UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS ARARAQUARA INFLUÊNCIA DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS DAS PLACAS DE PEYER NA MODULAÇÃO DAS RESPOSTAS Th1/Th2 EM CAMUNDONGOS INFECTADOS COM Yersinia pseudotuberculosis ORIVALDO PEREIRA RAMOS ARARAQUARA 2009 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS ARARAQUARA INFLUÊNCIA DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS DAS PLACAS DE PEYER NA MODULAÇÃO DAS RESPOSTAS Th1/Th2 EM CAMUNDONGOS INFECTADOS COM Yersinia pseudotuberculosis ORIVALDO PEREIRA RAMOS ORIENTADORA: PROFª. DRª. BEATRIZ MARIA MACHADO DE MEDEIROS ARARAQUARA 2009 Tese apresentada ao Programa de Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP, Campus de Araraquara, como pré-requisito para a obtenção do título de Doutor. Ficha Catalográfica Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara Ramos, Orivaldo Pereira R175i Influência das células dendríticas das placas Peyer na modulação das respostas Th1/Th2 em camundongos infectados com Yersinia pseudotuberculosis. / Orivaldo Pereira Ramos. – Araraquara, 2009. 123 f. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia Orientador: Beatriz Maria Machado de Medeiros 1.Yersinia pseudotuberculois. 2. Células dendríticas. 3.Linfócitos. 4.Imunologia. I.Medeiros, Beatriz Maria Machado de, orient.. II.Título. CAPES: 40300005 COMISSÃO EXAMINADORA Profa. Dra. Beatriz Maria Machado de Medeiros (Orientador e Presidente) Profa. Dra. Maria Terezinha Serrão Peraçoli (Membro Titular) Profa. Dra. Iracilda Zeppone Carlos (Membro Titular) Profa. Dra. Cleni Mara Marzocchi Machado (Membro Titular) Profa. Dra. Fernanda de Freitas Aníbal (Membro Titular) Araraquara, janeiro de 2009. TRABALHO realizado no Laboratório de Imunologia Básica do Departamento de Ciências Biológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP – Araraquara - SP, com o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), através do auxílio à pesquisa Proc. nº 2007/00134-6. DEDICO esse trabalho aos meus pais, Geraldo e Nair, pelo amor e pelos nobres ensinamentos recebidos; Aos meus filhos, Guilherme e Leonardo, e a minha esposa Luciana, pelo amor e compreensão nos momentos de ausência. AGRADECIMENTOS A Deus pela presença constante em minha vida; À minha orientadora, Profa. Dra. Beatriz Maria Machado de Medeiros, pela orientação, auxílio constante e oportunidade de vivenciar a pesquisa, bem como pelo exemplo de dedicação profissional; Ao Prof. Dr. Francisco Carlos Nather pela amizade, incentivo e apoio constante na realização desse trabalho; À Profa. Dra. Celi Vasques Crepaldi pela amizade e pelo apoio recebido, sem o qual não seria possível a realização desse trabalho; À Profa. Dra. Maria Aparecida R. Lima Grande pela amizade e apoio na confecção desse trabalho; À Valeria Aparecida de Araújo Mallavolta por todo o auxílio técnico recebido, incentivo e pela amizade construída; Aos amigos e colegas de laboratório Aline Tansini, Luis Gustavo Silva Monnazzi e Juliana Silva Oliveira pelo auxilio técnico, companheirismo e amizade; Aos professores Jorge Luiz Naliati Nunes, Silvia Zucchi Bailão e Margarete Dolores Marson Sanches do Centro Universitário Barão de Mauá pelo auxílio nos momentos de dificuldade; Aos amigos Luiz Gustavo Borsetti Ballestero e Juliana Cristina Cordeiro, do Centro Universitário de Araraquara – UNIARA, pela amizade e auxílios recebidos; À biomédica Fabiana R. de Morais pelo auxílio técnico nas análises de citometria de fluxo; Aos professores, funcionários e amigos do curso de pós-graduação em Biociências e Biotecnologia aplicadas à Farmácia e do Departamento de Ciências Biológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP – Araraquara, pela amizade e serviços prestados; À FAPESP pelo auxílio financeiro; E a todos que direta e indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho. SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE FIGURAS RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................20 2. OBJETIVOS .......................................................................................................................31 3. MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................................32 3.1. Fluxograma de trabalho.................................................................................................32 3.2. Animais..........................................................................................................................33 3.3. Amostras Bacterianas ....................................................................................................33 3.4. Infecção experimental dos animais com as amostras de Y. pseudotuberculosis...........33 3.4.1. Reativação das amostras.........................................................................................33 3.4.2. Preparo do inóculo..................................................................................................34 3.4.3. Esquema de infecção ..............................................................................................34 3.5. Obtenção e análise das células dendríticas ....................................................................34 3.5.1. Obtenção e enriquecimento (Kadaoui e Corthésy, 2004).......................................34 3.5.2. Análise fenotípica através de citometria de fluxo (Pulendram et al., 2001)...........35 3.5.3. Análise das moléculas de superfície através de citometria de fluxo ......................35 3.5.4. Determinação da produção de citocinas por ELISA. .............................................36 3.5.5. Determinação da ativação de células T Ag-específicas..........................................37 3.5.5.1. Preparo do Antígeno de Yersinia – HKY (“Heat-killed Yersinia”) ................37 3.5.5.2. Imunização de camundongos com HKY para a obtenção dos linfócitos T antígeno-específicos .....................................................................................................37 3.5.5.3. Obtenção e enriquecimento dos linfócitos T ...................................................37 3.5.5.4. Ensaio de proliferação de células T.................................................................38 3.6. Quantificação das sub-populações de linfócitos T e determinação do padrão de citocinas Th1 e Th2 através de citometria de fluxo (Morita et al., 1998) ............................39 3.6.1. Obtenção das células das placas de Peyer ..............................................................39 3.6.2. Análise fenotípica dos linfócitos das placas de Peyer ............................................39 3.6.3. Detecção das citocinas intracelulares IL-2, IFN-�, IL-4 e IL-10............................40 3.7. Análise estatística ..........................................................................................................41 4. RESULTADOS ...................................................................................................................42 4.1. Análise fenotípica das células dendríticas .....................................................................42 4.2. Análise das moléculas de superfície das células dendríticas.........................................47 4.3. Determinação das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e TNF-� no sobrenadante de cultura de células dendríticas............................................................................................................52 4.4. Determinação da ativação de células T Ag-específicas.................................................65 4.5. Análise fenotípica dos linfócitos T das placas de Peyer................................................68 4.6. Detecção das citocinas intracelulares IL-2, IL-4, IL-10 e IFN-� dos linfócitos das placas de Peyer .....................................................................................................................73 5. DISCUSSÃO .......................................................................................................................91 6. CONCLUSÕES.................................................................................................................102 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................................104 8. ANEXOS ...........................................................................................................................123 8.1. Parecer n° 07/2006 – Comitê de Ética em Pesquisa....................................................123 LISTA DE ABREVIATURAS AEP - Asparagina Endopeptidase APC – Célula Apresentadora de Antígeno BAB – “Blood Agar Base” BSA – “Bovine Serum Albumin” CD – “Cluster of Differentiation” CFSE – “Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl Ester” DC – Célula Dendrítica DN – Duplo Negativa DO – Densidade Óptica EDTA – “Ethylenediamine Tetracetic Acid” ELISA – "Enzyme Linked Immunosorbent Assay" FA – Adesão focal FACS – “Fluorescence-Activated Cell Sorting” FAE – Epitélio Intestinal Associado ao Folículo FITC – Isotiocianato de fluoresceína FPB – Proteína Ligante de Fyn HEPES – "N 2 Hydroxyethylpiperazine N' 2 ethane sulfonic acid" HKY – “Heat-Killed Yersinia” IDC – Célula Dendrítica Intersticial IFN-� – Interferon-gama IFR - Região Interfolicular IL – Interleucina iNOS – “Inducible NO Synthase” IP – Índice de Proliferação kb – Quilobase kDa – Quilodalton LC – Célula de Langerhan LcrV – Antígeno V LPS – Lipopolissacarídeo LT – Linfócito T MAPK – “Mitogen-Activated Protein Kinases” MHC – “Major Histocompatibility Complex” MLN – Linfonodos Mesentéricos moDC – Célula Dendrítica Derivada de Monócito NF-�B – “Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells” NK – "Natural Killer" nm - Nanômetro NO – Óxido Nítrico PAMP – Padrão Molecular Associado ao Patógeno PBS – “Phosphate Buffered Saline” PE – Ficoeritrina pg – Picogramas pi – Pós infecção PMA – Forbol Miristato Acetato PP – Placa de Peyer PRR – “Pattern Recognition Receptor” pYV – Plasmídeo Yop Virulon RMIF – Razão das Medianas de Intensidade de Fluorescência SD – Desvio padrão SED – Dome Subepitelial SFB – Soro Fetal Bovino SPF – “Specif Pathogen Free” SPRD – “Spectral red” TCR – Receptor de células T TLR – “Toll Like Receptor” TMB – Tetrametilbenzidina TNF-� – Fator de Necrose Tumoral-alfa TSB – “Tripic Soy Broth” TTSS – Sistema de Secreção do Tipo III UFC – Unidades Formadoras de Colônia Yop – “Yersinia Outer Protein” YpkA – “Yersinia protein kinase A” LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Número absoluto e percentual de células dendríticas (CD11c+) e das subpopulações CD11c+C11b+ e CD11c+CD8�+ das placas de Peyer dos animais infectados e controles no decorrer da infecção com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis........ 44 Tabela 2 – Percentual de células dendríticas CD11c+I-A/I-E+, CD11c+CD80+, CD11c+CD86+ e CD11c+CD54+ das placas de Peyer dos animais infectados e controles no decorrer da infecção com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis................................................ 49 Tabela 3 – Produção de IL-4 por células dendríticas das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 durante infecção com Y. pseudotuberculosis e grupo controle .............. 54 Tabela 4 – Produção de IL-10 por células dendríticas das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 durante infecção com Y. pseudotuberculosis e grupo controle .............. 57 Tabela 5 – Produção de IL-12 por células dendríticas das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 durante infecção com Y. pseudotuberculosis e grupo controle .............. 60 Tabela 6 – Produção de TNF-� por células dendríticas das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 durante infecção com Y. pseudotuberculosis e grupo controle .............. 63 Tabela 7 – Análise da capacidade de apresentação de antígenos das células dendríticas das placas de Peyer através da determinação da proliferação de células T CD4+ .......................... 65 Tabela 8 – Número absoluto de linfócitos T e das subpopulações CD3+CD4+ e CD3+CD8+ das placas de Peyer dos animais infectados e controles no decorrer da infecção com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis .......................................................................... 70 Tabela 9 – Detecção intracelular da citocina IL-2 nos LT-CD4 e CD8 das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis ................................................................................................................... 75 Tabela 10 – Detecção intracelular da citocina IL-4 nos LT-CD4 e CD8 das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis ................................................................................................................... 79 Tabela 11 – Detecção intracelular da citocina IL-10 nos LT-CD4 e CD8 das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis ................................................................................................................... 83 Tabela 12 – Detecção intracelular da citocina IFN-� nos LT-CD4 e CD8 das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 infectados com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis ................................................................................................................... 88 LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Número de células dendríticas (CD11c+) (A) e subpopulações CD11c+CD11b+ (B) e CD11c+CD8�+ (C) de camundongos BALB/c e C57BL/6 infectados com as amostras YpIII pIB1 e YpIII nos diferentes dias pós-infecção ......................................................................... 45 Figura 2 – Principais alterações ocorridas no número de células dendríticas (CD11c+) e subpopulações CD11c+CD11b+ e CD11c+CD8�+ durante as infecções de camundongos BALB/c e C57BL/6 com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis .............. 46 Figura 3 – Percentual de células dendríticas expressando moléculas de MHC II (I-A/I-E) (A), B7.1 (CD80) (B), B7.2 (CD86) (C) e ICAM-1 (CD54) (D) de camundongos BALB/c e C57BL/6 infectados com as amostras YpIII pIB1 e YpIII nos diferentes dias pós-infecção... 50 Figura 4 – Principais alterações ocorridas no número de células dendríticas quanto à expressão de moléculas de MHC II, B7.1, B7.2 e ICAM-1 durante as infecções de camundongos BALB/c e C57BL/6 com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis ................................................................................................................... 51 Figura 5 – Concentrações de IL-4 em sobrenadantes de culturas de células dendríticas das placas de Peyer dos camundongos BALB/c e C57BL/6 durante as infecções com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis........................................................................... 55 Figura 6 – Concentrações de IL-10 em sobrenadantes de culturas de células dendríticas das placas de Peyer dos camundongos BALB/c e C57BL/6 durante as infecções com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis........................................................................... 58 Figura 7 – Concentrações de IL-12 em sobrenadantes de culturas de células dendríticas das placas de Peyer dos camundongos BALB/c e C57BL/6 durante as infecções com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis..........................................................................................61 Figura 8 – Concentrações de TNF-� em sobrenadantes de culturas de células dendríticas das placas de Peyer dos camundongos BALB/c e C57BL/6 durante as infecções com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis........................................................................... 64 Figura 9 – Influência da infecção por Y. pseudotuberculosis com as amostras YpIII pIB1 e YpIII sobre a capacidade de células dendríticas estimularem a proliferação de células T CD4+ em camundongos BALB/c (A) e C57BL/6 (B) ........................................................................ 67 Figura 10 – Quantificação dos linfócitos T (LT) e subpopulações, LT-CD4 e LT-CD8, durante as infecções com as amostras YpIII pIB1 e YpIII. Camundongos BALB/c (A e B) e C57BL/6 (C e D) foram sacrificados no 1°, 3° e 5° dias após a infecção e os LT das placas de Peyer e suas subpopulações quantificadas através de citometria de fluxo............................... 71 Figura 11 – Principais alterações ocorridas no número de linfócitos T CD4 e CD8 durante as infecções com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis em camundongos BALB/c e C57BL/6.................................................................................................................. 72 Figura 12 – Cinética da produção de citocina IL-2 pelos LT-CD4 (A e B) e CD8 (C e D) das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 após infecção intragástrica com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis ........................................................... 76 Figura 13 – Principais alterações da produção de IL-2 pelos LT-CD4 e CD8 das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 após infecção intragástrica com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis........................................................................... 77 Figura 14 – Cinética da produção de citocina IL-4 pelos LT-CD4 (A e B) e CD8 (C e D) das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 após infecção intragástrica com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis ........................................................... 80 Figura 15 – Principais alterações da produção de IL-4 pelos LT-CD4 e CD8 das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 após infecção intragástrica com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis........................................................................... 81 Figura 16 – Cinética da produção de citocina IL-10 pelos LT-CD4 (A e B) e CD8 (C e D) das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 após infecção intragástrica com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis ........................................................... 84 Figura 17 – Principais alterações da produção de IL-10 pelos LT-CD4 e CD8 das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 após infecção intragástrica com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis........................................................................... 85 Figura 18 – Cinética da produção de citocina IFN-� pelos LT-CD4 (A e B) e CD8 (C e D) das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 após infecção intragástrica com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis ........................................................... 89 Figura 19 – Principais alterações da produção de IFN-� pelos LT-CD4 e CD8 das placas de Peyer de camundongos BALB/c e C57BL/6 após infecção intragástrica com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis........................................................................... 90 RESUMO Yersinia pseudotuberculosis e Y. enterocolitica são patógenos que causam desordens gastrintestinais. Estudos utilizando infecção in vitro demonstraram que Y. enterocolitica pode ter como alvo as células dendríticas (DCs), afetando várias de suas funções, incluindo sua maturação e produção de citocinas, e, conseqüentemente, contribuindo para a diminuição da ativação de células T CD4+. O objetivo deste estudo foi investigar o papel das células dendríticas das placas de Peyer (PP) na determinação do padrão de resposta imune, Th1 e Th2, durante a infecção por via intragástrica de camundongos suscetíveis (BALB/c) e resistentes (C57BL/6) com a amostra virulenta de Y. pseudotuberculosis (YpIII pIB1 – Yp+) ou seu par isogênico, curado do plasmídeo de virulência (YpIII – Yp-). As DCs das PP foram obtidas no 1°, 3° e 5° dia pós-infecção, quantificadas e analisadas quanto às suas sub- populações, expressões de moléculas de superfície e capacidade imunoestimulatória por citometria de fluxo, e quanto à secreção de citocinas (IL-4, IL-10, IL-12 e TNF-�) por ELISA. Os linfócitos das PP também foram obtidos no mesmo período e tiveram suas sub-populações e o padrão de citocinas intracelulares Th1/Th2 (IL-2, IL-4, IL-10 e IFN-�) analisado por citometria de fluxo. A infecção por Yp+ reduziu o número de DCs no 1° dia pós-infecção e aumentou, no período inicial, a expressão de B7.1 e B7.2 nos camundongos BALB/c. Nos camundongos C57BL/6 reduziu o número de DCs durante todo o período analisado, aumentou a expressão de B7.1 e B7.2 no período inicial e a expressão de ICAM-1. A infecção por ambas as amostras provocou redução da sub-população CD8�+ e da expressão de MHC II nas duas linhagens de animais, aumentou a sub-população CD11b+ nos animais suscetíveis e diminuiu nos animais resistentes. Os animais estudados não apresentaram diferenças importantes quanto à secreção de citocinas pelas DCs de PP e ambos tiveram aumentos das citocinas pesquisadas durante a infecção pelas amostras bacterianas. A amostra virulenta aumentou a capacidade das DCs de PP dos animais C57BL/6 em induzir a ativação dos linfócitos T antígeno-específicos. Os camundongos C57BL/6 apresentaram reduções no número de LT e na produção das citocinas intracelulares durante a infecção por ambas as amostras, quando comparados aos animais controles. Os camundongos BALB/c, por sua vez, apresentaram uma maior relação LT-CD4/LT-CD8 e maior produção de citocinas intracelulares nos LT. Esses resultados demonstraram que a infecção pela amostra virulenta levou à maturação inicial das DCs de PP nos camundongos BALB/c e C57BL/6 e aumentou a capacidade das DCs de PP dos animais C57BL/6 em induzir a ativação dos linfócitos T antígeno-específicos. Também demonstrou que a existência de um número maior de DCs da sub-população CD11b+ parece ser determinante do padrão de resistência dos camundongos C57BL/6. De um modo geral, os resultados obtidos quanto à produção das citocinas intracelulares presentes nos linfócitos T das PP demonstraram não haver uma polarização da resposta para nenhum dos perfis (Th1 ou Th2) durante a infecção com Yersinia pseudotuberculosis. Além disso, confirmaram uma maior produção de citocinas antagonistas pelos camundongos BALB/c e, ainda, os resultados obtidos com a amostra Yp- mostraram que outros fatores de virulência, além das Yops, interferem na produção e secreção das citocinas. Palavras chaves: Yersinia pseudotuberculosis, células dendríticas, linfócitos T, placas de Peyer, citocinas, ativação de célula T ABSTRACT Yersinia pseudotuberculosis and Y. enterocolitica are pathogens that cause gastrointestinal disorders. Studies using in vitro infection demonstrated that Y. enterocolitica can have as a target dendritic cells (DCs), affecting several of its functions, including their maturation and production of cytokines, and, consequently, contributing to the diminished activation of the T CD4+ cells. The aim of this study was to investigate the role of dendritic cell from Peyer’s patches (PP) in determining of immune response pattern, Th1 and Th2, during infection by the intragastric route in susceptible (BALB/c) and resistant (C57BL/6) mice with a virulent sample of Yersinia pseudotuberculosis (YpIII pIB1 – Yp+) or its isogenic pair, cured of the virulence plasmid (YpIII – Yp-). The PP DCs were obtained on the 1st, 3rd and 5th days post- infection, quantified and analyzed as far as their subpopulations, expressions of surface molecules and immunostimulatory capacity by flow cytometry, and the cytokines secretion (IL-4, IL-10, IL-12 and TNF-�) by ELISA. The PP lymphocytes were also obtained in the same period, and had their subpopulations and the pattern of intracellular Th1/Th2 cytokines (IL-2, IL-4, IL-10 and IFN-γ) analysed by flow cytometry. The infection by Yp+ reduced the number of DCs on the 1st day post-infection and increased, in the initial period, the expression of B7.1 and B7.2 in BALB/c. In C57BL/6 mice reduced the number of DCs throughout the study period, increased the expression of B7.1 and B7.2 in the initial period and the expression of ICAM-1. The infection by both samples reduced CD8�+ subpopulation and expression of MHC II in both animals, increased CD11b+ sub-population in susceptible animals and reduced the same sub-population in resistant animals. The studied animals did not present important differences as far as secretion of cytokines by the DCs of PP and both had increases of the researched cytokines during the infection by bacterial samples. The virulent sample increased the capacity of DCs from PP of the C57BL/6 animals to induce the activation of antigen-specific T lymphocytes. The C57BL/6 mice showed reductions in the number of T lymphocytes and in the production of intracellular cytokines during infection by both samples, when compared to control animals. The BALB/c mice showed a higher relation of LT-CD4/LT-CD8 and a higher production of intracellular cytokines in the T lymphocytes. These results demonstrated that infection by virulent sample let to the initial maturation of DCs in the PP of the BALB/c and C57BL/6 mice and increased the capacity of DCs from PP of the C57BL/6 animals to induce activation of antigen-specific T lymphocytes. Also showed that a larger number of CD11b+ subpopulation appears to be determinant of the resistance pattern of the C57BL/6 mice. Overall, the results on the production of intracellular cytokines in T lymphocytes of PP demonstrated that there is not a polarized response for any of the profiles (Th1 or Th2) during infection with Y. pseudotuberculosis. Moreover, confirmed the larger production of antagonists cytokines by BALB/c mice, and the results obtained with the Yp- sample showed that other virulence factors, in addition to the Yops, interfere in the production and secretion of cytokines. Keywords: Yersinia pseudotuberculosis, Dendritic cells, T lymphocytes, Peyer’s patch, cytokines, T-cell activation 20 1. INTRODUÇÃO Bactérias do gênero Yersinia fazem parte da família Enterobacteriaceae e compreendem 11 espécies. São coco-bacilos Gram-negativos, não esporulados, não encapsulados, oxidase-negativos, anaeróbios facultativos que fermentam a glicose e predominantemente extracelulares (ROSQVIST et al., 1988; SIMONET et al., 1990). Y. pestis, Y. pseudotuberculosis e alguns sorogrupos de Y. enterocolitica são agentes causadores de doenças em alguns animais e no homem. Já as demais espécies e sorogrupos de Y. enterocolitica são microrganismos ambientais ou patógenos oportunistas (BRUBAKER, 1991). Y. pestis é o patógeno responsável pelo desenvolvimento da peste bulbônica, uma doença sistêmica fatal, causada tanto pelo contato com roedores infectados ou suas pulgas, como pelo contato com o indivíduo doente (CARNIEL, 2002). Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica são enteropatógenos causadores de desordens gastrintestinais. As infecções por esses microrganismos são causadas pela ingestão de água ou alimentos contaminados, e desencadeiam enterite e linfadenite, geralmente autolimitadas no homem (BOTTONE, 1997). Apesar das diferentes formas de invasão do hospedeiro e da severidade de suas doenças, as três espécies apresentam, em comum, o tropismo pelo tecido linfóide (BRUBAKER, 1991). Além disso, a Yersinia apresenta uma notável capacidade de resistir à resposta imune primária do hospedeiro (NEUTRA et al., 1996) e é capaz de invadir os tecidos através de interações com as mucosas (BOTTONE, 1997). No intestino delgado os microrganismos invadem a barreira intestinal passando através das células M, células especializadas do epitélio associado ao folículo (FAE) que atuam na captura de antígenos. Depois de poucas horas após a infecção oral, a Yersinia é encontrada dentro das células M (HANSKI et al., 1989; GRUTZKAU et al., 1990; AUTENRIETH e FIRSHING, 1996). Após a invasão do epitélio intestinal, a bactéria replica dentro dos folículos linfóides conhecidos como placas de Peyer (PP) e também se espalha para os linfonodos mesentéricos (MLN), desencadeando uma linfadenite mesentérica. As cepas virulentas proliferam no tecido linfóide associado ao intestino e lâmina própria, onde causam destruição tecidual localizada, levando à formação de microabscessos (ROBINS-BROWNE et al., 1985; TZIPORI et al., 1987). Yersinia também pode disseminar-se através da lâmina própria para as vilosidades adjacentes e através da linfa para sítios mais remotos. Y. pseudotuberculosis pode ganhar a corrente sanguínea e causar septicemia, sendo este fato de ocorrência mais rara em humanos. 21 Em indivíduos com hemocromatose e imunodeprimidos, ela pode disseminar-se sistemicamente e ser fatal em 70% dos casos (ABBOTT et al., 1986). Em roedores pode disseminar-se do trato intestinal para o baço, o fígado e os pulmões (PUJOL e BLISKA, 2005). Assim como outras enterobactérias, a Yersinia apresenta vários fatores de virulência que contribuem para a sua evasão dos mecanismos de defesa do hospedeiro, sua sobrevivência e disseminação no organismo. Esses fatores de virulência codificados por genes cromossomais (inv, ail, yst, irp2 e myf) e por genes plasmideais (yadA e yop) promovem sua invasão e paralisam especialmente as funções do sistema complemento e da fagocitose (WUORELA e GRANFORS, 1998; CARNIEL, 2002). As três espécies patogênicas de Yersinia possuem um plasmídeo de virulência de 70- kb, altamente homólogo, chamado pIB1 em Y. pseudotuberculosis, pYV em Y. enterocolitica e pCD1 em Y. pestis (PORTNOY et al., 1981). Estes plasmídeos são importantes fatores de virulência dessas espécies, uma vez que codificam proteínas estruturais (“Yop secretion” - Ysc), reguladoras (“Low calcium response” - Lcr) e efetoras (“Yersinia outer proteins” - Yops) de um sistema de secreção do tipo III (TTSS). Este sistema de secreção, presente nesses microrganismos, permite à Yersinia secretar e translocar as Yops para dentro das células do hospedeiro (CORNELIS, 2002). No interior da célula do hospedeiro, as Yops efetoras interferem com as vias de sinalização envolvidas na regulação do citoesqueleto de actina, fagocitose, apoptose e resposta inflamatória (NAVARRO et al., 2005). Além do TTSS e das Yops, este plasmídeo codifica, ainda, a proteína YadA e o antígeno V (LcrV) (PERRY e FETHERSTON, 1997; CORNELIS et al, 1998). A proteína YadA é uma adesina não fimbrial que possui, além da função na adesão celular, a capacidade de proteger o patógeno contra a resposta imune humoral, bem como contra defensinas e lise por proteínas do sistema complemento (HEESEMANN et al., 2006). O LcrV é secretado no meio extracelular, onde atua inibindo a inflamação através da interação com o receptor Toll-like do tipo 2 (TLR-2), suprimindo as produções de fator de necrose tumoral-� (TNF-�) e interferon-� (IFN-�), e induzindo a produção de interleucina-10 (IL-10) (BRUBAKER, 2003) As Yops constituem um conjunto de 11 proteínas que desempenham a principal função na virulência da Yersinia, que é a de inibir a resposta imune do hospedeiro. Elas possibilitam à bactéria evadir-se da fagocitose e morte por neutrófilos e macrófagos, inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias e desencadear a apoptose de fagócitos (HARTLAND e ROBINS-BROWNE, 1998; CORNELIS, 2002; TRÜLZSCH et al., 2005). Essas proteínas 22 são sintetizadas apenas em meio deficiente de cálcio e na fase exponencial de crescimento a 37°C, sendo, portanto, reguladas por estímulos extracelulares de cálcio e de temperatura (HOLMSTRÖM et al., 1995; BOTTONE, 1997). Enquanto algumas Yops possuem ações efetoras dentro da célula hospedeira, outras, como a YopB e YopD, são secretadas no meio extracelular e têm como função translocar as efetoras para o interior das células eucarióticas. Acredita-se que, pelo menos, seis proteínas efetoras sejam ativas na célula do hospedeiro: YopH, YopE, YopJ (chamada de YopP em Y. enterocolitica), YpkA (chamada de YopO em Y. enterocolitica), YopM e YopT (CORNELIS e WOLF-WATZ, 1997; CORNELIS et al., 1998; NAVARRO et al., 2005). A atividade de YopE, uma proteína de 25 kDa, está associada com a despolimerização do citoesqueleto da célula do hospedeiro, o que dificulta, portanto, a fagocitose da bactéria (ROSQVIST et al., 1991). As funções de YopT (35,5 kDa) não são muito claras, porém, tem sido demonstrado que elas são semelhantes às da YopE (IRIARTE e CORNELIS, 1998; CORNELIS, 2002). A YopE e a YopT podem afetar diferentes vias de sinalização celular a fim de potencializar o efeito citotóxico da bactéria e assegurar a sobrevivência do patógeno no tecido linfóide (JURIS et al., 2002). A YopH é uma tirosina fosfatase com 51 kDa que desfosforiliza a p130Cas, a p125FAK, a paxilina e a proteína ligante de Fyn (FBP), todas elas proteínas tirosina-fosforiladas encontradas nos complexos de adesão focal (FA). A atividade de YopH parece causar uma desunião nesses complexos, diminuindo a entrada da bactéria nas células HeLa ou a sua fagocitose por macrófagos; além disso, também inibe o “burst” oxidativo (BLACK e BLISKA, 1997; PERSSON et al., 1997; BLACK et al., 1998; HAMID et al., 1999). Ainda, a YopH pode funcionar cooperativamente com a YopE na inibição da fagocitose por neutrófilos (RUCKDESCHEL et al., 1996). Sauvonnet et al. (2002a) mostraram a possível atuação da YopH na inativação da via do fosfatidilinositol-3 quinase com a conseqüente supressão, nos macrófagos, da expressão da proteína 1 quimioatraente de monócitos (MCP-1) e da proliferação de células T. Alonso et al. (2004) mostraram que a YopH inibe a sinalização pelo receptor de células T (TCR), promovendo a desfosforilação de Lck na posição Tyr-394 e, conseqüentemente, paralisando as células T e inibindo o desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa. A YpkA (“Yersinia protein kinase A”) é outra Yop com 81 kDa, que mostra extensa homologia com proteínas eucarióticas, mais propriamente com a família PSK das proteínas serina/treonina quinases. Ela se autofosforila e, assim como a Yop H, interfere com a 23 transdução de sinais nas células do hospedeiro por alterar os níveis celulares de fosforilação (GALIOV et al., 1993; HAKANSSON et al., 1996; HARTLAND & ROBINS-BROWNE, 1998). Dentro da célula do hospedeiro interage com a actina, podendo causar mudanças e rompimento do citoesqueleto, o que pode prejudicar a fagocitose da Yersinia por macrófagos e, também, a movimentação desses para as áreas de infecção (JURIS et al., 2002). A função da proteína YopM (41 kDa), mesmo que ainda permaneça pouco conhecida, tem se mostrado essencial para a virulência em modelos murinos de infecção (EVDOKIMOV et al., 2001; LEUNG et al., 1990). Recentemente, verificou-se que ela se liga e promove a atividade quinase da proteína quinase C2-like e da proteína quinase-1 ribossomal S6 (McDONALD et al., 2003), o que poderia explicar o seu efeito sobre a expressão de genes envolvidos na progressão do ciclo celular e crescimento celular (SAUVONNET et al., 2002b), modulando a expressão gênica do hospedeiro em benefício do patógeno (SKRZYPEK et al., 2003). A YopJ (32,5 kDa) é a Yop efetora que possui funções antiinflamatórias mais importantes, além de ser responsável pela indução de apoptose em macrófagos in vitro e in vivo (MILLS et al., 1997; MONACK et al., 1997; MONACK et al., 1998). Estudos têm sugerido que a mesma pode ser capaz de inibir a produção de citocinas TNF-� e IL-8 (SCHESSER et al., 1998; BOLAND e CORNELIS, 1998; PALMER et al., 1998) e que este fato resulta, provavelmente, do rompimento da ativação das vias de sinalização MAPK e NF- �B (JURIS et al., 2002). A apoptose de macrófagos causada pela YopJ, também resulta, muito provavelmente, da inativação do NF-�B (PAGLIARI et al., 2000). A mesma pode funcionar como uma cisteína protease e que pode ser uma protease ubiquitina-like, a qual tem sido envolvida na modulação de várias vias de sinalização de células eucarióticas (YEH et al, 2000). As proteínas codificadas pelos plasmídeos (pIB1, pYV e pCD1), ausentes nas cepas avirulentas, guiam a Yersinia patogênica através dos mecanismos de defesa do hospedeiro, permitindo que a mesma estabeleça seu nicho ecológico extracelularmente ou no interior de macrófagos (BOTTONE, 1997). Vários autores já sugeriram que as três espécies patogênicas de Yersinia podem sobreviver e replicar dentro de fagossomos de macrófagos e modificar as suas funções bactericidas. Pujol e Bliska (2005) verificaram que a sobrevivência e replicação de Yersinia em macrófagos parecem ser de grande importância nos estágios iniciais de colonização. Evidências de que a bactéria pode subverter as funções dos macrófagos foram demonstradas através da inibição da acidificação do fagossomo em infecções com Y. pseudotuberculosis, e 24 através da inibição da produção de óxido nítrico em infecções com Y. pseudotuberculosis e Y. pestis. Cepas virulentas de Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica são usualmente encontradas na forma de agregados bacterianos extracelulares, entre os abscessos, em tecidos linfóides de animais infectados por mais de 12 horas. Nos abscessos, a bactéria parece resistir eficientemente à fagocitose pelos neutrófilos (HANSKI et al., 1989; SIMONET et al., 1990) bem como induzir a apoptose de macrófagos (MONACK et al., 1997). Cepas curadas do plasmídeo de virulência são capazes de colonizar transitoriamente os linfonodos mesentéricos e os baços dos animais, entre uma a 48 horas após a infecção oral. Entretanto, isolados de Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica são contidos em granulomas e são eliminados (ROBINS-BROWNE et al., 1985; LIAN et al., 1987). Balada-Liasat e Mecsas (2006) verificaram a importância do plasmídeo de virulência de Y. pseudotuberculosis na colonização de vários tecidos após inoculação intragástrica em camundongos. Utilizando quatro mutantes para o sistema de secreção do tipo III (TTSS) (yscBL, yscNU, yscBU e pIB1-), inoculados em camundongos BALB/c, foram analisados os níveis de colonização e comparados ao da cepa isogênica selvagem, YpIII pIB1, a mesma utilizada neste trabalho. No 2° dia após a inoculação, os níveis de colonização das cepas mutantes no trato gastrointestinal, placas de Peyer e linfonodos cecais foram severamente atenuados. Nos linfonodos mesentéricos, os níveis de colonização foram similares entre as cepas mutantes e a selvagem, indicando que o TTSS não era necessário para a colonização desse órgão. No 5° dia, uma deficiente colonização das cepas mutantes foi evidenciada no trato gastrintestinal e baço, entretanto, nos linfonodos mesentéricos, placas de Peyer e linfonodos cecais foram similares ao da cepa selvagem e, em alguns casos, mais altos. Barnes et al. (2006) demonstraram que as colonizações do baço e do fígado podem ocorrer antes da replicação nos tecidos linfóides intestinais, indicando que a infecção hepatoesplênica não requer, necessariamente, a disseminação prévia da bactéria para as PP e os MLN. Experimentos com camundongos infectados com diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis, selvagem e mutantes com deleção no gene para produção de YopH e YopE, reafirmaram a capacidade do microrganismo de produzir infecção em sítios sistêmicos. Entretanto, os resultados mostraram que as cepas mutantes não foram capazes de colonizar o baço e fígado, ou seja, de promover infecção sistêmica, sugerindo a importância desses fatores de virulência na disseminação do patógeno e evasão da resposta imune do hospedeiro (LOGSDON e MECSAS, 2006). 25 Os mecanismos moduladores de Yersinia sobre a resposta imune inata e adaptativa ainda não estão totalmente esclarecidos. Uma resposta imune celular eficiente, controlada por diferentes tipos celulares e suas respectivas citocinas, é necessária para superar a infecção por Yersinia (AUTENRIETH et al., 1992; AUTENRIETH et al., 1994; BOHN et al., 1994; BOHN e AUTENRIETH, 1996; ZHAO et al., 2000). O controle da infecção por Yersinia enteropatogênica inicia-se com a primeira linha de defesa do sistema imune, envolvendo recrutamento de leucócitos polimorfonucleares, macrófagos e células NK (LIAN et al., 1987; AUTENRIETH et al., 1996; KERSCHEN et al., 2004). Subseqüentemente, uma importante resposta imune adaptativa é requerida para combater a infecção (VOGEL et al., 1993; IGWE et al., 1999), sendo que a sua resolução está associada à ativação de células Th1 (AUTENRIETH e HEESEMANN, 1992; AUTENRIETH et al., 1996). Citocinas pró-inflamatórias fator de necrose tumoral-� (TNF-�), interferon-� (IFN-�) e interleucina-12 (IL-12) parecem ser de grande importância durante a resposta imune contra Yersinia. A neutralização dessas citocinas foi capaz de eliminar a resistência a este patógeno, sugerindo que macrófagos ativados por células T são importantes células efetoras na resposta protetora à Yersinia (AUTENRIETH e HEESEMAN, 1992; BOHN et al., 1994; BOHN e AUTENRIETH, 1996). Um balanço entre as citocinas Th1 e Th2 pode influenciar o curso da infecção por Yersinia, principalmente na fase inicial da resposta imune do hospedeiro (ZHAO et al., 2000). As células Th1 secretam IFN-�, TNF-� e interleucina-2 (IL-2), citocinas importantes na promoção da imunidade mediada por células e necessárias para uma resposta efetiva contra bactérias intracelulares. As células Th2 secretam interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6) e interleucina-13 (IL-13), citocinas responsáveis pela indução da resposta imune humoral, resultando na ativação de linfócitos B e conseqüente produção de anticorpos. As respostas Th1 são essenciais para a eliminação da bactéria, ao passo que as Th2 estão associadas com a suscetibilidade e disseminação da infecção (YIN et al., 1997; HERMANN-MÄRKER e HÖHLER, 1998). A ativação mediada por receptor de antígeno na célula B e T pode sofrer interferência por Yersinia pseudotuberculosis e os efeitos inibitórios sobre os linfócitos são dependentes da produção de YopH. Quando as células T foram expostas transitoriamente à Yersinia, tornaram-se incapazes de influxionar cálcio e produzir citocinas. As células B primárias foram incapazes de regular positivamente a molécula co-estimuladora, B7.2, em resposta ao 26 estímulo antigênico. Esses resultados demonstraram que as respostas imunes mediadas por células T e B podem ser imensamente afetadas durante a infecção (YAO et al., 1999). O modelo murino de yersiniose estabelecido por Carter e Collins (1975) é, ainda, o mais conveniente e mais amplamente usado para a investigação da interação da Yersinia com o hospedeiro, sob condições próximas àquelas ocorridas no homem. Linfócitos T de diferentes linhagens de camundongos apresentam uma tendência a produzir diferentes perfis de citocinas Th1 e Th2 (HSIEH et al., 1995). Células TCD4+ de camundongos C57BL/6 expressam altos níveis de mRNA do IFN-� e níveis não-detectáveis de mRNA da IL-4, ao passo que células TCD4+ de camundongos BALB/c expressam níveis elevados de mRNA da IL-4 e muito pouco mRNA do IFN- � (HEINZEL et al., 1989; HEINZEL et al., 1991). A administração de IFN-�, IL-12 ou anticorpos anti-IL-4 tornam os camundongos BALB/c resistentes à Yersinia. Níveis elevados de IFN-�, predominantemente dependentes de IL-12, produzidos por células T CD4+ e células NK de camundongos C57BL/6, correlacionam-se com resistência contra Yersinia, comparados com os camundongos BALB/c (BOHN e AUTENRIETH, 1996). O IFN-� se apresenta como a principal citocina do perfil Th1, ao passo que a IL-4 se apresenta como a principal do perfil Th2, possuindo funções tanto indutoras como efetoras. O TNF-� atua em sinergismo com o IFN-� na ativação macrofágica (ROMAGNANI, 1994). As funções das citocinas Th2 na infecção por Yersinia precisam ser melhor investigadas (HEIN et al., 2000). Algumas citocinas, especialmente a IL-10, podem regular negativamente a resposta inflamatória. Durante a yersiniose em camundongos BALB/c, a IL-10 parece agir antagonicamente à IL-12 (BOHN e AUTENRIETH, 1996). O antígeno V (LcrV) de Y. pestis estimula a produção de IL-10, inibindo, assim, o processo inflamatório (BRUBAKER, 2003). Um estudo realizado anteriormente pelo nosso grupo, utilizando camundongos Swiss, sugeriu que as Yops secretadas por Y. pseudotuberculosis, principalmente a YopE e a YopH, possuem efeitos supressores sobre a produção de IL-12, TNF-� e NO pelos macrófagos (MONNAZZI et al., 2004). As células dendríticas (DCs) constituem um grupo de células apresentadoras de antígeno (APCs) derivado de progenitores hematopoiéticos com capacidade para interagir com linfócitos T e B e modular as suas respostas (SOUZA et al., 1999; ARDAVIN et al., 2001; KELLER, 2001). Tanto elas como seus precursores apresentam plasticidade funcional. Ao mesmo tempo em que podem atuar como uma primeira barreira contra a invasão e expansão viral através da liberação de IFNs do tipo I e como importantes integrantes da 27 resposta imune inata, podem atuar, também, apresentando antígenos às células T e funcionando como um membro do sistema imune adaptativo (KADOWAKI et al., 2000; FONTENEAU et al., 2003). Estão presentes em órgãos não linfóides, incluindo o epitélio (epiderme e mucosa), a derme e o interstício de órgãos vascularizados. Também são encontradas no sangue, na linfa e em todos os órgãos linfóides (INABA et al., 1986; LOMBARDI et al., 1993; SOUZA et al., 1999; ARDAVIN et al., 2001; KELLER, 2001). As células dendríticas humanas são leucócitos derivados de células progenitoras da medula óssea, originadas de 2 linhagens, mielóide e linfóide (BANCHEREAU et al., 2000; SHORTMAN e LIU, 2002). Células dendríticas derivadas de linhagens distintas diferem na sua distribuição tecidual, produção de citocinas e condições de crescimento (ADAMS et al., 2005). A linhagem mielóide, caracterizada por expressar CD11c e pouco CD123, dá origem às DCs convencionais ou “mielóides”, compostas por: células de Langerhans (LCs), células dendríticas intersticiais (IDCs) e células dendríticas derivadas de monócitos (moDCs) (SZABOLCS et al., 1996; GATTI et al., 2000). As moDCs podem ser encontradas em órgãos linfóides periféricos e na circulação sangüínea, onde produzem grandes quantidades de TNF- � em resposta a patógenos e outras causas de inflamação (ROSSI e YOUNG, 2005). As LCs e IDCs estão distribuídas em locais do organismo em que ocorre o primeiro encontro do antígeno com os mecanismos efetores do sistema imune. Assim, as LCs estão presentes na superfície epitelial da pele e mucosas, e as IDCs nos tecidos subpiteliais da derme e interstício de órgãos sólidos (ROSSI e YOUNG, 2005). Células dendríticas “mielóides” são, ainda, subdivididas em sub-populações; porém, não foram claramente descritas as funções de cada sub-população (HEATH et al., 2004). No baço murino duas principais sub-populações de células dendríticas podem ser encontradas, a CD11c+CD8�+ e a CD11c+CD11b+. Nas PP são encontradas três sub- populações de DCs convencionais: a CD11c+CD11b+CD8�-, a CD11c+CD11b-CD8�+ e a CD11c+CD11b-CD8-�- (Duplo Negativo). As DCs que expressam a molécula CD11b se localizam na região do dome subepitelial (SED) das PP. As que expressam a molécula CD8� reside na região interfolicular (IFR), rica em células T. E a terceira sub-população, que não expressa CD11b nem CD8�, sendo denominada DC duplo negativa (DN), é encontrada no SED, IFR e no epitélio associado ao folículo (FAE) (SATO e IWASAKI, 2005). As DN são encontradas em maiores porcentagens nos órgãos linfóides das mucosas, tais como as PP (29%) e os linfonodos mesentéricos (30%). No baço e linfonodos periféricos (13%) constituem uma população menor e indistinta (IWASAKI e KELSALL, 2001). A sub- 28 população de DCs CD11b+ parece ser especializada no processamento de antígenos exógenos para apresentação em associação com moléculas do Complexo Principal de Histocompatiblidade de classe II (MHC II). As DCs CD8�+ são especializadas na captura de células mortas e exercem papel na resistência a certas infecções virais. Esta sub-população também tem sido associada ao mecanismo de apresentação cruzada, que é a capacidade de processar antígenos que não se replicam, para apresentação às células T através de moléculas de classe I (DUDZIAK et al., 2007). A linhagem linfóide, por sua vez, é precursora das células dendríticas plasmocitóides, reconhecidas por serem CD11c- e possuírem elevada expressão de CD123 (GROUARD et al., 1997). Células dendríticas plasmocitóides são células importantes na imunidade inata antiviral e na autoimunidade. Encontradas no sangue e órgãos linfóides são células produtoras de IFNs � e podem estar associadas às respostas imunes anti-tumorais (ADAMS et al., 2005). Células dendríticas utilizam diversos mecanismos para capturar os antígenos: fagocitose, endocitose, pinocitose e interação com receptores específicos. As proteínas dos antígenos são processadas em peptídeos e apresentadas na superfície celular ligadas às moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe I ou II, onde serão reconhecidas por células T antígeno-específicas (ADAMS et al., 2005). Antígenos adquiridos no ambiente extracelular são tipicamente processados e apresentados associados às moléculas de MHC de classe II, ao passo que moléculas de MHC de classe I associam-se a antígenos presentes no compartimento citosólico (GUERMONPREZ et al., 2003; HOUDE et al., 2003; ACKERMAN et al., 2005). Quando expostas aos produtos microbianos, as DCs sofrem maturação e migram para órgãos linfóides secundários, locais de ativação de células T (NIESS e REINECKER, 2006). O processo de maturação estimula numerosas propriedades imunogênicas das DCs, tais como expressão de moléculas co-estimuladoras, secreção de citocinas e apresentação de antígenos (SCANDELLA et al., 2002; MAILLIARD et al., 2004), que maximizam sua habilidade em induzir a ativação e proliferação de linfócitos T (GRANUCCI et al., 2005). Em contraste, na ausência de inflamação, as DCs mantêm-se no estágio imaturo, não sendo capazes de ativar efetivamente as células T, e promovendo a proliferação abortiva ou anergia dos linfócitos T, mecanismo responsável pela estabilidade da tolerância periférica (STEINMAN et al., 2003). Os produtos microbianos constituem uma forma fisiológica de ativação das DCs mielóides e plasmocitóides (JARROSSAY et al., 2001; KADOWAKI et al., 2001). As DCs expressam receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) que interagem com padrões moleculares associados aos patógenos, expressos por produtos microbianos e moléculas do 29 tecido hospedeiro lesado (ROSSI e YOUNG, 2005). Dentre esses receptores de reconhecimento estão os denominados “Toll-like Receptors” (TRL) (QI et al., 2003). Em humanos e camundongos, as distintas subpopulações de DCs expressam diferentes TLRs. As DCs plasmocitóides expressam exclusivamente TLR-7 e TLR-9 (KRUG et al., 2001), ao passo que as mielóides expressam TLR-1-6 e TLR-8 (LIU, 2005). A interação com diferentes ligantes de TLRs estimula a maturação das DCs e induz a secreção de citocinas, modulando o balanço Th1/Th2 de acordo com as interações microbianas (REIS e SOUSA et al., 1999; MOSER e MURPHY, 2000). Outro grupo de receptores de reconhecimento de padrões expressos por células dendríticas é constituído pelos receptores de lectina tipo C, os quais interagem com carboidratos de glicoproteínas de antígenos próprios e com alguns patógenos que exploram essa interação para evadir da ativação imune. Células dendríticas residentes ou não ativadas expressam estes receptores, ao passo que células dendríticas ativadas e maduras têm baixa expressão de receptores de lectina tipo C (EBNER et al., 2004). Desse modo, TLRs e receptores de lectina tipo C trabalham para balancear tolerância imunológica e ativação celular (HAWIGER et al., 2001; LIU et al., 2002). Após a ativação da resposta imune celular e/ou humoral, T-dependente ou independente, a população de células dendríticas sofre uma redução significativa em sua quantidade, desencadeada, provavelmente, por apoptose (HART, 1997; McLELLAN e KÄMPGEN, 2000; KELLER, 2001). Estudos prévios demonstraram que Y. enterocolitica também pode ter as DCs como alvo (SCHOPPET et al., 2000). Estes autores demonstraram que embora infecção in vitro de DCs humanas com Y. enterocolitica não resulte na morte das DCs, uma regulação negativa transitória das moléculas de classe II do MHC e de moléculas CD80 foi observada e acompanhada por uma capacidade diminuída de ativação de célula T. Erfuth et al. (2004), utilizando um modelo de infecção in vitro, demonstraram que Y. enterocolitica pode afetar várias funções importantes de DCs de camundongos, incluindo maturação e a produção de citocinas. Foi demonstrado que YopP de Y. enterocolitica também induz morte celular de DCs murinas, incluindo mecanismos dependentes e independentes de caspase (ERFUTH et al., 2004; GRÖBNER et al., 2006). YopP previne a sensibilização de linfócitos T CD4+ e CD8+ muito provavelmente atuando sobre as DCs (ERFUTH et al., 2004; TRÜLZSCH et al., 2005). Kramer e Wiedig (2005) verificaram que Y. enterocolitica diminui o processamento de antígenos pelas células dendríticas e que este efeito é provocado, principalmente, pela YopP. 30 Estudos adicionais são necessários para esclarecer os mecanismos através dos quais as DCs atuam sobre os linfócitos T na yersiniose. Também é necessário investigar se as mudanças nas DCs induzidas por Yersinia também são observadas in vivo, isto é, após a infecção de camundongos com amostras patogênicas de Yersinia. Além disso, a maioria dos trabalhos realizados utilizou células dendríticas derivadas de medula óssea. Estas células podem não exibir as mesmas características funcionais e grau de maturação das células derivadas de baço ou das placas de Peyer. Diante do conhecimento de que tanto os tipos de DCs quanto os sinais de ativação a que as mesmas são expostas são importantes para o direcionamento do padrão de resposta Th1 ou Th2, o presente trabalho objetivou verificar a importância das DCs na determinação do padrão de resposta imune durante a infecção por via intragástrica de camundongos susceptíveis (BALB/c) e resistentes (C57BL/6) com Y. pseudotuberculosis e seu par isogênico, curado do plasmídeo de virulência. 31 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral � Investigar o papel das células dendríticas das placas de Peyer na determinação do padrão de resposta imune, Th1 e Th2, durante a infecção por via intragástrica de camundongos suscetíveis (BALB/c) e resistentes (C57BL/6) com Yersinia pseudotuberculosis ou seu par isogênico, curado do plasmídeo de virulência; 2.2. Objetivos específicos � Analisar a expressão de moléculas de superfície nas células dendríticas que contribuem para a formação da sinapse imunológica (MHC classe II, CD80, CD86 e ICAM-1); � Analisar a secreção de citocinas pelas células dendríticas (IL-4, IL-10, IL-12 e TNF-alfa); � Verificar a influência das células dendríticas dos animais infectados sobre a proliferação de linfócitos T e o padrão de citocinas Th1/Th2 secretadas pelos mesmos. 32 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Fluxograma de trabalho Preparo do inóculo Infecção dos animais Sacrifício dos animais no 1º, 3º e 5º dias pós-infecção Remoção das placas de Peyer Obtenção e enriquecimento das células dendríticas Obtenção e enriquecimento dos linfócitos T Células dendríticasCultivo e obtenção do sobrenadante Análise fenotípica através de citometria de fluxo Análise das moléculas de adesão por citometria de fluxo Análise da ativação de células T ag-específicas por citometria de fluxo Determinação da produção das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e TNF-� por ELISA Análise fenotípica dos linfócitos por citometria de fluxo Reativação das amostras bacterianas Detecção de citocinas intracelulares: IL-2, IFN-�, IL-4 e IL-10 por citometria de fluxo LyT dos baços dos animais imunizados com o Ag de Yersinia (HKY) 33 3.2. Animais No presente estudo foram utilizadas fêmeas de camundongos C57BL/6 e BALB/c, SPF (“Specific Pathogen Free”), com idades entre 6 e 8 semanas, adquiridas do Centro de Bioterismo da Universidade Estadual de Campinas (CEMIB – UNICAMP). Os animais foram transportados em mini-isoladores, alojados no Biotério do Departamento de Ciências Biológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista – UNESP/Campus de Araraquara, e mantidos em isoladores para garantir sua condição SPF, com acesso à ração e água esterilizadas “ad libitum”. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara – UNESP, sob o parecer n° 07/2006. A cópia do referido parecer encontra-se anexa (Anexo 1). 3.3. Amostras Bacterianas Foram utilizadas as seguintes amostras bacterianas: Yersinia pseudotuberculosis YpIII pIB1 (amostra portadora de plasmídeo de virulência – Yp+) e YpIII (amostra curada de plasmídeo de virulência – Yp-). Estas amostras foram gentilmente cedidas pelo Dr. Hans Wolf-Watz do Departamento de Biologia Celular e Molecular da Universidade de Umea, Suécia. 3.4. Infecção experimental dos animais com as amostras de Y. pseudotuberculosis 3.4.1. Reativação das amostras Previamente à padronização do inóculo, as amostras bacterianas foram reativadas mediante a passagem em camundongos. Para tal, uma alçada da amostra em estoque foi semeada em meio TSB (“Triptic Soy Broth”), incubada a 25°C por 24 horas e, a seguir, plaqueada em meio BAB (“Blood Agar Base”). Depois foi incubada novamente a 25°C, durante 48 horas, para a obtenção do crescimento bacteriano. Para cada amostra a ser reativada foram utilizados dois animais inoculados por via intravenosa com 0,2 mL da suspensão bacteriana, contendo um valor estimado de 107 unidades formadoras de colônia (UFC)/mL. Essa suspensão foi preparada a partir de uma suspensão inicial contendo 1010 UFC/mL, padronizada em escala 3 de Mac Farland e apresentando densidade ótica igual a 0,36 em 550 nm (DuR 530 Life Science UV/Vis Spectrophotometer – Beckman). Decorrido um período de 24 horas, os animais foram sacrificados, seus baços retirados, macerados em 1 mL de solução estéril de NaCl 0,85%, 34 semeados em meio de cultura BAB e incubados a 25ºC durante 48 horas. A partir deste crescimento foi preparado o inóculo para os experimentos. 3.4.2. Preparo do inóculo O crescimento das amostras após o plaqueamento dos baços dos animais foi retirado e diluído em solução esterilizada de NaCl 0,85%, de maneira a obter-se uma suspensão contendo cerca de 1010 UFC/mL, padronizada em espectrofotômetro a 550 nm e densidade óptica de 0,36. A partir dessa suspensão inicial, uma suspensão foi preparada para a realização da inoculação (108 UFC/mL). Outra, de 104 (diluição 10-6), foi utilizada para semeadura em meio BAB e confirmação da dose utilizada no inóculo. 3.4.3. Esquema de infecção Lotes de 6 ou 12 animais foram infectados, dependendo do experimento, com as diferentes amostras de Yersina pseudotuberculosis, mantendo-se sempre um lote com o mesmo número de animais não infectados como controle. A inoculação foi realizada por via intragástrica utilizando-se agulha de gavagem e um volume de 0,25 mL da suspensão bacteriana contendo 108 UFC/mL. Grupos de animais infectados e controles foram sacrificados e suas placas de Peyer retiradas no 1º, 3º e 5º dias após a infecção (pi). 3.5. Obtenção e análise das células dendríticas 3.5.1. Obtenção e enriquecimento (Kadaoui e Corthésy, 2004) Células dendríticas (DCs) foram obtidas das placas de Peyer de 6 ou 12 animais infectados e controles. Após o sacrifício dos camundongos em câmara de CO2, as placas foram removidas e incubadas por 30 minutos em 3 mL de RPMI-1640 suplementado com L- glutamina (2mM), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100ug/mL), 2-mercaptoetanol (5x10-2 M), 5 % de soro fetal bovino (SFB), 0,5 mg/mL de colagenase (tipo IA – Sigma) e 15 ug/mL de DNase (Sigma). A seguir, foram maceradas para a liberação das células. Suspensões celulares constituídas de 4 “pools” de 3 animais (2 “pools” de 3 animais para a determinação da ativação de células T Ag-específicas) foram filtradas em peneira de nylon com poros de 40 μm (Falcon, BD Biosciences) e recuperadas por centrifugação a 400 g, a 4°C, durante 10 minutos. Logo após, foram lavadas 2 vezes com 5 mL de tampão A [Tampão salina-fosfato (PBS) pH 7.3, 5% de soro fetal bovino e ácido etilenodiamino tetra-acético 5mM (EDTA) (pH 8.0)], através de centrifugação a 400 g durante 10 minutos, e 35 ressuspendidas no mesmo tampão em concentração que não excedesse 108 céls/mL. As células foram, então, incubadas com anticorpos de rato anti-CD16/CD32 de camundongo (Mouse FcBlock, 1/100, BD PharMingen) por 15 minutos a 4°C, lavadas e ressuspendidas em tampão A. Em seguida, procedeu-se a purificação das células dendríticas utilizando esferas magnéticas cobertas com anti-CD11c de camundongo (MicroBeads CD11c - Miltenyi Biotec), conforme as instruções do fabricante, e as células recuperadas por centrifugação foram ressuspendidas em RPMI suplementado e analisadas quanto à viabilidade celular através da técnica de exclusão do Azul Trypan (MISHELL e SHIIGI, 1980). Esse procedimento foi realizado para a obtenção das células dendríticas utilizadas em quatro experimentos: análise fenotípica, determinação da expressão de moléculas de adesão, análise da ativação de células T ag-específicas e determinação da produção das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e TNF-�. 3.5.2. Análise fenotípica através de citometria de fluxo (Pulendram et al., 2001) Após a purificação, 5x103-3x104 células dendríticas suspensas em 200 μl de tampão B gelado [PBS contendo 0,5% de soro albumina bovina (BSA), 5 mM EDTA (pH 8,0)] foram marcadas por 30 minutos, a 4°C e ao abrigo da luz com os anticorpos monoclonais anti- CD11c conjugado ao isotiocianato de fluoresceína (FITC), anti-CD11b conjugado à ficoeritrina (PE) e anti-CD8� conjugado à ficoeritrina Cy7 (PE-Cy7) (BD PharMingen) para determinação das sub-populações. Após duas lavagens com 500 μL de PBS contendo 1% de BSA, a 358 g, a 4°C e durante 5 minutos, as células foram ressuspendidas em 500 μL de PBS contendo 1% de formol e mantidas ao abrigo da luz até o momento da leitura. As DCs foram especificamente analisadas por “gating” seletivo baseado nos parâmetros de tamanho e granulosidade celulares. Imunoglobulinas isotipo-específicas marcadas com os mesmos fluorocromos (BD PharMingen), que não se ligam às células dendríticas murinas, foram utilizadas como controles. Todas as amostras foram analisadas através de citometria de fluxo em Citômetro BD FACS-Canto (BD Biosciences) com o auxílio do software FACSDiva. 3.5.3. Análise das moléculas de superfície através de citometria de fluxo Para avaliar a expressão das moléculas de superfície nas células dendríticas dos animais infectados e controles, utilizou-se o mesmo procedimento para a análise fenotípica, diferenciando apenas quanto aos anticorpos monoclonais utilizados. Suspensões de células dendríticas foram marcadas com o anticorpo monoclonal anti-CD11c-FITC e individualmente com anticorpos monoclonais anti-I-A/I-E-PE, anti-CD80-PE, anti-CD86-PE e anti-CD54-PE 36 (BD PharMingen). Também foram utilizadas como controles imunoglobulinas isotipo- específicas marcadas com os mesmos fluorocromos (BD PharMingen). 3.5.4. Determinação da produção de citocinas por ELISA. Para o estudo dos efeitos da infecção de camundongos com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis sobre a secreção de citocinas pelas células dendríticas, as mesmas foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com L-glutamina (2mM), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100ug/mL) e 10% de SFB, e mantidas por 48 h a 37°C, em 5% de CO2. Uma fração foi cultivada na presença de 1ug/mL de lipopolissacarídeo (LPS de Salmonella enterica sorotipo Typhimurium, Sigma), como controle positivo, e outras na presença de 10 �g/mL de HKY (suspensões de Y. pseudotuberculosis, YpIII e YpIII pIB1, mortas pelo calor) ou apenas de RPMI-1640 suplementado. Após o período de incubação, os sobrenadantes foram coletados, centrifugados a 18000 g e armazenados a -80ºC para posterior determinação das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e TNF-� secretadas, utilizando kits comerciais (OptEIATM ELISA set, BD PharMingen). Microplacas de poliestireno de 96 cavidades foram adsorvidas com 100 μL dos anticorpos de captura das respectivas citocinas pesquisadas, diluídos em Tampão Fosfato 0,2M (pH 6,5) ou Tampão Carbonato 0,1M (pH 9,5) (“Coating Buffer”), e incubadas “overnight” à 4ºC. As placas foram lavadas 3 vezes com 300 μL de PBS contendo 0,05% Tween-20 e bloqueadas com 200 �L de PBS contendo 10% de SFB (pH 7,0), à temperatura ambiente por 1 hora, e novamente lavadas 3 vezes. Adicionou-se 100 �L de cada citocina padrão ou do sobrenadante testado, e as placas foram incubadas à temperatura ambiente por 2 horas. Decorrido esse período, as placas foram lavadas 5 vezes e, em seguida, foram adicionados 100 �L do Detector de Trabalho (Anticorpo de Detecção + Reagente Enzimático) em cada cavidade. As mesmas foram incubadas à temperatura ambiente por 1 hora e, posteriormente, lavadas 7 vezes. Foram, então, adicionados 100 �L do substrato TMB (Tetrametilbenzidina e peróxido de hidrogênio - OptEIATM, BD PharMingen) em cada cavidade e realizou-se uma incubação de 30 minutos. A reação foi interrompida pela adição de 50 �L de H2SO4 2N (“Stop Solution”). As absorbâncias foram obtidas a 450 nm em leitor de ELISA (Microplate Reader - Model 550 – BIO-RAD) e as concentrações das citocinas foram determinadas utilizando-se curvas padrões previamente estabelecidas com concentrações conhecidas. 37 3.5.5. Determinação da ativação de células T Ag-específicas 3.5.5.1. Preparo do Antígeno de Yersinia – HKY (“Heat-killed Yersinia”) As amostras bacterianas foram cultivadas como descrito anteriormente, mortas pelo calor através de incubação em banho-maria a 60°C por 1 hora, coletadas por centrifugação (Centrífuga Beckman AvantiTM 30), lavadas duas vezes com PBS (pH 7,2) e ressuspendidas no mesmo. Esta suspensão bacteriana foi congelada e, posteriormente, liofilizada para que, na forma de pó, fosse possível a sua utilização na concentração adequada, 10 μg de liofilizado/mL. 3.5.5.2. Imunização de camundongos com HKY para a obtenção dos linfócitos T antígeno-específicos Camundongos BALB/c e C57BL/6 foram inoculados por via intraperitoneal com 10 μg de HKY misturados com 1 mg de hidróxido de alumínio em solução salina 0,15 M. Decorridos 14 dias, os camundongos receberam uma segunda dose de 10 μg do antígeno em solução salina. A partir de 7 dias após a 2ª inoculação, os linfócitos T dos baços dos animais foram isolados e utilizados no co-cultivo com células dendríticas. 3.5.5.3. Obtenção e enriquecimento dos linfócitos T Linfócitos T foram purificados dos baços dos animais imunizados com HKY, em condições assépticas, através de maceração em PBS gelado (pH 7,2), seguida de 2 lavagens a 200 g por 10 minutos. As células foram ressuspendidas em 5 mL de cloreto de amônio 0,83% e 1 mL de SFB e deixadas em repouso por 5 minutos, a fim de se promover a lise das hemácias. Após nova centrifugação, as células foram ressuspendidas em RPMI-1640 suplementado com 1 μL/mL de L-glutamina (2mM), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100ug/mL) e 10% de SFB para se efetuar a terceira lavagem. As células T foram purificadas utilizando-se um sistema de marcação indireta magnética (Pan T Cell Isolation Kit, Miltenyi Biotech), de acordo com as instruções do fabricante. Após a purificação, as células foram ressuspendidas em 5 mL de RPMI-1640 suplementado, centrifugadas e ressuspendidas em 1 mL de RPMI, igualmente suplementado, e procedeu-se a contagem do número dos linfócitos viáveis através de coloração com Azul Trypan. Os linfócitos T antígeno-específicos serviram como sensores para a eficácia da apresentação de antígenos pelas células dendríticas. 38 3.5.5.4. Ensaio de proliferação de células T A capacidade de apresentação de antígenos das células dendríticas das placas de Peyer dos animais infectados e controles foi analisada através de co-cultura com linfócitos T e determinação da proliferação das células T por citometria de fluxo usando o CFSE (Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl Ester). O CFSE acopla espontânea e irreversivelmente em proteínas de superfícies celulares e intracelulares, através de reação com cadeias laterais de lisina e de outros grupos amina disponíveis. Quando as células se dividem, a marcação de CFSE é igualmente distribuída entre as células filhas, que apresentam, todavia, metade da fluorescência das células mãe. O número de divisões, que pode ser seguido, só é limitado pelo nível de auto fluorescência de células não marcadas e pela uniformidade no tamanho da população das células marcadas (HODGKINS et al., 1996). Células T dos baços dos animais imunizados com HKY foram centrifugadas e ressuspendidas em PBS 0,5% BSA (máximo de 0,5-1,0 x107 células/mL) e, em seguida, marcadas com 2,5 μM de CFSE (Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl Ester, Sigma) por 10 minutos a 37°C, no escuro. Imediatamente após os 10 minutos, a marcação foi interrompida pela adição de 5 volumes de RPMI 10% de SFB gelado e incubação por 5 minutos em gelo, no escuro. As células foram lavadas 3 vezes com 20 mL de RPMI 10% de SFB gelado e ressuspendidas na concentração de 4 x 105 linfócitos T/mL. As células dendríticas provenientes dos camundongos infectados e controles foram pré-incubadas com 10 μg/mL de antígeno de Yersinia (HKY), a 37°C por 2 horas. Células T marcadas com CFSE foram colocadas em placas de 24 orifícios (Corning), na densidade de 4x105 células/cavidade, e co-cultivadas com 105 células dendríticas/cavidade. Suspensões de 4 x 105 linfócitos T não marcados e 4 x 105 linfócitos T marcados com CFSE, ambos não estimulados ou não co-cultivados com células dendríticas, também foram acrescentados à placa e foram, posteriormente, utilizados como controles. A placa foi embrulhada em papel alumínio e incubada por 4 dias a 37°C, em 5% de CO2. Decorrido o período de incubação, as células em cultura foram homogeneizadas e coletadas em tubos cônicos de 15 mL protegidos da incidência da luz. A seguir, foram lavadas 3 vezes com 2 mL de PBS 0,5% de BSA, a 4°C, por 5 minutos a 358 g e ressuspendidas em PBS 0,5% de BSA numa concentração de 4 x 105 céls/mL. Alíquotas de 500 μL das suspensões celulares foram distribuídas em tubos de citometria. Os tubos contendo linfócitos T marcados com CFSE e não estimulados e linfócitos T marcados com CFSE e estimulados (co-cultivados com células dendríticas) foram incubados com concentrações saturantes de anticorpo monoclonal anti-CD3-PE-Cy5 e anti- CD4-PE (BD PharMingen), no escuro, por 30 minutos e a 4°C. Ao término desta incubação, 39 as células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 0,5% de BSA (358 g/ 5 minutos) e ressuspendidas em PBS contendo 1% de formol, para fixação, e foram estocadas no escuro a 4°C até o momento da análise. A análise da intensidade de fluorescência do CFSE dos linfócitos CD3+CD4+ foi analisada por citometria de fluxo em Citômetro FACSCanto (Becton Dickinson), com excitação a 488 nm e canal de detecção FL1. A determinação da proliferação das células T foi analisada através da razão da mediana de intensidade de fluorescência obtida para os linfócitos marcados com CFSE e não estimulados (células que não proliferaram e que apresentam intensidade de fluorescência máxima) pela mediana de intensidade de fluorescência obtida para os linfócitos marcados com CFSE e estimulados ou co-cultivados com células dendríticas (células que proliferaram e que reduziram a intensidade de fluorescência do CFSE). 3.6. Quantificação das sub-populações de linfócitos T e determinação do padrão de citocinas Th1 e Th2 através de citometria de fluxo (Morita et al., 1998) 3.6.1. Obtenção das células das placas de Peyer Os camundongos dos grupos controles e infectados foram sacrificados em câmara de CO2, as placas de Peyer retiradas em condições assépticas e maceradas em 3 mL de RPMI suplementado com L-glutamina (2mM), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100ug/mL), 2-mercaptoetanol (5x10-2 M) e 5 % de SFB. A suspensão celular foi filtrada em peneira de nylon com poros de 70 μm (Falcon, BD Biosciences), transferida para tubos cônicos de polietileno e recuperada por centrifugação (Centrífuga Fanem Excelsa II 206MP) a 358 g, a 4°C, durante 5 minutos. Após a centrifugação, as células foram lavadas com 5 mL de RPMI- 1640 suplementado por mais duas vezes e ressuspendidas em 1 mL de RPMI, igualmente suplementado, para contagem do número de linfócitos viáveis, através de coloração com Azul Trypan. Uma fração dos linfócitos foi examinada quanto às suas características fenotípicas através de coloração com anticorpos monoclonais contra marcadores de superfície celular e outra foi avaliada quanto à produção de citocinas Th1/Th2, através da determinação de citocinas intracelulares presentes nos linfócitos. 3.6.2. Análise fenotípica dos linfócitos das placas de Peyer Uma fração dos linfócitos foi centrifugada e ressuspendida em 2 mL de PBS contendo 1% de BSA. A seguir, as células foram bloqueadas com uma solução de Mouse FcBlock (BD PharMingen) e incubadas por 20 minutos a 4°C. Após sua distribuição em tubos de 40 citometria, as mesmas foram incubadas com concentrações saturantes de anticorpo monoclonal anti-CD3-FITC, anti-CD4-PE e anti-CD8 conjugado ao “spectral red” (SPRD) (todos da marca Southern Biotech), no escuro, por 30 minutos e a 4°C. Ao término desta incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 1% de BSA (358 g/ 5 minutos) e ressuspendidas em PBS contendo 1% de formol, para fixação, e estocadas no escuro a 4°C até o momento da análise. A análise da expressão dos marcadores de superfície foi realizada no citômetro de fluxo FACSCanto (Becton Dickinson). Os linfócitos foram especificamente analisados por “gating” seletivo baseado nos parâmetros de tamanho e granulosidade celulares. Imunoglobulinas isotipo-específicas marcadas com os mesmos fluorocromos, que não se ligam aos linfócitos murinos, foram utilizadas como controles. 3.6.3. Detecção das citocinas intracelulares IL-2, IFN-�, IL-4 e IL-10 O restante da suspensão de linfócitos (105 células/mL), destinado à detecção intracitoplasmática das citocinas, foi distribuído em uma placa de 24 cavidades. Parte destas células foi estimulada com 25 ng/mL de forbol miristato acetato (PMA) (Sigma) e 1 μg/mL de ionomicina (Sigma), e a outra parte não recebeu estímulo. As células foram incubadas por 2 horas, a 37°C, em atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Em seguida, foram adicionados 10 μg/mL de brefeldina A (Sigma) em todas as cavidades e a placa foi incubada nas mesmas condições de temperatura e tensão de CO2, por mais 4 horas. A brefeldina A foi utilizada para melhorar a análise das citocinas intracelulares, devido ao seu efeito inibitório na secreção de proteínas, o que permite um acúmulo das citocinas no complexo de Golgi, produzindo um aumento do sinal que poderá ser detectado pelo citômetro de fluxo. Ao final do período, as suspensões de células, tanto estimuladas “in vitro” quanto não estimuladas, foram transferidas das cavidades da placa para respectivos tubos cônicos e centrifugadas a 358 g por 5 minutos. Em seguida, foram lavadas e ressuspendidas igualmente em PBS 1% de BSA (358 g / 5 minutos). Logo após, adicionou-se a solução Mouse FcBlock™ (BD PharMingen) e as células foram incubadas a 4°C por 20 minutos. Terminada esta incubação, iniciou-se a marcação das moléculas de superfície CD3 e CD8. Para isto, foram adicionados os anticorpos anti-CD3- FITC e anti-CD8-SPRD e realizou-se uma incubação por 30 minutos, a 4°C e ao abrigo da luz. Na seqüência, as células foram lavadas duas vezes com PBS 1% BSA (358 g / 5 minutos) e ressuspendidas em solução CytoFix /CytoPerm (BD PharMingen) a fim de proporcionar a fixação e permeabilização das mesmas. Após incubação de 20 minutos a 4°C e ao abrigo da luz, as células foram lavadas com o tampão Perm Wash (BD PharMingen), distribuídas nos 41 respectivos tubos de citometria, lavadas novamente e ressuspendidas em 50�L de Perm Wash. Os anticorpos monoclonais citocina-específicos anti-IL-2, anti-IFN-γ, anti-IL-4 e anti-IL-10 e anticorpos monoclonais isotipo-controles, todos conjugados com PE (Southern Biotech), foram adicionados aos seus respectivos tubos de citometria. Seguiu-se nova incubação a 4°C e ao abrigo da luz por um período de 30 minutos. As suspensões foram lavadas duas vezes com Perm Wash, foram adicionados 500 μL de PBS 1% de formol e os tubos foram acondicionados a 4°C e ao abrigo da luz até o momento da análise no citômetro de fluxo. A análise dos dados foi feita no citômetro FACSCanto usando o programa FACSDiva (BD). As citocinas produzidas pelos linfócitos T CD4+ foram analisadas indiretamente através da separação e análise da população de linfócitos CD3+ CD8-, visto que a estimulação com forbol ésteres diminui a expressão de CD4 (SOLBACH, 1982). 3.7. Análise estatística Para a análise estatística dos dados foi realizada, inicialmente, uma análise de ponto influente via intervalo interquartílico para eliminar os valores que se encontravam fora desse intervalo e que poderiam prejudicar a aproximação para a distribuição normal e, por conseqüência, interferir na aplicação da técnica de análise. Na análise realizada para a fenotipagem das subpopulações de linfócitos T das placas de Peyer constatou-se uma aproximação suficientemente boa com a distribuição normal, o que garantiu a aplicabilidade de testes paramétricos nos dados experimentais. Assim, foi utilizado o teste F, via análise de variância univariada de fator único (Anova One-Way), com um teste t para as comparações post-hoc. Para o experimento de detecção de citocinas intracelulares dos linfócitos foi realizada uma análise não-paramétrica devido às análises terem sido apresentadas por medianas. As comparações foram feitas com base no teste para amostras independentes de Mann-Whitney. Análises descritivas foram utilizadas para os experimentos que envolveram as células dendríticas (Imunofenotipagem, Análise das moléculas de adesão, Análise da ativação de células T ag-específicas e Determinação da produção das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e TNF- �). O número reduzido de células dendríticas obtido das placas de Peyer não forneceu números de dados suficientes para a realização de análise estatística. 42 4. RESULTADOS 4.1. Análise fenotípica das células dendríticas As células dendríticas (CD11c+) e subpopulações CD11c+C11b+ e CD11c+CD8�+ das placas de Peyer dos camundongos BALB/c e C57BL/6 foram quantificadas no 1°, 3° e 5° dias após a infecção com as amostras YpIII pIB1(Yp+) e YpIII (Yp-). As mesmas populações de dendríticas provenientes de animais não infectados foram quantificadas e os valores obtidos serviram como controles. Devido ao número reduzido de células dendríticas nas placas de Peyer utilizou-se um “pool” de células obtido das placas de Peyer de 12 animais para cada grupo e dia estudado. A Tabela 1 e Figura 1 apresentam o número encontrado de células dendríticas e suas subpopulações em 30.000 eventos analisados por citometria de fluxo. Quanto ao número de células dendríticas (CD11c+) encontrado, os animais controles da linhagem C57BL/6 apresentaram um número 3,5 vezes maior de células em relação aos animais controles BALB/c (Tabela 1). Em relação às subpopulações de células dendríticas, camundongos BALB/c controles apresentaram um número 4,8 vezes maior da sub-população CD11c+CD8-�+ em relação à CD11c+CD11b+; e camundongos C57BL/6 controles apresentaram um número 1,2 vezes maior da sub-população CD11c+CD11b+ em relação à sub-população CD11c+CD8-�+ (Tabela 1). Comparando os camundongos BALB/c infectados com a amostra Yp+ com o seu grupo controle foi possível verificar que apresentaram uma redução no número de células dendríticas no 1° dia pós-infecção, aumentando esse número gradativamente a partir do 3° dia, e tendo o seu maior aumento no 5° dia pós-infecção (1,7 vezes maior). Já o grupo infectado com a amostra Yp- apresentou um aumento durante todo o período analisado, principalmente a partir do 3° dia em que observou-se o seu maior aumento (2,0 vezes maior) (Figuras 1A, 2A e 2B). Os dois grupos infectados da linhagem C57BL/6 apresentaram redução no número de células dendríticas em todo o período da infecção, principalmente no 1° e no 5° dia, sendo observadas as maiores reduções durante o 5° dia (2,5 vezes menor para Yp+ e 4 vezes menor para Yp-) (Figuras 1A, 2C e 2D). Relativamente à quantificação da sub-população CD11c+C11b+ observou-se que os animais controles da linhagem C57BL/6 apresentaram um número maior desse subtipo 43 quando comparados aos animais da linhagem BALB/c (48,1 vezes maior) (Tabela 1 e Figura 1B). Aumentos da sub-população CD11c+C11b+ foram observados nos dois grupos de animais BALB/c. Para o grupo infectado com a amostra Yp+ esse aumento ocorreu em todo o período analisado, com o maior aumento no 5° dia pós-infecção (13,6 vezes). Para o grupo infectado com a amostra Yp- verificou-se um discreto aumento no 1° e no 5° dia, e o maior aumento no 3° dia (3,5 vezes maior) (Figuras 1B, 2E e 2F). A mesma sub-população teve seus números reduzidos nos animais C57BL/6 durante todo o período. Para a amostra Yp+ uma maior redução foi observada no 5° dia, e para a amostra Yp- ocorreu uma intensa redução, observada principalmente no 1° dia (67,3 vezes menor) (Figuras 1B, 2G e 2H). Animais controles C57BL/6 apresentaram um número maior de células dendríticas da sub-população CD11c+CD8�+ quando comparados aos animais controles BALB/c (8,5 vezes maior) (Tabela 1). Uma redução dessa sub-população foi observada durante todo o período analisado nos dois grupos da linhagem C57BL/6, com a maior redução no 5° dia para as duas amostras e uma redução mais intensa para a amostra não portadora de plasmídeo (Yp+, 5,2 vezes menor e Yp-, 66,5 vezes menor) (Figuras 1C, 2K e 2L). Os dois grupos da linhagem BALB/c apresentaram comportamentos diferentes em relação a essa sub-população de célula dendrítica. O grupo infectado com Yp+ apresentou redução dessa sub-população no 1° dia, mas aumentou a partir do 3° e atingiu o seu pico no 5° dia (aumento de 2,0 vezes em relação ao grupo controle). O grupo infectado com Yp- apresentou uma redução em todo o período, com uma maior redução observada no 5° dia (4,4 vezes menor) (Figuras 1C, 2I e 2J). De um modo geral, a infecção por Y. pseudotuberculosis com a amostra portadora de plasmídeo de virulência provocou um aumento no número de células dendríticas (CD11c+) e suas populações CD11c+C11b+ e CD11c+CD8�+ nos animais BALB/c, e uma redução no número de dendríticas e suas subpopulações nos animais C57BL/6. A infecção com a amostra não portadora de plasmídeo de virulência provocou um aumento no número de células dendríticas e no número da sub-população CD11c+C11b+, bem como uma redução no número da sub-população CD11c+CD8�+ nos animais BALB/c. Nos animais C57BL/6 provocou uma redução no número de dendríticas e no número das subpopulações. 44 Tabela 1 – Número absoluto de células dendríticas (CD11c+) e das subpopulações CD11c+C11b+ e CD11c+CD8�+ das placas de Peyer dos animais infectados e controles no decorrer da infecção com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os valores mostrados referem-se ao “pool” de células das placas de Peyer de 12 animais para cada dia, obtidos em 30.000 eventos analisados por citometria de fluxo Dias pós-infecção Amostra Animal Células 1° Dia 3° Dia 5° Dia Controle CD11c 237 487 592 352 CD11cCD11b 27 164 285 21 Balb/c CD11cCD8� 43 142 208 102 CD11c 746 1011 484 1225 CD11cCD11b 513 719 69 1010 YpIII pIB1 C57BL/6 CD11cCD8� 498 553 167 865 CD11c 358 722 627 352 CD11cCD11b 27 73 27 21 Balb/c CD11cCD8� 49 90 23 102 CD11c 339 517 303 1225 CD11cCD11b 15 22 17 1010 YpIII C57BL/6 CD11cCD8� 39 31 13 865 45 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 BALB/c (YpIIIpIB1) C57BL/6 (YpIIIpIB1) BALB/c (YpIII) C57BL/6 (YpIII) Figura 1. Número de células dendríticas (CD11c+) (A) e subpopulações CD11c+CD11b+ (B) e CD11c+CD8�+ (C) de camundongos BALB/c e C57BL/6 infectados com as amostras YpIII pIB1 e YpIII nos diferentes dias pós-infecção. A letra C corresponde aos animais não infectados (controles) e os números 1°, 3° e 5° correspondem aos dias pós-infecção. C 1° 3° 5° N ° D E D E N D R ÍT IC A S CD11c+CD8�+ DIAS PÓS-INFECÇÃO C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° CD11c+C11b+ DIAS PÓS-INFECÇÃO DIAS PÓS-INFECÇÃO N ° D E D E N D R ÍT IC A S N ° D E D E N D R ÍT IC A S CD11c+ C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° A B C 46 CD11c+ (A) BALB/c – Yp+ - 5° dia p.i. (B) BALB/c – Yp- - 3° dia p.i. (C) C57BL/6 - Yp+ - 5° dia p.i (D) C57BL/6 – Yp- - 5° dia p.i. CD11c+CD11b+ (E) BALB/c – Yp+ - 5° dia p.i (F) BALB/c – Yp- - 3° dia p.i. (G) C57BL/6 - Yp+ - 5° dia p.i. (H) C57BL/6 – Yp- - 1° dia p.i. CD11c+CD8�+ (I) BALB/c – Yp+ - 5° dia p.i. (J) BALB/c – Yp- - 5° dia p.i. (K) C57BL/6 - Yp+ - 5° dia p.i. (L) C57BL/6 – Yp- - 5° dia p.i Figura 2. Principais alterações ocorridas no número de células dendríticas (CD11c+) e subpopulações CD11c+CD11b+ e CD11c+CD8�+ durante as infecções de camundongos BALB/c e C57BL/6 com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis. 47 4.2. Análise das moléculas de superfície das células dendríticas As expressões das moléculas de MHC de classe II, B7.1, B7.2 e ICAM-1 foram investigadas nas células dendríticas dos animais infectados com as amostras de Y. pseudotuberculosis no curso da infecção e comparadas com as expressões apresentadas pelos animais não infectados do mesmo grupo. Para tal, foram utilizados anticorpos específicos anti-CD11c, anti-I-A/I-E, anti-CD80, anti-CD86 e anti-CD54, marcados com fluorocromos, e a análise do percentual de células dendríticas que apresentavam esses marcadores foi realizada através de citometria de fluxo. Devido ao número reduzido de células dendríticas presentes nas placas de Peyer utilizou-se um “pool” de células obtido das placas de Peyer de 12 animais para cada grupo e dia estudado. O percentual obtido de células dendríticas expressando essas moléculas, em uma análise de 30.000 eventos realizada por citometria de fluxo, foi representado na Tabela 2 e Figura 3. A expressão de moléculas de MHC II nos grupos de animais controles não se mostrou tão diferente entre as duas linhagens de animais. Camundongos controles C57BL/6 apresentaram 78% de células dendríticas expressando essa molécula contra 75% dos animais BALB/c (Tabela 2 e Figuras 4 A e 4B). Camundogos BALB/c infectados com a amostra Yp+ apresentaram uma redução no número de células dendríticas que expressavam essa molécula no 1° e no 3° dia pós-infecção e um aumento no 5° dia (80,9%), valor um pouco acima do apresentado pelo seu grupo controle (Figura 4C). Os demais grupos de animais, BALB/c (Yp-), C57BL/6 (Yp+) e C57BL/6 (Yp-), apresentaram uma redução no número dessas células (Figuras 4D, 4E e 4F). A maior redução observada foi para o último grupo e durante todo o período do experimento (40,6% no 1° dia, 55,8% no 3° dia e 53,4% no 5° dia p.i.) (Figuras 3A e 4F). Em relação à análise do percentual de células dendríticas que expressavam a molécula co-estimuladora B7.1 (CD80) verificou-se, inicialmente, que os animais controles C57BL/6 apresentaram um percentual maior em relação aos animais controles BALB/c (49,2% para 14,5%) (Tabela 2 e Figuras 4G e 4H). Os animais infectados BALB/c (Yp+), apesar de terem apresentado uma redução no percentual de células dendríticas que expressavam a molécula B7.1 no 3° dia pós-infecção (11,6%), apresentaram um aumento da expressão dessa molécula no 1° e no 5° dia (25,8% e 35,8%, respectivamente) (Figura 4I). Os infectados com a amostra Yp- apresentaram redução da expressão dessa molécula durante todo o período analisado (Figuras 3B e 4J). 48 Já os camundongos C57BL/6 (Yp+) apresentaram um aumento no 1° dia (51,4%), mas uma redução da expressão dessa molécula nos demais dias (Figura 4K). Por sua vez, os C57BL/6 (Yp-) apresentaram uma intensa redução em todo o período de infecção (Figuras 3B e 4L). Animais controles C57BL/6 apresentaram um percentual maior de células dendríticas que expressavam a molécula B7.2 (CD86) (34,9%) em relação aos animais controles Balb/c (7,0%) (Tabela 2 e Figuras 4M e 4N). Apesar dos animais infectados da linhagem BALB/c terem apresentado aumento da expressão da molécula B7.2 no 1° dia p.i. para a amostra Yp+ (9,5%) e no 3° dia p.i. para a amostra Yp- (8,3%), ambos os grupos apresentaram redução da expressão dessa molécula no final do período analisado, quando comparados com o seu grupo controle (Figuras 3C, 4O e 4P). Os animais da linhagem C57BL/6 infectados com a amostra Yp+ apresentaram um aumento na expressão de B7.2 no 1° e no 3° dia (61,7% e 48,4%) e uma intensa redução no 5° p.i. (8,0%) (Figura 4Q). Os infectados com a amostra Yp- apresentaram uma redução das células dendríticas que expressavam essa molécula em todo o período de infecção analisado (Figuras 3C e 4R). Camundongos controles BALB/c apresentaram um percentual maior de células dendríticas que expressavam a molécula ICAM-1 (CD54) (20,1%) em comparação aos camundongos controles C57BL/6 (9,4%) (Tabela 2 e Figuras 4S e 4T). Durante todo período de infecção analisado para o grupo BALB/c (Yp+) observou-se uma redução no número das células dendríticas que expressavam essa molécula, com a maior redução no 1° dia pós-infecção (8,2%) (Figura 4U). No grupo BALB/c (Yp-) foram observados aumentos no 1° e no 3° dia (24,6% e 32,5%, respectivamente) e uma redução no 5° dia p.i (10,3%) (Figuras 3D e 4V). Para os grupos de animais infectados C57BL/6 (Yp+ e Yp-) foram observados aumentos no número de células dendríticas que expressavam essa molécula em todo o período de infecção, com um maior aumento para a amostra portadora de plasmídeo de virulência (Figuras 3D, 4X e 4Z). 49 Tabela 2 – Percentual de células dendríticas CD11c+I-A/I-E+, CD11c+CD80+, CD11c+CD86+ e CD11c+CD54+ das placas de Peyer dos animais infectados e controles no decorrer da infecção com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis. Os valores apresentados referem-se ao “pool” de células das placas de Peyer de 12 animais para cada dia, obtidos em 30.000 eventos analisados por citometria de fluxo Dias pós-infecção Amostra Animal Moléculas 1° Dia (%) 3° Dia (%) 5° Dia (%) Controle (%) I-A/I-E (MHC II) 48,2 63,9 80,9 78,2 CD80 (B7.1) 25,8 11,6 35,8 14,5 CD86 (B7.2) 9,5 4,8 5,9 7,0 Balb/c CD54 (ICAM-1) 8,2 13,3 10,6 20,1 I-A/I-E (MHC II) 62,7 68,2 55,9 75,0 CD80 (B7.1) 51,4 33,7 34,7 49,2 CD86 (B7.2) 61,7 48,4 8,0 34,9 YpIII pIB1 C57BL/6 CD54 (ICAM-1) 38,2 32,5 23,2 9,4 I-A/I-E (MHC II) 68,5 60,1 72,0 78,2 CD80 (B7.1) 11,9 13,6 10,2 14,5 CD86 (B7.2) 4,5 8,3 4,4 7,0 Balb/c CD54 (ICAM-1) 24,6 32,5 10,3 20,1 I-A/I-E (MHC II) 40,6 55,8 53,4 75,0 CD80 (B7.1) 3,8 2,7 3,0 49,2 CD86 (B7.2) 7,8 1,8 7,4 34,9 YpIII C57BL/6 CD54 (ICAM-1) 26,8 25,5 16,0 9,4 50 0 20 40 60 80 100 % I- A /I- E (M H C II ) 0 20 40 60 80 100 % C D 80 (B 7. 1) 0 20 40 60 80 100 % C D 86 (B 7. 2) 0 20 40 60 80 100 % C D 54 (I C A M -1 ) BALB/c (YpIIIpIB1) C57BL/6 (YpIIIpIB1) BALB/c (YpIII) C57BL/6 (YpIII) Figura 3. Percentual de células dendríticas expressando moléculas de MHC II (I-A/I-E) (A), B7.1 (CD80) (B), B7.2 (CD86) (C) e ICAM-1 (CD54) (D) de camundongos BALB/c e C57BL/6 infectados com as amostras YpIII pIB1 e YpIII nos diferentes dias pós-infecção. A letra C corresponde aos animais não infectados (controles) e os números 1°, 3° e 5° correspondem aos dias pós-infecção. DIAS PÓS-INFECÇÃO DIAS PÓS-INFECÇÃO DIAS PÓS-INFECÇÃO DIAS PÓS-INFECÇÃO C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° C 1° 3° 5° A B C D 51 MHC II B7.1 B7.2 ICAM-1 Figura 4. Principais alterações ocorridas no número de células dendríticas quanto à expressão de moléculas de MHC II, B7.1, B7.2 e ICAM-1 durante as infecções de camundongos BALB/c e C57BL/6 com as amostras YpIII pIB1 e YpIII de Y. pseudotuberculosis. Controle BALB/c Controle C57BL/6 BALB/c – Yp+ - 5° d.p.i. BALB/c – Yp- - 5° d.p.i. C57BL/6 – Yp+ - 3° d.p.i. C57BL/6 – Yp- - 3° d.p.i. Controle BALB/c Controle BALB/c Controle BALB/c Controle C57BL/6 Controle C57BL/6 Controle C57BL/6 BALB/c – Yp+ - 5° d.p.i. BALB/c – Yp+ - 5° d.p.i. BALB/c – Yp+ - 1° d.p.i. BALB/c – Yp- - 5° d.p.i. BALB/c – Yp- - 5° d.p.i. BALB/c – Yp- - 3° d.p.i. C57BL/6 – Yp+ - 5° d.p.i. C57BL/6 – Yp+ - 5° d.p.i. C57BL/6 – Yp+ - 1° d.p.i. C57BL/6 – Yp- - 1° d.p.i. C57BL/6 – Yp- - 5° d.p.i. C57BL/6 – Yp- - 1° d.p.i. C B D E H G F I J K L M N O P Q R S T U V X Z A 52 4.3. Determinação das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e TNF-� no sobrenadante de cultura de células dendríticas Para estudar os efeitos da infecção com as diferentes amostras de Y. pseudotuberculosis em camundongos BALB/c e C57BL/6 sobre a secreção de citocinas pelas células dendríticas, as concentrações de IL-4, IL-10, IL-12 e TNF-� foram determinadas em sobrenadantes de culturas (48 horas) de células dendríticas das placas de Peyer. As concentrações dessas citocinas foram analisadas durante o curso da infecção (1 a 5 dias) e comparadas com as concentrações apresentadas pelos animais não infectados (controles). Devido ao número reduzido de células dendríticas presente nas placas de Peyer utilizou-se um “pool” de células obtido das placas de Peyer de 12 animais para cada grupo e dia estudado. O método utilizado para as determinações de concentrações das citocinas foi o de ELISA e as culturas celulares foram realizadas nas condições sem estímulo (apenas em meio RPMI) e com os estímulos de HKY e LPS. Em relação à produção de IL-4 verificou-se que, de uma maneira geral, camundongos BALB/c controles produziram maiores quantidades dessa citocina quando comparados aos camundongos C57BL/6 controles (Tabela 3). As infecções por ambas as amostras de Y. pseudotuberculosis, sob as condições de estímulos e sem estímulo, produziram aumentos na produção de IL-4 nos camundongos BALB/c em comparação à produção dessa mesma citocina pelas DCs dos animais controles (Tabela 3 e Figuras 5A e 5B), principalmente no 3° dia p.i. e para a amostra Yp-. Nas células dendríticas de camundongos BALB/c infectados com a amostra Yp+ foi observado um aumento gradativo na produção dessa citocina a partir do 1° dia p.i., alcançando um pico máximo no 3° dia p.i. (13,8 vezes maior com o estímulo de HKY, 6,8 vezes maior com o estímulo de LPS e 9,3 vezes maior apenas com RPMI). No 5° dia p.i. a produção apresentou uma queda, porém mantendo-se mais elevada que a produção observada nos anim