ÉVERTON ALVES TORDATO CASCATAS MULTIENZIMÁTICAS APLICADAS NA SÍNTESE ESTEREOSSELETIVA DE β-HIDROXIAMIDAS Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química Orientadora: Profª Drª Cintia Duarte de Freitas Milagre Araraquara 2018 Elaboração: FICHA CATALOGRÁFICA Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação Biblioteca do Instituto de Química, Unesp, câmpus de Araraquara T677c Tordato, Éverton Alves Cascatas multienzimáticas aplicadas na síntese estereosseletiva de beta-hidroxiamidas / Éverton Alves Tordato. – Araraquara : [s.n.], 2018 100 f. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Cintia Duarte de Freitas Milagre 1. Biocatálise. 2. Sintese assimétrica. 3. Enantiômeros. 4. Metaloenzimas. 5. Oxidorredutases. I. Título. DADOS CURRICULARES IDENTIFICAÇÃO Nome: Éverton Alves Tordato Nome em citações bibliográficas: TORDATO, É. A. FORMAÇÃO ACADÊMICA - Pós-graduação (stricto sensu), Mestrado em Química, Área de Concentração: Química Orgânica, Título: “Cascatas Multienzimáticas Aplicadas na Síntese Estereosseletiva de β-hidroxiamidas” sob orientação da Profª Drª Cintia Duarte de Freitas Milagre, no Instituto de Química de Araraquara (IQAr - UNESP), Araraquara/SP, Brasil, 2016 - 2018 - Graduação em Bacharel em Química com Atribuições Tecnológicas pelo Centro Universitário Hermínio Ometto (FHO – UNIARARAS), Araras/SP, Brasil, 2012 - 2015. FORMAÇÃO COMPLEMENTAR - Minicurso “Química Sustentável: Aplicações no meio acadêmico e na indústria”, promovido pelo Centro de Excelência para Pesquisa em Química Sustentável (CERSusChem) realizado na Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), São Carlos/SP, Brasil, 05 de outubro de 2017, 8 horas. - Minicurso “Desenvolvimento e validação de metodologias analíticas por HPLC – estratégias e discussões voltadas à indústria”, com carga horária de 16 horas, realizado no Centro Universitário Hermínio Ometto (FHO – UNIARARAS), Araras/SP, Brasil, 2015. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA Artigos submetidos para publicação - TORDATO, É. A.; MACHADO, L. H. C.; MILAGRE, C. D. F.; MILAGRE, H. M. S.; Artificial linear bi-enzymatic cascades: simultaneous and sequential modes for the synthesis of (S)-3-hydroxy-3-phenylpropanamide, Organic & Biomolecular Chemistry (submetido) Trabalhos publicados em anais de eventos científicos - TORDATO, É. A.; MACHADO, L. H.C.; MILAGRE, C. D. F.; Sequential cascade reactions toward the synthesis of (S)-3-hydroxy-3-phenylpropanamide, painel, 17th BMOS - Brazilian Meeting on Organic Synthesis, Salvador/BA, Brasil, 21 - 24 de outubro de 2018. - TORDATO, É. A.; MACHADO, L. H.C.; MILAGRE, C. D. F.; Biocatalytic cascade reactions: a sustainable process for the stereoselective synthesis of β-hydroxyamides, painel, 1st Brazilian Symposium on Sustainable Chemistry, São Pedro/SP, Brasil, 1 - 3 de outubro de 2018. - MACHADO, L. H. C.; TORDATO, E. A.; MILAGRE, C. D. F.; Síntese dos padrões usados nas reações biocatalíticas visando a síntese de β-hidroxi(amino)amidas, painel, 30º Congresso de Iniciação Científica da UNESP, Araraquara/SP, Brasil, 26 - 27 de setembro de 2018. - TORDATO, É. A.; MACHADO, L. H. C.; MILAGRE, C. D. F.; β- hydroxy(amino)amides: enzymatic catalysis via nitrile hydratases and ketoreductases, painel, 41ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química: Construindo o Amanhã, Foz do Iguaçu/PR, Brasil, 21 - 24 de maio de 2018 - TORDATO, É. A.; MILAGRE, C. D. F.; Screening of nitrile hydratases for the synthesis of 3-oxo-3-phenylpropanamide and 3-hydroxy-3-phenylpropanamide, painel, Workshop do Centro de Excelência para Pesquisa em Química Sustentável (CERSusChem), São Pedro/SP, Brasil, 06 - 07 de outubro de 2017. Apresentações de trabalho e/ou palestra - TORDATO, É. A.; MACHADO, L. H.C.; MILAGRE, C. D. F.; Biocatalytic cascade reactions: a sustainable process for the stereoselective synthesis of β-hydroxyamides, 1st Brazilian Symposium on Sustainable Chemistry, painel, São Pedro/SP, Brasil, 1 - 3 de outubro de 2018. - TORDATO, É. A.; MILAGRE, C. D. F.; Screening of nitrile hydratases for the synthesis of 3-oxo-3-phenylpropanamide and 3-hydroxy-3-phenylpropanamide, painel, Workshop do Centro de Excelência para Pesquisa em Química Sustentável (CERSusChem), painel, São Pedro/SP, Brasil, 06 - 07 de outubro de 2017. Estágios e Bolsas Auxílio - Bolsa de mestrado no período de 01/08/2016 a 31/07/2018, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Processo: 134686/2016-0 - Bolsa de graduação 50% no período 02/2012 a 12/2013 e 100% no período de 01/2014 a 12/2015, Programa Universidade para todos (PROUNI) - Estágio docência na disciplina de Química Orgânica Experimental I para o curso de graduação em química (BQ/BQT) realizado no 2º semestre de 2017 sob supervisão da Profª Drª Lidiane Gaspareto Felippe e Profª Drª Maysa Furlan no Instituto de Química de Araraquara (IQAr – UNESP), Araraquara/SP, Brasil, 2017. - Estágio no Laboratório de Análises e Simulação Tecnológica (LAST) do Departamento de Tecnologia Agroindustrial e Sócio-economia rural da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) campus Araras, sob supervisão da Profª Drª Maria Teresa Mendes Ribeiro Borges com bolsa da Fundação de Apoio Institucional ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico – FAI.UFSCar, Araras/SP, Brasil, 08/04 a 31/12 de 2015. Participação em eventos - 1ª e 2ª Olimpíada interna de química (OLINQUI) no Centro Universitário Hermínio Ometto. - 7º, 8º e 9º Congresso Científico UNIARARAS - 8ª Feira de Profissões do Centro Universitário Hermínio Ometto - Pint of Science Araraquara - 1ª Escola de Verão do Instituto de Química de Araraquara - 30º Congresso de Iniciação Científica da UNESP Organização de eventos - Integrante da equipe de apoio do festival internacional de divulgação científica Pint of Science, Araraquara, 15 – 17 de maio de 2017, 15 horas. Minicursos ministrados - Integrante da equipe de organização e realização do minicurso “Biocatálise: fundamentos e imobilização de biocatalisadores” na 1ª Escola de Verão do Instituto de Química de Araraquara (IQAr/UNESP), Araraquara/SP, Brasil, 26 de fevereiro – 02 de março de 2018, 20 horas. À minha família, especialmente para meus pais, Conceição e Sebastião e meu irmão Émerson DEDICATÓRIA AGRADECIMENTOS Ao CNPq pelo auxílio financeiro, essencial para que eu pudesse me dedicar com afinco ao meu desenvolvimento científico e a este projeto de pesquisa. Ao Instituto de Química de Araraquara e a UNESP pelo espaço e infraestrutura fundamentais para realização deste trabalho. À minha orientadora Profª Drª Cintia D. F. Milagre pela confiança, paciência, ensinamentos, incentivo e orientação ao longo destes dois anos. À minha família, pela ajuda, apoio, confiança e incentivo, fundamental para que eu chegasse até aqui. Esta conquista também a vos pertence. À força misteriosa que floresce em mim em meus estados niilistas e angustiantes. Ao CERSusChem e INCT- BioNat pelo auxílio financeiro ao grupo de pesquisa. À CAPES pela manutenção do Portal de Periódicos. Ao Prof. Dr. Uwe Bornscheuer do Departamento de Biotecnologia e Catálise Enzimática do Instituto de Bioquímica da Universidade de Greifswald – Alemanha, pela colaboração e envio dos plasmídeos contendo as ω-transaminases Ao Prof. Dr. Humberto M. S. Milagre pelas contribuições neste trabalho. Aos colegas de laboratório: Gabriel, Iris, João Lucas, Laíza, Lucas, Maraylla e Noelle pela convivência, cafés, momentos descontraídos e discussões. A todos funcionários do Instituto de Química pelo profissionalismo, atenção, dedicação e empenho, especialmente para o Rafa e a Márcia do laboratório didático de Química Orgânica, a Naira e ao Albertinho do Laboratório Multiusuário de Análises Químicas I, e a todo pessoal da manutenção, especialmente ao Sr. Antônio Carlos, Rogério e Afonso pela grande atenção e profissionalismo demonstrado. À Profª Drª Isabele Rodrigues Nascimento e sua aluna de doutorado Camila Luiza Cunha pelas análises no polarímetro. À Profª Drª Lourdes Campaner dos Santos pela análise no HPLC. À Drª Bianca pela análise no LC-MS. EPÍGRAFE “Pior que não terminar uma viagem é nunca partir” “Um homem precisa viajar por sua conta, não por meio de histórias, imagens, livros ou TV. Precisa viajar por si, com seus olhos e pés, para entender o que é seu. Para um dia plantar as suas próprias árvores e dar-lhes valor. Conhecer o frio para desfrutar do calor. E o oposto. Sentir a distância e o desabrigo para estar bem sob o próprio teto. Um homem precisa viajar para lugares que não conhece para quebrar essa arrogância que nos faz ver o mundo como o imaginamos, e não simplesmente como é ou pode ser. Que nos faz professores e doutores do que não vimos, quando deveríamos ser alunos, e simplesmente ir ver” Amyr Klink - Mar sem Fim, fevereiro de 2000 RESUMO A tão almejada meta global de desenvolvimento sustentável pode ser facilitada, no âmbito dos processos químicos, pelo uso de biocatalisadores nas reações de sínteses orgânicas. O uso de sistemas em cascatas multienzimáticas propicia menor geração de resíduos, uma vez que dispensa o isolamento e purificação dos intermediários sintéticos, reduzindo, desta forma, o consumo de produtos químicos (especialmente solventes), energia, espaço e tempo. As β-hidroxiamidas são intermediários sintéticos que podem ser empregados como blocos construtores quirais na síntese de ingredientes farmacêuticos ativos, polímeros, heterociclos, etc. Neste trabalho, foram realizadas triagens com 3 diferentes classes de enzimas para serem utilizadas nas reações em cascata, sendo: 13 nitrila hidratases disponíveis comercialmente, 7 cetorredutases sendo 4 de células íntegras de microrganismos (Bacillus cereus, Lysinibacillus boronitolerans, Saccharomyces cerevisiae e MLH 15) e 3 enzimas isoladas disponíveis comercialmente (Horse Liver, Recombinante e Saccharomyces cerevisiae) e 9 ω-transaminases sendo 5 expressas heterologamente (Aspergillus terreus, Chromobacterium violaceum, Mycobacterium vanbaalenii, Ruegeria pomeroyi e Vibrio fluvialis) e 4 enzimas isoladas comerciais (Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus, Neosartorya fischeri e Penicillium chrysogenum) com a finalidade de investigar a atividade e estereosseletividade dessas enzimas frente aos compostos de interesse deste projeto. Nas triagens com nitrila hidratases, 4 enzimas apresentaram grande potencial para catalisar a conversão dos substratos benzoilacetonitrila, rac-3-hidroxi-3-fenilpropanonitrila e rac-3-amino-3- fenilpropanonitrila nas amidas correspondentes com conversões que variaram de 86 - >99%. Não foi observada estereosseletividade para as enzimas nitrila hidratases. As conversões e ee dos microrganismos contendo cetorredutases com o substrato benzoilacetonitrila foram de 5 - 26% e 87 - 92%, respectivamente, com formação predominante do enantiômero (S). Porém, a enzima cetorredutase isolada e recombinante apresentou conversão e ee >99 do enantiômero (S). Também foi realizado um ensaio com o microrganismo Bacillus cereus e a cetorredutase recombinante frente ao substrato 3-oxo-3-fenilpropanamida e nenhuma conversão foi observada. Em relação as ω-transaminases expressas heterologamente e as enzimas isoladas nenhuma conversão foi observada frente ao substrato benzoilacetonitrila e 3- oxo-3-fenilpropanamida. Entretanto, como algumas enzimas nitrila hidratases haviam demonstrado grande potencial para a catálise dos três substratos citados acima e uma cetorredutase recombinante também havia apresentado excelente conversão e ee, o composto (S)-3-hidroxi-3-fenilpropanamida pôde ser obtido de duas formas diferentes de reações em cascata a partir da reação de redução/hidratação do substrato benzoilacetonitrila. Na abordagem de reações em cascatas multienzimáticas simultânea a conversão foi de 83% e ee >99% e na abordagem de reações em cascatas multienzimáticas sequencial a conversão foi de >99% e ee >99% em condições ambientalmente amigáveis de reação e eliminando etapas de extração e purificação do intermediário. Portanto, essas metodologias mostraram-se promissoras para o desenvolvimento de um processo sustentável visando a obtenção de compostos versáteis com elevada pureza enantiomérica. Palavras-chave: reações em cascata, β-hidroxiamida, estereosseletividade ABSTRACT The long-awaited global goal of sustainable development can be facilitated, in the context of chemical processes, by the use of biocatalysts in the organic synthesis reactions. The use of multi-enzymatic cascade systems results in less waste generation, since it eliminates the isolation and purification of synthetic intermediates, reducing the consumption of chemicals (especially solvents), energy, space and time. β-hydroxyamides are synthetic intermediates which can be employed as chiral building blocks in the synthesis of active pharmaceutical ingredients, polymers, heterocycles, etc. In this work, three different classes of enzymes were used for the cascade reactions: 13 nitriles hydratases commercially available, 7 keto reductases being 4 whole cells of microorganisms (Bacillus cereus, Lysinibacillus boronitolerans, Saccharomyces cerevisiae and MLH 15) and 3 isolated commercially available enzymes (Horse Liver, Recombinant and Saccharomyces cerevisiae) and 9 ω- transaminases, being 5 heterologously expressed (Aspergillus terreus, Chromobacterium violaceum, Mycobacterium vanbaalenii, Ruegeria pomeroyi and Vibrio fluvialis) and 4 commercially isolated enzymes (Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus, Neosartorya fischeri and Penicillium chrysogenum) with the purpose of investigating the activity and stereoselectivity of these enzymes with the substrates of interest of this project. In the screening of nitrile hydratase, 4 enzymes showed great potential to catalyze the conversion of the benzoylacetonitrile, rac-3-hydroxy-3- phenylpropanenitrile and rac-3-amino-3-phenylpropanenitrile substrates into the corresponding amides with conversions ranging from 86 -> 99 %. No stereoselectivity was observed with these enzymes. Conversions and ee of the whole cells biocatalysts containing keto reductases with benzoylacetonitrile were 5 - 26% and 87-92%, respectively, with predominant (S)-enantiomer formation. However, an isolated and recombinant keto reductase enzyme showed conversion and ee >99% of the (S)- enantiomer. An assay was also performed with Bacillus cereus and the recombinant keto reductase with 3-oxo-3-phenylpropanamide substrate and no conversion was observed. In relation to the heterologously expressed ω-transaminases and the isolated enzymes no conversion was observed with benzoylacetonitrile and 3-oxo-3- phenylpropanamide substrates. However, since some nitrile hydrates enzymes presented great potential for the catalysis with the three substrates mentioned above and a recombinant keto reductase afforded excellent conversion and ee, the building block (S)-3-hydroxy-3-phenylpropanamide compound could be obtained in two different approaches of cascade reactions from the reduction/hydration reaction of the benzoylacetonitrile substrate. In the simultaneous multi-enzymatic cascade reaction approach, conversion was 83% and ee> 99% and in the sequential multi-enzymatic cascade reaction approach, conversion and ee was >99% in both steps, under environmentally friendly reaction conditions and without step of extraction and isolation of the intermediate. Therefore, these methodologies are promising for the development of a more sustainable process toward the synthesis of versatile compounds with high enantiomeric purity. Key words: cascade reactions, β-hydroxyamide, stereoselectivity LISTA DE FIGURAS Figura 1: Representação estrutural de NHases dependentes de ferro (A) e cobalto (B) ............................................................................................................................. 23 Figura 2: Representação estrutural de uma ω –transaminase ................................. 26 Figura 3: Representação estrutural de uma cetorredutase ...................................... 29 Figura 4: Cromatograma mostrando a separação dos compostos 1 e rac-3 utilizando a coluna Restek® (Coluna A) .................................................................... 48 Figura 5: Cromatograma mostrando os sinais referentes aos enantiômeros do composto rac-3 utilizando a coluna quiral Lipodex E® (Coluna C) ........................... 49 Figura 6: Cromatograma mostrando os picos referentes aos enantiômeros do composto rac-4 utilizando a coluna quiral Lipodex E® (Coluna C) ........................... 52 Figura 7: Perfil cromatográfico da separação dos compostos 1 e rac-5 utilizando a coluna Restek® (Coluna A) ....................................................................................... 53 Figura 8: Perfil cromatográfico para a separação dos enantiômeros do composto rac-5 utilizando a coluna Lipodex E® (Coluna C) ..................................................... 55 Figura 9: Cromatograma mostrando os picos referentes aos enantiômeros do composto rac-6 utilizando a coluna quiral Hydrodex® β-3P (Coluna B) ................... 57 Figura 10: Espectro de massas da enamina formada .............................................. 60 Figura 11: Bolsões do sítio catalítico da enzima ω-Ta ............................................. 62 Figura 12: Conversão de 1 em (S)-3 utilizando B. cereus ou MLH 15 ..................... 65 Figura 13: Determinação do ee dos microrganismos B. cereus e MLH 15 ............... 65 Figura 14: Cromatograma da reação da S.cerevisiae com substrato 1 após 72 horas. ........................................................................................................................ 66 Figura 15: Determinação do excesso enantiomérico da S. cerevisiae ..................... 66 Figura 16: Consumo de 1 e formação dos produtos 1-A., 1-A.R., (S)-3 de 0,5 a 96 horas de reação ........................................................................................................ 69 Figura 17: Determinação dos excessos enantioméricos para a redução assimétrica do composto 1 em (S)-3 catalisada pela enzima KRED recombinante ..................... 74 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Programação da temperatura para a coluna A, B e C. ............................. 34 Tabela 2: Resultados das triagens das NHases com os substratos 1, rac-3 e rac-5 .................................................................................................................................. 59 Tabela 3: Conversões e ee do substrato 1 em (S)-3 catalisada pelos microrganismos contendo KRED ......................................................................................................... 64 Tabela 4: Conversões e ee de 1 para (S)-3 catalisada pelas enzimas KRED .......... 72 LISTA DE ESQUEMAS Esquema 1: Possíveis transformações do substrato 1 catalisadas por NHases, KRED e ω-TA ............................................................................................................ 19 Esquema 2: Síntese da fluoxetina e análogos utilizando o bloco construtor 3 ......... 20 Esquema 3: Processo biocatalítico para obtenção de amidas a partir de nitrilas catalisado por nitrila hidratase (NHase) .................................................................... 24 Esquema 4: Proposta mecanística para a hidratação da acetonitrila catalisada por NHase ....................................................................................................................... 25 Esquema 5: Reação geral para obtenção de aminas primárias a partir de carbonilas de cetonas ou aldeídos ............................................................................................. 27 Esquema 6: Proposta mecanística para a aminação redutiva da carbonila ............. 28 Esquema 7: Reação geral para obtenção de álcoois a partir de cetonas ................ 29 Esquema 8: Proposta mecanística para a redução carbonila .................................. 30 Esquema 9: Possibilidades de reações em cascata multienzimáticas visando a obtenção dos blocos construtores 4 e 6 .................................................................... 31 Fluxograma 1: Etapas para o desenvolvimento do projeto ...................................... 45 Esquema 10: Reação geral para hidrólise ácida da nitrila de 1 em 2 ....................... 46 Esquema 11: Reação geral para redução da carbonila de 1 em rac-3 .................... 48 Esquema 12: Reação geral para a hidratação da nitrila de rac-3 em rac-4 ............. 50 Esquema 13: Reação geral para a aminação redutiva da carbonila de 1 em rac-5 . 52 Esquema 14: Reação geral para a hidratação da nitrila de rac-5 em rac-6 ............. 55 Esquema 15: Reação geral de hidratação da nitrila catalisada por NHase .............. 58 Esquema 16: Reação entre o substrato 1 e a feniletilamina .................................... 60 Esquema 17: Reação geral para a aminação redutiva da carbonila de 1 e 2 catalisada por ω-TA .................................................................................................. 61 Esquema 18: Aminação redutiva do substrato 1-(2-metilfenoxi)-2-propanona catalisada pelos extratos enzimáticos. Aminação redutiva da carbonila do substrato 4-fenil-2-butanona catalisada por A. fumigatus. ........................................................ 62 Esquema 19: Obtenção da (S)-β-fenilalanina via reação em cascata partindo de 1 63 Esquema 20: Reação geral para a redução assimétrica da carbonila de 1 para formação de (S)-3 ..................................................................................................... 63 Esquema 21: Representação da Regra de Prelog para estereosseletividade ......... 67 Esquema 22: Formação do produto 1-A na presença de S. cerevisiae e glicose .... 67 Esquema 23: Proposta mecanística para a primeira etapa da formação do produto 1-A via condensação aldólica ácida. ......................................................................... 68 Esquema 24: Ciclo catalítico da enzima enoato redutase para redução da ligação dupla C=C do Intermediário A levando a formação de 1-A ..................................... 68 Esquema 25: Reação Geral para redução assimétrica da carbonila de 1 para (S)-3 utilizando a enzima KRED ......................................................................................... 71 Esquema 26: Reação em cascata sequencial para a obtenção do bloco construtor (S)-4 a partir de 1 ...................................................................................................... 75 Esquema 27: Reação em cascata simultânea para a obtenção do bloco construtor (S)-4 de 1 .................................................................................................................. 75 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ATR - Atenuated total reflection (Reflexão total atenuada) CCD - Cromatografia em Camada Delgada CCDP - Cromatografia em Camada Delgada Preparativa DEPT – Distortionless Enhancement by Polarization Transfer (Intensificação por transferência de polarização sem distorção) DMSO – Dimetilsulfóxido DSC – Dry Silica Cromatography – (Cromatografia em sílica seca) ee - excesso enantiomérico GC-FID - Gas Chromatography/Flame Ionization Detector (Cromatografia gasosa acoplada ao detector de ionização em chama) GC-MS - Gas Chromatography/Mass Spectrometry (Cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas) GDH - Glucose Dehydrogenase (Glicose desidrogenase) IPA – Isopropyl alcohol (Álcool isopropílico) IUBMB - International Union of Biochemistry and Molecular Biology (União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular IV - Infravermelho J - Constante de acoplamento KRED - Ketoreductases (Cetorredutases) m/z - razão massa carga NADH - Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina NB - Nutrient Broth (Meio Nutriente) NHases - Nitrila Hidratases PLP - Piridoxal-5-fosfato PMP - Piridoxamina-5-fosfato ppm - partes por milhão q.s.p. - quantidade suficiente para RMN de 1H - Ressonância magnética nuclear de hidrogênio RMN de 13C - Ressonância magnética nuclear de carbono rpm – rotação por minuto t.a. - temperatura ambiente TMS - Tetrametilsilano ω-TA - ω-transaminase Sumário 1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 19 1.1. Nitrila Hidratase (NHase) ................................................................................ 23 1.2. ω-Transaminases (ω-TA) ................................................................................ 26 1.3. Cetorredutase (KRED) .................................................................................... 28 2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 31 3. PARTE EXPERIMENTAL ...................................................................................... 32 3.1. Considerações Gerais ..................................................................................... 32 3.1.1. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e de Carbono (RMN de 1H e 13C) ............................................................................... 32 3.1.2. Métodos Cromatográficos ......................................................................... 32 3.1.3. Espectroscopia na região do infravermelho .............................................. 35 3.1.4. Ponto de Fusão......................................................................................... 35 3.1.5. Enzimas, Plasmídeos e Microrganismos .................................................. 35 3.1.6. Reagentes e Solventes ............................................................................. 35 3.1.7. Meio de Cultura......................................................................................... 36 3.1.8. Solução Tampão ....................................................................................... 36 3.1.9. Esterilização ............................................................................................. 36 3.1.10. Manipulação dos microrganismos ........................................................... 36 3.1.11. Experimentos com microrganismos ........................................................ 36 3.1.12. Outros ..................................................................................................... 36 3.2. Metodologias para as Sínteses e Dados Espectroscópicos dos Compostos .. 37 3.2.1. Síntese do composto 3-oxo-3-fenilpropanamida (2)61 .............................. 37 3.2.2. Síntese do composto rac-3-hidroxi-3-fenilpropanonitrila (rac-3)14;64 ......... 37 3.2.3. Síntese do composto rac-3-hidroxi-3-fenilpropanamida (rac-4)8 .............. 38 3.2.4. Síntese do composto rac-3-amino-3-fenilpropanonitrila (rac-5) ................ 39 Segunda etapa:68 ................................................................................................ 39 3.2.5. Síntese do composto rac-3-amino-3-fenilpropanamida (rac-6)61 .............. 40 3.3. Reações com enzimas isoladas, extratos enzimáticos e células íntegras ...... 41 3.3.1. Procedimento geral para triagem das NHases ......................................... 41 3.3.2. Procedimento geral para triagem de ω-TA (extratos enzimáticos) ........... 42 3.3.3. Procedimento geral para triagem de ω-TA (enzimas) ............................... 42 3.3.4. Procedimento geral para triagem das KRED (microrganismos) ............... 43 3.3.5. Procedimento geral para triagem das KRED (enzimas) ........................... 43 3.3.6. Procedimento geral para as reações em cascata ..................................... 44 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 45 4.1. Estratégia de trabalho ..................................................................................... 45 4.2.1. Síntese do composto 2 ............................................................................. 46 4.2.2. Síntese do composto rac-3 ....................................................................... 47 4.2.3. Síntese do composto rac-4 ....................................................................... 50 4.2.4. Síntese do composto rac-5 ....................................................................... 52 4.2.5. Síntese do composto rac-6 ....................................................................... 55 4.3. Triagem das enzimas NHases ........................................................................ 58 4.4. Triagem dos extratos enzimáticos e enzimas comerciais de ω-TA ................. 59 4.5. Triagem de microrganismos contendo KRED ................................................. 63 4.6. Triagem com as enzimas KRED isoladas ....................................................... 71 4.7. Desenvolvimento das reações em cascata simultânea e sequencial para obtenção do bloco construtor (S)-4 ........................................................................ 73 5. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 77 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 79 7. ANEXO .................................................................................................................. 87 19 1. INTRODUÇÃO A benzoilacetonitrila (1) é um substrato pró-quiral versátil devido às possibilidades de interconversão de seus grupos funcionais. Dessa forma, sua estrutura molecular pode ser transformada em diversos blocos construtores com variadas combinações de funcionalizações (Esquema 1). Sendo assim, apresenta uma gama de aplicações, como, por exemplo, na síntese dos fármacos fluoxetina e análogos1-7 e levamisol8, além de também poderem ser utilizados como precursores na síntese de compostos de maior complexidade estrutural tais como, β- aminoálcoois9-14, heterociclos15;16, polímeros17-20, etc. Esquema 1: Possíveis transformações do substrato 1 catalisadas por NHases, KRED e ω-TA Fonte: Autor, 2018 20 A título de exemplo, o bloco construtor 3-hidroxi-3-fenilpropanonitrila (3) (Esquema 2) pode ser utilizado como intermediário sintético na produção da fluoxetina e análogos.8,21 Entretanto, os procedimentos típicos de redução assimétrica de cetonas pró- quirais para a síntese de álcoois e formação de aminas primárias e a hidratação de nitrilas para a obtenção de amidas primárias apresentam características pouco atrativas do ponto de vista sustentável4-6, 15;16, 22-29, como, por exemplo, reação sob alta pressão, uso de catalisadores metálicos (recursos não-renováveis), atmosfera inerte, etapa de purificação, geralmente excesso enantiomérico (ee) <99% e possibilidade de contaminação do fármaco com traços de metais pesados.30;31 Esquema 2: Síntese da fluoxetina e análogos utilizando o bloco construtor 3 Fonte: Adaptado de (HAMMOND, et al, 2007)21 Sendo assim, grandes esforços vêm sendo realizados para a obtenção dessa classe de compostos. Xie e colaboradores23 obtiveram o composto (S)-3-hidroxi-3- fenilpropanamida (S)-4 por meio de hidrogenação assimétrica do precursor 3-oxo-3- fenilpropanamida (2) utilizando irídio como catalisador sob pressão de 15 atm e atmosfera inerte com 20 horas reacionais e ee 98%. Wessjohann e colaboradores26 sintetizaram o composto 4 em sua forma racêmica via reação de Reformatsky catalisada por cromo sob atmosfera inerte. González-Fernández e colaboradores15;16 obtiveram o composto 4 utilizando o substrato 1 em um processo one-pot com condições reacionais mais brandas, porém, em sua forma racêmica. Kitanosono e 21 colaboradores29 sintetizaram o composto 3 e 4 utilizando sais de cobre e reações de adição com boro com ee 81%. β-ceto amidas como o composto 2, são muito difíceis de serem obtidas ou não são acessíveis pelos métodos convencionais16,32, além disso, a grande maioria das metodologias sintéticas para a formação de amidas, são apropriadas para a obtenção de amidas secundárias e terciárias.33 Embora a síntese orgânica tenha atingido um elevado grau de desenvolvimento nas últimas décadas, os processos químicos convencionais ainda necessitam de grandes melhorias, principalmente tratando-se dos termos ecológicos e ambientais.34 Diante dessa questão de sustentabilidade, torna-se cada vez mais relevante explorar o potencial celular ou até mesmo mimetizar a forma em que as reações ocorrem no interior das células, pois as células são as fábricas químicas mais eficientes conhecidas35 onde as reações ocorrem em cascatas catalisadas por enzimas. A biocatálise pode ser definida como a transformação química de um substrato não-natural em um número limitado de etapas catalisada por células íntegras ou enzimas isoladas.36 O que a torna tão atrativa do ponto de vista sintético e ambiental são as condições brandas de reação em que a catálise pode ocorrer. Na grande maioria das vezes, a catálise ocorre sob pressão e temperatura ambiente, solução aquosa tamponada com pH próximo ao fisiológico e utiliza pequeno ou nenhum volume de cossolvente, para auxiliar na solubilização do substrato.37;38 Além disso, as enzimas são matérias-primas oriundas de fontes renováveis, biodegradáveis e potencialmente regio-, quimio- e enantiosseletivas na biotransformação de substâncias polifuncionalizadas.37;38 Dessa forma, evitam-se etapas de proteção e desproteção requeridas pela síntese tradicional e formação de subprodutos provenientes de processos de isomerização e rearranjos.37;38 Portanto, há considerável redução na geração de resíduos e consumo de energia.39;40 As reações em cascata são consideradas uma abordagem promissora para a síntese sustentável de compostos que requerem mais de uma etapa de reação35,41, pois evitam a extração e purificação de intermediários sintéticos. Dessa forma, há uma redução significativa na geração de resíduos e custos para a indústria42, consequentemente, o consumo de produtos químicos (especialmente solventes), energia, espaço e tempo é diminuído.34;35 22 As reações em cascata podem ser classificadas de acordo com vários parâmetros, como, por exemplo, número de etapas, número de catalisadores, tipos de catalisadores, tipos de reações redox, tipos das reações químicas em cada etapa, etc.42 Todas essas requerem mais de um catalisador. No entanto, há três tipos de reações em cascata que utilizam somente um catalisador, que são: (I) as reações dominó em que a reação é iniciada por um catalisador e as etapas subsequentes ocorrem espontaneamente, (II) reação sequencial catalisada, como, por exemplo, a enzima multifuncional policetídeo sintase, sendo que quando dois ou mais catalisadores adicionados em tempos diferentes da reação também é conhecida como reação sequencial e (III) reação em cascata em que o substrato tem diferentes funcionalizações que podem ser transformadas pelo mesmo catalisador mais de uma vez.42 Para maiores discussões, ver referências 34;35;41;43-48 Neste trabalho, definimos as reações como sendo em cascata simultânea ou sequencial. O que as diferem é o momento em que um segundo (bio)catalisador é adicionado na reação. Dessa forma, o parâmetro utilizado para classificar esse tipo de cascata é o parâmetro cronológico.42 Na Reação em Cascata Simultânea, a adição de todos os reagentes e (bio)catalisadores ocorrem no instante inicial da reação. Na Reação em Cascata Sequencial o segundo (bio)catalisador é adicionado somente quando o primeiro estágio atinge sua completude.35,42 O fato é que, adicionando todos os reagentes e (bio)catalisadores no início da reação ou não, ambas abordagens apresentam as mesmas vantagens relevantes citadas acima.35 Portanto, diante do contexto exposto acima, a obtenção desses blocos construtores utilizando metodologias sintéticas sustentáveis torna-se de grande relevância. Além da economia de recursos naturais e energéticos, apresentam grande aplicação como intermediários sintéticos na produção de moléculas com atividades biológicas. Sabendo que os blocos construtores ácido 3-amino-3-fenilpropanóico49;50 (7) e ácido 3-hidroxi-3-fenilpropanóico51 (8) já foram obtidos via reações em cascata multienzimáticas utilizando as enzimas ω-TA/nitrilase e KRED/ω-TA, respectivamente, partindo do substrato 1, torna-se de grande relevância a síntese estereosseletiva dos blocos construtores 3-hidroxi-3-fenilpropanamida (4) e 3-amino-3-fenilpropanamida (5) utilizando reações em cascata multienzimáticas. Para isso, três enzimas são 23 fundamentais: a enzima NHase, ω-TA e KRED. Na sequência, seguem maiores detalhes de cada enzima. 1.1. Nitrila Hidratase (NHase) A enzima NHase, classificada pela União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUMBM) como EC 4.2.1.84, é uma metaloenzima que pode conter grupo ferro não-heme (Fe3+) e cobalto não-corrinóide (Co3+) como grupos prostéticos no centro catalítico (Figura 1). Estes grupos prostéticos variam com as espécies de microrganismos e definem se a enzima sofrerá ou não foto-ativação52. O fenômeno da foto-ativação ocorre somente com a enzima NHase do tipo ferro que necessita de luz para desempenhar sua atividade catalítica, após ocorrer a quebra da ligação do óxido nítrico (NO) com o íon metálico Fe3+ e ser trocado por uma molécula de água ou íon hidróxido (dependendo do pH).52 Figura 1: Representação estrutural de NHases dependentes de ferro (A) e cobalto (B) A B Fonte: Protein Data Bank, estruturas 3A8L (Figura A) e 1IRE (Figura B) A enzima NHase é responsável por catalisar a reação de hidratação da nitrila na amida correspondente sem a formação de ácido carboxílico, conforme apresentado no Esquema 3. Co3+ Fe3+ 24 Esquema 3: Processo biocatalítico para obtenção de amidas a partir de nitrilas catalisado por nitrila hidratase (NHase) Fonte: (MASCHARAK, P. K.; 2013)52 Muitos esforços vêm sendo realizados para a elucidação do mecanismo da enzima NHase (Esquema 4). Hopmann53 em 2008 mostrou que na primeira etapa da catálise ocorre a formação de um intermediário cíclico a partir de um ataque nucleofílico do átomo de oxigênio de C-SO- ao substrato coordenado com o metal. Em 2016, Kayanuma e colaboradores54 concluíram que o aminoácido arginina (βR56), é essencial para a formação da ligação dissulfeto devido a formação de uma ligação de hidrogênio com o átomo de oxigênio da estrutura cíclica. Dessa forma, desempenha papel fundamental na atividade catalítica da enzima. Entretanto, algumas etapas ainda são pouco conhecidas, como, por exemplo, a formação do produto amida e a regeneração do sítio ativo da enzima.54 Como dito anteriormente, na primeira etapa do mecanismo (Esquema 4) ocorre a formação de um intermediário cíclico via ataque nucleofílico do átomo de oxigênio ligado ao aminoácido C-SO- ao substrato coordenado com o metal no sítio ativo. Na sequência, ocorre uma transferência de próton entre os resíduos Y72 → S113 → substrato, resultando na formação do intermediário cíclico protonado (Intermediário 2). Esta transferência é facilitada devido ao átomo de nitrogênio do substrato e os grupos hidroxilas dos resíduos S113, Y72 e Y37 formarem uma rede de ligações de hidrogênio, estabilizando o resíduo Y72 desprotonado. Logo após, ocorre a formação da ligação dissulfeto (Intermediário 3) entre a C109 e C114, a partir de um ataque nucleofílico do átomo de enxofre ligado ao resíduo C109. Quando o átomo de nitrogênio do substrato é protonado, o comprimento da ligação S-O se torna maior e da ligação C-O menor, facilitando a dissociação da ligação S-O e a formação da ligação S-S.54 25 Esquema 4: Proposta mecanística para a hidratação da acetonitrila catalisada por NHase Fonte: Adaptado de (KAYANUMA et al, 2016)54 26 A aproximação de uma molécula de água junto ao aminoácido C114, leva a formação do intermediário 4 e, posteriormente, o átomo de enxofre do aminoácido C114 sofre um ataque nucleofílico do oxigênio da molécula de água, resultando na formação do ácido imídico (Intermediário 5). A formação da ligação S-O do resíduo C114 e a dissociação da ligação S-S entre os resíduos C109 e C114 ocorrem simultaneamente. Após a formação do intermediário 5, ocorre a isomerização do mesmo para o produto amida. Esta etapa é catalisada pelo ácido sulfênico do resíduo C114-SOH que envolve transferência de prótons do oxigênio do ácido imídico para a C114-SOH e da C114-SOH para o nitrogênio do ácido imídico. Quando uma nova molécula de água se aproxima do sítio ativo, ocorre a dissociação do produto amida do íon metálico. A coordenação da molécula de água com o íon metálico se dá em três etapas sequenciais de transferência de próton: C114-SOH → molécula de água coordenada → S113 → Y72, resultando na restauração da estrutura inicial do sítio ativo da NHase.54 1.2. ω-Transaminases (ω-TA) As -TA pertencem à classe das transferases, classificadas pela União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular como EC 2.6.1.X55 (Figura 2) Figura 2: Representação estrutural de uma ω –transaminase Fonte: Protein Data Bank (estrutura 4BA5) As ω-transaminases são dependentes de PLP (piridoxal-5-fosfato) como cofator e catalisam a aminação redutiva de carbonilas cetônicas ou aldeídicas56;57 (Esquema 5). 27 Esquema 5: Reação geral para obtenção de aminas primárias a partir de carbonilas de cetonas ou aldeídos Fonte: Adaptado de (KOSZELEWSKI, et al, 2010)57 A molécula crucial para a reação de aminação redutiva é o cofator PLP juntamente com sua forma reduzida PMP. O mecanismo abaixo (Esquema 6) exemplifica a reação entre a isopropilamina (doador amino) e a acetofenona (aceptor amino). Na ausência do substrato, o PLP encontra-se ligado covalentemente ao aminoácido lisina no sítio catalítico, formando uma imina interna (base de Schiff) (A). A ligação C=N da imina interna é atacada pelo doador amino, neste caso a isopropilamina, formando uma imina entre o doador amino e o PLP. Este ataque é facilitado pela molécula de água no sítio ativo e pelo oxigênio fenólico do PLP que podem estabilizar o intermediário (B) formado através de ligações de hidrogênio. O resíduo da lisina do sítio ativo da enzima abstrai um próton do carbono quaternário que se tornou mais ácido devido a carga positiva no nitrogênio (C). A abstração do próton da lisina é realizada com o sistema em ressonância pelos elétrons da dupla ligação C=C, levando ao intermediário ( D), restabelecendo o sistema aromático. A imina é então hidrolisada, liberando o doador amino na forma de cetona e o cofator PLP é convertido em PMP (E) que transfere o grupo amino para a acetofenona (F) ao passo em que o aminoácido lisina do sítio ativo da enzima abstrai um próton ácido adjacente ao átomo de nitrogênio com carga positiva, levando a formação do intermediário (G). Novamente, com o sistema em ressonância, os elétrons da ligação C=N abstraem próton do aminoácido lisina. Então, o par de elétrons do grupo amino do aminoácido lisina do sítio ativo da enzima (H) realiza um ataque nucleofílico no átomo de carbono ligado ao nitrogênio que está mais eletrofílico por estar com carga positiva, sendo liberado o produto feniletilamina. 28 Esquema 6: Proposta mecanística para a aminação redutiva da carbonila Fonte: Adaptado de (BERGLUND, P.; HUMBLE, M. S.; BRANNEBY, C.; 2012)58 1.3. Cetorredutase (KRED) A cetorredutase (KRED) (Figura 3) pertence à classe das oxidorredutase (EC 1.1.1.1), também são conhecidas por álcool desidrogenase ou carbonila redutase e são dependentes dos cofatores NAD(P)+/NAD(P)H, (fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina) ou FAD+/FADH (dinucleotídeo de flavina e adenina). 29 Figura 3: Representação estrutural de uma cetorredutase Fonte: Protein Data Bank (estrutura 4RF4) Catalisam a reação de redução da carbonila de aldeídos e de cetonas, formando álcool primário e secundário, respectivamente, como mostram os Esquemas 7 e 8. Esquema 7: Reação geral para obtenção de álcoois a partir de cetonas Fonte: Adaptado de (BROUSSY; CHELOHA; BERKOWITZ, 2009)59 Na primeira etapa do mecanismo o íon metálico Zn2+ se complexa com o oxigênio da carbonila do substrato e o mesmo fica com carga parcial positiva (A). Desta forma, o átomo de oxigênio torna-se mais eletrofílico e retira mais densidade eletrônica do carbono carbonílico. Sendo assim, a carga parcial positiva no átomo de carbono fica ainda maior, tornando mais eletrofílico e, portanto, ficando mais suscetível ao ataque nucleofílico do cofator NAD(P)H. Na segunda etapa da reação, o par de elétrons não ligantes do nitrogênio presente no cofator NAD(P)H se desloca no anel, formando uma ligação dupla para manter a aromaticidade e liberar o hidreto que faz um ataque nucleofílico no carbono carbonílico do substrato reduzindo ao alcóxido (B). Na última etapa o ânion alcóxido é protonado por uma molécula de água complexada ao Zn2+ (C), formando o álcool como produto final da reação. 30 Posteriormente, o cofator NAD(P)H deve ser reciclado para que a catálise enantiosseletiva de redução assimétrica da carbonila possa evoluir. Esquema 8: Proposta mecanística para a redução carbonila Fonte: Adaptado de (HOLLMANN, F.; ARENDS, I. W. C. E.; HOLTMANN.D.; 2011)60 Etapa de reciclo do cofator C B A 31 2. OBJETIVOS - Avaliar o potencial catalítico das enzimas NHase, ω-TA e KRED frente aos substratos de interesse deste projeto para futuramente explorar um escopo maior de substratos; - Obter de forma enantiosseletiva os compostos 3-hidroxi-3-fenilpropanamida (4) e 3- amino-3-fenilpropanamida (6) utilizando reações em cascata multienzimáticas utilizando as enzimas KRED/NHase e ω-TA/NHase, respectivamente (Esquema 9), a partir de reações de redução/hidratação do substrato benzoilacetonitrila (1). Esquema 9: Possibilidades de reações em cascata multienzimáticas visando a obtenção dos blocos construtores 4 e 6 Fonte: Autor, 2018 32 3. PARTE EXPERIMENTAL 3.1. Considerações Gerais 3.1.1. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e de Carbono (RMN de 1H e 13C) Os espectros de RMN de 1H e 13C foram registrados no espectrômetro Bruker Fourier 300 (B0 7,05 T) na frequência de 300,19 MHz para o núcleo de hidrogênio e 75,5 MHz para o núcleo de carbono. As análises de RMN foram realizadas no Instituto de Química de Araraquara (IQAr/UNESP). Os sinais de deslocamentos químicos (δ) de hidrogênio foram registrados em ppm utilizando como padrão interno tetrametilsilano (TMS, δ = 0,00) e padrão externo CDCl3 (δ = 7,26) e os sinais de deslocamentos químicos de carbono foram registrados em ppm, utilizando como referência externa CDCl3 (δ = 77,0). Para os deslocamentos químicos de hidrogênio de CD3OD-d 4 foram registrados em 3,30 e 4,78 ppm e para carbono 49,0 ppm. Para os deslocamentos químicos de hidrogênio de DMSO-d 6 foi registrado em 2,49 ppm e para carbono 39,7 ppm. As constantes de acoplamento (J) foram medidas em Hertz (Hz) e os sinais foram caracterizados como: dupleto (d), duplo dupleto (dd), duplo dupleto duplo (ddd), tripleto (t), multipleto (m), simpleto (s), simpleto largo (sl). As interpretações dos espectros de RMN de 13C foram realizadas com auxílio da técnica DEPT135º (Distortionless Enhancement by Polarization Tranfer), sendo CH3/CH = sinal positivo (+), CH2 = sinal negativo (-) e C0 = carbono quaternário (intensidade nula). 3.1.2. Métodos Cromatográficos As análises cromatográficas em camada delgada (CCD) para monitoramento das reações foram realizadas utilizando-se de cromatoplacas de sílica gel 60 Macherey Nagel com indicador fluorescente UV254 (20 x 20 cm) sobre suporte de alumínio. A revelação dos compostos nas cromatoplacas foi feita com auxílio do espectrofotômetro Solab com irradiação no ultravioleta com comprimento de onda (λ) de 254 e 364 nm e pulverização com p-anisaldeído e subsequente aquecimento a 300 ºC com soprador térmico. As placas cromatográficas em camada delgada preparativa (CCDP) foram preparadas com sílica gel Kiesegel DF Riedel-deHaën com 0,75 mm de espessura sobre placa de vidro (20 x 20 cm). 33 Na purificação do composto 3-amino-3-fenilacrilonitrila por DSC (cromatografia flash em sílica seca) utilizou-se sílica gel 230-400 mesh da marca Macherey Nagel com gradiente de eluição em heptano/acetato de etila. As análises por Cromatografia Gasosa Acoplada ao Detector de Ionização de Chama (GC-FID) foram realizadas no Milagre Lab, utilizando-se o cromatógrafo gasoso Shimadzu – Modelo GC-2010 Plus equipado com injetor automático AOC – 20i e acoplado a um detector de ionização de chama. Para as análises de rotina utilizou-se coluna capilar de sílica fundida Restek RTX®-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm, 5% fenil e 95% dimetilpolisiloxano) coluna A. O cromatógrafo operou com fluxo constante de gás H2 de 1,17 – 1,22 mL/min, com temperatura no injetor de 260 ºC e no detector de 280 ºC. As programações de temperatura utilizada estão descritas na Tabela 1. O volume de injeção das amostras foi de 1 μL na concentração de 0,5 – 1,0 mg/mL no modo Split (100:1) As análises por GC-FID com coluna quiral para determinação dos excessos enantioméricos (ee) dos compostos foram realizadas utilizando-se a coluna Hydrodex® β-3P (25 m x 0,25 mm x 0,25 μm) (coluna B) e Lipodex® E (25 m x 0,25 mm x 0,25 μm) (coluna C) ambas da marca Macherey Nagel. O volume das injeções para ambas as colunas quirais foram de 1 μL na concentração de 0,5 – 1,0 mg/mL no modo split (100:1). As programações de temperatura utilizadas são descritas na Tabela 1. Os valores de conversão e excesso enantiomérico (ee) foram calculados pelas análises em CG-DIC baseando-se nas áreas dos compostos, segundo as equações abaixo: conv.(%) = (A produto/ A substrato + A produto) x 100% ee(%) = (A maior – A menor)/(A maior + A menor) x 100% As análises por GC-MS foram realizadas no Laboratório Multiusuário I de Análises Químicas do Instituto de Química de Araraquara (IQAr/UNESP), utilizando- se um cromatógrafo gasoso Agilent - Modelo 7890B acoplado a um espectrômetro de massas – Modelo 5977A cuja fonte de ionização por elétrons opera com energia de ionização de 70 eV. O espectrômetro de massas operou na faixa de m/z 45-500. Para o GC-MS foi utilizada uma coluna capilar de sílica fundida HP-5 MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm, 5% fenil-metilsiloxano). O cromatógrafo operou com fluxo constante de gás 34 He de 1 mL/min, temperatura no injetor de 260 ºC e de interface de 280 ºC. As injeções das amostras foram de 1 μL na concentração de 0,5 – 1,0 mg/mL. A programação da temperatura para as análises é a mesma utilizada nas análises de rotina com a coluna Restek RTX®-5, isto é, os três métodos descritos para a coluna A. Tabela 1: Programação da temperatura para a coluna A, B e C. Coluna Programação da temperatura Tempo total da programação (min) Composto Tempo de retenção (min) Taxa de Aquecimento (ºC/min) Temperatura (ºC) Tempo de espera (min) A - 80 2 13,67 1 2 Intermediário de rac-5 rac-4 rac-6 6,5 4,4 7,2 7,7 7,6 30 280 5 A - 100 0 30,10 1 rac-5 12,3 11,7 3 148 2 2 156 0 40 280 5 A - 100 3 25,50 1 rac-3 16,6 16,8 2 130 0 60 280 5 B Isoterma 180 ºC por 45 minutos 45,00 6 34,0 35,4 C - 155 5 30,50 (S)-3 (R)-3 18,5 19,2 1 165 0 30 180 15 C - 170 2 32,00 (R)-4 (S)-4 28,6 29,3 2 180 25 C - 155 5 25,50 5 11,7 12,5 1 165 0 30 180 10 35 3.1.3. Espectroscopia na região do infravermelho Os espectros de absorção na região do infravermelho foram registrados em um espectrômetro Bruker modelo Vertex 70 com transformada de Fourier, absorvendo na região 400 a 4000 cm-1 por meio de reflexão total atenuada em cristal diamante (ATR). 3.1.4. Ponto de Fusão As medidas de ponto de fusão foram realizadas em um equipamento MQAPF- 302 Microquímica equipamentos Ltda. 3.1.5. Enzimas, Plasmídeos e Microrganismos O kit comercial de NHase foi adquirido junto a empresa Prozomix®. As enzimas ω-TA comerciais foram adquiridas junto a empresa Sigma-Aldrich® e são pertencentes aos seguintes microrganismos: Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus, Penicillium chrysogenum e Neosartorya fischeri. Cinco plasmídeos contendo genes sintéticos de linhagens selvagens de ω-TA também foram utilizados e foram fornecidos pelo Prof. Dr. Uwe Bornscheuer do Departamento de Biotecnologia e Catalise Enzimática do Instituto de Bioquímica da Universidade de Greifswald – Alemanha. A manutenção dos plasmídeos foi realizada pela MSc. Iris dos Santos Teixeira, deste grupo de pesquisa. Os plasmídeos que codificam ω-TA (R)-seletivas são provenientes dos microrganismos A. terreus e Mycobacterium vanbaalenii e os que codificam ω-TA (S)-seletivas são provenientes dos microrganismos Chromobacterium violaceum, Ruegeria pomeroyi e Vibrio fluvialis JS17. Os microrganismos utilizados contendo KRED são: Bacillus cereus, Lysinibacillus boronitolerans e MLH 15 e são provenientes da coleção de microrganismos do Milagre Research Group. Além destes, também foi utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae do tipo II adquirida junto a empresa Sigma-Aldrich®. As enzimas isoladas de KRED são provenientes de horse liver, S. cerevisiae e recombinante e também foram adquiridas junto a empresa Sigma-Aldrich®. 3.1.6. Reagentes e Solventes Os solventes, reagentes e o substrato benzoilacetonitrila foram adquiridos junto a empresa Sigma-Aldrich®(Merck) 36 3.1.7. Meio de Cultura O meio de cultivo utilizado foi o Nutrient Broth (NB) adquirido junto à empresa Acumedia. 3.1.8. Solução Tampão Utilizou-se solução tampão fosfato (PBS) pH 7; 100 mM; 39 mL NaH2PO4 (0,2M) e 61 mL Na2HPO4 (0,2M); q.s.p. 100 mL; com adição de 5 g de D-glicose 3.1.9. Esterilização Os meios de cultura foram esterilizados em autoclave da marca Phoenix Lufferco a 121 ºC e 1,0 Kgf/cm2 por 15 minutos e para o descarte dos microrganismos por 45 minutos. 3.1.10. Manipulação dos microrganismos O repique dos microrganismos, as transferências de células e retirada de alíquotas para monitoramento de reações foi realizado no fluxo vertical previamente esterilizado com EtOH 70% e luz UV por 15 minutos. 3.1.11. Experimentos com microrganismos Os experimentos com microrganismos foram realizados em incubadora refrigerada com agitação orbital da marca Tecnal, a 115 rpm e 28 ºC. 3.1.12. Outros A síntese do composto 3-amino-3-fenilacrilonitrila foi realizada sob atmosfera de N2, vidraria pré-seca em estufa por 12 horas e, posteriormente, em soprador térmico e armazenada no dessecador para resfriamento. A peneira molecular 4 Å foi ativada na mufla a 400 ºC por 4 horas, sendo posteriormente armazenada no dessecador. 37 3.2. Metodologias para as Sínteses e Dados Espectroscópicos dos Compostos 3.2.1. Síntese do composto 3-oxo-3-fenilpropanamida (2)61 Em um balão de fundo redondo de 25,0 mL, adicionou-se 1 (145 mg; 1 mmol) e CH2Cl2 anidro (4,0 mL; 5,32 g; 63 mmol). Após completa solubilização do substrato 1, gotejou-se H2SO4 98% (1,7 mL; 3,128 g; 32 mmol) sob agitação magnética suave em temperatura ambiente. Em seguida, a solução reacional foi mantida sob agitação magnética vigorosa em temperatura ambiente por 6 horas. Logo após, foi neutralizada com NaOH 10 M a 0 ºC e extraída com AcOEt (3 x 10 mL) (30 mL; 27,06 g; 307 mmol). As fases orgânicas foram combinadas e lavadas com solução saturada de cloreto de sódio (NaCl(aq)). Adicionou-se à fase orgânica MgSO4 anidro e procedeu-se à filtração por gravidade, utilizando papel de filtro pregueado. O produto bruto foi purificado por CCDP (eluente: heptano/AcOEt 3:7). Nessas condições, o Rf encontrado foi: 1 = 0,78 e 2 = 0,26. Após purificação, obteve-se um rendimento de 40 %. O produto apresentou-se como um sólido amorfo de cor bege claro. A faixa de fusão foi igual 109-111 oC. 3-oxo-3-fenilpropanamida (2). FM: C9H9NO2. MM: 163 g·mol-1; sólido bege claro; GC-FID: tR = 4.4 min (Restek®); EM (IE, 70 eV) m/z (abundância relativa %): 120 (35), 105 (100) e 77 (65) IV – ( max) (cm-1) 3419, 3187, 1675, 1632; RMN de 1H – (300,19 MHz, CDCl3) δ 3,99 (s, 2H, H2), 5,71 (sl, 1NH), 7,17 (sl, 1NH), 7,38 – 7,56 (m, 3H, H6, H7e H8), 7,96 -8,05 (m, 2H, H4 e H9); (enol, CDCl3): 5,57 (s, 1H, H2), 14,24 (s, 1H, OH); RMN de 13C – (75,5 MHz, CDCl3) δ (ppm): 45,0 (CH2, C2), 128,6; 128,9 (CH, C5, C6, C7 e C8), 134,2 (CH, C9), 136,1 (C0, C4), 168,1 (C0, C1), 195,7 (C0, C3) 3.2.2. Síntese do composto rac-3-hidroxi-3-fenilpropanonitrila (rac-3)14;64 Em um balão de 25 mL, adicionou-se 1 (73 mg; 0,5 mmol) e EtOH grau HPLC (5 mL; 3,945 g; 86 mmol) a 0 ºC. Após completa solubilização de 1, adicionou-se em uma única porção NaBH4 (62,4 mg; 1,65 mmol). A mistura reacional foi mantida sob agitação magnética vagarosa com retorno gradual a temperatura ambiente por 30 minutos. A reação foi monitorada por CCD, utilizando como fase móvel CH2Cl2/n- hexano/AcOEt (4:1:1). Nessas condições, o Rf encontrado foi: 1 = 0,78 e rac-3 = 0,60. O solvente da reação foi evaporado no rotaevaporador sob pressão reduzida e o resíduo contido no balão suspendido com 5,0 mL de H2O destilada pH 5-6. A fase 38 aquosa foi extraída com AcOEt (3 x 15 mL) (45 mL = 40,59 g; 461 mmol). As fases orgânicas foram combinadas e secas sob MgSO4 anidro, filtradas por gravidade com papel de filtro pregueado e evaporadas em rotaevaporador, fornecendo um óleo viscoso de cor amarela. Obteve-se conversão >99% e rendimento de 84%. rac-3-hidroxi-3-fenilpropanonitrila (rac-3). FM: C9H9NO; MM: 147 g·mol-1; óleo viscoso amarelo; GC-FID: tR = 16.8 min (Restek®); tR-(R) = 19.2 min e tR-(S) = 18.5 min (Lipodex E.); [𝛼]𝐷 21= -27,7 EM (IE, 70 eV) m/z (abundância relativa %) EM - m/z (%): 147 (8), 129 (8), 107 (100), 105 (26) 79 (86), 77 (72), 51 (27); IV – (ν max (cm-1); 3421, 2254, 3066, 3033, 2984, 2935, 206, 1636; RMN de 1H – (300,19 MHz, CDCl3) δ (ppm) 2,47 (d, J= 3,3 Hz, 1H, OH), 2,77 (d, J = 6,2 Hz, 2H, H2), (m, J =3,3 e 6,2 Hz, 1H, H3), 7,31 – 7,39 (m, 5H, H5, H6, H7, H8 e H-9); RMN de 13C – (75,5 MHz, CDCl3) δ (ppm): 27,9 (CH2, C2), 70,2 (CH, C3), 117,2 (CN, C1), 125,5 (CH, C5 e C9), 128,9 (CH, C6 e C8), 129,0 (CH, C7), 140,9 (C0, C4) 3.2.3. Síntese do composto rac-3-hidroxi-3-fenilpropanamida (rac-4)8 Em um balão de 5 mL, adicionou-se rac-3 (85 mg; 0,578 mmol) e DMSO (580 μL; 638 mg; 8 mmol). Após completa solubilização de rac-3, adicionou-se H2O2 35% (190 μL; 275 mg; 8 mmol) e K2CO3 (23,8 mg; 0,172 mmol). A mistura reacional foi mantida sob agitação magnética por 6 horas. Logo após, adicionou-se 1,0 mL de H2O destilada e procedeu-se a extração com AcOEt (3 x 2,0 mL) (6 mL; 5,412 g; 61 mmol) Obteve-se conversão >99% e rendimento bruto acima do teórico, devido à um óleo amarelo extraído junto com produto. O produto bruto foi purificado por CCDP utilizando como fase móvel AcOEt 100%. O Rf de rac-4 foi de 0,23. Após purificação, o rendimento foi de 14% e o produto se apresentou como um sólido branco com faixa de fusão de 120-121 ºC. rac-3-hidroxi-3-fenilpropanamida (rac-4). FM: C9H11NO2; MM: 165 g·mol-1 ; sólido branco; GC-FID: tR = 7.7 min (Restek®); tR- (R) = 28.6 min e tR-(S) = 29.2 min (Lipodex E.); [𝛼]𝐷 21= -49,7 EM (IE, 70 eV) m/z (abundância relativa %): 51 (42), 59 (95), 63 (7), 77 (100), 91 (10), 105 (61), 120 (20), 131 (29), 146 (69), 165 (31); IV – (ν max) (cm-1); 3378, 3301, 3176, 3057, 3032, 2919, 2852, 1620; RMN de 1H – (300,19 MHz, CD3OD-d 4) δ (ppm): 1,29 (s, 1H, OH), 2,47 – 2,69 (ddd, J = 4,8, 8,7 e 14,4 Hz, 2H H2), 5,00 (dd, J = 4,8 e 8,7 Hz, 1H, H3), 7,21 – 7,43 (m, 5H, H5, H6, H7, 39 H8 e H9); RMN de 13C – (75,5 MHz, CD3OD-d 4) δ (ppm): 44,6 (CH2, C2), 70,5 (CH, C3), 125,4 (CH, C5 e C9), 127,1 (CH, C6 e C8), 127,9 (CH, C7), 143,9 (C0, C4), 175,0 (C0, C1) 3.2.4. Síntese do composto rac-3-amino-3-fenilpropanonitrila (rac-5) Primeira etapa:67 Formação do intermediário 3-amino-3-fenilacrilonitrila Em um balão de fundo redondo de duas bocas de 25,0 mL, adicionou-se 1 (145 mg; 1 mmol) e NH4OAc (786 mg; 10 mmol). Adicionou-se ao balão, o solvente composto por 1 mL de CH3COOH glacial (1,05 g; 17 mmol) em 5 mL de benzeno (4,38 g; 56 mmol) e 4 esferas de peneira molecular previamente ativada. Essa mistura reacional foi agitada sob refluxo e atmosfera de N2 por 4,5 horas. A reação foi monitorada por GC-FID. (O monitoramento por CCD também é viável uma vez que o revelador químico p-anisaldeído revela com grande intensidade o produto e não revela o material de partida). Ao término da reação, deixou-se a mistura reacional retornar a temperatura ambiente naturalmente. Em seguida, evaporou-se o solvente e o resíduo foi suspendido com 15 mL H2O destilada pH 8. Extraiu-se a fase aquosa com AcOEt (3 x 15 mL) (45 mL; 40,6 g; 461 mmol). As fases orgânicas foram combinadas e lavadas com solução saturada de NaCl. Após isso, as fases orgânicas foram secas sob MgSO4 anidro, filtradas por gravidade com papel de filtro pregueado e o solvente evaporado em rotaevaporador, fornecendo 135 mg de um sólido alaranjado. Obteve- se conversão >99% e rendimento de 94%. 3-amino-3-fenilacrilonitrila. FM: C9H8N2; MM: 144 g·mol-1; sólido alaranjado; GC-FID: tR = 7.2 min (Restek®); EM (IE, 70 eV) m/z (abundância relativa %): 144 (100), 129 (22), 117 (98), 104 (40), 89 (21), 77 (44), 51 (47) IV – (V max) (cm-1): 3444, 3353, 3240, 2182; RMN de 1H – (300,19 MHz, CDCl3) δ (ppm) 4,25 (s, 1H, H2), 4,74 – 5,20 (sl, 2 NH), 7,37 – 7,54 (m, 5H, H5, H6, H7, H8 e H9); RMN de 13C – (75,5 MHz, CDCl3) δ (ppm): 63,9 (CH2, C2), 119,6 (CN, C1), 126,1 (CH, C5 e C9), 129,1 (CH, C7), 131,1 (CH, C6 e C8), 135,5 (C0, C4), 161,6 (C0, C3) Segunda etapa:68 Em um balão de 10 mL, adicionou-se o substrato 3-amino-3-fenilacrilonitrila (166mg; 1,15 mmol), EtOH HPLC (3 mL; 2,367 g; 51 mmol), NaBH3CN (81,6; 1,3 mmol) e 3 μL do indicador verde de bromocresol 0,5% em EtOH grau HPLC. O balão 40 foi hermeticamente fechado com septo e, com auxílio de uma seringa de vidro, gotejou-se HCl 37% em EtOH grau HPLC (1:1) até a obtenção de cor amarela permanente. (Atenção: nesta etapa há liberação de HCN, sendo necessário utilizar borbulhador com solução NaOH 10 M para capturar este gás extremamente tóxico. Além disso, a reação deve ser realizada na capela de exaustão e com uso de sensor de HCN). A mistura reacional permaneceu sob agitação magnética em temperatura ambiente por 3 horas. A reação foi monitorada por CCD, utilizando eluente: heptano/AcOEt 1:1. Nessas condições o Rf encontrado foi: 3-amino-3-fenilacrilonitrila = 0,48 e rac-5 = 0,31. Para confirmar o término da reação, a placa de CCD foi revelada com solução de p-anisaldeído, pois revela somente o substrato e pôde ser observado que não havia resquício algum de substrato. Evaporou-se o solvente da reação no rotaevaporador sob pressão reduzida e a massa bruta contida no balão foi suspendida com 20 mL de H2O destilada pH 11. Adicionou-se solução saturada de NaCl à fase aquosa e a mesma foi extraída com AcOEt (3 x 20 mL) (60 mL; 54,12 g; 614 mmol). As fases orgânicas foram combinadas e lavadas com solução saturada de NaCl. Posteriormente, foram secas sob MgSO4 anidro, filtradas por gravidade com papel de filtro pregueado e o solvente evaporado em rotaevaporador, fornecendo 149 mg de um óleo viscoso amarronzado. Obteve-se conversão >99% e rendimento de 89%. Não foi necessária uma etapa de purificação. rac-3-amino-3-fenilpropanonitrila (rac-5). FM: C9H10N2; MM: 146 g·mol-1; óleo viscoso marrom; GC-FID: tR = 11.7 min (Restek®); tR-enantiômeros = 11.7 e 12.5 min (Lipodex E.); EM (IE, 70 eV) m/z (abundância relativa %): 145 (3), 129 (9), 106 (100), 104 (31), 79 (62) 77 (45) 51 (17) IV – (ν max (cm-1); 3365, 3301, 3187,2211; RMN de 1H – (300,19 MHz, CDCl3) δ (ppm) 1,79-1,83 (sl, 2H, 2 NH), 2,59 – 2,76 (t, J = 6 Hz, 2H, H2), 4,31-4,38 (dd, J= 5,7 e 6 Hz 1H, H3), 7,28 – 7,42 (m, 5H, H5, H6, H7, H8 e H-9); RMN de 13C – (75,5 MHz, CDCl3) δ (ppm): 28,5 (CH2, C2), 52,7 (CH, C3), 117,9 (CN, C1), 125,9 (CH, C5 e C9), 128,3 (CH, C7), 128,9 (CH, C6 e C8), 142,1 (C0, C4) 3.2.5. Síntese do composto rac-3-amino-3-fenilpropanamida (rac-6)61 Em um balão de fundo redondo de 10,0 mL, adicionou-se rac-5 (48 mg; 0,328 mmol) e CH2Cl2 anidro (~ 1,3 mL; 1,729 g; 20 mmol). Após completa solubilização de rac-5, gotejou-se H2SO4 98% (558 μL; 1,027 g; 10 mmol) sob agitação magnética 41 suave em temperatura ambiente. O balão se encontrava hermeticamente vedado com septo. Em seguida, a solução reacional foi mantida sob agitação magnética vigorosa em temperatura ambiente por 4 horas. A reação foi monitorada por GC-FID. Adicionou-se NaOH 10 M a 0 ºC até pH 12. Extraiu-se a fase aquosa com AcOEt (3 x 10,0 mL) (30 mL; 27,06 g; 307 mmol). O pH foi corrigido a cada extração. As fases orgânicas foram combinadas e lavadas com solução saturada de cloreto de sódio (NaCl). Adicionou-se à fase orgânica MgSO4 anidro e procedeu-se à filtração por gravidade, utilizando papel de filtro pregueado. O solvente foi evaporado em rotaevaporador. Obteve-se um sólido branco com filme amarelado adsorvido. A faixa de fusão de 114-116 ºC. A conversão foi de 99% e o rendimento bruto de 51%. O produto não foi purificado. rac-3-amino-3-fenilpropanamida (rac-6). FM: C9H12N2O; MM: 164 g·mol-1; sólido branco; GC-FID: tR = 7.6 min (Restek®); tR- enantiômeros = 34.0 e 35.4 min (Hydrodex β-3P); EM (IE, 70 eV) m/z (abundância relativa %): 51 (15), 59 (17), 79 (36), 106 (100), 119 (61), 146 (7), 163 (1), 164 (1); IV – (ν max) (cm-1); 3382, 3281, 3062, 3028, 2923, 2852, 1650, 1642; RMN de 1H – (300,19 MHz, DMSO-d 6) δ (ppm): 2,28 - 2,42 (d, J = 6,9 Hz, 2H, 2NH [amina]), 2,48 – 3,48 (m, 2H), 4,13-4,18 (t, J = 6,7 Hz, 1H, H3), 6,77 (sl, 1H, 1NH [amida]), 7,13 - 7,64 (m, 7H, H5, H6, H7, H8 e H9); RMN de 13C – (75,5 MHz, DMSO-d 6) δ(ppm): 45,7 (CH2, C2), 53,0 (CH, C3), 126,7 (CH, C5 e C9), 126,9 (CH, C7), 128,5 (CH, C6 e C8), 146,9 (C0, C4), 173,2 (C0, C1) 3.3. Reações com enzimas isoladas, extratos enzimáticos e células íntegras 3.3.1. Procedimento geral para triagem das NHases Em um tubo do tipo Eppendorf de 2,0 mL, adicionou-se tampão fosfato de sódio (1,0 mL; 200 mM) contendo solução de elementos traços de Fe3+ e Co3+ na proporção 1000:1; tampão/solução traços) e 5 μL de enzima. A solução de elementos traços consiste na adição de CoCl2 · 6H2O ou FeCl2 ˑ 6H2O em água destilada (2 mg/500 mL). O tubo de Eppendorf foi colocado em banho de gelo sob luz natural por 1,5 horas. Em seguida, foi levado ao termomixer a 25 ºC e 1000 rpm onde permaneceu por 2 minutos para atingir a temperatura programada. Logo após, adicionou-se o substrato 42 1 ou rac-3 ou rac-5 (1 mg; 6,90; 6,80 e 6,85 mM, respectivamente) solubilizado em DMSO (100 μL; 110 mg; 1,4 mmol). O tubo de Eppendorf foi incubado nas condições reacionais acima por 24 horas. Após o término, a solução aquosa foi extraída com AcOEt (3 x 0,5 mL) (1,5 mL; 1,353 g; 15 mmol). As fases orgânicas foram combinadas, secas sob MgSO4 anidro e filtradas com algodão. Evaporou-se o solvente e suspendeu-se o produto contido no tubo com AcOEt ou EtOH grau HPLC. Analisou- se via GC-FID. 3.3.2. Procedimento geral para triagem de ω-TA (extratos enzimáticos) Em um tubo do tipo Eppendorf de 2,0 mL, adicionou-se o substrato 1 ou 2 (4.4 mg; 20 mM), DMSO (15 μL; 16,5 mg; 0,2 mmol), 1 mM PLP (15 μL de uma solução estoque 0,1 M) e isopropilamina (39 μL; 28 mg; 0,48 mmol). Em seguida, adicionou- se o extrato enzimático (preparado em tampão pH 7,5; 100 mM) q.s.p. 1,5 mL (~ 1,4 mL). Aferiu-se o pH e o mesmo estava em 12, sendo corrigido para 7 com HCl 4 M. Esta solução reacional foi incubada a 30 ºC, 850 rpm por 24 horas. Após o término, a solução reacional foi alcalinizada (pH 12) com solução de NaOH 4 M e extraída com AcOEt (2 x 1,5 mL) (3,0 mL; 2,706 g; 31 mmol). As fases orgânicas foram combinadas, secas sob MgSO4 anidro e filtradas com algodão. A reação foi analisada por GC-FID. 3.3.3. Procedimento geral para triagem de ω-TA (enzimas) Em um tubo do tipo Eppendorf de 2,0 mL, adicionou-se substrato 1 ou 2 (1,5 mg; 17 mM), DMSO (6 μL; 6,6 mg; 0,084 mmol), 0,5 mmol de PLP (7,5 μL de uma solução estoque 0,1M) e 150 mM de isopropilamina (0,112 mL de uma solução estoque 0,2M). Adicionou-se tampão fosfato de sódio pH 7,0 100 mM q.s.p 0,6 mL. O pH do meio foi corrigido para 7 com adição de HCl 4M. Em seguida adicionou-se 2 mg da enzima ω-TA. O tubo foi deixado sob agitação em termomixer a 30 °C e 850 rpm por 24 horas. Após as 24 horas, a reação foi centrifugada (12.000 rpm/4 min) e a fase aquosa alcalinizada até pH 12 com solução de NaOH 10M e extraída com AcOEt (4 x 0,6 mL). (2,4 mL; 2,16 mg; 24 mmol). As fases orgânicas foram combinadas, secas sob MgSO4 anidro, evaporadas em rotaevaporador sob pressão reduzida e o produto bruto suspendido em AcOEt grau HPLC e analisado via GC-FID. 43 3.3.4. Procedimento geral para triagem das KRED (microrganismos) Ao tubo de ensaio com ágar inclinado contendo os microrganismos Lysinibacillus boronitolerans, Bacillus cereus ou MLH 15 previamente crescidos em BOD por 24 horas a 28-29 ºC, adicionou-se 5 mL de água estéril em cada tubo de ensaio (7 tubos). Formou-se uma suspensão microbiana e esta foi adicionada em um erlenmeyer de 500 mL contendo 70 mL de meio NB. Após 24 horas, dividiu-se em duas partes o volume total contido neste erlenmeyer (~105 mL) e estes foram adicionados em dois erlenmeyers de 2000 mL contendo 400 mL de meio NB que foram levados para o agitador orbital a 28-29 ºC a 115 rpm onde os microrganismos cresceram por 3 dias. Em seguida, os mesmos foram centrifugados, o sobrenadante descartado e a biomassa suspendida com solução tampão fosfato de sódio pH 7; 200 mM, contendo 5 gramas de glicose/100 mL de tampão. Adicionou-se o substrato de acordo com a quantidade de biomassa obtida, seguindo uma proporção de 50 mL de tampão, 0,260 mmol de substrato e 5,0 gramas de biomassa úmida. O substrato foi solubilizado em DMSO (0,5 mmol/2 mL) e adicionado na solução tampão contendo o microrganismo. Todas essas etapas foram realizadas em atmosfera estéril, inclusive para retirada das alíquotas. A solução reacional foi novamente levada ao agitador orbital a 28-29 ºC e 115 rpm por 72 horas. Ao término da reação, a solução reacional foi centrifugada a 3200 rpm por 15 minutos. Adicionou-se NaCl(s) ao sobrenadante e o mesmo foi extraído com AcOEt (3 porções de seu volume). As fases orgânicas foram combinadas e secas sob MgSO4 anidro. Filtrou-se a fase orgânica por gravidade utilizando papel de filtro pregueado e evaporou-se o solvente no rotaevaporador sob pressão reduzida. A reação foi analisada por GC-FID. 3.3.5. Procedimento geral para triagem das KRED (enzimas) Inicialmente, o cofator NADH (0,5 mg; 0,75 mM) ou NADPH (0,5 mg; 0,67 mM)) foi adicionado em uma solução tampão de fosfato de sódio (1,0 mL; 100 mM; pH 7) contendo Mg2+ (1,0 mM). Todas as soluções preparadas foram utilizadas no máximo em 2 dias. A adição do cofator NADH ou NADPH foi realizada somente no momento da reação. Em um tubo de Eppendorf de 2,0 ml, o substrato 1 ou 2 (1,0 mg; 6,9 e 6,1 mM, respectivamente) foi adicionado seguido de álcool isopropílico (IPA; 50 μL; 39,3 mg; 0,65 mmol) e após completa solubilização do substrato, adicionou-se 500 μL de tampão. Este tubo foi deixado em termomixer (25 ºC; 1000 rpm) por 2 minutos. Em um segundo tubo de Eppendorf, a enzima KRED foi adicionada (1 μL) seguido de 500 44 μL de solução tampão. Este tubo foi mantido no termomixer (25 ºC; 1000 rpm) por 2 minutos. Em seguida, o conteúdo do tubo contendo a enzima foi adicionado sobre o substrato. O tubo de Eppendorf foi incubado na condição reacional descrita acima e após 24 horas foi centrifugado (12.000 rpm / 4 minutos) e a fase aquosa foi extraída com acetato de etila (3 x 500 μL) (1,5 mL; 1,353 g; 15 mmol). As fases orgânicas foram combinadas, secas sob MgSO4 anidro, filtradas com algodão e o solvente evaporado. O produto bruto extraído foi suspenso com AcOEt ou EtOH HPLC (para amidas) e a reação foi analisada em GC-FID. 3.3.6. Procedimento geral para as reações em cascata Em um tubo de Eppendorf de 2,0 mL, 1 adicionou-se o substrato 1 (1,0 mg; 6,9 mM) e IPA (50 μL; 39,3 mg; 0,65 mmol). Após a completa solubilização, foi adicionado tampão fosfato de sódio (500 μL) contendo todos os reagentes descritos anteriormente no tópico 3.3.5. mais solução traço de cobalto na mesma concentração e proporção previamente descrita no tópico 3.3.1. Este tubo foi mantido no termomixer (25 ºC; 1000 rpm) por 2 minutos. Em um segundo tubo Eppendorf de 2,0 mL, a enzima KRED recombinante (1 μL) foi adicionada seguido do tampão (400 μL). Este tubo foi mantido no termomixer (25 ºC; 1000 rpm) por 2 minutos. Em seguida, o tubo contendo a enzima foi adicionado sobre o substrato e mantido no termomixer nas mesmas condições acima por 8 horas. NHase E0257 (5,0 μL) foi adicionada em um terceiro tubo de Eppendorf contendo tampão (100 μL). Esta solução foi adicionada no tubo da reação e mantida no termomixer (25 ºC; 1000 rpm) por 2 horas. A seguir a solução reacional foi centrifugada (12.000 rpm / 4 minutos), e a fase aquosa saturada com NaCl(s). Extraiu-se a fase aquosa com AcOEt (3 x 500 μL) (1,5 mL; 1,353 g; 15 mmol). As fases orgânicas foram combinadas, secas sob MgSO4 anidro, filtradas com algodão e o solvente foi evaporado. O produto bruto extraído foi suspenso EtOH HPLC e a reação foi analisada em GC-FID. Para a reação em cascata simultânea, utilizou-se as mesmas condições da reação em cascata sequencial, entretanto, utilizou-se a NHase 016 e todas as enzimas foram adicionadas simultaneamente. 45 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Estratégia de trabalho A estratégia de trabalho para o desenvolvimento deste projeto, encontra-se descrita e resumida no fluxograma 1 abaixo: Fluxograma 1: Etapas para o desenvolvimento do projeto Os blocos construtores racêmicos foram sintetizados previamente pelos métodos sintéticos convencionais para serem utilizados como padrões nos processos biocatalíticos. Uma vez sintetizados, foram caracterizados e métodos cromatográficos quirais foram desenvolvidos para a separação dos enantiômeros dos padrões racêmicos com a finalidade de auxiliar nas análises e determinação dos ee dos processos biocatalíticos estereosseletivos. 4.2. Síntese, caracterização e desenvolvimento dos métodos cromatográficos dos padrões dos produtos de interesse A primeira etapa desta discussão tratará da síntese, caracterização e desenvolvimento dos métodos cromatográficos dos padrões dos produtos esperados pelos processos biocatalíticos. Síntese dos produtos esperados pelas reações biocatalisadas utilizando metodologias clássicas da química Caracterização dos produtos sintetizados utilizando RMN, GC-MS e IV Desenvolvimento de métodos cromatográficos quirais para separação dos enantiômeros dos produtos racêmicos obtidos a partir das metodologias clássicas da química Triagem de enzimas isoladas, microrganismos e extratos enzimáticos Análises das conversões e dos excessos enantioméricos das triagens Desenvolvimento das reações em cascata multienzimáticas Determinação da configuração absoluta dos produtos biocatalíticos 46 4.2.1. Síntese do composto 2 O composto 2 foi sintetizado via hidrólise ácida da nitrila catalisada por ácido sulfúrico (Esquema 10). A reação foi realizada baseando-se na metodologia de Gonzáles-Vera e colaboradores.61 A reação foi monitorada por CCD e GC-FID. Os resultados obtidos entre as sínteses realizadas não foram reprodutíveis. Em algumas sínteses a reação se completou em 6 horas. Porém, algumas vezes o tempo de reação foi de 24 horas e provavelmente atingia seu equilíbrio devido a conversão não ultrapassar 97%. Em outras vezes uma pequena quantidade de ácido carboxílico foi observada através das análises no GC-FID ou então ao ser revelada com o revelador químico verde de bromocresol. A formação do ácido carboxílico é um processo cineticamente favorecido.16,33,62 O melhor resultado obtido foi com conversão de 97% e rendimento de 40% após purificação por CCDP. O uso de ácidos e bases fortes para hidratação de nitrilas é problemático devido às condições drásticas e rendimentos moderados.63 Além disso, durante a etapa de neutralização, há grande formação de sal e contaminação do produto.63 A reação catalisada por ácido reque controle da temperatura e proporção de reagentes com a finalidade de evitar a formação de polímeros promovida pela característica exotérmica da hidratação.63 A síntese de amidas frequentemente apresenta degradação, racemização e difícil purificação devido a possibilidade de formação de ácido carboxílico.33 Consequentemente, apresenta significativo impacto ambiental.16 Esquema 10: Reação geral para hidrólise ácida da nitrila de 1 em 2 Fonte: Autor, 2018 47 O composto 2 foi caracterizado por RMN de 1H, 13C e DEPT 135, CG/EM e IV e comparados com a literatura.32 No espectro de RMN de 1H (Apêndice-Espectro A), observa-se um simpleto em 3,98 ppm referentes aos 2H, C-2. Em 5,70 e em 7,12 ppm, observa-se dois simpletos largos referentes aos hidrogênios ligados ao átomo de nitrogênio. Os deslocamentos são diferentes devido a deslocalização eletrônica por ressonância que ocorre entre o par de elétrons não ligantes do nitrogênio com o grupo carbonila, conferindo uma estrutura plana à molécula, deixando os hidrogênios em ambientes magneticamente diferentes. Entre 7,37-7,67 ppm há um multipleto integrando para três hidrogênios referentes ao anel aromático H6, H7 e H8 e em 7,96- 8,03 ppm há um segundo multipleto integrando para dois hidrogênios H5 e H9. Como há a possibilidade de ocorrer tautomerismo ceto-enólico, observa-se outros dois sinais quando a molécula está em sua forma enólica. Um simpleto em 5,56 ppm referente a 1H, C-2 e um simpleto em 14,2 ppm característico do hidrogênio da hidroxila -OH em na forma enólica. O espectro de massas (Apêndice-Espectro C) não apresentou o sinal do íon molecular, apenas os fragmentos característicos com m/z (%) 120 (35), 105 (100) e 77 (65). No espectro no IV (Apêndice-Espectro D) observa-se a presença de duas bandas de absorção: uma referente a amida primária em 3419 cm-1 e a outra em 3187 cm-1 referente a deformação axial O-H, devido a possibilidade de ocorrer equilíbrio ceto-enólico. Além dessas duas bandas, observa-se outras duas em 1675 cm-1 e 1632 cm-1, características do estiramento da ligação C=O. 4.2.2. Síntese do composto rac-3 O composto rac-3 foi obtido via redução da carbonila do substrato 1 utilizando borohidreto de sódio (NaBH4) (Esquema 11). Esta síntese foi baseada na metodologia descrita por Kamila e colaboradores14 e Coady e colaboradores.64 A reação foi monitorada por CCD e após 30 minutos de reação, todo material de partida havia sido consumido. Junto com o produto foi recuperado um sólido branco que pôde ser separado com papel de filtro pregueado. O rendimento desta reação foi de 84%. 48 Esquema 11: Reação geral para redução da carbonila de 1 em rac-3 Fonte: Autor, 2018 Desenvolveu-se um método cromatográfico na coluna aquiral para as análises de rotina para a separação do composto 1 e rac-3 (Figura 4). O tempo de retenção de 1 e rac-3 passou a ter uma diferença de 0,2 minutos. Figura 4: Cromatograma mostrando a separação dos compostos 1 e rac-3 utilizando a coluna Restek® (Coluna A) A estrutura do composto rac-3 foi confirmada pelas análises dos espectros no RMN de 1H, 13C e DEPT 135, CG-EM e IV e comparados com a literatura.64 No espectro de RMN de 1H (Apêndice-Espectro E), observa-se um dupleto em 2,40-2,53 ppm referente ao hidrogênio da hidroxila se acoplando com o hidrogênio de C-3 com J=3,3 Hz. Em 2,79- 2,82 ppm, observa-se um dupleto, integrando para dois 49 hidrogênios que são referentes aos hidrogênios diastereotópicos ligados ao H2 com J=6,2 Hz. Em 4,96-5,12 ppm observa-se um multipleto, acoplando com 1H-OH e H2, integrando para um hidrogênio ligado ao carbono assimétrico H3, com J=3,3 e 6,2 Hz. Por fim, em 7,28-7,41 ppm observa-se os multipleto referente aos hidrogênios do anel aromático, integrando para 5H. O espectro de massas (Apêndice-Espectro G) apresentou o sinal do íon molecular com m/z (%)147 (7) e, além desse, os fragmentos característicos com m/z (%) 129 (8), 107 (100), 105 (26), 79 (86) 77 (72) e 51 (27). No espectro no IV (Apêndice-Espectro H) observa-se a presença de uma banda de absorção característica de álcool em 3421 cm-1 relativa ao estiramento da ligação O-H com ligações de hidrogênio. Além dessa, observa-se a banda da nitrila em 2254 cm-1, características do estiramento da ligação CN. Uma vez caracterizado, desenvolveu-se um método cromatográfico na coluna quiral do GC-FID para a separação dos enantiômeros do composto racêmico (Figura 5). As atribuições dos enantiômeros em cada pico do cromatograma foram realizadas a partir dos ee e das análises de [𝑎]𝐷 21 das reações biocatalisadas e comparadas com a literatura.65 Figura 5: Cromatograma mostrando os sinais referentes aos enantiômeros do composto rac-3 utilizando a coluna quiral Lipodex E® (Coluna C) 50 4.2.3. Síntese do composto rac-4 O composto rac-4 foi sintetizado baseando-se na metodologia descrita por Khamal e colaboradores8 (Esquema 12). Não foi utilizado H2SO4 para a hidratação da nitrila do composto rac-3 para a obtenção de rac-4, visto que o ácido sulfúrico não é um catalisador quimiosseletivo e poderia reagir com os dois grupos funcionais do substrato, levando a formação do produto insaturado a partir da reação de desidratação de álcoois.14,64 A reação foi monitorada por GC-FID e após 6 horas reacionais verificou-se que todo material de partida havia sido consumido. Como observado por Wessjohann e colaboradores26, também visualizamos apenas um spot na placa de CCD e um pico intenso no GC-FID, entretanto, o produto bruto se apresentou como um sólido branco impregnado com um óleo viscoso amarelo. Provavelmente, uma pequena quantidade do DMSO utilizado como solvente na reação possa ter sido recuperado juntamente com o produto. Esquema 12: Reação geral para a hidratação da nitrila de rac-3 em rac-4 Fonte: Autor, 2018 Dessa forma, o rendimento do produto bruto excedeu ao teórico e, então, foi realizada purificação por CCDP. O rendimento foi de apenas 14%. Um inconveniente dessa reação é que, na etapa de extração, uma massa considerável do produto é perdida, devido à grande afinidade pela fase aquosa.26 O composto rac-4 foi caracterizado por RMN de 1H, 13C e DEPT 135, GC/MS e IV e comparado com a literatura.28 No espectro de RMN de 1H (Apêndice-Espectro I), observa-se um simpleto em 1,29 ppm referente ao H da hidroxila. Em 2,47-2,69 ppm observa-se um duplo dupleto duplo referente aos dois hidrogênios diastereotópicos ligados ao H2. Observa-se que 51 há um simpleto muito intenso em 4,88 ppm. É o deslocamento esperado para os dois hidrogênios ligados ao átomo de nitrogênio da amida, entretanto, é o mesmo deslocamento da água em metanol. Dessa forma, não foi possível integrar esses hidrogênios. Em 5,00 ppm há um duplo dupleto integrando para 1 hidrogênio H-3. Por fim, em 7,21-7,43 ppm há um multipleto integrando para os 5 hidrogênios do anel aromático. O espectro de massas (Apêndice-Espectro K) apresentou o sinal do íon molecular com m/z (%) 165 (31) e, além deste, os fragmentos característicos com m/z (%) 146 (69), 131 (29), 120 (20), 105 (61), 91 (10), 77 (100), 59 (95) e 51 (42). No espectro no IV (Apêndice-Espectro L) observa-se a presença de duas bandas de absorção característica de amida primária. As absorções são em 3378 e em 3301 cm- 1 relativas as deformações axiais assimétrica e simétrica de N-H, respectivamente. Além dessa, observa-se a banda da hidroxila em 3176 cm-1 fazendo ligação de hidrogênio intramolecular. Isso fica evidente devido a banda ser larga, pouco intensa e não há a banda aguda de hidroxila livre, isto é, que não faz ligação de hidrogênio. Essa absorção é relativa a deformação axial de O-H. Por fim, observa-se uma absorção em 1620 cm-1, característica da deformação axial da carbonila C=O. Após a caracterização do composto rac-4, desenvolveu-se um método cromatográfico na coluna quiral do CG-DIC para a separação dos enantiômeros do composto racêmico (Figura 6). A determinação dos sinais para cada enantiômero no cromatograma pôde ser realizada a partir do ee do produto obtido nas reações em cascata multienzimáticas e comparados com a literatura.13 Além disso, o enantiômero (S)-4 era esperado, uma vez que a estereosseletividade da reação é determinada pela enzima KRED e as enzimas NHases não haviam apresentado seletividade. 52 Figura 6: Cromatograma mostrando os picos referentes aos enantiômeros do composto rac-4 utilizando a coluna quiral Lipodex E® (Coluna C) 4.2.4. Síntese do composto rac-5 Inicialmente, utilizou-se a metodologia proposta por Miriyala e colaboradores66 para a síntese one-pot de rac-5. Os autores utilizaram o substrato 3-oxo-3- fenilpropano. Porém, para o substrato 1 obteve-se conversão de apenas 6% para o produto 3-amino-3-fenilacrilonitrila após 6 horas, provavelmente devido as diferenças de reatividade entres os substratos. Então, uma nova metodologia foi utilizada para realizar a aminação redutiva da carbonila do substrato 1 em duas etapas (Esquema 13). Na 1ª etapa ocorre a formação da imina e na 2ª etapa sua redução. Então, para a obtenção do intermediário 3-amino-3-fenilacrilonitrila, utilizou-se umas das metodologias propostas por Zhao e colaboradores67 que utilizaram o substrato benzoilacetato de etila e na 2ª etapa a reação procede com a metodologia descrita por Chhiba e colaboradores68, utilizando o substrato 3-amino-3- fenilacrilonitrila. Esquema 13: Reação geral para a aminação redutiva da carbonila de 1 em rac-5 Fonte: Autor, 2018 53 Na 1º etapa da síntese, a reação foi monitorada por GC-FID e, após 4,5 horas de reação, todo material de partida havia sido consumido, gerando o composto 3- amino-3-fenilacrilonitrila com 94% de rendimento. Procedeu-se para a 2ª etapa da reação, reduzindo a ligação dupla para a obtenção da amina primária. Nesta etapa, a reação foi monitorada por CCD, utilizando p-anisaldeído como revelador químico, pois o substrato 3-amino-3-fenilacrilonitrila é revelado com grande intensidade e o produto rac-5 não é revelado. Após 3 horas de reação, verificou-se que todo material de partida havia sido consumido. O rendimento foi de 89%. Para este composto também foi necessário o desenvolvimento um método cromatográfico na coluna aquiral para as análises de rotina para a separação do composto 1 e rac-5 (Figura 7). O tempo de retenção de 1 e rac-5 passou a ter uma diferença de 0,6 minutos. Figura 7: Perfil cromatográfico da separação dos compostos 1 e rac-5 utilizando a coluna Restek® (Coluna A) A estrutura molecular do intermediário foi confirmada pelas análises dos espectros de RMN de 1H, 13C e DEPT 135, CG-EM e IV e comparados com a literatura.68 No espectro de RMN de 1H (Apêndice-Espectro M) observa-se um simpleto em 4,25 ppm referente a 1H, H2. De 4,70 a 5,20 ppm, observa-se um simpleto largo, integrando para dois hidrogênios que são referentes aos hidrogênios 54 ligados ao átomo de nitrogênio. E em 7,37- 7,54 ppm, observa-se um multipleto, integrando para os 5 hidrogênios aromáticos. O espectro de massas (Apêndice-Espectro O) apresentou o sinal do íon molecular com m/z (%) 144 (100) e, além desse, os fragmentos característicos com m/z (%) 129 (22), 117 (98), 104 (40), 89 (21), 77 (44) 51 (47). No espectro no IV (Apêndice-Espectro P) observa-se a presença de duas bandas de absorção referentes ao estiramento da ligação NH2 em 3444 e 3353 cm-1. Além dessas bandas, há uma harmônica em 3240 cm-1 relacionada ao dobramento da ligação N-H em 1626 cm-1. E em 2182 cm-1 observa-se o estiramento da ligação CN da nitrila. E as mesmas técnicas foram utilizadas para a elucidação estrutural do composto rac-5 e comparada com a literatura.68 No espectro de RMN de 1H (Apêndice-Espectro Q) observa-se um simpleto largo em 1,79-1,83 ppm integrando para 2 hidrogênios ligados ao átomo de nitrogênio. Em 2,59-2,77 ppm observa-se um multipleto, integrando os dois prótons diastereotópicos H-2. Em 4,30-4,39 ppm observa-se um duplo dubleto, integrando 1H ligado ao carbono assimétrico H-3. Por fim, em 7,28- 7,43 ppm há um multipleto integrando para cinco hidrogênios do anel aromático. O espectro de massas (Apêndice-Espectro S) não apresentou o sinal do íon molecular apenas os fragmentos característicos com m/z (%) 145 (3), 129 (9), 106 (100), 104 (31), 79 (62) 77 (45) e 51(17). No espectro no IV (Apêndice-Espectro T) observa-se a presença de duas bandas de absorção referentes ao estiramento da ligação NH2 em 3365 e 3301 cm-1. Além dessas bandas, há uma harmônica em 3187 cm-1 relacionada ao dobramento da ligação N-H em 1593 cm-1. E em 2211 cm-1 observa-se o estiramento da ligação CN da nitrila. Uma vez caracterizado, desenvolveu-se um método cromatográfico na coluna quiral do GC-FID para a separação dos enantiômeros do composto racêmico (Figura 8). As atribuições dos enantiômeros deste composto do cromatograma não puderam ser realizadas, pois não obtivemos resultados com as enzimas ω-TA. Portanto, as estruturas no cromatograma abaixo foram colocadas de forma aleatória. 55 Figura 8: Perfil cromatográfico para a separação dos enantiômeros do composto rac- 5 utilizando a coluna Lipodex E® (Coluna C) 4.2.5. Síntese do composto rac-6 Novamente, utilizou-se a metodologia de Gonzáles-Vera e colaboradores55 para a hidrólise ácida da nitrila (Esquema 14). A reação foi monitorada por GC-FID e, após 4 horas de reação, a conversão de rac-5 em rac-6 era de aproximadamente 99%. O rendimento bruto foi de 51%. O mesmo inconveniente observado durante a extração do composto rac-4 ocorreu com o composto rac-6. Esse composto também possui grande afinidade pela fase aquosa e, após a realização de duas extrações múltiplas consecutivas, o rendimento foi de 51%. Esquema 14: Reação geral para a hidratação da nitrila de rac-5 em rac-6 Fonte: Autor, 2018 56 Vale ressaltar que a cada extração, o pH tende a tornar-se menos alcalino, ficando em torno de 8-9. Sendo assim, é preciso verificar e corrigir o pH para 12, pois é o pH normalmente utilizado para a extração de aminas primárias. Após extração, uma amostra foi analisada no GC-FID e a pureza era de 99,2%. O composto rac-6 foi caracterizado por RMN de 1H, 13C e DEPT 135, GC-MS e IV e comparado com a literatura.68 No espectro de RMN de 1H (Apêndice-Espectro U), observa-se um dupleto em 2,28 - 2,42 ppm com constante de acoplamento de 6,9 Hz integrando para os dois hidrogênios diastereotópicos. Em torno de 2,5 - 3,5 ppm observa um simpleto muito intenso e um outro sinal largo ao lado. Devido ao DMSO ser um solvente bastante higroscópio, provavelmente uma quantidade de água foi absorvida pelo DMSO e acabou alargando e/ou sobrepondo outros sinais do composto rac-6. Em 4,13-4,18 ppm observa-se um tripleto com constante de acoplamento de 6,9 Hz referente ao hidrogênio ligado ao centro estereogênico H-3. Em 6,77 ppm, observa-se que há um pico largo, integrando para um hidrogênio. Este hidrogênio refere-se à ligação do átomo de hidrogênio com o nitrogênio da amina primária. Por fim, em 7,13 - 7,64 ppm há um multipleto integrando para 7 hidrogênios. Teoricamente, esperava-se encontrar uma integração para 5 hidrogênios. Talvez, a pequena quantidade de impureza (>1%) da amostra ou do solvente tenha contribuído para o valor desta integral. Porém, é possível afirmar que o composto rac-6 foi formado pelo fato de que o produto obtido durante a triagem com as NHases, utilizando o substrato rac-5, possui exatamente o mesmo tempo de retenção do produto da catálise ácida utilizando ácido sulfúrico. Além disso, a enzima utilizada está em sua forma isolada e comumente se apresenta como um reagente de elevada quimiosseletividade. O espectro de massas (Apêndice-Espectro X) apresentou o pico do íon molecular com m/z (%) 164 (1) e, além desse, os fragmentos característicos com m/z (%) 146 (7), 131 (2), 119 (61), 106 (100), 79 (37), 59 (17), 51 (15). No espectro no IV (Apêndice-Espectro W) observa-se em 3337 cm-1 a presença de uma banda aguda referente a deformação axial de N-H associada a ligação de hidrogênio e em 3197 cm- 1 uma banda larga e pouca intensa característica da deformação axial de N-H. Além dessas, há duas bandas em 3028 e 3003 cm-1 típicas de da deformação axial de N-H de amina primária. Em 1650 e 1616 cm-1, observa-se duas bandas de absorção, sendo 57 a primeira banda referente a deformação axial de C=O e a segunda de deformação angular de N-H. Para o composto rac-6 o método cromatográfico quiral para separação dos enantiômeros foi desenvolvido na coluna Hydrodex® β-3P (Figura 9). As estruturas moleculares dos enantiômeros do composto rac-6 estão de forma aleatória no cromatograma, pois este composto não pôde ser obtido em sua forma enantiomericamente pura para que uma análise no polarímetro pudesse ser realizada e comparada com a literatura. Figura 9: Cromatograma mostrando os picos referentes aos enantiômeros do composto rac-6 utilizando a coluna quiral Hydrodex® β-3P (Coluna B) 58 4.3. Triagem das enzimas NHases Foram realizadas triagens com 13 NHases disponíveis comercialmente (Prozomix®) frente aos substratos 1, rac-3 e rac-5. Utilizou-se a metodologia descrita por Amaral.69 A reação geral da triagem encontra-se no Esquema 15. Esquema 15: Reação geral de hidratação da nitrila catalisada por NHase Condições da reação: substrato 1, rac-3 ou rac-5 (1 mg; 7 μM), DMSO (100 μL), tampão fosfato de sódio (PBS) (1,0 mL), enzima (5 μL). Para mais detalhes, veja a seção de matérias e métodos. a As conversões foram determinadas pela análise no GC-FID. Analisando a Tabela 2 abaixo contendo o resultado das triagens com NHases, verifica-se que 6 enzimas (NHase 003, NHase 011, NHase 014, NHase 016, NHase E0257 e NHase E0259) catalisaram a hidratação da nitrila do composto 1 no composto 2 com conversões >99% (Entrada 1). Para o substrato rac-3, 9 enzimas (NHase 003, NHase 004, NHase 008, NHase 011, NHase 014, NHase 016, NHase 018, NHase E0257 e NHase E0259) catalisaram a conversão na amida correspondente rac-4 (Entrada 2). Vale a pena ressaltar quimiosseletividade da reação em que há um grupo nitrila na presença do grupo hidroxila que pode ser eliminado sob catálise ácida ou básica levando a formação do produto insaturado 3-fenilprop-2-enamida. Interessante notar o aumento do potencial catalítico das enzimas com o substrato rac-3. Por exemplo, a atividade da NHase 016 frente aos substratos 1 e rac-3 foi de 44 e 97%, respectivamente. Algumas enzimas como o NHase 004, 008 e 018 cujas conversões foram aproximadamente 90% com o substrato 1, atingiram conversões >99% com 59 rac-3. Talvez, a possibilidade do grupo hidroxila fazer uma nova ligação de hidrogênio, possa estabilizar o complexo enzima-substrato durante o estado de transição. Tabela 2: Resultados das triagens das NHases com os substratos 1, rac-3 e rac-5 Em relação ao substrato rac-5, somente a NHase 018 converteu >99% em rac- 6. Interessante notar que as NHases 003 e 004, que apresentaram elevadas conversões com os substratos 1 e rac-3, não mostraram atividade alguma frente ao substrato rac-5. As atividades das NHases 011, 014 e 015 reduziram consideravelmente frente a este substrato. Contudo, são resultados muito promissores e atrativos, visto que uma importante conversão de grupos funcionais está sendo realizada em condições muito brandas de reação e que dificilmente é obtida pelos métodos sintéticos convencionais que requerem condições drásticas.