UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” 

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS 

CÂMPUS DE JABOTICABAL 

 

 

 

 

 

RESPOSTA FISIOLÓGICA E MOLECULAR DE DOIS 

GENÓTIPOS DE MILHO À LIMITAÇÃO HÍDRICA 
 

 

 

 

Rafaela Josemara Barbosa Queiroz 

Engenheiro Agrônomo, MSc. 

 

 

 

 

 

 

 

JABOTICABAL - SÃO PAULO - BRASIL 

Outubro de 2010 



 

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” 

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS 

CÂMPUS DE JABOTICABAL 

 

 

 

 

 

RESPOSTA FISIOLÓGICA E MOLECULAR DE DOIS 

GENÓTIPOS DE MILHO À LIMITAÇÃO HÍDRICA 
 

 

Rafaela Josemara Barbosa Queiroz 
 

Orientador: Prof. Dr. Jairo Osvaldo Cazetta 

Coorientador: Prof. Dr. José Frederico Centurion 

 

 
Tese apresentada à Faculdade de Ciências 
Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de 
Jaboticabal, como parte das exigências para 
obtenção do grau de Doutor em Agronomia – 
Área de concentração Produção Vegetal. 

 

 

 

  

JABOTICABAL - SÃO PAULO - BRASIL 

Outubro de 2010 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  
Queiroz, Rafaela Josemara Barbosa 

Q3a Resposta fisiológica e molecular de dois genótipos de milho à limitação 
hídrica. – Jaboticabal, 2010 

 xi, 154f.; 28 cm 

  

 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências 
Agrárias e Veterinárias, 2010 

 Orientador: Jairo Osvaldo Cazetta 
Coorientador: José Frederico Centurion 
Banca examinadora: Manuel Pedro Salema Fevereiro, Carlos Alberto Martinez 

Y Huaman, Janete Aparecida Desidério, David Ariovaldo Banzatto 
 Bibliografia 

  

 1. Zea mays 2. Osmoprotetores. 3. Estresse hídrico I. Título. II. Jaboticabal – 
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. 

  

CDU 633.61 
  

Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – 

Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. 



 

DADOS CURRICULARES DO AUTOR 

 

RAFAELA JOSEMARA BARBOSA QUEIROZ - nascida em São Luis, Maranhão, em 19 

de novembro de 1980, é Engenheiro Agrônomo, pela Universidade Federal Rural da 

Amazônia – Belém, PA. Título esse concedido em 06 de novembro de 2003. Durante a 

graduação, foi bolsista de Iniciação Científica do Programa Institucional de Bolsas de 

Iniciação Científica (PIBIC) do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e 

Tecnológico (CNPq), participando ativamente em projetos de pesquisa da Empresa 

Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa Amazônia Oriental). Obteve título de 

Magister Scientiae pelo programa de Pós-Graduação em Agronomia (Produção Vegetal) 

da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio 

de Mesquita Filho”, Câmpus de Jaboticabal. Em Junho de 2006 foi aprovada para Curso 

de Doutoramento na mesma área e instituição em que realizou o Mestrado. Em Março 

de 2009, foi selecionada e contemplada com bolsa “sandwich” para desenvolver parte 

da sua tese no exterior por meio do Programa de Doutoramento no País com Estágio no 

Exterior Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal Superior (PDDE-CAPES). 

 



 

 

 

 

    

A verdadeira beleza da ciência está em saber não 

saber, em preferir ter mil dúvidas a uma certeza. 

Em compreender que os “achados” podem ser 

relativos, passíveis e mutáveis.  

É ter prazer em desvencilhar-se deles, sem medos; 

pois “saber não é uma supremacia sobre o quê os outros 

não sabem, e sim um asilo dos achados de outros”.  

E é isso que me instiga a uma incessante busca dos 

porquês... 

Penetrando-me cada vez mais aos meus 

deslumbramentos e devaneios científicos... 

Rafaela Josemara Barbosa QueirozRafaela Josemara Barbosa QueirozRafaela Josemara Barbosa QueirozRafaela Josemara Barbosa Queiroz    

(Inverno Jaboticabalense de 2008) 

 

 

 

 

"Entender é sempre limitado. Mas não entender... pode não ter fronteiras..."  

[ Cecília Meireles ] 



 

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DEDICO 



 

AGRADECIMENTOS 

 

Ainda que uma tese seja um trabalho individual, há contribuições de natureza 

diversa que não podem, nem devem deixar de ser ressaltadas. Por esse motivo, desejo 

expressar os meus sinceros agradecimentos: 

A Deus, meu Pai Celestial e Guia. 

À minha família, minha Mãe Mara Inêz Mascarenhas Barbosa, meus Irmãos, 

Saulo José Barbosa Queiroz e Paula Jéssica Chaves da Costa Barbosa, minha 

cunhada Geovanna Oliveira Machado Queiroz e claro, aos meus filhotes Yorkshires, 

Rubisco e Susy, e também meu Pitt Bull Bb bizon, meu primogênito. Vocês são as 

Borboletas do meu Jardim! Passamos pelas crisálidas da vida, mas nós transformamos 

nossas vidas num imenso, perene e colorido jardim! 

Ao meu grande amor, meu marido, Marcelo Lira Pinheiro, pelo incentivo, 

carinho, amizade e amor a mim confiados; principalmente, pela paciência em esperar o 

término da Pós-Graduação, mostrando-me que seu amor é inabalável e persistente; 

fazendo-me acreditar que para “estar junto” não-necessariamente se precisa estar 

perto”. Você é a Ágape da minh’alma... 

Ao Prof. Dr. Jairo Osvaldo Cazetta que me norteou desde os tempos de 

Mestrado, cujo valor e contribuição em minha formação são incalculáveis. Mostrou-me 

que para orientar, antes de tudo, é necessário ser amigo e ter muita paciência e, 

principalmente, humildade. Para ele nunca foi um demérito dizer: - Vamos aprender 

juntos! Pelo contrário, asilou-se de conhecimentos; e isso, para mim, é fazer ciência! O 

que o faz grande, em todos os aspectos: Número, Gênero e Grau! 

Ao Prof. Dr. José Frederico Centurion pelas orientações prévias à montagem 

do ensaio experimental e Coorientação nas pesquisas da tese. 



 

Ao Prof. Dr. Manoel Pedro Salema Fevereiro que sempre se mostrou solícito 

ao pedido do doutoramento “sandwich”, sobretudo a sua receptividade em realizar 

parceria com Instituições acadêmico-científicas brasileiras, bem como o quadro de 

Investigadores Científicos do LBCV.  

Ao Prof. Dra. Mara Cristina Pessoa da Cruz, pelo auxílio e interpretação das 

análises de solo, bem como implantação do manejo nutricional do experimento. 

Aos Pesquisadores, Dr. Eniel David Cruz e Dr. Moacyr B. Dias-Filho da 

Embrapa Amazônia Oriental, meus queridos e eternos orientadores, mestres e amigos, a 

quem sempre disponho para conselhos profissionais e pessoais, responsáveis pelos 

meus “despertar” e “aguçar” à pesquisa científico-acadêmica. 

Aos “irmãozinhos” de Pós-Graduação da Unesp/FCAV, Marcos Donizete 

Revoredo e Helen Cristina de Arruda Rodrigues, e ao antigo orientado e 

“escragiário” Guilherme Batista do Nascimento (Power), às estudantes de 

graduação, Jacqueline Nayara Ferraça Leite (Abafa), Cilene Cristina Mathias 

Mazzarelli (Dou-méstica), Nayara Patrícia Morotti (Philco), Mariana 

Gianneschi Demetrio (Mariza, Mãe), Amanda de Faria Santos (Dou-rada) e 

Jaqueline Cristina Fernandes (Sinistra), pela solicitude durante a condução do 

ensaio experimental e análises, convívio e amizade.  

Aos colegas do Laboratório de Análises Química e Bioquímica de Plantas 

(Unesp/FCAV), sempre dispostos a deixar a realização das tarefas mais prazerosa e 

menos maçante.  

Aos amigos decênios Maria das Graças Sant’Anna Ferreira dos Santos, 

Poliana Bento Bejo Altafim, Juliana Regina Rossi, Milena do Nascimento e 

suas respectivas famílias e a Família Valadão. Que nunca deixaram esmorecer os 

laços de amizade.  



 

Às minhas queridas irmãs e (ex) companheiras da república “Farfaruei”, Vanessa 

Cristiane Vollet; Natacha Deboni Cereser; Fernanda Malva Ramos Costa; 

Juliana Moraes Boldini; Johanna Ramírez Díaz; Sônia Regina Alves Tagliari; 

Greicy Mitzi Bezerra Moreno; Meire Aparecida Silvestrini Cordeiro; Verónica 

Gonzalez Cadavid; Ludmilla Carregari e à agregada mor Samira Domingues 

Carlin Cavallari pela amizade, incentivo, convivência alegre, paciência mútua, 

descobertas, pelos sorrisos e situações inusitadas, porém, divertidas, compartilhadas; 

pelo apoio nos momentos mais difíceis durante a conclusão do Mestrado e andamento 

do Doutorado. Saibam que mesmo em um lugar muito, muito longe, sempre me 

lembrarei dos anos, meses, dias, horas, segundos partilhados com vocês! 

À Família Vollet, minha segunda família, que amenizaram a saudade de minha 

casa, deixando-me fazer parte das suas vidas! Temos um laço afetivo que nem o tempo 

e o espaço o desatarão. 

A todos meus amigos e colegas do curso de Pós-Graduação, pela troca de 

experiências, ensinamentos e bons momentos partilhados.  

Aos meus primeiros alunos de graduação, Turma Bio08 da Unesp/FCAV, que 

foram pacientes em assistir aulas de uma eterna aprendiza! Porém, que responderam, 

grandiosamente, às exigências da disciplina de Química I; saibam que vocês 

tornaram-me uma pessoa melhor e que houve um aprendizado mútuo! Espero ter 

despertado em vocês o gosto em obter mais e mais conhecimento! 

Aos funcionários da Unesp/FCAV, pelo apoio infra-estrutural . 

À Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista 

“Júlio de Mesquita Filho” (Unesp/FCAV), ao Programa de Pós-Graduação em 

Agronomia/Produção Vegetal (PG/PV), bem como seu corpo docente, pela oportunidade 

e contribuição em minha formação profissional e aos Departamentos de Tecnologia e  



 

Biologia Aplicada à Agropecuária pelo apoio e uso infra-estrutural para realização desta 

pesquisa. 

À Coordenação de Aperfeiçoamento Superior (CAPES), pela concessão da bolsa 

de estudos de doutoramento no Brasil e pela bolsa “sandwich” para estágio no Exterior. 

 

“E ainda que tivesse o dom de profecia, e conhecesse todos os mistérios e toda a 

ciência, e ainda que tivesse toda a fé, de maneira tal que transportasse os montes, se 

não tivesse amor, nada seria... agora conheço em parte, mas então conhecerei como 

também sou conhecido... Agora, pois, permanecem a fé, a esperança e o amor, estes 

três, mas o maior destes é o amor. (1 Cor-13, 2;12-13) 



 
 

 

ix 

SUMÁRIO 

 

Página 

RESUMO.......................................................................................................................... x 

SUMMARY ...................................................................................................................... xi 

CAPÍTULO 1: Considerações Gerais .......................................................................... 04 

CAPÍTULO 2: Reação osmoprotetora na germinação de sementes de milho sob 

crescente potencial hídrico......................................................................................18 

2.1. Introdução......................................................................................................20 

2.2. Material e Métodos...........................................................................................21 

2.3. Resultados e Discussão.....................................................................................24 

2.4. Conclusões......................................................................................................35 

2.5. Referências Bibliográficas..................................................................................35 

CAPÍTULO 3: Tolerância de dois híbridos de milho à seca .......................................... 39 

3.1. Introdução......................................................................................................41 

3.2. Material e Métodos...........................................................................................43 

3.3. Resultados e Discussão.....................................................................................48 

3.4. Conclusões......................................................................................................63 

3.5. Referências Bibliográficas..................................................................................64 

CAPÍTULO 4: Quantificação da expressão gênica relativa do milho em resposta à 

disponibilidade hídrica no solo por meio de qRT-PCR.................................................70 

4.1. Introdução......................................................................................................72 

4.2. Material e Métodos...........................................................................................76 

4.3. Resultados e Discussão.....................................................................................89 

4.4. Conclusões.....................................................................................................113 

4.5. Referências Bibliográficas................................................................................113 

Considerações finais..............................................................................................118 

APÊNDICE............................................................................................................119 



 
 

 

x 

RESPOSTA FISIOLÓGICA E MOLECULAR DE DOIS GENÓTIPOS DE MILHO À 

LIMITAÇÃO HÍDRICA 

 

 

RESUMO – Nesta pesquisa foi avaliado o metabolismo de dois genótipos de 

milho (Zea mays L.) ao estresse hídrico e a correlação entre o teor de compostos 

responsáveis pela a aclimatação à limitação hídrica desses genótipos na germinação e 

no estádio vegetativo. Foram instalados dois experimentos. Inicialmente, um ensaio de 

germinação foi montado com o objetivo de verificar a tolerância de dois genótipos de 

milho, DKB 390 e DAS 2B710 ao déficit hídrico e de quantificar a prolina e a trealose nos 

tecidos endospermático e embrionário com intuito de descrever as suas funções 

fisiológicas na germinação. O segundo avaliou o ajustamento osmótico através das 

respostas bioquímicas e fisiológicas e moleculares de dois híbridos de milho sob duas 

disponibilidades hídricas no solo, em um latossolo vermelho. A partir desses resultados, 

verificou-se a tolerância destes híbridos a seca nesse estádio e o reflexo da expressão 

relativa de genes relacionados à síntese de solutos compatíveis em reposta à limitação 

hídrica no solo.  

 

Palavras-Chave: Zea mays, solutos compatíveis, expressão gênica relativa, mRNA, 

tolerância, seca. 



 
 

 

xi 

PHYSIOLOGICAL AND MOLECULAR RESPONSE OF TWO MAIZE GENOTYPES 

TO WATER RESTRICTION 

 

 

SUMMARY – The metabolism of maize genotypes (Zea mays L.) to soil water 

avaibility and the correlation between the content of compounds responsible for this 

acclimation to water limitation of these genotypes at the germination and the silking 

stage. Two experiments were carried out. First, the germination test was evaluated the 

tolerance of two genotypes of maize, DKB 390 and DAS 2B710 to water available and 

also to quantify the proline and trehalose in the endosperm and embryonary axis tissues 

with the aim of describe their physiological functions in germination. The second assay it 

was examined the osmotic adjustment through biochemical and physiological responses 

of two hybrids growing in two soil water availability. The results of that experiment, 

checking the degree of tolerance of these hybrids and the reflection of the gene 

expression related to synthesis of these compatible solutes in response to soil water 

availability.  

 

 

Keywords: Zea mays, compatible soluble, relative gene expression, mRNA, tolerance, 

drought 

 

 



 
 

 

1 

CAPÍTULO 1. CONSIDERAÇÕES GERAIS 

 

 

1.1. Introdução  

 

 O milho (Zea mays L.), uma das gramíneas de maior importância econômica do 

mundo, é cultivado em países de clima tropical, subtropical e de clima temperado com 

verões quentes. 

O estresse pela baixa disponibilidade hídrica (seca) é um dos principais 

problemas da agricultura e a habilidade das plantas para resistir a tal estresse é de 

suma importância para o desenvolvimento do agronegócio de qualquer país. Estudos de 

tolerância à seca envolvendo o milho podem trazer melhorias no crescimento e no 

rendimento da cultura em regiões com limitação hídrica, já que o milho é conhecido 

pela sua alta sensibilidade a este estresse. 

Grandes avanços em estudos sobre melhoramento do milho para a seca têm 

trazido resultados satisfatórios, gerando genótipos tolerantes. Contudo, pouco é 

conhecido sobre os mecanismos fisiológicos para a tolerância à seca. Nesse sentido, a 

caracterização dos materiais genéticos, assim como a elucidação dos possíveis 

mecanismos responsáveis pelo comportamento diferencial de genótipos sob condição de 

estresse, pode facilitar o processo de geração de novos materiais genéticos, além de 

contribuir para o desenvolvimento de técnicas de seleção que podem reduzir o tempo e 

o trabalho para avaliação de fontes genéticas de tolerância ao estresse hídrico. 

 Diante do exposto, é importante que se estude o acúmulo de solutos compatíveis 

e a expressão gênica de enzimas-chaves que regulam a biossíntese desses compostos e 

se estes influenciam na tolerância de plantas de milho submetidas a condições 

subótimas de água disponível no solo. 

 

 



 
 

 

2 

1.2. Revisão de Literatura:  

 

 

1.2.1. O cultivo do milho propenso à limitação hídrica no solo 

 

Previsões meteorológicas, através de projeções de modelos de simulação 

climática, indicam um aumento do aquecimento global nas próximas décadas, sendo 

esperada até o final do século XXI, uma variação de 1,4 a 5,8 ºC na temperatura. Em 

decorrência disso, fenômenos como as secas são eminentes. Estima-se que este 

aquecimento reduzirá em 20% a disponibilidade de água, não apenas nas zonas 

propensas à seca, mas também nas regiões tropicais e subtropicais. Posto isso, deduz-

se que uma grave crise hídrica é esperada, pois a falta de água dificultará o aumento da 

área agrícola irrigada e, consequentemente, a produção de alimentos, não havendo 

água suficiente para a agricultura, que é responsável por 70% do consumo mundial 

(Revisado por VIDAL et al., 2005).  

De acordo com o cenário traçado pelos especialistas, as grandes culturas terão 

suas áreas de cultivo reduzidas praticamente pela metade quando a temperatura média 

da Terra estiver 5,8 ºC acima da atual, situação prevista para ocorrer num prazo de 50 

a 100 anos (TILMAN et al., 2001). 

O milho é cultivado em regiões cuja precipitação varia de 300 a 5.000 mm 

anuais, sendo que a quantidade de água consumida por uma planta, durante o seu 

ciclo, está em torno de 600 mm, apresentando relativa tolerância à limitação hídrica 

durante a fase vegetativa. Porém, apresenta extrema sensibilidade na fase reprodutiva. 

Dois dias de estresse hídrico no florescimento diminuem o rendimento em mais de 20%, 

e quatro a oito dias no estádio de enchimento de grãos diminuem em mais de 50%. O 

aumento na deposição de matéria seca nos grãos está intimamente relacionado à 

fotossíntese e, uma vez que o estresse afeta este processo, reduz a produção de 



 
 

 

3 

carboidratos, implicando em menor acúmulo de matéria seca nos grãos (MAGALHÃES et 

al., 2002). 

Na maioria das áreas cultivadas com milho no mundo, a ocorrência de seca ou 

períodos de estresse hídrico são fatores abióticos causadores de substanciais reduções 

na produtividade. No Brasil, as áreas cultivadas com milho são predominantemente 

desenvolvidas sem irrigação e mesmo em anos regulares de precipitação pluvial 

observam-se, normalmente, perdas na produção em virtude de períodos de estiagem 

denominados “veranicos”. As oscilações nas safras de milho, das principais regiões 

produtoras do Brasil, estão associadas à disponibilidade de água, sobretudo no período 

crítico da cultura. Por isso é fundamental avaliar os efeitos da disponibilidade hídrica 

durante todo ciclo da cultura. Os efeitos dos fatores climáticos no crescimento e 

desenvolvimento, assim como, a partição de assimilados entre os órgãos são 

importantes nas taxas de crescimento da cultura (MAGALHÃES et al., 2009). 

O solo e a atmosfera são os constituintes físicos do ambiente no qual a maioria 

das espécies vegetais de interesse agronômico cresce e se desenvolve. São eles que 

fornecem, de forma natural, as substâncias necessárias ao crescimento e ao 

desenvolvimento das plantas, regulando a magnitude desses processos com o concurso 

da energia disponível no meio (ANGELOCCI, 2002). A restrição causada pela baixa 

disponibilidade de água do solo ou pela alta demanda evaporativa acionam certos 

mecanismos bioquímico-fisiológicos que permitem aos vegetais tolerar essas limitações 

climáticas. Dentre os mecanismos que contribuem para a tolerância à seca, os que têm 

sido discutidos pela comunidade científica é o ajustamento osmótico. Esse, por sua vez, 

inclui adaptações fisiológicas e bioquímicas de mecanismos que mantém o turgor celular 

em condições de baixo potencial hídrico celular, pelo acúmulo e translocação de solutos 

compatíveis nas células (VERSLUES et al., 2006). 

 

 



 
 

 

4 

1.2.2. Resposta de plantas ao déficit hídrico: aspectos bioquímico-fisiológicos 

e moleculares  

 

O estresse é geralmente definido como um fator externo que exerce uma 

influência desvantajosa sobre a planta. Esse conceito está intimamente associado com 

tolerância ao estresse, que é a capacidade da planta para enfrentar as condições 

desfavoráveis. Já a tolerância à seca é a aptidão da planta para enfrentar um ambiente 

desfavorável. Se a tolerância aumenta como consequência da exposição anterior ao 

estresse, diz-se que a planta está aclimatada (TAIZ & ZEIGER, 2010). 

Em ambas as condições, naturais e agrícolas, fatores ambientais, como 

temperatura do ar, podem tornar-se estressantes em apenas alguns minutos. Conteúdo 

de água no solo pode levar dias ou semanas, enquanto que outros fatores como a 

deficiência mineral do solo, podem levar meses para se tornar estressantes. Respostas 

celulares ao estresse podem incluir mudanças no ciclo e divisão celular, as membranas 

celulares, a arquitetura da parede celular e metabolismo, por exemplo, a acumulação de 

substâncias osmoticamente ativas (BRAY et al., 2001). 

 



 
 

 

5 

 

Figura 1. Resposta de plantas ao estresse hídrico (adaptado de BRAY et al., 2001). 

 

O déficit hídrico em plantas inicia um complexo de respostas (Figuras 2 e 3), 

começando com a percepção do estresse, o qual desencadeia uma cascata de eventos 

moleculares que é finalizada em vários níveis de respostas fisiológicas, metabólicas e de 

desenvolvimento. Em termos moleculares, o sinal de estresse, uma vez produzido pela 

célula vegetal, deve ativar uma rota de transdução que envia esta mensagem aos 

fatores de transcrição, que regulam a expressão dos genes encarregados da resposta ao 

estresse. A perda do volume e da turgescência celular ou a concentração de solutos 

altera a conformação de proteínas da parede celular e da membrana plasmática da 

célula vegetal, ativando rotas de transdução de sinais que dão lugar à expressão de 

determinados genes, transformando assim o fenômeno físico do déficit hídrico em uma 

resposta bioquímica (BRAY et al., 2001). 

Mudanças Mudanças Mudanças Mudanças 
no genótipono genótipono genótipono genótipo

SusceptibilidadeSusceptibilidadeSusceptibilidadeSusceptibilidade

ACLIMATAÇÃOACLIMATAÇÃOACLIMATAÇÃOACLIMATAÇÃO

SobrevivênciaSobrevivênciaSobrevivênciaSobrevivência

CrescimentoCrescimentoCrescimentoCrescimento

ADAPTAÇÃOADAPTAÇÃOADAPTAÇÃOADAPTAÇÃO

VariedadesVariedadesVariedadesVariedades

MutantesMutantesMutantesMutantes

MORTEMORTEMORTEMORTE

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E
S
TR
ES
S
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H
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R
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O
 SeveridadeSeveridadeSeveridadeSeveridade

Número de Número de Número de Número de 
exposiçõesexposiçõesexposiçõesexposições

CombinaçãoCombinaçãoCombinaçãoCombinação
de estressesde estressesde estressesde estresses

Características Características Características Características 
da plantada plantada plantada planta

Órgão Órgão Órgão Órgão 
ou ou ou ou 

tecido tecido tecido tecido 
afetadoafetadoafetadoafetado

Estádio Estádio Estádio Estádio 
de de de de 

desenvolvimentodesenvolvimentodesenvolvimentodesenvolvimento

GenótipoGenótipoGenótipoGenótipo

ResultadosResultadosResultadosResultadosRespostasRespostasRespostasRespostas

EscapeEscapeEscapeEscape

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TolerânciaTolerânciaTolerânciaTolerânciaDuraçãoDuraçãoDuraçãoDuração

CaracterísticasCaracterísticasCaracterísticasCaracterísticas
do estressedo estressedo estressedo estresse



 
 

 

6 

 

Figura 2. Modelo esquemático de um complexo de respostas à limitação hídrica 

(adaptado de BRAY et al., 2001). 

 

Essas substâncias osmoticamente ativas são moléculas ou íons atóxicos que não 

interferem no metabolismo e se acumulam predominantemente no citoplasma, onde 

têm função de manter a turgescência celular, além de estabilizar proteínas e estruturas 

celulares nas condições subótimas dos fatores ambientais. O potencial osmótico da 

solução celular, ou simplástica pode aumentar por perda de água ou por aumento da 

síntese desses solutos (ANGELOCCI, 2002). 

Há algum tempo, adota-se a hipótese de que o ajuste osmótico (osmoproteção) é 

uma característica importante de aclimatação que confere vantagens às plantas 

tolerantes ao estresse hídrico, porque é um modo de se manter o conteúdo de água da 

célula em níveis adequados à atividade fisiológica (TAIZ & ZEIGER, 2010). No entanto, 

existe outra vertente, que faz ressalvas ao ajuste osmótico como um mecanismo de 

Alterações  no Alterações  no Alterações  no Alterações  no 

metabolismo celularmetabolismo celularmetabolismo celularmetabolismo celular

Percepção Percepção Percepção Percepção 
estresseestresseestresseestresse

Transdução Transdução Transdução Transdução 
dos sinaisdos sinaisdos sinaisdos sinais

Modificações bioquímicoModificações bioquímicoModificações bioquímicoModificações bioquímico----

fisiológicasfisiológicasfisiológicasfisiológicas

, es

Problema:
a parte que “percebe” 

(raízes) não é a 
mesma que “gasta” 

água
(folhas)

Solução:
um sinal deve ser 

derivado das raízes 
para os ramos e folhas



 
 

 

7 

manutenção da turgescência e do crescimento do tecido sob deficiência hídrica ou 

estresse, pois o processo seria limitado pela própria fotossíntese, que é a fonte de 

solutos orgânicos, que em condições de estresse hídrico é reduzida (SERRAJ & 

SINCLAIR, 2002). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 3. A complexidade da resposta das plantas ao estress abiótico (adaptado de Prata, 2008 
apud  VINOCUR & ALTMAN, 2005). 

 
 
 
 
 

Estresse Secundário 
Estresse Osmótico 
Estresse Oxidativo 

 

Seca 

Frio 

Sal 

Calor 

 
Poluição 
Química 

Falha na homeostasia 
osmótica e iônica; 

Danos de proteínas 
funcionais e de estrutura 

e membranas. 

Mecanismos de 
resposta ao estresse 

 Sinais sensoriais, 
percepção e 
transdução 

Chaperoninas funcionais 
(Hsp, SP1, LEA) 

Movimento de moléculas 
água e íons (aquaporinas, 
transportadores de íons) 

Desintoxicação 

Osmoproteção: 
prolina, açúcares, 

polióis, etc. 

Controle da 
transcrição 

Osmosensores, enzimas de clivagem de 
fosfolipídios e mensageiros secundários (e.g. 
Ca2+, ROS), MAP cinases, sensores de Ca2+ e 
proteínas cinases dependentes de cálcio. 

Fatores de transcrição 

Ativação 
de Genes 

Restabelecimento de homeostase celular, 
proteção de proteínas funcionais e de estrutura 

e membranas. 

Tolerância ao estresse 



 
 

 

8 

Assim, uma função do ajuste osmótico poderia estar potencialmente ligada à 

eliminação de radicais livres, mas gerando, como função adicional, a retenção de água 

(revisado por ANGELOCCI, 2002). O estresse hídrico quebra o equilíbrio 

oxidativo/redutivo (redox) em várias organelas celulares, como os cloroplastos e as 

mitocôndrias. O declínio na funcionalidade dos cloroplastos, inevitavelmente, leva à 

geração de espécies como radicais livres.  

O estresse desempenha importante função na determinação de como o solo e o 

clima limitam a distribuição de espécies vegetais. O estresse é medido em relação à 

sobrevivência da planta, produtividade agrícola, crescimento (acúmulo de massa seca), 

processo primário de assimilação (absorção de CO2 e de minerais), que estão 

relacionados ao crescimento e desenvolvimento vegetal (TAIZ & ZEIGER, 2010). 

Dentre os mecanismos de tolerância ao estresse hídrico, variações das respostas 

fisiológicas, bioquímicas, bem como estratégias de crescimento têm sido comparadas e 

discutidas em relação a características de tolerância de plantas à deficiência hídrica no 

solo (STRECK, 2004; BARTELS & SUNKAR, 2005). O grau de tolerância de uma espécie 

ou cultivar pode ser determinado através da capacidade de acumular solutos 

compatíveis, os quais, além de atuarem no ajustamento osmótico, protegem as 

estruturas celulares contra os danos induzidos pela desidratação e oxidação (ANAMI et 

al., 2009). Por essa razão o nome soluto compatível utilizado algumas vezes para 

designar estes osmólitos não é o mais apropriado devido estes compostos não serem 

apenas compatíveis, ou seja, não prejudiciais quando em elevada concentração, mas 

também protetores. 

Medidas da variação da concentração de solutos têm sido usadas como meio para 

avaliar a capacidade de ajustamento osmótico das plantas. Supõe-se que o estresse 

hídrico pode afetar vias metabólicas ou "bombas" de íons ou causar um 

desbalanceamento entre fotossíntese e translocação de solutos. O grau de ajustamento 

osmótico na escala diária e em médio prazo varia bastante entre as espécies e até 



 
 

 

9 

mesmo entre genótipos. Desenvolve-se, preferencialmente, em plantas que sofrem uma 

secagem lenta, não persistindo mais que alguns dias. 

As reações bioquímicas e fisiológicas em resposta ao estresse hídrico podem ser 

monitoradas através de alterações do padrão de expressão atividade que codificam 

determinadas enzimas, como a nitrato redutase, glutamina sintetase, sacarose sintase, 

trealase-fosfato-sintase, trealase, entre outras. O aumento ou redução da expressão de 

um gene em plantas submetidas a condições de déficit hídrico pode ser fator 

determinante da capacidade de aclimatação dessas plantas, podendo ser identificada 

como um marcador molecular de tolerância ao estresse (VINOCUR & ALTMAN, 2005).  

Por exemplo, alterações no metabolismo a nível molecular provocam, entre 

outras reações, redução no teor de proteínas, como conseqüência da redução na sua 

síntese ou na decomposição acentuada, resultando uma liberação reforçada de 

aminoácidos. Neste caso há um acréscimo da atividade da enzima glutamina sintetase, 

responsável pelo metabolismo dos aminoácidos, como a prolina (FERREIRA et al., 

2002). Um exemplo de redução da atividade enzimática é o decréscimo da conversão da 

sacarose para amido nas folhas devido à diminuição da atividade da invertase, enzima-

chave que converte sacarose para hexose (SILVA & ARRABAÇA, 2004). Entretanto, o 

estudo da atividade de enzimas de catabolismo de solutos compatíveis também é 

importante, como a trealase. Esta enzima responsável pela hidrólise da trealose tem 

atividade mais acentuada em plantas que as enzimas de síntese, pois para que este 

dissacarídeo funcione como osmoprotetor, deve estar em concentrações baixas nos 

tecidos vegetais, pois existem evidências científicas de que quando presente em altas 

concentrações influencia negativamente nas chaperoninas, que são responsáveis pela 

homeostase das proteínas (WINGLER, 2002). 

A habilidade de algumas espécies ou genótipos de ajustar osmoticamente suas 

células em condições de estresse hídrico é uma resposta bioquímica-fisiológica que 

indica a capacidade destes organismos em aumentar a tolerância a períodos curtos de 

seca (NEPOMUCENO et al., 2001). Muitos trabalhos evidenciam que o acúmulo da 



 
 

 

10 

trealose e da prolina livre constitui-se em um critério para estudos de tolerância à seca, 

sendo estes osmoprotetores utilizados como indicadores bioquímico-fisiológicos de 

estresse hídrico (VINOCUR & ALTMAN, 2005; ANAMI et al., 2009; ROSA et al., 2009, 

DÍAZ et al., 2010). 

Em condições de estresse, o metabolismo de aminoácidos é amplamente 

alterado, sendo a síntese de proteínas diminuída e a proteólise aumentada. Como uma 

consequência disto, ocorre a indução da biossíntese de prolina promovida pelo 

incremento de metabólicos como poliaminas, amônia, arginina, ornitina, glutamina, 

glutamato (FERREIRA et al., 2002). Várias funções são propostas a este acúmulo: 

ajustamento osmótico; reserva de carbono e nitrogênio utilizados no crescimento para 

restabelecimento após estresse; desintoxicação do excesso de amônia; estabilizador de 

proteínas e membranas e eliminadores de radicais livres. Adicionalmente, existem 

evidências de que a biossíntese desse aminoácido poderia estar também associada à 

regulação do pH citosólico ou mediação do incremento da razão NADP+/NADPH, 

influenciando o fluxo de carbono devido à via oxidativa da pentose fosfato. Além disso, 

pode atuar como fonte acessível de energia, onde uma única molécula oxidada é capaz 

de produzir 30 ATP (KAVI KISHOR et al., 2005). 

A prolina livre é classificada como um “α – iminoácido”, pois seu grupo amino 

está ligado a dois átomos de carbono, conferindo características de neutralidade à 

molécula. O acúmulo deste aminoácido pode ocorrer por duas vias paralelas nas 

plantas, uma direta e outra via ornitina (KAVI KISHOR et al., 2005).  

A principal diferença entre as duas vias está na acetilação dos intermediários em 

uma delas. Pela via direta (dependente de glutamato), após a formação do glutamato 

semi-aldeído, a molécula se transforma em uma estrutura cíclica (∆’-pirrolina-5-

carboxilato), precursor da prolina. A estrutura cíclica é formada pela reação intra-

molecular (não-enzimática) dos grupos amino e aldeído do glutamato-semi-aldeído. Na 

via dos derivados acetilados (dependente de ornitina), a presença dos grupos acetil 

ligado ao grupo 2-amino impede essa reação interna, e uma estrutura aberta, a ornitina, 



 
 

 

11 

é formada. A ornitina pode ainda levar à formação da estrutura cíclica da prolina, após 

perda do grupo amino por transaminação. Embora as duas vias de biossíntese de 

prolina livre sejam igualmente importantes em condições normais, existem evidências 

que favorecem a via direta do glutamato (sem acetilação) em condições de estresse 

hídrico (BARTELS & SUNKAR, 2005; FUNCK et al., 2008). 

 

 

 

Figura 4. Rota metabólica do aminoácido prolina. 

 

NONONONO3333
----

NONONONO2222
----

NHNHNHNH3333

RN

RNi

∆∆∆∆ ’Pirrolina 5’- Carboxilato sintetase

Redutase nitrato

Glutamina sintetase

∆∆∆∆ ’Pirrolina 5’- Carboxilato redutatase
Pro oxigenase

Ortina aminotransferase



 
 

 

12 

Quando ocorre a assimilação de uma fonte de nitrogênio (amônio) pela planta, 

esta exige uma alta demanda por esqueletos de carbono que poderia ocasionar em um 

desvio de esqueletos de carbono para produção desse aminoácido (TAIZ & ZEIGER, 

2010). Entretanto, estudos indicam que a prolina desempenha um importante papel 

durante o desenvolvimento das plantas servindo como uma fonte rápida e acessível de 

energia. Além disso, a oxidação de uma molécula de prolina fornece 30 ATPs para a 

célula. Neste contexto, é importante saber como o acúmulo de prolina influencia outras 

vias de energia relacionadas, bem como no metabolismo de carbono durante e após o 

período de submissão a estresses abióticos (revisado por KAVI KISHOR et al., 2005). 

O acúmulo de prolina livre em condições de estresse tem sido estudado por mais 

de 45 anos. Dentre os osmólitos, a prolina é aquele que é mais pesquisado nas 

respostas de vegetais superiores a estresses abióticos (KAVI KISHOR et al., 2005, 

FUNCK et al., 2008).  

Com relação aos compostos advindos do metabolismo do carbono, a trealose tem 

despertado interesse pela comunidade científica. A trealose é um dos mais efetivos 

osmoprotetores, em termos de concentração mínima requerida. É um dissacarídeo que, 

por várias décadas, tem sido relatado em bactérias, fungos e leveduras como um dos 

responsáveis pela capacidade desses organismos de tolerar altos níveis de desidratação. 

Somente no final da década passada foi identificada em plantas superiores. A 

dificuldade na identificação de trealose, provavelmente, foi devido à alta atividade da 

enzima trehalase em plantas superiores. A trealose liga-se às membranas celulares e 

diminui sua temperatura de fusão, mantendo-as, assim, na sua fase líquido-cristalina 

(Revisado por NEPOMUCENO et al., 2001; PAUL et al., 2008). 

A trealose é dissacarídeo não-redutor, solúvel, é composto de duas moléculas de 

glicose (α-D-glicopiranosil-[1,1]-α-D-glicopiranosídeo). Esse carboidrato é isômero 

químico de outros dois dissacarídeos amplamente encontrados em plantas, a sacarose 

(α-D-glicose-[1,2]-β-D-frutose) e a maltose (α-D-glicose-[1,4]-α-D-glicose). Eles têm a 

mesma fórmula química (C12H22O11), entretanto, diferentes estruturas. Além destes 



 
 

 

13 

isômeros, existem três outros isômeros do dissacarídeo trealose: α,α-trealose, α,β-

trealose e β,β-trealose. Destes, apenas o α,α-trealose é encontrado endogenamente em 

plantas. Apesar da biossíntese deste composto ser similar à da sacarose, 

evolutivamente, a origem da trealose é mais antiga, devido à sua presença em todos os 

reinos (GODDIJN & DUN, 1999) (Figura 5).  

A sacarose é dissacarídeo não-redutor que pode ser hidrolisado em glicose e 

frutose pela ação da invertase, ou então separada em frutose e uridina difosfoglicose 

(UDPG) pela frutose sintase, conservando energia sob esta forma. Sendo os 

polissacarídeos da parede celular sintetizados a partir de UDPG, é de extrema 

importância a regulação da quantidade dos produtos deste açúcar. Pela figura 5 é 

possível visualizar o papel central que este açúcar representa para o metabolismo das 

plantas e como se relaciona com a trealose. 

Figura 5: Modelo esquemático das vias metabólicas da sacarose e trealose 

 

Glicose

+ Frutose

FOTOSSÍNTESE
S6P

Sacarose

UDP-Glic

Glic-1-P

Glic-6-P

Amido

UDP-Glicose + 
Glicose-6-P

Trealose 6 -P Trealose
2 Glicose

Trealase

Pi H2O

TPPTPS

UDP
H2O

SuSy

SPS

UDP-Glic

ADP-Glic

UDP-Glicose
pirofosforilase ADP-Glicose

pirofosforilase

Sacarose Sintase

Sacarose fosfato Sintase

Frutose-6-P



 
 

 

14 

Quando submetidas à limitação hídrica, as plantas desenvolvem alguns 

mecanismos de resposta a esse tipo de estresse, que se resumem em três principais 

eventos: percepção dos sinais, respostas em nível molecular e respostas 

morfofisiológicas.  



 
 

 

15 

1.1. Referências Bibliográficas 

 

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18 

CAPÍTULO 2: REAÇÃO OSMOPROTETORA NA GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE 

MILHO SOB CRESCENTE POTENCIAL HÍDRICO 

 

 

RESUMO – O aminoácido prolina e o dissacarídeo trealose ocorrem naturalmente 

nas plantas, mas acumulam-se nos tecidos em resposta à limitação hídrica. São 

conhecidos pelos efeitos na proteção de enzimas e integridade de membranas, bem 

como no ajustamento osmótico. O teor de prolina e de trealose nos tecidos 

endospermático e embrionário foi estudado com o objetivo de descrever as suas 

funções fisiológicas na germinação de dois híbridos de milho (DKB 390 e DAS 2B710) 

em resposta a diferentes potenciais hídricos. As sementes germinaram em substrato de 

papel contendo soluções de PEG 6000 (Polietilenoglicol) com diferentes potenciais 

hídricos: 0,0; -0,3; -0,6; -0,9 ou -1,2 MPa. A diminuição do potencial hídrico reduz a 

germinação e a massa seca da parte aérea e raiz das plântulas dos híbridos DKB 390 e 

DAS 2B710. Em condição de limitação hídrica, o índice de germinação de sementes sob 

tratamento foi semelhante entre os híbridos DKB 390 e DAS 2B710, contudo, o índice de 

velocidade de germinação foi maior e o tempo médio de germinação foi menor no 

híbrido DAS 2B710. A prolina pode ser utilizada como indicador metabólico de resposta 

dos híbridos de milho (DKB 390 e DAS 2B710) à limitação hídrica durante a germinação 

quando quantificada no eixo embrionário. No híbrido DAS 2B710 há o acúmulo de 

prolina conforme a redução do potencial hídrico. A trealose está presente na 

constituição do endosperma e eixo embrionário dos híbridos DKB 390 e DAS 2B710, mas 

não indica resposta metabólica à limitação hídrica na germinação.  

 

 

Palavras-chave: Prolina, trealose, Zea mays, estresse hídrico, híbridos, genótipos. 

 

 



 
 

 

19 

Reaction osmoprotectant on germination of maize seeds under increasing 

water potential 

 

 

ABSTRACT – The amino acid proline and the disaccharide trehalose occur widely 

in higher plants, and usually accumulate in the tissues as a response to drought 

stresses. Those compounds are known to have positive effects on protecting enzyme 

and membrane integrity along with adaptative roles in mediating osmotic adjustment in 

plants. The variability in proline and trehalose content in endosperm and embryos 

tissues was studied with the objective to describe their physiological role in two 

genotypes (DKB 390 and DAS 2B710) germinating maize in response to different water 

potentials. Seeds were germinated on filter paper soaked with polyethylene glycol (PEG-

6000) solution corresponding to the water potentials of 0.0; -0.3; -0.6; -0.9 or -1.2 MPa. 

The decrease of water potential reduces the germination and dry weight of shoot and 

root of seedlings of DKB 390 and DAS 2B710 genotypes. Under water stress, the 

germination index of the seeds under treatment was similar among the hybrids, 

however, the speed of germination was higher and average time of germination was 

shorter in DAS 2B710. Proline can be used as an indicator of metabolic response of 

maize hybrids (DKB 390 and 2B710 DAS) to water limitation during germination when 

quantified in the embryos axis. The DAS 2B710 hybrid accumulates proline as the 

reduction of water potential. Trehalose is present in the constitution of the endosperm 

and embryo axis of DKB and DAS 2B710 390 but does not indicate the metabolic 

response to water limitation on seed germination. 

 

 

Key words: Proline, trehalose, Zea mays, water stress, hybrids, genotypes.  



 
 

 

20 

2.1. Introdução 

 

A seca é um dos fatores ambientais mais limitantes na produção do milho. Por 

isso, há uma demanda por sementes de híbridos mais tolerantes aos estresses abióticos. 

Os esforços da pesquisa nesse campo têm se concentrado no estudo da fisiologia de 

plantas sob a seca, para determinar parâmetros e métodos rápidos de seleção de 

híbridos tolerantes (MAGALHÃES et al., 2002; ANAMI et al., 2009). 

Há indícios de que haveria plasticidade no grau de tolerância à limitação hídrica 

do milho, em função do estádio fenológico da cultura, isto é, dependendo da fase de 

desenvolvimento, uma planta pode ser mais ou menos suscetível à deficiência hídrica 

(MOHAMMADKHANI & HEIDARI, 2008; ABO-EL-KHEIR & MEKKI, 2007; ANAMI et al., 

2009). Todavia, são escassos os relatos de tolerância à seca, durante o processo de 

germinação, embasados em respostas bioquímico-fisiológicas (THAKUR & SHARMA, 

2005).  

Dessa forma, há um interesse em se comprovar a diferenciação de híbridos de 

milho quanto à susceptibilidade e/ou tolerância à seca mais precocemente, utilizando 

ensaios de germinação, além da avaliação bioquímico-fisiológica da semente, para uma 

melhor compreensão da fisiologia da germinação em condição de deficiência hídrica. 

Uma resposta à limitação hídrica é o acúmulo de solutos osmoticamente 

compatíveis com o metabolismo celular. Preconiza-se que essa resposta pode conduzir a 

um ajustamento osmótico e à manutenção de um estado hídrico favorável para o 

metabolismo e, nesse caso, os solutos denominam-se osmorreguladores. Em 

contrapartida, a síntese de certos solutos compatíveis pode ter uma função primordial 

na proteção de proteínas, na estabilização de membranas celulares e no controle de 

espécies reativas de oxigênio, cuja produção aumenta em condições de deficiência 

hídrica. Os solutos para tal finalidade são designados de osmoprotetores (MUNNS, 

2002). Essas moléculas também podem ser reservas de energia e, também de 

nitrogênio, no caso da prolina, para o restabelecimento da planta após período de 



 
 

 

21 

limitação hídrica (MUNNS, 2002; ANAMI et al., 2009). A prolina e a trealose são alguns 

dos principais solutos compatíveis estudados na avaliação e distinção da tolerância de 

plantas à seca.  

Situações de estresse hídrico no solo podem ser simuladas em condições de 

laboratório, utilizando-se soluções aquosas com diferentes potenciais osmóticos, como 

as soluções de manitol e/ou de polietilenoglicol (PEG). Potenciais osmóticos muito 

negativos, geralmente, ocasionam atraso ou mesmo diminuição na porcentagem de 

germinação. O PEG é um agente osmótico, quimicamente inerte, atóxico para as 

sementes e constituído por macromoléculas que dificultam a absorção da água pelo 

tegumento (VILLELA et al., 1991). No presente trabalho foi usado esse artifício para 

estudar a variabilidade do teor de prolina e de trealose nos tecidos endospermático e 

embrionário, com o objetivo de descrever as suas funções fisiológicas na germinação de 

dois híbridos de milho (Zea mays L): DKB 390 e DAS 2B710; bem como verificar o grau 

de tolerância relativa à limitação hídrica desses genótipos. 

 

 

2.2. Material e Métodos 

 

O experimento foi desenvolvido na Unesp – Universidade Estadual Paulista, FCAV 

– Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal, SP.  

Tratamentos (simulação do estresse hídrico): inicialmente, o grau de umidade foi 

avaliado em 25 sementes com quatro repetições pelo método de estufa a 105 ± 3 oC 

durante 24 h (BRASIL, 2009). Foram utilizadas sementes com características biométricas 

semelhantes, sendo estas previamente tratadas com solução de nistatina a 1% 

(fungicida) para manutenção da sanidade das mesmas. A cada três dias, as sementes 

foram transferidas para novas caixas gerbox, contendo papéis umedecidos com o 

respectivo tratamento, para manutenção constante dos potenciais osmóticos. As 

parcelas foram distribuídas ao acaso em câmara de germinação (tipo BOD), em 



 
 

 

22 

condições controladas, 30 °C ± 2 °C, 60 ± 2 % UR e fotoperíodo de 12 h, de acordo 

com BRASIL (2009). As contagens da germinação foram realizadas, diariamente, até o 

término do ensaio experimental (10 dias após a imposição dos tratamentos), 

considerando-se como germinadas as sementes com protrusão da raiz primária (2 mm).  

Índice de germinação de sementes sob tratamento (IGT): a partir das contagens 

diárias dos números de sementes germinadas para cada tratamento, calculou-se o IGT: 

número de sementes germinadas sob estresse / número de sementes germinadas da 

testemunha) x 100 (ZEID & EL-SEMARY, 2001). 

Índice de velocidade de germinação (IVG): com os dados diários do número de 

sementes germinadas, foi calculado o IVG, empregando-se a fórmula proposta por 

MAGUIRE (1962). 

Tempo médio de germinação (TMG): a partir das contagens diárias dos números de 

sementes germinadas para cada parcela experimental, pode-se estimar o TMG segundo 

EDMOND & DRAPALA (1958). 

Massa seca dos tecidos (g MS): após a liofilização, a parte aérea (PA), as raízes (R), 

o endosperma (EN) e o eixo embrionário (EE) foram separados manualmente, 

utilizando-se luvas e lupa para melhor separação desses tecidos. Após o manuseio, 

foram acondicionados em sacos de papel e armazenados em desumidificador até 

atingirem massa constante; subsequentemente foram pesados em balança de precisão  

(±0,01 g).  

Teor de prolina (Pro): após a liofilização, o eixo embrionário e endosperma foram 

separados e macerados em nitrogênio líquido e armazenados, separadamente, até a 

determinação da prolina. O acúmulo de prolina livre foi quantificado no endosperma 

(EN) e eixo embrionário (EE), segundo BATES et al., 1973. 

Teor de trealose (Tre): a enzima trealase conidial foi preparada e purificada por 

método de NEVES et al. (1994), com modificações. Realizou-se cromatografia de 

filtração em gel em CM-cellulose column (0,6 x 30 cm). A trealose foi determinada 

segundo método enzimático, utilizando-se 0,1 g de tecido liofilizado do EN e EE. 



 
 

 

23 

Tratamento estatístico: o delineamento experimental foi o inteiramente casualizado 

em arranjo fatorial 2 x 5 (híbridos x potenciais hídricos - HxP) com 4 repetições. Cada 

parcela experimental foi constituída de duas caixas tipo gerbox, cada uma contendo 25 

sementes depositadas sobre papel germitest esterilizado e, dependendo do tratamento, 

umedecido com água destilada estéril (testemunha) correspondendo ao potencial 0,0 

Mega Pascal (MPa) ou com diferentes concentrações de PEG 6000, obedecendo aos 

potenciais osmóticos: -0,3; -0,6; -0,9; e -1,2 MPa (sementes sob estresse). Os 

resultados foram submetidos à análise de variância (teste F) e as médias comparadas 

pelo teste de Tukey (5%) e análises da regressão polinomial foram utilizadas para o 

desdobramento dos graus de liberdade do fator quantitativo potencial osmótico e para o 

estudo da interação híbrido x potenciais osmóticos (BORGHETTI & FERREIRA, 2004; 

SANTANA & RANAL, 2004). Realizou-se análise de correlação linear de Pearson entre as 

variáveis avaliadas.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
Figura 1. Esquema metodológico do ensaio da germinação de sementes de milho sob 

crescente potencial hídrico. 



 
 

 

24 

2.3 – Resultados e Discussão 

  

A diminuição da disponibilidade hídrica para a germinação (DHG), simulada pelo 

polietilenoglicol (PEG), ocasionou redução de até 52% no índice de germinação de 

sementes (IGT) sob o menor potencial osmótico, aos 10 dias após a imposição dos 

tratamentos (DAT), independentemente do híbrido (Figura 2).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 2. Efeito da limitação hídrica na germinação de híbridos simples de milho, 

simulado pela solução de Polietilenoglicol (PEG 6000), no 10º dia após a 

semeadura. Índice de germinação de sementes sob tratamento (IGT) de 

híbridos de milho (Interação HxPns; p>0,05) 

 

 

IGE = -38,889x2 - 7,6667x + 99,4
R² = 0,99**

0

25

50

75

100

-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0

Índice de germ
inação de sem

entes 
sob tratam

ento (%
)

Potencial Hídrico (MPa)

IGE  DKB 390 = -47,675x2 - 14,413x + 98,395
R² = 0,98**

IGE 2B 710 = -38,889x2 - 7,6667x + 99,4
R² = 0,99**

0

25

50

75

100

-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0

IGE DKB 390

IGE DAS 2B710



 
 

 

25 

Para o índice de velocidade de germinação (IVG) e o tempo médio germinação 

(TMG), observou-se que o IVG reduziu-se proporcionalmente à menor DHG, enquanto 

para o TMG a relação é inversa, isto é, maior foi o tempo despendido à germinação das 

sementes. Nas variáveis IVG e TMG, verificou-se a diferença entre os híbridos, cujo 

maior IVG e menor TMG foram verificados no híbrido DAS 2B710 (Figuras 3A e 3B). 

Apesar do IGT de ambos híbridos assemelharem-se, averiguou-se que o IVG do híbrido 

DAS 2B710, no maior e menor potencial osmótico (0,0 MPa e -1,2 MPa), foi de 10,9 e 

2,8 sementes germinadas por dia, respectivamente, contrapondo os 9,1 e 1,6 sementes 

germinadas por dia do híbrido DKB 390, para os mesmos potenciais.  

Para o TMG do híbrido DAS 2B710 foram despendidos 2,4 e 6,5 dias para que 

100% e 58% das sementes germinassem sob os potenciais 0,0 MPa e -1,2 MPa, 

respectivamente; já para o híbrido DKB 390 foram utilizados 2,8 e 7,3 dias para que 

100% e 45% das sementes germinassem, respectivamente.  

Constatou-se que as variáveis que melhor descreveram o processo de 

germinação em condições adversas foram o IVG e o TMG, principalmente na distinção 

da resposta dos híbridos à limitação hídrica. Outra observação pertinente seria que, 

possivelmente, a diminuição do IVG e o aumento do TMG em crescente limitação hídrica 

poderiam ter sido ocasionados pela quiescência, para assegurar uma boa germinação e 

o estabelecimento das plântulas em condições normais (FINCH-SAVAGE & LEUBNER-

METZGER, 2006). 

Verificou-se que além do PEG diminuir a disponibilidade hídrica para a 

germinação, comprometeu o estabelecimento das plântulas. A massa seca (g MS) em 

diferentes tecidos das plântulas não foi reduzida proporcionalmente à disponibilidade 

hídrica, por exemplo, nos tecidos endospermático (EN) e embrionário (EE). Tal fato foi 

também observado por ZEID & EL-SEMARY (2001) e GILL et al. (2002), onde a 

biomassa de tecidos como EN e EE não se reduziu, porém, a parte aérea e o sistema 

radicular tiveram drásticas diminuições conforme a supressão da água, concordando 

com os resultados apresentados na Tabela 1.  



 
 

 

26 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 3. Efeito da limitação hídrica na germinação de híbridos simples de milho, simulado pela 

solução de Polietilenoglicol (PEG 6000), no 10º dia após a semeadura. Interação HxP* 

(p<0,05) para as variáveis Tempo médio (TMG) e Índice de velocidade germinação (IVG). 

A) TMG e IVG do híbrido DKB 390 B) TMG e IVG do híbrido DAS 2B710. **Regressão 

linear significativa (p<0,01). 

IVG= -6,899x + 10,43
R² = 0,98**

TMG = -3,3767x + 2,1875
R² = 0,97**

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0

Tem
po  m

édio de germ
inação 

(dias)
Ín

di
ce

 d
e 

ve
lo

ci
da

de
 d

e 
ge

rm
in

aç
ão

 
(s

em
en

te
s 

ge
rm

in
ad

as
 /

 d
ia

)

Potencial Hídrico (MPa)

DAS 2B710

IVG = 5,6967x + 8,4745
R² = 0,96**

TMG = 3,388x + 2,819
R² = 1,00**

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0

Tem
po m

édio de germ
inação

(dias)

Ín
di

ce
 d

e 
ve

lo
ci

da
de

 d
e 

ge
rm

in
aç

ão
(s

em
en

te
s 

ge
rm

in
ad

as
 /

 d
ia

)

Potencial Hídrico (MPa)

DKB 390
A 

B 

TMG 
IVG 

IVG 
TMG 



27 
 

Tabela 1. Modificações na massa seca (g/plântulas MS) de dois híbridos de milho em 

diferentes potenciais hídricos (MPa) e tecidos*: parte aérea, endosperma, 

eixo embrionário e raiz no 10º dia após imposição dos tratamentos.  

Potencial 

hídrico 

(MPa) 

Tecidos (g MS)1 

Parte Aérea Endosperma Eixo Embrionário Raiz 

DKB 390 
DAS 

2B710 
DKB 390 

DAS 

2B710 
DKB 390 

DAS 

2B710 
DKB 390 

DAS 

2B710 

  0,0 1,64 ± 0,11 1,52 ± 0,13 5,03 ± 0,55 5,25 ± 0,23 1,87 ± 0,24 1,67 ± 0,18 2,08 ± 0,15 1,67 ± 0,69 

-0,3 1,10 ± 0,19 1,65 ± 0,16 7,94  2,14 6,06 ± 2,07 1,91 ± 0,12 1,75 ± 0,19 1,69 ± 0,43 1,88 ± 0,33 

-0,6 0,99 ± 0,03 1,53 ± 0,54 5,29 ± 0,58 5,13 ± 0,64 1,66 ± 0,03 1,62 ± 0,10 2,09 ± 0,26 2,72 ± 0,99 

-0,9 0,90 ± 0,16 1,72 ± 0,00 6,90 ± 0,16 5,31 ± 0,37 1,58 ± 0,19 2,04 ± 0,09 1,22 ± 0,15 0,98 ± 0,06 

-1,2 0,29 ± 0,01 0,57 ± 0,01 6,97 ± 0,90 7,40 ± 0,85 1,52 ± 0,07 2,38 ± 0,21 0,06 ± 0,00 0,73 ± 0,17 

*Interação significativa entre híbridos x potenciais hídricos (p<0,05). 1Valores da média e desvio padrão. 

 

 

Essa resposta é esperada, pois a parte aérea e a raiz dependem da semente 

(órgão fonte de reserva de energia de carbono e nutrientes minerais), podendo até 

serem denominados de órgãos “comensais”, uma vez que há uma interdependência 

com a semente, principalmente da interação entre endosperma e eixo embrionário, para 

a formação desses órgãos (parte aérea e raiz), até que haja a autonomia dos mesmos 

(MARCOS FILHO, 2005).  

O teor de prolina no híbrido DKB 390, para os tecidos endospermático (EN) e 

embrionário (EE), nessa ordem, foi de 0,2 e 2,6 µmol g-1 MS em 0,0 MPa. Contudo, em 

situação de limitação hídrica (-0,3 a -1,2 MPa) acresceu-se, em média, em 2,8 e 2,7 

vezes (Tabela 2). Em contrapartida, o teor do aminoácido nos tecidos EN e EE do 

híbrido DAS 2B710 (0,2 e 0,5 µmol g-1 MS) aumentou em duas e oito vezes, 

respectivamente. O acúmulo de prolina foi gradativo conforme houve a limitação hídrica 

para o genótipo 2B 270, em ambos tecidos. Entretanto, para o DKB 390 apenas no EN 

houve similaridade na tendência linear. No EE, o teor do aminoácido foi oscilante, tendo 

um acúmulo máximo de 9,23 µmol g-1 MS em -0,32 MPa e mínimo de 3,66 µmol g-1 MS 

em -0,93 MPa (Figura 4).  



28 
 

 

O acúmulo de prolina no EN e no EE das sementes em função dos diferentes 

potenciais hídricos pode evidenciar a capacidade de osmoproteção dessas plantas 

durante o processo de germinação em condição adversa. Outro fato, é que o EN é um 

tecido altamente dependente do EE à mobilização de compostos. De acordo com 

MOHAMMADKHANI & HEIDARI (2008), o acúmulo desse aminoácido é relativamente 

dependente dos níveis de carboidratos nos tecidos e mencionam ainda que a sacarose 

tenha um efeito positivo no acúmulo de prolina.  

Sabe-se que o eixo embrionário possui maiores concentrações de açúcares não-

redutores e redutores, e que o endosperma tem seu metabolismo reduzido, pois a sua 

função principal é a de reserva e fonte energética, ou seja, há a predominância em sua 

constituição de macromoléculas como o amido (LOPES & LARKINS, 1993; BORGHETTI & 

FERREIRA, 2004). 

 

Tabela 2. Teor de solutos compatíveis (µmol/g MS) de dois híbridos de milho em diferentes 

potenciais hídricos (MPa) e tecidos, endosperma e eixo embrionário no 10º dia após 

imposição dos tratamentos.  

Potencial 

hídrico 

MPa 

Solutos compatíveis (µmol/g MS)1 

Prolina* Trealose 

DKB 390 DAS 2B710 DKB 390 DAS 2B710 

Endosperma 
Eixo 

embrionário 
Endosperma 

Eixo 

embrionário 
Endosperma 

Eixo 

embrionário 
Endosperma 

Eixo 

embrionário 

0,0 0,20 ± 0,00 2,61± 0,49 0,20± 0,00 0,54 ± 0,04 3,37 ± 0,60 8,02 ± 1,36 5,63 ± 1,67 7,75 ± 0,63 

-0,3 0,31 ± 0,01 10,83 ± 0,59 0,20 ± 0,00 3,35 ± 0,42 2,36 ± 1,03 6,44 ± 1,29 2,75 ± 1,17 6,27 ± 1,50 

-0,6 0,44± 0,10 4,38 ± 0,52 0,27 ± 0,04 3,52 ± 0,59 3,96 ± 1,03 6,17 ± 2,74 6,58 ± 1,13 6,93 ± 1,77 

-0,9 0,56 ± 0,06 5,30 ± 0,62 0,40± 0,07 5,82 ± 0,82 3,00 ± 1,36 7,39 ± 1,11 3,23 ± 1,05 3,23 ± 1,05 

-1,2 0,60 ± 0,08 7,62 ± 0,42 0,76 ± 0,04 6,61 ± 0,35 2,80 ± 0,44 4,18 ± 1,41 2,61 ± 0,44 2,61 ± 0,44 

*Interação significativa entre híbridos x potenciais hídricos (p<0,05). 1Valores da média e desvio padrão. 

 

 

Adicionalmente, esse aminoácido pode ser considerado um indicador metabólico 

de tolerância à seca para esses híbridos, principalmente se quantificado no EE das 

sementes, onde o teor é até oito vezes superior ao do EN, mostrando-se acumulativo a 

partir do potencial -0,3 MPa com leve declínio no potencial -1,2 MPa (Figura 5).  



29 
 

 

 

Figura 4. Efeito da limitação hídrica (simulada pela solução de polietilenoglicol) no 

conteúdo de prolina (µmol g-1 MS) em sementes germinadas de milho aos 

dez dias após a imposição dos tratamentos. Interação significativa HxP**(p < 

0,01). Tecidos: endospermático (EN) e embrionário (EE). Regressões 

significativas: **p < 0,01. 

 

 

Com isso, observa-se que a síntese de prolina (Pro), possivelmente, tenha um 

limite ótimo, o qual é dependente da condição de restrição hídrica em que a semente 

germina. O decréscimo do aminoácido pôde ter ocorrido em detrimento da semente 

requerer energia para manutenção do seu metabolismo, podendo estar associado à 

degradação de moléculas de Pro, resultantes da regulação recíproca das vias de síntese 

e de degradação o que a torna fonte energética. A versatilidade do aminoácido foi 

verificada por KAVI KISHOR et al. (2005) que relatam que a oxidação de 1 mol de 

prolina pode gerar 30 mol de ATP (Adenosina trifosfato). 

 

 

 

DKB 390 (EN) = -0,3488x + 0,2133
R² = 0,80**

2B 710 (EN) = -0,4386x + 0,1043
R² = 0,75**

2B 710 (EE) = -4,8715x + 1,0458
R² = 0,87**

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0

C
onteúdo de P

rolina (µ
m

o
l g

-1M
S)

Potencial Hídrico (MPa)

DKB 390 (EN)

DKB 390(EA)

2B 710 (EN)

2B 710 (EA)



30 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 5. Efeito da limitação hídrica (simulada pela solução de polietilenoglicol) sobre a 

distribuição média da prolina nos tecidos endospermático e embrionário de 

sementes germinadas de milho, aos dez dias após a imposição dos tratamentos.  

 

 

 Com relação ao conteúdo de trealose (Tre) nas sementes no 10º DAT, houve 

oscilação nos teores nos tecidos endospermático (EN) e embrionário (EE), independente 

do híbrido estudado (HxPns, p > 0,05). Contudo, o teor de trealose no EE foi o dobro em 

relação ao EN (Figura 6). A distinção quanto à concentração de metabólitos nesses 

tecidos é esperada, como mencionado anteriormente. Apesar disso, notou-se a mesma 

tendência em ambos tecidos conforme o estresse hídrico, em que nos potenciais -0,29 

MPa e -0,78 MPa apresentaram acúmulo máximo de 6,62 µmol g-1 MS e mínimo de 5,90 

µmol g-1 MS para EE, enquanto para o EN, 4,34 µmol g-1 MS foi o máximo acumulado (-

0,81 MPa), e mínimo 3,48 µmol g-1 MS (-0,29 MPa ).  

Observou-se que há um feedback negativo entre EE e EN, corroborando com a 

literatura DOWNIE et al. (2003). O potencial em que houve maior acúmulo de Tre no 

eixo embrionário (-0,29 MPa), foi o de menor acúmulo no EN (-0,29 MPa ) e vice-versa 

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0-0,3-0,6-0,9-1,2

P
orcentagem

 m
édia de prolina 

acum
ulada

Potencial hídrico(MPa)

Eixo embrionário

Endosperma



31 
 

 

(Figura 6). Com isso, o aumento e declínio de Tre (Figura 7) indica que há uma 

regulação metabólica entre os dois tecidos. O aumento, possivelmente, atrelou-se à 

redução de polímeros, em grande parte compartimentalizados, metabolizados a partir 

da demanda dessas moléculas na preservação da membrana plasmática, que estaria 

desestabilizada pela seca (PAUL et al., 2008).  

 

Figura 6. Efeito da limitação hídrica (simulada pela solução de polietilenoglicol) no conteúdo de 

trealose (µmol g-1 MS) em sementes germinadas de milho aos dez dias após a 

imposição dos tratamentos.  

 

 

Já a redução no teor de trealose (Tre) em ambos os tecidos poderia estar conexa 

ao dispêndio de energia para sintetizar cada mol desse açúcar, que é limitado nas 

plantas em condições adversas. Adicionalmente, há relatos do efeito deletério de 

elevadas concentrações da Tre nas células do tecido vegetal, pois podem influenciar 

negativamente as chaperoninas, responsáveis pela homeostase das proteínas 

(WINGLER, 2002). 

y = 8,7449x3 + 14,434x2 + 6,1588x + 4,268
R² = 0,24*

y = 6,2721x3 + 10,104x2 + 6,5359x + 7,8219
R² = 0,65*

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0

T
realose  (µ
m
ol g
-1

M
S
)

Potencial Hídrico (MPa)

Endosperma

Eixo embrionário



32 
 

 

Tal hipótese permite explicar as oscilações do teor nos distintos tecidos no 

presente trabalho. Assim, para que haja a manutenção do nível ótimo deste açúcar nos 

tecidos estudados, há um balanço entre a síntese e a degradação. De tal modo, 

percebe-se que nem sempre existe a relação direta entre a síntese de Tre com o 

aumento da limitação hídrica. Possivelmente, o soluto pode ter conduzido à manutenção 

de um estado hídrico favorável para o metabolismo, atendendo a função de 

osmorregulador. Do mesmo modo, como o acúmulo de Pro é relativamente dependente 

dos níveis de sacarose (MOHAMMADKHANI & HEIDARI, 2008), analogicamente, a 

trealose poderia ter função comum, uma vez que possui função semelhante ao seu 

isômero (WINGLER, 2002).  

 

 

Figura 7. Efeito da limitação hídrica (simulada pela solução de polietilenoglicol) sobre a 

distribuição média da trealose nos tecidos endospermático e embrionário de 

sementes germinadas de milho, aos dez dias após a imposição dos tratamentos.  

 

0%

25%

50%

75%

100%

0,0-0,3-0,6-0,9-1,2

P
orcentagem

 m
édia acum

ulada 
de trealose

Potencial Hídrico (MPa)

Eixo Embrionário

Endosperma



33 
 

 

Os estudos sobre a interação dos mecanismos dessas respostas, tanto do ponto 

de vista fisiológico quanto bioquímico, podem ser observados na análise de correlações 

de Pearson (Tabela 3).  

Verificou-se a dependência entre algumas variáveis avaliadas em resposta à 

germinação dos híbridos em limitação hídrica. Constatou-se que as variáveis que 

quantificam a germinação têm correlação entre si, bem como com algumas variáveis 

metabólicas. As sementes que germinaram mais rapidamente (alto IVG e baixo TMG) e 

em maior percentual, apresentaram biomassa seca na parte aérea e radicular 

proporcionais, bem como o teor de trealose (Tre) no eixo embrionário (Tre EE). O 

inverso ocorreu para o teor de prolina (Pro), tanto no endosperma (Pro EN) quanto no 

eixo embrionário (Pro EE). Com isso, demonstrou-se que esse dissacarídeo seria mais 

constitutivo, uma vez que apresentou tendência similar às variáveis de crescimento.  

 

Tabela 3. Estimativas dos coeficientes de correlação de Pearson (r) entre variáveis estudadas: Índice de 

velocidade de germinação (IVG), Tempo médio de germinação (TMG), Índice de germinação 

sob tratamento (IGT), Teor de prolina no endosperma (Pro EN), Teor de prolina no eixo 

embrionário (Pro EE), Teor de trealose no endosperma (Tre EN), Teor de trealose no eixo 

embrionário (Tre EE), Massa seca da parte aérea (MSPA), endosperma (MSEN), eixo 

embrionário (MSEE) e Raiz (MSR) no 10º dia após semeadura. 

 IVG TMG IGT Pro EN Pro EE Tre EM Tre EE MSPA MSEN MSEE MSR 

IVG  -0,98** 0,88** -0,89** -0,68* 0,47ns 0,65* 0,75* -0,55ns -0,19 ns 0,68* 

TMG -0,98*  -0,96** 0,92** 0,64* -0,46 ns -0,67* -0,83** 0,57 ns 0,17 ns -0,79** 

IGT 0,88** -0,96**  -0,89** -0,47 ns 0,36 ns 0,63 ns 0,83** -0,49 ns -0,14 ns 0,85** 

Pro EN -0,89** 0,92** -0,89**  0,49 ns -0,41 ns -0,43 ns -0,85* 0,57 ns 0,32 ns -0,73* 

Pro EE -0,68* 0,64* -0,47 ns 0,49 ns  -0,64* -0,56 ns -0,56 ns 0,82** 0,27 ns -0,47 ns 

Tre EN 0,47 ns -0,46 ns 0,36 ns -0,41 ns -0,64*  0,35 ns 0,38 ns -0,65* -0,42 ns 0,57 ns 

Tre EE 0,65* -0,67* 0,63 ns -0,43 ns -0,56 ns 0,35 ns  0,63 ns -0,44 ns 0,18 ns 0,48 ns 

MSPA 0,75* -0,83** 0,83** -0,85** -0,56 ns 0,38 ns 0,63 ns  -0,69* 0,01 ns 0,68* 

MSEN -0,55 ns 0,57 ns -0,49 ns 0,57 ns 0,82** -0,65* -0,44 ns -0,69*  0,27 ns -0,55 ns 

MSEE -0,19 ns 0,17 ns -0,14 ns 0,32 ns 0,27 ns -0,42 ns 0,18 ns 0,01 ns 0,27 ns  -0,21 ns 

MSR 0,68* -0,79** 0,85** -0,73* -0,47 ns 0,57 ns 0,48 ns 0,68* -0,55 ns -0,21 ns  

Correlação significativa *p < 0,05 e **p< 0,01; nsnão-significativa; N=10  

 



34 
 

 

 O mesmo não ocorreu para Pro EN e Pro EE, havendo uma relação inversa, pois 

as sementes que estiveram em condições hídricas ótimas para a germinação, não 

necessitariam acumular o aminoácido. Dessa forma, esse soluto compatível atuaria, 

efetivamente, na osmoproteção desses tecidos para assegurar o adequado 

estabelecimento das plântulas em condições subótimas. Outra hipótese seria de que 

além da prolina agir como uma molécula atóxica de proteção em condições de estresse, 

também atuaria na dormência secundária da semente. De acordo com THAKUR & 

SHARMA (2005), possivelmente, esse aminoácido faça parte do sistema que mantém o 

desenvolvimento do eixo embrionário em repouso, o que corrobora com os resultados 

de o teor acumulado de prolina ser maior nesse tecido (Figura 5), além da relação 

inversa com IVG e direta com TMG (Tabela 3).  

A relação negativa do teor de Pro EN com MSPA e MSR pode estar relacionada à 

localização, atuando como fonte energética, uma vez que, com o aumento MSPA e MSR 

há uma demanda energética para o estabelecimento da plântula, com isso o 

metabolismo de moléculas de prolina é necessário. A relação inversa do MSEN com teor 

de Tre EN poderia estar aliada ao metabolismo dos carboidratos (DOWNIE et al., 2003). 

Acréscimos no potencial osmótico celular ocorrem pelos aumentos na concentração de 

solutos compatíveis presentes na célula túrgida. Todavia, no caso da trealose, a 

osmorregulação ocorreria devido à degradação do açúcar para atender a manutenção 

do metabolismo, como fonte energética, atendendo a demanda celular na síntese de 

moléculas como a prolina (relação inversa Tre En e Pro EE).  

Dessa forma, o estudo da resposta na germinação de milho sob condições 

adversas é complexo e muitos aspectos necessitam ser mais estudados, elucidados e 

discutidos. 

 

 

 

 

 

 



35 
 

 

2.4. Conclusões 

 

 A diminuição do potencial hídrico reduz a germinação e a massa seca da parte 

aérea e raiz das plântulas dos híbridos DKB 390 e DAS 2B710; 

 Em condição de limitação hídrica, o índice de germinação de sementes sob 

tratamento foi semelhante entre os híbridos DKB 390 e DAS 2B710, contudo, o índice de 

velocidade de germinação foi maior e o tempo médio de germinação foi menor no 

híbrido DAS 2B710; 

A prolina pode ser utilizada como indicador metabólico de resposta dos híbridos 

de milho (DKB 390 e DAS 2B710) à limitação hídrica durante a germinação quando 

quantificada no eixo embrionário; 

No híbrido DAS 2B710 há o acúmulo de prolina no eixo embrionário conforme a 

redução do potencial hídrico; 

A trealose está presente na constituição do endosperma e eixo embrionário dos 

híbridos DKB 390 e DAS 2B710, mas não indica resposta metabólica à limitação hídrica 

na germinação.  

 

 

2.5. Referências Bibliográficas  

 

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39 
 

 

CAPÍTULO 3: TOLERÂNCIA DE DOIS HÍBRIDOS DE MILHO À LIMITAÇÃO 

HÍDRICA 

 

 

RESUMO: As plantas podem desencadear respostas à limitação hídrica como 

alterações no metabolismo, crescimento e desenvolvimento. Os teores de sacarose, 

trealose, açúcares redutores, amido, aminoácidos livres e prolina em folhas de milho 

(Zea mays L.), nos híbridos DKB 390 e DAS 2B710, foram determinados em respostas 

ao déficit hídrico no estádio vegetativo. O experimento foi conduzido em casa de 

vegetação. As plantas foram cultivadas em vasos (54 dm3) contendo Latossolo vermelho 

distrófico (LVd). Houve a redução na fotossíntese, na condutância estomática e no 

crescimento dos híbridos DKB 390 e DAS 2B710. O estresse hídrico induziu acúmulo de 

sacarose e prolina, que podem ser indicadores metabólicos de resposta à limitação 

hídrica dos híbridos DKB 390 e DAS 2B710. O híbrido DKB 390 mantém os teores de 

açúcares redutores e de amido, reduz o teor de trealose e aumenta o teor de 

aminoácidos livres quando exposto a uma condição hídrica adversa. Já o híbrido DAS 

2B710 reduz os teores açúcares redutores e de amido na menor disponibilidade hídrica 

no solo e mantém os de trealose e aminoácidos livres nessas condições. Os híbridos 

DKB 390 e DAS 2B710 apresentam tolerância semelhante à limitação hídrica no estádio 

vegetativo.  

 

 

Palavras-chave: Zea mays, fotossíntese, metabolismo, solutos compatíveis, estresse 

hídrico. 

 

 

 

 

 

 



40 
 

 

Tolerance of two maize hybrids to water stress 

 

 

ABSTRACT: Plants can trigger responses to water limitation as changes in 

metabolism, growth and development. The levels of sucrose, trehalose, reducing sugars, 

starch, total free amino acids and proline in leaves maize (Zea mays L.), DKB 390 and 

DAS 2B710 varieties, were determined in response to a water deficit at the silking stage. 

The experiment carried out in greenhouse. Plants were cultivated in pots (54 dm3) 

containing Oxisoil. There was a reduction in photosynthesis, stomatal conductance and 

growth of DKB 390 and DAS 2B710 hybrids. The water stress induced accumulation of 

sucrose and proline, which can be indicators of metabolic response to water limitation of 

DKB and 390 DAS 2B710. The DKB 390 hybrid maintains the reducing sugars and starch 

content, reduces the level of trehalose and increased the free amino acids content when 

exposed to adverse water conditions. Since the DAS 2B710 hybrid reduces the levels of 

reducing sugars and starch in less soil water availability and maintain the trehalose and 

free amino acids in these conditions. The DKB 390 and DAS 2B710 hybrids show similar 

tolerance to water limitation in the vegetative stage. 

 

 

Key words: Zea mays, photosynthesis, metabolism, soluble compatible, water stress 

 



41 
 

 

3.1. Introdução 

 

Durante o ciclo de vida das plantas nem sempre as condições ambientais são 

ótimos ao seu crescimento e desenvolvimento. Um importante fator ambiental que 

frequentemente limita o crescimento é a redução na disponibilidade hídrica do solo. O 

estresse hídrico ocorre geralmente na natureza e em ecossistemas de produção, de 

maneira gradual e, por isso, as plantas tolerantes desenvolveram mecanismos para se 

adaptarem às limitações hídricas do solo (MAGALHÃES et al., 2002; DURÃES et al., 

2004). 

A tolerância de plantas a ambientes adversos ou a condições de fatores 

ambientais subótimos envolve a adaptação a estresses múltiplos, com interações diretas 

e indiretas. Assim, torna-se de grande importância a caracterização de genótipos 

contrastantes, bem como os estudos sobre a interação e a sobreposição de 

mecanismos, tanto do ponto de vista fisiológico quanto bioquímico (DURÃES et al., 

2004; ANAMI et al., 2009). 

A capacidade de acúmulo de solutos compatíveis é uma resposta comum em 

organismos sob condições adversas, e vem sendo muito investigada nas plantas nos 

últimos anos (ZEID & EL-SEMARY, 2001; ABO-EL-KHEIR & MEKKI, 2007; 

MOHAMMADKHANI & HEIDARI, 2008; DÍAZ et al., 2010). Os vegetais superiores em 

condições de estresse hídrico acumulam açúcares, prolina livre, ácidos orgânicos, íons, 

entre outros solutos (BARTELS & SUNKAR, 2005; ANAMI et al., 2009). Estes solutos 

compatíveis são moléculas ou íons atóxicos que não interferem no metabolismo e se 

acumulam predominamente no citoplasma, onde têm função de manter a turgescência 

celular, além de estabilizar proteínas e estruturas celulares nas condições subótimas dos 

fatores ambientais (BRAY et al., 2001; BARTELS & SUNKAR, 2005).  

O crescimento vegetal é reflexo do balanço de carbono na planta, que depende 

dos processos de fotossíntese e de respiração nos vegetais, os quais, por sua vez, 

dependem de uma complexa série de fatores ambientais, como disponibilidade de água, 

de nutrientes e de energia (ANGELOCCI, 2002). A redução da capacidade fotossintética 

é uma importante resposta ao estresse hídrico. Para conservar água, nutrientes e 



42 
 

 

carboidratos necessários para a sobrevivência, as plantas apresentam modificações 

morfofisiológicas, como a redução da expansão foliar e o fechamento dos estômatos. 

Como o estômato controla a difusão de CO2 e de vapor de água, suas respostas à 

deficiência hídrica são fundamentais no controle da eficiência de assimilação de CO2 e 

da economia de água (TAIZ & ZEIGER, 2010). 

A cultura do milho (Zea mays L.) encontra-se amplamente disseminada no Brasil 

e no mundo. Dessa forma, o cultivo desta espécie é realizado em determinadas regiões 

cujo ciclo de desenvolvimento coincide com os períodos em que ocorre a limitação 

hídrica, afetando o desenvolvimento das plantas, e, portanto, a produção da biomassa 

vegetal. Estima-se que na região tropical, 95% do cultivo são realizados em áreas 

propensas à deficiência hídrica, ocasionando um declínio de 10% a 50% da produção, 

dependendo do estádio fenológico em que a cultura se encontra (MAGALHÃES et al., 

2002; MOHAMMADKHANI & HEIDARI, 2008). 

O estresse pela baixa disponibilidade hídrica é um dos principais problemas da 

agricultura e a habilidade das plantas para tolerar a tal estresse é de suma importância 

para o desenvolvimento do agronegócio de qualquer país. Estudos de tolerância à 

limitação hídrica envolvendo o milho podem trazer melhorias no crescimento e no 

rendimento da cultura em regiões com limitação hídrica, pois o milho é conhecido pela 

sua alta sensibilidade a este estresse (revisado por MAGALHÃES et al., 2009). Por isso, 

o objetivo deste trabalho foi avaliar o acúmulo de solutos orgânicos e suas respectivas 

contribuições para o ajustamento osmótico em folhas de diferentes híbridos de milho, 

em distintas disponibilidades hídricas no solo. 

 

 

 

 

 

 



43 
 

 

3.2. Material e Métodos 

 

3.2.1. Instalação e condução do experimento 

 

O experimento foi desenvolvido na Unesp – Universidade Estadual Paulista, FCAV 

– Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal, SP.  

Com o intuito de se observar as respostas bioquímico-fisiológicas à limitação 

hídrica foi desenvolvido um experimento em casa de vegetação com os híbridos DKB 

390 e DAS 2B710 que possuem as características apresentadas na Tabela 1. 

 

Tabela 1. Características dos híbridos de milho 

Empresa Híbrido Base genética* ciclo grão 

Dekalb DKB 390® HS Precoce semidentado 

Dow AgroSciences DAS 2B710® HS Precoce semiduro 

*Base Genética: HS-Híbrido simples. 

 

Após a germinação e desbaste, foram mantidas três plantas por vaso com 

capacidade para 54 dm3, as quais foram cultivadas em Latossolo Vermelho distrófico 

(LVd), típico, textura média, A moderado caulinítico, hipoférrico (ANDRIOLI & 

CENTURION, 1999) sem restrição hídrica até o estádio V3, quando as plantas foram 

submetidas a duas distintas tensões hídricas (-0,01 e -0,06 MPa). Sendo assim, os 

quatro tratamentos implantados foram os seguintes: 

 

Tratamento 1 = Híbrido DKB 390 cultivado em solo com tensão hídrica de -0,01 MPa 

(Controle); 

Tratamento 2 = Híbrido DKB 390 cultivado em solo com tensão hídrica de -0,06 MPa 

(déficit hídrico); 

Tratamento 3 = Híbrido DAS 2B710 cultivado em solo com tensão hídrica de -0,01 MPa 

(controle); 



44 
 

 

Tratamento 4 = Híbrido DAS 2B710 cultivado em solo com tensão hídrica de -0,06 MPa 

(déficit hídrico). 

 

 Para o controle do conteúdo de água no solo foram instalados dois tensiômetros 

em cada unidade experimental, sendo um na profundidade de 10 cm e o outro na de 30 

cm. Através de tensímetro digital, foi mensurada a umidade (tensão hídrica) do solo 

com o monitoramento diário das leituras das tensões do solo, mantendo a umidade 

concernente a cada tratamento (Figura 1). A estimativa da umidade do solo de cada 

vaso foi realizada a partir da média das leituras dos tensiômetros instalados nos vasos. 

A reposição de água foi realizada com uso de regas superficiais e de um tubo de PVC 

com perfurações ao longo de toda a extensão do vaso, instalado no centro geométrico, 

para garantir uma rápida e uniforme distribuição da umidade no solo do vaso. 

 

 

Figura 1. O controle do conteúdo de água no solo foi realizado através de tensiometria. 

 

 Após a germinação foram mantidas três plantas por vaso, as quais foram 

mantidas sem limitação hídrica até estágio vegetativo V3. A partir deste estádio, houve a 

diminuição da tensão do solo conforme estabelecido nos tratamentos, mantidos até o 

estádio V10 (Figura 2). 

As adubações de base e de cobertura foram realizadas de acordo com as 

recomendações para a cultura do milho (RAIJ et al., 1997; FORNASIERI FILHO, 1992; 



45 
 

 

Vide apêndice A.3). A temperatura e a umidade relativa do ar foram monitoradas na 

casa de vegetação, com auxílio de um termohigrômetro até o término do experimento.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 2. Mantiveram-se três plantas/vaso. Visão geral do experimento 

 

 

4.3.2. Avaliações bioquímico-fisiológicas 

 

Durante o período de limitação hídrica, o comprimento de uma folha jovem em 

expansão (com a lígula ainda não evidente) foi medido diariamente, no mesmo horário, 

em todas as unidades para cálculo da taxa de elongação foliar. O alongamento diário foi 

adquirido da diferença entre a medida do dia corrente com a do dia anterior. A 

elongação foliar está relacionada à expansão da célula que é dependente do turgor 

celular, o qual é extremamente sensível à limitação hídrica. Com auxílio de uma trena 

mediu-se a altura das plantas (do solo até a inserção da folha +1) e a altura de inserção 



46 
 

 

de espiga (do solo até a inserção da espiga principal). O diâmetro foi avaliado com 

auxílio de paquímetro no terceiro internó a contar do solo.  

Na primeira folha jovem e completamente expandida foi medida a fotossíntese 

líquida e condutância estomática, com auxílio de um medidor portátil de fotossíntese 

(LI-6400, Li-Cor, Inc. EUA), equipado com uma fonte artificial de luz, ajustada para 

3000 micro mol/m2/s, entre 9 e 12 h, horário local (Figura 3).  

No estádio V6, foi coletada a folha +1 (caracterizada como primeira folha com 

aurícula visível) no início da manhã e imediatamente armazenadas em nitrogênio líquido 

e posteriormente transferidas para ultra-freezer ajustado a –80 ºC até serem realizadas 

as quantificações dos metabólitos (Figura 4). 

 

Figura 3. Mensuração da fotossíntese líquida e condutância estomática, com auxílio de medidor 

portátil de fotossíntese (LI-6400, Li-Cor, Inc. EUA). 

 



47 
 

 

 

 

Figura 4. Amostras de folhas liofilizadas maceradas em nitrogênio líquido para análises 

bioquímicas. 

 

 

Para a extração dos metabólitos sacarose, açúcares redutores, amido e 

aminoácidos livres, utilizaram-se 25 mg de cada amostra. Em seguida a amostra foi 

agitada em um tubo de centrífuga contendo 1 mL de etanol 80% e em seguida colocou-

se em banho-maria a 60 ºC, por 30 minutos. Após centrifugação durante 20 minutos a 

1.200 x g o sobrenadante foi retirado, adicionado mais 1 mL de etanol 80% repetindo-

se o processo por mais duas vezes, juntou-se os sobrenadantes e o volume completado 

para 8 mL com água deionizada (FALEIROS et al., 1996).  

Neste extrato foram determinados os teores de açúcares redutores através da 

reação com DNSA (ácido 3,5-dinitrosalicílico), com posterior determinação 

espectrofotométrica a 520 nm, seguindo as indicações de FALEIROS et al. (1996). Os 

teores de sacarose foram determinados através da reação quantitativa com resorcinol, 

com posterior leitura espectrofotométrica a 520 nm (FIEW & WILLENBRINK, 1987). Os 

teores de aminoácidos livres foram determinados pela reação quantitativa com 

ninhidrina, com posterior determinação espectrofotométrica a 570 nm (MOORE, 1968).  

A prolina livre foi extraída e mensurada de acordo com método descrito por 

BATES et al.(1973). 



48 
 

 

A trealose foi determinada por reação enzimática através da ação hidrolítica da 

trealase em meio tamponado, sendo posteriomente, quantificado o produto glicolítico, 

através da enzima glicoseoxidase e, posterior leitura espectrofotométrica a 505 nm 

(NEVES et al., 1994). 

Para as avaliações biométricas, a parte área foi separada nas partes: lâminas 

foliares, colmo+bainha, flores e espiga, sendo acondicionadas em saco de papel e 

colocadas para secar em estufa de circulação forçada de ar a 80 ºC até atingir peso 

constante. Posteriormente foram pesadas em balança digital com precisão de ± 0,01 g. 

 

 

3.2.3. Delineamento experimental e tratamento estatístico 

 

O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado em um arranjo 

fatorial 2x2 (dois híbridos x duas disponibilidades hídricas no solo) com cinco repetições, 

a fim de se ter um melhor controle das variáveis ambientais dentro da casa de 

vegetação.  

Realizou-se a análise de variância pelo teste F, utilizando-se do teste de Tukey 

para a comparação entre médias dos fatores qualitativos, híbridos (H) e disponibilidade 

hídrica no solo (DHS), segundo BANZATTO & KRONKA (2006). 

 

 

3.3. Resultados e Discussão 

 

 Para a grande maioria das respostas bioquímico-fisiológicas, a interação híbrido x 

disponibilidade hídrica no solo (HxDHS) foi não-significativa (p>0,05), ou seja, os efeitos 

da disponibilidade hídrica sobre a fotossíntese (A), a condutância estomática (gs), a 

elongação foliar (EFM), a altura da planta (Alt), a altura de inserção de espiga (Alt.I.E), 

o diâmetro do colmo (Diam.), a sacarose (sac.), a trealose (Tre) e a prolina (Pro) 

independem do tipo de híbrido. Para as variáveis açúcares redutores (Aç.Red.), amido e 

aminoácidos livres (AA) a interação foi significativa (p<0,05) (Tabela 1).  



49 
 

 

As plantas sob estresse hídrico apresentaram reduções significativas (≈ 98%) na 

fotossíntese líquida (Figura 5). O híbrido DKB 390 apresentou valores 26,05 e 1,47 

µmoles de CO2/m2/s nas DHS -0,01 e -0,06 MPa, respectivamente. Enquanto que para o 

híbrido DAS 2B710 foram 29,43 e 1,47 µmoles de CO2/m2/s, nas mesmas condições. A 

condutância estomática (Figura 6) também foi afetada no potencial mais negativo (-0,06 

MPa), de forma similar nos híbridos de milho: de 0,37 para  

0, 019 mmol de H2O/m2/s, para o híbrido DKB 390, e de 0,30 para 0,020 mmol de 

H2O/m2/s no DAS 2B710.  

  



50 
 

 

Tabela 5. Análise de variância por meio do Teste F das respostas bioquímico-fisiológicas (p value) de híbridos de milho 

submetidos a diferentes disponibilidades hídricas no solo.  

 

**significativo (p<0,01); *significativo (p<0,05); nsnão-significativo (p>0,05).        

Causa da variação G.L. 
p value dos parâmetros bioquímico-fisiológicos 

A Gs EFM Alt. Alt.I.E Diam. MST Sac. Tre. Ac.Red Amido AA Pro 

Híbridos (H) 1 0,46ns 0,12ns 0,78ns 0,33ns 0,57ns 0,74ns 0,77ns 0,01** 0,01** 0,01** 0,10ns 0,01** 0,30ns 

Disponibilidade hídrica 

no solo (DHS) 
1 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01* 0,01** 0,01** 

Interação HxDHS 1 0,46ns 0,15ns 0,67ns 0,79ns 0,46ns 0,80ns 0,73ns 0,06 ns 0,06ns 0,01** 0,02* 0,01** 0,97ns 

(Tratamentos) 3              

Resíduo 16              

Total 19              

C.V - 19,42 15,64 11,11 16,14 18,23 14,06 19,32 8,25 10,75 10,07 9,48 9,06 7,26 



51 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 5. Fotossíntese líquida de híbridos de milho em resposta a diferentes disponibilidades hídricas no 

solo. **Diferença estatística entre as disponibilidades hídricas no solo independente do híbrido 

(p<0,01). 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 6. Condutância estomática de híbridos de milho em resposta a diferentes disponibilidades hídricas 

no solo. **Diferença estatística entre as disponibilidades hídricas no solo independente do 

híbrido (p<0,01). 

Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solons

Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança

 Hibrido
 DKB 390
 Hibrido
 2B 710

-0,01 MPa -0,06 MPa

Disponibilidade hídrica no solo (MPa)

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

F
o

to
ss

ín
te

se
 L

íq
u

id
a 
(µ

M
o
l/

m
2
/s

)
**

**

Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solons

Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança

 Hibrido
 DKB 390
 Hibrido
 2B 710

-0,01 MPa -0,06 MPa

Disponibilidade hídrica no solo (MPa)

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

C
o
n
d
u
tâ

n
ci
a 

es
to

m
át

ic
a 

(m
m

o
l/

m
2
/s

)

**

**



52 
 

 

Esses resultados indicam que as plantas de milho sob deficiência hídrica possuem 

um decréscimo da fotossíntese, devido à diminuição da condutância estomática, 

ocasionando o fechamento dos estômatos e a redução da transpiração (GRZESIAK et 

al., 2007; GHANNOUM, 2009). Decréscimos na fotossíntese e na condutância foram 

também observados por XU et al. (2009) em uma variedade de milho chinesa sob 

deficiência hídrica. Estudos de HUND et al. (2009) indicaram diferenças na tolerância de 

híbridos de milho ao estresse hídrico por meio da avaliação das taxas fotossintéticas e 

condutância estomática, contrariamente, neste estudo os híbridos apresentaram 

respostas semelhantes em ambas DHS, corroborando com MAGALHÃES et al. (2009) 

que caracterizaram linhagens de milho contrastantes à seca no estádio de florescimento 

através de parâmetros de trocas gasosas, e não verificaram diferenças significativas 

entre as linhagens sob estresse hídrico. 

O decréscimo na elongação foliar média foi semelhante para os dois híbridos 

(Figura 7). Contudo, houve diminuição significativa do crescimento do híbrido DKB 390 

sob limitação hídrica. Como o alongamento foliar depende da expansão celular, em 

déficit hídrico, há uma inibição da expansão celular. Há evidências que fatores como 

síntese da parede celular e de membranas, divisão celular e síntese protéica coordenam 

essa resposta (TAIZ & ZEIGER, 2010), corroborando com os resultados de SANTOS & 

CARLESSO (1998) que verificaram menor redução na expansão de folhas de milho em 

plantas cultivadas em solo de textura arenosa, submetidas a déficit hídrico. 

Os efeitos deletérios do estresse hídrico sobre o crescimento das plantas dos dois 

híbridos de milho foram detectados em todos os parâmetros analisados (Tabela 1). As 

características biométricas: altura, altura de inserção de espiga, diâmetro do colmo e 

massa seca total apresentaram diferenças quando as plantas foram submetidas à 

disponibilidade hídricas distintas. Conforme houve a supressão hídrica, a altura, a altura 

de inserção de espiga, o diâmetro do colmo e a massa seca total apresentaram 

reduções drásticas, aferindo redução no cresci