Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT 29409161812001273 15/05/2019 870190045652 16:17 Número do Processo: BR 10 2019 009921 6 Dados do Depositante (71) Depositante 1 de 1 Nome ou Razão Social: UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS - UNICAMP Tipo de Pessoa: Pessoa Jurídica CPF/CNPJ: 46068425000133 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Jurídica: Instituição de Ensino e Pesquisa Endereço: Cidade Universitária Zeferino Vaz Cidade: Campinas Estado: SP CEP: 13084-971 País: Brasil Telefone: Fax: Email: patentes@inova.unicamp.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 15/05/2019 às 16:17, Petição 870190045652 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 1/61 Dados do Pedido Natureza Patente: 10 - Patente de Invenção (PI) Título da Invenção ou Modelo de Utilidade (54): COMPOSIÇÃO DE CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS NATURAIS COM INTRÍNSECA AÇÃO ANESTÉSICA, BACTERICIDA, ANTIFÚNGICA E BIOPESTICIDA Resumo: A presente invenção se relaciona a formulações compreendendo carreadores lipídicos nanoestruturados.Especificamente, a formulação ora pleiteada compreende nanopartículas carreadoras lipídicas (NLC) naturais cuja composição estritamente natural permite o encapsulamento de óleos essenciais com notável perfil de estabilidade mantendo tamanho e uma distribuição de diâmetro médio homogêneos após 1 ano de monitoramento em temperatura ambiente. Tal característica permite a obtenção de uma pluralidade de efeitos intrínsecos, com ação anestésica, bactericida, antifúngica e biopesticida contra lagartas, carunchos e ácaros, sem exigir o encapsulamento de princípios ativos sintéticos. 15Figura a publicar: Dados do Procurador Nome ou Razão Social: Frateschi Procurador: Numero OAB: Numero API: CPF/CNPJ: 05923951894 Endereço: Avenida ENgenheiro Luiz ANtonio Laloni 321 Cidade: Campinas Estado: SP CEP: 13086906 Telefone: 1935215262 Fax: Email: patentes@inova.unicamp.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 15/05/2019 às 16:17, Petição 870190045652 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 2/61 Dados do Inventor (72) Inventor 1 de 15 Nome: LÍGIA NUNES DE MORAIS RIBEIRO CPF: 34541758873 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Pesquisador Endereço: Rua Monteiro Lobato, 255 Cidade: Campinas Estado: SP CEP: 13082-865 País: BRASIL Telefone: (19) 352 16144 Fax: Email: nuneslica@gmail.com Inventor 2 de 15 Nome: ENEIDA DE PAULA CPF: 03953663801 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: Rua Dr. Olímpio da Silva Miranda, 289 Cidade: Campinas Estado: SP CEP: 13083-010 País: BRASIL Telefone: (19) 352 16143 Fax: Email: depaula@unicamp.br Inventor 3 de 15 Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 15/05/2019 às 16:17, Petição 870190045652 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 3/61 Nome: SIMONE RAMOS DE CASTRO CPF: 78828988215 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Enfermeiro de nível superior, nutricionista, farmacêutico e afins Endereço: Av. Santa Isabel, 193 Cidade: Campinas Estado: SP CEP: 13084-012 País: BRASIL Telefone: (19) 352 16144 Fax: Email: simonercastro@hotmail.com Inventor 4 de 15 Nome: LUDMILLA DAVID DE MOURA CPF: 10630779660 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Estudante de Pós Graduação Endereço: Rua Romeu Tórtima, 770. Apt 11 Cidade: Campinas Estado: SP CEP: 13084-791 País: BRASIL Telefone: (19) 352 16144 Fax: Email: ludmilladavidm@gmail.com Inventor 5 de 15 Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 15/05/2019 às 16:17, Petição 870190045652 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 4/61 Nome: MARCELO LANCELLOTTI CPF: 25534567864 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Biólogo, biomédico e afins Endereço: Rua Áustria ,177 Cidade: Americana Estado: SP CEP: 13471-620 País: BRASIL Telefone: (19) 352 18128 Fax: Email: marcelo.lancellotti@fcf.unicamp.br Inventor 6 de 15 Nome: MÁRCIA CRISTINA BREITKREITZ CPF: 29837713852 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Físico, químico, meteorologista, geólogo, oceanógrafo e afins Endereço: Rua do Sol, 148 Edificio Acácia apto 31 Cidade: Campinas Estado: SP CEP: 13085-260 País: BRASIL Telefone: (19) 352 13028 Fax: Email: marciacristinab@iqm.unicamp.br Inventor 7 de 15 Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 15/05/2019 às 16:17, Petição 870190045652 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 5/61 Nome: VIVIANE APARECIDA GUILHERME DAMASIO CPF: 31836371896 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Pesquisador Endereço: Rua Dr Mauro Brandemburgo 814 j 31 Cidade: Campinas Estado: SP CEP: 13098-421 País: BRASIL Telefone: (19) 992 464318 Fax: Email: viguilherme@gmail.com Inventor 8 de 15 Nome: GUSTAVO HENRIQUE RODRIGUES DA SILVA CPF: 29537328880 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Estudante de Pós Graduação Endereço: Rua Angelo Varandas, 93 Cidade: Paulínia Estado: SP CEP: 13140-000 País: BRASIL Telefone: (19) 352 16144 Fax: Email: gustavohrs@gmail.com Inventor 9 de 15 Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 15/05/2019 às 16:17, Petição 870190045652 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 6/61 Nome: LEONARDO FERNANDES FRACETO CPF: 20633995819 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: Rodovia Raposo Tavares km 82, Condomínio Recanto dos Pássaros, Lote 3 Quadra D. Cidade: Alumínio Estado: SP CEP: 18125-990 País: BRASIL Telefone: (15) 323 83456 Fax: Email: leonardo.fraceto@unesp.br Inventor 10 de 15 Nome: MÔNICA PASCOLI CPF: 40425850862 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Biólogo, biomédico e afins Endereço: Avenida Comendador Pereira Inácio, 253, Apartamento 03 Cidade: Sorocaba Estado: SP CEP: 18030-005 País: BRASIL Telefone: (15) 997 177742 Fax: Email: mo.pascoli@msn.com Inventor 11 de 15 Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 15/05/2019 às 16:17, Petição 870190045652 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 7/61 Nome: FELÍCIA PEREIRA DE ALBUQUERQUE CPF: 33001760850 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Biólogo, biomédico e afins Endereço: Rua Constantino Verrone, nº 192, bloco 2, apartamento 404 Cidade: Sorocaba Estado: SP CEP: 18071-053 País: BRASIL Telefone: (15) 981 776237 Fax: Email: felicia.pa@hotmail.com Inventor 12 de 15 Nome: RICARDO ANTONIO POLANCZYK CPF: 50276239091 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: Alameda Jose de Oliveira Fagundes, 150 Cidade: Jaboticabal Estado: SP CEP: 14890-242 País: BRASIL Telefone: (16) 320 97306 Fax: Email: r.polanczyk@unesp.br Inventor 13 de 15 Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 15/05/2019 às 16:17, Petição 870190045652 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 8/61 Nome: DANIEL JUNIOR DE ANDRADE CPF: 33968213866 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane s/n. Jaboticabal-SP. Campus da UNESP. Departamento de Fitossanidade – Laboratório de Acarologia Cidade: Jaboticabal Estado: SP CEP: 14884-900 País: BRASIL Telefone: (16) 320 97293 Fax: Email: danieldwv@yahoo.com.br Inventor 14 de 15 Nome: ANDRÉ RICARDO DE LIMA DAMASIO CPF: 03964048984 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: Av. João Scarparo Netto 240, apto 226 Nobres Cidade: Campinas Estado: SP CEP: 13080-655 País: BRASIL Telefone: (19) 352 11437 Fax: Email: adamasio@unicamp.br Inventor 15 de 15 Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 15/05/2019 às 16:17, Petição 870190045652 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 9/61 Nome: MARCELO VENTURA RUBIO CPF: 32028082810 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Biólogo, biomédico e afins Endereço: Rua Pedro Virilo 48, apto 15 Cidade: Indaiatuba Estado: SP CEP: 13339-545 País: BRASIL Telefone: (19) 352 11437 Fax: Email: marcelov.rubio@gmail.com NomeTipo Anexo Relatório Descritivo 1377_RELATORIO DESCRITIVO_100519.pdf Reivindicação 1377_REIVINDICACOES_100519.pdf Desenho 1377_DESENHOS_100519.pdf Resumo 1377_RESUMO_100519.pdf Comprovante de pagamento de GRU 200 1377_GRU_211118.pdf Procuração PROCURACAO_UNICAMP_110419.pdf Documentos anexados Acesso ao Patrimônio Genético Declaração Negativa de Acesso - Declaro que o objeto do presente pedido de patente de invenção não foi obtido em decorrência de acesso à amostra de componente do Patrimônio Genético Brasileiro, o acesso foi realizado antes de 30 de junho de 2000, ou não se aplica. Declaro, sob as penas da lei, que todas as informações acima prestadas são completas e verdadeiras. Declaração de veracidade Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 15/05/2019 às 16:17, Petição 870190045652 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 10/61 1 / 33 COMPOSIÇÃO DE CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS NATURAIS COM INTRÍNSICA AÇÃO ANESTÉSICA, BACTERICIDA, ANTIFÚNGICA E BIOPESTICIDA Campo da invenção [001] A presente invenção se relaciona a formulações compreendendo carreadores lipídicos nanoestruturados. Especificamente, a formulação ora pleiteada compreende nanopartículas carreadoras lipídicas (NLC) naturais cuja composição permite o encapsulamento de óleos essenciais com notável perfil de estabilidade, mantendo tamanho e distribuição de diâmetro médio homogêneos mesmo após 1 ano de monitoramento. Em outras palavras, a presente formulação permite a obtenção de uma pluralidade de efeitos terapêuticos intrínsecos, obtidos por meio do encapsulamento de óleos essenciais e ação sinérgica dos demais componentes promotores de ação anestésica, bactericida, antifúngica e biopesticida, sem exigir o encapsulamento de princípios ativos sintéticos. Fundamentos da invenção [002] Sistemas nanoestruturados, enquanto adjuvantes na entrega de compostos ativos, vêm emergindo como uma estratégia interessante no desenvolvimento de novos medicamentos, composições cosméticas ou nutracêuticas. Exemplos não-exaustivos incluem lipossomos, Quantum dots, dendrímeros, matrizes poliméricas, nanoestruturas de carbono e matrizes lipídicas. [003] Dentro deste contexto, as matrizes lipídicas se destacam em termos de P&D devido à Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 11/61 2 / 33 compatibilidade destas com uma ampla gama de compostos, possibilidade de modulação de entrega de um dado composto, direcionamento do ativo, além de integrar diferentes funcionalidades. [004] Dentre as matrizes lipídicas, destacam-se os sistemas de nanopartículas lipídicas sólidas (Solid Lipid Nanoparticles ou SLNs) e carreadores lipídicos nanoestruturados (nanostructured lipid carriers ou NLCs). [005] Sistemas de nanopartículas lipídicas sólidas consistem em lipídeos sólidos estabilizados por emulsionantes apresentando um diâmetro médio inferior a 1000 nm. Algumas de suas principais vantagens residem na escalabilidade industrial e biodegradabilidade, características desejáveis para o desenvolvimento de fármacos, tal como a proposta descrita na patente CN102106821, por exemplo. [006] Por outro lado, SLNs apresentam diversas restrições em relação à taxa de encapsulação de fármaco ou princípios ativos e a possibilidade de expulsão do princípio ativo no processo de cristalização durante as condições de armazenamento – as alterações polimórficas nas estruturas lipídicas sólidas tendem a remover os compostos previamente encapsulados nos SLNs. [007] Os sistemas carreadores lipídicos nanoestruturados (nanostructured lipid carriers ou NLCs), compreendem um núcleo oleoso formado por lipídeos em fase líquida e em fase sólida em temperatura ambiente, estabilizados por tensoativos. Os lipídios utilizados Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 12/61 3 / 33 comumente como base para preparação dos NLC incluem triglicerídeos, glicerídeos parciais, ácidos graxos, esteroides e ceras. De modo geral, NLCs têm maior capacidade de encapsulação de drogas devido à estrutura cristalina imperfeita, e, por consequência, melhorando a estabilidade do encapsulado solubilizado na matriz. [008] Outras características compreendem a possibilidade de gerar sistemas de liberação prolongada, além de apresentar um menor perfil de toxicidade quando comparado a sistemas poliméricos (ver, por exemplo, CA2840215, WO2011116963 e WO2012038061), devido à ausência de solventes orgânicos. [009] Por outro lado, o desenvolvimento de formulações à base de NLCs exigem uma caracterização rigorosa de alguns parâmetros, como tamanho de partícula, distribuição de tamanho, polimorfismo e encapsulação de fármaco, todos críticos em relação a estabilidade da formulação final. A complexidade dos ensaios realizados para tal fim constitui um desafio para o lançamento de novos medicamentos ou produtos no mercado que empreguem tais sistemas. [0010] Neste contexto, observa-se um interesse crescente por fármacos que empreguem técnicas que permitam o encapsulamento de óleos essenciais. Estes consistem em metábolitos vegetais formados majoritariamente por compostos mono e sesquiterpênicos e usualmente obtidos por destilação a vapor. Diversos estudos correlacionam tais substâncias a propriedades antimicrobianas, anti- Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 13/61 4 / 33 inflamatórias, antioxidantes, anti-neoplásicas, bem como propriedades antivirais, antifúngicas e antiparasitárias. A natureza hidrofóbica de tais compostos os torna extremamente compatíveis para a encapsulação em NLCs, e, consequentemente, excelentes candidatos para o desenvolvimento de novas possibilidades terapêuticas, considerando também seu baixo preço e grande diversidade. Descrição do Estado da técnica [0011] Neste intuito, algumas linhas de pesquisa vêm direcionando esforços para a obtenção de encapsulamento de óleos essenciais como óleo de cravo (Marques, E. Nanoencapsulação de óleo essencial de cravo em matrizes lipídicas. Tese de conclusão de Curso. Universidade Federal de Santa Catarina, Engenharia de Alimentos, 2017), canela (Wen et al. Nanostructured lipid carriers: a promising topical system for delivering cinnamon oil in wound care treatment Fifth Euro-Mediterranean conference of Natural Products, Limassol, Cyprus, 2018), óleo de amêndoas (De Paula, B.O. et al. Desenvolvimento e caracterização de filmes lipídico-biopoliméricos funcionais para liberação transdérmica de lidocaína. XXIV CONGRESSO DE INICIAÇÃO CIENTíFICA DA UNICAMP, 2016). [0012] Algumas metodologias comuns no Estado da Técnica compreendem o emprego de homogeneização sob pressão a quente, tal como a descrita em WO2017185147 ou por Sena (SENA, L. Obtenção e Caracterização de Carreadores Lipídicos Nanoestruturados a partir de gordura vegetal de Murumuru, Dissertação Mestrado. Universidade Federal do Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 14/61 5 / 33 Pará, Instituto de Ciências da Saúde Belém, 2016). [0013] A partir dos documentos citados no Estado da Técnica, é possível observar que nenhum destes permite a obtenção de formulações nanoencapsuladas composta por excipientes estritamente naturais e com atividade terapêutica intrínseca, tampouco composições que mantenham a estrutura do encapsulado devidamente estabilizada. Tal fato constitui uma severa restrição na viabilização de formulações farmacêuticas naturais que explorem efeitos potencialmente sinérgicos entre óleos essenciais. Breve descrição da invenção [0014] Neste sentido, visando contornar as desvantagens relatadas no Estado da Técnica, o presente pedido de patente revela formulações biofuncionais estáveis baseadas em carreadores lipídicos nanoestruturados naturais (NLC) e dotados de ação terapêutica intrínseca e composição estritamente natural. [0015] As presentes composições são compostas de diferentes matrizes lipídicas estruturais e bioativas, especificamente cera de abelha, palma, manteiga de karité e/ou cacau estabilizadas por biossurfactantes naturais, tais como: - lauril glicosídeo, por exemplo Plantaren 1200®; - decilpoliglicosídeo, por exemplo Plantaren 2000®; - derivado de óleo de coco, tais como: Dietanolamida do Ácido Graxo de coco com 90% mínimo de concentração (por exemplo, Amida 90®); monoetanolamina cocamida (por exemplo, Cocamide®); Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 15/61 6 / 33 - emulsionante olivato de sorbitano, derivado de oliva (por exemplo, Oliva Mil®). [0016] Mais especificamente, a referida composição compreende de 5 a 20% (m/v) de carreadores lipídicos nanoestruturados estritamente naturais selecionados do grupo que compreende cera de abelha; manteigas de karité; cacau e palma; ou combinação das mesmas; de 1 a 3% (m/v) de óleos essenciais e de 1 a 10 % (m/v) de biossurfactantes. [0017] A cera de abelha está presente em uma quantidade de 5 a 9% (m/v), as manteigas de karité em uma quantidade de 10 a 20% (m/v, o cacau estar em uma quantidade de 10 a 20% (m/v), o óleo de palma estar em uma quantidade de 10 a 20% (m/v) e os óleos essenciais serem selecionados do grupo compreendendo cravo; canela; cravo- canela; pimenta preta; hortelã ou combinações das mesmas. [0018] Os biossurfactantes são naturais e selecionados do grupo compreendido por lauril glicosídeo; decilpoliglicosídeo; derivado de óleo de coco; emulsionantes derivados de oliva ou combinações das mesmas. Onde o lauril glicosídeo está presente em uma quantidade de 1 a 10% (m/v), o decilpoliglicosídeo está presente em quantidade de 1 a 10% (m/v), o óleo de coco compreende Dietanolamida do Ácido Graxo de coco (por exemplo, Amida 90®) com 90% mínimo de concentração em uma quantidade de 1 a 5% (m/v), monoetanolamina cocamida está presente em uma quantidade de 1 a 8% (m/v) e o emulsionante derivado de oliva, Olivato de sorbitano, estar presente em uma quantidade de 3% a 10% (m/v). Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 16/61 7 / 33 [0019] Adicionalmente, é objeto da presente invenção uma composição de carreadores lipídicos nanoestruturado compreendendo 10% m/v de manteiga de palma, 3% m/v de óleo essencial de cravo e 2% m/v de lauril glicosídeo na amostra (F1). [0020] Outro objeto adicional refere-se a uma composição de carreadores lipídicos nanoestruturado compreendendo 10% m/v de manteiga de palma, 3% m/v de óleo essencial de canela e 2% m/v de lauril glicosídeo na amostra (F2). [0021] Outro objeto adicional refere-se a uma composição de carreadores lipídicos nanoestruturado compreendendo 10% m/v de manteiga de palma, 1,5% m/v de óleo essencial de canela, 1,5% m/v de óleo essencial de cravo, 2% m/v de lauril glicosídeo na amostra (F3). [0022] Outro objeto de invenção ora proposta refere-se ao uso das composições, conforme definidas acima, por serem empregadas na preparação de formulações medicamentosas; formulações químicas e formulações biopesticidas. Sendo que para formulação medicamentosa ter uso para tratar dor; inflamação; infecções bacterianas; infecções fúngicas. Para formulação biopesticida ter uso para controlar lagartas, carunchos e ácaros. [0023] Notou-se surpreendentemente que as formulações ora pleiteadas apresentaram notável estabilidade em período de 1 ano (25°C), fato este comprovado por meio de ensaios de tamanho e distribuição de partículas, potencial Zeta e concentração de Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 17/61 8 / 33 nanopartículas. Breve Descrição das Figuras [0024] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, como se segue. [0025] A Figura 1 ilustra o perfil cromatográfico de eugenol, empregando a técnica de UHPSFC. [0026] A Figura 2 ilustra o perfil cromatográfico do óleo de cravo empregando a técnica de UHPSFC. [0027] A Figura 3 ilustra o perfil cromatográfico de canela empregando a técnica de UHPSFC. [0028] A Figura 4 ilustra o perfil cromatográfico da formulação F1 empregando a técnica de UHPSFC. [0029] A Figura 5 ilustra o perfil cromatográfico da formulação F2 empregando a técnica de UHPSFC. [0030] A Figura 6 ilustra o perfil cromatográfico da formulação F3 empregando a técnica de UHPSFC. [0031] A Figura 7 ilustra o perfil cromatográfico de eugenol empregando a técnica de UHPLC. [0032] A Figura 8 ilustra o perfil cromatográfico de óleo de cravo empregando a técnica de UHPLC. [0033] A Figura 9 ilustra o perfil cromatográfico de óleo de canela empregando a técnica de UHPLC. [0034] A Figura 10 ilustra o perfil cromatográfico da formulação F1 empregando a técnica de UHPLC. [0035] A Figura 11 ilustra o perfil cromatográfico da formulação F2 empregando a técnica de UHPLC. [0036] A Figura 12 ilustra o perfil cromatográfico Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 18/61 9 / 33 da formulação F3 empregando a técnica de UHPLC. [0037] A Figura 13 ilustra a caracterização estrutural das formulações mediante a técnica de DSC. [0038] A Figura 14 ilustra a caracterização estrutural das formulações mediante a técnica de FTIR-ATR. [0039] A Figura 15 ilustra imagens de microscopia eletrônica de transmissão das diferentes formulações de NLC (F1, F2 e F3) em um aumento de 100.000x (acima) e 60.000x (abaixo). [0040] A Figura 16 ilustra o efeito analgésico máximo possível em camundongos submetidos ao teste de Tail Flick após a administração de 100 µL das formulações F1, F2, F3 e do controle de solução salina de lidocaína 0,5%, n=5. [0041] As Figuras 17 e 18 ilustram os esquemas utilizados nos ensaios in vitro para determinação da atividade antifúngica. [0042] A Figura 19 ilustra a avaliação do crescimento fúngico após 24 e 48 h de cultivo estático, suplementado com extratos complexos. [0043] A Figura 20 ilustra a avaliação do crescimento fúngico após 24 e 48 h de cultivo estático, suplementado com os insumos puros. [0044] A Figura 21 ilustra a mortalidade de carunchos de feijão após a exposição de diferentes concentrações das formulações F1, F2 e F3. [0045] A Figura 22 exibe a porcentagem de mortalidade de ácaro rajado Tetranychus urticae com Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 19/61 10 / 33 formulações nanoestruturadas F1, F2 e F3, nas concentrações de 0,003, 0,03, 0,3 e 3,0% e do controle positivo (Propargite) e controle negativo (água desionizada) aos 4 dias após a transferência (4 DAA). [0046] A Figura 23 exibe a porcentagem de repelência de ácaro rajado Tetranychus urticae com formulações nanoestruturadas F1, F2 e F3, nas concentrações de 0,003, 0,03, 0,3 e 3,0% e do controle positivo (Propargite) e controle negativo (água desionizada) aos 4 dias após a transferência (4 DAA). Descrição detalhada da invenção [0047] A presente invenção se refere a formulações compreendendo carreadores lipídicos nanoestruturados. [0048] Mais particularmente, ditas formulações abrangem diferentes lipídios naturais, tais como cera de abelha de 5 a 9% (m/v), preferivelmente 5%; manteigas de karité, cacau e palma de 10 a 20% (m/v), preferivelmente 10%, e óleos essenciais de cravo, canela, cravo-canela, pimenta preta e hortelã de 1 a 3% (m/v), preferivelmente 3%. [0049] Já os biossurfactantes, podem ser escolhidos dentre o grupo compreendendo lauril glicosídeo (Plantaren 1200®) de 1 a 10% (m/v), preferivelmente 2%; decilpoliglicosídeo (Plantaren 2000®) de 1 a 10% (m/v), preferivelmente 2%, Dietanolamida do Ácido Graxo de coco (Amida 90®) de 1 a 5% (m/v), preferivelmente 1%; Monoetanolamina do Ácido Graxo de coco (Cocamide®), de 1 a 8% (m/v), preferivelmente 1% Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 20/61 11 / 33 e Olivato de Sorbitano da oliva (Oliva Mil®) de 3 a 10% (m/v), preferivelmente 3%. [0050] A combinação de excipientes preferenciais para a presente invenção é selecionada do grupo que compreende: i) manteiga de palma (10% m/v) + óleo essencial de cravo (3% m/v) e lauril glicosídeo (Plantaren 1200®) (2% m/v) - (F1); ii) manteiga de palma (10% m/v) + óleo essencial de canela (3% m/v) e lauril glicosídeo (Plantaren 1200®) (2% m/v) - (F2); iii) manteiga de palma (10%) + óleo essencial de cravo (1,5%) + óleo essencial de canela (1,5% m/v) e lauril glicosídeo (Plantaren 1200®) (2% m/v) - F3. Preparação dos carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC) [0051] O preparo das diferentes formulações pode ser realizado pelo método da emulsificação-ultrasonicação ou homogeneização sob alta pressão. Em uma concretização preferencial, emprega-se a técnica de emulsificação- ultrasonicação nas condições a seguir. [0052] Separam-se os componentes lipídicos e ambas as fases lipídicas são aquecidas em banho-maria, 10ºC acima da temperatura de fusão do lipídio sólido (manteiga de palma, TF 40°C). Simultaneamente, a fase aquosa foi composta pela solução do biossurfactante Plantaren 1200®, aquecida na mesma temperatura da fase lipídica. Para a formação da pré-emulsão, a fase aquosa foi gotejada à fase Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 21/61 12 / 33 lipídica, sob agitação de 10000 rpm, por 2 min, em agitador Ultra-Turrax (Ultra-turrax® T18). A pré-emulsão formada foi imediatamente submetida à sonicação por 15 minutos. Ao término desta etapa, a nanoemulsão gerada foi arrefecida em banho de gelo, até alcançar 25°C, a fim de solidificar as nanopartículas formadas. As formulações preparadas apresentaram coloração amarelo pálida, de aspecto líquido e homogêneo. Ensaios de medidas de tamanho, dispersão das partículas, potencial Zeta e concentração de nanopartículas [0053] As medidas de tamanho de partícula, PDI e potencial Zeta foram realizadas pela diluição das formulações (1:1000 v/v) em água desionizada. O equipamento de espalhamento dinâmico de luz usado foi o ZetaSizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments, Malvern, Worcester-shire, UK). [0054] Os experimentos de rastreamento de nanopartículas (NTA) foram realizados no equipamento NanoSight NS300 (NanoSight - Malvern®, Reino Unido), que utiliza um vídeo-microscópio para analisar as propriedades de espalhamento de luz e o movimento browniano de partículas em suspensão, afim de obter medidas de tamanho, concentração e agregação das mesmas, em amostras em suspensão líquida. [0055] As medidas foram realizadas após diluição das amostras em água desionizada (1:50000 v/v) e injeção no interior do porta-amostra por meio de uma seringa esterilizada, até seu total preenchimento (~ 0,5 mL). A análise foi realizada com um feixe de laser verde (λ=532 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 22/61 13 / 33 nm), a 25°C, em triplicata. [0056] Os resultados obtidos estão sumarizados de acordo com a Tabela 1 a seguir: Tabela 1. Caracterização estrutural das formulações de NLC naturais (F1, F2 e F3) no dia do preparo e após 1 ano. [0057] Os ensaios a seguir demonstram que os valores de tamanho de partícula, PDI, potencial Zeta e concentração de nanopartículas mantiveram-se estáveis após 1 ano de acompanhamento em temperatura ambiente, exibindo excelentes propriedades estruturais. Obtenção do perfil cromatográfico dos óleos essenciais por Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC) e Cromatografia com Fluido Supercrítico de Ultra Alta Eficiência (UHPSFC) [0058] Considerando as Figuras 1 a 12, a extração dos princípios ativos dos óleos essenciais de cravo e canela foi realizada com metanol. O eugenol foi utilizado como padrão por ser o composto majoritário presente em ambos os óleos essenciais de cravo e canela (folha), de acordo com o laudo do fabricante. [0059] O perfil cromatográfico do eugenol (Figura 1), óleos essenciais de cravo (Figura 2) e canela (Figura 3) e das formulações F1 a F3 (Figuras 4 a 6, respectivamente) foram obtidos a partir das seguintes condições cromatográficas para a técnica de UHPSFC: coluna Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 23/61 14 / 33 cromatográfica Acquity HSS C18 1,7 µm 2,1 x 50 mm, vazão da fase móvel: 1,50 mL min -1, temperatura do forno: 40°C, pressão de retorno: 1500 psi, volume de injeção: 0,5 µL, solvente de injeção: metanol, modo de eluição: 0,00–1,50 min: 100% CO2, 1,50–2,50 min: gradiente 5%/min de metanol, 2,50 – 4,00 min: 95% CO2: 5% metanol e detecção (PDA): 281,6 nm. [0060] Para a técnica UHPLC as condições cromatográficas adotadas foram: coluna cromatográfica Acquity BEH C18 1,7 µm 2,1 x 50 mm, vazão da fase móvel: 0,3 mL min-1, temperatura do forno: 30°C, temperatura amostrador: 30°C, volume de injeção: 2,0 µL, solvente de injeção: MeOH, Fase Móvel do solvente A 10 mM ácido fórmico em água e do solvente B 10 mM ácido fórmico em Acetonitrila, modo de eluição: 0,00–1,00 min: 5% de solvente B, 1,00– 7,00 min: gradiente 15%/min de solvente B, 7,00–8,00 min: 95% de solvente B e 8,00–10,00 min: 5% de solvente B e detecção (PDA): 281,6 nm. [0061] O perfil cromatográfico obtido a partir de ensaios com UHPLC do eugenol, óleos essenciais de cravo, canela e formulações F1 a F3 estão representados nas Figuras 7, 8, 9, 10, 11 e 12 respectivamente. [0062] Tais resultados confirmam que o princípio ativo (eugenol) presente nos óleos essenciais foi mantido após sua encapsulação pelas nanopartículas lipídicas. Isso demonstra que o método empregado, apesar de utilizar calor em seu procedimento, não foi responsável pela evaporação ou degradação do ativo na fórmula. Tais perfis cromatográficos Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 24/61 15 / 33 obtidos mediante distintas técnicas estão aptos a caracterizar analiticamente os novos compostos desenvolvidos. Caracterização estrutural das formulações de NLC preparadas (FTIR-ATR, DSC e TEM) [0063] Os espectros de absorção na região do infravermelho (FTIR-ATR) foram obtidos mediante a técnica de transformada de Fourier. Os espectros foram registrados na região compreendida entre 4000 e 500 cm-1. Esta técnica foi utilizada por permitir o estudo das possíveis interações entre os excipientes utilizados, proporcionando valiosas informações acerca da nova estrutura preparada. [0064] As amostras foram analisadas por um Calorímetro Diferencial de Varredura (DSC), em um porta- amostra padrão de alumínio selado. As análises foram feitas em atmosfera de nitrogênio, a um fluxo de 50 mL.min-1, na faixa de temperatura de + 0 a + 100 °C. As curvas de análise térmica são úteis para comprovar mudanças termodinâmicas das formulações em relação aos excipientes empregados. [0065] As amostras foram visualizadas em microscópio eletrônico de transmissão Zeiss – LEO 906, pertencente ao Laboratório de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biologia/Unicamp. Para o preparo da amostra, uma gota da formulação será adicionada a uma grade de carbono. Após 10 s, o excesso da amostra foi retirado com papel de filtro e, em seguida, uma gota de solução aquosa de uranila a 2% (p/p) foi adicionada sobre a mesma, no Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 25/61 16 / 33 intuito de melhorar o contraste das imagens. Após cerca de 8 s, o líquido em excesso foi novamente retirado com papel de filtro e, na sequência, uma gota de água Milli-Q foi adicionada à grade, seguindo-se o mesmo procedimento para a retirada do excesso, após 5 s. Em seguida, a grade permaneceu em repouso, em temperatura ambiente, até a secagem das amostras. [0066] Conforme observado na Figura 13 e Figura 14, as técnicas estruturais de caracterização confirmaram que as formulações desenvolvidas têm perfil compatível com sistemas de carreador lipídico nanoestruturado, mesmo sendo compostas somente por excipientes naturais, sem a indicação de decomposição ou degradação de qualquer um dos excipientes nas condições analisadas. Além disso, a Figura 15 referente à microscopia eletrônica de transmissão, ilustra a morfologia das diferentes formulações de NLC (F1, F2 e F3) em um aumento de 100.000x (acima) e 60.000x (abaixo), que confirmou o formato esférico de contornos bem delimitados, de dimensões semelhantes às quantificadas por DLS, de acordo com o esperado para este tipo de formulação. Assim, os lipídios estruturais escolhidos como matriz para a nanopartícula, os biossurfactantes empregados em sua estabilização e os óleos essenciais encapsulados como moléculas-ativas mostraram-se compatíveis entre si, sendo excelentes excipientes destas novas formulações com diversas atividades terapêuticas. [0067] A seguir, serão descritos as metodologias e testes relacionados à capacidade antimicrobiana, Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 26/61 17 / 33 analgésica, antifúngica e biopesticida das composições ora pleiteadas. Teste de suscetibilidade antimicrobiana [0068] As formulações foram avaliadas quanto à atividade antimicrobiana dos compostos, determinada pelo método de difusão em ágar, utilizando-se diferentes cepas bacterianas Gram-positivas (BEC 9393- Staphylococcus aureus, RIB1- Stapylococcus aureus MRSA, S. EP.- Staphylococcus epidermidis, e SAATCC- Staphylococcus aureus ATTC 25922) e Gram-negativas (31 NM- Pseudomonas aeuroginosa cepa clínica e KP 230- Klebsiella pneumoniae ATCC 25619). [0069] As placas contendo ágar Mueller Hinton preparadas antecipadamente foram retiradas da geladeira e armazenadas até atingir a temperatura ambiente. Foram feitos poços de 12 mm de diâmetro. Com um swab estéril, o inóculo bacteriano com turvação 0,5 da escala de MacFarland foi distribuído uniformemente sobre a superfície do ágar, deixados em repouso em temperatura ambiente, por aproximadamente 5 minutos. As placas foram incubadas em estufa a 35 ± 1ºC por 24 horas. O halo de inibição do crescimento foi medido por meio de régua milimetrada. Os testes foram realizados em duplicata e em dias diferentes. O álcool etílico hidratado 96º foi empregado como controle negativo e a solução do antibiótico ciprofloxacino (CPR) foi utilizado como controle positivo. [0070] De acordo com a Tabela 2, fica evidente a atividade bactericida de cada formulação (F1, F2 e F3) em Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 27/61 18 / 33 relação aos distintos tipos de cepas bacterianas testadas, em comparação com o controle positivo do antibiótico. As formulações compostas por lipídios naturais apresentaram um efeito antimicrobiano semelhante ou maior que o antibiótico empregado como controle positivo, como é o caso da cepa bacteriana BEC. E ainda, as formulações foram eficazes contra a cepa KP230 (Gram -), onde o antibiótico CPR não teve efeito terapêutico sobre a mesma. Cabe ressaltar, que formulações de NLC com maiores concentrações de óleos essenciais poderão ser preparadas com sucesso e seu efeito bactericida poderá ser igualmente avaliado. Tabela 2. Susceptibilidade bacteriana de diferentes cepas tratadas com as formulações naturais F1, F2 e F3, e com o controle positivo do antibiótico ciprofloxacino (CPR). Estudo in vivo da eficiência anestésica por Tail-flick [0071] A avaliação da atividade analgésica (bloqueio sensorial) das formulações de NLC natural F1, F2 e F3 foi realizada em camundongos Swiss machos (30-35 g). Os animais foram alojados nas seguintes condições: 25°C ± 2°C, 30% -70% de umidade e 12/12 h de ciclo claro/escuro, com comida e água disponíveis ad libitum e separados em grupos de 5 animais. [0072] Primeiramente, os animais foram anestesiados Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 28/61 19 / 33 com volume máximo de 100 µL da formulação ou de solução de cloridrato de lidocaína 0,5% como controle. As amostras foram aplicadas por via intradérmica na base da cauda do animal. As medidas foram realizadas no equipamento de tail- flick (Onda Científica Ltda). A base da cauda foi colocada sob estímulo térmico (~55ºC) por um tempo de latência de 10 segundos (cutoff), até a reação de movimentação da cauda. O animal foi submetido a esse procedimento em tempos de 30 min e 1 hora, e a partir disso, a cada hora até que o tempo de latência atinja o valor da linha basal. Todos os experimentos foram realizados pelo mesmo observador. [0073] A Figura 14 ilustra os resultados obtidos e expressos em percentagem de efeito máximo possível (%EMP) e os resultados tratados com o software GraphPad Prism® 6.0. Todas as análises foram realizadas no Instituto de Biologia da Unicamp, de acordo com as normas do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na área de Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB-Unicamp) aprovado pelo comitê de ética (4833-1/2018). [0074] Tais resultados demonstraram que o efeito das formulações testadas (F1, F2 e F3) não apresentaram diferença estatística (AUC) em relação ao fármaco controle – lidocaína 0,5% em salina – após administração via intra- dérmica na base da cauda de camundongos. As formulações testadas também se comportaram de maneira similar ao controle mesmo em relação ao tempo de recuperação do bloqueio sensorial, reforçando assim a similaridade de ação dessas formulações de NLC naturais com o fármaco de ação Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 29/61 20 / 33 anestésica reconhecida (lidocaína). Tabela 3. Dados de área sobre a curva (AUC) e tempo de recuperação dos camundongos submetidos ao teste de Tail Flick em relação a cada grupo testado. Avaliação in vitro da atividade fungicida [0075] A atividade antifúngica dos extratos foi avaliada frente aos seguintes microrganismos: Aspergillus fumigatus, Cândida albicans e Trichophyton rubrum. Os fungos foram mantidos e repicados em meio potato dextrose agar (PDA; Sigma-Aldrich). Após o repique em meio sólido, as culturas foram incubadas em estufa a 35 °C, por 24 h, 96 h e até esporulação, respectivamente em C. albicans, T. rubrum e A. fumigatus. Devido a não produção de esporos, os ensaios de T. rubrum foram padronizados discos 4 mm de diâmetro nos inóculos em meio sólido. [0076] Para os testes de atividade antifúngica, foram utilizadas 3 diferentes formulações classificadas como E1 (F1), E2 (F2) e E3 (F3). Essas três formulações, são extratos solúveis em água e foram utilizados diretamente no ensaio, e também foram analisadas com seus insumos separadamente que foram classificados de I1 a I5. [0077] A avaliação da atividade antifúngica dos insumos puros foi desenvolvida de acordo com os parâmetros determinados pelo CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) em microplaca estéril de 96 poços. Dessa forma Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 30/61 21 / 33 utilizou-se o meio de cultivo sintético RPMI-1640 tamponado em pH 7,0 com 0,165 mol/L de MOPS (ácido 3-[N-morfolino] propanosulfônico) a fim de não antagonizar com os agentes antifúngicos. [0078] Os extratos foram analisados em 12 concentrações diferentes, diluídas em série de 1:1 em solução salina (NaCl 0,85%), iniciando 0,3% de E1 a E3 de acordo com a Figura 17. Os insumos foram analisados em duplicata em 6 concentrações diferentes, diluídas em série de 1:1 em solução salina (NaCl 0,85%), iniciando em 1% do insumo I1; 0,5% do insumo I2; e 0,3% dos insumos I3 a I5 de acordo com a Figura 18. [0079] Os microrganismos foram contados utilizando câmara de Neubauer e inoculados na concentração final de 103 e 104 unidades por/ml de C. albicans e A. fumigatus, respectivamente. Todas as placas de microdiluição foram incubadas a 35°C sem agitação. [0080] Na última linha da segunda placa foram adicionados 3 diferentes controles em duplicatas. O controle negativo, somente com o meio RPMI-1640; controle positivo, contendo o meio RPMI e o inóculo; e o controle positivo contendo 1% de DMSO. [0081] Na penúltima linha da placa foram adicionadas 4 réplicas de controles positivos, contendo o meio RPMI e o inóculo. Todas as análises foram realizadas em duplicata (1-6 e 7-12). [0082] No teste convencional de microdiluição, o crescimento em cada poço recebeu um escore numérico, da Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 31/61 22 / 33 seguinte maneira: 4 = nenhuma redução do crescimento; 3 = ligeira redução do crescimento ou aproximadamente 75% do crescimento do controle (meio isento de droga); 2 = redução proeminente de crescimento ou aproximadamente 50% do crescimento do controle; 1 = ligeiro crescimento ou aproximadamente 25% do crescimento do controle; e 0 = opticamente claro ou ausência de crescimento. [0083] Nas presentes análises classificaram-se alguns poços com o valor 5, pois nessa determinada condição o microrganismo apresentou crescimento maior do que o controle positivo. A menor concentração de um agente antifúngico que inibe substancialmente o crescimento do organismo visualmente detectado é denominado CIM (concentração inibitória mínima). Assim, para a determinação do CIM avaliou-se o crescimento dos cultivos após 24 e 48 horas, conforme representado a seguir nas Figuras 19 e 20. [0084] A atividade antifúngica dos extratos em C. albicans foi verificada para os extratos E1 a E3. Em relação a atividade antifúngica em A. fumigatus, o crescimento foi completamente inibido utilizando os extratos E1 a E3. Dessa forma, os valores de CIM foram obtidos para os três extratos complexos (Tabela 3). Por convenção os valores de análise da inibição variam de 0 a 4, no entanto classificamos algumas condições com o escore numérico de 5. [0085] Esses valores foram observados no cultivo de C. albicans no extrato E2. Esse aumento no crescimento se Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 32/61 23 / 33 deve a uma possível suplementação do meio de cultivo favorecendo o crescimento do microrganismo, uma vez que os extratos são complexos e podem conferir uma vantagem nutricional nessas determinadas condições. Tabela 3. Resumo das atividades antifúngicas após 48 h. [0086] A atividade antifúngica em C. albicans foi verificada apenas para os insumos I2, em todas as concentrações avaliadas. Enquanto que I4, I5 e I3 apresentaram, respectivamente, uma inibição de aproximadamente 75%, 50% e 25% do crescimento. Em relação a atividade antifúngica em A. fumigatus, foi verificada a inibição de crescimento apenas para os insumos I2, em todas as concentrações testadas, e I4 na concentração de 0,30%. [0087] A inibição do crescimento em 75% e 50%, respectivamente, foi observada em I5 e I3. Em ambos os fungos o insumo I1 não promoveu nenhuma alteração no crescimento dentre as concentrações testadas. Dessa forma, os valores de CIM foi determinado somente em I4 na concentração de 0,30% para A. fumigatus. [0088] Apesar de observar a inibição de crescimento de ambos os fungos em todas as concentrações de I2 não se Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 33/61 24 / 33 atingiu uma diluição que permitisse o crescimento fúngico. Dessa forma podem-se dizer que o CIM do I2 é menor do que a menor concentração testada. [0089] A Tabela 4 sumariza as atividades antifúngicas após 48 horas: Tabela 4. Resumo das atividades antifúngicas após 48 h. [0090] Posteriormente aos cultivos de 48 h, 100 µl do volume dos poços que apresentaram CIM definido foram inoculados em PDA a 35 °C a fim de verificar se o extrato tem atividade fungicida ou fungistática. De acordo com os dados obtidos, pode-se inferir que os insumos I2 e I4 tem atividade fungistática, visto que foi detectado o Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 34/61 25 / 33 crescimento de A. fumigatus e C. albicans após o inóculo em meio sólido. [0091] Para os testes de atividade antifúngica em meio sólido em placa de Petri utilizou-se 10 ml de meio PDA suplementado com 0,30% de extrato complexo. Nesse teste os ensaios foram realizados em duplicata de cada extrato complexo adicionado de uma duplicata controle contendo somente PDA. [0092] A avaliação do crescimento foi realizada diariamente por um período de 10 dias a partir do inóculo para os fungos A. fumigatus, C. albicans e T. rubrum. [0093] A partir do primeiro dia já foi possível observar o crescimento de todos os fungos no cultivo controle. Após os 10 dias de acompanhamento não foi possível observar o crescimento de nenhum fungo em todos os extratos complexos. Dessa forma, infere-se que existe uma sinergia entre os insumos que permite a inibição do crescimento em períodos maiores em comparação aos insumos puros. [0094] Dentre os extratos analisados foi possível determinar a CIM dos extratos E1, E2 e E3 tanto em C. albicans quanto em A. fumigatus. Quanto aos insumos analisados foi observado a inibição de crescimento em I2 e I5, no entanto só possível determinar a CIM exata de I5 para A. fumigatus. Apesar de não inibir completamente o crescimento do A. fumigatus os insumos I3 e I5 inibiram em pelo menos 50% o crescimento esperado. [0095] Dessa forma, de acordo com a viabilidade, Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 35/61 26 / 33 pode-se atingir a inibição do crescimento em concentrações maiores às testas nesse ensaio. Quanto a inibição do crescimento de C. albicans, pode-se inferir que I3, I4 e I5 apresentam potencial inibição de crescimento, porém em concentrações maiores do que as testadas nesse ensaio. Além disso, foi observado que o insumo I2 tem atividade fungistática em A. fumigatus e C. albicans; e I4 tem atividade fungistática em A. fumigatus. Apesar dos resultados obtidos com os insumos purificados, o ensaio em meio sólido mostrou que os extratos complexos têm maior eficiência e são capazes de inibir o crescimento de A. fumigatus, C. albicans e T. rubrum em períodos de até 10 dias. Avaliação da atividade lagarticida das formulações [0096] Para cada espécie foram utilizadas 50 lagartas em cada tratamento, distribuídas em 10 potes plásticos (7,0 x 3 cm). Em cada recipiente foi colocado 19,2 cm3 de dieta artificial, sobre a qual foi aplicado 200 microlitros da suspensão contendo os tratamentos. Após a secagem do excesso de agua foram transferidas lagartas de segundo instar de cada espécie. A mortalidade foi anotada sete dias após os tratamentos. Na testemunha foi aplicada agua destilada. A lagarta foi considerada morta quando não apresentada movimentos quando tocada com pincel de cerdas finas. [0097] A maior mortalidade obtida foi para o tratamento F2 para S. frugiperda (56%) e em seguida com o Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 36/61 27 / 33 tratamento F3 (42%) para C. includens. Para os demais tratamentos a mortalidade foi inferior, com redução ou estabilidade da mortalidade em função da redução da concentração testada. Na testemunha a mortalidade foi zero para todos os tratamentos. A diferença de suscetibilidade entre as espécies era esperada, uma vez que ambas apresentam a mesma variação de resposta a inseticidas convencionais e bioinseticidas. [0098] Os ensaios a seguir ilustram a mortalidade de diferentes espécies frente as formulações F1-F3 sob diferentes diluições. a) Mortalidade de Chrysodeixis includens (Lepidoptera: Noctuidae) frente ao tratamento F3 1 Diluição (0,3%) POTES 1 a 10 Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 2 2 3 1 2 0 1 2 5 3 21 (42%) 2 Diluição (0,03%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 1 2 1 3 2 0 1 0 1 2 13 (26%) 3 Diluição (0,003%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 1 1 3 2 1 0 1 1 3 2 15 (30%) b) Mortalidade de Chrysodeixis includens (Lepidoptera: Noctuidae) com Tratamento F2. 1 Diluição (0,3%) Dia de 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 37/61 28 / 33 avaliação Número mortos 0 1 1 0 2 2 0 1 0 3 10 (20%) 2 Diluição (0,03%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 4 0 2 1 0 2 2 0 0 0 11 (22%) 3 Diluição (0,003%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 0 0 2 0 2 3 1 1 1 1 11 (22%) c)Mortalidade de Chrysodeixis includens (Lepidoptera: Noctuidae): Tratamento F1 1 Diluição (0,3%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 2 1 3 1 3 2 0 2 1 2 17 (34%) 2 Diluição (0,03%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 2 1 0 1 2 0 0 0 3 2 11 (22%) 3 Diluição (0,003%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 1 0 2 0 0 0 0 2 1 0 6 (12%) d) Mortalidade de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae): Tratamento F3 POTES 1 a 10 1 Diluição (0,3%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 2 (4%) Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 38/61 29 / 33 2 Diluição (0,03%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 0 1 0 1 1 0 0 2 0 1 6 (12%) 3 Diluição (0,003%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 0 0 3 1 0 0 0 2 0 0 5 (10%) e) Mortalidade de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae): Tratamento F2 1 Diluição (0,3%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 4 4 4 3 3 2 1 1 3 3 28 (56%) 2 Diluição (0,03%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 2 2 0 1 1 1 3 1 2 1 14 (28%) 3 Diluição (0,003%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 0 0 3 1 0 2 1 1 1 0 9 (18%) f) Mortalidade de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae): Tratamento F1 1 Diluição (0,3%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 3 1 2 3 0 2 1 2 2 5 20 (40%) 2 Diluição (0,03%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 5 2 3 0 2 1 0 0 1 1 15 (30%) Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 39/61 30 / 33 3 Diluição (0,003%) Dia de avaliação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TOTAL Número mortos 0 1 5 1 0 0 0 0 0 0 7 (14%) Avaliação da mortalidade de carunchos de feijão [0099] A cultura de Acanthoscelides obtectus utilizada foi obtida e estabilizada no Laboratório de Biologia do Instituto de Ciência e Tecnologia de Sorocaba, Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” – Campus Sorocaba, São Paulo, Brasil. Os insetos foram mantidos em bandejas, com aeração, em incubadora e condições de ausência de luz, temperatura de 27 ± 2 °C, com umidade máxima de 73% e mínima de 52%. [00100] O feijão carioca (Qualitá®), adquirido em supermercado comum local utilizado para manutenção da cultura e realização dos experimentos foi previamente mantido em freezer durante 14 dias e seco visando evitar possível infestação vinda do campo e reduzir qualquer efeito potencial por resíduo de inseticida. [00101] Em frascos plásticos de 145 mL com pequenos furos na tampa para aeração, foi adicionado 25 g de feijão carioca, aplicado os tratamentos de F1, F2, F3, F1C, F2C e F3C e os frascos foram agitados manualmente por 60 segundos visando garantir distribuição completa do material nos grãos de feijão. Dez A. obtectus de 1 a 5 dias de idade não sexados foram colocados em cada um deles, e os frascos foram mantidos sob condições laboratoriais controladas (ausência de luz, temperatura de 27 ± 2 °C, umidade de 52% a 73%) durante 96 horas. O experimento foi realizado nas Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 40/61 31 / 33 concentrações de 8.13, 16.25, 32.5, 65 e 130 uL do ativo/kg do feijão. [00102] A mortalidade foi avaliada após o período de exposição, em estereoscópio Coleman® XTB-2B e os besouros foram considerados mortos quando não apresentavam movimentos mesmo estimulados por toque de pincel com cerdas finas durante 30 segundos. Duas repetições foram realizadas para cada dose e para o tratamento controle e o experimento repetido por três vezes. [00103] De acordo com o demonstrado na Figura 21, pode-se evidenciar que todas as formulações foram responsáveis pela mortalidade dos carunchos em porcentagens igual ou superior a 50%, nas 5 concentrações testadas. Avaliação in vivo da Atividade acaricida [00104] Os ácaros Tetranychus urticae utilizados no experimento foram procedentes de uma criação mantida sobre plantas de feijão-de-porco Canavalia ensiformes (L.) DC cultivadas em vasos de 2 L de capacidade, contendo solo, areia e esterco bovino (1:1:1) como substrato. A criação estava mantida em câmara climatizada (temperatura 25 ± 1ºC, umidade de 70 ± 10% e fotoperíodo de 12 horas). [00105] No experimento foram utilizadas arenas confeccionadas de folhas da planta hospedeira (C. ensiformis) de 2,5 cm de diâmetro. As arenas foram colocadas em placas de Petri de 9 x 2 cm contendo espuma umedecida e as arenas foram circundadas com algodão hidrófilo. [00106] Foram avaliados 14 tratamentos estabelecidos Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 41/61 32 / 33 na Tabela 5. Cada tratamento foi repetido 8 vezes e cada repetição foi composta por uma arena. As aplicações dos produtos foram realizadas sob torre de Potter calibrada a 4 lbf.pol-2. Foram aplicados 2 mL de calda por disco, correspondendo a 1,56 mg cm-2 de resíduo seco. Após a secagem dos produtos sobre as folhas (aproximadamente 2 horas) foram transferidos com pincel de um pelo, cerca de 10 ácaros fêmeas adultas de T. urticae para cada arena, totalizando 80 ácaros por tratamento. Após as transferências as arenas foliares foram levados para câmara climatizada com temperatura de 25 ± 1ºC, umidade relativa de 70±10% e fotofase de 12 horas. As avaliações para quantificação dos ácaros mortos, vivos e retidos na barreira de algodão foram realizadas aos 1, 2, 3 e 4 dias após a transferência (DAA) dos ácaros. Forma de análise dos dados: [00107] Foi calculada a porcentagem de mortalidade de ácaros e a porcentagem de repelência de ácaros. [00108] Com base nas Figuras 22 e 23, evidenciou-se que as formulações testadas apresentaram atividade acaricida semelhante ao controle positivo, em todos os casos. Além disso, elas mostraram-se excelentes repelentes contra os ácaros, sendo superior ao controle positivo mesmo quando diluídas, em todos os casos. Tabela 5. Descrição dos tratamentos a serem utilizados no experimento. Tratamentos Produtos Concentração % de ativo 1 F1 0,003 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 42/61 33 / 33 2 F1 0,03 3 F1 0,3 4 F1 3,0 5 F2 0,003 6 F2 0,03 7 F2 0,3 8 F2 3,0 9 F3 0,003 10 F3 0,03 11 F3 0,3 12 F3 3,0 13 Propargite _ controle positivo 1 mL / L-1 14 Água desionizada_controle negativo - [00109] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas. Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 43/61 1 / 3 REIVINDICAÇÕES 1. Composição de carreadores lipídicos nanoestruturados, caracterizada por compreender: - carreadores lipídicos nanoestruturados estritamente naturais selecionados do grupo que compreende cera de abelha; manteigas de karité; cacau e palma; ou combinação das mesmas; - óleos essenciais; e - biossurfactantes. 2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender: - de 5 a 20% (m/v) de carreadores lipídicos nanoestruturados estritamente naturais selecionados do grupo que compreende cera de abelha; manteigas de karité; cacau e palma; ou combinação das mesmas; - de 1 a 3% (m/v) de óleos essenciais; e - de 1 a 10 % (m/v) de biossurfactantes. 3. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato da cera de abelha estar presente em uma quantidade de 5 a 9% (m/v). 4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato das manteigas de karité estarem em uma quantidade de 10 a 20% (m/v). 5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato do cacau estar em uma quantidade de 10 a 20% (m/v). 6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato do óleo de Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 44/61 2 / 3 palma estar em uma quantidade de 10 a 20% (m/v). 7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato dos óleos essenciais serem selecionados do grupo compreendendo cravo; canela; cravo-canela; pimenta preta; hortelã ou combinações das mesmas. 8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada pelos biossurfactantes serem naturais e selecionados do grupo compreendido por lauril glicosídeo; decilpoliglicosídeo; derivado de óleo de coco; emulsionantes derivados de oliva ou combinações das mesmas. 9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de lauril glicosídeo estar presente em uma quantidade de 1 a 10% (m/v). 10. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de decilpoliglicosídeo estar presente em quantidade de 1 a 10% (m/v). 11. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato dos derivados de óleo de coco compreender Dietanolamida do Ácido Graxo de coco com 90% (Amida 90®) mínimo de concentração em uma quantidade de 1 a 5% (m/v) e monoetanolamina cocamida estar presente em uma quantidade de 1 a 8% (m/v). 12. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato do emulsionante derivado de oliva estar presente em uma quantidade de 3% a 10% (m/v). 13. Composição de acordo com a reivindicação 12, Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 45/61 3 / 3 caracterizada por o emulsionante derivado de oliva ser Olivato de sorbitano. 14. Composição de carreadores lipídicos nanoestruturados, caracterizada por compreender 10% m/v de manteiga de palma; 3% m/v de óleo essencial de cravo; e 2% m/v de lauril glicosídeo - (F1). 15. Composição de carreadores lipídicos nanoestruturados, caracterizada por compreender 10% m/v de manteiga de palma; 3% m/v de óleo essencial de canela e 2% m/v de lauril glicosídeo - (F2). 16. Composição de carreadores lipídicos nanoestruturados, caracterizada por compreender 10% m/v de manteiga de palma; 1,5% m/v de óleo essencial de canela; 1,5% m/v de óleo essencial de cravo; 2% m/v de lauril glicosídeo - (F3). 17. Uso das composições, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada por ser empregada na preparação de formulações medicamentosas; formulações químicas e formulações biopesticidas. 18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a formulação medicamentosa ser para tratar dor; inflamação; infecções bacterianas; infecções fúngicas. 19. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a formulação biopesticida ser para controlar lagartas, carunchos e ácaros. Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 46/61 1 / 11 Figura 1 Figura 2 Figura 3 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 47/61 2 / 11 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 48/61 3 / 11 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 49/61 4 / 11 Figura 10 Figura 11 Figura 12 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 50/61 5 / 11 Figura 13 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Manteiga palma Tr an sm ita nc e (a .u .) Wavenumber (cm-1) Plantaren O. Cravo O. Canela F1 F2 F3 O. Cravo/Canela Figura 14 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 51/61 6 / 11 Figura 15 Figura 16 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 52/61 7 / 11 Figura 17 Figura 18 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 53/61 8 / 11 Figura 19 Figura 20 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 54/61 9 / 11 Figura 21 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 55/61 10 / 11 Figura 22 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 56/61 11 / 11 Figura 23 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 57/61 1 / 1 RESUMO COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS NATURAIS COM INTRÍNSECA AÇÃO ANESTÉSICA, BACTERICIDA, ANTIFÚNGICA E BIOPESTICIDA CONTRA LAGARTAS, CARUNCHOS E ÁCAROS A presente invenção se relaciona a formulações compreendendo carreadores lipídicos nanoestruturados. Especificamente, a formulação ora pleiteada compreende nanopartículas carreadoras lipídicas (NLC) naturais cuja composição estritamente natural permite o encapsulamento de óleos essenciais com notável perfil de estabilidade mantendo tamanho e uma distribuição de diâmetro médio homogêneos após 1 ano de monitoramento em temperatura ambiente. Tal característica permite a obtenção de uma pluralidade de efeitos intrínsecos, com ação anestésica, bactericida, antifúngica e biopesticida contra lagartas, carunchos e ácaros, sem exigir o encapsulamento de princípios ativos sintéticos. Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 58/61 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 59/61 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 60/61 Petição 870190045652, de 15/05/2019, pág. 61/61 Peticionamento Eletrônico Formulário Relatório Descritivo Reivindicação Desenho Resumo Comprovante de pagamento de GRU 200 Procuração 2019-05-15T16:17:24-0300 Brasil Documento Assinado - INPI