embora já tenham sido isoladas de molhos de maçã e morangos tratados termicamente (TANIWAKI; SILVA, 2001). Rhodotorula glutinis tem sido isolada de ar, polpa de madeira, água de cervejaria, folha, flor, água poluída, etc. (KURTZMAN; FELL, 1998). Schizosaccharomyces pombe apresenta duas características que a diferencia da maioria das demais leveduras deteriorantes de alimentos. Em primeiro lugar, a reprodução vegetativa não se dá por brotamento, mas sim por fissão lateral, e em segundo, se desenvolve melhor e mais rapidamente a 37 do que a 25°C, o que a torna um deteriorante potencial em países tropicais. É xerofílica, resistente aos conservantes e apresenta resistência térmica dependente da Aa e do soluto presente, sendo maior na presença de sacarose (Aa = 0,95/D65 = 1,48 minutos) do que na presença de glicose (Aa = 0,95/D65 = 0,41 minutos), frutose (Aa = 0,95/D65 = 0,27 minutos) ou glicerol (Aa = 0,95/D65 = 0,21 minutos). É relativamente incomum como deteriorante, tendo sido isolada de xarope de açúcar e licor de framboesa conservados com dióxido de enxofre (TANIWAKI; SILVA, 2001). Algumas fontes incluem melaço de cana-de-açúcar e maçã (KURTZMAN; FELL, 1998). As demais culturas isoladas e identificadas estão relacionadas geralmente às seguintes origens (KURTZMAN; FELL, 1998): ¬ Dekkera bruxellensis: cerveja, mosto de uva e vinho. ¬ Torulaspora delbrueckii: salsicha fermentada, planta de processamento de alimentos, vinho, cerveja, suco de uva, excremento de inseto, carvalho e árvore apodrecida. ¬ Rhodotorula minuta: ar, água, plantas e animais terrestres ou marinhos e picles. ¬ Rhodotorula mucilaginosa: pimenta vermelha em pó, larva de Drosophila, ar e cerveja pasteurizada. ¬ Trichosporon beigelii: cabelo e lesão de pele. ¬ Hanseniaspora vineae: solo e também solo de vinha. ¬ Sporidiolobus johnsonii: folhas. ¬ Candida apis: abelhas. ¬ Cryptococcus albidus: ar, abelha, pacientes com várias doenças, unha, pele, vinho, folha, solo, queijo azul, esterco de cabra e tanque de purificação para água poluída. ¬ Stephanoascus ciferrii: bovino, estaca de cerca, suíno e solo. ¬ Pichia farinosa: cacau fermentado, arroz estocado e farinha de trigo. ¬ Debaryomyces vanrijiae var. vanrijiae: solo e formigueiro. ¬ Bullera variabilis: folha seca de arroz e base seca de bambu. ¬ Sporobolomyces roseus: grama, batata estragada, solo, ar e polpa de madeira. T A B E LA 4. D is tr ib ui çã o da s le ve du ra s se gu nd o a or ig em (m ar ca B ). P ol pa d e: C ód ig o da s cu ltu ra s N úm er o de cu ltu ra s P or ce nt ag em (n = 87 ) A ba ca te P F 40 1 01 1, 15 % A ba ca xi P F 43 1 01 1, 15 % A ba ca xi + H or te lã P F 34 1; P F 34 3; P F 34 4 03 3, 45 % A ba ca xi + La ra nj a P F 41 2; P F 41 3 02 2, 30 % A ça í P F 30 1; P F 30 4 02 2, 30 % A ce ro la P F 44 1 01 1, 15 % A m or a P F 25 1; P F 25 2; P F 25 3; P F 25 4; P F 25 5; P F 25 6; P F 25 7; P F 25 8; P F 25 10 ;P F 25 12 10 11 ,4 9% B an an a P F 31 1; P F 31 2; P F 31 3; P F 31 4; P F 31 6; P F 31 7; P F 31 10 07 8, 04 % C aj u P F 46 1; P F 46 3 02 2, 30 % C lo ro fil a* P F 49 1; P F 49 2; P F 49 3 03 3, 45 % F ra m bo es a P F 28 1; P F 28 2 02 2, 30 % F ru ta s V er m el ha s* * P F 38 1; P F 38 2 02 2, 30 % G oi ab a P F 48 1; P F 48 2; P F 48 3; P F 48 4; P F 48 5; P F 48 6; P F 48 7 07 8, 04 % (c on tin ua ) T A B E LA 4. D is tr ib ui çã o da s le ve du ra s se gu nd o a or ig em (m ar ca B ) (c on tin ua çã o) . P ol pa d e: C ód ig o da s cu ltu ra s N úm er o de cu ltu ra s P or ce nt ag em (n = 87 ) La ra nj a P F 56 1; P F 56 2; P F 56 3; P F 56 4; P F 56 6; P F 56 7; P F 56 8; P F 56 9; P F 56 10 09 10 ,3 5% La ra nj a + A ce ro la P F 42 3 01 1, 15 % M el an ci a P F 39 1; P F 39 2; P F 39 3; P F 39 4; P F 39 5; P F 39 6; P F 39 7; P F 39 9; P F 39 10 ;P F 39 11 10 11 ,4 9% M ilh o V er de P F 60 1; P F 60 2; P F 60 3 03 3, 45 % M or an go P F 58 1; P F 58 2; P F 58 3 03 3, 45 % P ês se go P F 27 1; P F 27 2; P F 27 3; P F 27 4; P F 27 5 05 5, 75 % P ita ng a P F 57 1 01 1, 15 % T an ge rin a P F 54 1; P F 54 2; P F 54 3; P F 54 4; P F 54 5; P F 54 7; P F 54 8 07 8, 04 % U va P F 37 1; P F 37 2; P F 37 3; P F 37 4; P F 37 5 05 5, 75 % Le ge nd a: P F N ,n on de :P F = P ol pa de fr ut a; N = N úm er o da a m os tr a e n = N úm er o da le ve du ra is ol ad a. * P ol pa m is ta d e ki w i, ab ac ax i, m aç ã e fo lh as ve rd es . ** P ol pa m is ta d e m or an go ,a m or a e fr am bo es a. T A B E LA 5. D is tr ib ui çã o da s le ve du ra s se gu nd o a or ig em (m ar ca C ). P ol pa d e: C ód ig o da s cu ltu ra s N úm er o de cu ltu ra s P or ce nt ag em (n = 49 ) A ba ca xi P F 17 1; P F 17 2; P F 17 3; P F 17 9 04 8, 16 % C ac au P F 2 2 01 2, 04 % C aj u P F 4 1 ;P F 4 2 ;P F 4 3 ;P F 4 4 ;P F 4 5 ;P F 4 6 ;P F 4 7 ;P F 4 1 0; P F 4 1 1; P F 4 1 2 10 20 ,4 1% G oi ab a P F 11 1; P F 11 2; P F 11 3; P F 11 4; P F 11 5; P F 11 6; P F 11 7 07 14 ,2 9% M am ão P F 16 1; P F 16 2; P F 16 3; P F 16 4; P F 16 5; P F 16 6 06 12 ,2 5% M an ga P F 12 1; P F 12 3; P F 12 4; P F 12 6; P F 12 8; P F 12 9 06 12 ,2 5% M el ão P F 3 1 ;P F 3 2 ;P F 3 3 ;P F 3 4 ;P F 3 5 ;P F 3 6 ;P F 3 7 ;P F 3 8 ;P F 3 9 ; P F 3 1 0; P F 3 1 1; P F 3 1 2 12 24 ,4 8% M or an go P F 14 1 01 2, 04 % U va P F 10 1; P F 10 3 02 4, 08 % Le ge nd a: P F N ,n on de :P F = P ol pa de fr ut a; N = N úm er o da a m os tr a e n = N úm er o da le ve du ra is ol ad a. T A B E LA 6. F re qü ên ci a re la tiv a da s le ve du ra s is ol ad as . Le ve du ra s C ód ig o da s cu ltu ra s N úm er o de cu ltu ra s P or ce nt ag em (n = 13 6) S ac ch ar om yc es ce re vi si ae P F 3 1 ;P F 3 2 ;P F 3 3 ;P F 3 4 ;P F 3 5 ;P F 3 6 ;P F 3 7 ;P F 3 9 ; 57 41 ,9 0% P F 3 1 0; P F 3 1 1; P F 3 1 2; P F 4 1 ;P F 4 2 ;P F 4 3 ;P F 4 4 ;P F 4 5 ; P F 4 6 ;P F 4 7 ;P F 4 1 0; P F 4 1 1; P F 4 1 2; P F 10 1; P F 10 3; P F 16 1; P F 16 2; P F 16 3; P F 16 4; P F 16 5; P F 17 3; P F 27 3; P F 27 5; P F 31 2; P F 37 3; P F 39 1; P F 39 5; P F 39 6; P F 39 11 ;P F 41 1; P F 41 3; P F 46 3; P F 48 1; P F 48 2; P F 48 3; P F 48 4; P F 48 6; P F 49 2; P F 49 3; P F 54 1; P F 54 2; P F 54 3; P F 54 5; P F 54 7; P F 56 3; P F 56 4; P F 56 7; P F 56 10 ;P F 57