UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA ANIMAL MANIPULAÇÃO DO SÊMEN DE GARANHÕES COM DIFERENTES GRAUS DE HEMOSPERMIA Luiz Roberto Pena de Andrade Junior Botucatu – SP 22/09/2017 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA ANIMAL MANIPULAÇÃO DO SÊMEN DE GARANHÕES COM DIFERENTES GRAUS DE HEMOSPERMIA LUIZ ROBERTO PENA DE ANDRADE JUNIOR Dissertação apresentada a Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de mestre em Biotecnologia Animal, área Reprodução Animal. Orientador: Prof. Titular Frederico Ozanam Papa Botucatu – SP Setembro/2017 iv Nome do autor: Luiz Roberto Pena de Andrade Junior Título: MANIPULAÇÃO DO SÊMEN DE GARANHÕES COM DIFERENTES GRAUS DE HEMOSPERMIA BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Frederico Ozanam Papa Presidente e orientador Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ - UNESP - Botucatu /SP Prof. Dr. José Antônio Dell'Aqua Junior Membro Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ – UNESP - Botucatu /SP Dr. Márcio Teoro do Carmo Membro Veterinário Autônomo - Botucatu /SP Data da Defesa: 22 de setembro de 2017 v AGRADECIMENTOS A Deus por sua proteção durante todo o meu caminho até aqui percorrido. A minha família, minha base de sustentação, meu pai Luiz Roberto, minha mãe Adalgisa e minha irmã Carolina, mesmo estando distantes durante toda minha caminhada, foram meus grandes incentivadores. Ao meu HERÓI, meu pai, médico veterinário que sempre foi meus olhos, mãos e acima de tudo minha alma. A minha namorada Camila, por todo o carinho a mim depositado. Ao grande mestre e “pai” Prof. Papa, que me acolheu e sempre esteve presente durante todo o desenvolvimento do nosso projeto. A Prof. Fabiana pois, sem seus auxílios durante toda minha carreira acadêmica nada disso teria acontecido. Ao Prof. Nereu pelos conselhos, abraços e minutos de conversa que fizeram diferença para toda minha vida, ao Prof. Marco Alvarenga pelas oportunidades, considerações e conselhos, ao Prof. José Dell’Aqua pelas horas de discussão e incentivo. A todos os professores do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária pelos ensinamentos. Aos funcionários do departamento pelo apoio durante a execução do projeto, meu muito obrigado para Edilson, Edvaldo (cabeça), Camila Dell’Aqua, Felipe, D. Raquel. A minha família Botucatuense Troncarelli pelo amor, por todos os momentos aqui vividos e apoio concedido. Aos meus grandes amigos Luis, Endrigo, Sidnei, Bertiny, Felipe Dalanezi, Felipe Hartwig, João Alexandre, Gabriel Leite, Lorenzo, Patricia Papa, Priscilla Guasti, Marcio Teoro, Lucas Troncarelli, pela união e força para execução do projeto e desenvolvimento de um trabalho em equipe, entre irmãos. À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Botucatu-SP, pela oportunidade de cursar o Mestrado. Agradeço aos haras parceiros que contribuíram para execução deste projeto: Haras Itapuã e Central Lub Breeding. Finalizo agradecendo a todos que de alguma forma contribuíram para mais esta etapa de minha vida. vi RESUMO ANDRADE JUNIOR, L.R.P. MANIPULAÇÃO DO SÊMEN DE GARANHÕES COM DIFERENTES GRAUS DE HEMOSPERMIA . Botucatu – SP. 2017, p.44 Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista. Métodos de processamento espermático são rotineiramente utilizados para otimização do sêmen de garanhões. As biotecnologias aplicadas a reprodução permitem que animais geneticamente superiores disseminem suas características. Apesar disso, mesmo em garanhões clinicamente sadios, o sêmen criopreservado possui taxas de fertilidade inferiores quando comparado ao sêmen fresco, em decorrência do estresse químico e físico gerados pela preservação através do frio. Tal, condição pode ser intensificada em animais que apresentam alterações no trato reprodutivo que comprometam a qualidade seminal, como por exemplo, a presença de sangue no ejaculado, denominado hemospermia. Esta afecção geralmente é observada em decorrência de lesões na uretra, processo uretral, pênis e vesícula seminal. O efeito dos componentes sanguíneos sobre a qualidade do sêmen ainda não está bem estabelecido. A manipulação do sêmen por meio da centrifugação com gradientes de densidade além de proporcionar a seleção das células espermáticas, possivelmente permite a separação das hemácias do ejaculado em casos de hemospermia. Em virtude da escassez de informações sobre a viabilidade do sêmen na presença do sangue, visto que os ejaculados com quadro de hemospermia são descartados e a possibilidade de separar as hemácias do ejaculado apresentam dificuldades no aproveitamento do sêmen, mais estudos são necessários acerca do assunto para minimizar as dúvidas da utilização ou não do ejaculado. Palavras-chave: equino, hemospermia, coloide, fertilidade vii ABSTRACT ANDRADE JUNIOR, L.R.P. MANIPULATION OF STALLIONS SEMEN WITH DIFFERENT DEGREES OF HEMOSPERMIA - Botucatu – SP. 2017, p.51 Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista. Sperm processing methods are routinely used for stall optimization of stallions. Biotechnology applied to reproduction allows genetically superior in animals to be better harvested, to disseminate their characteristics through generations. Despite this, even in clinically healthy stallions, cryopreserved semen has lower fertility rates when compared to fresh semen, due to the stress generated by cryopreservation. Such a condition can be intensified in animals that present pathologies in the reproductive tract that compromise seminal quality, such as the presence of blood in the ejaculate, called hemospermia. This condition is usually seen as a result of injuries to the urethra, urethral process or penis. It is unknown what amount of blood in an ejaculate leads to subfertility. The manipulation of semen by centrifugation with density gradients in addition to providing the selection of the spermatic cells possibly allows the separation of the red blood cells from the ejaculate in cases of hemospermia. Due to the scarcity of information on the viability of semen in the presence of blood and the possibility of separating red blood cells from ejaculate more studies are needed on the subject. Keywords: equine, hemospermia, colloid, fertility viii LISTA DE FIGURAS FIGURA 1- Anatomia do pênis do garanhão...............................................................10 FIGURA 2- Esquematização do tratamento de fístula uretral através de cauterização química............................................................................................................................17 ix SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ......................................................................... 11 2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................... 12 2.1. Anatomia do sistema reprodutor do macho .......................................................... 12 2.2. Anatomofisiologia da célula espermática ............................................................. 14 2.3. Hemospermia em garanhões ............................................................................... 15 2.3.1. Etiopatogenia ................................................................................................. 16 2.3.2. Sinais Clínicos ............................................................................................... 17 2.3.3. Diagnóstico .................................................................................................... 17 2.3.3.1. Ultrassonografia ...................................................................................... 18 2.3.3.2. Endoscopia ............................................................................................. 18 2.3.3.3. Coleta fracionada .................................................................................... 18 2.3.4. Tratamentos ................................................................................................... 19 2.3.5. Influência do sangue na qualidade do sêmen equino .................................... 21 2.4. Separação espermática por gradiente de densidade ........................................... 22 2.4.1. Manipulação do sêmen na presença de sangue ........................................... 23 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 24 HIPÓTESE ..................................................................................................................... 33 OBJETIVOS ................................................................................................................... 33 ARTIGO I – Hemospermia em garanhões ..................................................................... 35 ARTIGO II- Fertilidade do sêmen de garanhões com hemospermia .............................. 50 CAPÍTULO 1 11 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA O rebanho de equinos do Brasil está classificado como sendo o quarto maior do mundo, estando atrás apenas dos Estados Unidos, China e México, e movimenta anualmente mais de R$ 7,0 bilhões e 642 mil empregos (GUERRA, 2015). Há mais de meio século as biotecnologias de criopreservação do sêmen de bovinos são utilizadas comercialmente com êxito, proporcionando um grande avanço na espécie neste quesito. Na reprodução de equinos a seleção genética relacionada à qualidade dos espermatozoides, em especial, resistência destes ao processo de refrigeração e congelação, esteve ausente durante anos (AVANZI et al., 2011). Desta forma, faz-se necessário o aprimoramento das biotecnologias aplicadas ao sêmen do garanhão, a exemplo refrigeração e congelação, de modo a promover um avanço para equinocultura, otimizando a qualidade do ejaculado dos garanhões. Na espécie equina a biotecnologia mais utilizada é a refrigeração, porém o uso do sêmen congelado vem crescendo cada vez mais, proporcionando a disseminação do material genético de animais superiores, sem interferência de localização, além de preservar as células espermáticas por tempo indeterminado (MILLER, 2008). Entretanto, durante o processo de criopreservação os espermatozoides sofrem danos em decorrência da preservação pelo frio, situação esta agravada em garanhões que possuam alguma enfermidade no trato reprodutivo, como a hemospermia, que é caracterizada pela presença de sangue no ejaculado. As causas de hemospermia em garanhões estão relacionadas a presença de lesões no trato reprodutivo masculino, desde o epidídimo até o processo uretral. Lesões no processo uretral e uretra, e as enfermidades de carcinoma de células escamosas e vesiculite seminal podem ser apontadas como principais causas de hemospermia. A idade em que os animais apresentam o quadro clínico pode ser variável (MCKINNON, 1992). A presença de hemácias no ejaculado possivelmente não afetaria a cinética e morfologia espermática, no entanto, há redução da fertilidade de garanhões com hemospermia (TURNER et al., 2011). Nos casos de garanhões que apresentam alto índice de células morfologicamente anormais é necessário o uso de biotecnologias que proporcionem 12 uma maximização das características seminais, a fim de obter resultados satisfatórios no momento da inseminação artificial nas éguas. Um protocolo utilizado por Miles et al. (2013), envolve a utilização do Equipure®, uma sílica como gradiente de seleção, que permite a separação de espermatozoides levando em consideração sua baixa motilidade, obtendo após a centrifugação uma alta taxa de espermatozoides móveis. Desta forma a utilização de gradientes de densidade seria uma opção para permitir a separação de hemácias do ejaculado em casos de hemospermia, uma vez que a densidade dos eritrócitos (1,07 gr/cm3) e espermatozoides (1,22 gr/cm3) sejam diferentes e possivelmente o desenvolvimento de um gradiente com densidade 1,15 gr/cm3 permita a sedimentação das células vermelhas acima e a passagem dos espermatozoides. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Anatomia do sistema reprodutor do macho Para a formação e deposição do sêmen no trato reprodutor da fêmea é necessário uma interação entre as estruturas anatômicas do sistema reprodutor masculino (KLEIN, 2014). Dentre as partes que o compõe estão um par de testículos que se encontram dentro da bolsa testicular, músculo cremaster, epidídimos, ductos deferentes, pênis e glândulas sexuais acessórias compostas por ampolas dos ductos deferentes, vesículas seminais, próstata e bulbouretrais (MCKINNON; VOSS, 1992; KLEIN, 2014). O pênis ou órgão copulador no garanhão possui a particularidade de ser do tipo músculo cavernoso, dividido em base, corpo e glande (AMANN & GRAHAM, 1993). Quando em ereção os espaços cavernosos, como corpo esponjoso da glande, corpo esponjoso do pênis, que envolve a uretra, aumentam de volume devido ao preenchimento por sangue carreado pelos estímulos nervosos através das vias eferentes dos ramos arteriais do pudendo e obturador (figura 1) (KLEIN, 2014; SAMPER, 2009; HAFEZ, 2004). 13 Figura 1. a: Anatomia do pênis do garanhão. b: Corte transversal do pênis do garanhão. (adaptado de RIEGEL & HAKOLA , 2004) Os testículos são as gônadas masculinas, compostos pelo parênquima testicular formado por tecido intersticial (células de Leydig, vasos sanguíneos e linfáticos, tecido conjuntivo e nervos), túbulos seminíferos e “rete testis” (SENGER, 2005). As células de Sertoli são encontradas no lúmen dos túbulos seminíferos, responsáveis pela espermatogênese e estimuladas pela ação do hormônio folículo estimulante (FSH) estas são conectadas pelas junções gap formando a barreira hematotesticular (SENGER, 2005; KLEIN, 2014). As células espermáticas ao atingirem a cabeça do epidídimo, são encaminhadas para o corpo e posteriormente cauda do epidídimo por contrações do músculo liso. No epidídimo, as células são armazenadas e adquirem sua capacidade de fertilizar (MCKINNON; VOSS, 1992; KLEIN, 2014). Durante o processo de ejaculação, os espermatozoides passam pelos ductos deferentes que desembocam na uretra pélvica, sendo assim, os mesmos serão eliminados juntamente com as secreções das glândulas sexuais acessórias durante a ejaculação (KLEIN, 2014). 14 O conjunto de glândulas sexuais acessórias é composto por ampola do ducto deferente, vesículas seminais, próstata e bulbouretrais e são responsáveis pela produção de fluido que será eliminado juntamente com os espermatozoides durante a ejaculação (MCKINNON; VOSS, 1992). A ligação entre bexiga e processo uretral é denominado de uretra, na qual é revestida pelo músculo bulboesponjoso, e através de suas contrações irá conduzir a urina bem como o sêmen durante a ejaculação (ENGLAND, 2005). 2.2. Anatomofisiologia da célula espermática O espermatozoide é uma célula altamente especializada com função de fertilizar e transferir o genoma masculino (VARNER et al., 2015). Na espécie equina a cabeça do espermatozoide possui formato oval e alongado, é responsável pelo armazenamento do material genético possui no seu interior a cromatina condensada composta de ácido desoxirribonucleico (DNA) (GADELLA et al., 2001; TOSHIMORI; ITO, 2003; RUIZ-PESINI et al., 2007). O acrossoma consiste em revestimento de camada dupla responsável pela penetração do espermatozoide no oócito pela liberação de enzimas hidrolíticas. Na espécie equina, o acrossoma corresponde a 2/3 da dimensão da cabeça do espermatozoide (BRITO, 2007; VARNER et al., 2015). A cauda é responsável pelo movimento da célula, e é dividida em peça principal e terminal. Sua porção inicial é composta pela bainha fibrosa na qual envolve 9 fibras densas, 9 pares de microtúbulos periféricos conectados por dineínas e um par central de microtúbulos. O movimento da célula é gerado pelo deslocamento dos microtúbulos, desencadeado pelo consumo energético das dineínas, energia esta gerada pela hidrólise da adenosina trifosfato (ATP) (BRITO, 2007; RUIZ-PESINI et al., 2007). A peça intermediária é responsável pela produção de energia para movimentação da célula espermática, e estruturalmente é semelhante a peça principal da cauda se diferenciando apenas pela ausência da bainha fibrosa e na presença de uma bainha mitocondrial, que contém mitocôndrias como unidades formadoras de energia (GADELLA et al., 2001; VARNER et al., 2015). 15 A célula espermática possui uma membrana que a reveste completamente (DOWSETT et al., 1984; PESCH; BERGMANN, 2006; VARNER et al., 2015), que dispõe de uma bicamada fosfolipídica, composta por ácidos graxos saturados e insaturados unidos a grupamentos fosfato (ROBERTSON, 1981). Esta disposição permite as células uma extremidade polar hidrofílica, assim como, um centro polar hidrofóbico, conferindo uma impermeabilidade à maioria dos solutos polares (OLIVEIRA et al., 2013; NELSON; COX, 2014). As proteínas presentes nas membranas podem ser integrais ou periféricas, e desempenham algumas funções tais como, transporte de substâncias entre meio interno e externo, atividade metabólica com função enzimática, reconhecimento celular e permitem ligações entre as células (ROBERTSON, 1981; OLIVEIRA et al., 2013). Num contexto geral, a membrana plasmática é responsável pela manutenção da homeostase celular e suas organelas, requisito essencial para a sobrevivência e manutenção do potencial de fertilização das células espermáticas, sendo a integridade funcional das membranas dos espermatozoides considerada imprescindível para os processos de capacitação, reação acrossomal e adesão ao oócito (FLESCH; GADELLA, 2000). 2.3. Hemospermia em garanhões A hemospermia é definida como presença de sangue no ejaculado e é consequência de uma afecção originada de qualquer local do trato reprodutor masculino (TURNER et al., 2016). A origem do sangue no sêmen dos garanhões pode se apresentar em diversos locais, comumente decorrente das lesões do processo uretral, uretra e em casos de vesiculite seminal crônica levando aumento da vascularização da glândula devido ao processo inflamatório e, consequentemente no momento da ejaculação, haverá presença de sangue (TURNER et al., 2011). Apesar de casos de hemospermia não serem usuais, esta enfermidade tem sido relatada por diversos autores (BEDFORD et al., 2000; ANDRADE JR et al., 2016; TURNER et al., 2016). 16 2.3.1. Etiopatogenia Para uma avaliação de um garanhão, ou seja, realização de um exame andrológico afim de diagnosticar alguma enfermidade, é necessário que se saiba a localização, forma e tamanho de cada órgão do sistema reprodutor do garanhão (SAMPER & TIBARY, 2006). Em alguns casos há comunicação entre os corpos esponjosos do pênis e o lúmen uretral no momento da ejaculação o sangue será transferido para a uretra e liberado juntamente ao sêmen (SCHUMACHER et al., 1995). As principais causas de hemospermia incluem epididimite, vesiculite seminal, fissuras no processo uretral, na glande do pênis, fístulas uretrais, estenose uretral, neoplasias, lesões provocadas pelo Habronema spp e obstrução das ampolas dos ductos deferentes (BLANCHARD, 1987; SOJKA et al., 1985; BEDFORD et al., 2000). Dentre os locais mais comuns para ocorrência de lesões traumáticas destaca-se o processo uretral principalmente no momento da cópula, na qual pode ocorrer laceração do mesmo pelo fio de crina da cauda da fêmea (VARNER et al., 2000). Animais que possuem lesões provocadas por habronemose cutânea apresentam um quadro secundário de processo inflamatório principalmente na região da glande do pênis, o que propicia o aumento da vascularização durante a ejaculação e a eliminação de sangue no ejaculado de garanhões (LOVE et al., 1992). Em casos de obstrução das ampolas dos ductos deferentes, a presença do sangue no ejaculado pode ser subsequente à desobstrução das glândulas podendo ser resultado de lesão do órgão (MCKINNON, 1992). As causas infecciosas de hemospermia são: vesiculite seminal bacteriana, uretrite e epididimite (VARNER et al., 1991; LOVE et al., 1992; VOSS & PICKETT, 1975). Essas enfermidades podem levar a lesões ulcerativas da pele do pênis e causar sangramentos durante a cópula, sendo os agentes infecciosos mais comumente encontrados em casos de uretrite e vesiculite seminal bacteriana: Streptococcus spp, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa (SULLINS et al., 1988). Além disso o Herpesvírus equino pode provocar lesões na superfície da pele do pênis e sangrar facilmente durante a cópula ou coleta do sêmen com vagina artificial (GALOSI et al., 1998). 17 2.3.2. Sinais Clínicos A hemospermia é consequencia de alguma enfermidade do trato reprodutor do garanhão e para determinar a causa é necessário que se utilize ferramentas que permitam investigar todas as prováveis suspeitas. Na sua grande maioria os garanhões não apresentam dor durante a ereção e/ou na ejaculação (SULLINS et al., 1988), entretanto em alguns casos de vesiculite seminal podem ocorrer distúrbios ejaculatórios (SANCLER-SILVA, 2014). A gravidade da lesão depende da causa inicial, e a presença de sangue pode variar entre os ejaculados, sendo assim, há a necessidade de múltiplas coletas de sêmen para detectar o problema (SCHUMACHER et al., 1995). Desta forma, o tempo de avaliação do garanhão deve ser levado em consideração, uma vez que animais que se encontram em repouso e/ou descanso sexual podem mascarar a alteração devido à ausência de sangue nas primeiras ejaculações, sendo necessárias coletas repetidas em um intervalo curto de dias (TURNER, 2011). 2.3.3. Diagnóstico Caso haja suspeita de hemospermia o sêmen deverá ser coletado por vagina artificial e examinado de acordo com a coloração. Tanto a hemospermia severa, como a moderada, são diagnosticadas pelo aspecto da amostra, entretanto para hemospermia leve é necessário um exame microscópico para identificar a presença de células vermelhas entremeadas às células espermáticas. Devido a homogeneidade entre as células espermáticas e hemácias é necessário realizar uma coloração descrita por (SEGABINAZZI et al., 2015) para identificação das hemácias nos ejaculado. 18 2.3.3.1. Ultrassonografia Quando as lesões externas não são identificadas como fonte do sangramento é necessário lançar mão de técnicas de diagnóstico que permitam a visualização do trato reprodutor masculino interno (TURNER, 2011). A palpação e a ultrassonografia dos testículos, epidídimo e funículo espermático podem revelar importantes alterações nos órgãos em questão (MALMGREN ; SUSSEMILCH, 1992). Do mesmo modo, a palpação transretal e a ultrassonografia permitem um exame profundo das glândulas sexuais acessórias e identificação de possíveis alterações, como por exemplo obstrução das glândulas ampolares, assim como processo inflamatório nas glândulas vesiculares (BLANCHARD & VARNER,1992). 2.3.3.2. Endoscopia Videoendoscópios flexíveis ou de fibra óptica podem ser utilizados para exame completo do trato urogenital de garanhões (TIBARY, 2007; SCHUMACHER & VARNER, 2008; CHENIER, 2009; MENZIES-GOW, 2011), podendo identificar uretra peniana, pélvica, glândula vesicular e bexiga urinária (BALL, 2008). A mucosa uretral se apresenta de coloração rósea pálida, contém dobras longitudinais e sua aparência é semelhante à do esôfago (BERTONE, 1998). 2.3.3.3. Coleta fracionada A ejaculação e ereção no garanhão são controladas pelas vias aferentes e eferente provenientes da inervação da medula espinhal. A ereção ocorre a partir do relaxamento da musculatura lisa dos corpos cavernosos e esponjosos em associação com o aumento do fluxo sanguíneo arterial para o pênis (MCDONNEL, 1992). Durante a cópula há aumento da atividade da musculatura regulado por estímulos nervosos do sistema nervoso autônomo parassimpático para corpos cavernosos e esponjosos e estímulos somáticos para isquiocavernoso e bulboesponjoso (SCHUMACHER; 19 RIDDELL, 1986). O processo ejaculatório no garanhão tem como característica a presença dos jatos divididos de acordo o momento da ejaculação, sendo eles, a porção da secreção das glândulas sexuais acessórias bulbouretrais e próstata, epidídimo e ampolas dos ductos deferentes e fração final das vesículas seminais (MCDONNEL, 1992). Após a identificação de sangue no ejaculado de garanhões o exame físico da superfície externa do pênis, fossa uretral e processo uretral devem ser realizados no órgão antes e após a ereção. Caso não haja identificação das lesões, uma ferramenta útil para diagnosticar a causa do problema é a coleta do sêmen com o fundo da vagina artificial aberta, na qual a glande do pênis irá se projetar e permitindo a visualização da mesma durante a ejaculação (VARNER et al., 2000). Outra alternativa corresponde a coleta fracionada descrita por Oliveira (2016), na qual permite a interrupção dos jatos e separação dos mesmos com auxílio de pinças durante a ejaculação. Portanto, se todos os jatos apresentarem coloração avermelhada é sugestivo de hemospermia por alterações na uretra e/ou testiculares, mas, se apenas a última fração das glândulas vesiculares estiverem na coloração avermelhada provavelmente um processo infeccioso sugestivo de hemospermia devido a vesiculite seminal. 2.3.4. Tratamentos A abordagem para um tratamento adequado depende da origem do problema. Em alguns casos de hemospermia preconiza-se o repouso sexual do garanhão, como em lesões traumáticas de uretra e processo uretral. No entanto, o garanhão pode apresentar o quadro clínico no retorno à atividade reprodutiva. Além de que, alguns garanhões realizam a masturbação, que consiste na ereção e em movimentos consecutivos do pênis no abdômen (SULLINS et al., 1988). O método utilizado para impedir a masturbação em garanhões é agressivo; o emprego de tarraxas no abdômen, sendo assim, agravando o quadro clínico do animal principalmente em casos de alterações de processo uretral (MCDONNELL et al., 1991). Em casos de fístula uretral e/ou uretrite é indicada a cauterização química da lesão de acordo com o tratamento proposto por Silva-Junior et al. (2016), que consiste na 20 endoscopia para se obter diagnóstico diferencial para vesiculite seminal. Após o diagnóstico da origem do sangramento, é realizado tratamento local com policresuleno a 4% em três aplicações de 100 mL com intervalo de 24 horas. Para acesso a uretra peniana, é utilizada uma pipeta flexível para inseminação de sêmen congelado, na qual é introduzida completamente e em seguida é administrado o volume do medicamento com a bisnaga para inseminação artificial, no momento de aplicação do fármaco a pipeta é retirada lentamente e o processo uretral é ocluído de forma manual para deixar o líquido em contato com a lesão por cinco minutos. Após esse período, o processo uretral é desocluído e líquido eliminado (figura 2). Figura 2. Esquematização do tratamento de fístula uretral através de cauterização química. a: Introdução da pipeta flexível até o local da lesão. b: Deposição do policresuleno a 4% na uretra e deixar agir por 5 minutos. c: Remoção do agente caustico. (Autoria própria). Em lesões na uretra pélvica, o mesmo procedimento citado anteriormente é realizado, no entanto, utiliza-se o endoscópio para acessar o local da lesão. Uma outra alternativa corresponde ao método cirúrgico de uretrotomia subisquial que consiste em realizar uma fístula temporária na uretra de 4 semanas, podendo se estender até 6 semanas com a finalidade de diminuir a pressão do corpo esponjoso no momento final da ejaculação (SCHUMACHER et al., 1995; SULLINS et al., 1988; LAVERTY et al., 1992). Segundo Blanchard (1987), em garanhões que apresentam grau de hemospermia leve e estão em época de estação de monta é indicada a introdução de diluente a base de leite desnatado no útero das éguas previamente a monta, com intuito de diminuir a contaminação, entretanto, em casos de hemospermia severa, a diluição do sêmen no útero não reduz o grau de contaminação. 21 Em relação ao tratamento para vesiculite seminal, devem-se levar em consideração alguns fatores que são cruciais para o sucesso, tais como, a biodisponibilidade dos fármacos e baixa vascularização das glândulas vesiculares dificultando que a maioria dos anitibióticos atinjam o órgão acometido com uma concentração inibitória mínima adequada para debelar o agente etiológico (SAMPER & TIBARY, 2006; CHENIER, 2009; MIRAGAYA et al., 2011; TIBARY & RODRIGUEZ, 2011; VARNER et al., 2011). De acordo com Varner e Schumacher (2011), a lavagem direta do lúmen glandular e infusão de antimicrobianos é o tratamento de eleição, entretanto são necessárias repetições diárias de no mínimo cinco dias consecutivos. Sancler-Silva (2014) realizou o tratamento local da vesiculite seminal e avaliou a influência deste na qualidade seminal, e foi relatado que a conduta terapêutica adotada melhorou os parâmetros seminais de cinética e integridade de membrana plasmática no sêmen fresco, refrigerado e congelado após uma semana do tratamento, mas o mesmo não foi observado após um mês do início do tratamento, devido a recidiva da enfermidade. 2.3.5. Influência do sangue na qualidade do sêmen equino Os prejuízos no programa de reprodução assistida devido a hemospermia são altos, uma vez que os garanhões acometidos apresentam queda na fertilidade ou infertilidade (TURNER et al., 2016). Em humanos (ELEY et al., 2005; SATTA et al., 2006; VIGNERA et al., 2011) e equinos (ORTEGA-FERRUSOLA et al.,2009; FENNEL et al., 2010), a presença de bactérias e leucócitos proporcionam o aumento das espécies reativas de oxigênio (EROS) e produção de citocinas pró-inflamatórias, afetando a integridade de membranas, função mitocondrial e integridade de DNA, levando ao aumento de marcadores de apoptose na célula espermática, redução da motilidade e consequentemente queda na taxa de fertilidade. Os mecanismos pelo qual a presença do sangue afeta a qualidade seminal e por consequência as taxas de concepção não estão elucidados. Em um estudo realizado por Turner et al. (2016), no qual comparou-se as taxas de fertilidade do ejaculado na 22 presença de sangue contendo 5%, 50% v/v e na ausência de sangue, foi verificada a redução das taxas de concepção para o grupo 50 %, tal fato pode ser justificado pela formação de coágulos e aglutinações dos espermatozoides, impedindo a movimentação dos mesmos no trato reprodutor da fêmea. De acordo com Voss (1976), o responsável pela queda na fertilidade é a série vermelha do sangue. Neste estudo 50% das éguas inseminadas com o ejaculado acrescido da série branca do sangue (soro) ficaram gestantes em contrapartida, apenas 7,7% das éguas inseminadas com sêmen na presença de sangue total obtiveram o concepto. Andrade Jr et al. (2016) demonstraram que ejaculado contaminado com até 5% v/v de sangue total não há influência nas taxas de fertilidade. 2.4. Separação espermática por gradiente de densidade Nos casos em que garanhões apresentam um alto índice de células morfologicamente anormais é necessário o uso de tecnologias que proporcionem uma maximização do uso do sêmen, com objetivo de obter resultados satisfatórios no momento da inseminação artificial. Um protocolo recente utilizado por (MILES et al., 2013), envolve a utilização de uma sílica como gradiente de seleção o EquipureTM, que permite a retenção de espermatozoides com anormalidades morfológicas, obtendo uma população de células morfologicamente normais. De acordo com Maziero et al. (2012), a centrifugação do sêmen equino em EquipureTM proporcionou aumento das taxas de motilidade progressiva e porcentagem de espermatozoides rápidos após 24 horas de refrigeração, o mesmo foi observado por Papa et al. (2012) quando utilizado sêmen descongelado. Morrell et al. (2014) estudaram a diminuição da carga bacteriana no ejaculado de garanhões após a centrifugação em Androcoll, e observaram redução de até 90% das bactérias. No entanto, foi observado que a centrifugação em colóide reduz mas, não elimina a contaminação do ejaculado sendo necessário a adição de antibióticos ao diluente. Papa et al. (2013) observaram que após a centrifugação do sêmen de garanhões com baixas taxas de recuperação embrionária em gradiente de densidade EquipureTM 23 houve aumento no número de embriões (70%) para o grupo de seleção espermática em relação ao grupo controle (33%), mostrando que, a seleção de uma população de espermatozoides utilizando gradiente de densidade se mostrou uma técnica eficiente para o aumento da qualidade seminal assim como nos indices de fertilidade, para sêmen fresco e refrigerado. 2.4.1. Manipulação do sêmen na presença de sangue Em alguns casos de hemospermia há recidivas e/ou quadro crônico da lesão, sendo assim, necessário utilização de técnicas alternativas para manipulação do sêmen destes garanhões. Em estudo realizado por Ramires-Neto et al. (2013), foi demonstrado que o uso de uma membrana hidrofóbica sintética de 2µm de diâmetro (Sperm Filter®) e posterior centrifugação em gradiente de densidade (EquipureTM), no processamento do sêmen de um garanhão com alta carga leucocitária devido a vesiculite seminal, obteve bons resultados no programa de inseminação artificial. Em outro estudo realizado pelo mesmo grupo, foi relatada superioridade dos valores de integridade da membrana plasmática para o sêmen filtrado em Sperm Filter® em relação ao não filtrado após 24 horas de refrigeração. Além disso, no mesmo estudo, o número de unidades formadoras de colônias foi menor para o grupo de sêmen diluído e filtrado na membrana hidrofóbica em relação ao sêmen diluído e puro, demonstrando que a membrana hidrofóbica foi eficaz na redução da carga bacteriana no primeiro grupo. De acordo com Parrish et al. (1995) a execução da técnica “swin up” que consiste em selecionar células que estejam sem movimento se mostrou eficiente para separação de espermatozoides mortos e possivelmente para hemácias uma vez que, devido à ausência da mobilidade eritrocitária as mesmas ficariam sedimentadas e em contrapartida os espermatozoides móveis se encontravam na região superior. Para Turner et al. (2016), em situações de altas concentrações de sangue no ejaculado de garanhões a fertilidade é comprometida devido a formação de coágulos e aglutinação dos espermatozoides, havendo a necessidade de adição de anticoagulantes na diluição. 24 Referências Bibliográficas AMANN, R. P.; GRAHAM, J. K. 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CAPÍTULO 2 35 ARTIGO I – HEMOSPERMIA EM GARANHÕES Artigo submetido à Revista Veterinária e Zootecnia ISSN 0102-5716, ranqueada como B3 pelo QUALIS – CAPES de 2015. RESUMO Métodos de processamento espermático são rotineiramente utilizados para otimização do sêmen de garanhões. As biotecnologias aplicadas a reprodução permitem que animais geneticamente superiores disseminem suas características. Apesar disso, mesmo em garanhões clinicamente sadios, o sêmen criopreservado possui taxas de fertilidade inferiores quando comparado ao sêmen fresco, em decorrência do estresse químico e físico gerados pela preservação através do frio. Tal, condição pode ser intensificada em animais que apresentam alterações no trato reprodutivo que comprometam a qualidade seminal, como por exemplo, a presença de sangue no ejaculado, denominado hemospermia. Esta afecção geralmente é observada em decorrência de lesões na uretra, processo uretral, pênis e vesícula seminal. O efeito dos componentes sanguíneos sobre a qualidade do sêmen ainda não está bem estabelecido. Diante disso objetivou-se com o presente estudo referenciar as principais causas assim como, tratamentos e efeitos da presença do sangue no ejaculado de garanhões. Palavras-chave: equino, sangue, ejaculado, sêmen HEMOSPERMIA IN STALLIONS ABSTRACT Sperm processing methods are routinely used for stall optimization of stallions. Reproductive biotechnology allows genetically superior animals to disseminate their characteristics. Nevertheless, even in clinically healthy stallions, cryopreserved semen has lower fertility rates when compared to fresh semen, due to the chemical and physical stress generated by cold preservation. This condition may be intensified in animals that present changes in the reproductive tract that compromise seminal quality, such as the presence of blood in the ejaculate, called hemospermia. This condition is usually observed due to lesions in the urethra, urethral process, penis and seminal vesicle. The effect of blood components on semen quality is still not well established. In view of this, the present study aimed to identify the main causes as well as treatments and effects of the presence of blood in the ejaculate of stallions. Keywords: equine, blood, ejaculate, semen 36 HEMOSPERMIA EN SEMENTAL RESUMEN Los métodos de procesamiento espermático se utilizan rutinariamente para optimizar el semen de sementales. Las biotecnologías aplicadas a la reproducción permiten que los animales genéticamente superiores diseminen sus características. A pesar de ello, incluso en los sanos clínicamente sanos, el semen criopreservado tiene tasas de fertilidad inferiores en comparación con el semen fresco, debido al estrés químico y físico generado por la preservación a través del frío. Esta condición puede ser intensificada en animales que presentan alteraciones en el tracto reproductivo que comprometen la calidad seminal, como por ejemplo, la presencia de sangre en el eyaculado, denominado hemospermia. Esta afección generalmente se observa como consecuencia de lesiones en la uretra, proceso uretral, pene y vesícula seminal. El efecto de los componentes sanguíneos sobre la calidad del semen todavía no está bien establecido. Ante esto se objetivó con el presente estudio referenciar las principales causas así como, tratamientos y efectos de la presencia de la sangre en el eyaculado de sementales. Palabras claves: equino, sangre, eyaculación, semen INTRODUÇÃO O rebanho de equinos do Brasil está classificado como sendo o quarto maior do mundo, estando atrás apenas dos Estados Unidos, China e México, e movimenta anualmente mais de R$ 7,0 bilhões e 642 mil empregos (1). Há mais de meio século as biotecnologias de criopreservação do sêmen de bovinos são utilizadas comercialmente com êxito, proporcionando um grande avanço na espécie neste quesito. Na reprodução de equinos a seleção genética relacionada à qualidade dos espermatozoides, em especial, resistência destes ao processo de refrigeração e congelação, esteve ausente durante anos (2). Desta forma, faz-se necessário o aprimoramento das biotecnologias aplicadas ao sêmen do garanhão, a exemplo refrigeração e congelação, de modo a promover um avanço para equinocultura, otimizando a qualidade do ejaculado dos garanhões. Na espécie equina a biotecnologia mais utilizada é a refrigeração, porém o uso do sêmen congelado vem crescendo cada vez mais, proporcionando a disseminação do material genético de animais superiores, sem interferência de localização, além de preservar as células espermáticas por tempo indeterminado (3). Entretanto, durante o processo de criopreservação os espermatozoides sofrem danos em decorrência da preservação pelo frio, situação esta agravada em garanhões que possuam alguma enfermidade no trato reprodutivo, como a hemospermia, que é caracterizada pela presença de sangue no ejaculado. As causas de hemospermia em garanhões estão relacionadas a presença de lesões no trato reprodutivo masculino, desde o epidídimo até o processo uretral. Lesões no processo uretral e uretra, e as enfermidades de carcinoma de células escamosas e vesiculite seminal podem ser apontadas como principais causas de hemospermia. A idade em que os animais apresentam o quadro clínico pode ser variável (4). A presença de hemácias no ejaculado possivelmente não afetaria a cinética e morfologia espermática, no entanto, há redução da fertilidade de garanhões com hemospermia (5). O objetivo do presente estudo é revisar as causas de hemospermia em garanhões, assim como, possíveis tratamentos de acordo com a lesão apresentada. 37 REVISÃO DE LITERATURA Anatomia do sistema reprodutor do macho Para a formação e deposição do sêmen no trato reprodutor da fêmea é necessário uma interação entre as estruturas anatômicas do sistema reprodutor masculino (6). Dentre as partes que o compõe estão um par de testículos que se encontram dentro da bolsa testicular, músculo cremaster, epidídimos, ductos deferentes, pênis e glândulas sexuais acessórias compostas por ampolas dos ductos deferentes, vesículas seminais, próstata e bulbouretrais (4,6). O pênis ou órgão copulador no garanhão possui a particularidade de ser do tipo músculo cavernoso, dividido em base, corpo e glande (7). Quando em ereção os espaços cavernosos, como corpo esponjoso da glande, corpo esponjoso do pênis, que envolve a uretra, aumentam de volume devido ao preenchimento por sangue carreado pelos estímulos nervosos através das vias eferentes dos ramos arteriais do pudendo e obturador (figura 1) (6,8,9). Figura 1. a: Anatomia do pênis do garanhão. b: Corte transversal do pênis do garanhão. (adaptado de RIEGEL & HAKOLA , 2004) Os testículos são as gônadas masculinas, compostos pelo parênquima testicular formado por tecido intersticial (células de Leydig, vasos sanguíneos e linfáticos, tecido conjuntivo e nervos), túbulos seminíferos e “rete testis” (10). As células de Sertoli são encontradas no lúmen dos túbulos seminíferos, responsáveis pela espermatogênese e estimuladas pela ação do hormônio folículo estimulante (FSH) estas são conectadas pelas junções gap formando a barreira hematotesticular (6,10). 38 As células espermáticas ao atingirem a cabeça do epidídimo, são encaminhadas para o corpo e posteriormente cauda do epidídimo por contrações do músculo liso. No epidídimo, as células são armazenadas e adquirem sua capacidade de fertilizar (4,6). Durante o processo de ejaculação, os espermatozoides passam pelos ductos deferentes que desembocam na uretra pélvica, sendo assim, os mesmos serão eliminados juntamente com as secreções das glândulas sexuais acessórias durante a ejaculação (6). O conjunto de glândulas sexuais acessórias é composto por ampola do ducto deferente, vesículas seminais, próstata e bulbouretrais e são responsáveis pela produção de fluido que será eliminado juntamente com os espermatozoides durante a ejaculação (4). A ligação entre bexiga e processo uretral é denominado de uretra, na qual é revestida pelo músculo bulboesponjoso, e através de suas contrações irá conduzir a urina bem como o sêmen durante a ejaculação (11). Anatomofisiologia da célula espermática O espermatozoide é uma célula altamente especializada com função de fertilizar e transferir o genoma masculino (12). Na espécie equina a cabeça do espermatozoide possui formato oval e alongado, é responsável pelo armazenamento do material genético possui no seu interior a cromatina condensada composta de ácido desoxirribonucleico (DNA) (13-15). O acrossoma consiste em revestimento de camada dupla responsável pela penetração do espermatozoide no oócito pela liberação de enzimas hidrolíticas. Na espécie equina, o acrossoma corresponde a 2/3 da dimensão da cabeça do espermatozoide (12,16). A cauda é responsável pelo movimento da célula, e é dividida em peça principal e terminal. Sua porção inicial é composta pela bainha fibrosa na qual envolve 9 fibras densas, 9 pares de microtúbulos periféricos conectados por dineínas e um par central de microtúbulos. O movimento da célula é gerado pelo deslocamento dos microtúbulos, desencadeado pelo consumo energético das dineínas, energia esta gerada pela hidrólise da adenosina trifosfato (ATP) (15,16). A peça intermediária é responsável pela produção de energia para movimentação da célula espermática, e estruturalmente é semelhante a peça principal da cauda se diferenciando apenas pela ausência da bainha fibrosa e na presença de uma bainha mitocondrial, que contém mitocôndrias como unidades formadoras de energia (12,13). A célula espermática possui uma membrana que a reveste completamente (12,17,18), que dispõe de uma bicamada fosfolipídica, composta por ácidos graxos saturados e insaturados unidos a grupamentos fosfato (18). Esta disposição permite as células uma extremidade polar hidrofílica, assim como, um centro polar hidrofóbico, conferindo uma impermeabilidade à maioria dos solutos polares (19,20). As proteínas presentes nas membranas podem ser integrais ou periféricas, e desempenham algumas funções tais como, transporte de substâncias entre meio interno e externo, atividade metabólica com função enzimática, reconhecimento celular e permitem ligações entre as células (18,19). Num contexto geral, a membrana plasmática é responsável pela manutenção da homeostase celular e suas organelas, requisito essencial para a sobrevivência e manutenção do potencial de fertilização das células espermáticas, sendo a integridade funcional das membranas dos espermatozoides considerada imprescindível para os processos de capacitação, reação acrossomal e adesão ao oócito (21) 39 Hemospermia em garanhões A hemospermia é definida como presença de sangue no ejaculado e é consequência de uma afecção originada de qualquer local do trato reprodutor masculino (22). A origem do sangue no sêmen dos garanhões pode se apresentar em diversos locais, comumente decorrente das lesões do processo uretral, uretra e em casos de vesiculite seminal crônica levando aumento da vascularização da glândula devido ao processo inflamatório e, consequentemente no momento da ejaculação, haverá presença de sangue (5). Apesar de casos de hemospermia não serem usuais, esta enfermidade tem sido relatada por diversos autores (22-24). Etiopatogenia Para uma avaliação de um garanhão, ou seja, realização de um exame andrológico afim de diagnosticar alguma enfermidade, é necessário que se saiba a localização, forma e tamanho de cada órgão do sistema reprodutor do garanhão (25). Em alguns casos há comunicação entre os corpos esponjosos do pênis e o lúmen uretral no momento da ejaculação o sangue será transferido para a uretra e liberado juntamente ao sêmen (26). As principais causas de hemospermia incluem epididimite, vesiculite seminal, fissuras no processo uretral, na glande do pênis, fístulas uretrais, estenose uretral, neoplasias, lesões provocadas pelo Habronema spp e obstrução das ampolas dos ductos deferentes (23,27,28). Dentre os locais mais comuns para ocorrência de lesões traumáticas destaca-se o processo uretral principalmente no momento da cópula, na qual pode ocorrer laceração do mesmo pelo fio de crina da cauda da fêmea (29). Animais que possuem lesões provocadas por habronemose cutânea apresentam um quadro secundário de processo inflamatório principalmente na região da glande do pênis, o que propicia o aumento da vascularização durante a ejaculação e a eliminação de sangue no ejaculado de garanhões (30). Em casos de obstrução das ampolas dos ductos deferentes, a presença do sangue no ejaculado pode ser subsequente à desobstrução das glândulas podendo ser resultado de lesão do órgão (6). As causas infecciosas de hemospermia são: vesiculite seminal bacteriana, uretrite e epididimite (30-32). Essas enfermidades podem levar a lesões ulcerativas da pele do pênis e causar sangramentos durante a cópula, sendo os agentes infecciosos mais comumente encontrados em casos de uretrite e vesiculite seminal bacteriana: Streptococcus spp, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa (33). Além disso o Herpesvírus equino pode provocar lesões na superfície da pele do pênis e sangrar facilmente durante a cópula ou coleta do sêmen com vagina artificial (34). Sinais Clínicos A hemospermia é consequencia de alguma enfermidade do trato reprodutor do garanhão e para determinar a causa é necessário que se utilize ferramentas que permitam investigar todas as prováveis suspeitas. Na sua grande maioria os garanhões não apresentam dor durante a ereção e/ou na ejaculação (33), entretanto em alguns casos de vesiculite seminal podem ocorrer 40 distúrbios ejaculatórios (35). A gravidade da lesão depende da causa inicial, e a presença de sangue pode variar entre os ejaculados, sendo assim, há a necessidade de múltiplas coletas de sêmen para detectar o problema (26). Desta forma, o tempo de avaliação do garanhão deve ser levado em consideração, uma vez que animais que se encontram em repouso e/ou descanso sexual podem mascarar a alteração devido à ausência de sangue nas primeiras ejaculações, sendo necessárias coletas repetidas em um intervalo curto de dias (5). Diagnóstico Caso haja suspeita de hemospermia o sêmen deverá ser coletado por vagina artificial e examinado de acordo com a coloração. Tanto a hemospermia severa, como a moderada, são diagnosticadas pelo aspecto da amostra, entretanto para hemospermia leve é necessário um exame microscópico para identificar a presença de células vermelhas entremeadas às células espermáticas. Devido a homogeneidade entre as células espermáticas e hemácias é necessário realizar uma coloração descrita por (36) para identificação das hemácias nos ejaculado. Ultrassonografia Quando as lesões externas não são identificadas como fonte do sangramento é necessário lançar mão de técnicas de diagnóstico que permitam a visualização do trato reprodutor masculino interno (5). A palpação e a ultrassonografia dos testículos, epidídimo e funículo espermático podem revelar importantes alterações nos órgãos em questão (37). Do mesmo modo, a palpação transretal e a ultrassonografia permitem um exame profundo das glândulas sexuais acessórias e identificação de possíveis alterações, como por exemplo obstrução das glândulas ampolares, assim como processo inflamatório nas glândulas vesiculares (38). Endoscopia Videoendoscópios flexíveis ou de fibra óptica podem ser utilizados para exame completo do trato urogenital de garanhões (39-42), podendo identificar uretra peniana, pélvica, glândula vesicular e bexiga urinária (43). A mucosa uretral se apresenta de coloração rósea pálida, contém dobras longitudinais e sua aparência é semelhante à do esôfago (44). Coleta fracionada A ejaculação e ereção no garanhão são controladas pelas vias aferentes e eferente provenientes da inervação da medula espinhal. A ereção ocorre a partir do relaxamento da musculatura lisa dos corpos cavernosos e esponjosos em associação com o aumento do fluxo sanguíneo arterial para o pênis (45). Durante a cópula há aumento da atividade da musculatura regulado por estímulos nervosos do sistema nervoso autônomo parassimpático para corpos cavernosos e esponjosos e estímulos somáticos para isquiocavernoso e bulboesponjoso (46). O processo ejaculatório no garanhão tem como característica a presença dos jatos divididos de acordo o momento da ejaculação, sendo eles, a porção da secreção das glândulas sexuais 41 acessórias bulbouretrais e próstata, epidídimo e ampolas dos ductos deferentes e fração final das vesículas seminais (45). Após a identificação de sangue no ejaculado de garanhões o exame físico da superfície externa do pênis, fossa uretral e processo uretral devem ser realizados no órgão antes e após a ereção. Caso não haja identificação das lesões, uma ferramenta útil para diagnosticar a causa do problema é a coleta do sêmen com o fundo da vagina artificial aberta, na qual a glande do pênis irá se projetar e permitindo a visualização da mesma durante a ejaculação (29). Outra alternativa corresponde a coleta fracionada descrita por Oliveira (47), na qual permite a interrupção dos jatos e separação dos mesmos com auxílio de pinças durante a ejaculação. Portanto, se todos os jatos apresentarem coloração avermelhada é sugestivo de hemospermia por alterações na uretra e/ou testiculares, mas, se apenas a última fração das glândulas vesiculares estiverem na coloração avermelhada provavelmente um processo infeccioso sugestivo de hemospermia devido a vesiculite seminal. Tratamentos A abordagem para um tratamento adequado depende da origem do problema. Em alguns casos de hemospermia preconiza-se o repouso sexual do garanhão, como em lesões traumáticas de uretra e processo uretral. No entanto, o garanhão pode apresentar o quadro clínico no retorno à atividade reprodutiva. Além de que, alguns garanhões realizam a masturbação, que consiste na ereção e em movimentos consecutivos do pênis no abdômen (33). O método utilizado para impedir a masturbação em garanhões é agressivo; o emprego de tarraxas no abdômen, sendo assim, agravando o quadro clínico do animal principalmente em casos de alterações de processo uretral (48). Em casos de fístula uretral e/ou uretrite é indicada a cauterização química da lesão de acordo com o tratamento proposto por Silva-Junior et al. (49), que consiste na endoscopia para se obter diagnóstico diferencial para vesiculite seminal. Após o diagnóstico da origem do sangramento, é realizado tratamento local com policresuleno a 4% em três aplicações de 100 mL com intervalo de 24 horas. Para acesso a uretra peniana, é utilizada uma pipeta flexível para inseminação de sêmen congelado, na qual é introduzida completamente e em seguida é administrado o volume do medicamento com a bisnaga para inseminação artificial, no momento de aplicação do fármaco a pipeta é retirada lentamente e o processo uretral é ocluído de forma manual para deixar o líquido em contato com a lesão por cinco minutos. Após esse período, o processo uretral é desocluído e líquido eliminado (figura 2). Figura 2. Esquematização do tratamento de fístula uretral através de cauterização química. a: Introdução da pipeta flexível até o local da lesão. b: Deposição do policresuleno a 4% na 42 uretra e deixar agir por 5 minutos. c: Remoção do agente caustico. (Autoria própria). Em lesões na uretra pélvica, o mesmo procedimento citado anteriormente é realizado, no entanto, utiliza-se o endoscópio para acessar o local da lesão. Uma outra alternativa corresponde ao método cirúrgico de uretrotomia subisquial que consiste em realizar uma fístula temporária na uretra de 4 semanas, podendo se estender até 6 semanas com a finalidade de diminuir a pressão do corpo esponjoso no momento final da ejaculação (50,33,51). Segundo Blanchard (27), em garanhões que apresentam grau de hemospermia leve e estão em época de estação de monta é indicada a introdução de diluente a base de leite desnatado no útero das éguas previamente a monta, com intuito de diminuir a contaminação, entretanto, em casos de hemospermia severa, a diluição do sêmen no útero não reduz o grau de contaminação. Em relação ao tratamento para vesiculite seminal, devem-se levar em consideração alguns fatores que são cruciais para o sucesso, tais como, a biodisponibilidade dos fármacos e baixa vascularização das glândulas vesiculares dificultando que a maioria dos anitibióticos atinjam o órgão acometido com uma concentração inibitória mínima adequada para debelar o agente etiológico (25,43,52,53,54). De acordo com Varner e Schumacher (55), a lavagem direta do lúmen glandular e infusão de antimicrobianos é o tratamento de eleição, entretanto são necessárias repetições diárias de no mínimo cinco dias consecutivos. Sancler-Silva (35) realizou o tratamento local da vesiculite seminal e avaliou a influência deste na qualidade seminal, e foi relatado que a conduta terapêutica adotada melhorou os parâmetros seminais de cinética e integridade de membrana plasmática no sêmen fresco, refrigerado e congelado após uma semana do tratamento, mas o mesmo não foi observado após um mês do início do tratamento, devido a recidiva da enfermidade. Influência do sangue na qualidade do sêmen equino Os prejuízos no programa de reprodução assistida devido a hemospermia são altos, uma vez que os garanhões acometidos apresentam queda na fertilidade ou infertilidade (22). Em humanos (56-58) e equinos (59,60), a presença de bactérias e leucócitos proporcionam o aumento das espécies reativas de oxigênio (EROS) e produção de citocinas pró-inflamatórias, afetando a integridade de membranas, função mitocondrial e integridade de DNA, levando ao aumento de marcadores de apoptose na célula espermática, redução da motilidade e consequentemente queda na taxa de fertilidade. Os mecanismos pelo qual a presença do sangue afeta a qualidade seminal e por consequência as taxas de concepção não estão elucidados. Em um estudo realizado por Turner et al. (22), no qual comparou-se as taxas de fertilidade do ejaculado na presença de sangue contendo 5%, 50% v/v e na ausência de sangue, foi verificada a redução das taxas de concepção para o grupo 50 %, tal fato pode ser justificado pela formação de coágulos e aglutinações dos espermatozoides, impedindo a movimentação dos mesmos no trato reprodutor da fêmea. De acordo com Voss (61), o responsável pela queda na fertilidade é a série vermelha do sangue. Neste estudo 50% das éguas inseminadas com o ejaculado acrescido da série branca do sangue (soro) ficaram gestantes em contrapartida, apenas 7,7% das éguas inseminadas com sêmen na presença de sangue total obtiveram o concepto. Andrade Jr et al. (24) demonstraram que ejaculado contaminado com até 5% v/v de sangue total não há influência nas taxas de fertilidade. 43 Separação espermática por gradiente de densidade Nos casos em que garanhões apresentam um alto índice de células morfologicamente anormais é necessário o uso de tecnologias que proporcionem uma maximização do uso do sêmen, com objetivo de obter resultados satisfatórios no momento da inseminação artificial. Um protocolo recente utilizado por MILES et al. (62), envolve a utilização de uma sílica como gradiente de seleção o Equipure TM , que permite a retenção de espermatozoides com anormalidades morfológicas, obtendo uma população de células morfologicamente normais. De acordo com Maziero et al. (63), a centrifugação do sêmen equino em Equipure TM proporcionou aumento das taxas de motilidade progressiva e porcentagem de espermatozoides rápidos após 24 horas de refrigeração, o mesmo foi observado por Papa et al. (64) quando utilizado sêmen descongelado. Morrell et al. (65) estudaram a diminuição da carga bacteriana no ejaculado de garanhões após a centrifugação em Androcoll, e observaram redução de até 90% das bactérias. No entanto, foi observado que a centrifugação em colóide reduz mas, não elimina a contaminação do ejaculado sendo necessário a adição de antibióticos ao diluente. Papa et al. (66) observaram que após a centrifugação do sêmen de garanhões com baixas taxas de recuperação embrionária em gradiente de densidade Equipure TM houve aumento no número de embriões (70%) para o grupo de seleção espermática em relação ao grupo controle (33%), mostrando que, a seleção de uma população de espermatozoides utilizando gradiente de densidade se mostrou uma técnica eficiente para o aumento da qualidade seminal assim como nos indices de fertilidade, para sêmen fresco e refrigerado. Manipulação do sêmen na presença de sangue Em alguns casos de hemospermia há recidivas e/ou quadro crônico da lesão, sendo assim, necessário utilização de técnicas alternativas para manipulação do sêmen destes garanhões. Em estudo realizado por Ramires-Neto et al. (67), foi demonstrado que o uso de uma membrana hidrofóbica sintética de 2µm de diâmetro (Sperm Filter ® ) e posterior centrifugação em gradiente de densidade (Equipure TM ), no processamento do sêmen de um garanhão com alta carga leucocitária devido a vesiculite seminal, obteve bons resultados no programa de inseminação artificial. Em outro estudo realizado pelo mesmo grupo, foi relatada superioridade dos valores de integridade da membrana plasmática para o sêmen filtrado em Sperm Filter ® em relação ao não filtrado após 24 horas de refrigeração. Além disso, no mesmo estudo, o número de unidades formadoras de colônias foi menor para o grupo de sêmen diluído e filtrado na membrana hidrofóbica em relação ao sêmen diluído e puro, demonstrando que a membrana hidrofóbica foi eficaz na redução da carga bacteriana no primeiro grupo. De acordo com Parrish et al. (68) a execução da técnica “swin up” que consiste em selecionar células que estejam sem movimento se mostrou eficiente para separação de espermatozoides mortos e possivelmente para hemácias uma vez que, devido à ausência da mobilidade eritrocitária as mesmas ficariam sedimentadas e em contrapartida os espermatozoides móveis se encontravam na região superior. 44 Para Turner et al. (22), em situações de altas concentrações de sangue no ejaculado de garanhões a fertilidade é comprometida devido a formação de coágulos e aglutinação dos espermatozoides, havendo a necessidade de adição de anticoagulantes na diluição. CONSIDERAÇÕES FINAIS Apesar dos diferentes achados em relação aos prejuízos relacionados a presença do sangue no ejaculado dos garanhões, os resultados ainda são inconsistentes. Ainda há controvérsia sobre os malefícios que o sangue promove no ejaculado da espécie em questão, necessitando-se de aprofundamento sobre as interações das substâncias presentes no sangue com a células espermática e suas possíveis consequências. REFERÊNCIAS 1. Guerra, PJ. Brasil tem o quarto maior rebanho equino do mundo, com 5,8 milhões de cabeça. Notícia 16/03/2010. Conselho Federal de Medicina Veterinária. Disponível em: http://www.cfmv.org.br/portal/noticia.php?cod=606. Acesso em: 04 de janeiro de 2017. 2. Avanzi BR, Ramos RS, Nichi M, Fioratti EG, Dell’Aqua Jr JA, Wechsler FS, Papa FO Avaliação da cinética espermática, integridade de membrana plasmática e resistência ao estresse oxidativo no sêmen equino congelado com diferentes concentrações espermáticas. Revista Veterinária e Zootecnia, v.18, n.2, p.226-238, 2011. 3. Miller CD. Optimizing the use of frozen-thawed equine semen. Theriogenology, v.70, p.463- 468, 2008. 4. Mckinnon AO, Voss JL. 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As amostras foram refrigeradas durante 24 horas a 5˚C e avaliadas para cinética espermática, integridade de membranas e geração de superóxido. No experimento 2 cada ejaculado (n=60) foi dividido em 3 tratamentos distintos: S50 (50% de ejaculado + 50% v/v sangue autólogo), S25 (S50 + 1:1 de Botu-sêmen® e S12,5 (S50 + 2:1 de Botu-sêmen®), as amostras foram avaliadas para cinética espermática, integridade de membranas, produção de superóxido e taxa de fertilidade. Em relação aos parâmetros motilidade total, motilidade progressiva e porcentagem de espermatozoides rápidos houve redução para os grupos na presença de sangue tanto no experimento 1 (H5), assim como no experimento 2 (S50). Para a avaliação do índice de fertilidade no experimento 2, as éguas inseminadas na presença do sangue sem adição de diluente (S50) para sêmen fresco não obtiveram concepto (0%), entretanto conforme a relação diluente e sêmen aumentou as taxas de fertilidade aumentaram para os grupos S25 (25%) e S12,5 (90%). Conclui-se que, a fertilidade é afetada de acordo com a proporção sangue/ejaculado, não a simples presença do sangue no ejaculado. 51 1. Introdução A presença de sangue no ejaculado de garanhões denominada hemospermia, pode ocorrer de forma continua ou intermitente, e é geralmente descrita como causa de infertilidade em cavalos [1]. As principais causas de hemospermia incluem epididimite, vesiculite seminal, fissuras no processo uretral, lesões na glande do pênis, fístulas uretrais, estenose uretral, neoplasias, lesões provocadas pelo Habronema spp e obstrução das ampolas dos ductos deferentes [2-4]. Dentre os locais mais comuns para ocorrência das lesões traumáticas destaca-se o processo uretral, devido o fio de crina da cauda da fêmea promover lacerações durante a cópula [5]. Voss et al. [6] relataram que o responsável pela queda na fertilidade é a série vermelha do sangue. Neste estudo 50% das éguas inseminadas com soro sanguíneo adicionado no sêmen ficaram gestantes em contrapartida, apenas 7,7% das éguas inseminadas com sêmen na presença do sangue total obtiveram o concepto. Diante disso, o objetivo do presente estudo foi desenvolver uma técnica eficiente de separação entre sêmen e as hemácias a partir da utilização de gradientes de densidade durante a centrifugação, assim como, avaliar a taxa de fertilidade do sêmen na presença de altas concentrações de sangue e após sua diluição em diferentes proporções de meio diluidor. 2. Material e métodos Este estudo foi aprovado pela comissão de ética no uso de animais (CEUA) número do protocolo 50/2016, da Universidade Estadual Paulista- UNESP Botucatu, SP, Brasil 2.1. Animais Foram utilizados 15 garanhões com idade entre 5 e 15 anos, clinicamente sadios e de diferentes raças (Quarto de Milha, PSI, Mangalarga Marchador, Mangalarga e Brasileiro de Hipismo). Os garanhões foram mantidos em estábulo recebendo como alimentação Tifton-85, ração e água ad libitum. Foram utilizadas 20 éguas com idade entre 10 e 18 anos, mantidas em 52 piquetes de 1200 m 2 , com lotação de quatro animais por piquete, recebendo a mesma alimentação supracitada para os garanhões. 2.2. Coleta do sêmen Foi utilizado 1 ejaculado de cada garanhão. Imediatamente após a coleta com vagina artificial modelo Botupharma® (Botupharma Ltda-Botucatu-Brasil), foi realizada uma análise inicial para estimar a qualidade do sêmen. Para isso foi empregado o método do sistema computadorizado de análise espermática – CASA (Computer Assisted Sperm Analysis (HTM- IVOS 12 Hamilton Thorne Research, Beverly, MA). Após a realização da triagem inicial, foi determinada a concentração espermática através da contagem das células em câmara de Neubauer. Em seguida, cada ejaculado foi fracionado em seis alíquotas iguais, acrescido o diluente teste estipulado para cada experimento, sendo 4 amostras destinadas a refrigeração. Em seguida foi fixada concentração d