RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 05/08/2018. O tomate constrito-alongado: uma nova arquitetura de fruto induzida pela expressão ectópica de LANCEOLATE e alteração de resposta à auxina em carpelos em formação Airton de Carvalho Júnior Botucatu – SP 2016 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU O tomate constrito-alongado: uma nova arquitetura de fruto induzida pela expressão ectópica de LANCEOLATE e alteração de resposta à auxina em carpelos em formação Aluno: Airton de Carvalho Júnior Orientador: Fábio Tebaldi Silveira Nogueira Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Genética). Botucatu – SP 2016 Dedicatória Dedico a todos que contribuíram afetiva e financeiramente para a conclusão desse trabalho bem como para a minha formação acadêmica e profissional. Por um Brasil em que fazer Ciência seja mais que uma paixão: seja uma profissão! CARVALHO, A. J. AGRADECIMENTOS Primeira e prioritariamente a Deus pela oportunidade de cursar o mestrado em Ciências Biológicas (Genética), o que é a realização de um sonho pessoal e profissional. A minha mãe, Maria Almeida Freire, pelo exemplo moral e pela dedicação incondicional a mim e aos meus irmãos hoje e sempre. Ao meu pai Airton de Carvalho pelo exemplo de dedicação profissional e superação pessoal (quando as oportunidades não são sequer acessíveis) e pela oportunidade de reconciliação. Aos meus irmãos Anderson e André por estarmos sempre juntos aprendendo com a trajetória que cada um decidiu seguir e oferecendo suporte mútuo para trilhá-las. Aos meus irmãos Heloísa e Felipe, que mesmo distantes, têm estado presente nos últimos anos, nos permitindo escrever novos (e melhores) capítulos na história dos Carvalhos. À minha namorada Gabriela por ter me conquistado em tão pouco tempo com seu sorriso, carisma e inteligência. Você tem sido uma das minhas razões de viver nesses últimos três anos e tenho certeza de que continuará sendo por toda uma vida juntos que está por vir. Obrigado por apoiar minhas decisões profissionais, por ampliar meus horizontes e por me ajudar a ser um ser-humano melhor! Te amo Amora! Não se esqueça: Meu coração é regador de Flor. Às minhas novas tias de coração: Isabel Maria (Bel), Maria Isabel (Nê) e Alice Marim! Vocês são muito especiais e exemplos de ser-humano! Obrigado por me adotarem como sobrinho. Amo vocês! Ao meu orientador Fábio Tebaldi Silveira Nogueira pelo apoio, incentivo e suporte durante o desenvolvimento deste trabalho, mas principalmente, pela confiança depositada no meu potencial acadêmico-profissional. Você é um exemplo do cientista que eu pretendo me tornar. Ao meu ex-orientador de Bacharelado em Ciências Biológicas, Robson Francisco Carvalho, pelo exemplo de liderança e postura profissional e, principalmente, por me oferecer a primeira oportunidade para iniciar minha carreira acadêmica. Aos meus amigos do Laboratório GMDV: Eder Silva, Geraldo Silva, Antoine Gady, João Correa, Bianca Ribeiro e Felipe Hermínio. Vocês fizeram todo o trabalho ser muito mais fácil e agradável. Obrigado pela parceria (Eder e Antoine) e pelos conselhos para o melhor desenvolvimento deste trabalho e pela amizade massa de vocês, véio. Ao professor Dr. Lázaro Perez, seus alunos e à técnica Cássia por contribuírem com os materiais necessários para o desenvolvimento deste trabalho. Aos amigos: Mateus, Marcela, Heloísa, Maísa e Fred. Obrigado pela ajuda de vocês e pelos momentos de festar e cafezar. Aos meus amigos, ou melhor, irmãos de São Paulo; Bruno, Rodrigo, Juliana e Renato. Por fazerem parte da minha história, pelos momentos quêin: uma lata e quatro copos. Lembram? Sem o apoio e incentivo de vocês jamais chegaria onde estou hoje. Aos meus amigos: Cristiane (Larika) e Sérgio (Freadão) pelo companheirismo, amizade e suporte financeiro-conselheiro (né Freadão?!) nos anos de Graguação. Se não fosse por esse apoio, talvez não tivesse optado por este caminho no Mestrado. Obrigado por fazerem parte da minha história e dos momentos de articulações! Aos meus amigos de Botucatu: Fabiano Parenti, Pedro Sozinho, Ana Prado, Maelson Nascimento, Helder Silva, Adriana de Deus, Elaine Nunes, Elaine Galhardo, Vandinha Souza, Jean Marques e Flávio Codina. Vocês fizeram a diferença nos árduos, mas curtidos anos de Gradução, sem os quais não estaria me tornando Mestre. À amizade de vocês e às memórias das festas, dos luais, das cachoeiras, .... momentos inesquecíveis, mesmo para a minha amnésia... Aos amigos de casa: Ricardo, Junior, Arnaldo, Valdson, Pedro e Daniel. Obrigado pela amizade, apoio...e por dividirem as contas (rs). À Biologia Integral XLV! Por aprender com todos vocês, pelos momentos, pelas risadas, festas e pelos que me aturaram nos momentos de amnésia pós-acidente. Em especial para; Laura Migliorini, Luana Campos, Thaís Roque, Natália Mendes, Jennifer Tezuka, Suyen Naide, Raísa Melo, Bruna Capoville e Luciana Bérgamo (in memoriam). À FAPESP pelo suporte financeiro para o desenvolvimento deste trabalho oferecido através do processo 2015/07171-0. A todos que, mesmo não citados, fazem parte da minha história. ÍNDICE 1.INTRODUÇÂO.....................................................................................................................12 1.1. Desenvolvimento do gineceu de tomateiro: as fases que determinam o tamanho e forma do fruto......................................................................................................................................12 1.2. O papel da auxina no desenvolvimento do fruto................................................................14 1.3. Genes regulatórios do desenvolvimento do carpelo pré-antese.........................................15 1.4. Os fatores de transcrição TCPs..........................................................................................17 1.5. O mutante LANCEOLATE (La/+) .....................................................................................18 1.6. miR319a/LA: uma via regulatória do desenvolvimento vegetal .......................................19 2.2. OBJETIVO.........................................................................................................................21 2.1. Objetivos específicos.........................................................................................................21 3. METODOLOGIA.................................................................................................................21 3.1. Material vegetal: obtenção dos genótipos, cultivo e coleta..............................................21 3.2. Determinação da mutação do mutante La/+ introgredido em Micro-Tom........................23 3.3. Caracterização morfológica e histológica do desenvolvimento do carpelo.......................23 3.4. Hibridização in situ (ISH)..................................................................................................23 3.4.1. Sondas de hibridização ISH............................................................................................24 3.4.2. Ensaio de hibridização....................................................................................................24 3.5. Cruzamento entre plantas mutantes La/+ e plantas transgênicas MT pDR5::GUS...........25 3.6. Análise quantitativa da expressão gênica por RT-qPCR...................................................26 3.6.1. Extração, quantificação e análise da qualidade de RNA total........................................26 3.6.2. Análise quantitativa da expressão gênica por Transcrição Reversa e Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-qPCR)..............................................................................26 3.7. Análises estatísticas............................................................................................................27 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................................27 4.1. Caracterização do fenótipo reprodutivo do mutante La/+.................................................27 4.1.1. Alterações morfológicas da flor......................................................................................27 4.1.2. Arquitetura constrita-alongada do fruto..........................................................................29 4.1.3. Progressão do fenótipo reprodutivo de plantas La/+: do carpelo ao fruto......................31 4.1.4. Caracterização do desenvolvimento do carpelo..............................................................32 4.1.5. Atraso no florescimento..................................................................................................34 4.2. Identificação do alelo LANCEOLATE ..............................................................................35 4.3. Regulação do desenvolvimento do carpelo pela via LA/miR319a.....................................37 4.3.1. O padrão de expressão espaço-temporal de LA..............................................................37 4.3.1.1. Expressão ectópica de LA no meristema floral (MF) de plantas La/+.........................37 4.3.1.2. Expressão diferencial de LA no ovário e anteras maduros de plantas La/+.................38 4.3.2. Aumento dos níveis de expressão de LA durante o desenvolvimento do carpelo de plantas La/+..............................................................................................................................40 4.3.3. Expressão do miR319a em ovários de tomateiro............................................................42 4.3.3.1. Expressão espaço-temporal do miR319a em ovário e anteras maduros......................42 4.3.3.2. Regulação temporal de LA pelo miR319a....................................................................43 4.4. A potencial regulação dos genes SUN e OVATE pela via miR319a/LA............................44 4.5. O aumento de resposta à auxina do mutante La/+ determina o padrão de crescimento constrito-alongado do fruto.......................................................................................................46 4.5.1. O padrão espacial de resposta à auxina nos botões florais de plantas La/+...........................................................................................................................................46 4.5.2. A polarização de resposta à auxina nos carpelos maduros de plantas La/+...........................................................................................................................................47 4.5.3. O acúmulo e a maior responsividade à auxina no carpelo de plantas La/+....................49 4. 6. Modelo proposto para o desenvolvimento do fruto de tomateiro.....................................52 5. TABELAS SUPLEMENTARES..........................................................................................55 6. FIGURAS SUPLEMENTARES...........................................................................................56 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................................57 LISTA DE TABELAS TABELAS Tabela1. Fases de desenvolvimento: do carpelo ao fruto de tomateiro (Solanum pimpinellifolium).......................................................................................................................13 Tabela 2. Padrão de brotação das plantas do mutante La/+.....................................................35 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura carpelar do tomateiro ...............................................................................14 Figura 2. Comparação fenotipica entre plantas MT e La/+.....................................................22 Figura 3. Alterações fenotípicas dos verticilos florais de plantas La/+..................................28 Figura 4. Modificações da arquitetura do fruto de plantas La/+.............................................30 Figura 5. Padrão de crescimento constrito-alongado do fruto de plantas La/+.......................31 Figura 6. Progressão fenotípica do mutante La/+: do carpelo ao fruto...................................32 Figura 7. Caracterização histológica do desenvolvimento do carpelo.....................................33 Figura 8. O alelo La-1 do mutante La/+..................................................................................36 Figura 9. Expressão ectópica de LA no MF do mutante La/+.................................................37 Figura 10. Expressão diferencial de LA em ovários maduros de plantas La/+........................39 Figura 11. Aumento da expressão de LA na morfogênese de ovários de plantas La/+...........41 Figura 12. Co-localização do miR319a e LA em ovários maduros..........................................42 Figura 13. O padrão de expressão do miR319a.......................................................................43 Figura 14. A superexpressão de SUN durante o desenvolvimento inicial do fruto constrito- alongado do mutante La/+.........................................................................................................44 Figura 15. Redução da expressão de OVATE durante o desenvolvimento inicial do fruto constrito-alongado do mutante La/+.........................................................................................45 Figura 16. Localização diferencial de atividade de auxina em botões florais de La/+ pDR5::GUS...............................................................................................................................46 Figura 17. Polarização basal de resposta à auxina em ovários maduros de La/+ pDR5::GUS...............................................................................................................................47 Figura 18. Aumento de expressão de ToFZY1 no período de maturação do carpelo do mutante La/+.............................................................................................................................50 Figura 19. Expressão diferencial do gene ARF3 durante o desenvolvimento do carpelo do mutante La/+.............................................................................................................................51 Figura 20. Modelo hipotético das vias regulatórias do desenvolvimento do carpelo do mutante La/+.............................................................................................................................54 Figura S1. Obtenção da sonda de hibridização LANCEOLATE.............................................55 Figura S2. Eficiência da sonda de hibridização LANCEOLATE.............................................55 RESUMO Os fatores de transcrição do tipo Teosinte Branched1/Cycloidea/PCF (TCP) controlam diferentes aspectos do desenvolvimento vegetal, como morfogênese foliar, simetria floral e padrão de ramificação. Em tomateiro (Solanum lycopersicum L.), a mutação do gene do tipo TCP LANCEOLATE (LA) no sítio de reconhecimento do microRNA miR319 promove drástica alteração da arquitetura vegetativa; em vez da característica folha composta de tomateiro, plantas mutantes La/+ desenvolvem folhas simples de margens não recortadas. Neste estudo, demonstramos que o fruto também apresenta fenótipo alterado: plantas mutantes La/+ apresentam frutos alongados no eixo proximal-distal e estreitos no eixo meso- lateral. O crescimento diferencial nos eixos de crescimento caracteriza um novo padrão de desenvolvimento do fruto: o constrito-alongado. O carpelo já apresenta essas alterações durante sua morfogênese, as quais são acentuadas progressivamente até a formação do fruto. A caracterização do desenvolvimento do carpelo revela a expressão ectópica de LA no meristema floral, indicando que uma alteração espaço-temporal na expressão do gene LA no início do desenvolvimento do carpelo determina uma nova arquitetura do ovário e, consequentemente, do fruto. A análise de distribuição de auxina no carpelo do mutante indica, ainda, um gradiente basal-apical que pode determinar mais um intrigante fenótipo do fruto de LA: a não formação de septos e a formação de uma placenta rudimentar. Adicionalmente, a detecção de uma polarização basal de resposta à auxina no carpelo sugere uma revisão do atual modelo de desenvolvimento do gineceu baseado em arabidopsis e a proposição de um novo modelo de desenvolvimento para o gineceu de tomateiro. Palavras-chave: desenvolvimento, gineceu, Solanum lycopersicum, miR319. 12 1. INTRODUÇÂO 1.1. Desenvolvimento do carpelo de tomateiro: as fases que determinam o tamanho e forma do fruto. O fruto é uma das últimas estruturas a se desenvolver durante o ciclo de vida dos vegetais. No entanto, sua forma e tamanho são determinados previamente em alguns períodos críticos do desenvolvimento; desde o crescimento vegetativo até a formação e determinação das estruturas reprodutivas (Ruan et al., 2012). Apesar de frutos secos e deiscentes representarem a maioria dos frutos das espécies vegetais, os estudos de desenvolvimento de fruto são focados, principalmente, em espécies de frutos carnosos devido a sua importância para a dieta humana. Ênfase tem sido dada, em particular, ao tomateiro (Solanum lycopersicum L.) como sistema para análises genéticas e moleculares do desenvolvimento e amadurecimento de frutos carnosos (Giovannoni et al, 2001). O surgimento do meristema floral (MF) é considerado o início do desenvolvimento do fruto de tomateiro (Tabela 1), pois é o momento em que se inicia o desenvolvimento do carpelo e demais verticilos florais (Xiao et al., 2009). Os primeiros 10 dias de desenvolvimento representam um período crítico que influencia significativamente as dimensões finais do fruto, uma vez que o número de células em divisão e diferenciação vão determinar o tamanho e a forma do carpelo e, consequentemente, do fruto maduro (Causier et al., 2010; Palmer et al., 2015). Essa primeira fase é denominada pré-antese (anterior à abertura da flor) e é marcada pela organização das células do MF e delimitação dos limites entre os eixos de crescimento (proximal-distal, meso-lateral e adaxial-abaxial), os quais definem as células que se diferenciam para formar as estruturas carpelares: ovário, estilete, estigma, placenta e óvulos. (Heisler et al., 2001; Nahar et al.,2012). Entre o quinto e sexto dia, ocorre o surgimento dos primórdios carpelares e a formação dos lóculos (Szymkowiak e Sussex, 1992; Brukhin et al, 2003). O carpelo continua se desenvolvendo até o décimo dia, quando se dá a formação dos óvulos, até o estabelecimento da arquitetura final do carpelo, que ocorre por volta do vigésimo dia (Figura 1 - Fig. 1). Ao final desta fase, a formação do carpelo maduro coincide com a antese (abertura da flor), quando ocorre a polinização e fertilização dos óvulos (Gillaspy et al., 1993). Inicia-se, então, a fase pós-antese, período de intensa divisão celular seguido por uma rápida fase de expansão celular que culmina em extensivo aumento no tamanho do fruto (Terao et al., 2013). O último estágio do desenvolvimento do fruto é o amadurecimento, no qual ocorre uma série de modificações 13 bioquímicas e fisiológicas responsáveis pelas características do fruto maduro (van der Knaap et al., 2014). Tabela 1. Fases de desenvolvimento: do carpelo ao fruto de tomateiro (Solanum pimpinellifolium). Adaptado de Xiao et al., 2009. Fases Estágios de desenvolvimento Eventos celulares Dias pós- formação do MF 1 Inflorescência e formação do MF Determinação do número e tamanho das células do MF 0 2 Organização do MF Identidade celular e delimitação dos eixos de crescimento 1 3 Primórdio carpelar Proliferação e expansão celular 5-6 4* Crescimento do carpelo Diferenciação tecidual 6-10 Maturação do carpelo Crescimento do carpelo --------- Diferenciação tecidual 10 11-18 5 Antese --------- 19 6 Fertilização e embriogênese Proliferação 20-25 7 Crescimento do fruto Extensão 25-39 *: a morfogênese do carpelo compreende o período de 2-10 dias pós formação do MF referente ao intervalo das fases 1-4 do desenvolvimento do fruto. MF: meristema floral. 14 Figura 1. Estrutura carpelar do tomateiro. Microscopia eletrônica de varredura (false colored) do gineceu (mostrando estilete, ovário e receptáculo) de tomateiro cv. Micro- Tom (MT). Fonte: Laboratório GMDV. 1.2. O papel da auxina no desenvolvimento do fruto A participação da auxina no desenvolvimento do carpelo é determinante para o estabelecimento da sua arquitetura, bem como para a formação dos tecidos internos do ovário: a placenta e os óvulos (Robert et al., 2015). Nessa fase inicial do desenvolvimento do fruto, similarmente ao que ocorre na morfogênese foliar, o carpelo cresce a partir de um pico de síntese de auxina no MF controlado pelo posicionamento das proteínas PIN (PIN FORMED PROTEINS) (Van Mourik et al., 2012). A localização da auxina no MF é fundamental para a delimitação das regiões de surgimento dos primórdios carpelares, as quais coincidem com áreas com menos auxina (Yu e Huang, 2016). Um desarranjo desse posicionamento pode levar a alterações da morfologia da flor, como acontece com o mutante pin-1 em arabidopsis (Vernoux et al., 2000). O crescimento dos verticilos florais é então regulado por importantes fatores transcricionais que controlam o desenvolvimento floral, como LEAFY e APETALA 1, os quais são induzidos positivamente pela auxina no MF (Winter et al., 2015). O papel da auxina nas etapas subsequentes do desenvolvimento do carpelo ainda não é bem conhecido. Após o desenvolvimento do carpelo durante o período pré-antese da flor, período considerado a fase inicial do desenvolvimento do fruto (Ruan et al., 2012), o desenvolvimento prossegue pós-antese da flor, momento marcado pela fertilização dos óvulos (van der Knaap et al., 2014). A fase pós-antese é caracterizada basicamente por uma fase de crescimento, em que ocorre o estímulo para o início das divisões celulares e subsequente expansão celular, seguida por uma fase de amadurecimento em que há alteração da coloração e acúmulo de 15 nutrientes e açúcares que conferem as características organolépticas (e.g. sabor e aroma) do fruto (Osorio et al., 2011). Durante a fase de crescimento, há um aumento no nível de auxina, citocinina e giberelina no fruto, de modo que esses fitohormônios agem de maneira orquestrada para promover a divisão e a expansão celular (Mc Atee et al., 2013). Em tomateiro, há um aumento de giberelina no ovário pós fertilização e posterior aumento da síntese de auxina nas sementes em desenvolvimento (Olimpieri et al., 2007). A auxina produzida é transportada para o pericarpo do fruto, onde induz a síntese de giberelina que promove a expansão celular em sinergia com a auxina (Hu et al., 2008). Esse crosstalk entre auxina e giberelina é conhecido como a hipótese de “controle da semente” sobre o crescimento do fruto (Ozga et al., 1992). A síntese inicial de auxina já é detectada, inclusive, em óvulos de até 6 dias antes da antese da flor, momento em que ocorre a fertilização dos óvulos e se inicia o transporte da auxina sintetizada nas sementes para a placenta e pericarpo do fruto (Pattison e Catalá, 2012). Na fase posterior de amadurecimento, há um declínio gradual de síntese de auxina citocinina e giberelina, enquanto ocorre um aumento de ácido abscísico (ABA) e etileno que promovem o transporte de açúcares, redução da acidez e alteração da cor e aroma do fruto (Klee e Giovannoni, 2011). A função de cada hormônio nesses processos ainda não é bem documentada, mas já foi demonstrado que a síntese de ABA precede a do etileno (Jiang et al., 2000) e que a aplicação desse hormônio induz a síntese de etileno por meio da ativação de genes de sua biossíntese (Zhang et al., 2009). Por sua vez, a supressão de ABA resulta em atraso do amadurecimento (Sun et al., 2012). Curiosamente, foi demonstrado que o etileno pode induzir um aumento de síntese de auxina também nessa fase, através da indução de expressão de genes de síntese e sinalização (Trainotti et al., 2007). 1.3. Genes regulatórios do desenvolvimento do carpelo pré-antese A regulação do desenvolvimento do carpelo ocorre através da interação dos fitohormônios com importantes genes responsáveis pela determinação da forma e tamanho do fruto (Rodríguez et al., 2011). Esses genes regulam o desenvolvimento do carpelo durante as fases de pré-antese, especificamente a partir da formação do MF, a saber: Locule Number (LC), FASCIATED (FAS), Cell Number Regulator (CNR), OVATE e SUN (van der Knaap et al., 2014). O gene CNR controla o número e tamanho de células do MF (Guo et al., 2010), 16 OVATE e SUN estão relacionados com o desenvolvimento de frutos alongados (Wang et al., 2011; Huang et al., 2013) e FAS e LC controlam o número de lóculos do fruto (Muños et al., 2011). Dentre esses genes, o OVATE e o SUN são expressos durante o período de surgimento dos primórdios carpelares (Wu et al., 2011), o que sugere que esses genes podem influenciar diretamente a determinação da morfologia do carpelo regulando as taxas de proliferação e expansão celular. O gene OVATE está localizado no cromossomo 2 e codifica proteínas Ovate Family proteins (OFPs), uma nova classe de proteínas identificada em várias espécies vegetais incluindo arabidopsis (19 OFPs) e tomateiro (26 OFPs) (Liu et al., 2014). A mutação OVATE encontrada em tomateiro apresenta um códon prematuro de parada transducinal, o que leva à perda do domínio C-terminal 9 (que caracteriza a família OFP) conservado em arabidopsis, tomateiro e outras espécies vegetais (Liu et al., 2002). Essa alteração da proteína gera alterações na estrutura do carpelo, além da formação de frutos alongados e/ou oblongos (formato de pêra) (Wu et al., 2015). As modificações no carpelo podem estar associadas com a interação de OVATE com um domínio TRM, o qual é característico de uma superfamília de proteínas que participam da síntese e organização de microtúbulos do citoesqueleto; (Spinner et al., 2013; van der Naap et al., 2014). Isso ocorre em função do OVATE ser um repressor do crescimento e alongamento do fruto, possivelmente reprimindo a expressão do SlGA20ox1, gene de biossíntese de giberelina (Wang et al., 2007), De fato, a expressão transiente de AtOFP1 e AtOFP5 em folhas de tabaco detectou sinal de ambos em microtúbulos e plantas que superexpressam AtOFP1 apresentam redução da expressão de AtGA20ox1 (Hackbusch et al., 2005). Além da modificação da morfologia do fruto, o aumento da expressão de OVATE em tomateiro resulta em redução da estatura da planta e dos verticilos florais (Liu et al., 2002), sugerindo uma regulação pleiótropica no desenvolvimento vegetal, provavelmente em sinergia com outros importantes genes reguladores do desenvolvimento como LANCEOLATE (LA) e SUN. O gene SUN, por sua vez, está localizado no cromossomo 7 e codifica uma proteína envolvida na sinalização de cálcio intracelular. Um evento de translocação que ocorre do cromossomo 10 para o 7 no mutante SUN de tomateiro resulta em sua maior expressão durante o desenvolvimento da flor e leva à formação de frutos alongados (Jiang et al., 2009). A relação desse fenótipo com o aumento de expressão de SUN ainda não está bem 17 esclarecida, mas já foi demonstrado que o mutante SUN apresenta alterações no padrão de divisão e distribuição de células do pericarpo (van der Knaap et al., 2014). Adicionalmente, plantas obtidas do cruzamento entre mutantes para ambos OVATE e SUN apresentam efeito sinérgico no alongamento do fruto, indicando o envolvimento em vias comuns de regulação da fase de proliferação e expansão celular (Parapunova et al., 2014). Curiosamente, um fenótipo similar aos frutos desses mutantes é observado no mutante natural de tomateiro do gene do tipo TCP LANCEOLATE (mutante La). 1.4. Os fatores de transcrição TCPs Plantas mutantes La possuem mutação no gene LANCEOLATE. Este gene pertence à família de fatores de transcrição do tipo Teosinte Branched1/Cycloidea/PCF (TCP; Martin- Trillo et al., 2010). Os TCPs controlam diversos aspectos do desenvolvimento, como morfogênese foliar, simetria floral e padrão de ramificação (Uberti et al., 2013). Os TCPs são caracterizados pela presença do domínio basic-helix-loop-helix (bHLH) de ligação ao DNA e, baseado na homologia deste domínio, os TCPs de Arabidopsis thaliana são subdivididos em duas classes: classe I e II (Cubas et al., 1999). A classe I é representada pelos PCFs, os quais regulam a divisão celular e crescimento em processos como desenvolvimento embrionário (Herve et al., 2009) e biossíntese de pólen (Takeda et al., 2006), enquanto a classe II é representada pelo Cycloidea (CYC) e Teosinte Branched1 (TB1) que estão relacionados com a determinação da arquitetura da planta, regulando, entre outros processos, a simetria floral (Howarth et al., 2014) e o desenvolvimento das gemas axilares (branching), respectivamente (Aguilar-Martínez et al., 2007). As vias moleculares dos TCPs de classe II ainda não estão bem esclarecidas, mas já foi demonstrado o papel do TCP4 na regulação do ciclo celular e na repressão da divisão celular (Aggarwal et al., 2011; Schommer et al., 2014). O gene TCP4 em arabidopsis é o homólogo de LA de tomateiro, o qual também pode ser denominado SlTCP4 (Solanum lycopersicum TCP4) (Parapunova et al., 2014). Interessantemente, os TCPs de classe II são regulados pós-transcricionalmente pelo microRNA miR319, como é o caso do LA, gene que está relacionado com a determinação da arquitetura da planta de tomateiro por meio da regulação do período de diferenciação da morfogênese foliar (Ori et al., 2007). 18 1.5. O mutante LANCEOLATE (La) O fenótipo mais característico da mutação LANCEOLATE é a alteração da arquitetura vegetativa: em vez da característica folha composta de tomateiro, o mutante apresenta folha simples de margens não recortadas, o que lhe confere um aspecto morfológico similar a uma lança. Essa mutação apresenta dominância incompleta, o que gera um fenótipo dose- dependente para o alelo La; os homozigotos (La/La) têm folhas muito pequenas e geralmente não sobrevivem, enquanto os heterozigotos (La/+) se desenvolvem e apresentam o fenótipo foliar característico da mutação (Stettler et al., 1964). O fenótipo observado nos mutantes La/La e La/+ deve-se a uma substituição de base no sítio de reconhecimento ao miR319, o que impede a regulação dos seus níveis de expressão por esse microRNA (miRNA) durante a morfogênese foliar (Ori et al., 2007). Curiosamente, a análise da atividade do promotor pDR5 (promotor sintético responsível ao fitohormônio auxina), revela que o mutante La/+ apresenta redução de resposta à auxina na região meristemática do primórdio foliar (Ben-Gera e Ori, 2012). Entretanto, a maior expressão de LA deveria estar associada com níveis maiores de auxina, uma vez que a diferenciação foliar é adiantada. De fato, o mutante de tomateiro e (entire), ao liberar a inibição de auxina, apresenta folhas simples similares ao mutante La/+ (Ben-Gera et al., 2012) e ao duplo mutante La/+ ;e (Ben-Gera e Ori, 2012). O controle de distribuição de auxina também é essencial para a regulação do crescimento proximal-distal e estabelecimento da simetria radial durante o desenvolvimento do carpelo (Moubayidin e Østergaard, 2014), o que indica uma relação com outro fenótipo bastante intrigante e pouco estudado do mutante La/+: o desenvolvimento de frutos alongados. Estas características do fruto podem estar associadas com modificações da estrutura do carpelo no eixo de crescimento proximal-distal e/ou meso-lateral durante as fases 2 e 3 da pré-antese, o que sugere alterações na distribuição de auxina ao longo desse eixo de crescimento e nas vias regulatórias de OVATE e SUN, associadas a um novo padrão de expressão de LA. Curiosamente, essas alterações morfológicas do carpelo conferem ao fruto um aspecto similar à pimenta (fruto das espécies do gênero Capsicum) o que pode sugerir mutações em alelos de genes conservados entre as espécies da família Solanaceae (Kim et al., 2014). 19 1.6. miR319a/LA: uma via regulatória do desenvolvimento vegetal Os miRNAs são importantes moléculas envolvidas na regulação da expressão gênica em vias de crescimento e desenvolvimento vegetal (Baulcombe, 2004; Mallory e Vaucheret, 2006). Essas moléculas são pequenos RNAs não codificantes de 19-22 nucleotídeos que regulam a expressão gênica se ligando a um sítio complementar em seus RNAs mensageiros (RNAms) alvo (miRBase 21, http://www.mirbase.org/). Essa associação induz a desestabilização e/ou clivagem ou mesmo bloqueamento da tradução do RNAm por associação do complexo miRNA/RNAm alvo com ribozimas argonautas do complexo de silenciamento induzido por miRNA (RISC) (Iwakawa et al., 2013). O miR319 foi descoberto em plantas mutantes de Arabidopsis thaliana jagged and wavy leaves (jaw-D) por apresentar um drástico fenótipo da folha (complexa e de margem mais recortada) e, consequentemente, da arquitetura vegetativa da planta. A descoberta ocorreu durante um screening de plantas transgênicas transformadas com um vetor contendo um T-DNA (Tagging-DNA) que carrega um enhancer viral derivado do pCaMV35S (cawliflower mosaic virus promoter 35S). Esse T-DNA se insere randomicamente no genoma e induz a expressão de genes próximos levando ao surgimento de mutantes ganho de função (Weigel et al., 2000). Curiosamente, a análise de jaw-D revelou que a inserção do T-DNA ocorreu numa região intergênica do cromossomo 4 onde não foi localizada nenhuma ORF (open region frame). Isso sugeriu que JAW poderia não ser um gene codificador de proteína. Experimentos de microarranjo (microarray) identificaram cinco genes TCPs com expressão reduzida no mutante jaw-D que contêm uma região altamente conservada de 21 nucleotídeos em seus RNAms compartilhada com TCPs de 20 espécies. O sequenciamento de jaw-D identificou uma sequência complementar à região conservada dos RNAms dos TCPs e a análise de expressão indicou superexpressão do transcrito, o que levou à identificação do gene codificador de microRNA (MIR) MIR319 (Palatnik et al., 2003). A estratégia permitiu a descoberta de outros miRNAs e seus alvos por microarray, abordagem utilizada posteriormente também em animais (Lim et al., 2005). A identificação dos alvos do miR319 vieram a partir de estudos com a indução de novas mutações em jaw-D, utilizando a aplicação do agente mutagênico EMS (etilmetanosulfanato). Dos mutantes identificados, o soj8 (supressor of jaw-D) apresentou uma mutação no sítio de reconhecimento do miR319 que levou à supressão do fenótipo foliar de jaw-D, compensando os altos níveis de expressão do miR319 nessa planta e confirmando a 20 regulação dos TCPs pelo miR319 (Palatnik et al., 2007). Além disso, foi identificada a redução do tamanho da folha em plantas transgênicas de arabidopsis rTCP4(miR319-resistant TCP), o qual possui seis mutações sinônimas inseridas no sítio de reconhecimento do miR319, além da mesma mutação encontrada no mutante soj8 (Palatnik et al., 2003; 2014). Os TCPs regulados pelo miR319 pertencem à classe II dessa família de fatores de transcrição (Lopez et al., 2015). Em tomateiro, a relação entre os níveis de expressão do miR319 e seus alvos determina o tempo de diferenciação das células presentes na margem foliar (blastozona), região que ao se diferenciar, dá origem a folhas compostas e de margem recortada. No caso do mutante La, baixos níveis de expressão do miR319 e altos níveis do gene LA geram folhas simples. Em contrapartida, a maior expressão do miR319 e consequente menor expressão do LA resulta em crescimento indeterminado das folhas (Ori et al., 2007). Recentemente, foi demonstrado em A. thaliana que das três isoformas do miR319 (miR319a, miR319b e miR319c), o miR319a é a isoforma que regula o gene TCP4 (Ori et al., 2007) e que a mutação de perda de função para o MIR319a leva à formação de pétalas curtas e estames que apresentam deformidades durante o desenvolvimento das anteras (Nag et al., 2009), indicando que a via miR319a/TCP4 também regula o desenvolvimento de órgãos reprodutivos e, consequentemente, a arquitetura floral. O gene CINCINNATA, outro homólogo de LA em Antirrhinum, regula o desenvolvimento de pétalas (Crawford et al., 2004). Essas evidências sugerem que as vias de regulação da morfogênese foliar podem regular também o desenvolvimento dos verticilos florais em tomateiro. Embora a importância dessa via para o desenvolvimento vegetativo e de algumas estruturas florais já esteja estabelecida, ainda não havia sido esclarecido o papel da via miR319a/LANCEOLATE durante o desenvolvimento do carpelo de tomateiro, estrutura floral que determina a forma e o tamanho dos frutos. Portanto, a hipótese deste trabalho é que a via miR319a/LANCEOLATE regule o desenvolvimento dos carpelos em tomateiro, similarmente ao seu controle do desenvolvimento foliar. Tal controle pode envolver, ainda, modificações de resposta ao fitohormônio auxina e modulação de expressão de genes associados ao estabelecimento da arquitetura carpelar e ao desenvolvimento inicial do fruto. 57 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Aggarwal P, Padmanabhan B, Bhat A, Sarvepalli K, Sadhale PP, Nath U. 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