RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 16/01/2021. Laís Salomão Arias Síntese e avaliação dos efeitos de um nanocarreador de miconazol sobre microrganismos orais ARAÇATUBA - SP 2020 Laís Salomão Arias Síntese e avaliação dos efeitos de um nanocarreador de miconazol sobre microrganismos orais Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Araçatuba da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutora em Ciência Odontológica – Área Saúde Bucal da Criança. Orientador: Prof. Dr. Douglas Roberto Monteiro Coorientadores: Prof. Tit. Alberto Carlos Botazzo Delbem Prof. Assoc. Juliano Pelim Pessan ARAÇATUBA - SP 2020 Catalogação-na-Publicação Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP Arias, Laís Salomão. A696s Síntese e avaliação dos efeitos de um nanocarreador de miconazol sobre microrganismos orais / Laís Salomão Arias. - Araçatuba, 2020 154 f. : il. ; tab. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia, Araçatuba Orientador: Prof. Douglas Roberto Monteiro Coorientador: Prof. Juliano Pelim Pessan Coorientador: Prof. Alberto Carlos Botazzo Delbem 1. Biofilmes 2. Candida 3. Miconazol 4. Nanopartículas 5. Óxido ferroso-férrico 6. Quitosana I. T. Black D27 CDD 617.645 Claudio Hideo Matsumoto – CRB-8/5550 Dados Curriculares LAÍS SALOMÃO ARIAS Nascimento 07/06/1990 Campo Grande-MS Filiação Edison Rubens Arrabal Arias Sônia Maria Salomão Arias 2008/2011 Curso de graduação em Odontologia na Universidade Federal de Mato Grosso do Sul 2012/2014 Residência em Odontopediatria na Universidade Estadual de Londrina 2014/2016 2016/2020 Curso de Pós-Graduação em Ciência Odontológica – área Saúde Bucal da Criança, nível de Mestrado, na Faculdade de Odontologia de Araçatuba- UNESP Curso de Pós-Graduação em Ciência Odontológica – área Saúde Bucal da Criança, nível de Doutorado, na Faculdade de Odontologia de Araçatuba- UNESP, com período sanduíche na University of Glasgow (2018/2019) Associações CROSP - Conselho Regional de Odontologia de São Paulo SBPqO - Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica IADR - International Association for Dental Research Dedicatória ________________________________ Dedicatória _______________________________________________ Dedico este trabalho Aos meus pais, Edison e Sônia Pelo apoio em todos os momentos difíceis, pelo exemplo de bondade e dedicação, pelos olhares atentos às minhas necessidades mais do que às minhas vontades. Por me ensinarem a ter firmeza de caráter e a levantar frente às dificuldades sempre com muita humildade. Finalmente, por me ensinarem o caminho para uma fé na qual a vida é plena. Não poderia ter tido melhor berço. Amo e admiro muito vocês! À minha irmã, Juliana Por ser minha companheira. Por regozijar-se pelos mesmos gostos, argumentar desgostos, dividir madrugadas filosóficas de conversas e me assegurar de que não estou sozinha e de que a melhor escolha da minha vida foi ter pedido que viesse ao mundo para 'brincar' comigo. Eu tenho muito orgulho da sua dedicação em tudo e de como já caminha sozinha em sua jornada pela vida. E fico igualmente feliz quando posso te ajudar com conselhos ou quando os seus conselhos me confortam. Obrigada por, lá no céu, ter escolhido ser minha irmã. Amo você. À minha avó Helena (in memoriam) Por viver o amor. Ser exemplo. Ser fé. Ser vida. Ser bondade. Ser carinho. Ser sabedoria. Ser vó. Ser mãe. Ser todos os recursos que nunca me faltaram. Exemplo é isso: ser por alguém. Tudo isso me ensinou e marcou minha vida para sempre. Nada é mais forte, nem mais bonito do que este legado. Não importa quanto tempo passe, sempre me lembrarei de você com muito carinho e esperança. Minha meta é poder algum dia, servir de exemplo para alguém. Vó Helena, mulher de fé. Tenho saudades e vou amá-la sempre. Agradecimentos Especiais ___________________________________ Agradecimentos especiais _______________________________________________ A Deus Pela minha vida, família e saúde. Pela proteção recebida a todo momento, por guiar meus passos pelos melhores caminhos e por me conferir a centelha que vem de ti e que pulsa e gera todas as coisas. Agradeço pelo constante aprendizado que a vida me proporciona e que me faz repensar conceitos com a mesmo frequência em que aumento meu conhecimento de ti e de mim mesma. Espero não falhar nos seus planos assim como nunca falhou nos meus. Obrigada por todas as pessoas maravilhosas que colocou no meu caminho e pelo amparo que recebi nas horas mais difíceis. À minha família Por me apoiarem, me amarem e por serem os maiores torcedores da minha vida. Por se tornarem meu motivo de querer ser cada dia mais e melhor. Por todas as orações, e por serem a minha estrutura e meu chão forte. Muito obrigada, amo muito vocês. Ao meu coorientador , Prof. Juliano Pessan Por ser mais que um simples co-orientador, não só para mim, mas para todos no nosso departamento. Agradeço por me ensinar tantas coisas além das disciplinas. Por dividir suas experiências e por tirar do seu tempo tão corrido para ouvir com sincera atenção as minhas dificuldades e tentar solucionar minhas barreiras. Sem O-Juliano não haveria Doutorado Sanduíche, não haveria defesa e também não haveria A-Laís. Serei sempre grata por toda a paciência e acolhimento, e pela amizade nos anos de Araçatuba. Admiro seu profissionalismo e a sua dedicação em tudo o que acredita. Você é um membro fundamental na equipe FOA-UNESP e um modelo para mim e para todos os alunos. Vou levar seu exemplo comigo aonde eu for. Muito obrigada! Ao meu coorientador , Prof. Alberto Delbem Gratidão por sempre ajudar à todos e querer ver prosperar cada membro do nosso departamento. Obrigada por nos mostrar este exemplo de profissional que une competência e trabalho em equipe com uma grande humildade. Isso faz todos nos admirarmos e nos espelharmos. Sei que é uma pessoa de poucas palavras. Mas há quem diga que "o silêncio é o grande elemento onde as grandes coisas se formam". Não há dúvidas de que por trás desse silêncio, há uma mente observadora e cientista peculiar, que nos ensina que a grandeza do homem está em seu propósito. Questionar, duvidar e confrontar é o que traz grandes mudanças na história. Obrigada por viver e nos ensinar diariamente esse exemplo de grandeza. Ao meu orientador Douglas Roberto Monteiro Há 5 anos sou grata por ter me acolhido com tamanha humildade e vontade de compartilhar seus conhecimentos. Agradeço por ter me ensinado desde o início, embora eu não tivesse experiência alguma com o laboratório ou com a pós-graduação. Agradeço pelo tempo e atenção sempre redobrada que dedica à minha orientação, e por toda a paciência que sempre teve comigo. Agradeço principalmente por sempre acreditar em mim, muitas vezes mais do que eu acredito em mim mesma. Isso pode parecer pouco, mas fez toda a diferença e me ajudou em cada passo até aqui. Não é à toa que com tom carinhoso, e um pouco de desespero e desabafo te chamamos de "mestre". É sempre a pessoa mais calma e confiável a quem recorremos para buscar de volta o nosso caminho. Agradeço a amizade,risadas, confiança, conselhos e ensinamentos em todos esses anos. Te admiro demais e espero algum dia ser metade do profissional e pessoa que você é. Levarei esse "mestre" no meu coração pra sempre. Meu muito obrigada! Ao Prof. Robson Agradeço por ser um exemplo de professor. Sua dedicação ao ensino, aos pacientes e aos alunos realmente nos inspiram para sermos profissionais cada vez melhores e para ajudarmos cada vez mais pessoas. Muito obrigada por mostrar que isso é possível, fundamental e transformador! Aos demais professores da FOA-UNESP Sou sempre grata por todos os ensinamentos. Foi uma honra aprender com todos que conheci e presenciar a enorme competência e capacidade de cada um. Essa equipe é gigante em conhecimento e em coração. Eu tenho orgulho de todos os anos que compartilhei com vocês. Muito obrigada! Ao Francisco Nunes de Souza Neto1 e Andressa Kubo (Universidade Federal de São Carlos - UFSCar) Muito obrigada pela amizade, parceria e a incrível conexão do nosso grupo. Muita gratidão por dividirem seu conhecimento e nos auxiliarem na síntese e caracterização do nanosistema utilizado neste estudo. Aos meus amigos de Araçatuba... Ao Renan Aparecido Fernandes e Gabriela Fernandes Quero agradecer essa dupla por caminhar comigo desde o mestrado e mostrar que a insegurança proporcionada por novas mudanças pode nos trazer as pessoas mais queridas, as risadas mais genuínas e as amizades mais preciosas. Deus foi muito bom por colocá-los em meu caminho. Muito obrigada por tudo! À Luhana Por ter sido companheira de apartamento, de conversas até mais tarde, de jantinhas aleatórias no meio da semana, de muitos bolos de banana deliciosos, tortas de legume e filminhos nas tardes de domingo. Por ter sido minha família por todo o tempo que passamos juntas. Saudades de você. Muito obrigada por tudo! Ao Igor Zen Por ter aceitado ser meu inesperado segundo companheiro de apartamento. Por ser sempre tão atencioso e querido. Por ter se dedicado nas limpezas semanais ao som de esquisitas músicas da rádio Disney, por ser meu parceiro de assistir Master Chef Brasil e por além de aturar, se esforçar em aprender as minhas frases de efeito em japonês. Agradeço tanto por ser essa pessoa sincera, espontânea e agradeço por todo o empenho em manter o contato ainda quando fui morar fora do país. Sem dúvidas, isso significou demais pra mim e me ajudou em momentos bem difíceis. Que nossa amizade seja para sempre. Muito obrigada! À Ana Paula Vieira Obrigada por ser minha amizade tranquila. Obrigada por nossa troca de xingamentos , sinceridades e verdades que no fim das contas é mais carinhosa do que as palavras corriqueiras de muitas pessoas. Obrigada por se preocupar genuinamente comigo. Obrigada por ter caminhado junto a mim em uma parte bem difícil da nossa pesquisa. O tempo nos traz entendimento. Entendo hoje que Deus me deu você para que eu chegasse sã até aqui. Muito obrigada por tudo, minha amiga! À Mayra Frasson Por sua forma de lidar com a vida e suas palavras que sempre trazem conforto. A forma como você cultiva suas amizades e encara os problemas é maravilhosa e sempre me ajudou muito. Quero agradecer em especial pela presença que você marcou no tempo que eu estive fora do país. Você e o Igor sempre lembraram de mim, queriam saber como eu estava e me fizeram muito mais feliz. A experiência de não estar na nossa terra pode às vezes causar bastante medo e solidão. Vocês foram uma luz cálida que espantou as indecisões e me ajudou a viver mais plenamente essa experiência. Da mesma forma, pode contar comigo sempre, muito obrigada! À Amanda Andolfatto Deus é tão bom que mesmo na reta final do doutorado me brindou com pessoas muito incríveis, do tipo que a sua alma reconhece a bondade e firmeza de caráter. Você é uma delas e não importa termos passado pouco tempo juntas, parece que nos conhecemos há muito tempo e espero que a distância não seja obstáculo para nossa amizade. Você por perto é luz na minha vida, muito obrigada amiga! À Nayara, Heitor, Tata, Priscila e Francyenne Fico muito feliz e agradecida por ter amigos maravilhosos, de bem com a vida e bom coração. Essa "turma do cortiço" é simplesmente fantástica. Por todas as jantinhas, saídas e trocas de risadas que vocês proporcionam à todos: muito obrigada sempre! À Thayse, Caio, Karina e Leonardo Obrigada pelos intervalos de café, pelo jeito espontâneo que vocês tem e que me faz dar muitas risadas e pelo exemplo de alunos dedicados e companheiros. Que bom passar o tempo com vocês. Nosso laboratório é ainda mais incrível quando estão lá. Muito obrigada! Aos demais alunos do Departamento de Odontopediatria Fico feliz por dizer que nosso departamento está em boas mãos e cheios de alunos dedicados e com muito potencial. Obrigada pela presença e auxílio de cada um que me ajudou a chegar até aqui. Todos foram fundamentais. Que orgulho dessa equipe! Muito obrigada. Aos meus amigos de Glasgow... À Jamilli Medeiros Tenho tanto a te agradecer. Foi minha primeira amiga do "estrangeiro". Foi minha confidente, companheira de viagens e passeios e de tentativas de jantinhas brasileiras na Escócia. O nosso tempo juntas foi curto, mas intenso e me ajudou como ninguém a passar por essa incrível experiência. Novamente só tenho a agradecer à Deus por colocá-la em meu caminho.Obrigada demais por sua amizade! À Aline Ribeiro Não tenho nem palavras para te agradecer amiga. Você é um exemplo enorme de profissional e eu tenho um orgulho enorme de você. Obrigada por todos os "perrengues" que passamos juntas, pelas coisas incríveis que vivenciamos e por cultivar nossa amizade que agora é pra vida inteira, afinal, virei sua "cumadre, uai". Ao refletir sobre o meu período de Doutorado e o último ano, vejo que só tenho o que agradecer pelo apoio de pessoas incríveis como você. Muito obrigada por tudo! À Francesca Picarella e Laura Tramarin A amizade de vocês só me trouxe risadas e muita alegria. Essa interação Brasil x Itália é poderosa e me enriqueceu com muita cultura, música, alegria e sonhos. Obrigada pelo Natal que passamos juntas e por todo o carinho com essa brasileira. Meu doutorado no exterior com vocês foi muito mais bonito. À Khawlah Albashaireh Khawlah, muito obrigada por ser mais que uma irmã para mim no tempo que passamos juntas. É incrível perceber que nem a barreira de línguas, religião ou cultura pode impedir uma amizade verdadeira.Sinto muito sua falta. Obrigada pelo apoio e por me fazer conhecer novas perspectivas. Nossa amizade só me trouxe crescimento e eu sou muito grata. À Abeer, Om Alkihir, Sumaya e Inas Agradeço demais pela amizade, pelos ensinamentos,pelas risadas, pelas comidas caseiras incríveis, pelo compartilhamento de cultura e por tamanho carinho e empatia por esta brasileira. Que bom olhar pra trás e lembrar que eu tinha vocês! Obrigada por tudo. À Sudhanvi, Rebecca, Zain, Vageesh , Merryn, Nishtha, Queenie, Weiyi and Charlotte Esse grupo foi fantástico e me recebeu tão bem. Obrigada pela amizade e por dividirmos tanta cultura e experiências juntos! Ao Jason Brown e Ryan Kean Muito obrigada por me receberem tão bem, lidarem com a diferença de sotaques e cultura e se empenharem com tanto zelo na tarefa de me ensinar e guiar nos protocolos laboratoriais, apresentações, artigos e pesquisas do Departamento de Ciências Orais da Universidade de Glasgow. Foi incrível e enriquecedor aprender com vocês. Agradecimentos _________________________________ Agradecimentos _______________________________________________ À Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP na pessoa de seu diretor Prof. Tit. Glauco Issamu Miyahara, pela oportunidade de aprendizado e crescimento pessoal e profissional. Ao atual coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciência Odontológica da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP Prof. Dr. Luciano Tavares Angelo Cintra, pelo trabalho, competência e acessibilidade. Ao Departamento de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP pela oportunidade da realização do meu doutorado e aos professores e funcionários pelo convívio tão agradável. Às funcionárias da seção de Pós-graduação da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP Valéria, Cristiane e Lilian, pela presteza, apoio e suporte durante todo esse tempo. À todos os funcionárias da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP pela convivência, dedicação e trabalho duro para manter a nossa Instituição, muito obrigada! Aos queridos Pós-graduandos do Departamento de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP pela amizade, convivência agradável e auxílio mútuo que proporcionaram um ambiente maravilhoso de intenso crescimento pessoal e profissional. Ao Professor Dr. Emerson Camargo e equipe da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) pelo grande apoio e parceria no desenvolvimento e caracterização do nanosistema utilizado no presente estudo. À empresa nChemi na pessoa de Bruno H. R. de Lima pela parceria e fornecimento da magnetita utilizada no presente estudo. Ao LabMicro - FCT / Unesp (Faculdade de Tecnologia e Ciências Aplicadas (FCT), Universidade Estadual Paulista (Unesp), Presidente Prudente / São Paulo, Brasil) na pessoa de José Diego Fernandes e o Prof. Carlos José Leopoldo Constantino pela disponibilidade do equipamento e auxílio na obtenção das imagens de microscopia confocal. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo grande apoio financeiro na forma de Auxílio Regular à Pesquisa (Processo 2017/24416-2). Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro na forma de bolsa de pesquisa de doutorado (Processo nº.: 140543/2017-1) e de Auxílio à Pesquisa (Edital MCTI/CNPq 16/2016 – Universal – Faixa A, Processo nº.: 404721/2016-8). À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro na forma de bolsa de pesquisa de doutorado sanduíche (PDSE – Edital nº 47/2017 – Seleção 2018, Processo nº.: 88881.188706/2018- 01), código financeiro 001. Ao meu orientador no exterior, Professor Gordon Ramage por abrir a oportunidade para que eu pudesse desenvolver minha pesquisa na Universidade de Glasgow sob sua orientação durante 11 meses. Obrigada pelo patrocínio proporcionado no desenvolvimento de nossa pesquisa e por ser tão acessível e ter tido interesse genuíno na troca de experiências entre as instituições. Obrigada por ter me dado a oportunidade de aprender tantas metodologias no seu laboratório e por ser presente e dedicado na minha supervisão. Quero agradecer por tudo do fundo do meu coração e deixar registrado que foi uma honra aprender com esse grande nome da área de Microbiologia. À Universidade de Glasgow e equipe de funcionários pela recepção e incrível oportunidade dada aos pesquisadores estrangeiros. Obrigada por serem tão prestativos, acessíveis e amigáveis. Aos alunos do departamento de Ciências Orais da Faculdade de Odontologia da Universidade de Glasgow (Dental School - University of Glasgow) pela recepção, convivência amigável, auxílio e ensinamentos durante meus 11 meses em Glasgow, muito obrigada! Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho Meu muito obrigada! “A educação é para a alma humana, o que a escultura é para um bloco de mármore” Joseph Addison Resumo Geral ________________________________ ARIAS, L.S. Síntese e avaliação dos efeitos de um nanocarreador de miconazol sobre microrganismos orais. 2020 149f. Tese (Doutorado em Ciência Odontológica, área de Saúde Bucal da Criança) - Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba 2020. RESUMO GERAL A presente tese teve como objetivo geral preparar, caracterizar e avaliar os efeitos antimicrobianos de um nanocarreador de miconazol (MCZ) à base de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro (NPsMOF) funcionalizadas com quitosana (QS). Assim, dois subprojetos (SP1 e SP2) foram desenvolvidos e apresentaram os seguintes objetivos específicos: SP1) Preparar, caracterizar e avaliar os efeitos do nanocarreador NPsMOF-QS-MCZ sobre células planctônicas e biofilmes simples e misto de Candida albicans e Candida glabrata; SP2) Avaliar o efeito do nanocarreador na composição de três diferentes modelos de biofilmes polimicrobianos patogênicos orais (gengivite, prótese total e cárie dentária). A primeira etapa do SP1 consistiu em revestir as NPsMOF com QS e carregar este core-shell com MCZ, a fim de caracterizar este nanocarreador por métodos físico-químicos. As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) do nanocarreador foram determinadas pelo método da microdiluição em caldo, usando o índice da concentração inibitória fracionária a fim de avaliar se houve interação sinergística entre os compostos. Ainda, biofilmes simples e mistos de Candida foram formados no fundo de placas de 24 ou 96 poços por 48 h e, em seguida, tratados por 24 h com NPsMOF-QS-MCZ carreando MCZ a 31,2 e 78 µg/ml, na presença e ausência de um campo magnético externo. Os biofilmes foram avaliados quantitativamente por biomassa total, atividade metabólica, contagem de unidades formadoras de colônias (UFCs) e composição da matriz extracelular. Os dados foram analisados por ANOVA a dois fatores, seguida pelo teste de Holm-Sidak (p<0,05). Ainda, a estrutura dos biofilmes foi avaliada qualitativamente por microscopia eletrônica de varredura e microscopia confocal. Os resultados do SP1 mostraram que o nanocarreador apresentou diâmetro menor que 50 nm e valores de CIM menores do que aqueles encontrados para MCZ sozinho, com efeito sinérgico sobre C. albicans. NPsMOF-QS-MCZ a 78 µg/ml foi mais eficaz que MCZ sozinho na redução de UFCs e atividade metabólica de biofilmes misto e simples de C. albicans. A biomassa total dos biofilmes e a matriz extracelular não foram afetadas pelo nanocarreador, e a aplicação de um campo magnético externo não melhorou seu efeito antibiofilme. As imagens de microscopia confirmam que tratamentos com o nanocarreador, principalmente na maior concentração, apresentaram maior atividade antibiofilme. Com relação ao SP2, as CIMs de NPsMOF-QS-MCZ foram determinadas para diferentes espécies microbianas, e todos os biofilmes polimicrobianos foram desenvolvidos por 5 dias e tratados por 24 h com NPsMOF-QS-MCZ a 64 µg/ml. Após o tratamento, os biofilmes foram avaliados quanto à biomassa total, atividade metabólica, contagem de UFCs e análise composicional por PCR quantitativo. Microscopia eletrônica de varredura foi usada para analisar a estrutura do biofilme. As diferenças entre os grupos foram determinadas por teste t não pareado (p<0,05). Os resultados do SP2 mostraram que NPsMOF-QS-MCZ foi mais eficaz que MCZ sozinho contra a maioria das células fúngicas e bacterianas testadas. Ainda, este nanocarreador foi capaz de reduzir a atividade metabólica, biomassa total e UFCs (p<0,05) dos biofilmes, além de alterar a sua ultraestrutura. Por fim, NPsMOF-QS-MCZ afetou a composição dos três biofilmes polimicrobianos avaliados, reduzindo principalmente os números de Streptococcus spp. e alterando a prevalência das espécies nos biofilmes. Em suma, os resultados dos SP1 e SP2 permitiram concluir que o nanocarreador melhorou o efeito antimicrobiano do MCZ, dependendo da espécie e parâmetro de biofilme avaliados. O nanocarreador também mostrou potencial para interferir nas interações sinergísticas entre células fúngicas e bacterianas dentro de biofilmes polimicrobianos. Palavras-chaves: Biofilmes; Candida; Miconazol; Nanopartículas; Óxido ferroso- férrico; Quitosana. General Abstract ________________________________ ARIAS, L.S. Synthesis and evaluation of the effects of a miconazole nanocarrier on oral microorganisms. 2020 149f. Tese (Doutorado em Ciência Odontológica, área de Saúde Bucal da Criança) - Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba 2020. GENERAL ABSTRACT The present thesis aimed to prepare, characterize and evaluate the antimicrobial effects of a miconazole (MCZ) nanocarrier based on iron oxide magnetic nanoparticles (IONPs) functionalized with chitosan (CS). Thus, two subprojects (SP1 and SP2) were developed and had the following specific objectives: SP1) To prepare, characterize and evaluate the effects of the IONPs-CS-MCZ nanocarrier on planktonic cells and single- and dual-species biofilms of Candida albicans and Candida glabrata; SP2) To evaluate the effect of IONPs-CS-MCZ on the composition of three different models of oral pathogenic biofilms (gingivitis, denture and dental caries). The first step of SP1 was to coat IONPs with CS and to load this core-shell association with MCZ, in order to characterize this nanocarrier by physicochemical methods. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of the nanocarrier were determined by the microdilution method, using the fractional inhibitory concentration index in order to assess whether there was synergistic interaction between the compounds.. In addition, single- and dual-species biofilms of Candida species were formed at the bottom of 24- or 96-well plates for 48 h and, in sequence, treated for 24 h with IONPs-CS-MCZ carrying MCZ at 31.2 and 78 µg/ml, in both the presence and absence of an external magnetic field. Biofilms were quantitatively evaluated by total biomass, metabolic activity, counting of colony forming units (CFUs) and extracellular matrix components. Data were analyzed by two- way ANOVA, followed by Holm-Sidak test (p <0.05). In addition, the structure of biofilms was qualitatively evaluated by scanning electron microscopy and confocal microscopy. The results from SP1 showed that IONPs-CS-MCZ presented diameter smaller than 50 nm, and MIC values lower than those found for MCZ alone, with synergistic effect on C. albicans. Moreover, 78 µg/ml IONPs-CS-MCZ was more effective than MCZ alone in reducing CFUs and metabolic activity of single biofilms of C. albicans and dual-species biofilms. Total biofilm biomass and extracellular matrix were not affected by the nanocarrier, and the application of an external magnetic field did not improve the nanocarrier effects. Microscopy images confirm that treatments with the nanocarrier, mainly in the highest concentration, exhibited greater antibiofilm activity. Regarding SP2, the MICs of IONPs-CS-MCZ were determined for different microbial species, and all polymicrobial biofilms were developed for 5 days and treated for 24 h with IONPs-CS-MCZ at 64 µg/ml. After treatment, the biofilms were evaluated for total biomass, metabolic activity, counting of CFUs and quantitative PCR analysis. Scanning electron microscopy was used to analyze the biofilm ultrastructure. Differences between groups were determined by unpaired t-test (p<0.05). Results from SP2 showed that IONPs-CS-MCZ was more effective than MCZ alone against most fungal and bacterial cells tested. Moreover, this nanocarrier was able to reduce the metabolic activity, total biomass and CFUs (P <0.05) of the biofilms, besides altering their ultrastructure. Finally, IONPs-CS-MCZ affected the composition of the three evaluated biofilms, mainly reducing the numbers of Streptococcus spp. and changing the prevalence of species in the biofilms. From the results obtained by SP1 and SP2, it was possible to conclude that the nanocarrier improved the antimicrobial effect of MCZ, depending on the species and biofilm parameter evaluated. Nanocarrier also showed potential to interfere in the synergistic interactions among fungal and bacterial cells within polymicrobial biofilms. Keywords: Biofilms, Candida; Miconazole; Nanoparticles; Ferrosoferric Oxide; Chitosan. Lista de Figuras ________________________________ Lista de Figuras _______________________________________________ Laís Salomão Arias LISTA DE FIGURAS Capítulo 1 FIGURE 1 - Transmission electron microscopy image (a), size distribution histogram (b), Fourier-transform infrared spectrum (c) and thermogravimetric analysis (d) for the iron oxide magnetic nanoparticles-chitosan-miconazole nanocarrier. Enlarged image in (a) represents the core of a chitosan-coated nanoparticle, and miconazole particles bound to chitosan. The red circle in (c) shows the region of characteristic bands of the presence of miconazole............................................................. 81 FIGURE 2- Quantification of total biomass (mean absorbance values per cm2) for single- (a and b) and dual-species (c) biofilms of C. albicans ATCC 10231 and C. glabrata ATCC 90030 treated with 110 μg/ml iron oxide magnetic nanoparticles (IONPs), 110 μg/ml chitosan (CS), 78 μg/ml miconazole (MCZ) and MCZ-containing nanocarrier at 31.2 (IONPs-CS-MCZ31.2) and 78 μg/ml (IONPs-CS-MCZ78), in the absence or presence of an external magnetic field. Negative control denotes non-treated biofilms (NC). Different uppercase and lowercase letters show significant differences among the treatments for biofilms treated in the absence and presence of an external magnetic field, respectively (2-way ANOVA and Holm-Sidak test, p < 0.05)......................................................... 82 Lista de Figuras _______________________________________________ Laís Salomão Arias FIGURE 3 - Quantification of metabolic activity (mean absorbance values per cm2) for single- (a and b) and dual-species (c) biofilms of C. albicans ATCC 10231 and C. glabrata ATCC 90030 treated with 110 μg/ml iron oxide magnetic nanoparticles (IONPs), 110 μg/ml chitosan (CS), 78 μg/ml miconazole (MCZ) and MCZ-containing nanocarrier at 31.2 (IONPs-CS-MCZ31.2) and 78 μg/ml (IONPs-CS-MCZ78), in the absence or presence of an external magnetic field. Negative control denotes non-treated biofilms (NC). Different uppercase and lowercase letters show significant differences among the treatments for biofilms treated in the absence and presence of an external magnetic field, respectively (2-way ANOVA and Holm-Sidak test, p < 0.05)......................................................... 83 FIGURE 4 - Quantification of cultivable cells (mean values of the logarithm of colony-forming units per cm2) for single- (a and b) and dual- species (c and d) biofilms of C. albicans ATCC 10231 and C. glabrata ATCC 90030 treated with 110 μg/ml iron oxide magnetic nanoparticles (IONPs), 110 μg/ml chitosan (CS), 78 μg/ml miconazole (MCZ) and MCZ-containing nanocarrier at 31.2 (IONPs-CS-MCZ31.2) and 78 μg/ml (IONPs-CS-MCZ78), in the absence or presence of an external magnetic field. Negative control denotes non-treated biofilms (NC). Different uppercase and lowercase letters show significant differences among the treatments for biofilms treated in the absence and presence of an external magnetic field, respectively (2-way ANOVA and Holm-Sidak test, p < 0.05). Within each treatment, asterisk (*) indicates significant difference between biofilms treated in the absence and presence of an external magnetic field............................................................................. 84 Lista de Figuras _______________________________________________ Laís Salomão Arias Capítulo 2 FIGURE 5 - Scanning electron microscopy imagens of dual-species biofilms of Candida albicans ATCC 10231 and C. glabrata ATCC 90030 treated with 110 μg/ml iron oxide magnetic nanoparticles (b), 110 μg/ml chitosan (c), 78 μg/ml miconazole (d) and miconazole-containing nanocarrier at 31.2 (e) and 78 μg/ml (f). Negative control denotes non-treated biofilm (a). Magnification: 2500x. Bars: 10 μm. The red arrows in images (c), (e) and (f) indicate particle clusters..................... 85 FIGURE 6 - Confocal laser scanning microscopy imagens of dual-species biofilms of Candida albicans ATCC 10231 and C. glabrata ATCC 90030 treated with 110 μg/ml iron oxide magnetic nanoparticles (b), 110 μg/ml chitosan (c), 78 μg/ml miconazole (d) and miconazole-containing nanocarrier at 31.2 (e) and 78 μg/ml (f). Negative control denotes non-treated biofilm (a). Magnification: 20x. Bars: 100 μm............................. 86 FIGURE 1 - Results of XTT reduction assay (A), quantification of total biomass (B) and scanning electron microscopy (SEM) observation (C) for the gingivitis biofilm model non-treated (control) and treated with the nanocarrier containing miconazole at 64 mg/L (IONPs-CS-MCZ). Magnification of the SEM images: 1,000x and 3,500x; Bars: 10 and 5 µm. Significant differences between the groups were calculated by unpaired t-test (∗ p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗ p < 0.001, ∗∗∗∗ p < 0.0001). White arrows represent adhesion of bacteria to yeasts/hyphae. Yellow arrow represents loss of cellular membrane integrity.................................................................... 118 Lista de Figuras _______________________________________________ Laís Salomão Arias FIGURE 2 - Results of XTT reduction assay (A), quantification of total biomass (B) and scanning electron microscopy (SEM) observation (C) for the denture biofilm model non-treated (control) and treated with the nanocarrier containing miconazole at 64 mg/L (IONPs-CS-MCZ). Magnification of the SEM images: 1,000x and 3,500x; Bars: 10 and 5 µm. Significant differences between the groups were calculated by unpaired t-test (∗ p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗ p < 0.001, ∗∗∗∗ p < 0.0001). White arrows represent adhesion of bacteria to yeasts/hyphae. Yellow arrow represents loss of cellular membrane integrity.................................................................... 119 FIGURE 3 - Results of XTT reduction assay (A), quantification of total biomass (B) and scanning electron microscopy (SEM) observation (C) for the caries biofilm model non-treated (control) and treated with the nanocarrier containing miconazole at 64 mg/L (IONPs-CS-MCZ). Magnification of the SEM images: 1,000x and 3,500x; Bars: 10 and 5 µm. Significant differences between the groups were calculated by unpaired t-test (∗ p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗ p < 0.001, ∗∗∗∗ p < 0.0001). White arrows represent adhesion of bacteria to yeasts/hyphae. Yellow arrow represents loss of cellular membrane integrity................................................................... 120 FIGURE 4 - Results of counting of colony forming units (A), colony forming equivalents of viable cells (B) and biofilm percentage composition (C) for gingivitis biofilm model non-treated (control group) and treated with nanocarrier containing 64 mg/L miconazole (IONPs-CS-MCZ). Significant differences between the groups were calculated by unpaired t-test (∗ p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗ p < 0.001, ∗∗∗∗ p < 0.0001)..................... 121 Lista de Figuras _______________________________________________ Laís Salomão Arias FIGURE 5 - Results of counting of colony forming units (A), colony forming equivalents of viable cells (B) and biofilm percentage composition (C) for denture biofilm model non-treated (control group) and treated with nanocarrier containing 64 mg/L miconazole (IONPs-CS-MCZ). Significant differences between the groups were calculated by unpaired t-test (∗ p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗ p < 0.001, ∗∗∗∗ p < 0.0001)..................... 122 FIGURE 6 - Results of counting of colony forming units (A), colony forming equivalents of viable cells (B) and biofilm percentage composition (C) for caries biofilm model non-treated (control group) and treated with nanocarrier containing 64 mg/L miconazole (IONPs-CS-MCZ). Significant differences between the groups were calculated by unpaired t-test (∗ p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗ p < 0.001, ∗∗∗∗ p < 0.0001)..................... 123 Lista de Tabelas ________________________________ Lista de Tabelas _______________________________________________ Laís Salomão Arias LISTA DE TABELAS Capítulo 1 Table 1 - Minimum inhibitory concentration (MIC) values of iron oxide magnetic nanoparticles (IONPs), chitosan (CS) and miconazole (MCZ), alone or in association, for the tested Candida strains......................................................................... 77 Table 2 - Mean values (standard deviation) of the protein content obtained from the extracellular matrix of single- and dual- species Candida biofilms after treatment with different compounds................................................................................ 78 Table 3 - Mean values (standard deviation) of the carbohydrate content obtained from the extracellular matrix of single- and dual- species Candida biofilms after treatment with different compounds................................................................................ 79 Table 4 - Mean values (standard deviation) of the DNA content obtained from the extracellular matrix of single- and dual- species Candida biofilms after treatment with different compounds................................................................................ 80 Capítulo 2 Table 1 - Values of minimum inhibitory concentration (MIC) of miconazole (MCZ) and MCZ nanocarrier (IONPs-CS-MCZ) for planktonic (pMIC) and sessile (sMIC50 e sMIC80 ) cells of different Candida albicans strains.............................................. 114 Table 2 - Values of minimum inhibitory concentration (MIC) of miconazole (MCZ) and MCZ nanocarrier (IONPs-CS-MCZ) for planktonic (pMIC) and sessile (sMIC50 e sMIC80 ) cells of the species included in the different studied biofilm models............ 115 Table 3 - Bacterial and fungal primer sequences for real time PCR......... 116 Table 4 - Mean % composition values for each microorganism from the three different biofilm models (Gingivitis, Denture and Dental caries)......................................................................................... 117 Sumário _______________________________ SUMÁRIO INTRODUÇÃO GERAL 38 CAPÍTULO 1- Novel nanocarrier of miconazole based on chitosan-coated iron oxide nanoparticles as a nanotherapy to fight Candida biofilms TITLE PAGE 48 ACKNOWLEDGEMENTS 48 ABSTRACT 50 INTRODUCTION 52 MATERIALS AND METHODS 53 RESULTS 59 DISCUSSION 62 REFERENCES 66 TABLE AND FIGURE CAPTIONS 74 CAPÍTULO 2- Effect of a miconazole nanocarrier on the composition of three in vitro models of pathogenic oral biofilms TITLE PAGE 88 ABSTRACT 89 INTRODUCTION 91 MATERIALS AND METHODS 93 RESULTS 99 DISCUSSION 102 ACKNOWLEDGEMENTS 106 REFERENCES 107 FIGURE CAPTIONS 112 ANEXOS 124 Introdução geral _______________________________ Introdução geral - 36 - _______________________________________________ Introdução geral O ecossistema oral é um ambiente único que proporciona nichos favoráveis à colonização e proliferação de diferentes microrganismos, os quais se encontram, na maioria das vezes, em associações comunitárias complexas formando biofilmes 1 . Os desequilíbrios causados pela falta de higiene oral, uso de certos medicamentos, próteses orais, alterações imunológicas e doenças sistêmicas como diabetes e síndrome da imunodeficiência adquirida geram alterações na composição do microbioma oral, levando ao desenvolvimento de doenças orais como gengivite, cárie dentária e candidíases 2-5 . As leveduras do gênero Candida colonizam a cavidade oral de 25 a 75% dos indivíduos saudáveis 6-8 . No entanto, em estado de desequilíbrio, fungos oportunistas contribuem significativamente para o desenvolvimento de patologias orais 7 . Como um exemplo, Candida albicans seguido por Candida glabrata são os microrganismos mais frequentemente detectados em candidíases orais, como a estomatite protética relacionada à Candida 9,10 . Ainda, C. albicans promove associações sinérgicas com outros microrganismos patogênicos, como Streptococcus mutans 11 . Tal associação é mediada principalmente pela secreção de glicosiltransferases por S. mutans 12 , já que estas exoenzimas produzem α-glucanos que aumentam a adesão de S. mutans à parede celular de C. albicans 12,13 . Além disso, a associação destas espécies resulta na secreção de baixas concentrações (25-50 µM) da molécula de quorum sensing farnesol por C. albicans, o que estimula a formação de biofilmes de S. mutans 14 . Dentre os agentes antifúngicos empregados no tratamento das candidíases destaca-se o miconazol (MCZ), um fármaco de amplo espectro do grupo imidazol, capaz de combater fungos e algumas bactérias 15 . MCZ tem atividade superior à nistatina Introdução geral -37 - _______________________________________________ no combate à candidíase oral 16 e é superior em termos de eficácia em relação a outros azóis, uma vez que apresenta atividade fungicida e fungistática 17 . Entretanto, esta droga pode interagir com outros fármacos, reduzindo sua eficácia, bem como apresentar efeitos colaterais como irritação da mucosa, vômito, diarreia e dores de cabeça 16,18 . O conhecimento do microbioma oral como um conjunto heterogêneo de espécies que modulam umas às outras, o seu ambiente e também o hospedeiro, auxilia a compreender não apenas como ocorre a progressão das doenças, mas também como os microrganismos se adaptam às intempéries físicas e químicas 19 . A literatura tem relatado com maior frequência o desenvolvimento de resistência microbiana aos fármacos convencionais, como o MCZ, e os principais fatores envolvidos são a super- expressão de bombas de efluxo, alteração do alvo celular da droga e a formação de biofilmes 20-23 . A fim de resolver esta problemática, os pesquisadores vêm estudando novas estratégias que possam contornar os mecanismos de resistência sem estimular o desenvolvimento de microrganismos ainda mais resistentes e de difícil erradicação. O uso de nanopartículas como sistemas controlados de entrega de drogas tem sido bastante investigado, já que os nanocarreadores têm potencial para contornar barreiras físicas e químicas, bem como entregar a droga na célula alvo, reduzindo o tempo de exposição e a quantidade de fármaco empregada. Como resultado, o uso de nanocarreadores pode diminuir os efeitos colaterais dos fármacos, bem como as chances de desenvolvimento de mecanismos de resistência por parte dos microrganismos 24-26 . Nessa perspectiva, as nanopartículas magnéticas de óxido de ferro (NPsMOF) permitem fácil manipulação com ajuda de um campo magnético externo e a entrega de drogas de modo ativo e passivo, além de apresentar alta receptividade pelo tecido ou Introdução geral -38 - _______________________________________________ célula alvo 27 . Ainda, a capacidade de funcionalização do núcleo ou 'core' de óxido de ferro com compósitos ou 'shell' de diversas naturezas (ex.: polímeros, surfactantes, ouro, silanos, entre outros) 28 permite reduzir a oxidação das nanopartículas e torná-las mais biocompatíveis, favorecendo sua aplicabilidade clínica 28 . A quitosana (QS) é um polímero derivado da quitina (obtida da carapaça de crustáceos) que tem se mostrado como revestimento apropriado às NPsMOF, já que apresenta propriedades antimicrobianas e hemostáticas, além de ser biocompatível e biodegradável 29,30 . Ainda, a QS permite a ligação química e o carreamento de diferentes drogas, diversificando o campo de atuação dos nanocarreadores 30-32 . Embora os nanocarreadores à base de NPsMOF tenham sido testados em diversos estudos in vitro e in vivo, revestidos ou não por QS, sua aplicabilidade tem sido quase inteiramente voltada para terapias de tratamento do câncer 28,33,34 . Entretanto, estudos recentes têm investigado a ação antibiofilme de nanocarreadores de diferentes drogas convencionais baseados em NPsMOF, mostrando resultados favoráveis em comparação às drogas aplicadas sozinhas 30,32,35 . Por fim, uma outra aplicação é a utilização de um campo magnético externo guiado a fim de mover as NPsMOF pelo biofilme e criar microcanais que facilitam a penetração de drogas nas camadas mais internas do biofilme, promovendo ação antimicrobiana sobre um número maior de células 36,37 . Diante de todo o contexto supracitado e tendo em vista que a eficácia antimicrobiana de um nanocarreador de MCZ com base em NPsMOF revestidas com QS permanece desconhecida, os objetivos do presente estudo foram: 1) preparar e caracterizar um novo nanocarreador de MCZ com base em NPsMOF revestidas com QS (NPsMOF-QS-MCZ), bem como avaliar seu efeito antimicrobiano sobre biofilmes Introdução geral -39 - _______________________________________________ simples e mistos de C. albicans e C. glabrata, na presença e ausência de um campo magnético externo; 2) avaliar o efeito in vitro do nanocarreador NPsMOF-QS-MCZ na composição de modelos polimicrobianos de biofilmes orais patogênicos de gengivite, prótese total e cárie dentária. Para alcançar os objetivos propostos, o presente estudo foi dividido em dois capítulos, como detalhado abaixo: - Capítulo 1: “Novel miconazole nanocarrier based on chitosan-coated iron oxide nanoparticles as a nanotherapy to fight Candida biofilms” (artigo nas normas do periódico Colloids and Surfaces B: Biointerfaces). - Capítulo 2: “Effect of a miconazole nanocarrier on the composition of three in vitro models of pathogenic oral biofilms” (artigo nas normas do periódico Journal of Oral Microbiology). Referências 1. Seneviratne CJ, Zhang CF, Samaranayake LP. Dental plaque biofilm in oral health and disease. Chin J Dent Res. 2011;14(2):87-94. 2. Ferizi L, Dragidella F, Spahiu L, Begzati A, Kotori V. The Influence of Type 1 Diabetes Mellitus on Dental Caries and Salivary Composition. Int J Dent. 2018;2018:5780916. 3. Gaitan-Cepeda LA, Sanchez-Vargas O, Castillo N. Prevalence of oral candidiasis in HIV/AIDS children in highly active antiretroviral therapy era. A literature analysis. 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