UUnniivveerrssiiddaaddee EEssttaadduuaall PPaauulliissttaa –– UUnneesspp IInnssttiittuuttoo ddee QQuuíímmiiccaa –– AArraarraaqquuaarraa ““JJúúlliioo ddee MMeessqquuiittaa FFiillhhoo”” DDiisssseerrttaaççããoo ddee MMeessttrraaddoo EEssttuuddoo ffiittooqquuíímmiiccoo ddooss ffrruuttooss ddee SSeennnnaa ssppeeccttaabbiilliiss ee aannáálliissee ccoommppaarraattiivvaa ddoo ppeerrffiill aallccaallooííddiiccoo ddee SS.. ssppeeccttaabbiilliiss ee CCaassssiiaa lleeppttoopphhyyllllaa MMaarrccooss PPiivvaattttoo ((MMeessttrraannddoo)) OOrriieennttaaddoorraa:: PPrrooffªª DDrrªª VVaannddeerrllaann ddaa SSiillvvaa BBoollzzaannii CCoo--OOrriieennttaaddoorr:: PPrrooff.. DDrr.. IIaann CCaassttrroo--GGaammbbooaa AArraarraaqquuaarraa,, 22000055 UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE EESSTTAADDUUAALL PPAAUULLIISSTTAA ““JJÚÚLLIIOO DDEE MMEESSQQUUIITTAA FFIILLHHOO”” IINNSSTTIITTUUTTOO DDEE QQUUÍÍMMIICCAA EEssttuuddoo ffiittooqquuíímmiiccoo ddooss ffrruuttooss ddee SSeennnnaa ssppeeccttaabbiilliiss ee aannáálliissee ccoommppaarraattiivvaa ddoo ppeerrffiill aallccaallooííddiiccoo ddee SS.. ssppeeccttaabbiilliiss ee CCaassssiiaa lleeppttoopphhyyllllaa MMaarrccooss PPiivvaattttoo OOrriieennttaaddoorraa:: PPrrooffªª DDrrªª VVaannddeerrllaann ddaa SSiillvvaa BBoollzzaannii CCoo--OOrriieennttaaddoorr:: PPrrooff.. DDrr.. IIaann CCaassttrroo--GGaammbbooaa Dissertação apresentada ao Instituto de Química – Campus de Araraquara da Universidade Estadual Paulista, como requisito para a obtenção do título de Mestre, no Curso de Pós-Graduação em Química, área de concentração Química Orgânica. Araraquara 2005 FICHA CATALOGRÁFICA Pivatto, Marcos P693e Estudo fitoquímico dos frutos de Senna spectabilis e análise comparativa do perfil alcaloídico de S. spectabilis e Cassia leptophylla / Marcos Pivatto. – Araraquara : [s.n], 2006 135 f. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Vanderlan da Silva Bolzani Co-orientador: Ian Castro-Gamboa 1. Produtos naturais. 2. Alcalóides. 3. Alcalóides piperidínicos. 4. Perfil alcaloídico. I. Título. Elaboração: Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação MARCOS PIVATTO Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química. Araraquara, 01 de dezembro de 2005. BANCA EXAMINADORA Dados Curriculares 1 DADOS PESSOAIS Nome: Marcos Pivatto Nascimento: 16/01/1979, Corbélia/PR - Brasil CPF: 914738451-49 RG: 3511018-8114935 2 FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO 2003 - 2005 Mestrado em Química. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. Título: Estudo fitoquímico dos frutos de Senna spectabilis e análise comparativa do perfil alcaloídico de S. spectabilis e Cassia leptophylla. Ano de obtenção: 2005. Orientador: Vanderlan da Silva Bolzani. Bolsista do: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES, Brasil. 1999 - 2003 Graduação em Química Bacharelado. Universidade Federal de Mato Grosso, UFMT, Mato Grosso, Brasil. Título: Estudo da sorção do inseticida endosulfan e seu metabólito sulfato de endosulfan em solos do tipo Glei Húmico e Latossolo Vermelho Amarelo. Orientador: Drª Eliana Freire Gaspar de Carvalho Dores. Bolsista do: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPQ, Brasil. 3 ATUAÇÃO PROFISSIONAL Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT Vínculo institucional 2000 - 2003 Vínculo: Bolsista de Iniciação Científica, Enquadramento funcional: Bolsista PIBIC - CNPq/UFMT, Carga horária: 20 h semanais, Regime: Dedicação exclusiva. Atividades 8/2002 - 7/2003 Outra atividade técnico-científica, Departamento de Química. Atividades realizadas 1. Bolsista de Iniciação Científica. 8/2000 - 4/2003 Estágio, Departamento de Química. Estágios realizados 1. Estágio no Grupo de Estudos de Poluentes Ambientais, envolvendo Análise de Resíduos de Biocidas. 8/2001 - 7/2002 Outra atividade técnico-científica, Departamento de Química. Atividades realizadas 1. Bolsista de Iniciação Científica. 8/2000 - 7/2001 Outra atividade técnico-científica, Departamento de Química. Atividades realizadas 1. Bolsista de Iniciação Científica. 4 PRODUÇÃO CIENTÍFICA E TECNOLÓGICA 4.1 PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA 4.1.1 Resumos simples em anais de eventos 1 PIVATTO, Marcos; DORES, Eliana Freire Gaspar de Carvalho; VILLA, Ricardo Dalla; SHERWINSKI, Sônia Lima; ABREU, Adley Bergson Gonçalves de; CARBO, Leandro; CUNHA, Marcelo Luiz Ferreira. Avaliação do grau de contaminação dos recursos hídricos do Pantanal por biocidas e metais. In: IX ENCONTRO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2001, Cuiabá. Anais do IX Encontro de Iniciação Científica. Cuiabá: UFMT, 2001. p. 83-83. 2 VILLA, Ricardo Dalla; ALVES, Bety Virgínia; DORES, Eliana Freire Gaspar de Carvalho; PIVATTO, Marcos; SHERWINSKI, Sônia Lima; ABREU, Adley Bergson Gonçalves de; CARBO, Leandro; CUNHA, Marcelo Luiz Ferreira. Determinação de DDT em solo do Galpão Sanitário da Funasa - MT. In: IX ENCONTRO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2001, Cuiabá. Anais do IX Encontro de Iniciação Científica. Cuiabá: UFMT, 2001. p. 77-77. 3 ABREU, Adley Bergson Gonçalves de; DORES, Eliana Freire Gaspar de Carvalho; PIVATTO, Marcos; VILLA, Ricardo Dalla; SHERWINSKI, Sônia Lima; CARBO, Leandro; CUNHA, Marcelo Luiz Ferreira. Determinação de DDT total em agentes da Funasa - Distrito de Cáceres - MT. In: IX ENCONTRO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2001, Cuiabá. Anais do IX Encontro de Iniciação Científica. Cuiabá: UFMT, 2001. p. 82-82. 4 SHERWINSKI, Sônia Lima; ALVES, Bety Virgínia; DORES, Eliana Freire Gaspar de Carvalho; VILLA, Ricardo Dalla; PIVATTO, Marcos; ABREU, Adley Bergson Gonçalves de; CARBO, Leandro; CUNHA, Marcelo Luiz Ferreira. Resíduos de pesticidas organoclorados no leite pasteurizado comercializado na região de Cuiabá - MT. In: IX ENCONTRO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2001, Cuiabá. Anais do IX Encontro de Iniciação Científica. Cuiabá: UFMT, 2001. p. 78-78. 5 PIVATTO, Marcos; DORES, Eliana Freire Gaspar de Carvalho; MARTINS, Eucarlos de Lima; ABREU, Adley Bergson Gonçalves de; CARBO, Leandro; CUNHA, Marcelo Luiz Ferreira. Avaliação do potencial de contaminação do ambiente por biocidas devido ao seu uso em áreas de lavoura de algodão. In: X ENCONTRO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2002, Cuiabá. Anais do X Encontro de Iniciação Científica. Cuiabá: UFMT, 2002. p. 63-63. 6 ABREU, Adley Bergson Gonçalves de; DORES, Eliana Freire Gaspar de Carvalho; MARTINS, Eucarlos de Lima; PIVATTO, Marcos; CARBO, Leandro; CUNHA, Marcelo Luiz Ferreira. Avaliação do Potencial de Contaminação do ambiente por biocidas devido ao seu uso em áreas de lavoura de algodão. In: X ENCONTRO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2002, Cuiabá. Anais do X Encontro de Iniciação Científica. Cuiabá: UFMT, 2002. p. 62-62. 7 VILLA, Ricardo Dalla; DORES, Eliana Freire Gaspar de Carvalho; MARTINS, Eucarlos de Lima; PIVATTO, Marcos; ABREU, Adley Bergson Gonçalves de; CARBO, Leandro; CUNHA, Marcelo Luiz Ferreira. Avaliação do potencial de contaminação do ambiente por biocidas devido ao seu uso em áreas de lavoura de algodão. In: X ENCONTRO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2002, Cuiabá. Anais do X Encontro de Iniciação Científica. Cuiabá: UFMT, 2002. p. 65-65. 8 VILLA, Ricardo Dalla; DORES, Eliana Freire Gaspar de Carvalho; MARTINS, Eucarlos de Lima; ABREU, Adley Bergson Gonçalves de; PIVATTO, Marcos; CARBO, Leandro; CUNHA, Marcelo Luiz Ferreira. Determinação de DDT em solo do galpão sanitário da Funasa em Varzea-Grande - MT. In: X ENCONTRO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2002, Cuiabá. Anais do X Encontro de Iniciação Científica. Cuiabá: UFMT, 2002. p. 64-64. 9 PIVATTO, Marcos; ABREU, Adley Bergson Gonçalves de; DORES, Eliana Freire Gaspar de Carvalho; MARTINS, Eucarlos de Lima; CARBO, Leandro; CUNHA, Marcelo Luiz Ferreira. Estudo da adsorção do inseticida endosulfan e seu metabólito sulfato de endosulfan em solo do tipo Glei Húmico. In: II ECOQ/XII ECODEQ - IQ/UNB, 30/09 a 02/10/2002, 2002, Brasília. 2002. 10 MARTINS, Eucarlos de Lima; DORES, Eliana Freire Gaspar de Carvalho; PIVATTO, Marcos; ABREU, Adley Bergson Gonçalves de. Estudo da adsorção dos inseticidas clorpirifós e lambda-cialotrina em solos Glei Húmico e Latossolo coletados em Mato Grosso. In: II ECOQ/XII ECODEQ - IQ/UNB, 30/09 a 02/10/2002, 2002, Brasilia. 2002. 11 ABREU, Adley Bergson Gonçalves de; DORES, Eliana Freire Gaspar de Carvalho; PIVATTO, Marcos; MARTINS, Eucarlos de Lima; CARBO, Leandro; CUNHA, Marcelo Luiz Ferreira. Estudo de adsorção de herbicidas utilizados na lavoura de algodão em solo Glei Húmico. In: II ECOQ/XII ECODEQ - IQ/UNB, 30/09 a 02/10/2002, 2002, Brasília. 2002. 12 PIVATTO, Marcos; SILVA, Sebastião Claudino da; DORES, Eliana Freire Gaspar de Carvalho; MARTINS, Eucarlos de Lima; ABREU, Adley Bergson Gonçalves de. Estudo da sorção do inseticida endosulfan e seu metabólito sulfato de endosulfan em solos do tipo Glei Húmico e Latossolo Vermelho Amarelo. In: XI ENCONTRO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2003, Cuiabá. Anais do XI Encontro de Iniciação Científica. Cuiabá: UFMT, 2003. p. 52-52. 13 SANTOS, Denise Graziele Gois; DORES, Eliana Freire Gaspar de Carvalho; SILVA, Sebastião Claudino da; PIVATTO, Marcos; ABREU, Adley Bergson Gonçalves de; MARTINS, Eucarlos de Lima; CARBO, Leandro; CUNHA, Marcelo Luiz Ferreira. Estudo das interações sortivas do herbicida atrazina em Latossolo Vermelho Amarelo. In: XI ENCONTRO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2003, Cuiabá. Anais do XI Encontro de Iniciação Científica. Cuiabá: UFMT, 2003. p. 51-51. 14 PIVATTO, Marcos; GAMBOA, Ian Castro; VIEGAS JUNIOR, Claudio; FURLAN, Maysa; SILVA, Dulce Helena Siqueira; BOLZANI, Vanderlan da Silva. Estudo químico dos frutos de Senna spectabilis visando o Isolamento de novos alcalóides piperidínicos bioativos. In: 28ª REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE QUÍMICA, 2005, Poços de Caldas - MG. Química para o Desenvolvimento Sustentável e Inclusão Social. Ipiranga - SP: Copypress, 2005. p. PN-09. 15 PIVATTO, Marcos; CROTTI, Antônio Eduardo Miller; VIEGAS JUNIOR, Cláudio; REZENDE, Amanda de; GAMBOA, Ian Castro; YONG, Maria Claudia Marx; SILVA, Dulce Helena Siqueira; BOLZANI, Vanderlan da Silva; LOPES, Norberto Peporine. Structural elucidation of bioactive piperidine alkaloid co-metabolites from Senna spectabilis ESI-MS and ESI-MS/MS. In: INTERNATIONAL CONGRESS ON NATURAL PRODUCTS RESEARCH 46TH ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY OF PHARMACOGNOSY, 2005, Corvallis - Oregon - EUA. Frontiers in Bioorganic and Natural Products Chemistry. Corvallis: American Society of Pharmacognosy, 2005. p. 171-171. 4.1.2 Artigos completos publicados em periódicos 1 PIVATTO, Marcos; CROTTI, Antônio Eduardo Miller; LOPES, Norberto Peporine; CASTRO-GAMBOA, Ian; REZENDE, Amanda de; VIEGAS JUNIOR, Cláudio; YOUNG, Maria Cláudia Marx; FURLAN, Maysa; BOLZANI, Vanderlan da Silva. Electrospray Ionization mass spectrometry screening of piperidine alkaloids from Senna spectabilis (Fabaceae) extracts: Fast identification of new constituents and co-metabolites. Journal of the Brazilian Chemical Society, Brasil, v. 16, n. 6B, p. 1431-1438, 2005. 4.2 PRODUÇÃO TÉCNICA 4.2.1 Demais tipos de produção técnica 1 PIVATTO, Marcos. Vetores e Geometria Analítica. 1999. (Monitoria). 2 PIVATTO, Marcos. Química Analítica I. 2000. (Monitoria). 3 PIVATTO, Marcos. Química Orgânica I. 2001. (Monitoria). 4 PIVATTO, Marcos. Química Orgânica I. 2002. (Monitoria). 5 INDICADORES DE PRODUÇÃO Produção bibliográfica Artigos publicados em periódicos - 1 Completos - 1 Trabalhos em eventos - 15 Resumos - 15 Produção técnica Demais tipos de produção técnica - 4 A meu pai, que nunca mediu esforços para que meu sonho se realizasse Agradecimentos O aprendizado foi muito mais que a dissertação de mestrado, os ensinamentos da academia foram imprescindíveis, mas a convivência do dia-dia com os colegas, professores, companheiros e amigos, foi o que me fez crescer e aprender verdadeiramente o que este período significou em minha vida. Conversas, desacertos, teimosias, alegrias, tristezas momentos de dificuldades fizeram de mim um pouco melhor e isso eu agradeço a cada um que participou dessa caminhada que só está começando. Agradeço: à profª Drª Vanderlan da Silva Bolzani, pessoa enérgica que as vezes assusta com sei jeito duro, mas que guarda dentro de si uma mãe responsável por todos os seus alunos, querendo sempre o melhor de cada um. Obrigado pela orientação, confiança e carinho. ao prof. Dr. Ian Castro-Gamboa (tio), quando o chão desaparecia dos meus pés foi você que me mostrou que por mais dolorosa que fosse a perda o conforto de uma palavra amiga torna a dor suportável. Obrigado pela co-orientação, amizade e carinho. aos membros da banca examinadora Dulce Helena Siqueira Silva e Norberto Peporine Lopes a quem admiro e considero um amigo, profissional exemplar responsável e dinâmico. aos técnicos Alberto Camilo Alécio e Nivaldo Boralle pelos excelentes espectros de massas e RMN, respectivamente, pelas discussões e dúvidas esclarecidas, a tia Hélia pelo carinho e amizade. Em nome de alguns, agradeço aos colegas e amigos do Departamento de Química Orgânica: Adriana (Kbção), Mariana Carrara Cafêu, Marcelo Telascrea, Geraldo, Helder, Jonas, Luciana de Ávila, Andreinha, Débora Baldoqui, Viviane, Maria Amélia, Patrícia Pauleti, Nina, Renata Sordi, Ioanis, Marcos (Tomate), do Departamento de Química Analítica Gilbert, Elias, Cláudio, Emanuel, prof. Massao, pelos conselhos e amizade. aos funcionários do Instituto de Química UNESP – Araraquara, pelo convívio, suporte e disposição em ajudar. aos meus “irmãos” Cláudio Viegas Júnior, Patrícia Pauleti, Camila Kissi Higa, Luis Octávio Regasini, obrigado por agüentarem minhas teimosias. Aprendi muito com vocês! à Amanda pelo carinho e amizade. Você é uma pessoa especial que apareceu na minha vida. Tia, te gosto de grande!!! às meninas da república Crocólis: Dani, Cecília, Fer e ao agregado Binha. Quando a saudade de casa apertava a amizade e carinho de vocês fez a diferença. Valeu pelos churrascos, almoços, bolos... . Adoro vocês!!! aos amigos de república (Cuiabanos) Adriano Buzutti de Siqueira e Danilo Luiz Flumignan, pelos momentos de descontração, discussões, alegrias e amizade. Se não foram tão bons no futebol, foram grandes amigos. aos amigos de Mineiros: Roberto César, Armando, Gideone, Luciana, Tinta, Mirela, Júlio César, Maysa, Camila, Baterinha, Diego, Galvani, Lilia, que mesmo a distância fizeram parte da minha vida. à minha mãe Marisa Pivatto, minha irmã Jackeline Kelly Pivatto, minhas tias Maria Estér Acadroli Carvalho e Marizete Acadroli Santos e minha avó Otacília Ida Acadroli pelas orações, carinho e amor incondicional. Vocês são o alicerce da minha vida! àqueles que mesmo de passagem deixaram um pouco de si, obrigado! Se levaram alguma coisa de mim, devolvam!!! rsrsrsrs à Deus por ter colocado essas pessoas em minha vida. ““OO qquuee pprreevveemmooss rraarraammeennttee ooccoorrrree,, oo qquuee mmeennooss eessppeerraammooss ggeerraallmmeennttee aaccoonntteeccee”” Benjamin Disraeli Resumo O presente trabalho objetivou o estudo fitoquímico dos frutos de Senna spectabilis e o estudo comparativo do perfil alcaloídico entre S. spectabilis e Cassia leptophylla, outra espécie vegetal relatada como fonte de alcalóides piperidínicos. O estudo fitoquímico dos frutos de S. spectabilis forneceu 4 alcalóides piperidínicos: cassina (1), 3-O-acetil-cassina (20), 3-O-feruloil-cassina (18) e um estereoisômero da cassina (19), cujas configurações, ralativa e absoluta, ainda não foram determinadas. Dentre estes, somente a cassina (1) já era conhecida e foi isolada, em nosso grupo de pesquisa, como o alcalóide majoritário das flores da mesma espécie. Estes alcalóides foram avaliados quanto às atividades seqüestradora de radicais livres (DPPH) e inibidora da enzima acetilcolinesterase. As substâncias 1, 2 e 4 apresentaram forte atividade anticolinesterásica, com concentração inibitória mínima semelhante à galantamina, utilizada como padrão positivo. Quanto à atividade seqüestradora de radicais livres, o único que apresentou leve estabilização do radical foi o derivado feruloil piperidínico (18), quando comparado com a rutina, utilizada como padrão positivo. Entretanto, a maior concentração do alcalóide não atingiu a concentração inibitória de 50% (IC50), observada para a rutina. O estudo do perfil químico entre as espécies S. spectabilis e C. leptophylla foi inicialmente baseado em experimentos comparativos de cromatografia em camada delgada e ressonância magnética nuclear de hidrogênio. Os resultados obtidos demonstraram que somente os extratos das flores e frutos de S. spectabilis apresentavam substâncias alcaloídicas como metabólitos detectáveis. Por outro lado, a análise por espectrometria de massas permitiu evidenciar metabólitos alcaloídicos piperidínicos em ambas as espécies estudadas, levando-nos a concluir sobre a importância desta técnica na bioprospecção de metabólitos minoritários. Abstract The present work aimed the phytochemical study of the fruits of Senna spectabilis and a comparative analysis of the alkaloid profile between S. spectabilis and Cassia leptophylla, another species reported as a source of piperidine alkaloids. The phytochemical study of the fruits of S. spectabilis furnished 4 piperidine alkaloids: cassine (1), 3-O-acetyl-cassine (20), 3-O-feruloyl-cassine (18) and a stereoisomer of cassine (19), whose absolute and relative configurations were not stablished yet. Among these, only cassine (1) was already known and it had been previously isolated as the major alkaloid of the flowers in the same species. These alkaloids were evaluated for their potential as free radical scavengers towards DPPH and acetylcholinesterase inhibitors. Substances 1, 2 and 4 showed strong activity in inhibition of acetylcholinesterase, with a minimum inhibitory concentration similar to galantamina, used as a reference compound. In the free radical scavenger assay, compound 18 was the only active, showing a slightly radical stabilization, when compared with the rutina, used as a reference compound. However, the largest concentration of the alkaloid didn’t reach the inhibitory concentration for 50% (IC50), obtained by rutina. The chemical profile study between S. spectabilis and C. leptophylla species was initially based on comparative experiments using thin layer chromatography, and proton nuclear magnetic resonance. The results indicated that alkaloidal metabolites were present only in the S. spectabilis extracts. On the other hand, analysis by tandem mass spectrometry revealed the presence of piperidine alkaloids in both species, leading us to conclude the relevance of this technique in bioprospecting of minority metabolites. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 22 1.1. Considerações gerais sobre o posicionamento taxonômico Cassia/Senna e seus usos na medicina popular ................................................................................... 26 1.2. Descrição botânica de Senna spectabilis e Cassia leptophylla ...................... 28 Senna spectabilis ............................................................................................................ 28 Cassia leptophylla .......................................................................................................... 30 1.3. Alcalóides piperidínicos ................................................................................. 31 1.3.1. Proposta biossintética para os alcalóides piperidínicos.............................. 34 1.4. Espécies de Senna e/ou Cassia como fontes de alcalóides piperidínicos....... 35 1.5. Considerações gerais sobre a espectrometria de massas ionização por electrospray ................................................................................................................ 38 2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 39 3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 40 3.1. Instrumentação ............................................................................................... 40 3.2. Materiais Utilizados........................................................................................ 41 3.2.1. Solventes..................................................................................................... 41 3.2.2. Cromatografia............................................................................................. 41 3.3. Reveladores Utilizados ................................................................................... 42 3.3.1. Revelador de Iodocloroplatinato ................................................................ 42 3.3.2. Revelador Dragendorff ............................................................................... 42 3.3.3. Revelador de Anisaldeído........................................................................... 43 3.3.4. Iodo Sublimado .......................................................................................... 43 3.4. Preparo do Material Vegetal........................................................................... 43 3.5. Partição líquido/líquido .................................................................................. 44 3.6. Preparo das amostras para CLAE................................................................... 44 3.7. Extração ácido/base ........................................................................................ 45 3.8. Avaliação das atividades antioxidante e anticolinesterásica .......................... 46 3.8.1. Ensaio espectrofotométrico com 2,2-difenil-picrilhidrazina (DPPH) ........ 46 3.8.2. Avaliação da atividade anticolinesterásica ................................................. 47 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 50 4.1. Estudo fitoquímico dos frutos de Senna spectabilis...................................... 50 4.2. Elucidação estrutural dos alcalóides isolados................................................. 53 4.2.1. Elucidação estrutural do alcalóide 1 ........................................................... 53 Proposta de configuração relativa para o alcalóide 1..................................................... 69 4.2.2. Elucidação estrutural do alcalóide 20 ......................................................... 70 Proposta de configuração relativa para o alcalóide 20................................................... 87 4.2.3. Elucidação estrutural do alcalóide 18 ......................................................... 87 Proposta de configuração relativa para o alcalóide 18................................................. 105 4.2.4. Elucidação estrutural do alcalóide 19 ....................................................... 106 4.3. Ensaio antioxidante com DPPH ................................................................... 120 4.4. Avaliação da atividade anticolinesterásica ................................................... 121 4.5. Análise do perfil alcaloídico de Senna spectabilis e Cassia leptophylla ..... 122 4.5.1. Cromatografia em Camada Delgada, RMN de 1H, CLAE-UV e EM ...... 122 5. CONCLUSÕES.................................................................................................... 129 Perspectivas ................................................................................................................. 130 6 REFERÊNCIAS................................................................................................... 131 Lista de Figuras Figura 1. Glicosídeo do ácido salicílico (salicilina), produto natural isolado de Salix alba e os derivados sintéticos: ácido salicílico e ácido acetil salicílico ........ 24 Figura 2. Senna spectabilis: detalhes da planta, flores, frutos, sementes, casca e madeira . ............................................................................................................................... 29 Figura 3. Senna spectabilis: espécime cultivado no IQ–UNESP Araraquara, de onde foram coletados as flores e frutos. .......................................................................... 29 Figura 4. Cassia leptophylla: detalhes da planta, flores, frutos, sementes, casca e madeira. .................................................................................................................. 30 Figura 5. Morfina, alcalóide isolado do látex da papoula de Papaver somniferum ....... 31 Figura 6. Coniína, alcalóide isolado de Conium maculatum, causador da morte do filósofo grego Sócrates no ano de 399 a.C. ........................................................... 32 Figura 7. Atropina, isolada de Hyoscyamus niger.......................................................... 32 Figura 8. Tubocurarina, isolada de Strychnos castelnaeana, utilizada pelos índios nas flechas para a caça .................................................................................................. 33 Figura 9. Proposta de biogênese para os alcalóides da coniína a partir da lisina ........... 34 Figura 10. Hipótese biossintética para os alcalóides da cicuta com base nos estudos de marcação isotópica e de degradação....................................................................... 35 Figura 11. Alcalóides piperidínicos isolados de espécies de Senna/Cassia ................... 37 Figura 12. Partição do extrato dos frutos do espécime S. spectabilis............................. 44 Figura 13. Pré-tratamento das amostras, extração de substâncias lipofílicas................. 45 Figura 14. Esquema modificado de extração ácido/base para o isolamento dos alcalóides piperidínicos ........................................................................................................... 46 Figura 15. Reação de redução do radical DPPH ............................................................ 47 Figura 16. Galantamina, controle positivo nos ensaios de inibição de AChE................ 48 Figura 17. Reação da AChE com acetato de 1-naftila e subseqüente formação do corante azóico roxo no bioensaio em CCD......................................................................... 49 Figura 18. Esquema de purificação da fração SSFr – CH2Cl2........................................ 52 Figura 19. Cromatograma da sub-fração PMC.01 F28-30. Condições cromatográficas: coluna Phenomenex LC18 5 µm, 250 x 4,6 mm, fase móvel: 5 a 100% de ACN – HOAc 5%, (30 min), fluxo: 1 mL/min, detecção: UV 254 nm .............................. 52 Figura 20. Correlações 1H–13C observadas no mapa de contorno gHMBC do alcalóide 1 ................................................................................................................................ 67 Figura 21. Proposta de fragmentação para o alcalóide 1 e seu homólogo...................... 69 Figura 22. Correlações 1H–13C observadas no mapa de contorno gHMBC do alcalóide 20............................................................................................................. 85 Figura 23. Correlações 1H–13C observadas no mapa de contorno gHMBC do alcalóide 18........................................................................................................... 102 Figura 24. Proposta de fragmentação para o alcalóide 18 e seu homólogo.................. 104 Figura 25. Correlações 1H–13C observadas no mapa de contorno gHMBC do alcalóide 19........................................................................................................... 118 Figura 26. Curva analítica do ensaio antioxidante do alcalóide 18 .............................. 121 Figura 27. Avaliação qualitativa da atividade anticolinesterásica: a) alc. 18; b) alc. 19; c) alc. 1; d) alc. 20 e e) controle galantamina........................................................... 121 Figura 28. Bioautografia em placa de sílica, avaliação da CIM para os alcalóides inibidores de AChE .............................................................................................. 122 Figura 29. Cromatoplacas comparando o perfil alcaloídico da extração ácido/base (1, 2, 3, 4), e das matrizes tratadas conforme item 3.6 (1', 2', 3', 4'), com os padrões isolados de S. spectabilis (SiO2 GF254; CHCl3:MeOH:NH4OH; 9:1:0,25; IClPt). .............................................................................................................................. 123 Figura 30. Cromatoplaca comparativa da fração alcalóidica da extração ácido/base com os alcalóides isolados de S. spectabilis, observada sob lâmpada de UV 365 nm e em seguida revelada com IClPt (SiO2 GF254; CHCl3:MeOH:NH4OH; 9:1:0,25). 123 Figura 31. Estrutura dos alcalóides isolados de S. spectabilis...................................... 126 Lista de Tabelas Tabela 1. Material vegetal dos espécimes coletados. ..................................................... 50 Tabela 2. Dados de RMN 1H e gCOSY (500 MHz, CDCl3) do alcalóide 1.................. 58 Tabela 3. Dados de RMN 13C, DEPT 135, gHMQC e gHMBC do alcalóide 1 ............. 61 Tabela 4. Dados de RMN 1H e gCOSY (500 MHz, CDCl3) do alcalóide 20................. 71 Tabela 5. Dados de RMN 13C, DEPT 135, gHMQC e gHMBC do alcalóide 20 ........... 75 Tabela 6. Dados de RMN 1H e gCOSY (500 MHz, CDCl3) do alcalóide 18................. 93 Tabela 7. Dados de RMN 13C, DEPT 135, gHMQC e gHMBC do alcalóide 18 ........... 98 Tabela 8. Dados de RMN 1H e gCOSY (500 MHz, CD3OD) do alcalóide 19 ............ 110 Tabela 9. Dados de RMN 13C, DEPT 135, gHMQC e gHMBC do alcalóide 19 ......... 115 Tabela 10. Ensaio antioxidante, variação percentual da absorbância (%∆A) .............. 120 Tabela 11. Frações alcaloídicas da extração ácido/base............................................... 124 Tabela 12. Determinação das fórmulas e massas moleculares por EM de alta resolução. .............................................................................................................................. 128 Lista de Espectros Espectro 1. Espectro na região do IV (KBr), do alcalóide 1 .......................................... 53 Espectro 2. Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) do alcalóide 1 ....................... 55 Espectro 3. Ampliação do espectro 2 (δ 1,0–1,5) do alcaloíde 1 ................................... 56 Espectro 4. Ampliação do espectro 2 (δ 1,7–2,4) do alcalóide 1 ................................... 56 Espectro 5. Ampliação do espectro 2 (δ 2,5–3,5) do alcalóide 1 ................................... 57 Espectro 6. Mapa de contorno gCOSY (500 MHz, CDCl3) do alcalóide 1 ................... 59 Espectro 7. Ampliação do espectro 6 (δ 1,0–1,8) do alcalóide 1 ................................... 60 Espectro 8. Espectro de RMN 13C (125 MHz, CDCl3) do alcalóide 1 ........................... 62 Espectro 9. Ampliação do espectro 8 (δ 15,0–70,0), alcalóide 1 ................................... 62 Espectro 10. Espectro de RMN 13C DEPT 135 (125 MHz, CDCl3) do alcalóide 1 ....... 63 Espectro 11. Mapa de contorno gHMQC (500 MHz, CDCl3) do alcalóide 1 ................ 64 Espectro 12. Mapa de contorno gHMBC (500 MHz, CDCl3), do alcalóide 1 ............... 65 Espectro 13. Mapa de contorno gHMBC (500 MHz, CDCl3), do alcalóide 1 ............... 66 Espectro 14. Mapa de contorno gHMBC (500 MHz, CDCl3), do alcalóide 1 ............... 66 Espectro 15. IES-EM (modo positivo) do alcalóide 1.................................................... 68 Espectro 16. IES-EM/EM íon quasi-molecular m/z = 298 do alcalóide 1 ..................... 68 Espectro 17. IES-EM/EM íon quasi-molecular m/z = 326, homólogo do alcalóide 1 ... 68 Espectro 18. Espectro de NOESY 1D (500 MHz, CDCl3), irradiando o hidrogênio δ 2,71 do alcalóide 1............................................................................................... 69 Espectro 19. Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) do alcalóide 20 .................. 70 Espectro 20. Ampliação do espectro 19 (δ 2,4–4,8) do alcalóide 20 ............................. 71 Espectro 21. Mapa de contorno gCOSY (500 MHz, CDCl3) do alcalóide 20 ............... 72 Espectro 22. Ampliação do espectro 21 (δ 1,0–3,0) do alcalóide 20 ............................. 73 Espectro 23. Ampliação do espectro 21 (δ 1,3–2,2) do alcalóide 20 ............................. 74 Espectro 24. Espectro de RMN 13C (125 MHz, CDCl3) do alcalóide 20 ....................... 76 Espectro 25. Ampliação do espectro 24, alcalóide 20 .................................................... 76 Espectro 26. Espectro de RMN 13C DEPT 135 (125 MHz, CDCl3) do alcalóide 20 ..... 77 Espectro 27. Ampliação do espectro 26 (δ 20,0–70,0) do alcalóide 20 ......................... 77 Espectro 28. Mapa de contorno gHMQC (500 MHz, CDCl3) do alcalóide 20 .............. 78 Espectro 29. Mapa de contorno gHMQC (δ 16,0–32,0) do alcalóide 20 ....................... 79 Espectro 30. Mapa de contorno gHMQC (δ 40,0–75,0) do alcalóide 20 ....................... 80 Espectro 31. Mapa de contorno gHMBC (500 MHz, CDCl3), do alcalóide 20 ............. 81 Espectro 32. Mapa de contorno gHMBC (δ 16,0–34,0), do alcalóide 20 ...................... 82 Espectro 33. Mapa de contorno gHMBC (δ 16,0–32,0) do alcalóide 20 ....................... 83 Espectro 34. Mapa de contorno gHMBC (δ 45,0–70,0) do alcalóide 20 ....................... 84 Espectro 35. Mapa de contorno gHMBC (δ 170,0–215,0) do alcalóide 20 ................... 85 Espectro 36. IES-EM/EM íon quasi-molecular m/z = 340 do alcalóide 20 ................... 86 Espectro 37. IES-EM/EM íon quasi-molecular m/z = 326, homólogo do alcalóide 20. 86 Espectro 38. Espectro de NOESY 1D (500 MHz, CDCl3), irradiando o hidrogênio δ 2,91, do alcalóide 20............................................................................................ 87 Espectro 39. Espectro na região do IV (KBr), do alcalóide 18 ...................................... 88 Espectro 40. Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) do alcalóide 18 ................... 89 Espectro 41. Ampliação parcial (δ 1,1 – 3,0) do espectro 40, alcalóide 18 ................... 90 Espectro 42. Ampliação parcial (δ 2,5 – 5,0) do espectro 40, alcalóide 18 ................... 91 Espectro 43. Ampliação parcial (δ 6,4 – 7,8) do espectro 40, alcalóide 18 ................... 92 Espectro 44. Mapa de contorno gCOSY (δ 1,0–5,0) do alcalóide 18 ............................ 94 Espectro 45. Mapa de contorno gCOSY (δ 6,3–7,8) do alcalóide 18 ............................ 95 Espectro 46. Espectro de RMN 13C (125 MHz, CDCl3) do alcalóide 18 ....................... 96 Espectro 47. Ampliação parcial (δ 24,0–31,0) do espectro 46, alcalóide 18 ................. 96 Espectro 48. Espectro de RMN de DEPT 135 (125 MHz, CDCl3) do alcalóide 18....... 97 Espectro 49. Ampliação parcial (δ 23,0–31,0) do espectro 48, alcalóide 18 ................. 97 Espectro 50. Mapa de contorno gHMQC (δ 14,0–34,0; 500 MHz; CDCl3) do alcalóide 18............................................................................................................. 99 Espectro 51. Mapa de contorno gHMQC (δ 40,0–73,0) do alcalóide 18 ....................... 99 Espectro 52. Mapa de contorno gHMQC (δ 105,0–149,0) do alcalóide 18 ................. 100 Espectro 53. Mapa de contorno gHMBC (δ 20,0–75,0) do alcalóide 18 ..................... 100 Espectro 54. Mapa de contorno gHMBC (δ 108,0–172,0) do alcalóide 18 ................. 101 Espectro 55. Mapa de contorno gHMBC (δ 140,0–214,0) do alcalóide 18 ................. 101 Espectro 56. Experimento de NOESY 1D (500 MHz, CDCl3), irradiando os hidrogênios do grupo metoxílico em δ 3,93 do alcalóide 18.................................................... 102 Espectro 57. Espectro de IES–EM (modo positivo) do alcalóide 18 ........................... 103 Espectro 58. Espectro de IES-EM/EM do íon quasi-molecular m/z = 474 do alcalóide 18........................................................................................................... 103 Espectro 59. Espectro de IES-EM/EM do íon quasi-molecular m/z =502, homólogo do alcalóide 18........................................................................................................... 104 Espectro 60. Espectro de NOESY 1D (500 MHz, CDCl3), irradiando o hidrogênio δ 2,99 do alcalóide 18........................................................................................... 105 Espectro 61. Espectro na região do IV (KBr), do alcalóide 19 .................................... 106 Espectro 62. Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CD3OD) do alcalóide 19 ............... 107 Espectro 63. Ampliação parcial (δ 1,0–2,4) do espectro 62, alcalóide 19 ................... 108 Espectro 64. Ampliação parcial (δ 2,8–3,8) do espectro 62, alcalóide 19 ................... 109 Espectro 65. Mapa de contorno gCOSY (δ 1,1–3,8) do alcalóide 19 .......................... 111 Espectro 66. Espectro de RMN 13C (125 MHz, CD3OD) do alcalóide 19 ................... 112 Espectro 67. Ampliação parcial (δ 19,0–65,0) do espectro 66, alcalóide 19 ............... 113 Espectro 68. Espectro de RMN de DEPT 135 (125 MHz, CD3OD) do alcalóide 19... 114 Espectro 69. Ampliação parcial (δ 15,0–65,0) do espectro 68, alcalóide 19 ............... 114 Espectro 70. Mapa de contorno gHMQC (500 MHz, CD3OD), do alcalóide 19 ......... 116 Espectro 71. Mapa de contorno gHMQC (500 MHz, CD3OD), do alcalóide 19 ......... 116 Espectro 72. Mapa de contorno gHMBC (500 MHz, CD3OD), do alcalóide 19 ......... 117 Espectro 73. Mapa de contorno gHMBC (500 MHz, CD3OD), do alcalóide 19 ......... 117 Espectro 74. Mapa de contorno gHMBC (500 MHz, CD3OD), do alcalóide 19 ......... 118 Espectro 75. Espectro de IES-EM (modo positivo) do alcalóide 19 ............................ 119 Espectro 76. Espectro de IES-EM/EM do íon quasi-molecular m/z = 298 do alcalóide 19 .............................................................................................................................. 119 Espectro 77. Espectro de IES-EM/EM do íon quasi-molecular m/z = 326 do alcalóide 19 .............................................................................................................................. 119 Espectro 78. Perfil alcalóidico por RMN 1H das frações alcalóidicas da extração ácido/base das flores e frutos de S. spectabilis..................................................... 124 Espectro 79. Perfil alcalóidico por RMN 1H das frações alcalóidicas da extração ácido/base das flores e folhas de C. leptophylla ................................................... 125 Espectro 80. IES-EM fração alcaloídica (ácido/base) das flores de S. spectabilis (ni = não identificado) .......................................................................................... 127 Espectro 81. IES-EM fração alcaloídica (ácido/base) dos frutos de S. spectabilis (ni = não identificado) .......................................................................................... 127 Espectro 82. IES-EM fração alcaloídica (ácido/base) das flores de C. leptophylla (ni = não identificado) .......................................................................................... 127 Espectro 83. IES-EM fração alcaloídica (ácido/base) das folhas de C. leptophylla (ni = não identificado) .......................................................................................... 128 Lista de Abreviaturas AAS – Ácido Acetil Salicílico AB-CLFl – Extração ácido/base da matriz C. leptophylla flores AB-CLFo – Extração ácido/base da matriz C. leptophylla folhas AB-SSFl – Extração ácido/base da matriz S. spectabilis flores AB-SSFr – Extração ácido/base da matriz S. spectabilis frutos AChE – acetilcolinesterase ACN – acetonitrila AcOEt – acetato de etila aq. – aquoso CCDC – Cromatografia em Camada Delgada Comparativa CC – cromatografía em coluna CIM – Concentração Inibitória Mínima CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência d – dupleto DPPH – 2,2-difenil-picrilhidrazina dq – duplo quadrupleto EECL-Fl – extrato etanólico Cassia leptophylla flores EECL-Fo – extrato etanólico Cassia leptophylla folhas EESS-Fl – extrato etanólico Senna spectabilis flores EESS-Fr – extrato etanólico Senna spectabilis frutos EM – Espectrometria de massas FE – Fase Estacionária FM – Fase Móvel gCOSY – Gradient COrrelation SpectroscopY gHMBC – Gradient Heteronuclear Multiple Bond Coherence gHMQC – Gradient Heteronuclear Multiple Quantum Coherence Hex – hexano HOAc – ácido acético HTS – high trough-put screening IC50 – Concentração de substância teste que seqüestre 50% do radical livre DPPH IClPt – revelador Iodocloroplatinato IES – Ionização por electrospray IV – Espectroscopia na região do Infravermelho MeOH – metanol m – multipleto νas – estiramento assimétrico νs – estiramento simétrico n-BuOH – n-butanol NOESY – Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY NuBBE – Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais RMN de 1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio Um RMN de 13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono Treze s – simpleto sl – simpleto largo SNC – Sistema Nervoso Central J – constante de acoplamento (em Hertz) TEA – trietilamina t – tripleto δ – deslocamento químico em relação ao TMS (expresso em ppm) 22 1. INTRODUÇÃO A utilização de plantas como fonte de medicamentos é uma prática constante e disseminada pela população ao longo dos anos, prática esta que tem suas raízes na antiguidade, onde o homem primitivo intuitivamente buscava descobrir soluções para suas necessidades básicas, como nutrição e cura de enfermidades. É provável que o emprego de plantas como medicamentos seja tão antigo quanto o próprio homem. Em estudos realizados na Tanzânia, com chimpanzés, verificou-se que estes ingeriam em jejum, folhas de certas plantas que os livravam de vermes intestinais (MIGUEL; MIGUEL, 2000). Numerosas etapas marcaram a evolução da arte de curar, porém, torna-se difícil delimitá-las com exatidão, já que a medicina esteve por muito tempo associada às práticas mágicas, místicas e ritualísticas, muitas vezes até considerando as plantas como sendo seres espirituais. Nas origens da história, a noção das plantas com ação terapêutica e tóxica passou a ser objeto de interesse. Arqueólogos encontraram partes de plantas tidas como medicinais em túmulos pré-históricos. No ano de 1975, no território atual do Iraque, foi descoberto um esqueleto humano de quase 60 mil anos de idade e junto a este, foi encontrada petrificada pequena quantidade de pólen concentrado de achilea e jacinto, utilizados até hoje pelos camponeses da região (MIGUEL; MIGUEL, 2000). Já no ano 3000 a.C., a China dedicava-se ao cultivo de plantas medicinais. Sabe-se também que, desde 2300 a.C., os egípcios, assírios e hebreus cultivavam diversas ervas e traziam de suas expedições tantas outras. Com estas plantas, chegavam a criar purgantes, vermífugos, diuréticos, cosméticos e especiarias culinárias, além de líquidos e gomas utilizados em mumificação (MARTINS et al., 2003). Na Grécia antiga, as plantas juntamente com o seu valor terapêutico ou tóxico eram muito conhecidas. Hipócrates (460-377 a.C.), denominado o “Pai da Medicina”, reuniu em sua obra “Corpus Hipocratium” a síntese dos conhecimentos médicos de seu tempo, indicando para cada enfermidade o remédio vegetal e o tratamento adequado. No começo da Era Cristã, Dioscórides enumerou em seu tratado, “De Materia Medica”, mais de 500 drogas de origem vegetal, descrevendo o emprego terapêutico de muitas delas (MARTINS et al., 2003). Na Idade Média, a medicina e o estudo das plantas medicinais estagnaram-se por um longo período. Os eventos históricos que surgiram na Europa, como a ascensão e 23 queda do Império Romano e o fortalecimento da Igreja Católica, exerceram enorme influência sobre todo conhecimento existente na época, incluindo as informações acerca de plantas medicinais. Muitos dos escritos dos filósofos gregos foram esquecidos ou mesmo perdidos, para serem parcialmente recuperados apenas no início do século XVI (MARTINS et al., 2003). Segundo Phillipson (2001), alguns mosteiros europeus mantiveram viva a literatura medicinal, mas fora desses locais propagava-se o folclore, normalmente com rituais mágicos. No seu processo de evolução, a arte de curar recebeu poderoso impulso dos alquimistas. Dentre os quais destaca-se Paracelso, que lançou as bases da medicina natural e foi um dos principais responsáveis pelo avanço da terapêutica do século XVI (MARTINS et al., 2003). Mas foi a partir do final do século XVIII e início do século XIX, com a consolidação da Química como disciplina científica moderna, que os estudos com plantas medicinais ganharam impulso. Os princípios ativos passaram a ser isolados das plantas medicinais e suas estruturas determinadas. Estabelecia-se assim o paradigma ocidental, que apenas um simples e único composto ativo apresenta os efeitos farmacológicos definidos (YUNES; CALIXTO, 2001). O ano de 1828 passou a ser um marco para a história da Química de Produtos Naturais. Buchner, estudando as cascas de Salix alba (Figura 1), isolou pela primeira vez o princípio ativo responsável pelas propriedades farmacológicas dessa planta, o glicosídeo do álcool salicílico (Figura 1). Inicia-se assim, a história do analgésico mais vendido no mundo. Em 1860, Kolbe e Lauteman sintetizam o ácido salicílico (Figura 1) e seu sal sódico a partir do fenol. Felix Hofman, em 1898, sintetizou um composto de caráter menos ácido, acetilando o grupo hidroxila na posição orto, descobrindo assim o tão usado ácido acetil salicílico (AAS) (Figura 1). Era a obtenção do primeiro fármaco sintético, oriundo da otimização de um produto natural, através de uma correlação de estrutura e propriedade química, com possibilidade de ser usado de forma maciça, devido à facilidade de sua síntese e de seu baixo custo (YUNES; CALIXTO, 2001). 24 Figura 1. Glicosídeo do ácido salicílico (salicilina), produto natural isolado de Salix alba e os derivados sintéticos: ácido salicílico e ácido acetil salicílico Assim estavam lançadas as bases da química medicinal moderna. Nos anos seguintes surgiriam novos fármacos de origem sintética. A química de produtos naturais, passaria do âmbito único e exclusivo das plantas a englobar também os insetos, microrganismos (fungos, bactérias, etc), animais, minerais e organismos marinhos como fontes naturais de modelos moleculares a fármacos (SOEJARTO, 1996). A partir da segunda metade do século XX, novas técnicas analíticas, incluindo equipamentos de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), Espectrometria de Massas e Cromatografia, passaram a constituir ferramentas fundamentais para o isolamento e determinação estrutural dos compostos naturais, inclusive os bioativos, de maneira rápida, reprodutível e com isso diminuir o tempo experimental despendido no procedimento fitoquímico. Acompanhando esse processo, foram desenvolvidas as tecnologias de screening em larga escala (HTS = high trough-put screening) permitindo a análise de até cem mil compostos num único dia em relação a determinados alvos biológicos (YUNES; CALIXTO, 2001). As técnicas avançadas de HTS dependem da análise de um grande número de compostos os quais podem ser obtidos ou por química combinatória ou pela quimiodiversidade produzida pela natureza. Deve ser mencionado que a primeira, tão propalada no final do século passado, ainda não conseguiu, pelo menos até o presente, seu objetivo de ser a principal fonte de diversidade de estruturas moleculares, uma vez que este é um requisito fundamental na pesquisa farmacêutica visando atingir diferentes alvos biológicos. Diante dos resultados pouco produtivos da química combinatória, os cientistas voltaram seus estudos para os produtos naturais, considerando que durante os milhões de anos de evolução biológica a seleção natural foi capaz de produzir Salix alba glicosídeo do álcool salicílico ácido salicílico ácido acetil salicílico O O OH OH CH2OH HO OH O O CH2OH COOH COOH 25 substâncias complexas, quase que impossíveis de serem obtidas por um processo de química combinatória (YUNES; CALIXTO, 2001). Apesar da flora mundial constituir uma importante fonte de matéria-prima para a busca de substâncias com estruturas e ação farmacológica inéditas, esta riqueza vegetal responde apenas com a produção de cerca de 120 fármacos em uso clínico (SOEJARTO, 1996). Outro dado marcante sobre as plantas floríferas refere-se ao último levantamento publicado por Verpoorte et al. (1998), demonstrando que das 34.847 espécies quimicamente estudadas, 30% apresentaram alguma atividade biológica. Se considerarmos este dado estatístico e a quantidade de espécies ainda sem qualquer estudo, é possível especular o isolamento de no mínimo um milhão de metabólitos secundários a partir de fontes vegetais (VERPOORTE et al., 1998). Pelos comentários apresentados, o valor agregado dos medicamentos de origem vegetal não pode ser desconsiderado. Acredita-se que a venda mundial destes medicamentos movimenta, anualmente, um comércio em torno de U$ 22 bilhões (HARVEY et al., 1998). Segundo Matos (1997), na década de 1970, 41% das receitas médicas prescritas nos Estados Unidos continham uma ou mais substâncias de origem vegetal. No Brasil, em 1994, 5,5% do mercado de medicamentos vendidos em farmácias (U$ 212 milhões) correspondiam às vendas de medicamentos contendo exclusivamente princípios ativos de origem vegetal (FERREIRA, 1998). O Brasil, com aproximadamente 22% de todas as angiospermas, ainda possui uma das maiores biodiversidades do planeta, mesmo contabilizando o alto índice de devastação que vem ocorrendo na Amazônia, Mata Atlântica e Cerrado. Apesar dessa enorme variedade de plantas, muitas das quais com aplicação medicinal, apenas uma pequena parcela teve algum estudo químico ou biológico realizado. Assim, a exploração racional da biodiversidade brasileira, mesmo na era pós-genômica, é um tema recorrente e merece investimento objetivando a busca de novos fármacos (BOLZANI et al., 1999). A bioprospecção auxiliada por testes biológicos gerais e/ou específicos é hoje considerada uma das formas mais racionais para a busca de fármacos potenciais de origem vegetal. No contexto nacional, a pesquisa de bioprospecção, com certeza, possibilitará a identificação de uma maior variedade de metabólitos secundários bioativos, uma vez que muitas famílias de plantas estão associadas a classes específicas de substâncias, sendo que inúmeras espécies continuam sem qualquer estudo químico e/ou biológico (SOERJARTO, 1996). 26 Entre os estudos químicos e biológicos da flora paulista, principalmente da Mata Atlântica e do Cerrado, destacam-se aqueles sobre o “Estudo Químico e Biológico de Rubiaceae Brasileiras”, no final da década de 80. O projeto teve como objetivo não só conhecer a composição química das várias espécies de Rubiaceae destes biomas, mas também detectar substâncias antifúngicas potenciais. Ao longo de quinze anos, mais de trinta espécies de Rubiaceae tiveram suas composições químicas, atividades antifúngica e antitumoral avaliadas (BOLZANI et al., 1999). Em 1999, o programa interdisciplinar Biota-FAPESP (Conservação e Utilização da Biodiversidade do Estado de São Paulo, http://www.biota.org.br) foi criado com o objetivo de mapear e catalogar de maneira racional toda a biodiversidade remanescente do Estado de São Paulo. Dentre os vários projetos inseridos neste programa encontra-se o “Conservação e uso sustentável da diversidade vegetal do Cerrado e Mata Atlântica: Diversidade química e prospecção de fármacos potenciais” que vem sendo desenvolvido pelo Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE). 1.1. Considerações gerais sobre o posicionamento taxonômico Cassia/Senna e seus usos na medicina popular Com o novo sistema de classificação taxonômica adotado para a família Leguminosae, várias espécies de Cassia foram incluídas no grupo Senna, outras continuaram como Cassia e algumas continuam como sinonímia de Senna. Esta família, uma das maiores dentre as Angiospermae, pela nova classificação passou a ser denominada Fabaceae e está subdividida em três subfamílias: Mimosoideae, Fabaoideae e Caesalpinioideae. Nesta última, estão incluídos os gêneros Cassia e Senna, bastante estudados, devido à importância de seus usos na medicina popular (RIBEIRO et al., 1999). Mulchandani e Hassarajani (1977), estimavam o conhecimento de cerca de 200 espécies pertencentes ao gênero Cassia. Segundo Agarkar e Jadge (1999), existem hoje mais de 600 espécies, entre arbustos, árvores e ervas. Com as recentes modificações na classificação das leguminosas, o gênero Cassia, diminuiu devido à mudança de posição taxonômica de várias espécies de Cassia para Senna. Com base nos estudos de morfologia floral principalmente, algumas espécies de Cassia continuam com a sua 27 posição inalterada, muito embora, várias ainda continuem como sendo sinonímia de Senna. Esta confusão taxonômica entre os dois gêneros é um problema para os estudos químicos e farmacológicos que o NuBBE está realizando com a espécie Senna spectabilis, erroneamente identificada em nossos estudos anteriores como Cassia leptophylla. Dentre as espécies dos gêneros Cassia/Senna mais estudadas, cerca de vinte e seis são relatadas como fontes de derivados antracênicos, substâncias descritas como responsáveis pelas atividades dos extratos de C. fistula (sinonímia Senna fistula), C. sophera (sinonímia S. sophera), C. alata (sinonímia S. alata), C. obtusifolia (sinonímia S. obtusifolia), C. tora (sinonímia S. obtusifolia), C. angustifólia (S. angulata), C. autifolia, C. nodosa (sinonímia C. javanica) e C. cinnamon, bastante estudadas devido aos relatos de seu uso popular no tratamento de diabetes, infecções microbianas e virais, febre, parasitoses, inflamações, asma e feridas da pele (AGARKAR; JADGE, 1999). Recentemente, algumas espécies dos gêneros Cassia e Senna vêm despertando maior interesse para estudos químicos e farmacológicos, devido ao seu uso popular em países do continente asiático e africano, principalmente na Índia e na China. Nestes países, formulações medicamentosas com plantas destes gêneros são utilizadas no tratamento de uma série de enfermidades em substituição ao tratamento alopático convencional. Isto se deve, principalmente, ao fato de que em alguns destes países a renda per capita é muito baixa, levando a população ao uso de plantas para o tratamento de suas doenças (SAMY; IGNACIMUTHU; SEN, 1998; SAMY; IGNACIMUTHU, 2000). Nos ecossistemas brasileiros, tanto o gênero Cassia como Senna são muito freqüentes, sendo que na região sudeste algumas espécies são bastante apreciadas devido à beleza de suas flores, sendo muito utilizadas como plantas ornamentais (LORENZI, 1998). Na região norte, são bastante empregadas em medicamentos caseiros, como é o caso da canafístula (C. fistula), utilizada como purgativo (MATOS, 2000). Bhakta et al. (1999) relataram ainda o uso desta espécie no tratamento de infecções bacterianas, doenças de pele, reumatismo e desordens hepáticas. Recentemente, Ingkaninan et al. (2003) relataram a atividade inibidora de acetilcolinesterase no extrato preparado com raízes desta planta. 28 1.2. Descrição botânica de Senna spectabilis e Cassia leptophylla Senna spectabilis Senna spectabilis (Figuras 2 e 3) é uma planta arbórea, pertencente à família Fabaceae (Leguminosae), sub-família Caesalpinioideae, conhecida popularmente como são-joão, cássia-do-nordeste, canafístula-de-besouro e pau-de-ovelha, possuindo como sinonímias botânicas Cassia spectabilis (VIEGAS JUNIOR et al., 2004), ou Cassia excelsa Schrad. (LORENZI, 1998). É decídua1, heliófita2, seletiva xerófita3, pioneira e característica do nordeste semi-árido (caatinga), mas também é comum no cerrado do estado de São Paulo. Ocorre preferencialmente em solos mais profundos, bem drenados e de razoável fertilidade (LORENZI, 1998). Pode atingir de 6–9 m de altura, com tronco de 30–40 cm de diâmetro. Suas folhas são compostas pinadas4, tendo de 10–20 pares de folíolos de 2–4 cm de comprimento. Sua madeira, devido às limitações de tamanho, é aproveitada apenas para a confecção de objetos leves, caixotaria, lenha e carvão. A árvore é ornamental durante o longo período em que permanece florida, podendo ser empregada com sucesso no paisagismo em geral. Pelo porte pequeno e beleza de sua florada, é ideal para arborização de ruas, o que já vem sendo feito em muitas cidades do Estado de São Paulo. O período de floração ocorre durante os meses de dezembro–abril, já a maturação dos frutos ocorre nos meses de agosto–setembro (LORENZI, 1998). 1 decídua: vegetal que perde suas folhas numa estação específica do ano. 2 heliófita: vegetal que necessita da luminosidade solar para o desenvolvimento. 3 xerófita: vegetal que vive em ambiente seco e apresenta adaptações estruturais e funcionais que minimizam a perda de água por evaporação, próprio de regiões áridas ou com longo período de estiagem. 4 pinadas: folhas com mais de três folíolos saindo de vários pontos na raque central, ex.: 29 Figura 2. Senna spectabilis: detalhes da planta, flores, frutos, sementes, casca e madeira (LORENZI, 1998). Figura 3. Senna spectabilis: espécime cultivado no IQ–UNESP Araraquara, de onde foram coletados as flores e frutos. 30 Cassia leptophylla Cassia leptophylla Vog. é uma planta arbórea, pertencente à família Fabaceae (Leguminosae), sub-família Caesalpinioideae, conhecida popularmente como falso-barbatimão (Figura 4). É perenifólia, heliófita e característica de formações secundárias das florestas situadas em regiões altas, como as florestas de pinhais dos estados do Paraná e de Santa Catarina, sendo encontrada raramente no interior da mata primária densa. Apresenta dispersões irregulares e descontínuas, sendo bastante adaptada à insolação direta (LORENZI, 1998). Pode atingir de 8–10 m de altura, com tronco de 30–40 cm de diâmetro. Suas folhas são compostas pinadas, tendo de 8–12 pares de folíolos de 3–5 cm de comprimento. Sua madeira é moderadamente pesada, compacta, dura e moderadamente durável, pode ser empregada para obras leves como caixotaria, confecção de brinquedos, laminados, etc. Suas flores cobrem toda a copa, apresentando coloração amarela intensa, excelente para o paisagismo em geral. O período de floração ocorre durante os meses de novembro–janeiro, já a maturação dos frutos ocorre nos meses de junho–julho (LORENZI, 1998). Figura 4. Cassia leptophylla: detalhes da planta, flores, frutos, sementes, casca e madeira (LORENZI, 1998). 31 1.3. Alcalóides piperidínicos O estudo dos alcalóides teve início em 1806, quando o farmacêutico alemão Friedrich Serturner isolou pela primeira vez do ópio de Papaver somniferum a morfina (alusão à Morpheus, deus dos sonhos na mitologia grega), cuja fórmula estrutural só foi proposta em 1925, por Robinson (Figura 5) (CROTEAU; KUTCHAN; LEWIS, 2000; YUNES; CALIXTO, 2001). Figura 5. Morfina, alcalóide isolado do látex da papoula de Papaver somniferum O termo alcalóide foi cunhado em 1819 pelo farmacêutico alemão Carl Meissner, lingüisticamente derivado da palavra árabe al-qali, denominação vulgar da planta da qual a soda foi originalmente obtida, representa os compostos nitrogenados farmacologicamente ativos encontrados predominantemente nas angiospermas (CROTEAU; KUTCHAN; LEWIS, 2000). O uso de extratos vegetais contendo alcalóides como medicamentos, venenos e em poções mágicas, pode ser observado desde os primórdios da civilização. Um exemplo clássico é a bebida preparada à base de cicuta, contendo o alcalóide coniína, utilizada em execuções na Grécia antiga, como no caso do filósofo Sócrates no ano de 399 a.C. (Figura 6) (BOER, 1950). HO N CH3 H O HO Papaver somniferum papoula morfina 32 N H H coniina Conium maculatum “A morte de Sócrates”, pintado por Jacques-Louis David em 1787. Figura 6. Coniína, alcalóide isolado de Conium maculatum, causador da morte do filósofo grego Sócrates no ano de 399 a.C. (BOER, 1950) Durante o Império Romano, Lívia, esposa do Imperador Augusto, eliminava seus inimigos e adversários políticos assassinando-os em banquetes com o uso secreto de beladona, fonte do alcalóide atropina o qual era adicionado aos alimentos (SIMÕES et al., 2003). A rainha Cleópatra utilizava extratos de Hyoscyamus niger, fonte de atropina, para dilatar suas pupilas e parecer mais sedutora a seus rivais políticos (Figura 7) (CROTEAU; KUTCHAN; LEWIS, 2000). Figura 7. Atropina, isolada de Hyoscyamus niger (SIMÕES et al., 2003) No Brasil, os índios da bacia Amazônica utilizavam o extrato seco da planta conhecida como curare (Strychnos castelnaeana), contendo o alcalóide tubocurarina, para preparar dardos e flechas envenenados a serem empregados na caça e nas guerras (Figura 8) (PINTO, 1995). Hyoscyamus niger atropina N O O CH3 OH 33 Figura 8. Tubocurarina, isolada de Strychnos castelnaeana, utilizada pelos índios nas flechas para a caça (PINTO, 1995) Desde a descoberta da morfina, mais de 12 000 alcalóides já foram isolados. Este vasto grupo de metabólitos com grande diversidade estrutural, representa cerca de 20% das substâncias naturais descritas (CROTEAU; KUTCHAN; LEWIS, 2000). Pelletier tentando estabelecer uma definição para essa classe de substâncias formulou que: Um alcalóide seria uma substância orgânica, de origem natural, cíclica, contendo nitrogênio num estado de oxidação negativo e cuja distribuição é limitada entre os organismos vivos. Essa definição, porém, excluiria compostos nitrogenados tais como: aminas simples, aminoácidos, peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos, nucleotídeos, porfirinas, vitaminas e compostos nitro e nitroso. Outras definições foram cunhadas por diferentes pesquisadores, contudo até o momento nenhuma se apresentou completamente abrangente (SIMÕES et al., 2003). Alcalóides contendo um átomo de nitrogênio em um anel heterocíclico são chamados de alcalóides verdadeiros e são classificados de acordo com o sistema anelar presente na molécula. As substâncias com o átomo de nitrogênio não-pertencente a um sistema heterocíclico são denominadas de protoalcalóides. Compostos nitrogenados com e sem anéis heterocíclicos que não são derivados de aminoácidos são chamados de pseudoalcalóides (SIMÕES et al., 2003). Strychnos castelnaeana Índio preparando o curare tubocurarina N O N H O OH OCH3 H HO H3CO CH3 CH3 H3C H 34 1.3.1. Proposta biossintética para os alcalóides piperidínicos Os alcalóides piperidínicos apresentam uma grande diversidade química, sendo metabolizados por animais, microrganismos e plantas (O’DONOVAN; KEOGH, 1968). Devido a essa diversidade torna-se difícil estabelecer uma rota biossintética comum a todos esses sistemas. Devido ao conhecimento milenar das propriedades da cicuta (Conium maculatum L., Figura 6), seus alcalóides têm sido alvo de vários estudos ao longo dos anos, com o objetivo de estabelecer a rota biossintética responsável por essa classe de metabólitos nas plantas superiores. Segundo Robinson (1917), a lisina (I) seria o precursor do anel piperidínico na coniína (Figura 9). Uma etapa de desaminação, seguida de descarboxilação do amino ácido I levariam a um intermediário ∆1-piperidínico (II). Condensação de II com ácido acetoacético levaria ao intermediário III, que após reação de descarboxilação seguida de redução levaria a coniína. No entanto, estudos utilizando compostos marcados mostraram insignificante atividade atribuída aos alcalóides (LEETE, 1964). Schiedt e Hoss conseguiram comprovar a incorporação de L-lisina-14C na coniína, entretanto estudos de degradação não foram realizados para determinar se o radioisótopo estava presente no anel piperidínico (LEETE, 1964). Isso levou a suposição que a radioatividade observada na coniína poderia ser atribuída à metabolização da L-lisina-14C para unidades radioativas de acetato e em seguida incorporação pela coniína (LÓPEZ; CID; BIANCHINI, 1999). Figura 9. Proposta de biogênese para os alcalóides da coniína a partir da lisina Também foram realizados experimentos com acetatos marcados (radioisótopos), mostrando que estes eram incorporados à cadeia piperidínica, indicando assim, como precursor biossintético, uma cadeia policetídica de oito átomos de carbono linearmente ligados por quatro unidades de acetato. O nitrogênio seria então incorporado pela molécula por meio de reações enzimáticas, como mostra a Figura 4. Estudos de degradação foram realizados para confirmação desta hipótese (LEETE, 1964). H2N COOHH2N N H+ COOH H2C CH3 O N H CH3 COOH O N H CH3 coniína I II III 35 Figura 10. Hipótese biossintética para os alcalóides da cicuta com base nos estudos de marcação isotópica e de degradação (LEETE, 1964) Desta forma poucos estudos sobre a biossíntese dos alcalóides 3-piperidinóis- 2,6-dissubstituídos, são descritos na literatura. No entanto, acredita-se que esses sejam sintetizados pela mesma rota biossintética estabelecida para os alcalóides da cicuta (Figura 4) (BEVAN; OGAN, 1964; MULCHANDANI; HASSARAJANI, 1977; BRUNETON, 1999). 1.4. Espécies de Senna e/ou Cassia como fontes de alcalóides piperidínicos. Em 1964, foi isolada, pela primeira vez, a (-)-cassina (1) (Figura 11), presente nas folhas de C. excelsa (HIGHET, 1964). Sua estrutura molecular e estereoquímica foram discutidas e propostas por Highet e Highet (1966), mas a configuração absoluta só foi estabelecida por Rice e Coke (1966). Em 1967, Lythgoe e Vernengo estudando um espécime de C. carnaval Speg. isolaram das folhas desta planta quatro alcalóides, CH3 O O O HO O CH3 COOH * * * * * - - - CH3 OHO O * * * * CH3 OH O CH3 ONH2 N CH3 N H CH3 HO N H CH3 O N H CH3 OH N H CH3 N CH3 CH3 espontânea H2O L-alanina 5-ceto-octanal aminotransferase CH COOHH3C H2N alanina coniceína redutase S-adenosil metionina metilconiínatransferase N-metilconiína conhidrinonaconhidrina pseudoconhidrina coniina N CH3 coniceína policeto-ácido 5-ceto-octanal 4 36 sendo a cassina o alcalóide majoritário e outros três inéditos: carnavalina (2), (+)-prosopinona (3) e o alcalóide D (4), cuja estereoquímica não foi definida (LYTHGOE et al., 1972). Posteriormente, Christofidis et al. (1977), estudando os extratos de C. spectabilis reisolou a cassina. Também foram isoladas a (-)-6-iso-carnavalina (5), a (-)-espectalinina (6), 6-iso-cassina (7) e a (+)-espectalina (8) (Figura 11). Em 1971, a cassina e a carnavalina foram identificadas nas flores de C. jahnii, utilizada na medicina popular dos Andes Venezuelanos como purgativo (MENDEZ, 1971). Além destes, neste mesmo espécime também foram encontrados compostos antraquinônicos, bastante conhecidos pelo poder laxativo. Um estudo de triagem biológica feito com espécies de leguminosas no estado de São Paulo levou à seleção de Senna spectabilis, uma espécie já relatada como fonte de alcalóides piperidínicos (CHRISTOFIDIS et al., 1977; LYTHGOE et al., 1972). Estes resultados, aliados ao fato de que alcalóides deste tipo são de particular interesse científico devido às suas propriedades farmacológicas, estimularam Bolzani et al. (1995) a investirem no estudo químico das folhas desta espécie. Foram isolados sete alcalóides piperidínicos: (-)-espectalina (9), leptofilina A (10), 3-O-acetil-leptofilina A (11), leptofilina B (12), (-)-espectalinina (6), carnavalina (2) e 6-iso-carnavalina (5) (Figura 11), sendo que as substâncias 9, 10 e 11 apresentaram atividade citotóxica seletiva em cepas de S. cerevisiae com deficiência no reparo do DNA, sendo indicativo de atividade antitumoral potencial (BOLZANI et al., 1995). Em estudos recentes, Kamo et al. (2003), isolaram de um espécime de C. spectabilis coletada na África, dois alcalóides piperidínicos inéditos: espectaminas A (13) e B (14) (Figura 11), identificados como inibidores específicos de ânion superóxido em macrófagos. Viegas Junior et al. (2004), estudando as flores de C. spectabilis, isolaram três novos alcalóides chamados de: (-)-3-O-acetil-espectalina (15), (-)-7-hidroxi-espectalina (16) e 6-iso-espectalina (17), além da (-)-espectalina (9), já conhecida (Figura 11). A continuidade deste estudo pelo grupo demonstrou que S. spectabilis biossintetiza uma grande variedade destes alcalóides, e que alguns, também apresentaram atividade analgésica, antiinflamatória e no SNC como é o caso dos alcalóides inibidores de acetilcolinesterase (AChE) (ALEXANDRE-MOREIRA et al., 2003; VIEGAS JUNIOR et al., 2005) 37 Figura 11. Alcalóides piperidínicos isolados de espécies de Senna/Cassia 1 2 3 6 54 7 8 9 12 1110 13 14 17 1615 N CH3 O H3C HO H 7 N CH3 OH H3C HO H 7 N CH3 O HO H 7 HO N CH3H3C HO H N CH3 OH H3C HO H 7 N CH3 OH H3C HO H 9103 OH OH N CH3 O H3C HO H 7 N CH3 O H3C HO H 9 N CH3 O H3C HO H 9 N OH H3C HO H 7 OH N OH H3C O H 7 OH H3C O N COOH H3C HO H 6 N CH3 O H3C O H 7 O N CH3 O H3C O H 7 H3C O N CH3 O H3C O H 9 H3C O N CH3 O HO H 9 HO N CH3 O H3C HO H 9 38 1.5. Considerações gerais sobre a espectrometria de massas ionização por electrospray Um espectrômetro de massas pode ser entendido, como um instrumento contendo uma fonte de íons, um separador ou filtro de massas (massa/carga – m/z) e um detector. Embora, existam várias estratégias para a separação e detecção, a etapa de ionização é aquela com maior número de diferentes estratégias. Amostras sólidas, líquidas ou gasosas contendo espécies voláteis ou não e com interesses voltados desde a análise elementar até a composição de proteínas, requerem diferentes processos de ionização. Nesse contexto, surgiu a ionização por electrospray como uma alternativa para a geração de íons a partir de espécies pouco voláteis presentes em fase líquida (MORAES; LAGO, 2003). O electrospray foi sugerido como um possível modo de ionização para espectrometria de massas por Dole em 1968. No entanto, seus experimentos não foram convincentes, pois estes visavam a análise de espécies poliméricas, como poliestireno, que não estão ionizados em solução. Foi somente em 1984 que Yamashida e Fenn demonstraram a aplicabilidade da fonte de electrospray como um método de ionização branda (MORAES; LAGO, 2003). Segundo Pinto et al. (2002), foi a partir da década de 90 que a técnica de electrospray se desenvolveu e seu emprego se estendeu às análises de moléculas termolábeis, complexos organo-metálicos e moléculas de elevada massa molecular incluindo polímeros e proteínas. A versatilidade da técnica de electrospray, permitindo o acoplamento com técnicas cromatográficas como a CLAE ou ainda a análise seqüencial (tandem), têm se desenvolvido e possibilitando estudos qualitativos e quantitativos ou mesmo de determinações moleculares (PINTO et al., 2002). 39 2. OBJETIVOS 1) Estudo dos frutos de Senna spectabilis visando o isolamento de novos alcalóides piperidínicos bioativos. 2) Verificação da atividade inibidora de acetilcolinesterase e seqüestradora de radicais livres, pelos alcalóides isolados de S. spectabilis. 3) Estudo comparativo de S. spectabilis e Cassia leptophylla para obtenção do perfil micromolecular destas duas espécies. 40 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Instrumentação As análises espectrométricas foram realizadas utilizando-se os seguintes equipamentos: Espectrômetro de ressonância magnética nuclear (RMN) Bruker modelos AC-200F (4,7 Tesla), operando em freqüência de 200 MHz para os núcleos de hidrogênio e 50 MHz para o carbono. Espectrômetro de RMN Varian INOVA 500 (11,7 Tesla), operando em freqüência de 500 MHz para os núcleos de hidrogênio e 125 MHz para o carbono. Cromatógrafo líquido da marca Varian ProStar, consistindo de uma bomba ternária mod. 240, um detector de arranjo de diodo mod. 330 e um injetor automático mod. 410, controlados pelo programa Star Chromatography Workstation versão 5.3. As colunas utilizadas foram: Phenomenex LC18 5 µm, 250 x 4,6 mm e Phenomenex Phenyl-Hexyl 5µm, 250 x 4,6 mm. Espectrômetro de massas de baixa resolução do tipo triplo quadrupolo (Quattro- LC, Micromass, Manchester, UK). As amostras foram introduzidas utilizando uma seringa de fluxo (10 µL.min-1). Após análise das condições experimentais, o capilar foi aquecido e polarizado a 250°C e 3kV. Aplicou-se um cone de energia constante de 20V para a extração dos íons e os dados de massas finais foram adquiridos no modo positivo. Espectrofotômetro na região do infravermelho da marca Nicolet, modelo IMPACT 400. As pastilhas foram preparadas utilizando KBr como suporte. Ponto de fusão foi medido em aparelho digital da marca Micro Química, modelo MQAPF – 301. Espectrofotômetro (UV/Visible Spectrophotometer), da marca Amersham Biosciences, modelo Ultrospec 2100 pro. 41 3.2. Materiais Utilizados 3.2.1. Solventes Acetonitrila (CH3CN): Mallinkrodt Chromar HPLC Metanol (CH3OH): J. T. Baker; Baker Analyzed HPLC Ácido acético glacial (H3CCO2H): Quemis P.A. ACS Ácido sulfúrico (H2SO4): Quemis P.A. ACS Éter etílico ((CH3CH2)2O): Synth P.A. ACS Cloreto de metileno (CH2Cl2): Synth P.A. ACS Clorofórmio (CHCl3): Synth P.A. ACS Hidróxido de amônio (NH4OH): Synth P.A. ACS Trietilamina ((H3CCH2)3N) 99% ACROS Organics Solventes grau técnico, purificados em destilador semi-industrial com coluna de fracionamento (4 m de altura): hexano, acetato de etila, etanol, metanol, acetona. Água deionizada em aparelho da marca Milli-Q plus Solventes deuterados: Clorofórmio-d 99,8% ACROS Organics Metanol-d4 99,8% Cambridge Isotope Laboratories, Inc 3.2.2. Cromatografia Para as separações cromatográficas em coluna aberta foram utilizadas as seguintes fases estacionárias: Alumina neutra (Al2O3) Sigma Sílica gel (SiO2) para cromatografia flash (0,035 – 0,070 mm, diâmetro de poro ca 6 nm) ACROS Organics Para a cromatografia em camada delgada foram utilizadas as seguintes fases estacionárias: 42 Placas comerciais de sílica gel 60 com indicador de fluorescência (UV254) 0,20 mm de espessura Placas comerciais de alumina (UV254) 0,20 mm de espessura Macherey-Nagel Placas de sílica gel 60 G e Alumina G, preparadas aplicando-se uma suspensão da fase em água destilada, na proporção 1:2 (m/v), sobre placas de vidro de 5, 10 e 20 x 20 cm, obtendo-se espessuras variadas do adsorvente (0,25; 0,50; 0,75 e 1,00 mm) através de espalhador Quickfitt. Depois de preparadas, as placas foram secas a temperatura ambiente por um período de aproximadamente 6 h e em seguida ativadas em estufa a 120 ºC, por 2 h. As revelações foram feitas por: irradiação ultravioleta (UV 254 ou 366 nm) ou por nebulização dos reveladores descritos no item 3.3 3.3. Reveladores Utilizados As visualizações em placas cromatográficas utilizaram os seguintes reveladores (TOUCHSTONE, 1978): 3.3.1. Revelador de Iodocloroplatinato Solução A: Solução aquosa a 5% (m/m), de ácido hexacloroplatínico (IV) (H2(PlCl6).6H2O). Solução B: Solução aquosa a 10% (m/m), de iodeto de potássio (KI). Solução spray: Misturar uma parte da Sol. A com nove partes da Sol. B e diluir com volume igual de água. Resultados: Detecta alcalóides 3.3.2. Revelador Dragendorff Solução A: 0,85 g de subnitrato de bismuto (BiONO3) numa mistura de 10 mL de ácido acético glacial e 40 mL de água. Solução B: 8 g de iodeto de potássio (KI), em 20 mL de água. Solução estoque: Misturar partes iguais das Soluções A e B. 43 Solução spray: Misturar uma parte da solução estoque, duas partes de ácido acético e dez partes de água. Resultados: Detecta alcalóides 3.3.3. Revelador de Anisaldeído Anisaldeído/HOAc/MeOH/H2SO4 (1:20:170:10). Obs.: Adicionar os reagentes nessa mesma ordem e de preferência em banho de gelo. Resultado: Revelador universal. 3.3.4. Iodo Sublimado Utilizou-se câmara de vidro saturada por vapor de Iodo sólido (I2). Resultado: Revelador universal. 3.4. Preparo do Material Vegetal O material vegetal de Cassia leptophylla foi coletado no Instituto de Botânica de São Paulo, no qual está depositada a exsicata sob o nº SP 370 916. A coleta do material vegetal de Senna spectabilis foi feita no Instituto de Química de Araraquara e sua exsicata está depositada no Instituto de Botânica de São Paulo sob o nº SP 370 917. Os materiais foram separados em folhas e flores de C. leptophylla e flores e frutos de S. spectabilis (Tabela 1). Como sugerido por Simões et al. (2003), as folhas e flores de C. leptophylla e flores de S. spectabilis foram secas em estufa provida de sistema de circulação forçada de ar por um período de cinco a seis dias à temperatura de 40 ºC. Em seguida foram triturados em moinho de facas e submetidos a extração com etanol. Os frutos de S. spectabilis foram triturados verdes e em seguida preparado o extrato etanólico. O processo de extração e concentração foi repetido cinco vezes, com intervalo de aproximadamente cinco dias entre uma extração e outra, obtendo-se assim os quatro extratos mostrados na Tabela 1. 44 3.5. Partição líquido/líquido Para o estudo dos frutos de S. spectabilis foi inicialmente adotado um procedimento de partição líquido/líquido do estrato etanólico (EESS-Fr). Foram dissolvidos cem gramas deste extrato em metanol/água (4:1) e submetidos a partição líquido-líquido com hexano, diclorometano, acetato de etila e n-butanol, sucessivamente (Figura 12). Figura 12. Partição do extrato dos frutos do espécime S. spectabilis 3.6. Preparo das amostras para CLAE O pré-tratamento das amostras foi feito segundo o esquema da Figura 13, onde foi tomado um grama de cada um dos extratos descritos na Tabela 1. Depois de tratados, foi retirada uma alíquota de cada uma das frações, agora isentas de substâncias lipofílicas. Foram preparadas soluções de concentração 1 mg/mL, as quais foram mantidas em repouso por um período de 12 h em eppendorf. Em seguida, foi feita nova filtração utilizando um sistema constituído de uma seringa adaptada com uma F. AcOEt SSFr - AcOEt 1,87 g F. n-BuOH SSFr - n-BuOH 16,88 g F. hidrometanólica SSFr – MeOH/H2O 25,41 g n-BuOH (3 x 200 mL) Sol. hidrometanólica AcOEt (5 x 200 mL) Sol. hidrometanólica CH2Cl2 (5 x 200 mL) F. hexânica SSFr – Hex 0,89 g EESS-Fr (100 g) 1. Solub. MeOH/H2O 4:1 (500 mL) 2. Filtração Resíduo insolúvel SSFr – RS 10,66 g Sol. hidrometanólica hexano (5 x 200 mL) Sol. hidrometanólica F. CH2Cl2 SSFr -CH2Cl2 5,66 g Concentração, secagem e filtração Concentração, secagem e filtração 45 membrana de politetrafluoroetileno (PTFE), diâmetro de poro de 0,45 µm da marca Gelman, coletando o filtrado em frasco de 1,5 mL. Figura 13. Pré-tratamento das amostras, extração de substâncias lipofílicas 3.7. Extração ácido/base A extração ácido/base foi feita segundo o esquema da Figura 14, partindo-se de 2 g de cada um dos extratos descritos na Tabela 1, até a obtenção da fração alcaloídica CH2Cl2 (alcalóides totais) (SRIPHONG et al., 2003). F. hexânica F. hidrometanólica 1 g 1. Solub. MeOH/H2O 4:1 (25 mL) 2. Filtração Resíduo insolúvel Sol. hidrometanólica hexano (3 x 25 mL) EECL-Fl EECL-Fo EESS-Fl EESS-Fr 46 Figura 14. Esquema modificado de extração ácido/base para o isolamento dos alcalóides piperidínicos (SRIPHONG et al., 2003), 3.8. Avaliação das atividades antioxidante e anticolinesterásica 3.8.1. Ensaio espectrofotométrico com 2,2-difenil-picrilhidrazina (DPPH) Em solução, o radical DPPH apresenta cor violeta intensa que é conseqüência do elétron desemparelhado (radical livre estável). Esse radical tem um máximo de absorção em 517 nm, um decréscimo na absorbância devido à ligação com um hidrogênio radicalar, cedido pela espécie antioxidante, e conseqüente estabilização do radical é indicado pela mudança de cor violeta para amarelo (Figura 15) (SON; LEWIS, 2002). Alcaloídica n-BuOH (3 x 20 mL) F. CH2Cl2 1. NH4OH até pH = 9 – 11 2. CH2Cl2 (3 x 20 mL) F. hexânica 2 g 1. Solub. H2SO4 5% (30 mL) 2. Filtração Resíduo insolúvel Sol. ácida hexano (3 x 20 mL) Sol. ácida Sol. alcalina F. n-BuOH F. alcalina EECL-Fl EECL-Fo EESS-Fl EESS-Fr 47 Figura 15. Reação de redução do radical DPPH Foram preparadas soluções metanólicas de diferentes concentrações (15, 30, 60, 120 e 180 µM ) de cada uma das substâncias a serem analisadas (1 mL). Como fonte de radicais livres foi utilizada uma solução metanólica de DPPH (100 µM, 2 mL). Foram misturadas em tubo de ensaio, sendo que mistura reacional apresentou as seguintes concentrações 5, 10, 20, 40 e 60 µM num volume final de 3 mL. Os ensaios foram ralizados em triplicata e as leituras da absorbância realizadas depois de 30 minutos. Como padrão positivo foi utilizado o flavonóide rutina, nas mesmas condições descritas. Os resultados foram plotados numa curva analítica de absorção pela concentração. Todos os alcalóides isolados foram submetidos ao ensaio. 3.8.2. Avaliação da atividade anticolinesterásica O ensaio quali e quantitativo por bioautografia (Cromatografia em Camada Delgada – CCD) consiste no desenvolvimento de uma cromatoplaca da substância em análise, juntamente com um controle positivo inibidor da enzima acetilcolinesterase (AChE) (galantamina, Figura 16). Para os ensaios quantitativos (Concentração Inibitória Mínima – CIM) foram aplicadas quantidades conhecidas e em ordem decrescente de massa, do controle e da amostra, objetivando encontrar a menor quantidade inibidora de AChE, que possa ser observada visualmente. Após o desenvolvimento da cromatografia, a placa foi borrifada com a solução da enzima AChE (6,66 U) (Solução A) e o solvente evaporado com secador de cabelo. A placa cromatográfica foi incubada em câmara úmida fechada a 37 °C por 20 minutos, e em seguida borrifada com a Solução D (MARSTON; KISSLING; HOSTETTMANN, 2002). N N NO2O2N NO2 . N NH NO2O2N NO2 RH antioxidante R. DPPH (DPPH)H reduzido + + 517 nm 48 A coloração roxa aparece em aproximadamente 2 minutos. O aparecimento de mancha branca (indicação de inibição da reação enzimática), sobre um fundo de coloração roxa indica que houve inibição da atividade da enzima acetilcolinesterase. A Figura 17 mostra um esquema das reações que se sucedem até o aparecimento da coloração na cromatoplaca (MARSTON; KISSLING; HOSTETTMANN, 2002). Os resultados foram observados e fotografados em câmera fotográfica Epson e os valores de Rf calculados para os halos onde houve inibição da enzima. Soluções: Solução A: Acetilcolinesterase (1000 U, Sigma, produto no C2880) dissolvida em 150 mL do tampão Tris-HCl (0,05 M; pH=7.9), a solução estoque será armazenada a 4 °C, no momento do uso será adicionado 0,1% de albumina de soro bovino fração V; Solução B: 250 mg de acetato de 1-naftila em 100 mL de etanol; Solução C: 400 mg do sal Fast Blue B em 160 mL de água destilada; Solução D: mistura de 10 mL da solução B + 40 mL da solução C. Figura 16. Galantamina, controle positivo nos ensaios de inibição de AChE O N H3CO OH CH3 49 Figura 17. Reação da AChE com acetato de 1-naftila e subseqüente formação do corante azóico roxo no bioensaio em CCD OCOCH3 AChE OH CH3COOH NN OCH3 H3CO N N 2Cl NN OCH3 H3CO NN OH OH Corante azóico (roxo) Sal fast blue B + acetato de 1-naftila α−naftol 50 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO A partir das matrizes de S. spectabilis e C. leptophylla foram preparados os extratos descritos na Tabela 1. As folhas e flores de C. leptophylla e as flores de S. spectabilis foram secas em estufa por um período de cinco a seis dias em temperatura de 40 ºC. Em seguida foram triturados em moinho de facas e submetidos à extração com etanol. Os frutos de S. spectabilis foram coletados verdes devido ao processo de maturação levar ao apodrecimento da grande maioria. Logo após a coleta, foram triturados em liquidificador e submetidos à extração com etanol. O processo de extração e concentração foi repetido cinco vezes, com intervalo de aproximadamente cinco dias entre uma extração e outra, obtendo-se assim os quatro extratos mostrados na Tabela 1. Foi possível observar o baixo rendimento no preparo dos mesmos, o que pode levar a necessidade de grandes quantidades do material vegetal, caso existam micromoléculas ativas minoritárias. Tabela 1. Material vegetal dos espécimes coletados. Espécime massa do mat. veg. seco (g) Sigla do extrato massa de extrato (g) Rendimento (%) Cassia leptophylla – flores 285,30 EECL-Fl 63,53 22,27 Cassia leptophylla – folhas 1 294,05 EECL-Fo 69,92 5,40 Senna spectabilis – flores 950,38 EESS-Fl 184,03 19,36 Senna spectabilis – frutos 7 983,09* EESS-Fr 675,71 8,46 * massa do material vegetal verde 4.1. Estudo fitoquímico dos frutos de Senna spectabilis Inicialmente o extrato etanólico dos frutos de S. spectabilis (EESS-Fr) foi submetido à cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) para confirmação da presença de alcalóides, classe essa já isolada anteriormente das flores desse mesmo espécime. Foram utilizadas cromatoplacas de sílica ou alumina, eluente CHCl3:MeOH:NH3 (9:1:0,25) e revelador de Dragendorff ou Iodocloroplatinato (IClPt), indicadores da presença de alcalóides. Confirmada a presença dos mesmos, 100 g de EESS-Fr foram submetidos a partição líquido/líquido, conforme descrito no item 3.4 (HOSTETTMANN; QUEIROZ; VIEIRA, 2003). 51 Uma observação a ser feita é que a somatória das massas obtidas no processo de partição é bem menor que a massa de partida, o que pode ser explicado pela presença de solvente no extrato inicial, uma vez que o mesmo não foi concentrado até a secura, enquanto que para as frações obtidas da partição houve a eliminação quase que total do solvente. A análise por CCDC das frações da partição indicou que a maior concentração de alcalóides estava na fração CH2Cl2, chamada de SSFr – CH2Cl2 (5,66 g). Dessa fração (1 g), foi submetido a cromatografia em coluna (CC), utilizando como fase estacionária (FE) alumina neutra (150 g). A eluição foi feita em gradiente de Hex/Et2O 1:1 até 100% de Et2O, seguida de Et2O /MeOH 100:0 até 100% de MeOH, obtendo-se assim um total de 30 sub-frações. A análise por CCDC permitiu reagrupar as sub-frações em 7 grupos, sendo PMC.01 F1-3 e PMC.01 F.20-28 as que apresentaram misturas de alcalóides em quantidade suficiente para serem novamente submetidos a processos de fracionamento (Figura 18). A sub-fração PMC.01 F1-3 (30,4 mg) apresentou uma mistura de dois alcalóides, os quais foram separados por CC (PMC.06), utilizando como FE alumina neutra (3 g), sistema de solvente (CH2Cl2/MeOH 99:01) otimizado em CCD, mantido até a eluição da primeira substância (alcalóide 20). Em seguida foi aumentada a polaridade gradativamente até a eluição da segunda substância (alcalóide 1) (Figura 18). A sub-fração PMC.01 F28-30 (402,6 mg) apresentou absorção significativa sob lâmpada na região do ultravioleta (UV). Essa fração foi analisada por CLAE, indicando a presença de pelo menos quatro substâncias com espectros na região do UV bastante semelhantes (Figura 19). Parte dessa sub-fração (200 mg), foi submetida a CC (PMC 05), utilizando como FE sílica gel (9 g). O sistema de solvente foi otimizado em CCD e consiste em AcOEt/MeOH/TEA 9:1:0,01. Sendo os alcalóides substâncias com caráter básico, sua separação se torna extremamente difícil quando se utiliza sílica como FE, devido aos grupos silanóis, sítios com caráter ácido, reterem fortemente essas micromoléculas. Para diminuir esse tipo de interação (silanóis e os alcalóides), foi adicionado trietilamina (TEA) à fase móvel (amina competidora), diminuindo assim a retenção dos alcalóides e facilitando a separação (McCALLEY, 2002; PAHL et al., 1997). Foram coletadas 50 sub-frações as quais foram reunidas por CCDC. Desse fracionamento foram isolados os alcalóides 18 e 19 como mostra o esquema da Figura 18. 52 Espectro na região do UV Figura 18. Esquema de purificação da fração SSFr – CH2Cl2 Figura 19. Cromatograma da sub-fração PMC.01 F28-30. Condições cromatográficas: coluna Phenomenex LC18 5 µm, 250 x 4,6 mm, fase móvel: 5 a 100% de ACN – HOAc 5%, (30 min), fluxo: 1 mL/min, detecção: UV 254 nm PMC.06 F3-5 3,4 mg PMC.06 F8-16 9 mg PMC.05 F7-11 20,2 mg PMC.05 F20-29 36,5 mg PMC.05 CC SiO2 (9 g) FM: AcOEt/MeOH/TEA (9:1:0,01) SSFr – CH2Cl2 (1 g) PMC.01 CC Al2O3 (150 g) FM: Hex/Et2O – Et2O/MeOH PMC.01 F1-3 30,4 mg PMC.01 F28-30 402,6 mg PMC.06 CC Al2O3 (3 g) FM: CH2Cl2/MeOH (99:01) Alcalóide 20 Alcalóide 1 Alcalóide 18 Alcalóide 19 200 mg 53 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 20 40 60 80 100 543,89601,76713,62 781,12858,27 908,42 993,28 1120,581161,08 1255,58 1367,24 1454,24 1708,83 2515,032688,61 2854,48 2923,91 3151,50 3408,02 Tr an sm itâ nc ia (% ) Número de onda (cm-1) N H HO H3C CH3 7 O 4.2. Elucidação estrutural dos alcalóides isolados 4.2.1. Elucidação estrutural do alcalóide 1 O alcalóide 1 foi isolado como um sólido de coloração amarela pálida, apresentando um ponto de fusão entre 52-55 ºC. A análise do espectro na região do infravermelho (IV), permitiu identificar uma banda em 3408 cm-1, proveniente do estiramento do grupo O–H livre. O estiramento do grupo –OH ligado foi observado em 3152 cm-1, como uma banda larga, indicando que a função estaria participando de uma ligação de hidrogênio intramolecular. Não foi possível observar a banda proveniente do estiramento do grupo amino secundário, provavelmente sobreposta pelas bandas do grupo hidroxila. Os estiramentos assimétrico e simétrico dos grupos C–H alifáticos foram visíveis em νas 2924 e νs 2854 cm-1, respectivamente. A banda relativa ao estiramento da função carbonila (C=O) de cetona foi observada em ν 1709 cm-1, assim como as absorções relativas às deformações angulares assimétricas em ν 1454 e simétricas em ν 1367 do grupo metila (Espectro 1). Espectro 1. Espectro na região do IV (KBr), do alcalóide 1 54 A análise do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3), do alcalóide 1 (Espectro 2), permitiu identificar um simpleto largo em δ 3,47, referente ao H–3 hidroximetínico. Um duplo quadrupleto em δ 2,71, integrando para um hidrogênio, foi atribuído a H–2, o qual apresentou somente acoplamento com H–7 (J = 6,5 Hz), Tabela 2. A extremidade da cadeia lateral, funcionalizada por um grupamento metil-cetona foi identificada pela presença de um tripleto em δ 2,31, integrando para dois hidrogênios e um simpleto em δ 2,03 integrando para três hidrogênios, que foram atribuídos a 2 H–10' e 3 H–12', respectivamente. Esta dedução foi confirmada pelo mapa de contorno gHMBC (Espectro 12), que mostrou as interações 3J de H–10' e H–12' com C–12' e C–10', respectivamente. O dupleto em δ 1,05, integrando para três hidrogênios acoplando com H–2 no mapa de contorno gCOSY (Espectro 6), foi atribuído a H–7. Os sinais relativos aos hidrogênios da cadeia lateral encontram-se sobrepostos na região de δ 1,16 (Tabela 2). O comprimento da cadeia lateral foi primeiramente proposto com base no valor da integral de hidrogênios em δ 1,16, (18 hidrogênios) correlacionados aos metilenos da cadeia, pela analise simultânea dos dados do mapa de contorno gHMQC (Espectro 11), 13C e DEPT 135 (Espectros 8, 9 e 10). 55 Espectro 2. Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) do alcalóide 1 N H HO H3C 1 11' 53 5'3'1' 7 CH3 O 7' 9' 56 Espectro 3. Ampliação do espectro 2 (δ 1,0–1,5) do alcaloíde 1 Espectro 4. Ampliação do espectro 2 (δ 1,7–2,4) do alcalóide 1 57 Espectro 5. Ampliação do espectro 2 (δ 2,5–3,5) do alcalóide 1 58 Tabela 2. Dados de RMN 1H e gCOSY (500 MHz, CDCl3) do alcalóide 1 a, b, c Posição δH, m, J gCOSY 2 2,71 dq (6,5; 1,0) H–7 3 3,47 sl H–4a, H–4b, H–2 4a 1,82 m H–3, H–4b, H–5a, H–5b 4b 1,41 m H–3, H–4a, H–5a, H–5b 5a 1,40 m H–4a, H–4b, H–5b, H–6 5b 1,30 m H–4a, H–4b, H–5a, H–6 6 2,48 m H–5a, H–5b, H–1' 7 1,05 d (6,5) H–2 1' 1,30 m H–6, H–2'–8' 2'– 8' 1,16 sl H–1', H–10' 9' 1,46 m H–10', H–2'–8' 10' 2,31 t (7,5) H–9', H–12' 11' ----- ----- 12' 2,03 s H–10' a Deslocamentos químicos (δ) em ppm, em relação ao TMS como padrão interno b Constantes de acoplamento (J), expressas em Hz c m = multiplicidade 59 Espectro 6. Mapa de contorno gCOSY (500 MHz, CDCl3) do alcalóide 1 N H HO H3C 1 11' 53 5'3'1' 7 CH3 O 7' 9' 60 Espectro 7. Ampliação do espectro 6 (δ 1,0–1,8) do alcalóide 1 A atribuição dos carbonos do alcalóide 1 (Tabela 3), foi realizada conforme os dados obtidos dos espectros de RMN de 13C e DEPT 135 (Espectros 8, 9 e 10), e da análise simultânea dos dados dos espectros de gHMQC (Espectro 11) e de 1H (Espectros 2, 3, 4 e 5). O tamanho da cadeia lateral foi estimada pelo número de átomos de carbono observados nos espectros de 13C e DEPT (Espectros 8, 9 e 10), sendo constituída por dez metilenos, uma carbonila e uma metila. 61 Tabela 3. Dados de RMN 13C, DEPT 135, gHMQC e gHMBC do alcalóide 1 a Posição δC DEPT 135 gHMQC gHMBC 2 55,8 CH 2,71 H–7, H–4a 3 67,7 CH 3,47 H–7 4 31,8 CH2 1,82 H–5a 5 25,7 CH2 1,40 H–3, H–1' 6 57,1 CH 2,48 H–1', H–5b 7 18,2 CH3 1,05 H–2 1' 36,4 CH2 1,30 H–3'– 8' 2' 25,4 CH2 1,16 H–1' 3'– 8' 29,1–29,4 CH2 1,19 H–9', H–10' 9’ 23,8 CH2 1,46 H–3'– 8', H–10' 10' 43,7 CH2 2,39 H–9', H–12' 11' 209,2 C ----- H–10', H–12' 12' 29,7 CH3 2,03 H–10' a Deslocamentos químicos (δ) em ppm, em relação ao TMS como padrão interno 62 Espectro 8. Espectro de RMN 13C (125 MHz, CDCl3) do alcalóide 1 Espectro 9. Ampliação do espectro 8 (δ 15,0–70,0), alcalóide 1 N H HO H3C 1 11' 53 5'3'1' 7 CH3 O 7' 9' 63 Espectro 10. Espectro de RMN 13C DEPT 135 (125 MHz, CDCl3) do alcalóide 1 N H HO H3C 1 11' 53 5'3'1' 7 CH3 O 7' 9' 64 Espectro 11. Mapa de contorno gHMQC (500 MHz, CDCl3) do alcalóide 1 N H HO H3C 1 11' 53 5'3'1' 7 CH3 O 7' 9' 65 Espectro 12. Mapa de contorno gHMBC (500 MHz, CDCl3), do alcalóide 1 N H HO H3C 1 11' 53 5'3'1' 7 CH3 O 7' 9' 66 Espectro 13. Mapa de contorno gHMBC (500 MHz, CDCl3), do alcalóide 1 Espectro 14. Mapa de contorno gHMBC (500 MHz, CDCl3), do alcalóide 1 N H HO H3C 1 11' 53 5'3'1' 7 CH3 O 7' 9' 67 1 53 4'2' 6' 8' N H HO H3C CH3 O Na Figura 20 são mostradas algumas correlações 1